JP2016533757A - 変更されたグリコシル化パターンを有するFc含有分子を産生する細胞並びにその方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列;
− Fc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を含む細胞が提供される。
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列;
− Fc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列の存在によって特徴付けられる高等真核細胞で産生されるFc含有分子が提供される。
− ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列、及びFc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を、このエンドグルコサミニダーゼ酵素及びこのFc含有分子の発現に適した条件で含む高等真核細胞を用意するステップ;及び
− Fc含有分子がエンドグルコサミニダーゼに細胞内で接触した後にこのFc含有分子を回収するステップを含む。
− 本明細書に記載のFc含有分子を用意するステップ;
− このFc含有分子を対象に投与するステップを含む。
本発明は、特定の実施形態について特定の図面を参照して説明するが、本発明は、これらに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲のどの参照符号も、発明の範囲を限定すると解釈するべきではない。描かれた図面は、単なる略図であり、限定するものではない。各図面において、一部の要素のサイズは、例示目的のために拡大され、正確な縮尺では描かれていないこともある。「含む(comprising)」という語がこの説明及び特許請求の範囲で使用される場合、この語は、他の要素又はステップを排除するものではない。単数形の名詞について述べる際に不定冠詞又は定冠詞、例えば、「1つの(a)」又は「1つの(an)」、「その(the)」が使用される場合、この語は、明確に他の記載がない限り、その名詞の複数形を含む。
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列;
− このFc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を有する。
− ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列、及びFc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を、エンドグルコサミニダーゼ酵素及びFc含有分子の発現に適した条件下で含む高等真核細胞を用意するステップ;及び
− エンドグルコサミニダーゼと細胞内で接触した後にFc含有分子を回収するステップを含む。
− 特定の三糖Neu5Ac−Hex−HexNAc修飾グリコシル化パターンを有するFc含有分子を用意するステップ;
− このFc含有分子を対象に投与するステップを含む。
哺乳動物細胞で産生される糖タンパク質は、しばしば、複合型N−グリカン合成を含む多数の生合成ステップの結果として不均一である(図1a)。各ステップは、100%未満の効率であり、一部の酵素は基質を競合し、多数の異なる糖型が生じる。治療糖タンパク質の不均一性は、グリカンがクリアランス及び生物活性に影響を与えるため、下流のプロセシング及びプロセスの再現性に負の影響を及ぼし、かつ変化しやすい有効性をもたらし得る1、2。例えば、グリカンのシアル酸含有量は、しばしば、薬物動態を決定する3。グリカンの不均一性の問題の対処では、N−グリカンは、しばしば、タンパク質の折り畳みに極めて重要であり、かつN−グリコシル化部位の突然変異によって単純に除去できないと考えなければならない。ここで、本発明者らは、ゴルジN−グリコシル化経路をショートカットして、最小サイズのシアル化三糖N−グリカンを有するタンパク質を産生させる哺乳動物細胞糖鎖工学技術を導入する(図1a)。
本発明者らは、一過性に過剰発現される分泌サイトカイン(ヒト顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、hGM−CSF13)、安定して過剰発現されるGPCR、5HT1DR12(実施例3)、一過性に過剰発現されるモノクローナル抗体(抗CD20、オビヌツズマブ)14(実施例4)、及び一過性に過剰発現されるFc含有融合タンパク質(抗TNF、エタネルセプト)(実施例5)に対する安定したGlycoDelete工学の効果を評価した。
GlycoDeleteが、安定したトランスフェクションベースのタンパク質の産生に適合性であること、及びGlycoDeleteが、膜タンパク質を処理できることを確認するために、安定したGlycoDelete工学とは別に、GPCR、即ち、5HT1DR12が安定して過剰発現される安定した細胞株を作製した。膜タンパク質抽出物のPNGase Fでの処理により、293SGnTI−/−細胞で安定して過剰産生される5HT1DRの分子量(MW)の大きな変化が明らかになった。これとは対照的に、PNGase Fで処理するしないにかかわらず、293SGlycoDelete細胞で産生される受容体は、293SGnTI−/−細胞からのPNGase Fで処理された受容体とほぼ同じMWであった。本発明者らは、293SGlycoDelete細胞では、ST−endoTが5HT1DR N−グリカンを完全に加水分解したと結論付けた(図11)。
