JP2016531546A - 免疫グロブリン分子試料を分析する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫グロブリン試料を分析する方法、関連ペプチド、およびそのような方法を実施するためのキットを提供する。

Description

本発明は、免疫グロブリン試料を分析する方法、関連ペプチド、およびそのような方法を実施するためのキットに関する。

構造特性評価および生理化学分析などで抗体を特性評価することが、抗体ベースの治療法の開発者および製造者に必要とされている。質量分析（ＭＳ）は、治療用モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を特性評価するための重要な分析手段の１つである。ＨＰＬＣと組み合わせた質量分析は、これらの大きな生体分子の一次構造、ならびに翻訳後修飾（ＰＴＭ）およびグリカン構造を研究するために一般に使用される。大きなサイズのＭＡｂ（１５０ｋＤ）に翻訳後修飾（ＰＴＭ）が伴うことによって、これらの生物学的治療法を分析的に特性評価することが特に困難となっている。

例えば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、治療薬の標的化された送達を実現するためにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性を利用する、治療薬の重要なクラスである。抗体の標的部位特異性および結合特性、リンカーおよび治療薬のインビトロおよびインビボでの安定性、治療薬の有効性、ならびに抗体における治療薬の分布および平均数の両方が、ＡＤＣの臨床有効性に極めて重要である。したがって、ＡＤＣの生理化学的特性を理解し、製造およびその後の保存中にＡＤＣを評価およびモニターするための分析および生物学的分析技術を開発することが重要である。

ストレプトコッカルエリスロジェニックトキシンＢ（ＳｐｅＢ）は、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のシステインプロテアーゼであり、ＩｇＧをヒンジ領域において、２つの安定な単量体Ｆａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントに切断することが示されている。具体的には、ＳｐｅＢはヒトＩｇＧをグリシン残基２３６および２３７の間で切断することが報告されている。化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来の第２のシステインプロテアーゼである、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）は、ＩｇＧに対してＳｐｅＢと同一の切断部位を有すると報告されている。

本発明者らは、ＩｇＧに対するＳｐｅＢおよびＩｄｅＳの活性を慎重に検証し、ＳｐｅＢが実際には、ヒンジ領域においてＩｄｅＳとは異なる部位でＩｇＧを切断するという驚くべき発見を成した。本発明者らは、この驚くべき発見を発展させ、ＳｐｅＢおよびＩｄｅＳによる免疫グロブリンのタンデム切断により、以前に考えられていたよりも詳細に、免疫グロブリン分子のヒンジ領域を研究することが可能になることに気が付いた。このことは、ヒンジ領域が、翻訳後修飾および抗体薬物複合体における治療薬の結合に重要な部位であるため、重要である。したがって、本発明は以下を提供する。

免疫グロブリン分子試料を分析する方法であって、試料を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと接触させるステップ、ならびに生じた混合物を分析するステップを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、ヒトＩｇＧのヒンジ領域において異なる標的部位をそれぞれ切断するシステインプロテアーゼ酵素である、方法。

アミノ酸配列ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３）、または１つもしくは２つの保存された改変を含む前記配列の変異体からなるペプチド。

免疫グロブリン分子試料を分析する方法において使用するためのキットであって、上で定義される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む、キット。

ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）単独、ＳｐｅＢ（Ｆｐｎ−１）およびＩｄｅＳの両方、またはＳｐｅＢ単独によるヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体ハーセプチンの切断後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）単独、ＳｐｅＢ（Ｆｐｎ−１）およびＩｄｅＳの両方、またはＳｐｅＢ単独によるヒトモノクローナルＩｇＧ１抗体ハーセプチンの切断後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。 質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により決定された、ヒトモノクローナルＩｇＧ１（ハーセプチン）に対するＳｐｅＢ（Ｆｐｎ−１）およびＩｄｅＳの異なる切断部位の図式的概要を示す図である。 ＦａｂおよびＦｃフラグメントを生じる、ＳｐｅＢ（Ｆｐｎ−１）によるヒトＩｇＧ切断の図式的概要を示す図である。ヒンジ領域における新規のＳｐｅＢ切断部位も示す。 アバスチン、ハーセプチン、およびアドセトリス抗体由来のペプチドのヒンジ領域を重ね合せたＲＰクロマトグラムを示す図である。 アバスチン、ハーセプチン、およびアドセトリス抗体由来のペプチドのヒンジ領域を重ね合せたＲＰクロマトグラムを示す図である。図４Ｂでは、対照の合成ヒンジペプチドを加えている。 [配列の簡単な説明]

