JP2016530219A - Ｃｘｃｌ１２活性に関与する疾患を処置するためのビタミンｄ受容体アゴニスト - Google Patents

Ｃｘｃｌ１２活性に関与する疾患を処置するためのビタミンｄ受容体アゴニスト Download PDF

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Abstract

本明細書において、ビタミンＤ受容体アゴニスト（例えば、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ前駆物質、およびビタミンＤ受容体アゴニスト前駆物質）の投与により、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）アゴニスト（例えば、ＧＬＰ−１アゴニスト、例えば、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））によって誘発される膵炎などの膵炎を処置および防止する方法を提供する。いくつかの例では、被験体は、２型糖尿病などの糖尿病を有する。一局面において、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）の生物学的活性を低減する方法が提供され、この方法は、ＣＸＣＬ１２を発現する星状細胞を、治療有効量の１つまたは複数のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニストと接触させ、それによりＣＸＣＬ１２の上記生物学的活性を低減するステップを含む。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年６月５日に出願された米国仮出願第６１／８３１，５１５号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
政府の支援についての承認
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＨＬ１０５２７８、ＤＫ０５７７９７８、ＤＫ０９０９６２、ＣＡ０１４１９５およびＥＳ０１０３３７の下、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ａｗａｒｄによって付与されたＴ３２−ＣＡ００９３７０の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本出願は、１つまたは複数のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニストの投与による、隣接する星状細胞の活性化が存在する膵炎およびがんなどの疾患を処置または防止する方法に関する。
政府の支援についての承認
本発明は、Ｔ３２−ＣＡ００９３７０ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ａｗａｒｄの下、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＨＬ１０５２７８、ＤＫ０５７７９７８、ＤＫ０９０９６２、ＣＡ０１４１９５およびＥＳ０１０３３７の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
腫瘍間質におけるがん関連線維芽様細胞（ＣＡＦ）は、最も一般的な形態のヒトのがんである癌腫の開始および進行に深刻な影響を発揮することが示されている（Ｂｈｏｗｍｉｃｋら、２００４年；ＫａｌｌｕｒｉおよびＺｅｉｓｂｅｒｇ、２００６年；ＰｉｅｔｒａｓおよびＯｓｔｍａｎ、２０１０年；ＲａｓａｎｅｎおよびＶａｈｅｒｉ、２０１０年；Ｓｈｉｍｏｄａら、２０１０年）。特に、膵管腺癌（ＰＤＡ）は突出した間質のコンパートメントによって規定され、ＣＡＦによるものとされる多くの特徴が、膵臓がんの進行を促進し、治療有効性を妨害する（ＭａｈａｄｅｖａｎおよびＶｏｎ Ｈｏｆｆ、２００７年）。ＣＡＦは、部分的に、腫瘍細胞における生存促進性の経路のパラクリンの活性化により同種移植モデルにおけるＰＤＡ増殖を増強し、腫瘍−間質相互作用の阻害により腫瘍の進行を制限する（Ｈｗａｎｇら、２００８年；Ｉｊｉｃｈｉら、２０１１年；Ｖｏｎｌａｕｆｅｎら、２００８年）。さらに、ＰＤＡに付随する高密度の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は腫瘍内脈管構造を閉塞し、化学療法剤送達を妨げ（Ｏｌｉｖｅら、２００９年）、この間質の「道路閉塞（ｒｏａｄｂｌｏｃｋ）」を克服する新たなアイディアにつながる（Ｊａｃｏｂｅｔｚら、２０１２年；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、２０１２年）。薬物送達以外では、最近の証拠は、腫瘍間質を多数の腫瘍タイプにおける生来の薬物抵抗性に関係づけ（Ｓｔｒａｕｓｓｍａｎら、２０１２年；Ｗｉｌｓｏｎら、２０１２年）、新生物形成細胞および間質の構成成分の両方を標的化する処置のパラダイムが、ＰＤＡに出現しつつある（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎら、２０１２年）。これらの知見は、ＰＤＡの微小環境において、ＣＡＦは潜在的な治療標的を表すことを示唆するものの、膵臓の腫瘍の微小環境における優勢な線維芽細胞型である、膵臓星状細胞（ＰＳＣ）の腫瘍支持的な特徴は理解不十分のままである。
ＰＳＣは、ネスチン陽性で常在性の膵臓の脂質貯蔵細胞であり、正常なＥＣＭの代謝回転において重要な役割を有する（Ａｐｔｅら、１９９８年；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２００３年）。健康なとき、ＰＳＣは、ビタミンＡに富む、豊富な細胞質脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）、および低レベルのＥＣＭ構成成分の生成を特徴とする静止状態にある（Ａｐｔｅら、２０１２年）。膵臓の傷害の間、ＰＳＣは、サイトカイン、増殖因子、酸化ストレス、または代謝ストレスによって活性化され、筋線維芽細胞様細胞に分化転換する（ＭａｓａｍｕｎｅおよびＳｈｉｍｏｓｅｇａｗａ、２００９年）。活性化されたＰＳＣは細胞質脂肪滴を失い、線維芽細胞活性化マーカーであるα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）を発現し、増殖能を獲得し、大量のＥＣＭタンパク質を合成する。活性化されたＰＳＣは、静止状態では全く抑制される膨張性のセクレトームも取得する（Ｗｅｈｒら、２０１１年）。慢性的な傷害の条件下でＰＳＣを持続的に活性化すると、病的なマトリクス分泌をもたらし、線維症をまねき、療法に対する物理的なバリアを作り出す。さらに、活性化されたＰＳＣおよび膵臓がん細胞に対する相反的な支持的役割はますます認められるようになっており、すなわち、膵臓がん細胞は分裂促進因子および線維形成因子を生成し、これらは血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）など、ＰＳＣ活性化を促進する（ＡｐｔｅおよびＷｉｌｓｏｎ、２０１２年；Ｂａｉｌｅｙら、２００８年）。相反的に、活性化されたＰＳＣは、ＰＤＧＦ、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ならびにがん細胞の増殖、生存、および遊走を促進し得る他の因子を生成する（ＡｐｔｅおよびＷｉｌｓｏｎ、２０１２年；Ｆｅｉｇら、２０１２年）。腫瘍促進性の特徴は、活性化されたＰＳＣの状態に大部分制限され、活性化のプロセスは、肝臓星状細胞における最近の研究により示唆されるように、可逆的であり得る（Ｋｉｓｓｅｌｅｖａら、２０１２年）。しかし、このプロセスを制御する細胞の因子および分子経路は依然として謎である。
Ｂｈｏｗｍｉｃｋら、Ｓｔｒｏｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２、３３２〜３３７ ＫａｌｌｕｒｉおよびＺｅｉｓｂｅｒｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ（２００６）６、３９２〜４０１
本発明者らは、薬理学的手段を使用して、活性化されたがん関連ＰＳＣ（ＣＡＰＳＣ）を静止状態に逆戻りさせて、腫瘍−間質クロストークおよび腫瘍の増殖を妨害し、がん細胞に向けられた化学療法の臨床的有効性の増強をもたらすことができることを提唱した。マウスおよびヒトのＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を行ってＰＳＣ活性化シグネチャーを決定し、治療標的を同定した。この分析により、試験した活性化段階全てにおいて、ＰＳＣにおける高レベルのビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の発現が明らかになった。本明細書に提供するデータは、ＶＤＲが、ＰＳＣ活性化状態の主要なゲノム制御因子として働くことを示す。マウス膵炎モデルにおいて、ＶＤＲリガンドは線維症および炎症を低減し、逆に、Ｖｄｒ−／−マウスは自発的に膵線維症を発症する。さらに、ＶＤＲリガンドはＰＤＡにおける複数の腫瘍支持性のシグナル伝達経路を同時に侵食し、単一の薬剤としてのＶＤＲリガンドの効果は無視できるのに関わらず、同時投与した化学毒性薬剤（ｃｈｅｍｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）の有効性を増強する。まとめると、これらの結果は、炎症、線維症、およびがんを含めた間質関連の病態に影響を及ぼす、広く応用できる戦略を強調する。
これらの観察に基づき、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）の生物学的活性を低減する方法を提供する。例えば、このような方法は、星状細胞（例えば、ＣＸＣＬ１２を発現する星状細胞）を、治療有効量の１つまたは複数のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニストと接触させ、それによりＣＸＣＬ１２の生成および分泌を低減するステップを含むことができる。一例では、ＶＤＲアゴニストは、著しい高カルシウム血症効果のないアゴニストなどの合成のアゴニスト（例えば、パリカルシトールまたはカルシポトリオール）である。一部の例では、ＶＤＲアゴニストは、ＣＸＣＬ１２核酸発現、ＣＸＣＬ１２タンパク質発現、ＣＸＣＬ１２分泌（例えば、星状細胞による）、腫瘍細胞に対するＣＸＣＬ１２結合、および腫瘍細胞に対するＴ細胞結合のＣＸＣＬ１２による防止の１つまたは複数を低減する。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
一例では、ＣＸＣＬ１２の活性の低減を使用して、被験体における腫瘍を処置する。例えば、被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニスト、および治療有効量の１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方を含む療法を投与することができる。治療薬剤を同時に投与する必要はない。例えば、薬剤を逐次的に投与することができる。一例では、ＶＤＲアゴニストを投与した後、治療有効量の化学療法薬剤または生物学的薬剤を投与する。