GlycoDelete技術の範囲をさらに検討するために、モノクローナル抗体−CD20抗体オビヌツズマブ(GA101)14を、293S細胞及び293SGlycoDelete細胞で一過性に発現させて、細胞培地から精製した。細胞株は、同様の量の抗体を産生した(図12)。293S−産生抗CD20は、そのFc結合N−グリコシル化部位(重鎖Cγ2−ドメインのN297)のみに、典型的にはIgGs19であるコア−フコシル化バイアンテナ型N−グリカンを有する(図13)。予想通り、PNGaseFでの処理は、MWを低下させた(図14a)。対照的に、293SGlycoDelete細胞で産生される抗体の重鎖は、293S細胞からのPNGaseF−処理抗体の重鎖とほぼ同じMWであり、このMWは、PNGaseF処理によってさらに低下することはなかった(図14a)。この結果は、endoTによって切断されたこのIgGのN−グリカンに一致している。従って、GlycoDelete細胞は、hIgG Fc結合N−グリカンも処理する。
次に、本発明者らは、エタネルセプト、即ち、IgG1抗体の定常領域の端部に融合されたヒト2型TNF受容体からなる組換え融合タンパク質をGlycoDelete細胞で一過性に発現させて精製した。実施例2及び4で試験されたタンパク質と同様に、LC−MS分析により、GlycoDeleteタンパク質のFc部分が、HexNAc、Gal−HexNAc、及びNeu5Ac−Gal−HexNAc N−グリカンで修飾されていることが明らかになった(図18)。(これは、Fc鎖からのEQQYNSTYRペプチド(配列番号:1)で評価した)。
結論として、この研究は、哺乳動物細胞を用いる糖タンパク質産生でのN−グリコシルの不均一性の問題を解決するアプローチとしてGlycoDelete糖鎖工学の戦略を導入する。GlycoDeleteは、任意であるが特に考えられる、(GnTI、遺伝子MGAT1によってコードされる)単一グリコシルトランスフェラーゼの不活性化、及び脱グリコシル化酵素の過剰発現、これに続くレクチン選択を含む。GlycoDelete細胞は、Gal−GlcNAc二糖、又はそのα−2,3−シアル化三糖誘導体及び単糖中間体の一部を含むタンパク質を産生する。これは、野生型哺乳動物細胞で産生される多数のグリカン構造とは対照的である。GlycoDelete戦略は、N−グリカンの折り畳み促進機能の維持と、哺乳動物ゴルジN−グリカンプロセシングによって導入される広範な不均一性の回避とをバランスさせる。バイオ医薬品製造におけるN−グリカンの複雑さの軽減の利点に加えて、in vitroで生産される同様の短い単純なN−グリカンの治療効果の例が報告されている21〜23。さらに、本発明者らは、治療目的が、追加のエフェクター機能を必要としない抗原の中和である場合、GlycoDelete工学が、抗体の特徴を好ましく変更することを示した。従って、GlycoDeleteは、バイオ医薬品業界で関心領域である「バイオベター」をもたらすであろう28。この戦略は、保存されたN297残基のグリコシル化を単に変更することによって循環半減期を延長するため、Fc含有分子の発現に特に適していると思われる。これは、例えば、治療IgG注射にとって重要な治療上の利点を有し、この治療IgG注射は、その頻度を大幅に減らすことができ(例えば、半分の頻度)、しかも同じ親和性のためリガンドに対して同じ効果を維持する。
一般的な細胞の培養及びトランスフェクション
本発明者らは、293SGnTI(−)細胞を、10%FBS、292μg/mL L−グルタミン、100単位/mL ペニシリン、及び100μg/mL ストレプトマイシン(全てSigma−Aldrich)を含むDMEM/F12(Gibco)中、5%CO2、37℃の湿潤インキュベーターに維持した。
endoT融合構築物(pCAGGS−GM2S−endoT及びpCAGGS−ST−endoT)及び分泌endoT構築物(pCAGGS−s−endoT)を、上記のように293SGnTI(−)細胞に一過性にトランスフェクトした。上清及び細胞溶解物のサンプルを分析して、ドメインを標的にする能力を評価した(図2)。
endoTによる脱N−グリコシル化を、全てのendoT構築物を293SGnTI(−)細胞に安定にトランスフェクトして、Flt3受容体細胞外ドメインを誘導的に発現させることによって評価した(図3)。
本発明者らは、ST−endoT PCR断片をpCR(登録商標)II−TOPO(登録商標)プラスミド(Life Technologies)にクローニングした。本発明者らは、得られたTopo−ST−endoTプラスミド(逆相補鎖挿入)をXhoI及びKpnIで消化し、挿入物を精製した。pcDNA3.1/zeo(−)プラスミドをXhoI及びPvuIで1回消化して1.5kbの断片を精製し、そしてPvuI及びKpnIで1回消化して3.6kbの断片を精製した。続くベクター断片及びST−endoT断片との3点ライゲーションにより、pcDNA3.1/zeo−ST−endoTプラスミドを得た。