配列番号１は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＳｐｅＢのアミノ酸配列である。
配列番号２は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳをコードするアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＳｐｅＢおよびＩｄｅＳによる例示的ＩｇＧ分子（ハーセプチン）の切断により生じるペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４は、例示的ＩｇＧ分子（ハーセプチン）のヒンジ領域の一部のアミノ酸配列である。（図２に示すように）この配列はＳｐｅＢ（Ｆｐｎ−１）およびＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）の切断部位を含む。
配列番号５は、Ｍｅｔ Ａｌａ Ｎ末端をＳｐｅＢ配列に含む、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＳｐｅＢのアミノ酸配列である。
配列番号６は、推定シグナル配列を含む、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳをコードするアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＳｐｅＢおよびＩｄｅＳにより認識されるヒンジ領域を含む、例示的ＩｇＧ分子（ハーセプチン）の抗ＨＥＲ２重鎖１のアミノ酸配列である。

開示される方法および産物の様々な適用を、当技術分野における特定の必要性に合わせることが可能であることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定的であることを意図されないことも理解されるべきである。さらに、この明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示されない限り、複数形の対象を含む。したがって、例えば「ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」への言及は２つ以上のそのような免疫グロブリンなどを含む。これ以前であれ以降であれ、本明細書で引用される全ての出版物、特許および特許出願は、その全体にわたって、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、免疫グロブリン分子試料を分析する方法であって、試料を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと接触させるステップを含む、方法を提供する。試料は典型的には少なくとも１つのＩｇＧ分子を含み、方法は典型的にはエクスビボで、好ましくはインビトロで実施される。

第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは酵素であり、具体的にはＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧを重鎖のヒンジ領域において切断するシステインプロテアーゼ酵素である。第１および第２のポリペプチドは、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域において異なる切断部位を標的とする。したがって、免疫グロブリン分子試料を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと接触させることで多様なサイズの分子の混合物が生じ、これを分析して元の試料についての情報を得ることができる。混合物は特に、第１のポリペプチドの切断部位と第２のポリペプチドの切断部位との間にある、ＩｇＧの重鎖のヒンジ領域由来の短鎖ペプチドを含む。本発明の方法は、典型的にはこの短鎖ペプチドの有無、および／または量を決定する。本発明の方法はさらに、例えば翻訳後修飾および／または治療薬などの結合部分の有無を決定するために、短鎖ペプチドを分析することも可能である。

第１のポリペプチドは、典型的にはＳｐｅＢポリペプチド、好ましくは化膿レンサ球菌（S. pyogenes）由来のＳｐｅＢポリペプチドである。第１のポリペプチドは、好ましくはパパインではない。第１のポリペプチドは、他の生物、例えば他のレンサ球菌属（Streptococcus）の細菌、例えばサーモフィラス菌（Streptococcus thermophilius）由来のＳｐｅＢポリペプチドであってもよい。第１のポリペプチドは、好ましくは配列番号１または５に示すアミノ酸配列を含むまたはからなる。

第１のポリペプチドは、ＩｇＧのヒンジ領域をＫａｂａｔナンバリングシステムによる２３８および２３９位（ＥＵナンバリングシステムによる２２５および２２６位）の間で切断する。実施例の方法により、ＳｐｅＢは配列番号７（ハーセプチンの抗ＨＥＲ２重鎖１）のアミノ酸番号２２９および２３０の間を切断する。ＳｐｅＢポリペプチドは任意の好適な手段により得られる。例えば、それを発現する任意の好適な生物、例えば化膿レンサ球菌（S. pyogenes）細菌などからそれを単離可能である。ＳｐｅＢポリペプチドは市販されている。

