KR20160079784A

KR20160079784A - 면역글로불린 분자 시료를 분석하는 방법

Info

Publication number: KR20160079784A
Application number: KR1020167010252A
Authority: KR
Inventors: 프레드릭 올슨; 마리아 노르드그렌; 말린 메자레; 사라 프레드릭슨
Original assignee: 게노비스 에이비
Priority date: 2013-09-20
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2016-07-06
Also published as: WO2015040125A1; CA2923704A1; AU2014323081A1; JP2016531546A; EP3047280A1; GB201316744D0; US20160231329A1; SG11201602138VA

Abstract

본 발명은 면역글로불린 시료를 분석하는 방법, 관련된 펩티드 및 그러한 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.

Description

면역글로불린 분자 시료를 분석하는 방법{A method for analysing a sample of immunoglobulin molecules}

본 발명은 면역글로불린 시료를 분석하는 방법, 관련된 펩티드 및 그러한 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

구조적 특징 및 이화학적 분석과 같은 항체의 특성은 항체 기반 치료법의 개발자와 생산자에게 필요하다. 질량분석기(Mass spectrometry , MS)는 치료용 단일클론 항체(monoclonal antibodies, MAbs)를 특징짓는 핵심적인 분석장치 중 하나이다. HPLC와 결합된 질량분석기는 이러한 큰 생체분자의 번역 후 변형(PTMs) 및 글리칸구조 뿐만 아니라 1차 구조 연구에 흔히 사용된다. 번역 후 변형(PTMs)과 함께 MAbs (150 kD)의 큰 크기는 이러한 생물학적 치료법의 분석적 특징을 도전적으로 만든다.

예를 들어, 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugates, ADC)는 치료제의 중요한 분야로, 치료제의 표적 전달을 달성하기 위해 단일클론 항체(mAbs)의 선택성을 활용한다. 항체-약물 접합체의 임상효능에서 중요한 것은 표적 부위-특이성과 항체의 결합 특성, 연결기(linker)와 치료제의 시험관 내 및 생체 내 안정성, 치료제의 효능 및 항체 상의 치료제의 평균 수와 분포이다. 따라서 항체-약물 접합체의 이화학적 특징을 이해하는 것과 제조 및 후속 보관 동안 항체-약물 접합체를 평가 및 관찰하기 위해 분석적이고 생물분석적인 기술을 개발하는 것이 중요하다.

연쇄상구균 발적 독소 B(Streptococcal erythrogenic toxin B, SpeB)는 스트렙토코커스 피오게네스균(Streptococcus pyogenes)으로부터의 시스테인 프로테아제(cystein protease)로서, 두 개의 안정한 단량체의 Fab 단편과 하나의 Fc 단편 내의 경첩부위(hinge region)에서 IgG를 절단하는 것을 보여준다. 특히, SpeB는 글리신 잔기 236과 237 사이에서 인간 IgG를 절단하는 것으로 보고되었다. 스트렙토코커스 피오게네스균(Streptococcus pyogenes)으로부터의 제2 시스테인 프로테아제, S. 피오게네스균의 면역글로불린 G-분해(degrading) 효소 (IdeS)는 SpeB로서 IgG에 대해 동일한 절단 부위를 갖는 것으로 보고되었다.

본 발명자들은 IgG에 관한 SpeB와 IdeS의 활성을 주의 깊게 조사하였고, SpeB가 사실상 IdeS의 경첩부위와는 다른 부위에서 IgG를 절단한다는 놀라운 발견을 하였다. 이 놀라운 발견에 나아가, 발명자들은 SpeB와 IdeS의 면역글로불린의 탠덤 절단이 이전에 가능하다고 생각했던 것보다 더 상세하게 면역글로불린 분자의 경첩부위 조사를 허용한다는 것을 알게 되었다. 이것은 경첩부위가 항체-약물 접합체에서 치료제의 결합을 위한 그리고 번역 후 변형을 위한 핵심적인 부위이기 때문에 중요하다. 따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:

시료를 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계; 및 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 면역글로불린 분자 시료의 분석 방법에 있어서, 여기서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 인간 IgG의 경첩부위(hinge region)에서 상이한 표적 부위를 각각 절단하는, 시스테인 프로테아제 효소인 것인, 방법;

아미노산 서열 CPPCPAPELLG (서열번호 3), 또는 하나 또는 두 개의 보존적인 변형을 포함하는 상기 서열의 변이체로 구성된 펩티드; 및

상기에서 정의된 바와 같은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하고, 면역글로불린 분자 시료의 분석 방법에 사용하기 위한 키트.

도 1A 및 1B는 IdeS (FabRICATOR) 단독, SpeB (Fpn-1) 및 IdeS 함께, 또는 SpeB 단독에 의한 인간 단일클론 IgG1 항체인 허셉틴(Herceptin) 절단에 따른 SDS-PAGE의 결과를 보여준다.
도 2는 질량분석기 (LC/MS)에 의해 측정된, 인간 단일클론 IgG1 (허셉틴)에 대한 SpeB (Fpn-1)와 IdeS의 다른 절단 부위의 개략도를 나타낸다.
도 3은 Fab와 Fc 단편을 발생시키는 SpeB (Fpn-1)에 의한 인간 IgG 절단의 개략도를 나타낸다. 또한, 새로운 SpeB에 의한 경첩 부위에서의 절단 부위를 나타낸다.
도 4A 및 4B는 아바스틴(avastin), 허셉틴(Herceptin)과 애드세트리스(Adcetris) 항체로부터 펩티드 경첩부위의 오버레이를 갖는 RP 크로마토그램을 나타낸다. 도 4B에서, 대조군 합성 경첩 펩티드가 첨가되었다.

염기서열의 간단한 설명

서열번호 1은 S. 피오게네스균 SpeB의 아미노산 서열이다.