本発明者らは、pcDNA3.1(−)Zeo−ST−endoTを用いて小規模トランスフェクションで293SGnTI(−)細胞をトランスフェクトした。本発明者らは、トランスフェクションの48時間後に、15μg/mL ConAで選択を開始した。14日後、細胞をトリプシン処理して、10μg/mL ConAを含む条件培地(滅菌濾過され、新鮮な50%(v/v) DMEM/F12と混合された、2日経過した293SGnTI(−)培養物の培地)に再プレーティングした。14日後、5つの大きな十分に分離されたクローンを採集して、10μg/mL ConAの存在下で増殖させた。2つの最も速く増殖しているクローンをさらに分析した。
70〜80%コンフルエントな培養物からの細胞を、まず約60,000細胞/mlに希釈し、(0時間の時点で)再度カウントし、6ウェルプレートに移した(180,000細胞/ウェル)。各時点で、3つのウェルを、ピペット操作で培地を上下させて取り外し、生細胞を、トリパンブルー排除及び血球計を用いて各ウェルでカウントした。図1cに示されている結果は、2つの重複実験の1つを示している。
GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays(Affymetrix)での分析のためのRNAの単離及びサンプルの調製は次の通りである。
一過性のGM−CSFの発現のためのプラスミド(pORF−hGM−CSF−6xHis)を、293SGnTI(−)細胞株及び293SGlycoDelete細胞株の両方に一過性にトランスフェクトした。分泌GM−CSFを培地から精製した。
C末端に6His残基が標識されたヒトGM−CSFの部分的なCDSを、pORF−hGM−CSFプラスミド(Invivogen,CA,USA)からプライマーPR18及びPR19を用いて増幅した。本発明者らは、Apal及びEcoRIを用いてPCR断片及びpORF−hGM−CSFプラスミドを消化し、両方の断片を連結してpORF−hGM−CSF−6xHisプラスミドを得た。
293SGnTI−/−細胞及び293SGlycoDelete細胞を、pORF−hGM−CSF−6xHisプラスミドを一過性にトラスフェクトした(一過性トランスフェクション、オンライン法を参照)。トランスフェクションの4日後、50mlの発現タンパク質を含む培地を回収し、3kDa MWCO膜を用いて緩衝液A(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、及び20mM イミダゾール pH7.5)を透析した。透析液を、Ni2+イオンが充填された1ml His−Trap HPカラム(GE healthcare UK Ltd,Buckinghamshire,UK)にかけた。次いで、カラムを、A280が低下して基準値に戻るまで緩衝液Aで洗浄した。10カラム容量の6%緩衝液B(20mM NaH2PO4 pH7.50+20mM NaCl+0.5M イミダゾール)でカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を100%緩衝液Bで溶出し、1ml画分で収集した。収集した画分中のGM−CSFの存在を、トリシンSDS−PAGEゲル電気泳動法9によって検証した。本発明者らは、盲検としての緩衝液Bに対する画分を含むGM−CSFのA280吸光度に基づいてタンパク質濃度を測定した。濃度は、protparamツール(http://web.expasy.org/protparam)10によって計算した、ジスルフィド結合中の全てのシステイン残基(13980M−1 cm−1)を用いる理論吸収係数を用いて計算した。
抗CD20を、上記のように293S細胞株及び293SGlycoDelete細胞株の両方で一過性に発現させて、次のように精製した:抗CD20を含むベクターでの293S細胞及び293SGlycoDelete細胞の一過性トランスフェクション(一過性トランスフェクション、オンライン法を参照)の4日後、発現タンパク質を含む培地を回収し、アフィニティーカラム5ml HiTrap MabSelect SuRe(GE healthcare UK Ltd,Buckinghamshire,UK)にかけた。次いで、カラムを、A280が低下して基準値に戻るまでPBSで洗浄した。結合したタンパク質を50mM グリシン pH3.5で溶出し、1ml画分で収集した。収集した画分中の抗CD20の存在を、トリシンSDS−PAGEゲル電気泳動法によって検証した。本発明者らは、抗CD20を含むプールされた画分に対して、pH6.0の25mM ヒスチジン 125mM NaCl 緩衝液で緩衝液交換を行った。精製サンプル中の抗体濃度を、Synergy MX分光光度計(Biotek,VT,USA)を用いて測定した。本発明者らは、精製抗体のA280吸光度に基づいてタンパク質濃度を測定した。濃度は、理論吸収係数を用いて計算した。
5HT1DRを安定に発現する細胞株の作製、5HT1Dサンプルの調製、及び分析の詳細な方法は次の通りである。