第２のポリペプチドは、典型的にはＩｄｅＳポリペプチド、好ましくは化膿レンサ球菌（S. pyogenes）由来のＩｄｅＳポリペプチドである。第２のポリペプチドは、他の生物、例えば他のレンサ球菌属（Streptococcus）の細菌由来のＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。レンサ球菌属（Streptococcus）は、好ましくは群Ａレンサ球菌属（Streptococcus）、群Ｃレンサ球菌属（Streptococcus）、または群Ｇレンサ球菌属（Streptococcus）である。具体的には、第２のポリペプチドは群Ｃレンサ球菌属（Streptococcus）、例えばＳ・エクイ（S. equii）またはＳ・ズーエピデミクス（S. zooepidemicus）由来のＩｄｅＳポリペプチドであってもよい。代わりに、第２のポリペプチドはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来であってもよい。第２のポリペプチドは、好ましくは配列番号２または６に示すアミノ酸配列を含むまたはからなる。

第２のポリペプチドは、ＩｇＧのヒンジ領域をＫａｂａｔナンバリングシステムによる２４９および２５０位（ＥＵナンバリングシステムによる２３６および２３７位）の間で切断する。実施例の方法により、ＩｄｅＳは配列番号７（ハーセプチンの抗ＨＥＲ２重鎖１）のアミノ酸番号２４０および２４１の間を切断する。ＩｄｅＳポリペプチドは任意の好適な手段により得られる。例えば、それを発現する任意の好適な生物、例えば化膿レンサ球菌（S. pyogenes）細菌などからそれを単離可能である。ＩｄｅＳポリペプチドは市販されている。

第１および第２のポリペプチドの異なる切断部位を説明するため、例示的ＩｇＧ分子（ハーセプチン）のヒンジ領域から取られた配列を以下に示す。第１のポリペプチドは、２つのイタリック体で下線を引いた残基の間を切断する。第２のポリペプチドは、２つの太字で下線を引いた残基の間を切断する。

この配列を含むＩｇＧ分子を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドで切断することによって、新規の短鎖ペプチドが生じる。前記ペプチドはＫａｂａｔナンバリングシステムによるヒンジ領域の２３９〜２４９の残基（ＥＵナンバリングによる２２６〜２３６の残基）に対応する。前記ペプチドは、典型的には約１０９６Ｄａ（最も近いＤａ）の分子量を有し、典型的には配列ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３）からなっていてよい。前述から理解されるであろうが、短鎖ペプチドの分子量は、２３９〜２４９の残基（Ｋａｂａｔナンバリング）のいずれか１つに結合した他の部分（例えば治療薬など）の存在、またはそれらの残基のいずれか１つの翻訳後修飾（例えばグリコシル化）により変化するであろう。第１および第２のポリペプチドの切断部位を図２でさらに説明する。

本発明の方法のために、第１のポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、それらの各変異体またはフラグメントが元のポリペプチドの機能特性を維持しているという条件で、前記変異体またはフラグメントで置き換えることができる。具体的には、第１のポリペプチドの変異体またはフラグメントはＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を維持し、第１のポリペプチドと同一部位でＩｇＧを切断しなければならない。第２のポリペプチドの変異体またはフラグメントはＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を維持し、第２のポリペプチドと同一部位でＩｇＧを切断しなければならない。

任意のポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、好適なアッセイを用いて決定可能である。例えば、試験ポリペプチドを好適な温度、例えば３７℃でＩｇＧとともにインキュベートすることが可能である。次いで出発物質および反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、望ましいＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定することが可能である。切断産物にＮ−末端シークエンシングを行い、切断がＩｇＧのヒンジ領域において起こったことを検証することが可能である。ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害研究によりさらに特性評価することが可能である。好ましくは、活性は、ともにプロテアーゼ阻害剤である、ペプチド誘導体Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ_２および／またはヨード酢酸により阻害される。しかし、第２のポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）については、活性は一般的にＥ６４により阻害されない。