서열번호 2는 S. 피오게네스균 AP1로부터 분리된 IdeS를 암호화하는 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 SpeB과 IdeS에 의해 예시적인 IgG 분자(허셉틴)의 절단의 결과인 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열번호 4는 예시적인 IgG 분자 (허셉틴)의 경첩부위 부분의 아미노산 서열이다. 이 서열은 SpeB (Fpn-1) 및 IdeS (FabRICATOR) 절단 부위를 포함한다 (도 2에서 나타난 바와 같음).

서열번호 5는 SpeB 서열에서 Met Ala N-말단을 포함하는 S. 피오게네스균 SpeB의 아미노산 서열이다.

서열번호 6은 추정 신호서열을 포함하는 S. 피오게네스균 AP1으로부터 분리된 IdeS를 암호화하는 아미노산 서열이다.

서열번호 7은 예시적인 IgG 분자 (허셉틴)의 항-HER2 중사슬의 아미노산 서열로, SpeB와 IdeS에 의해 인지되는 경첩부위를 포함한다.

개시된 방법과 생산물의 상이한 적용은 기술분야의 특정한 필요에 따라 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본 명세서에 사용한 용어는 오직 본 발명의 특정한 구현예들을 설명하기 위한 목적으로 이해되고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된, 단수 형태인 “a”, “an” 및 “the”는 만약 분명하게 지시하고 있지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, “an 면역글로불린”의 대상은 두 개 또는 그 이상의 면역글로불린 및 유사체를 포함한다. 위쪽 또는 아래쪽에 본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원은 그것의 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 시료를 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드와 접촉하는 것을 포함하는 면역글로불린 분자 시료의 분석 방법을 제공한다. 상기 시료는 통상적으로 적어도 하나의 IgG 분자를 포함하고, 상기 방법은 생체 외에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 시험관 내에서 수행할 수 있다.

상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 효소이고, 명확하게는 시스테인 프로테아제 효소이며, 그것은 중사슬의 경첩부위에서 IgG, 바람직하게는 인간 IgG를 절단한다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 IgG의 중사슬의 경첩부위에서 상이한 절단 부위를 표적으로 한다. 따라서, 면역글로불린 분자 시료를 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드에 접촉시키는 단계는 다양한 크기의 분자 혼합물의 결과를 초래하고, 원래 시료에 관한 정보를 제공하도록 분석될 수 있다. 상기 혼합물은 특히 제1 폴리펩티드의 절단 부위와 제 2폴리펩티드의 절단 부위 사이에 있는 IgG 중사슬의 경첩부위로부터의 짧은 펩티드를 포함한다. 본 발명의 방법은 통상적으로 상기 짧은 펩티드의 존재, 부존재 및/또는 양을 측정한다. 본 발명의 방법은 또한 상기 짧은 펩티드를 분석할 수 있고, 예를 들어, 번역 후 변형 및/또는 치료제와 같은 결합된 부분의 존재 또는 부존재를 측정한다.

상기 제1 폴리펩티드는 통상적으로 SpeB 폴리펩티드이고, 바람직하게는 S. 피오게네스균로부터의 SpeB 폴리펩티드이다. 상기 제 1폴리펩티드는 바람직하게는 파파인(papain)이 아니다. 상기 제 1폴리펩티드는 다른 스트렙토코커스(Streptococcus) 박테리아, 예를 들어, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilius)와 같은 또 다른 생명체로부터의 SpeB 폴리펩티드일 수 있다. 상기 제1 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1 또는 5에 설명된 아미노산 서열로 구성되거나 포함할 수 있다.

상기 제1 폴리펩티드는 카바트 넘버링 시스템에 따른 위치 238과 239 (EU 넘버링 시스템에 따른 위치 225와 226) 사이의 IgG의 경첩부위(hinge region)를 절단한다. 예로써, SpeB는 서열번호 7 (허셉틴의 항-HER2 중사슬 1)의 아미노산 넘버 229와 230 사이를 절단한다. SpeB 폴리펩티드는 임의의 적절한 수단으로 얻을 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스균 박테리아와 같은 SpeB를 발현하는 임의의 적절한 생명체로부터 분리될 수 있다. SpeB 폴리펩티드는 상업적으로 이용가능하다.

상기 제2 폴리펩티드는 통상적으로 IdeS 폴리펩티드이고, 바람직하게는 S. 피오게네스균로부터의 IdeS 폴리펩티드이다. 상기 제 2폴리펩티드는 다른 스트렙토코커스 박테리아와 같은 또 다른 생명체로부터의 IdeS 폴리펩티드일 수 있다. 스트렙토코커스는 바람직하게는 그룹A 스트렙토코커스, 그룹C 스트렙토코커스 또는 그룹G 스트렙토코커스이다. 특히 제2 폴리펩티드는 말 연쇄상구균(S. equii) 또는 S. 주에피데미커스(S. zooepidemicus)와 같은 그룹C 스트렙토코커스로부터의 IdeS 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로, 상기 제2 폴리펩티드는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 얻어질 수 있다. 제2 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 2 또는 6에 설명된 아미노산 서열로 구성되거나 포함할 수 있다.

상기 제2 폴리펩티드는 카바트 넘버링 시스템에 따른 위치 249와 250 (EU 넘버링 시스템에 따른 위치 236과 237) 사이의 IgG의 경첩부위(hinge region)를 절단한다. 예로써, IdeS는 서열번호 7 (허셉틴의 항-HER2 중사슬 1)의 아미노산 넘버 240과 241 사이를 절단한다. IdeS 폴리펩티드는 임의의 적절한 수단으로 얻을 수 있다. 예를 들어, S. 피오게네스균 박테리아와 같은 IdeS를 발현하는 임의의 적절한 생명체로부터 분리될 수 있다. IdeS 폴리펩티드는 상업적으로 이용 가능하다.