よって、本開示は、膵臓、肝臓、腎臓、肺、胆管、または前立腺のがんなどのがんを処置するための方法を提供する。このような方法は、がんを有する哺乳動物被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップと、哺乳動物被験体に、治療有効量の、がんに対する化学療法または生物療法（例えば、膵管腺癌に対して、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、タンパク質が結合したパクリタキセル、またはこれらの組合せ）を投与するステップとを含むことができる。
一例では、ＣＸＣＬ１２の生成および分泌の低減を使用して膵炎を処置または防止する。例えば、膵炎を有するか、もしくは膵炎を発症するリスクのある被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストの両方を含む療法を投与することができる。一例では、被験体は、ＧＬＰ−１アゴニストなどのグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）アゴニストを摂取し／受けており、または以前に摂取していた被験体である。よって、一部の例では、処置しようとする被験体は、２型糖尿病などの糖尿病を有する。ＧＬＰアゴニストの例には、それだけには限定されないが、エキセナチド、タスポグルチド、インスリングラルギン、ピオグリタゾン、アルビグルチド、リキシセナチド、サキサグリプチン、リラグルチド、リナグリプチン、アログリプチン、シタグリプチン、およびメトホルミン／シタグリプチンが含まれる。
よって、本開示は、ＧＬＰ−１アゴニスト療法に起因する膵炎などの膵炎を処置または防止するための方法を提供する。このような方法は、膵炎を有するか、もしくは膵炎を発症するリスクのある哺乳動物被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップを含むことができる。一例では、被験体は、ＧＬＰ−１アゴニストなどのＧＬＰアゴニストを摂取し／受けており、または以前に摂取し／受けていた被験体である。よって、一部の例では、処置しようとする被験体は、２型糖尿病などの糖尿病を有する。
本開示の前述および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する、以下の発明を実施するための形態から、より明らかになろう。
図１Ａ〜１Ｆは、活性化された、およびがん関連のＰＳＣは線維化促進性の（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ）炎症促進性の表現型を表すことを示す図である。（Ａ）活性化の間に発現が変更された遺伝子カテゴリーを実証する、初代マウスＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの選択された遺伝子を表すヒートマップ。データを、１群あたりｎ＝３の、活性化（７日目）対前活性化（３日目）のｌｏｇ２倍の変化として表す。（Ｂ）ＰＤＡ患者（ｎ＝５）またはがんのない（ｃａｎｃｅｒ−ｆｒｅｅ）ドナー（ｎ＝４）から単離し、十分な収率および純度を実現するために１５日間培養し、ＰＤＡ対がんのないｌｏｇ２倍の変化として表した、初代ヒトＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析から選択した遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ）前活性化および活性化した初代マウスＰＳＣにおける血管新生の負（上）および正（下）の制御因子の相対的存在量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示すヒートマップ。（Ｄ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、３日間培養して拡大および精製した、マウス全膵臓ホモジネート、および単離したＰＳＣにおける、Ｖｄｒ発現。（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって示される膵臓の集団におけるＶｄｒ発現（３６Ｂ４に対して正規化、ｎ＝５）。腺房、管、および島をレーザーキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により単離し、ＰＳＣを密度勾配遠心分離（ＤＣ）により単離した。（Ｆ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した、（３６ｂ４に対して正規化、ｎ＝３）前活性化および活性化したマウスＰＳＣ（左）ならびにヒトがん非関連およびがん関連ＰＳＣ（右）におけるＶｄｒ発現。バーは平均値を示し、エラーバーはＳＤを示す。 図１Ａ〜１Ｆは、活性化された、およびがん関連のＰＳＣは線維化促進性の（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ）炎症促進性の表現型を表すことを示す図である。（Ａ）活性化の間に発現が変更された遺伝子カテゴリーを実証する、初代マウスＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの選択された遺伝子を表すヒートマップ。データを、１群あたりｎ＝３の、活性化（７日目）対前活性化（３日目）のｌｏｇ２倍の変化として表す。（Ｂ）ＰＤＡ患者（ｎ＝５）またはがんのない（ｃａｎｃｅｒ−ｆｒｅｅ）ドナー（ｎ＝４）から単離し、十分な収率および純度を実現するために１５日間培養し、ＰＤＡ対がんのないｌｏｇ２倍の変化として表した、初代ヒトＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析から選択した遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ）前活性化および活性化した初代マウスＰＳＣにおける血管新生の負（上）および正（下）の制御因子の相対的存在量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示すヒートマップ。（Ｄ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、３日間培養して拡大および精製した、マウス全膵臓ホモジネート、および単離したＰＳＣにおける、Ｖｄｒ発現。（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって示される膵臓の集団におけるＶｄｒ発現（３６Ｂ４に対して正規化、ｎ＝５）。腺房、管、および島をレーザーキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により単離し、ＰＳＣを密度勾配遠心分離（ＤＣ）により単離した。（Ｆ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した、（３６ｂ４に対して正規化、ｎ＝３）前活性化および活性化したマウスＰＳＣ（左）ならびにヒトがん非関連およびがん関連ＰＳＣ（右）におけるＶｄｒ発現。バーは平均値を示し、エラーバーはＳＤを示す。 図２Ａ〜２Ｅは、図１に関連する、培養３日目から７日目の間の、活性化された表現型への初代マウスＰＳＣ分化転換を示す図である。ＰＳＣを、８週齢の、７日間培養した野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの膵臓から単離した（補完の実験手順を参照されたい）。（Ａ）明視野の鏡検により、培養３日目の前活性化ＰＳＣにおける細胞質の脂肪滴（矢印によって示す）が示され、これが培養７日目までに筋線維芽細胞様の活性化されたＰＳＣを生じる。スケールバー＝５０μｍ。（Ｂ）ＲＮＡを３日目および７日目に収集し、線維芽細胞活性化マーカーＡｃｔａ２に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。（Ｃ）ＰＳＣ単離直後（０日目）、ならびに培養３日目および７日目にＲＮＡを収集した。α−アミラーゼに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って、培養３日後に最早検出できなかった腺房細胞の汚染の度合いを決定した。（Ｄ）全細胞溶解産物を調製し、ウエスタンブロットによって分析して、全マウス膵臓中および単離されたＰＳＣ中のＶｄｒのタンパク質レベルを決定した。アクチンをローディング対照とした。代表的な２匹のマウスからの溶解産物をここに示す。（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した、細胞型特異的遺伝子の相対的発現により評価した、単離された膵臓集団の純度。データを３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。 図２Ａ〜２Ｅは、図１に関連する、培養３日目から７日目の間の、活性化された表現型への初代マウスＰＳＣ分化転換を示す図である。ＰＳＣを、８週齢の、７日間培養した野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの膵臓から単離した（補完の実験手順を参照されたい）。（Ａ）明視野の鏡検により、培養３日目の前活性化ＰＳＣにおける細胞質の脂肪滴（矢印によって示す）が示され、これが培養７日目までに筋線維芽細胞様の活性化されたＰＳＣを生じる。スケールバー＝５０μｍ。（Ｂ）ＲＮＡを３日目および７日目に収集し、線維芽細胞活性化マーカーＡｃｔａ２に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。（Ｃ）ＰＳＣ単離直後（０日目）、ならびに培養３日目および７日目にＲＮＡを収集した。α−アミラーゼに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って、培養３日後に最早検出できなかった腺房細胞の汚染の度合いを決定した。（Ｄ）全細胞溶解産物を調製し、ウエスタンブロットによって分析して、全マウス膵臓中および単離されたＰＳＣ中のＶｄｒのタンパク質レベルを決定した。アクチンをローディング対照とした。代表的な２匹のマウスからの溶解産物をここに示す。（Ｅ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した、細胞型特異的遺伝子の相対的発現により評価した、単離された膵臓集団の純度。データを３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。 図３Ａ〜３Ｆは、ＶＤＲが制御する転写ネットワークはＰＳＣ活性化に対抗することを示す図である。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオール（Ｃａｌ）で４８時間処理し、中性脂質の検出用にＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色した、初代ヒトＣＡＰＳＣの代表的な画像。ＤＭＳＯまたはＣａｌで処理した患者３人の試料における細胞１個あたりのＢＯＤＩＰＹ陽性面積のパーセントの定量化を、平均値＋ＳＤとしてプロットし、下に示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定（＊ｐ＜０．０５）によって決定した。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）ビヒクルまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理した２７個の初代ヒトＣＡＰＳＣにおけるＡＣＴＡ２の発現。値をＤＭＳＯ／Ｃａｌとしてプロットし、３６Ｂ４に対して正規化した。