ポリペプチドの特定の切断部位の維持についても、任意の好適な手段により決定することが可能である。例えばそれを、ポリペプチドによるＩｇＧの切断から生じるフラグメントを、切断部位があらかじめ確認されているポリペプチドによるＩｇＧの切断から生じるフラグメントと比較することにより決定することが可能である。例えば、第１のポリペプチドの変異体またはフラグメントは、配列番号１または５のポリペプチドと同一のフラグメントを生じなければならない。第２のポリペプチドの変異体またはフラグメントは、配列番号２または６のポリペプチドと同一のフラグメントを生じなければならない。

第１のポリペプチドの変異体は、配列番号１または５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含んでいてよい。配列番号１または５の変異体の同一性を、配列番号１もしくは５に示す配列の少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００個以上の連続するアミノ酸の領域、またはより好ましくは配列番号１もしくは５の全長にかけて測定することが可能である。

第２のポリペプチドの変異体は、配列番号２または６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含んでいてよい。配列番号２または６の変異体の同一性を、配列番号２もしくは６に示す配列の少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００個以上の連続するアミノ酸の領域、またはより好ましくは配列番号２もしくは６の全長にかけて測定することが可能である。

アミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して算出可能である。例えば、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、同一性を算出するまたは配列を並べる（例えば（典型的にはそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定する）ために使用可能である。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さの文字列とアラインメントさせた場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致または満たす、検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接文字列スコア閾値とも称される（Altschul et al、上記を参照）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、ＨＳＰを含む文字列を探し出すための探査を開始するためのシーズとして作用する。文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。各方向への文字列ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘ減少した場合、１つもしくは複数の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが０もしくはそれ未満となった場合、またはいずれかの配列の端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは文字列長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両ストランドの比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性について統計的分析を行う。例えばKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの基準が、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列を第２の配列と比較した際に、最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は他の配列と類似していると考えられる。代わりに、ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、そのデフォルト設定で使用される）、同一性を算出するために使用可能なＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。

変異体は対立遺伝子変異体、およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸群の置換、欠失または挿入を含みうる。変異体配列は、元の配列と比較した場合に少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０以上の（アミノ酸の置換、欠失または挿入でありうる）突然変異において異なっていてよい。例えば、１〜５０、２〜３０、３〜２０、または５〜１０のアミノ酸置換、欠失または挿入がなされてよい。置換変異体は、好ましくは１つまたは複数のアミノ酸を同一数のアミノ酸で置き換え、保存されたアミノ酸置換を作り出すことを含む。例えば、アミノ酸は類似の特性を有する代替のアミノ酸、例えば他の塩基性アミノ酸、他の酸性アミノ酸、他の中性アミノ酸、他の荷電アミノ酸、他の親水性アミノ酸、他の疎水性アミノ酸、他の極性アミノ酸、他の芳香族アミノ酸、または他の脂肪族アミノ酸などで置換することが可能である。好適な置換体を選択するために使用可能な、２０個の主要アミノ酸の一部の特性は以下の通りである。

第１のポリペプチドのフラグメントは、典型的には配列番号１または５の１００以下、１５０、２００、２５０、３００または３５０個の連続するアミノ酸からなる。第２のポリペプチドのフラグメントは、典型的には配列番号２または６の１００以下、１５０、２００、２５０、３００または３５０個の連続するアミノ酸からなる。

本明細書に記載される任意のポリペプチド、変異体またはフラグメントのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように、および／または化合物の安定性を増大させるように改変されうる。ポリペプチドが合成手段によって生産される場合、このようなアミノ酸は生産中に導入されうる。ポリペプチドは合成または組換え生産後にも改質されうる。本明細書に記載されるポリペプチド、変異体またはフラグメントはＤ−アミノ酸を使用して生産されうる。このような場合、アミノ酸はＣからＮの向きに逆の配列に連結するであろう。これは、このようなポリペプチドを生産するための、当技術分野における慣行である。いくつかの側鎖修飾が当技術分野において知られており、ポリペプチド、変異体またはフラグメントの側鎖になされてよく、それらが、本明細書に記述されうる、任意のさらに求められる活性または特性を維持しやすくなる。ポリペプチド、変異体またはフラグメントが化学的に修飾、例えば翻訳後に修飾されうることも理解されるであろう。例えば、それらはグリコシル化、リン酸化されているか、または修飾されたアミノ酸残基を含みうる。