예시적인 IgG 분자 (허셉틴)의 경첩부위로부터 가져온 서열은 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각 상이한 절단 부위를 하기에 설명하기 위해 나타낸다. 제1 폴리펩티드는 두 개의 이탤릭체에 밑줄 표시된 잔기 사이를 절단한다. 제2 폴리펩티드는 두 개의 볼드체에 밑줄 표시된 잔기 사이를 절단한다.

KTH TC PPCPAPELL GG PSVF (서열번호 4)

제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 의한 이 서열을 포함하는 IgG 분자의 절단은 새로운 짧은 펩티드를 생성한다. 상기 펩티드는 카바트 넘버링 시스템에 따른 경첩위치의 잔기 239 내지 249 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 226 내지 236)에 해당한다. 상기 펩티드는 통상적으로 대략 1096 Da의 분자량(가장 근접한 Da)을 가지고, 통상적으로 서열 CPPCPAPELLG (서열번호 3)로 구성될 수 있다. 예상되는 바와 같이, 짧은 펩티드의 분자량은 잔기 239 내지 249(카바트 넘버링) 위치의 임의의 하나에 결합된 또 다른 부분 (치료제와 같은)의 존재, 또는 그것의 잔기 중에 임의의 하나에 번역 후 변형 (글리오실레이션(glyosylation)과 같은)에 의해 바뀔 수 있다. 또한, 제1 및 제2 폴리펩티드의 절단 부위를 도 2에 나타내었다.

본 발명의 방법을 위해 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드는 각각의 변이체 또는 단편으로 대체될 수 있는 것으로, 제공된 상기 변이체 또는 단편은 본래 폴리펩티드의 기능적 특성을 보유한다. 특히, 상기 제1 폴리펩티드의 변이체 또는 단편은 IgG 시스테인 프로테아제의 활성을 가지고 제1 폴리펩티드와 같은 부위에서 IgG를 절단한다. 상기 제2 폴리펩티드의 변이체 또는 단편은 IgG 시스테인 프로테아제의 활성을 가지고 제2 폴리펩티드와 같은 부위에서 IgG를 절단한다.

임의의 폴리펩티드의 시스테인 프로테아제 활성은 적절한 분석법의 도움으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 시험 폴리펩티드는 37 ℃와 같이 적절한 온도에서 IgG와 함께 배양될 수 있다. 그 후에, 시작물질과 반응 생성물은 원하는 IgG 절단 생성물이 존재하는지 판단하기 위해 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다. 절단이 IgG의 경첩부위에서 발생했는지를 확인하기 위해, 절단 생성물이 N-말단 시퀀싱의 대상이 될 수 있다. 폴리펩티드의 시스테인 프로테아제 활성은 억제 연구에 의해 더 특성화 될 수 있다. 바람직하게는, 활성은 프로테아제 억제제인 펩티드 유도체 Z-LVG-CHN₂ 및/또는 요오드 아세트산에 의해 억제된다. 그러나 제2 폴리펩티드 (또는 변이체 또는 이의 단편)에 대하여 활성은 일반적으로 E64에 의해 억제되지 않는다.

폴리펩티드의 특정한 절단부위의 유지는 또한 임의의 적절한 수단에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드로 IgG를 절단한 결과인 단편과 절단부위를 이전에 확인한 폴리펩티드가 IgG를 절단한 결과인 단편을 비교함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드의 변이체 또는 단편은 서열번호 1 또는 5의 폴리펩티드와 동일한 단편을 생성해야 한다. 제2 폴리펩티드의 변이체 또는 단편은 서열번호 2 또는 6의 폴리펩티드와 동일한 단편을 생성해야 한다.

제1 폴리펩티드의 변이체들은 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 이상 서열번호 1 또는 5와 상동성을 가진 폴리펩티드를 포함할 것이다. 서열번호 1 또는 5의 변이체의 상동성은 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300 또는 그 이상의 서열번호 1 또는 5에서 나타난 서열의 연속적인 아미노산의 영역에 대해 측정될 수 있고, 더 바람직하게는 서열번호 1 또는 5의 전체 길이에 대해 측정될 수 있다.

제2 폴리펩티드의 변이체들은 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 이상 서열번호 2 또는 6과 상동성을 가진 폴리펩티드를 포함할 것이다. 서열번호 2 또는 6의 변이체의 상동성은 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300 또는 그 이상의 서열번호 2 또는 6에서 나타난 서열의 연속적인 아미노산의 영역에 대해 측정될 수 있고, 더 바람직하게는 서열번호 2 또는 6의 전체 길이에 대해 측정될 수 있다.

아미노산의 상동성은 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10에서 설명된 것처럼, 예를 들어, PILEUP과 BLAST 알고리즘은 상동성을 계산하거나 염기서열을 배열하는데 사용될 수 있다 (동등하거나 상응하는 염기서열을 식별하는 것 같은 (일반적으로 그것의 기본설정 상에서)). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information에서 공개적으로 이용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 같은 길이의 글자를 정렬했을 때, 일부 양성수치 임계값 T에 맞거나 만족하는 요청한(쿼리) 서열 내에서 길이 W의 짧은 글자를 식별하여 높은 점수 서열쌍(high scoring sequence pair, HSPs)을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃한 글자의 임계값으로 불린다 (Altschul et al, supra). 이러한 초기의 이웃 단어 발단은 그것들을 포함하는 HSPs를 찾기 위한 초기 조사의 시발점으로 작용한다. 상기 단어의 발단은 누적 정렬점수가 증가될 수 있을 때까지 각 서열의 양방향으로 연장된다. 각 방향에서 단어 발단의 연장은 이 때 중지된다: 누적 정렬 점수가 그것의 최대 달성 값으로부터 양 X에 의해 떨어지기 시작했을 때; 누적 점수가 하나 또는 그 이상의 음-점수 잔류 정렬의 누적때문에 0 또는 그 아래로 갈때; 또는 각 서열의 끝에 도달했을 때. BLAST 알고리즘 계수인 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 단어길이 (W)를 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (참조 Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) 정렬 (B)를 50, 기대 (E)를 10, M=5, N=4, 그리고 양 가닥의 비교를 기본값으로 사용한다.

BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다; 참고문헌, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한가지 측정은 최소 합계 확률 (P(N))로서, 이는 우연히 발생하는 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간에 일치할 확률 지표이다. 예를 들어, 만약 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 비교한 최소 합계 확률이 약 1보다 작거나, 바람직하게는 약 0.1보다 작거나, 더 바람직하게는 약 0.01보다 작거나 가장 바람직하게는 0.001보다 작은 경우에 한 서열이 또 다른 서열과 유사한 것으로 여겨진다. 대안적으로 UWGCG 패키지는 상동성을 계산하는데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램(예를 들어, 그것의 기본설정에 사용하는)을 제공한다 (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).

변이체들은 대립유전자 변이체와 단백질 서열 내의 단일의 아미노산 또는 아미노산 그룹의 대체, 결실 또는 삽입을 포함한다. 변이된 염기서열은 본래의 염기서열과 비교했을 때, 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 또는 그 이상의 돌연변이(아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이 될 수 있는)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 1 내지 50, 2 내지 30, 3 내지 20, 5 내지 10의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입이 만들어질 수 있다. 치환 변이체는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 같은 수의 아미노산으로 교체되고, 보존적인 아미노산 치환이 이루어진 것을 포함한다. 예를 들어, 하나의 아미노산이 비슷한 특성을 가진 대안적인 아미노산, 예컨대 또 다른 염기성의 아미노산, 또 다른 산성의 아미노산, 또 다른 중성의 아미노산, 또 다른 전하를 가지는 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성의 아미노산, 또 다른 방향성 아미노산, 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적절한 치환을 선택하는데 사용될 수 있는 20가지 주요 아미노산의 일부 특성들을 하기에 나타내었다;

Ala	지방족, 소수성, 중성	Met	소수성, 중성
Cys	극성, 소수성, 중성	Asn	극성의, 친수성, 중성
Asp	극성 소수성, (-)전하	Pro	소수성, 중성
Glu	극성 소수성, (-)전하	Gln	극성, 친수성, 중성
Phe	방향족, 소수성, 중성	Arg	극성, 친수성, (+)전하
Gly	지방족, 중성	Ser	극성, 친수성, 중성
His	방향족, 극성, 친수성, (+)전하	Thr	극성, 친수성, 중성
Ile	지방족, 소수성, 중성	Val	지방족, 소수성, 중성
Lys	극성, 친수성, (+)전하	Trp	방향족, 소수성, 중성
Leu	지방족, 소수성, 중성	Tyr	방향족, 극성, 소수성

제1 폴리펩티드 단편은 통상적으로 서열번호 1 또는 5의 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개 이상의 연속적인 아미노산으로 구성된다. 제2 폴리펩티드 단편은 통상적으로 서열번호 2 또는 6의 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개 이상의 연속적인 아미노산으로 구성된다.

본 명세서에 설명된 것처럼 임의의 폴리펩티드, 변이체 또는 단편들의 아미노산 서열은 비자연적으로 발생한 아미노산을 포함하고, 및/또는 화합물의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 폴리펩티드가 합성 수단에 의해 생산될 때, 그러한 아미노산은 생성 중에 도입될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 합성 또는 재조합 생성에 따라 변형될 수 있다. 본 명세서에서 설명하는 폴리펩티드, 변이체 또는 단편들은 D-아미노산을 이용하여 생산될 수 있다. 그러한 경우에서, 아미노산은 C에서 N 방향으로 역방향 서열로 연결될 것이다. 이것은 그러한 폴리펩티드를 생산하기 위한 기술분야에서 통상적이다. 많은 측쇄변형이 당업계에 알려져 있고, 본 명세서에서 특정될 수 있는 임의의 추가적으로 필요한 활성 또는 특징이 유지되면서 폴리펩티드, 변이체 또는 단편의 측쇄에서 변형이 일어난다. 그것은 또한 폴리펩티드, 변이체 또는 단편들이, 예컨대 번역 후 변형되는 것과 같이, 화학적으로 변형되는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 그것들은 당화(glycosylated), 인산화되거나 또는 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 면역글로불린을 포함하는 시료는 적어도 하나의 IgG 분자를 포함하는 조건 하에, IgM, IgA, IgD, 및/또는 IgW와 같은 면역글로불린 분자를 포함할 수 있다. 상기 IgG는 예컨대, 인간, 원숭이, 토끼, 양 또는 쥐와 같은 임의의 종으로부터 얻어질 수 있고, 바람직하게는 인간이다. 상기 IgG는 인간화 또는 합성된 것일 수 있다. IgG는 쥐 IgG2a 또는 IgG3일 수 있다. 바람직하게는 IgG는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다.

면역글로불린 분자를 포함하는 임의의 적절한 시료는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 상기 시료는 통상적으로 유체이다. 예를 들어, 상기 시료는 혈액, 혈청 또는 침 시료일 수 있다. 대안적으로 시료는 합성으로 생산된 면역글로불린의 배치에서 얻어지거나 약제학적 담체 또는 희석제와 함께 환자에게 투여되기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 시료는 임의의 치료용 단일 클론 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함한다. 예를 들어, 상기 시료는 아바스틴, 허셉틴 또는 애드세트리스의 분자를 포함한다.