（Ｃ）ＤＭＳＯ（Ｄ）またはＣａｌ（Ｃ）で処理した（ｎ＝３）、前活性化（収集後３日間培養）または活性化（収集後７日間培養）初代マウスＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの選択された遺伝子を表すヒートマップ。ＶＤＲ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１およびＶｄｒを対照として示す。表３に関連。（Ｄ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＣａｌの存在下で培養した活性化初代マウスＰＳＣにおける血管新生の負（上）および正（下）の制御因子の相対的存在量を示すヒートマップ。（Ｅ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理したＣＡＰＳＣにおけるＰＳＣ活性化またはがんシグネチャーからの選択された遺伝子の発現レベル。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤをプロットする。ｑＲＴ−ＰＣＲを技術的に３連で行い、値を３６Ｂ４に対して正規化した。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｆ）ＣＡＰＳＣに、ＶＤＲに対するｓｉＲＮＡのプール（ｓｉＶＤＲ）または非標的化対照（ｓｉＮＴ）をトランスフェクトした。次いで、細胞をＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。値を３６Ｂ４に対して正規化した。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図３Ａ〜３Ｆは、ＶＤＲが制御する転写ネットワークはＰＳＣ活性化に対抗することを示す図である。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオール（Ｃａｌ）で４８時間処理し、中性脂質の検出用にＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色した、初代ヒトＣＡＰＳＣの代表的な画像。ＤＭＳＯまたはＣａｌで処理した患者３人の試料における細胞１個あたりのＢＯＤＩＰＹ陽性面積のパーセントの定量化を、平均値＋ＳＤとしてプロットし、下に示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定（＊ｐ＜０．０５）によって決定した。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）ビヒクルまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理した２７個の初代ヒトＣＡＰＳＣにおけるＡＣＴＡ２の発現。値をＤＭＳＯ／Ｃａｌとしてプロットし、３６Ｂ４に対して正規化した。（Ｃ）ＤＭＳＯ（Ｄ）またはＣａｌ（Ｃ）で処理した（ｎ＝３）、前活性化（収集後３日間培養）または活性化（収集後７日間培養）初代マウスＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの選択された遺伝子を表すヒートマップ。ＶＤＲ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１およびＶｄｒを対照として示す。表３に関連。（Ｄ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＣａｌの存在下で培養した活性化初代マウスＰＳＣにおける血管新生の負（上）および正（下）の制御因子の相対的存在量を示すヒートマップ。（Ｅ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理したＣＡＰＳＣにおけるＰＳＣ活性化またはがんシグネチャーからの選択された遺伝子の発現レベル。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤをプロットする。ｑＲＴ−ＰＣＲを技術的に３連で行い、値を３６Ｂ４に対して正規化した。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｆ）ＣＡＰＳＣに、ＶＤＲに対するｓｉＲＮＡのプール（ｓｉＶＤＲ）または非標的化対照（ｓｉＮＴ）をトランスフェクトした。次いで、細胞をＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。値を３６Ｂ４に対して正規化した。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図３Ａ〜３Ｆは、ＶＤＲが制御する転写ネットワークはＰＳＣ活性化に対抗することを示す図である。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオール（Ｃａｌ）で４８時間処理し、中性脂質の検出用にＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色した、初代ヒトＣＡＰＳＣの代表的な画像。ＤＭＳＯまたはＣａｌで処理した患者３人の試料における細胞１個あたりのＢＯＤＩＰＹ陽性面積のパーセントの定量化を、平均値＋ＳＤとしてプロットし、下に示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定（＊ｐ＜０．０５）によって決定した。スケールバー＝２０μｍ。（Ｂ）ビヒクルまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理した２７個の初代ヒトＣＡＰＳＣにおけるＡＣＴＡ２の発現。値をＤＭＳＯ／Ｃａｌとしてプロットし、３６Ｂ４に対して正規化した。（Ｃ）ＤＭＳＯ（Ｄ）またはＣａｌ（Ｃ）で処理した（ｎ＝３）、前活性化（収集後３日間培養）または活性化（収集後７日間培養）初代マウスＰＳＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの選択された遺伝子を表すヒートマップ。ＶＤＲ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１およびＶｄｒを対照として示す。表３に関連。（Ｄ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＣａｌの存在下で培養した活性化初代マウスＰＳＣにおける血管新生の負（上）および正（下）の制御因子の相対的存在量を示すヒートマップ。（Ｅ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理したＣＡＰＳＣにおけるＰＳＣ活性化またはがんシグネチャーからの選択された遺伝子の発現レベル。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤをプロットする。ｑＲＴ−ＰＣＲを技術的に３連で行い、値を３６Ｂ４に対して正規化した。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｆ）ＣＡＰＳＣに、ＶＤＲに対するｓｉＲＮＡのプール（ｓｉＶＤＲ）または非標的化対照（ｓｉＮＴ）をトランスフェクトした。次いで、細胞をＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。値を３６Ｂ４に対して正規化した。結果は３つの患者試料の代表であり、平均値＋ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図４Ａ〜４Ｃは、図６に関連する、ＶＤＲ活性化はＰＳＣにおけるＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路に拮抗することを示す図である。（Ａ）ビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオール（Ｃａｌ）で４８時間処理した初代ヒトＣＡＰＳＣを固定し、中性脂質の検出用にＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色した。６つの画像（１９／２７試料を代表する）は、Ｃａｌ処理細胞を表し、静止状態の特徴である細胞質脂肪滴を含んでいる。（Ｂ）ｈＰＳＣ細胞系を急性的に、１ｎｇ／ｍｌＴＧＦβで４時間活性化し、１００ｎＭカルシポトリオール（Ｃａｌ）で１６時間前処理した。細胞を固定し、ＳＭＡＤ３およびＶＤＲ、ならびにアイソタイプ対照としてウサギＩｇＧ用にクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）にかけた。クロマチン免疫沈降をＱＰＣＲによって分析して、ＶＤＲおよびＳＭＡＤ３の、ＨＡＳ２および（Ｃ）ＣＯＬ１Ａ１遺伝子のプロモーター領域に対する結合を評価した。ウサギＩｇＧを、両方の抗体に対するアイソタイプ対照として供した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。 図５Ａ〜５Ｃは、図６に関連する、セルレイン誘発性膵炎の間、ＶＤＲ活性化により炎症および線維症が低減することを示す図である。慢性（ｎ＝１０）および急性（ｎ＝５）の膵炎の方法の詳細は、実施例１を参照されたい。膵臓を収集し、スライスし、直ちにホルマリンで固定し、またはＯＣＴに包埋し、凍結した。（Ａ）示される処置群からのＦＦＰＥ切片のＨ＆Ｅ染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）示される処置群からの凍結切片に対する、コラーゲンＩおよびＰＳＣマーカーＧＦＡＰに対する同時免疫蛍光法。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）６月齢の野生型およびＶｄｒ−／−同腹仔からの膵臓を収集し、コラーゲンをシリウスレッドで染色した。遺伝子型ごとに代表的な２試料を示す（ｎ＝８）。スケールバー＝５００μｍ。 図６Ａ〜６Ｈは、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＣ活性化を変調することを示す図である。（Ａ）セルレイン（Ｃｅｒ）またはセルレイン＋Ｃａｌを１２週間注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝１０）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）セルレインまたはセルレイン＋Ｃａｌで１２週間処置した野生型マウスからの凍結切片上の、ホスホ−Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ３）に対する免疫蛍光染色の定量化（ｎ＝５）。（Ｃ）急性膵炎を誘発するためにＣｅｒまたはＣｅｒ＋Ｃａｌを注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（詳細は実施例１を参照されたい；ｎ＝５）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｄ）急性膵炎を有するマウスにおいて、ＣＤ４５陽性細胞によって測定した白血球の動員（凍結切片の免疫蛍光染色、２００×視野における陽性細胞、ｎ＝５）。（Ｅ）急性膵炎を有するマウスにおいて、シリウスレッド染色によって測定した線維症（２００×視野あたり、ｎ＝５）。（Ｆ）急性膵炎を誘発するためにセルレインを注射したＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝５）。平均値＋ＳＤを示し、値をＢ２Ｍに対して正規化した。（Ｇ）急性膵炎を有するＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスにおけるシリウスレッド陽性面積（２００×視野あたり、ｎ＝５）。