本発明の方法において使用される、免疫グロブリンを含む試料は、少なくとも１つのＩｇＧ分子を含むという条件で、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、および／またはＩｇＷなどの免疫グロブリン分子を含みうる。前記ＩｇＧは任意の種、例えばヒト、サル、ウサギ、ヒツジ、またはマウス由来であってよいが、好ましくはヒト由来である。前記ＩｇＧはヒト化されていてもキメラでもよい。ＩｇＧはマウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ３であってよい。好ましくは、ＩｇＧはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

免疫グロブリン分子を含む任意の好適な試料が、本発明の方法において使用可能である。試料は、典型的には流体である。例えば、試料は血液、血清または唾液試料であってよい。代わりに、試料は合成的に生産された免疫グロブリンのバッチから取られてもよく、または患者に投与するために、医薬担体または賦形剤とともに製剤化されてもよい。このように、試料は任意の治療用モノクローナル抗体または抗体薬物複合体を含んでいてよい。例えば、試料はアバスチン、ハーセプチン、またはアドセトリスの分子を含んでいてよい。

試料は、好ましくは治療薬に結合した少なくとも１つのヒトＩｇＧ分子を含む。好ましくは、ヒトＩｇＧ分子はシステイン残基のチオール基を介して治療薬に結合する。好ましくは、システイン残基はヒトＩｇＧ分子のヒンジ領域、最も好ましくは２３９および２４９の残基（Ｋａｂａｔナンバリングシステム）の間にある。好ましくは、治療薬は細胞毒である。好適な毒素はアウリスタチン、カリケアミシン、ＣＣ−１０６５、ドキソルビシン、メイタンシノイド、メトトレキサート、およびビンカアルカロイドを含む。

本発明の方法は、以下のステップを含みうる：
（ａ）試料を第１のポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）生じた混合物からＦｃフラグメントを単離するステップ、
（ｃ）単離されたＦｃフラグメントを第２のポリペプチドと接触させるステップ、および
（ｄ）生じた混合物を分析するステップ。

ステップ（ａ）は、第１のポリペプチドによる、試料中の免疫グロブリン分子の切断を可能にする任意の条件下で行われうる。好適な条件は実施例に記載される。典型的には、任意の標準緩衝液がｐＨ６．５〜８．０で使用される。標準緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス、炭酸水素アンモニウム、ＭＥＳ、ＨＥＰＥｓ、および酢酸ナトリウムを含む。典型的には、試料は少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、好ましくは少なくとも６０分間、第１のポリペプチドとともにインキュベートされる。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、または４５℃で、最も好ましくは約３７℃で行われる。典型的には、酵素：抗体比は約１：５０（ｗ：ｖ）である。典型的には、還元剤、例えばヨードアセトアミド、ＤＴＴ、またはＴＣＥＰが使用される。

ステップ（ｂ）におけるＦｃフラグメントの分離は、任意の好適な方法を使用して行われうる。例えば、Ｆｃフラグメントは、アフィニティ分離、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、または透析により、生じた混合物から分離されうる。典型的には、混合物は好適なＦｃ結合剤と接触されうる。ステップ（ａ）から生じた混合物はヒトＩｇＧ Ｆｃ結合樹脂にアプライされてよく、樹脂に結合しないＦｃフラグメント以外の成分（例えば、Ｆａｂフラグメント、還元剤、およびＳｐｅＢなど）は溶出されうる。Ｆｃ結合剤、例えばヒトＩｇＧ Ｆｃ結合樹脂などは市販されている。

ステップ（ｃ）は、第２のポリペプチドによるＦｃフラグメントの切断を可能にする任意の条件下で行われうる。好適な条件は実施例に記載される。典型的には、任意の標準緩衝液が上記のように使用される。典型的には、試料は少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、好ましくは少なくとも６０分間、ＩｄｅＳポリペプチドとともにインキュベートされる。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、または４５℃で、最も好ましくは約３７℃で行われる。典型的には、酵素：抗体比は約１：５０（ｗ：ｖ）である。典型的には、還元剤は使用されない。