바람직하게는, 상기 시료는 적어도 치료제에 결합된 하나의 인간 IgG 분자를 포함한다. 바람직하게는, 인간 IgG 분자는 시스테인 잔기에 티올 그룹을 통해 치료제에 결합된다. 바람직하게는, 시스테인 잔기가 인간 IgG 분자의 경첩부위에 있는 것이고, 가장 바람직하게는, 239 및 249 잔기 사이 (카바트 넘버링 시스템)에 있는 것이다. 바람직하게는 상기 치료제는 사이토톡신이다. 적절한 독성물질에는 아브리스타틴(avristatin), 칼리키마이신(calicheamicin), CC-1065, 독소루비신(doxorubicin), 메이톤시노이드(maytonsinoid), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)를 포함한다.

본 발명의 방법은 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다:

(a) 시료를 제1 폴리펩티드와 접촉하는 단계;

(b) 그 결과의 혼합물로부터 Fc 단편을 분리하는 단계;

(c) 상기 분리된 Fc 단편을 상기 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계; 및

(d) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계.

단계 (a)는 제1 폴리펩티드에 의해 면역글로불린 분자의 절단을 허용하는 임의의 조건 하에서 수행될 수 있다. 적절한 조건이 실시예에 설명된다. 통상적으로, pH 6.5 내지 8.0의 임의의 표준 완충액이 사용된다. 표준 완충액은 PBS(phosphate buffer saline), 트리스, 탄산수소암모늄, MES, HEPEs 및 초산나트륨을 포함한다. 통상적으로 시료는 제1 폴리펩티드와 함께 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 바람직하게는 적어도 60분 배양된다. 바람직하게는 배양은 실온에서, 더 바람직하게는, 대략 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃ 또는 45 ℃, 가장 바람직하게는 대략 37 ℃에서 이루어진다. 통상적으로, 효소:항체 비율은 대략적으로 1:50 (w:v)이다. 통상적으로 요오드아세트아미드, DTT 또는 TCEP와 같은 환원제가 사용된다.

단계 (b)에서 Fc 단편의 분리는 임의의 적절한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 단편은 친화성 분리, 크기-배제 크로마토그래피(SEC), 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과법 또는 투석에 의한 결과의 혼합물로부터 분리될 수 있다. 통상적으로 혼합물은 적절한 Fc 결합제와 접촉될 수 있다. 단계 (a)의 결과인 혼합물은 수지 (예를 들어, Fab 단편, 환원제 및 SpeB와 같은)에 결합하지 않은 다른 Fc 단편보다는 인간 IgG Fc-결합수지 및 구성요소에 적용될 수 있고, 녹여서 분리될 수 있다. 인간 IgG Fc-결합수지와 같은 Fc-결합제는 상업적으로 이용가능하다.

단계 (c)는 제2 폴리펩티드에 의해 Fc 단편의 절단이 허용되는 임의의 조건 하에서 수행될 수 있다. 적절한 조건이 실시예에 설명된다. 통상적으로, 임의의 표준 완충액은 상기에 설명된 바와 같이 사용된다. 통상적으로 시료는 IdeS 폴리펩티드와 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 바람직하게는 적어도 60분을 배양한다. 바람직하게는 배양은 실온에서, 더 바람직하게는 대략 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃ 또는 45 ℃, 가장 바람직하게는 대략 37 ℃에서 이루어진다. 통상적으로, 효소:항체 비율은 대략적으로 1:50 (w:v)이다. 통상적으로 환원제는 사용되지 않는다.

단계 (c)는 임의의 적절한 방법에 따라 선택적으로 Fc 단편을 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있는데, 예를 들어 단계 (c)의 결과인 혼합물을 인간 IgG Fc-결합 수지에 적용하는 방법이다. Fc 단편은 유지될 것이고, 다른 분자들 (예를 들어, 제2 폴리펩티드 및 1096 Da 펩티드를 포함하는)은 용출된 후 분리될 수 있다.

그 방법은 대안적으로 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:

(a) 시료를 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계;

(b) 그 결과의 혼합물로부터 Fab 단편을 분리하는 단계;

(c) 상기 분리된 Fab 단편을 상기 제1 폴리펩티드와 접촉하는 단계; 및

(d) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계.

단계 (a)는 제2 폴리펩티드에 의해 시료 내의 면역글로불린 분자의 절단을 허용하는 임의의 조건하에서 수행될 수 있다. 적절한 조건은 상기 설명한 바와 같다.

단계 (b)에서 Fab 단편의 분리는 임의의 적절한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편은 Fab 단편의 분리를 위한 상기 설명한 방법을 사용하여 결과의 혼합물로부터 분리될 수 있다. 통상적으로 임의의 적절한 Fab 결합제가 사용될 수 있다.

단계 (c)는 제1 폴리펩티드에 의해 Fab 단편의 절단을 허용하는 임의의 조건하에서 수행될 수 있다. 제1 폴리펩티드에 의해 전체 면역글로불린의 절단을 위한 적절한 조건은 상기에서 설명한 바와 같다.

단계 (c)는 임의의 적절한 방법에 따라 선택적으로 Fab 단편을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들어 단계 (c)의 결과인 혼합물을 적절한 Fab 결합제에 적용하는 것이다. Fab 단편은 유지될 것이고 다른 분자들 (예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 1096 Da 펩티드를 포함하는)은 용출된 후 분리될 수 있다.

이 방법은 대안적으로 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:

(a) 시료를 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 모두와 접촉하는 단계; 및

(b) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계.

단계 (a)는 제1 및 제2 폴리펩티드에 의해 시료 내의 면역글로불린의 절단을 허용하는 조건하에서 수행될 수 있다. 적절한 조건은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기에서 설명한 이전 단계와 상관없이, 임의의 적절한 방법은 결과의 최종 혼합물을 분석하는 데 사용될 수 있다. 통상적으로 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계는 적어도 하나의 분자의 분자량을 측정하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography) 및/또는 질량분석법(mass spectrometry)을 이용한다.

상기 결과의 혼합물의 분석은 하기를 측정하기 위해 수행될 수 있다:

(a) 치료제와 결합한 시료 내 면역글로불린 분자의 비율; 및/또는

(b) 치료제 : 면역글로불린 분자의 비; 및/또는

(c) 번역 후 변형의 존재 또는 부재.