pT−REx−DEST30プラスミド(Invitrogen)を、dam/dcmメチル化欠損大腸菌(E.coli)株で増殖し、BclI及びXbaIで消化した。dsDNAインサートを、オリゴPR11及びオリゴPR12のアニーリングによって作製した。続くdsDNAインサートの、XbaI/BclI消化pT−REx−DEST30断片へのライゲーションにより、pT−REx−MCSプラスミドを構築した。
本発明者らは、293SGnTI−/−をpT−RExL−5HT1DRho−IRESdsRed2プラスミドでトランスフェクトし、293SGlycoDelete細胞をpTRExL−5HT1DRhoプラスミド又はpT−RExL−5HT1DRho−IRESdsRed2プラスミドでトランスフェクトすることによって、5HT1D受容体を安定的かつ誘導的に発現する細胞株を作製した。600μg/ml(293SGnTI−/−細胞)及び150μg/ml G418(293SGlycoDelete細胞)でG418(Sigma−Aldrich)を用いて選択を行った。次いで、本発明者らは、G418耐性細胞を、条件培地で限界希釈クローニングした。本発明者らは、2μg/ml テトラサイクリン及び1mM バルプロエート(Sigma−Aldrich)を用いて5HT1D受容体の発現を誘導した。本発明者らは、蛍光顕微鏡法による誘導の2〜3日後に、最高強度の赤色蛍光を発現する293SGnTI−/−5HT1DRクローンを選択した。
293SGlycoDeleteクローンを発現する5HT1DRのELISA分析のために、本発明者らは、2μg/mlテトラサイクリン及び1mM バルプロエート(Sigma−Aldrich)を用いた誘導の2〜3日後に、24ウェルプレートから細胞を回収した。本発明者らは、細胞を遠心分離で沈降させ、上清を廃棄した。細胞を、RIPA緩衝液+プロテアーゼインヒビターを用いて、氷上で20分間インキュベートすることによって溶解した。本発明者らは、サンプルを12,000rpmで10分間の遠心分離によって残屑を除去した。本発明者らは、製造者の取扱説明書に従って、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,USA)でタンパク質を測定した。ピキア・パストリス(P.pastoris)で産生される15μgの5HT1DRの陽性コントロールサンプル及び15μgの293SGlycoDelete陰性コントロールサンプルをmaxisorbプレートで、4℃で一晩コーティングした。本発明者らは、このプレートを、水で3回、そして洗浄緩衝液(PBS+0.1% Tween−80)で1回洗浄した。ブロッキング緩衝液(PBS+1% 粉乳)を各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、サンプル緩衝液(PBS+0.05% Tween+0.5% 粉乳)で1/100に希釈した抗rho1D4抗体(University of British Columbia,Vancouver,Canada)を添加し、サンプルを室温で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、次いで、サンプル緩衝液で1/5000に希釈したHRP二次抗体(GE Healthcare Biosciences,Pittsburgh,PA,USA)に結合された抗マウスIgGをサンプルに添加した。最後に、プレートを再び洗浄し、サンプルを、製造者の取扱説明書に従って、BD OptEIA(商標)TMB基質試薬セット(BD,Franklin Lakes,NJ,USA)で分析した。
本発明者らは、5HT1D受容体を安定的かつ誘導的に発現する293SGnTI−/−細胞株及び293SGlycoDelete細胞株を作製した。5HT1DR発現構築物の作製及びこれに続く安定した5HT1DR−発現クローンの作製の詳細な方法は、補足事項1に記載されている。各細胞株の選択された5HT1DR−発現クローンを、2μg/ml テトラサイクリン及び1mM バルプロエートを用いて誘導した。誘導の3日後に細胞を収集した。細胞ペレットを、5mlの20mM Tris−HCl pH8.0+1mM EDTA+コンプリートEDTAフリープロテアーゼインヒビター(Roche,Mannheim,Germany)に再懸濁した。1.25mlの各サンプルを、VCX500超音波処理器(Sonics & Materials Inc.,Newtown,CT,USA)を用いて氷上で超音波処理した(15サイクル、各サイクル:1秒オンで5秒オフ、20%の増幅)。本発明者らは、溶解物を、即座に13,000rpm及び4℃で10分間遠心分離し、上記の緩衝液+0.35mM NaCl、及び0.5% n−ドデシル−β−D−マルトシドでペレットを可溶性にした。サンプルを再び、即座に13,000rpm及び4℃で10分間遠心分離して残屑を除去した。