ステップ（ｃ）は場合によって、任意の好適な方法に従って、例えばステップ（ｃ）から生じた混合物をヒトＩｇＧ Ｆｃ結合樹脂にアプライすることにより、Ｆｃフラグメントを除去するステップをさらに含みうる。Ｆｃフラグメントは維持され、他の分子（例えば、第２のポリペプチドおよび１０９６Ｄａペプチドを含む）は溶出され、次いで単離されうる。

方法は、代わりに以下のステップを含みうる：
（ａ）試料を第２のポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）生じた混合物からＦａｂフラグメントを単離するステップ、
（ｃ）単離されたＦａｂフラグメントを第１のポリペプチドと接触させるステップ、および
（ｄ）生じた混合物を分析するステップ。

ステップ（ａ）は、第２のポリペプチドによる、試料中の免疫グロブリン分子の切断を可能にする任意の条件下で行われうる。好適な条件は上記の通りである。

ステップ（ｂ）におけるＦａｂフラグメントの分離は、任意の好適な方法を使用して行われうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、Ｆｃフラグメントを分離するための上記方法を使用して、生じた混合物から分離されうる。典型的には、任意の好適なＦａｂ結合剤が使用されうる。

ステップ（ｃ）は、第１のポリペプチドによるＦａｂフラグメントの切断を可能にする任意の条件下で行われうる。好適な条件は、第１のポリペプチドによる免疫グロブリン全体の切断について上記の通りである。

ステップ（ｃ）は場合によって、任意の好適な方法に従って、例えばステップ（ｃ）から生じた混合物を好適なＦａｂ結合剤にアプライすることにより、Ｆａｂフラグメントを除去するステップをさらに含みうる。Ｆａｂフラグメントは維持され、他の分子（例えば、第１のポリペプチドおよび１０９６Ｄａペプチドを含む）は溶出され、次いで単離されうる。

方法は、代わりに以下のステップを含みうる：
（ａ）試料を第１および第２のポリペプチドの両方と接触させるステップ、ならびに
（ｂ）生じた混合物を分析するステップ。

ステップ（ａ）は、第１および第２のポリペプチドによる、試料中の免疫グロブリンの切断を可能にする条件下で行われる。好適な条件は上記の通りである。

上記の先行するステップに関係なく、生じた最終混合物を分析するステップにおいて任意の好適な方法が使用されうる。典型的には、生じた混合物を分析するステップは、少なくとも１つの分子の分子量を、好ましくはＨＰＬＣおよび／または質量分析を使用して決定するステップを含む。

生じた混合物の分析は、
（ａ）治療薬が結合している試料中の免疫グロブリン分子の割合、および／または
（ｂ）治療薬：免疫グロブリン分子の比、および／または
（ｃ）翻訳後修飾の有無
を決定するために実施されうる。

治療薬が結合している試料中の免疫グロブリン分子の割合、および／または治療薬：免疫グロブリン分子の比を決定することは、関心部位に輸送されうる治療薬の量を決定する一助となり、試料の安全性および有効性の両方に直接影響しうる。典型的な方法は、ＵＶ／ＶＩＳ、ＵＶ／ＭＡＬＤＩ、および／またはＵＶ／ＤＡＲ分光法、ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析を含む。

生じた混合物は、典型的には約１０９６Ｄａの分子量を有するペプチドの有無および／または量について分析されうる。上で説明され、実施例で示されるように、本発明の方法によるヒトＩｇＧの切断によって、典型的にはこのようなペプチドが生じるであろう。

特定の実施形態（「オフライン」特性評価と称する）において、混合物はＨＰＬＣのみを使用して分析される。この実施形態は、典型的には免疫グロブリンまたは抗体薬物複合体があらかじめ（例えばＨＰＬＣおよび質量分析の両方によって）完全に特性評価されている場合に使用される。これは、ＨＰＬＣクロマトグラムにおける各ピークが既に分かっており、高度に精密かつ正確に定義されうるためである。このような場合、ピークが予測された位置に現れると、試料はあらかじめ特性評価された試料と一致すると考えられうる。そうでなければ、何が異なるのかを決定するために、試料のさらなる分析が必要となりうる。例えば、試料をさらに特性評価するために、質量分析が使用可能である。この実施形態は、同一の抗体が定常的に大量生産され、定期的に試料が品質管理目的で試験される場合に特に有用でありうる。