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｈ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処置後のＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図６Ａ〜６Ｈは、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＣ活性化を変調することを示す図である。（Ａ）セルレイン（Ｃｅｒ）またはセルレイン＋Ｃａｌを１２週間注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝１０）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）セルレインまたはセルレイン＋Ｃａｌで１２週間処置した野生型マウスからの凍結切片上の、ホスホ−Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ３）に対する免疫蛍光染色の定量化（ｎ＝５）。（Ｃ）急性膵炎を誘発するためにＣｅｒまたはＣｅｒ＋Ｃａｌを注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（詳細は実施例１を参照されたい；ｎ＝５）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｄ）急性膵炎を有するマウスにおいて、ＣＤ４５陽性細胞によって測定した白血球の動員（凍結切片の免疫蛍光染色、２００×視野における陽性細胞、ｎ＝５）。（Ｅ）急性膵炎を有するマウスにおいて、シリウスレッド染色によって測定した線維症（２００×視野あたり、ｎ＝５）。（Ｆ）急性膵炎を誘発するためにセルレインを注射したＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝５）。平均値＋ＳＤを示し、値をＢ２Ｍに対して正規化した。（Ｇ）急性膵炎を有するＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスにおけるシリウスレッド陽性面積（２００×視野あたり、ｎ＝５）。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｈ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処置後のＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図６Ａ〜６Ｈは、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＣ活性化を変調することを示す図である。（Ａ）セルレイン（Ｃｅｒ）またはセルレイン＋Ｃａｌを１２週間注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝１０）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）セルレインまたはセルレイン＋Ｃａｌで１２週間処置した野生型マウスからの凍結切片上の、ホスホ−Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ３）に対する免疫蛍光染色の定量化（ｎ＝５）。（Ｃ）急性膵炎を誘発するためにＣｅｒまたはＣｅｒ＋Ｃａｌを注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（詳細は実施例１を参照されたい；ｎ＝５）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｄ）急性膵炎を有するマウスにおいて、ＣＤ４５陽性細胞によって測定した白血球の動員（凍結切片の免疫蛍光染色、２００×視野における陽性細胞、ｎ＝５）。（Ｅ）急性膵炎を有するマウスにおいて、シリウスレッド染色によって測定した線維症（２００×視野あたり、ｎ＝５）。（Ｆ）急性膵炎を誘発するためにセルレインを注射したＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝５）。平均値＋ＳＤを示し、値をＢ２Ｍに対して正規化した。（Ｇ）急性膵炎を有するＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスにおけるシリウスレッド陽性面積（２００×視野あたり、ｎ＝５）。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｈ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処置後のＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図６Ａ〜６Ｈは、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＣ活性化を変調することを示す図である。（Ａ）セルレイン（Ｃｅｒ）またはセルレイン＋Ｃａｌを１２週間注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝１０）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）セルレインまたはセルレイン＋Ｃａｌで１２週間処置した野生型マウスからの凍結切片上の、ホスホ−Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ３）に対する免疫蛍光染色の定量化（ｎ＝５）。（Ｃ）急性膵炎を誘発するためにＣｅｒまたはＣｅｒ＋Ｃａｌを注射したマウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（詳細は実施例１を参照されたい；ｎ＝５）。値を３６ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤとしてプロットする。（Ｄ）急性膵炎を有するマウスにおいて、ＣＤ４５陽性細胞によって測定した白血球の動員（凍結切片の免疫蛍光染色、２００×視野における陽性細胞、ｎ＝５）。（Ｅ）急性膵炎を有するマウスにおいて、シリウスレッド染色によって測定した線維症（２００×視野あたり、ｎ＝５）。（Ｆ）急性膵炎を誘発するためにセルレインを注射したＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル（ｎ＝５）。平均値＋ＳＤを示し、値をＢ２Ｍに対して正規化した。（Ｇ）急性膵炎を有するＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスにおけるシリウスレッド陽性面積（２００×視野あたり、ｎ＝５）。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。（Ｈ）ＤＭＳＯまたは１００ｎＭ Ｃａｌで４８時間処置後のＶｄｒ＋／＋およびＶｄｒ−／−マウスから単離したＰＳＣにおける、選択された遺伝子の発現レベル。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意ではない）。 図７Ａ〜７Ｃは、図８に関連して、ＶＤＲはＰＳＣにおいて一貫して発現され、リガンド応答性であるが、発現は変動性であり、転写活性は膵臓がん細胞ではより低いことを示す図である。（Ａ）ＶＤＲ発現を、示される膵臓がん細胞系５つ、およびＣＡＰＳＣ試料３つ（００５１、００５２、および００５６）におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｂ）示される細胞系または試料をビヒクルまたはＣａｌ（１００ｎＭ、１６時間）とインキュベートし、ＶＤＲ標的遺伝子ＣＹＰ２４Ａ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６Ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを表す。（Ｃ）ヒトＰＤＡの切除した切片を、ＶＤＲおよびα−ＳＭＡ（活性化ＰＳＣのマーカー）の二重免疫蛍光染色に使用した。核をＤＡＰＩで対比染色した。バー：４０μｍ。 図８Ａ〜８Ｉは、間質のＶＤＲ活性化により腫瘍形成促進性の（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）パラクリンシグナル伝達が低減することを示す図である。（Ａ）１００ｎＭ Ｃａｌ４８時間対培地単独（左）で、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）４８時間対培地単独（中央）で、またはＣａｌ処理したＣＡＰＳＣ（１００ｎＭ、４８時間）からのＣＭで４８時間対培地単独で処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞中ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出された、遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロット。青色は有意な変化を示し、赤色は有意な変化はないことを示す。（Ｂ）培地単独（ＤＭＥＭ）に対する倍数変化としてプロットした、（Ａ）に記載したＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、選択された遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ〜Ｇ）上記に記載した通り、示される細胞系を、Ｃａｌと直接、またはＣａｌ処理ありもしくはなしのＣＡＰＳＣからのＣＭとインキュベートした。候補遺伝子ＣＸＣＬ１、ＣＳＦ２、およびＡＵＲＫＢの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。値を３６Ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤを示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。結果を１患者の試料での反復として示し、複数の患者試料（ｎ＝４）からの結果を代表するものであるが、試料間の変動性が認められた。（Ｈ）１００ｎＭ Ｃａｌ、ＣＡＰＳＣ ＣＭ、Ｃａｌ＋ＣＡＰＳＣ ＣＭ、またはＣａｌ＋ＣＡＰＳＣ（Ｃａｌ処置）ＣＭで４８時間処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞からのｐ−ＳＴＡＴ３に対する免疫ブロット。アクチンはローディング対照として作用した。値は濃度測定の比率を示す（ｐ−ＳＴＡＴ３／アクチン）。（Ｉ）上記に記載した通りに処理し、示される用量のゲムシタビンと４８時間インキュベートした、ＭｉａＰａＣａ−２細胞の変動性。結果はＣＡＰＳＣ ＣＭ試料３つの代表であり、平均値±ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。アスタリスクは、示される用量のゲムシタビンの、ＣＭとＣＭ（ＰＳＣ＋Ｃａｌ）との試料間の変動性における統計学的な有意差を示す。 図８Ａ〜８Ｉは、間質のＶＤＲ活性化により腫瘍形成促進性の（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）パラクリンシグナル伝達が低減することを示す図である。