치료제와 결합한 시료 내 면역글로불린 분자의 비율 및/또는 치료제의 비를 결정하는 단계: 면역글로불린 분자는 관심 있는 부위에 전달될 수 있는 치료제의 양을 결정하는데 도움을 줄 수 있고, 시료의 안정성과 효능 모두에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 통상적인 방법은 UV/VIS, UV/MALDI 및/또는 UV/DAR 분광학과 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석법을 포함한다.

결과의 혼합물은 통상적으로 대략 1096 Da 분자량을 가지는 펩티드의 존재, 부존재 및/또는 양에 대해 분석될 수 있다. 상기 설명한 바 및 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 인간 IgG의 절단은 통상적으로 그러한 펩티드가 결과물일 것이다.

구체적인 구현예에서 (오프-라인 특징으로 참조되는) 혼합물은 오직 HPLC를 이용하여 분석된다. 이 구현예는 면역글로불린 또는 항체-약물 접합체가 HPLC 크로마토그램에서 각각의 피크가 이미 알려져 있고 높은 정밀도와 정확성으로 정의되었기 때문에 이전에 완전하게 특징화 되었을 때 통상적으로 사용될 수 있다 (예를 들어 HPLC 및 질량분석법에 의해). 그런 경우에, 예상한 위치에 피크가 나타난다면 시료는 이전에 특징된 시료와 일치하는 것으로 생각할 수 있다. 만약, 아니라면 시료의 추가적인 분석이 무엇이 다른지를 결정하기 위해서 필요하다. 예를 들어, 질량분석법이 시료를 추가적으로 특징화 하기 위해 사용될 수 있다. 이 구현예는 동일한 항체가 통상적으로 대량생산되고 주기적으로 시료가 품질관리 목적으로 시험되는 곳에서 특히 유용하다.

피로글루탐산 형성, 산화, 탈아미드화, 이성질화, 당화, 디설파이드 셔플링, 펩티드 결합 절단 및 교차결합과 같은 번역 후 변형의 존재 또는 부존재를 측정하는 전형적인 방법은 모세관 전기이동(capillary electrophoresis, CE), 모세관 액체크로마토그래피(capillary liquid chromatography, CLC), 자외선 흡수 및 레이저 유도 형광(laser-induced fluorescence, LIF)법을 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 3의 서열을 가지는 분리된 펩티드 또는 하나 또는 두 개의 보존적인 변형, 바람직하게는 오직 서열의 2 내지 10번째 위치내를 포함하는 상기 서열의 변이체를 포함한다. 상기 펩티드는 면역글로불린이 포함된 시료를 본 발명의 제1 및 제2 폴리펩티드로 처리하는 방법으로 생성된다. 또한, 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같은, 임의의 치료제에 결합된 상기 펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 키트를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 1

인간 IgG에 대한 SpeB 활성을 SDS-PAGE 및 질량분석법을 사용하여 조사하였다. SpeB의 절단 부위가 예기치 않게 이전에 보고된 것과 다르다는 것을 발견하였다.

인간 단일클론 IgG(허셉틴)를 IdeS, SpeB 또는 두 효소의 조합과 함께 배양하였다. SDS-PAGE 분석(도 1)은 절단 부위가 이전의 보고와 달리 두 효소에 대해 동일하지 않다는 것을 나타내고 있다. IdeS 및 SpeB가 단독인 경우와 비교하여 IdeS 및 SpeB의 조합인 경우 SDS-PAGE에서 관찰된 질량 변화는 절단 부위가 다르다는 것을 나타낸다. 이것은 또한 IdeS(반응에서 차후에 첨가된)가 SpeB에 의해 생성된 단편을 절단할 수 있음을 보여준다.

IdeS 및 SpeB의 절단 부위의 추가적인 조사를 위하여, 질량분석법과 조합한 액체크로마토그래피 (LC/MS)는 상기 언급된 SDS-PAGE로부터의 결과를 확인하고, 절단 부위의 세부사항을 밝히기 위해 사용되었다. LC/MS 분석의 결과는 도 2에 나타내었으며, SpeB 및 IdeS의 다른 절단 부위를 확인할 수 있다. SpeB의 개략도를 도 3에 나타내었다.

실시예 2

경첩 부위 펩티드 CPPCPAPELLG (서열번호 3에 설명된 바와 같이)가 항체 시료로부터 준비되었다.

항체 시료(아바스틴, 허셉틴 및 애드세트리스)의 Fc 단편을 His-태그된 재조합 SpeB 효소(또한 Fpn-1로 지칭됨)를 사용하여 초기에 분리하였다. 이 절단 반응은 pH 6.5 내지 8.0의 표준 완충액에서 수행하였으며, 효소 : 항체 비율을 1:50 (w:w) 및 15 mM의 환원제 DTT 또는 TCEP를 37 ℃에서 1시간 동안 사용하였다. 절단 완결 후, 전체 반응의 물질을 Capture Selec 인간 IgG Fc 수지에 적용하여 Fab 단편, 환원제 및 IdeS 효소로부터 자유롭게 용출하였다. 용출된 Fc는 상기 Fpn-1에 대해 기재한 바와 같이, His-태그된 재조합 IdeS 효소 (또한, FabRICATOR로도 지칭됨)에 의해 환원제 없이 반응에서 절단되었다. 이것은 경첩 부위 펩티드 (약 1096 Da) 및 수득된 경첩 부위 펩티드가 없는 Fc 단편을 초래한다. 경첩 부위 펩티드의 추가적인 분리를 위해, Capture Select 인간 IgG Fc를 다시 사용하여, Fc와 결합 작용 및 분획을 통해 흐름 속에서 FabRICATOR 효소를 갖는 1096 Da 펩티드를 남겨두게 된다.