翻訳後修飾、例えばピログルタミン酸形成、酸化、脱アミド、異性化、糖化、ジスルフィドシャッフリング、ペプチド結合切断、および架橋などの有無を決定するための典型的な方法は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリー液体クロマトグラフィー（ＣＬＣ）、ＵＶ吸光度、およびレーザー誘起蛍光法（ＬＩＦ）を含む。

本発明は、配列番号３の配列、または好ましくは配列の２〜１０位以内のみに１つもしくは２つの保存された改変を含む前記配列の変異体を有する、単離されたペプチドも提供する。ペプチドは、本発明の第１および第２のポリペプチドにより、免疫グロブリンを含む試料を処理することで生産されうる。本発明は、上で定義される、任意の治療薬に結合した前記ペプチドをさらに提供する。

本発明は、本発明の第１および第２のポリペプチドを含むキットも提供する。前記キットは、本発明の方法において使用可能である。

以下の実施例で本発明を説明する。

ヒトＩｇＧに対するＳｐｅＢ活性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析を使用して検証されてきた。ＳｐｅＢの切断部位が予想に反して、以前に報告されたものとは異なることが判明している。

ヒトモノクローナルＩｇＧ（ハーセプチン）を、ＩｄｅＳ、ＳｐｅＢ、または両方の酵素の組み合わせとともにインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１）は、以前の報告に反して、切断部位が両方の酵素について同一ではないことを示している。ＩｄｅＳおよびＳｐｅＢ単独と比較した場合の、ＩｄｅＳおよびＳｐｅＢの組み合わせについての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された質量シフトは、切断部位が異なることを示している。これは、（続いて反応に添加された）ＩｄｅＳがＳｐｅＢにより生じたフラグメントを切断できることも示している。

ＩｄｅＳおよびＳｐｅＢの切断部位をさらに研究するために、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）を、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を検証するため、および切断部位の詳細を明らかにするために使用した。ＬＣ／ＭＳ分析の結果は図２にまとめられており、ＳｐｅＢおよびＩｄｅＳについての異なる切断部位を裏付けている。ＳｐｅＢの図式的概要を図３に示す。

ヒンジ領域ペプチドＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３に示す）を、抗体試料から調製した。

抗体試料（アバスチン、ハーセプチン、およびアドセトリス）のＦｃフラグメントを、まずＨｉｓタグを付けた組換えＳｐｅＢ酵素（Ｆｐｎ−１とも称する）を使用して単離した。この切断反応を、３７℃で１時間、酵素：抗体比１：５０（ｗ：ｗ）および１〜５ｍＭの還元剤ＤＴＴまたはＴＣＥＰを使用して、ｐＨ６．５〜８．０の標準緩衝液中で行った。切断が完了した後、反応全体由来の物質がＣａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＧ Ｆｃ樹脂にアプライされ、Ｆａｂフラグメント、還元剤、およびＩｄｅＳ酵素を除かれて溶出された。

溶出されたＦｃを、Ｆｐｎ−１についての上記の通り、ただし還元剤無しの反応において、Ｈｉｓタグを付けた組換えＩｄｅＳ酵素（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲとも称する）により切断した。これにより、結果としてヒンジ領域ペプチド（約１０９６Ｄａ）およびヒンジ領域ペプチドを欠いたＦｃフラグメントが得られた。ヒンジ領域ペプチドをさらに単離するため、Ｆｃを結合するように作用し、流出画分中にＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ酵素とともに１０９６Ｄａペプチドを残す、Ｃａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＧ Ｆｃを再度使用した。

ペプチドＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ画分を、２１５ｎｍ検出で、Ｚｏｒｂａｘ ＲＲＨＤ ３００ＳＢ−Ｃ１８逆相カラムを使用するＵＨＰＬＣシステムにより分析した。合成１０９６Ｄａヒンジ領域ペプチドを方法対照として使用した。