（Ａ）１００ｎＭ Ｃａｌ４８時間対培地単独（左）で、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）４８時間対培地単独（中央）で、またはＣａｌ処理したＣＡＰＳＣ（１００ｎＭ、４８時間）からのＣＭで４８時間対培地単独で処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞中ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出された、遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロット。青色は有意な変化を示し、赤色は有意な変化はないことを示す。（Ｂ）培地単独（ＤＭＥＭ）に対する倍数変化としてプロットした、（Ａ）に記載したＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、選択された遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ〜Ｇ）上記に記載した通り、示される細胞系を、Ｃａｌと直接、またはＣａｌ処理ありもしくはなしのＣＡＰＳＣからのＣＭとインキュベートした。候補遺伝子ＣＸＣＬ１、ＣＳＦ２、およびＡＵＲＫＢの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。値を３６Ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤを示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。結果を１患者の試料での反復として示し、複数の患者試料（ｎ＝４）からの結果を代表するものであるが、試料間の変動性が認められた。（Ｈ）１００ｎＭ Ｃａｌ、ＣＡＰＳＣ ＣＭ、Ｃａｌ＋ＣＡＰＳＣ ＣＭ、またはＣａｌ＋ＣＡＰＳＣ（Ｃａｌ処置）ＣＭで４８時間処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞からのｐ−ＳＴＡＴ３に対する免疫ブロット。アクチンはローディング対照として作用した。値は濃度測定の比率を示す（ｐ−ＳＴＡＴ３／アクチン）。（Ｉ）上記に記載した通りに処理し、示される用量のゲムシタビンと４８時間インキュベートした、ＭｉａＰａＣａ−２細胞の変動性。結果はＣＡＰＳＣ ＣＭ試料３つの代表であり、平均値±ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。アスタリスクは、示される用量のゲムシタビンの、ＣＭとＣＭ（ＰＳＣ＋Ｃａｌ）との試料間の変動性における統計学的な有意差を示す。 図８Ａ〜８Ｉは、間質のＶＤＲ活性化により腫瘍形成促進性の（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）パラクリンシグナル伝達が低減することを示す図である。（Ａ）１００ｎＭ Ｃａｌ４８時間対培地単独（左）で、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）４８時間対培地単独（中央）で、またはＣａｌ処理したＣＡＰＳＣ（１００ｎＭ、４８時間）からのＣＭで４８時間対培地単独で処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞中ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出された、遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロット。青色は有意な変化を示し、赤色は有意な変化はないことを示す。（Ｂ）培地単独（ＤＭＥＭ）に対する倍数変化としてプロットした、（Ａ）に記載したＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、選択された遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ〜Ｇ）上記に記載した通り、示される細胞系を、Ｃａｌと直接、またはＣａｌ処理ありもしくはなしのＣＡＰＳＣからのＣＭとインキュベートした。候補遺伝子ＣＸＣＬ１、ＣＳＦ２、およびＡＵＲＫＢの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。値を３６Ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤを示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。結果を１患者の試料での反復として示し、複数の患者試料（ｎ＝４）からの結果を代表するものであるが、試料間の変動性が認められた。（Ｈ）１００ｎＭ Ｃａｌ、ＣＡＰＳＣ ＣＭ、Ｃａｌ＋ＣＡＰＳＣ ＣＭ、またはＣａｌ＋ＣＡＰＳＣ（Ｃａｌ処置）ＣＭで４８時間処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞からのｐ−ＳＴＡＴ３に対する免疫ブロット。アクチンはローディング対照として作用した。値は濃度測定の比率を示す（ｐ−ＳＴＡＴ３／アクチン）。（Ｉ）上記に記載した通りに処理し、示される用量のゲムシタビンと４８時間インキュベートした、ＭｉａＰａＣａ−２細胞の変動性。結果はＣＡＰＳＣ ＣＭ試料３つの代表であり、平均値±ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。アスタリスクは、示される用量のゲムシタビンの、ＣＭとＣＭ（ＰＳＣ＋Ｃａｌ）との試料間の変動性における統計学的な有意差を示す。 図８Ａ〜８Ｉは、間質のＶＤＲ活性化により腫瘍形成促進性の（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）パラクリンシグナル伝達が低減することを示す図である。（Ａ）１００ｎＭ Ｃａｌ４８時間対培地単独（左）で、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）４８時間対培地単独（中央）で、またはＣａｌ処理したＣＡＰＳＣ（１００ｎＭ、４８時間）からのＣＭで４８時間対培地単独で処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞中ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出された、遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロット。青色は有意な変化を示し、赤色は有意な変化はないことを示す。（Ｂ）培地単独（ＤＭＥＭ）に対する倍数変化としてプロットした、（Ａ）に記載したＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、選択された遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ〜Ｇ）上記に記載した通り、示される細胞系を、Ｃａｌと直接、またはＣａｌ処理ありもしくはなしのＣＡＰＳＣからのＣＭとインキュベートした。候補遺伝子ＣＸＣＬ１、ＣＳＦ２、およびＡＵＲＫＢの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。値を３６Ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤを示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。結果を１患者の試料での反復として示し、複数の患者試料（ｎ＝４）からの結果を代表するものであるが、試料間の変動性が認められた。（Ｈ）１００ｎＭ Ｃａｌ、ＣＡＰＳＣ ＣＭ、Ｃａｌ＋ＣＡＰＳＣ ＣＭ、またはＣａｌ＋ＣＡＰＳＣ（Ｃａｌ処置）ＣＭで４８時間処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞からのｐ−ＳＴＡＴ３に対する免疫ブロット。アクチンはローディング対照として作用した。値は濃度測定の比率を示す（ｐ−ＳＴＡＴ３／アクチン）。（Ｉ）上記に記載した通りに処理し、示される用量のゲムシタビンと４８時間インキュベートした、ＭｉａＰａＣａ−２細胞の変動性。結果はＣＡＰＳＣ ＣＭ試料３つの代表であり、平均値±ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。アスタリスクは、示される用量のゲムシタビンの、ＣＭとＣＭ（ＰＳＣ＋Ｃａｌ）との試料間の変動性における統計学的な有意差を示す。 図８Ａ〜８Ｉは、間質のＶＤＲ活性化により腫瘍形成促進性の（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）パラクリンシグナル伝達が低減することを示す図である。（Ａ）１００ｎＭ Ｃａｌ４８時間対培地単独（左）で、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）４８時間対培地単独（中央）で、またはＣａｌ処理したＣＡＰＳＣ（１００ｎＭ、４８時間）からのＣＭで４８時間対培地単独で処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞中ＲＮＡ−Ｓｅｑによって検出された、遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロット。青色は有意な変化を示し、赤色は有意な変化はないことを示す。（Ｂ）培地単独（ＤＭＥＭ）に対する倍数変化としてプロットした、（Ａ）に記載したＲＮＡ−Ｓｅｑ分析からの、選択された遺伝子を表すヒートマップ。（Ｃ〜Ｇ）上記に記載した通り、示される細胞系を、Ｃａｌと直接、またはＣａｌ処理ありもしくはなしのＣＡＰＳＣからのＣＭとインキュベートした。候補遺伝子ＣＸＣＬ１、ＣＳＦ２、およびＡＵＲＫＢの発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。値を３６Ｂ４に対して正規化し、平均値＋ＳＤを示す。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。結果を１患者の試料での反復として示し、複数の患者試料（ｎ＝４）からの結果を代表するものであるが、試料間の変動性が認められた。（Ｈ）１００ｎＭ Ｃａｌ、ＣＡＰＳＣ ＣＭ、Ｃａｌ＋ＣＡＰＳＣ ＣＭ、またはＣａｌ＋ＣＡＰＳＣ（Ｃａｌ処置）ＣＭで４８時間処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞からのｐ−ＳＴＡＴ３に対する免疫ブロット。アクチンはローディング対照として作用した。値は濃度測定の比率を示す（ｐ−ＳＴＡＴ３／アクチン）。（Ｉ）上記に記載した通りに処理し、示される用量のゲムシタビンと４８時間インキュベートした、ＭｉａＰａＣａ−２細胞の変動性。結果はＣＡＰＳＣ ＣＭ試料３つの代表であり、平均値±ＳＤとしてプロットする。統計学的有意性をスチューデントの独立ｔ検定によって決定した（＊ｐ＜０．０５）。アスタリスクは、示される用量のゲムシタビンの、ＣＭとＣＭ（ＰＳＣ＋Ｃａｌ）との試料間の変動性における統計学的な有意差を示す。 図９Ａ〜９Ｇは、図１０に関連して、ＶＤＲリガンドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＡにおける間質活性化を低減することを示す図である。マウスＰＤＡに由来する膵臓がん細胞系３つを、ＶＤＲ発現および活性に関して、マウスＰＳＣと比べた。