本発明者らは、糖タンパク質を、40mMのβ−メルカプトエタノール及び0.5% SDSを含む50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)で希釈した。サンプルを、98℃で10分間インキュベートした。冷却後、1% Igepal CA630及び適切な酵素を添加した:100UのPNGaseF(社内生産)、200mUのアルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)シアリダーゼ(社内生産)、2mUのストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)β−1,4−ガラクトシダーゼ(Prozyme)、又はこれらの組み合わせ。サンプルを37℃で一晩インキュベートし、翌日にトリシンSDS−PAGEゲルで分析した。
Thermofluorアッセイを、Ericsson et al.17らに記載されているように行った。簡単に述べると、精製タンパク質を、緩衝液(GM−CSF用のPBS、及び抗CD20用のHis緩衝液−25mM ヒスチジン、125mM NaCl、pH6.00)及び20倍濃縮Syproオレンジ染料(DMSO中、5000倍溶液、life technologies,Paisley,UK)を含む溶液で適切なアッセイ容量(10〜20μl)に希釈した。各実験は、技術的トリプリケートとして行い、試験タンパク質を用いないトリプリケート空測定を含めた。温度の関数である蛍光を348ウェルLightcycler 480(Roche,Basel,Switzerland)で、0.01℃/秒の温度ランプ速度で25℃〜95℃まで記録した。
異なる細胞株のGM−CSF(20μL中、1〜4μgのタンパク質)に、10μLの3×トリシンゲルローディング緩衝液(1.5M Tris−HCl、pH8.45、35% グリセロール、10% SDS、0.01% クマーシー、及び30mM DTT)が補充され、98℃で10分間インキュベートした。3μLの500mM ヨードアセトアミドストックを添加し、サンプルを、暗室で1時間インキュベートした。本発明者らは、12% トリシンSDS−PAGEゲルでサンプルを分離し、バンドを切り出した。
本発明者らは、9μgの抗CD20を20μLの50mM リン酸緩衝液、pH7.0で希釈した。酵素なし、100mUのアルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)シアリダーゼ(社内生産)、又は2mUのβ−1,4−ガラクトシダーゼ(ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae))及び100mUのシアリダーゼを添加し、この混合物を37℃で4時間インキュベートした。サンプルを、2M 尿素、10mM DTT、50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液で、60℃で30分間変性させた。20mMの濃度になるようにヨードアセトアミドを添加し、サンプルを暗室で30分間インキュベートした。次に、サンプルを1/50(w/w)トリプシン(Promega)で消化し、37℃で一晩インキュベートした。
シアル化されたGlycoDeleteグリカンのパーセンテージを計算するために、本発明者らは、未消化(AGalGlcNAcUndig及びAGlcNAcUndig)及びα−2,3−シアリダーゼ消化(AGalGlcNAcDig及びAGlcNAcDig)GlycoDelete GM−CSFサンプルの両方のGal−GlcNAc−N(m/z=3622.3)及びGlcNAc−N(m/z=3460.2)糖ペプチドのMALDI MSスペクトルのピークの下の面積を抽出した。シアル化グリカンのパーセンテージを、以下の式に示されているように計算した。Gal−GlcNAc−Nピーク面積を、両方のスペクトルにおいてGlcNAc−Nピーク面積に対してまず正規化した。未消化サンプルから得られたGal−GlcNAc−Nピークの値を、シアリダーゼ消化サンプルからのGal−GlcNAc−Nピークの値から差し引いた。次いで、この差異を、消化サンプルのGlcNAc及びGalGlcNAcピークの合計正規化ピーク面積(N27又はN37を含む糖ペプチドの合計正規化ピーク面積)で除した。
TF1細胞(ATCC n° CRL−2003)を、RPMI 1640、10%(v/v) FBS、2mMのL−Gln、及び2ng/mLの組換えヒトGM−CSF中、37℃、5% CO2で維持した。アッセイを開始する前に、サイトカインを含まない培地で細胞を3回洗浄した。続いて、細胞を、サイトカインを含まない培地に戻し(200,000細胞/mL)、37℃で2時間放置した。
13〜16週齢のニュージーランドホワイト雄又は雌ウサギ(各抗原に対して2匹のウサギ、1匹のウサギの結果のみが図7及び図14に示されている)に、293S GM−CSF、GlycoDelete GM−CSF、293S抗CD20、又はGlycoDelete抗CD20を注射した。500μLの抗原溶液中の50μgの抗原(0.9% NaCl溶液で500μLまで希釈された50μgのタンパク質)+500μLの完全フロイントアジュバントを、0日目、14日目、28日目、及び56日目に皮下注射した。ウサギの採血を、0日目(免疫前採血)、38日目、66日目、及び80日目(最終採血)に行った。免疫は、CER Groupeによって行われ、CER Groupe倫理委員会によって承認された。