図４Ａのクロマトグラムは、アドセトリス、アバスチン、およびハーセプチンの製剤由来の１０９６Ｄａペプチドを示す。図４Ｂのクロマトグラムは、合成ペプチドも示す。アドセトリスは、ヒンジ領域にも結合部位を有する抗体薬物複合体である。この製剤は、ＴＣＥＰによる還元後、ヒンジ領域の結合変異体として同定される、２つのさらなるピークにより際立っている。
配列表

Claims (18)

1. 免疫グロブリン分子試料を分析する方法であって、前記試料を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと接触させるステップ、ならびに生じた混合物を分析するステップを含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ヒトＩｇＧのヒンジ領域において異なる標的部位をそれぞれ切断するシステインプロテアーゼ酵素である、方法。
2. 前記第１のポリペプチドが、ＩｇＧの前記ヒンジ領域をＫａｂａｔナンバリングシステムによる２３８および２３９位（ＥＵナンバリングシステムによる２２５および２２６位）の間で切断する、および／または前記第２のポリペプチドが、ＩｇＧの前記ヒンジ領域をＫａｂａｔナンバリングシステムによる２４９および２５０位（ＥＵナンバリングシステムによる２３６および２３７位）の間で切断する、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含むまたはからなり、前記第２のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列、またはその変異体もしくはフラグメントを含むまたはからなる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記配列の変異体が、前記配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記配列のフラグメントが、前記配列の最大３００個の連続するアミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記試料中の少なくとも１つの免疫グロブリン分子がＩｇＧ分子、好ましくはヒトＩｇＧ分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 少なくとも１つの前記ＩｇＧ分子が、治療薬と、好ましくは前記ＩｇＧ分子のシステイン残基のチオール基を介して結合する、請求項５に記載の方法。
7. 前記システイン残基が、前記ＩｇＧ分子の前記ヒンジ領域にある、請求項６に記載の方法。
8. 前記治療薬が細胞毒、好ましくはアウリスタチン、カリケアミシン、ＣＣ−１０６５、ドキソルビシン、メイタンシノイド、メトトレキサート、およびビンカアルカロイドから選択される、請求項６または７に記載の方法。
9. （ａ）前記試料を前記第１のポリペプチドと接触させるステップ、
   （ｂ）生じた混合物からＦｃフラグメントを単離するステップ、
   （ｃ）前記単離されたＦｃフラグメントを前記第２のポリペプチドと接触させるステップ、および
   （ｄ）生じた混合物を分析するステップ
   を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. （ａ）前記試料を前記第２のポリペプチドと接触させるステップ、
    （ｂ）生じた混合物からＦａｂフラグメントを単離するステップ、
    （ｃ）前記単離されたＦａｂフラグメントを前記第１のポリペプチドと接触させるステップ、および
    （ｄ）生じた混合物を分析するステップ
    を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
11. （ａ）前記試料を前記第１および前記第２のポリペプチドの両方と接触させるステップ、ならびに
    （ｂ）生じた混合物を分析するステップ
    を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記生じた混合物を分析するステップが、前記混合物中の少なくとも１つの分子の分子量を、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／または質量分析を使用して決定するステップを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記分析が、約１０９６Ｄａの分子量を有するペプチドの有無および／または量を決定するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ペプチドが、配列ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３）、または１つもしくは２つの保存された改変を含み、好ましくは前記改変が前記配列の２〜１０位内でのみ起こる前記配列の変異体からなる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記分析が、
    （ａ）治療薬が結合しているおよび／または結合していない、前記試料中の免疫グロブリン分子の割合、
    （ｂ）治療薬：免疫グロブリン分子の比、および／または
    （ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列の翻訳後修飾の有無
    を決定するために実施される、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. アミノ酸配列ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３）、または１つもしくは２つの保存された改変を含み、好ましくは前記改変が前記配列の２〜１０位内でのみ起こる前記配列の変異体からなるペプチドであって、場合によって前記ペプチドが治療薬に結合する、ペプチド。
17. 免疫グロブリンを含む試料を、請求項１で定義される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドと接触させることにより生産される、請求項１６に記載のペプチド。
18. 免疫グロブリン分子試料を分析する方法において使用するためのキットであって、請求項１で定義される第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む、キット。