（Ａ）ＲＮＡを、示される細胞系および活性化したマウスＰＳＣ（培養７日目）から単離し、Ｖｄｒ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｂ）示される細胞型をビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオールで１６時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｖｄｒ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｃ）ＰＳＣを模擬手術および同種移植のレシピエントから単離した。ＲＮＡを単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＰＳＣ活性化マーカーの発現を測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｄ）模擬手術または同種移植のレシピエントから膵臓を回収し、ホルマリン固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色に使用した。ＫＰＣマウスにおけるＰＤＡからの代表的な三色染色を比較用に示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与したＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、ホルマリンで固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色で染色した（以下の２００×視野あたりを定量化；ｎ＝５、スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。（ＦおよびＧ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与し、処置の最後の１２日間２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンＱ３ＤＸ４を腹腔内注射した、ＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、スライスし、直ちにホルマリンで固定し、または液体窒素中凍結した。（Ｆ）ＦＦＰＥ切片を、ホスホ−ヒストンＨ３の免疫組織学的染色およびその後の定量化に使用した（実験手順を参照されたい）。プロットは、範囲、中央値、および四分位数を示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）瞬間凍結した膵臓をホモジナイズし、ＲＮＡを単離し、本発明者らの遺伝子シグネチャーからの間質および上皮の遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．＝有意ではない。 図９Ａ〜９Ｇは、図１０に関連して、ＶＤＲリガンドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＡにおける間質活性化を低減することを示す図である。マウスＰＤＡに由来する膵臓がん細胞系３つを、ＶＤＲ発現および活性に関して、マウスＰＳＣと比べた。（Ａ）ＲＮＡを、示される細胞系および活性化したマウスＰＳＣ（培養７日目）から単離し、Ｖｄｒ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｂ）示される細胞型をビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオールで１６時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｖｄｒ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｃ）ＰＳＣを模擬手術および同種移植のレシピエントから単離した。ＲＮＡを単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＰＳＣ活性化マーカーの発現を測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｄ）模擬手術または同種移植のレシピエントから膵臓を回収し、ホルマリン固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色に使用した。ＫＰＣマウスにおけるＰＤＡからの代表的な三色染色を比較用に示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与したＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、ホルマリンで固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色で染色した（以下の２００×視野あたりを定量化；ｎ＝５、スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。（ＦおよびＧ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与し、処置の最後の１２日間２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンＱ３ＤＸ４を腹腔内注射した、ＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、スライスし、直ちにホルマリンで固定し、または液体窒素中凍結した。（Ｆ）ＦＦＰＥ切片を、ホスホ−ヒストンＨ３の免疫組織学的染色およびその後の定量化に使用した（実験手順を参照されたい）。プロットは、範囲、中央値、および四分位数を示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）瞬間凍結した膵臓をホモジナイズし、ＲＮＡを単離し、本発明者らの遺伝子シグネチャーからの間質および上皮の遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．＝有意ではない。 図９Ａ〜９Ｇは、図１０に関連して、ＶＤＲリガンドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＡにおける間質活性化を低減することを示す図である。マウスＰＤＡに由来する膵臓がん細胞系３つを、ＶＤＲ発現および活性に関して、マウスＰＳＣと比べた。（Ａ）ＲＮＡを、示される細胞系および活性化したマウスＰＳＣ（培養７日目）から単離し、Ｖｄｒ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。（Ｂ）示される細胞型をビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオールで１６時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｖｄｒ標的遺伝子Ｃｙｐ２４ａ１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｃ）ＰＳＣを模擬手術および同種移植のレシピエントから単離した。ＲＮＡを単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＰＳＣ活性化マーカーの発現を測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｄ）模擬手術または同種移植のレシピエントから膵臓を回収し、ホルマリン固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色に使用した。ＫＰＣマウスにおけるＰＤＡからの代表的な三色染色を比較用に示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与したＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、ホルマリンで固定した。ＦＦＰＥ切片をマッソン三色染色で染色した（以下の２００×視野あたりを定量化；ｎ＝５、スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５）。スケールバー＝１００μｍ。（ＦおよびＧ）６０μｇ／ｋｇカルシポトリオールまたは食塩水の腹腔内注射を２１日間、毎日投与し、処置の最後の１２日間２０ｍｇ／ｋｇゲムシタビンＱ３ＤＸ４を腹腔内注射した、ＰＤＡ同種移植のレシピエント。膵臓を回収し、スライスし、直ちにホルマリンで固定し、または液体窒素中凍結した。（Ｆ）ＦＦＰＥ切片を、ホスホ−ヒストンＨ３の免疫組織学的染色およびその後の定量化に使用した（実験手順を参照されたい）。プロットは、範囲、中央値、および四分位数を示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）瞬間凍結した膵臓をホモジナイズし、ＲＮＡを単離し、本発明者らの遺伝子シグネチャーからの間質および上皮の遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．＝有意ではない。 図１０Ａ〜１０Ｅは、間質のＶＤＲ活性化は、ゲムシタビンと組み合わせた場合、ｉｎ ｖｉｖｏにおける膵臓癌腫に対する有効性を示すことを示す図である。ＫＰＣマウスをゲムシタビン（Ｇｅｍ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ）、またはＧｅｍ＋Ｃａｌで９日間処置した（別に示されなければ、Ｇｅｍ：ｎ＝４；Ｃａｌ：ｎ＝７；Ｇｅｍ＋Ｃａｌ：ｎ＝７）。（Ａ）高分解度超音波によって測定した、試験のエンドポイントの腫瘍体積におけるパーセント変化。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。＊ｐ＜０．０２；クルスカル−ワリスおよびダン（Ｄｕｎｎ）のノンパラメトリック比較検定。（Ｂ）アニリンブルー染色したコラーゲン線維を、２００×視野あたりの陽性のピクセルとして定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）腫瘍ホモジネート中の遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントの独立ｔ検定により＊ｐ＜０．０５（Ｇｅｍ単独に比べて）。（Ｄ）ゲムシタビンの最終用量の２時間後、Ｇｅｍ処置およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置したマウス（それぞれｎ＝４および７）における、ゲムシタビントリホスフェートの腫瘍内濃度（ｄＦｄＣＴＰ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定）。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）切断したカスパーゼ−３（ＣＣ３）に対するＩＨＣを、２００×視野あたりのＣＣ３陽性腫瘍細胞の％として定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。 図１０Ａ〜１０Ｅは、間質のＶＤＲ活性化は、ゲムシタビンと組み合わせた場合、ｉｎ ｖｉｖｏにおける膵臓癌腫に対する有効性を示すことを示す図である。ＫＰＣマウスをゲムシタビン（Ｇｅｍ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ）、またはＧｅｍ＋Ｃａｌで９日間処置した（別に示されなければ、Ｇｅｍ：ｎ＝４；Ｃａｌ：ｎ＝７；Ｇｅｍ＋Ｃａｌ：ｎ＝７）。（Ａ）高分解度超音波によって測定した、試験のエンドポイントの腫瘍体積におけるパーセント変化。