グリコシダーゼ消化を上記のように行った。Maxisorpマイクロタイタープレートのウェルを、50μlのコーティング緩衝液(0.05M Na2CO3、0.05M NaHCO3、pH9.6)中、0.25μg/mLのGM−CSF又は0.15μg/mLの抗CD20でコーティングし(一晩、4℃)、PBS+0.1% Tweenで3回洗浄し、250mM グリシンを含むPBS中、1% BSAで、室温で2時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを一晩乾燥させた。
Raji細胞のFc受容体を、抗CD32抗体IV.3(参照文献29)(社内生産)及びAT10(カタログ番号:MCA1075、AbD Serotec)を10μg/mLでブロックし、そして細胞を氷上で1時間インキュベートした。次に、細胞を96ウェルプレートにプレーティングし(105細胞/ウェル)、そして293S抗CD20又は293SGlycoDelete抗CD20を、10μg/mLから開始する希釈系列に添加した。細胞を、4℃で1時間インキュベートし、次いでPBS+2% BSAで2回洗浄した。抗CD20を検出するために、DyLight 649(カタログ番号:109−496−097、Jackson laboratories)にコンジュゲートした抗F(Ab)2二次抗体を、1:200の希釈で添加した。細胞を、再び4℃で30分間インキュベートし、PBS+2% BSAで2回洗浄した。細胞を固定するために、150μLの固定液(CellFIX,Becton Dickinson)を各ウェルに添加し、4℃で1時間インキュベートした。フローサイトメトリー(FACSCalibur,Becton Dickinson)によって二次抗体を検出した。図3cにプロットされたデータ点は、3つの技術的レプリケートの平均値を表している。エラーバーは標準偏差である。この実験は2回行った。
Biacore 2000 SPRバイオセンサー(GE Healthcare)を使用して、FcRnと様々な抗CD20糖型との相互作用をアッセイする。全ての実験を25℃で行った。CM5チップを、10μL/分の流速で、EDC(1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド)及びNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)の溶液との7分間の架橋結合のために活性化させた。次に、10mM 酢酸緩衝液、pH5.0中、10μg/mLのストレプトアビジン(Roche)を、同じ流速で7分間固定し、1,180〜1,280共鳴単位(RU)の密度が得られた。固定後、チップを、1Mのエタノールアミンを7分間注入することによってブロックした。固定を終了させるために、チップを、20μLの40mM NaOH、1M NaCl緩衝液で3回洗浄した。
Maxisorpマイクロタイタープレートのウェルを、50μlのPBS中、コーティング抗体(FcγRI ELISAのための8μg/mLの抗イディオタイプ抗体;FcγRIIa及びFcγRIIbそれぞれのための16μg/mL及び10μg/mLのHz 15Cl、ヒト化抗TLR4 IgG1(NovImmune))を用いて4℃で一晩コーティングし、次いで、洗浄緩衝液(PBS+0.05% Tween)で5回洗浄し、各ウェルに付き、PBS中、250μlの3% BSAで、37℃で1時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを、洗浄緩衝液で5回洗浄した。
精製IgGのFcγRIIIaへのリアルタイム結合を、Octet RED96システム(Fortebio,Menlo Park,CA)でバイオレイヤー干渉法(BLI)を用いて評価した。アッセイは、1mM リン酸塩、15mM NaCl、0.002%(vol/vol) Tween20、0.005%(wt/vol) アジ化ナトリウム、0.1mg/mL(wt/vol) BSA、pH7.4を含むキネティクス緩衝液中、30℃の温度で行った。ヘキサヒスチジンタグで標識されたFcγRIIIaV(R&D Systems,MN,USA)を、キネティクス緩衝液中、1.5μg/mLの濃度にした。受容体を、抗ペンタ−His バイオセンサー(Fortebio,Menlo Park,CA)で10分間捕捉した。リガンド濃度は、0.5nmであった。基準値シグナルは、キネティックス緩衝液中、2分間のインキュベーションで安定した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll管(Vacutainer tube CPT,Becton Dickinson)での遠心分離後に新鮮な血液から単離した。ナチュラルキラー(NK)細胞を、陰性NK細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いてPBMCプールから単離した。これらの細胞を、増殖培地(RPMI 1640+10% FBS+2mM グルタミン)+10ng/mL IL−2中、一晩活性化させた。