상기 펩티드 FabRICATOR 분획을 215 nm 검출에서 Zorbax RRHD 300SB-C18 역상 컬럼을 사용하여 UHPLC 시스템에 의해 분석하였다. 합성된 1096 Da 경첩 부위 펩티드는 대조군으로 사용되었다.

도 4A의 크로마토그램은 애드세트리스, 아바스틴 및 허셉틴의 준비물질들로부터 1096 Da 펩티드를 나타낸다.

도 4B의 크로마토그램은 또한 합성 펩티드를 나타낸다. 애드세트리스는 경첩 부위에 또한 결합 부위가 있는 항체 약물 접합체이다. 이 준비물질을 TCEP로 환원 후에 두 개의 추가적인 피크가 눈에 띄는데, 경첩 부위에 결합한 변이체로 확인되었다.

<110> GENOVIS AB <120> A methods for analysing a sample of immunoglobulin molecules <130> JAK1602 <150> GB 1316744.0 <151> 2013-09-20 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 371 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Asp Gln Asn Phe Ala Arg Asn Glu Lys Glu Ala Lys Asp Ser Ala Ile 1 5 10 15 Thr Phe Ile Gln Lys Ser Ala Ala Ile Lys Ala Gly Ala Arg Ser Ala 20 25 30 Glu Asp Ile Lys Leu Asp Lys Val Asn Leu Gly Gly Glu Leu Ser Gly 35 40 45 Ser Asn Met Tyr Val Tyr Asn Ile Ser Thr Gly Gly Phe Val Ile Val 50 55 60 Ser Gly Asp Lys Arg Ser Pro Glu Ile Leu Gly Tyr Ser Thr Ser Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Ala Asn Gly Lys Glu Asn Ile Ala Ser Phe Met Glu Ser 85 90 95 Tyr Val Glu Gln Ile Lys Glu Asn Lys Lys Leu Asp Thr Thr Tyr Ala 100 105 110 Gly Thr Ala Glu Ile Lys Gln Pro Val Val Lys Ser Leu Leu Asp Ser 115 120 125 Lys Gly Ile His Tyr Asn Gln Gly Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Thr Pro 130 135 140 Val Ile Glu Lys Val Lys Pro Gly Glu Gln Ser Phe Val Gly Gln His 145 150 155 160 Ala Ala Thr Gly Cys Val Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ile Met Lys Tyr 165 170 175 His Asn Tyr Pro Asn Lys Gly Leu Lys Asp Tyr Thr Tyr Thr Leu Ser 180 185 190 Ser Asn Asn Pro Tyr Phe Asn His Pro Lys Asn Leu Phe Ala Ala Ile 195 200 205 Ser Thr Arg Gln Tyr Asn Trp Asn Asn Ile Leu Pro Thr Tyr Ser Gly 210 215 220 Arg Glu Ser Asn Val Gln Lys Met Ala Ile Ser Glu Leu Met Ala Asp 225 230 235 240 Val Gly Ile Ser Val Asp Met Asp Tyr Gly Pro Ser Ser Gly Ser Ala 245 250 255 Gly Ser Ser Arg Val Gln Arg Ala Leu Lys Glu Asn Phe Gly Tyr Asn 260 265 270 Gln Ser Val His Gln Ile Asn Arg Ser Asp Phe Ser Lys Gln Asp Trp 275 280 285 Glu Ala Gln Ile Asp Lys Glu Leu Ser Gln Asn Gln Pro Val Tyr Tyr 290 295 300 Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Gly His Ala Phe Val Ile Asp Gly Ala 305 310 315 320 Asp Gly Arg Asn Phe Tyr His Val Asn Trp Gly Trp Gly Gly Val Ser 325 330 335 Asp Gly Phe Phe Arg Leu Asp Ala Leu Asn Pro Ser Ala Leu Gly Thr 340 345 350 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Phe Asn Gly Tyr Gln Ser Ala Val Val Gly 355 360 365 Ile Lys Pro 370 <210> 2 <211> 310 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 2 Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro 1 5 10 15 Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile 100 105 110 Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys 115 120 125 Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro 130 135 140 Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly 165 170 175 Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu 180 185 190 Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp 195 200 205 Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His 210 215 220 Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala 225 230 235 240 Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser 245 250 255 Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn 260 265 270 Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn 275 280 285 Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp 290 295 300 Ser Trp Asn Gln Thr Asn 305 310 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe 20 <210> 5 <211> 373 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 5 Met Ala Asp Gln Asn Phe Ala Arg Asn Glu Lys Glu Ala Lys Asp Ser 1 5 10 15 Ala Ile Thr Phe Ile Gln Lys Ser Ala Ala Ile Lys Ala Gly Ala Arg 20 25 30 Ser Ala Glu Asp Ile Lys Leu Asp Lys Val Asn Leu Gly Gly Glu Leu 35 40 45 Ser Gly Ser Asn Met Tyr Val Tyr Asn Ile Ser Thr Gly Gly Phe Val 50 55 60 Ile Val Ser Gly Asp Lys Arg Ser Pro Glu Ile Leu Gly Tyr Ser Thr 65 70 75 80 Ser Gly Ser Phe Asp Ala Asn Gly Lys Glu Asn Ile Ala Ser Phe Met 85 90 95 Glu Ser Tyr Val Glu Gln Ile Lys Glu Asn Lys Lys Leu Asp Thr Thr 100 105 110 Tyr Ala Gly Thr Ala Glu Ile Lys Gln Pro Val Val Lys Ser Leu Leu 115 120 125 Asp Ser Lys Gly Ile His Tyr Asn Gln Gly Asn Pro Tyr Asn Leu Leu 130 135 140 Thr Pro Val Ile Glu Lys Val Lys Pro Gly Glu Gln Ser Phe Val Gly 145 150 155 160 Gln His Ala Ala Thr Gly Cys Val Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ile Met 165 170 175 Lys Tyr His Asn Tyr Pro Asn Lys Gly Leu Lys Asp Tyr Thr Tyr Thr 180 185 190 Leu Ser Ser Asn Asn Pro Tyr Phe Asn His Pro Lys Asn Leu Phe Ala 195 200 205 Ala Ile Ser Thr Arg Gln Tyr Asn Trp Asn Asn Ile Leu Pro Thr Tyr 210 215 220 Ser Gly Arg Glu Ser Asn Val Gln Lys Met Ala Ile Ser Glu Leu Met 225 230 235 240 Ala Asp Val Gly Ile Ser Val Asp Met Asp Tyr Gly Pro Ser Ser Gly 245 250 255 Ser Ala Gly Ser Ser Arg Val Gln Arg Ala Leu Lys Glu Asn Phe Gly 260 265 270 Tyr Asn Gln Ser Val His Gln Ile Asn Arg Ser Asp Phe Ser Lys Gln 275 280 285 Asp Trp Glu Ala Gln Ile Asp Lys Glu Leu Ser Gln Asn Gln Pro Val 290 295 300 Tyr Tyr Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Gly His Ala Phe Val Ile Asp 305 310 315 320 Gly Ala Asp Gly Arg Asn Phe Tyr His Val Asn Trp Gly Trp Gly Gly 325 330 335 Val Ser Asp Gly Phe Phe Arg Leu Asp Ala Leu Asn Pro Ser Ala Leu 340 345 350 Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Phe Asn Gly Tyr Gln Ser Ala Val 355 360 365 Val Gly Ile Lys Pro 370 <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 6 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 7 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450