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。＊ｐ＜０．０２；クルスカル−ワリスおよびダン（Ｄｕｎｎ）のノンパラメトリック比較検定。（Ｂ）アニリンブルー染色したコラーゲン線維を、２００×視野あたりの陽性のピクセルとして定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）腫瘍ホモジネート中の遺伝子発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。スチューデントの独立ｔ検定により＊ｐ＜０．０５（Ｇｅｍ単独に比べて）。（Ｄ）ゲムシタビンの最終用量の２時間後、Ｇｅｍ処置およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置したマウス（それぞれｎ＝４および７）における、ゲムシタビントリホスフェートの腫瘍内濃度（ｄＦｄＣＴＰ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定）。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）切断したカスパーゼ−３（ＣＣ３）に対するＩＨＣを、２００×視野あたりのＣＣ３陽性腫瘍細胞の％として定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マン−ホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。 図１１Ａ〜１１Ｂは、図１２に関連して、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでゲムシタビンの有効性を増大することを示す図である。（Ａ）ＰＤＡを有するＫＰＣマウスを示される通りに処置し、処置の開始前、処置４日目、および試験のエンドポイント時に、高分解能超音波により画像化した（実施例１を参照されたい）。ゲムシタビンのコホートにおけるマウス１匹は４日目に画像化されず、ＣａｌおよびＧｅｍ＋Ｃａｌ両方のコホートからマウス２匹を、エンドポイントの前に、施設のガイドラインに従って屠殺した。ウォーターフォールプロットは、処置４日目（上）および試験のエンドポイント時（下）に前処理した腫瘍体積からの体積増大の％を示す。（Ｂ）腫瘍を、示されるレジメンで処置したＫＰＣマウスから収集し、ホモジネートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析して、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ；上左）およびゲムシタビンの脱アミノ代謝産物（ｄＦｄＵ；上右）の腫瘍内濃度を決定した。ｄＦｄＣ／ｄＦｄＵの比率を下列に示す。ラインは平均値±ＳＤを示す。異常値を同定し、赤色ボックス中に示した。 図１１Ａ〜１１Ｂは、図１２に関連して、ＶＤＲリガンドはｉｎ ｖｉｖｏでゲムシタビンの有効性を増大することを示す図である。（Ａ）ＰＤＡを有するＫＰＣマウスを示される通りに処置し、処置の開始前、処置４日目、および試験のエンドポイント時に、高分解能超音波により画像化した（実施例１を参照されたい）。ゲムシタビンのコホートにおけるマウス１匹は４日目に画像化されず、ＣａｌおよびＧｅｍ＋Ｃａｌ両方のコホートからマウス２匹を、エンドポイントの前に、施設のガイドラインに従って屠殺した。ウォーターフォールプロットは、処置４日目（上）および試験のエンドポイント時（下）に前処理した腫瘍体積からの体積増大の％を示す。（Ｂ）腫瘍を、示されるレジメンで処置したＫＰＣマウスから収集し、ホモジネートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析して、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ；上左）およびゲムシタビンの脱アミノ代謝産物（ｄＦｄＵ；上右）の腫瘍内濃度を決定した。ｄＦｄＣ／ｄＦｄＵの比率を下列に示す。ラインは平均値±ＳＤを示す。異常値を同定し、赤色ボックス中に示した。 図１２Ａ〜１２Ｃは、ＶＤＲリガンドはゲムシタビンの送達および有効性を増強することを示す図である。ＫＰＣマウスを９日間、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ）、またはＧｅｍ＋Ｃａｌで処置した（別に示されなければ、Ｇｅｍ：ｎ＝４；Ｃａｌ：ｎ＝７；Ｇｅｍ＋Ｃａｌ：ｎ＝７）。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した腫瘍ホモジネートにおけるＤｃｋおよびＣｄａ遺伝子の発現。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｂ）ＣＤ３１に対するＩＨＣを、４００×視野あたりのＣＤ３１（ＮｏｖａＲｅｄ）陽性面積として定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マンホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）Ｇｅｍ処置、およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置したＫＰＣ腫瘍からの代表的なＣＤ３１のＩＨＣ。矢印は、ゲムシタビン処置した腫瘍における崩壊した血管（上）、およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置腫瘍における見かけの管腔を有する血管（下）を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１２Ａ〜１２Ｃは、ＶＤＲリガンドはゲムシタビンの送達および有効性を増強することを示す図である。ＫＰＣマウスを９日間、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）、カルシポトリオール（Ｃａｌ）、またはＧｅｍ＋Ｃａｌで処置した（別に示されなければ、Ｇｅｍ：ｎ＝４；Ｃａｌ：ｎ＝７；Ｇｅｍ＋Ｃａｌ：ｎ＝７）。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した腫瘍ホモジネートにおけるＤｃｋおよびＣｄａ遺伝子の発現。値を３６ｂ４に対して正規化した。バーは平均値＋ＳＤを示す。（Ｂ）ＣＤ３１に対するＩＨＣを、４００×視野あたりのＣＤ３１（ＮｏｖａＲｅｄ）陽性面積として定量した。プロットは範囲、中央値、および四分位数を示す。マンホイットニーのＵ検定により＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）Ｇｅｍ処置、およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置したＫＰＣ腫瘍からの代表的なＣＤ３１のＩＨＣ。矢印は、ゲムシタビン処置した腫瘍における崩壊した血管（上）、およびＧｅｍ＋Ｃａｌ処置腫瘍における見かけの管腔を有する血管（下）を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１３は、膵臓の腫瘍−間質クロストークを限定する、シグナル依存的間質リモデリングにおけるＶＤＲに対する役割を示すモデルである。ＰＳＣは活性化の間、腫瘍支持的な機能を進行的に獲得するが、これは、上皮のコンパートメントから（およびおそらくは免疫／炎症細胞から）分泌される因子によって、膵臓の傷害ならびに腫瘍の進行により駆動されるプロセスである。ＶＤＲ活性化は、ＰＳＣの、より静止状態の、より腫瘍支持的でない状態への復帰を駆動する。したがって、膵臓の腫瘍を、腫瘍細胞を標的化するゲムシタビン、およびＰＳＣを非活性化するＶＤＲリガンドで同時処理することにより、ゲムシタビン単独の送達および有効性に対する主なバリアを表す、腫瘍−間質の相互のクロストークの全体的な低減がもたらされる。
配列表
核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定される通り、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字の略語を使用して示す。各核酸配列の鎖を１つだけ示すが、相補的な鎖が、示される鎖に対するあらゆる参照として含まれることが理解される。
配列番号１から１０６は例示的なプライマー配列を示す。
用語および方法の以下の説明は、本開示をよりよく記載し、当業者が本開示を実施するのを導くために提供する。単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明らかな指示がなければ、１つまたは１つを超えるものを意味する。例えば、「ＶＤＲアゴニストを含む」の語は単一または複数のＶＤＲアゴニストを含み、「少なくとも１つのＶＤＲアゴニストを含む」の句と等価と考えられる。「または」の語は、文脈による別段の明らかな指示がなければ、記載する代替のエレメントの単一のエレメント、または２つもしくはそれを超えるエレメントの組合せを意味する。本明細書で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む」は、付加的なエレメントを排除せずに「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む」を意味する。本明細書に言及するＧｅｎｂａｎｋ受託番号は全て、２０１４年６月５日に入手できる配列に対する参照によって組み入れられる。特許および特許出願、ならびに本明細書に列挙するＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号を含めた参照は全て、参照によって組み入れられる。
別段の説明がなければ、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野における通常の技術者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するのと同様、または等価の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載するものである。材料、方法、および例は説明にすぎず、限定的ではないものとされる。
本開示を実施または試験するのに適する方法および材料は以下に記載するものである。しかし、提供する材料、方法、および例は説明にすぎず、限定的ではないものとされる。したがって、別段の記載があるものを除き、本開示の方法および技術は、記載するものと同様もしくは等価の方法および材料に従って、ならびに／または当技術分野では周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用され、論じられる、様々な一般的でより具体的な参照に記載される通り、行うことができる。
用語
本開示の様々な実施形態の概説を促進するために、特定の用語の以下の説明を提供する。
投与：経口、直腸、膣、経皮、および非経口の投与を含む。一般的に、非経口製剤は、経口摂取以外のあらゆる可能な様式によって投与されるものである。この用語はまた、静脈内投与であっても、髄腔内投与であっても、筋肉内投与であっても、腹腔内投与であっても、関節内投与であっても、腫瘍内投与であっても、または皮下投与であっても、注射を意味し、ならびに鼻腔内、吸入、皮内、および局所適用などを含めた、様々な表面適用を意味する。よって、ＶＤＲアゴニスト、ならびに化学療法および生物療法は、当技術分野では公知であるあらゆる方法によって投与することができる。