36匹の雌の8週齢のC57BL/6Jマウス(Charles River)の2つの群を、18.5μg(1mg/体重kg)の293S抗CD20又は293SGlycoDelete抗CD20のいずれかを静注するために無作為に割り当てた。各時点(1時間、24時間、48時間、4日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び28日目)で、1つの処置群に付き4匹のマウスを、最終採血のために屠殺し、抗CD20の濃度を、製造者の取扱説明書に従って、FastELYSAヒトIgGキット(RD−Biotech)を用いて決定した。図14gに示されているデータ点は、各時点の(4匹のマウスの)平均値である。エラーバーは、平均値の標準偏差である。この実験は、注射後の早い時点での採血で繰り返した(図17を参照)。実用的な理由から、研究者は、マウスの処置群割り当てについて非盲検とした。この実験は、Ghent University(Belgium)及びジュネーブのCantonal Veterinary Office(Switzerland)の倫理委員会によって承認された。
シグナル配列を含まないendoTコード配列3を、PCRプライマーPR1及びPR4(ST−endoT用)、PR2及びPR4(GM2S−endoT用)、又はPR3及びPR4(「endoT」用)を用いて、フルサイズのendoTコード配列を含むpUC19クローニングベクターから増幅した。全てのプライマー配列は、補足事項2に記載されている。ST6GalI4(ST−endoT用)及びB4GALNTI5(GM2S−endoT用)のN末端部分のコード配列を、それぞれプライマーPR5、PR6、及びPR7、PR8を用いて、ヒトヘパトームG2 cDNAライブラリーから増幅した。シグナル配列を含まないST−endoT、GM2S−endoT、及びendoTを作製するための各融合PCR反応をそれぞれ、PR5及びPR4、PR7及びPR4、並びにPR3及びPR4を用いて準備した。続く、XhoI及びBsu36Iを用いる融合PCR産物ST−endoT、GM2S−endoT、及びendoTの消化、並びにXhoI及びBsu36Iで消化された脱リン酸化pCAGGSプラスミドへのライゲーションにより、pCAGGS−ST−endoTプラスミド及びpCAGGS−GM2S−endoTプラスミドを得た。s−endoT構築物のdsDNAシグナル配列を、オリゴヌクレオチドPR9及びPR10のアニーリングによって作製した。pCAGGS−endoTプラスミドを、XhoI及びKpnIで消化した。続く、アダプターのプラスミドへのライゲーションにより、pCAGGS−s−endoTプラスミドを得た。
細胞を、上記のようにトランスフェクトした(オンライン法を参照)。pCAGGS−s−endoT、pCAGGS−GM2S−endoT、又はpCAGGS−ST−endoTでのトランスフェクションの3日後に、細胞及び上清を回収した。細胞溶解物を得るために、細胞を、1000rpmでの遠心分離によって収集し、PBSで1回洗浄した。細胞溶解物を、約100万の細胞を500μlのRIPA緩衝液(150mM 塩化ナトリウム、1.0% Igepal CA−630、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、及び50 mM Tris、pH8.0)と共に回転台で、4℃で30分間インキュベートし、続いて14,000rpmで10分間遠心分離し、不溶性物質を廃棄することによって調製した。20μlのサンプルに、5μlの5倍SDS−PAGEローディング緩衝液(8.3% SDS、41.7% グリセロール、0.1% ブロモフェノールブルー、208mM Tris−HCl、pH6.8、及び65mM ジチオスレイトールが添加されて新鮮)を補充し、10分間煮沸した。
細胞溶解物又は上清のサンプルの25μlのアリコートを、免疫ブロット法によってendoT融合タンパク質の存在について分析した。特注のendoT酵素に対するウサギポリクローナル抗体(CER groupe,Departement Sante,Marloie,Belgium)を用いて間接的な検出を行った。抗原は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)で作製され、本発明者らの研究室で以前に精製されたendoTとした。最終抗原調製物は、リン酸緩衝生理食塩水中、1mg/ml 抗原とした。二次抗体を、IRDye 680ヤギ抗ウサギIgG(LI−COR Biosciences,Lincoln,NE,USA)とした。C末端処理を評価するために、同じブロットを、mycタグに対するマウス一次抗体(Life Technologies,Paisley,UK)及びIRDye 800ヤギ抗マウスIgG二次抗体(LI−COR Biosciences,Lincoln,NE,USA)で精査した。