Claims

시료를 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계 및 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계를 포함하는, 면역글로불린 분자 시료의 분석 방법에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 인간 IgG의 경첩부위(hinge region)에서 상이한 표적 부위를 각각 절단하는, 시스테인 프로테아제 효소인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드는 카바트 넘버링 시스템에 따른 위치 238과 239 (EU 넘버링 시스템에 따른 위치 225와 226) 사이의 IgG의 경첩 부위(hinge region)를 절단하고, 및/또는
상기 제2 폴리펩티드는 카바트 넘버링 시스템에 따른 위치 249과 250 (EU 넘버링 시스템에 따른 위치 236와 237) 사이의 IgG의 경첩 부위(hinge region)를 절단하는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성되고, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 변이체 또는 이의 단편을 포함하거나 구성되는 것인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 서열의 변이체는 상기 서열에 최소한 80%이상 상동성을 갖는 아미노산 서열이고, 상기 서열의 단편은 상기 서열의 300 연속 아미노산까지 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시료 내 하나 이상의 면역글로불린 분자는 IgG 분자, 바람직하게는 인간 IgG 분자인 것인, 방법.
제5항에 있어서,
하나 이상의 상기 IgG 분자는 치료제에 결합되고, 바람직하게는 IgG 분자의 시스테인 잔기의 티올기를 통한 것인, 방법.
제6항에 있어서,
상기 시스테인 잔기는 IgG 분자의 경첩부위(hinge region)에 있는 것인, 방법
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 치료제는 사이토톡신(cytotoxin), 바람직하게는 아브리스타틴(avristatin), 칼리키마이신(calicheamicin), CC-1065, 독소루비신(doxorubicin), 메이톤시노이드(maytonsinoid), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)로부터 선택된 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(a) 상기 시료를 상기 제1 폴리펩티드와 접촉하는 단계;
(b) 그 결과의 혼합물로부터 Fc 단편을 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 Fc 단편을 상기 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계; 및
(d) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계;를 포함하는 것인, 방법
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(a) 상기 시료를 상기 제2 폴리펩티드와 접촉하는 단계;
(b) 그 결과의 혼합물로부터 Fab 단편을 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 Fab 단편을 상기 제1 폴리펩티드와 접촉하는 단계; 및
(d) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계;를 포함하는 것인, 방법
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(a) 상기 시료를 상기 제1 및 제 2 폴리펩티드 모두와 접촉하는 단계; 및
(b) 그 결과의 혼합물을 분석하는 단계;를 포함하는 것인, 방법
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 결과의 혼합물을 분석하는 단계는 혼합물 내 하나 이상의 분자의 분자량를 측정하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography) 및/또는 질량분석법(mass spectrometry)을 이용하는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
상기 분석은 대략적으로 1096 Da의 분자량을 갖는 펩티드의 존재, 부재 및/또는 양을 측정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 펩티드는 CPPCPAPELLG (서열번호 3) 서열, 또는 하나 또는 두 개의 보존적인 변형(conservative modifications)을 포함하는 상기 서열의 변이체를 포함하고, 바람직하게는 상기 변형은 오직 상기 서열의 2 내지 10번째 내의 위치에서 발생하는 것인, 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분석은 하기를 측정하기 위해 수행되는 것인, 방법:
(a) 시료 내 면역글로불린 분자가 치료제와 결합 및/또는 결합하지 않은 비율;
(b) 치료제 : 면역글로불린 분자의 비; 및/또는
(c) 서열번호: 3에 설명된 아미노산 서열의 번역 후 변형의 존재 또는 부재.
아미노산 서열 CPPCPAPELLG (서열번호 3), 또는 하나 또는 두개의 보존적인 변형을 포함하는 상기 서열의 변이체로 구성된 펩티드에서,
바람직하게는 상기 변형은 오직 상기 서열의 2 내지 10번째 위치에서 발생하고; 선택적으로 상기 펩티드는 치료제와 결합된 것인, 펩티드.
제16항에 있어서,
면역글로불린을 포함하는 시료를 제1항에서 정의된 바와 같은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드와 접촉하여 생성되는 것인, 펩티드.
제1항에서 정의된 바와 같은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는, 면역글로불린 분자 시료의 분석 방법용 키트.