CDSの存在を検証するために、ゲノムDNAを、製造者の取扱説明書に従って、Gentra Puregene Core kit A(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて293SGlycoDelete細胞株及び293SGnTI−/−細胞株の両方の約100万の細胞から調製した。タッチダウンPCR反応を、各50μlの反応に対する約10ngのゲノムDNA及びプライマーPR11及びPR12を利用するPhusion(登録商標)High−Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)で行った。PCRサイクリングは、2サイクルごとに1℃で、67℃〜64℃に下げられ、64℃で30サイクル維持される(合計36サイクルとなる)プライマーアニーリング温度を用いるタッチダウンプロトコルとした。PCR産物を、製造者の取扱説明書に従って、DNA−500試薬キット(Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan)を利用するShimadzu MultiNAマイクロチップDNA/RNA電気泳動システムで分析した。
ST−endoTタンパク質の発現を、ウエスタンブロット法によって評価した。方法は、二次抗体がIRDye 800ヤギ抗ウサギIgG抗体(LI−COR Biosciences,Lincoln,NE,USA)であった点を除いて、添付の図1に示されている方法と同じである。
N−結合オリゴ糖を、96ウェルプレート膜プレートのウェルのPVDF膜へのブロット時に精製タンパク質から調製し、上記6のABI 3130キャピラリーDNAシーケンサーを用いる、レーザー誘導蛍光検出器付きキャピラリー電気泳動法(CE−LIF)によって分析した。
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Claims (15)
- 高等真核細胞であって:
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列;
− Fc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を含む、高等真核細胞。 - 前記エンドグルコサミニダーゼ酵素の発現がゴルジ装置を標的とする、請求項1に記載の細胞。
- 前記エンドグルコサミニダーゼ酵素が、マンノシル−糖タンパク質endo−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ(E.C.3.2.1.96)、特にEndoTである、請求項1又は2に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞、特にCHO細胞又はHek293S細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞。
- 高等真核細胞での産生によって得られるFc含有分子であって、前記高等真核細胞が、
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列;
− 前記Fc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列の存在によって特徴付けられる、Fc含有分子。 - Fc部分のN297のグリコシル化が、三糖構造Neu5Ac−Hex−HexNAc、二糖構造Hex−HexNAc、及び単糖構造HexNAcから選択されるグリカンからなることを特徴とする、Fc含有分子。
- Fc部分のN297のグリコシル化が、三糖構造Neu5Ac−Hex−HexNAc、二糖構造Hex−HexNAc、及び単糖構造HexNAcから選択される1つ以上のグリカンからなることを特徴とする、複数の同一Fc含有分子。
- 前記三糖構造がNeu5Ac−α−2,3−Gal−β−1,4−GlcNAcであり、前記二糖構造がGal−β−1,4−GlcNAcであり、前記単糖構造がGlcNAcである、請求項6に記載のFc含有分子、又は請求項7に記載の複数のFc含有分子。
- 抗体、特にIgGである、請求項5〜8のいずれか1項に記載のFc含有分子。
- 薬剤として使用される、請求項5〜9のいずれか1項に記載のFc含有分子。
- 静注免疫グロブリン療法に使用される、請求項5〜9のいずれか1項に記載のFc含有分子。
- 高等真核細胞の残基N297に特定のグリコシル化パターンを有するFc含有分子を産生させる方法であって:
− ゴルジ局在化シグナルに機能的に連結されたエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列、及び前記Fc含有分子をコードする第2の外因性核酸配列を、前記エンドグルコサミニダーゼ酵素及び前記Fc含有分子の発現に適した条件で含む高等真核細胞を用意するステップ;及び
− 前記Fc含有分子が前記エンドグルコサミニダーゼに細胞内で接触した後に前記Fc含有分子を回収するステップを含む、方法。 - 前記Fc含有分子が分泌される、請求項12に記載の方法。
- 抗原の結合を変更することなく、Fc含有分子を必要とする対象に投与される前記Fc含有分子の循環時間を長くする方法であって:
− 請求項1〜3、8、及び9のいずれか1項に記載のFc含有分子を用意するステップ;
− 前記Fc含有分子を前記対象に投与するステップを含む、方法。 - 抗原結合活性を維持し、かつ非修飾糖型と比較して長いin vivoでの循環時間を有する、請求項1〜3、8、及び9に記載のいずれか1項に記載のFc含有分子。
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