接触：１薬剤を別の１薬剤に近接して接近させ、それにより薬剤を相互作用させること。例えば、ＶＤＲアゴニストを含む組成物は、細胞（例えば、組織培養物中の）に適用し、または被験体に投与し、それによりＶＤＲアゴニストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞（例えば、星状細胞もしくはがん細胞）と相互作用させることができる。
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）：ＯＭＩＭ６００８３５。間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）としても知られる。インタークリンファミリーの間質細胞由来アルファケモカインメンバー。コードされるタンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体であるケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４に対するリガンドとして機能し、胚形成、免疫監視、炎症応答、組織のホメオスタシス、ならびに腫瘍の増殖および転移を含めた多くの多様な細胞機能において役割を果たす。ＣＸＣＬ１２配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベース（例えば、受託番号ＮＰ＿００１１７１６０５．１、ＡＡＶ４９９９９．１、ＡＡＴ７６４３７．１、ＣＲ４５０２８３．１、ＮＭ＿００１００９５８０．１、およびＡＹ８０２７８２．１）などから公的に入手できる。当業者であれば、ＣＸＣＬ１２バリアント（例えば、上記に提供するものなど、ＣＸＣＬ１２活性を有し、天然のＣＸＣＬ１２配列に少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、または少なくとも８０％の配列同一性を保持するバリアントなど）を含めた、さらなるＣＸＣＬ１２の核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
単離された：「単離された」生物学的構成成分（例えば、核酸分子、ペプチド、または細胞）は、混合試料（例えば、細胞抽出物）中の他の生物学的構成成分から精製分離される。例えば、「単離された」ペプチドまたは核酸分子は、ペプチドまたは核酸分子が存在していた細胞（例えば、組換えペプチドもしくは核酸分子のための発現宿主細胞）の他の構成成分から分離されたペプチドまたは核酸分子である。
膵臓がん：膵臓内の悪性腫瘍。予後は一般的によくない。膵臓がんの約９５％は腺癌である。残りの５％は、外分泌の膵臓の腫瘍（例えば、漿液性嚢胞腺腫）、腺房細胞がん、および膵臓の神経内分泌腫瘍（例えば、インスリノーマ）である。「インスリノーマ」は、インスリンを分泌する能力を保持するベータ細胞のがんである。インスリノーマを有する患者は通常、神経糖低糖症（ｎｅｕｒｏｇｌｙｃｏｐｅｎｉｃ）症状を発症する。神経糖低糖症症状には、特に運動または空腹時の、反復性の頭痛、嗜眠、複視、およびかすみ目が含まれる。重度の低血糖症は、てんかん、昏睡、および持続性の神経学的損傷をもたらし得る。低血糖に対するカテコールアミン作動性の応答に由来する症状（例えば、振戦、心悸亢進、頻脈、発汗、空腹感、不安、悪心）。膵臓腺癌は腺組織に生じる。症状には、腹痛、食欲不振、体重減少、黄疸、および胆嚢の無痛性の拡張が含まれる。
腺癌およびインスリノーマを含めた膵臓がんに対する古典的な処置には、外科切除（Ｗｈｉｐｐｌｅ法など）、ならびに、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、およびタンパク質が結合したパクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））の１つまたは複数などの薬剤、例えばゲムシタビン／Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の併用の化学療法が含まれる。
膵炎：膵臓の炎症。一部の例では、ＩＩ型糖尿病の処置または管理に使用されるものなどのＧＬＰ−１によって引き起こされる。一例では、ＧＬＰ−１アゴニストによって引き起こされる膵炎を有する被験体を、開示された方法を使用して処置する。別の例では、ＧＬＰ−１アゴニストで処置されている（または以前に処置された）被験体を、今後の膵炎の発症を防ぐために、開示された方法を使用して処置する。
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体は慣例的なものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、本明細書に開示する組成物の医薬上の送達に適する組成物および製剤を記載するものである。例えば、ＶＤＲアゴニスト、化学療法剤、または生物製剤を、１つ（ｏｎ）または複数の薬学的に許容される担体の存在下で投与することができる。
一般的に、担体の性質は、使用する特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）では、従来の非毒性の固体担体は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムなどを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、および酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどのｐＨ緩衝剤など、微量（ｍｉｎｏｒ ａｍｏｕｎｔ）の非毒性の補助物質を含むことができる。他の医薬組成物の実施形態は、当業者であれば知っている通り、慣例的な薬学的に許容される担体、アジュバント、および対イオンと調製することができる。一部の実施形態における組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、散剤、液剤、溶液剤、または懸濁剤など、固体、半固体、および液体の剤形における単位用量の形態である。
被験体：ヒトおよび非ヒトの哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、生存する多細胞性の脊椎をもつ生物体。本明細書に開示された方法および組成物は、医薬および獣医学の設定において等しい適用がある。したがって、「被験体」の一般用語には、それだけには限定されないが、ヒトまたは獣医学上の被験体、例えば、他の霊長類（サルを含む）、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含めた全ての動物が含まれることが理解される。一例では、被験体は、２型糖尿病などの糖尿病を有し、または発症し得る被験体である。一例では、被験体は、膵炎（例えば、ＧＬＰ−１アゴニストの摂取による膵炎）または膵臓がん（例えば、膵管腺癌）などの膵臓障害を有し、または発症し得る被験体である。一例では、被験体は、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、前立腺がん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌、胆管癌、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、もしくは血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、または膵臓がん（例えば、ＰＤＡ）などのがんを有する被験体である。
治療有効量：単独で、または疾患の進行を防止し、疾患の退行を引き起こすのに十分な、もしくは疾患により引き起こされた症状を緩和することができる他の薬剤と併用した、治療薬剤（例えば、ＶＤＲアゴニスト、化学療法剤、または生物製剤）の量。一例では、治療有効量のビタミンＤ受容体アゴニストを使用して、嘔吐、内出血、血圧上昇、疼痛、および膵臓の炎症または腫脹など、ＧＬＰ−１アゴニストによって誘発される膵炎に関連する症状を防止または処置する。一例では、治療有効量のＶＤＲアゴニストを、治療有効量の化学療法剤または生物製剤と併用して使用して、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、胆管、または肺のがんなどのがんに関連する症状を防止または処置し、例えば、腫瘍のサイズまたは体積を低減し、腫瘍の転移を低減し、腫瘍における腫瘍細胞の数を低減し、腫瘍の増殖の速度を低減し、腫瘍における化学療法剤もしくは生物製剤の量を増大する。一例では、治療有効量は、膵炎、または肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、胆管、もしくは肺のがんの症状を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％（ＶＤＲアゴニストの投与なしに比べて）低減するのに十分なビタミンＤ受容体アゴニストを含む、本明細書に提供する組成物の量である。
疾患の処置または防止：処置は、疾患または病状（例えば、ＧＬＰ−１アゴニストによって誘発される膵炎、または肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、胆管、もしくは肺のがん）の徴候または症状が発症し始めた後、徴候または症状を回復させる治療的介入を意味する。防止は、１つまたは複数のＧＬＰ−１アゴニストを受容している被験体など、膵炎を発症している、または膵炎を発症するリスクのあるヒトなど、疾患に対する素因を有することが知られているヒトなどにおける、疾患の完全な発症の阻害を意味する。
ビタミンＤ：一群の脂溶性セコステロイドプロホルモンおよびホルモンであり、その２つの主要な形態はビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ３（コレカルシフェロール）であり、これらは、ビタミンＤの生理学的に活性な形態であるカルシトリオールとしても知られる１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）に変換される。
ビタミンＤアゴニストまたは類似体：ＶＤＲリガンド（例えば、カルシトリオール）、ＶＤＲアゴニスト前駆物質、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ前駆物質など、ビタミンＤ受容体に結合し、ビタミンＤ受容体を活性化する、合成または天然のあらゆる化合物。天然および合成のビタミンＤアゴニストおよび類似体の、特定の、非限定的な例には、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ＬＧ１９００９０、ＬＧ９１９０１１９、ＬＧ１９０１５５、ＬＧ１９０１７６、およびＬＧ１９０１７８（例えば、Ｂｏｅｈｍら、（１９９９年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻、２６５〜２７５頁を参照されたい）；ＬＹ２１０８４９１、およびＬＹ２１０９８６６（Ｍａら、（２００６年）Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１１６巻、８９２〜９０４頁）；２β−（３−ヒドロキシプロポキシ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＤ−７１）（Ｔｓｕｒｕｋａｍｉ ら、（１９９４年）Ｃａｌｃｉｆ． Ｔｉｓｓ． Ｉｎｔ．、５４巻、１４２〜１４９頁）；ＥＢ１０８９（Ｐｅｐｐｅｒら、（２００３年）Ｂｌｏｏｄ、１０１巻、２４５４〜２４６０頁）；ＯＣＴ（２２−オキサ−カルシトール）（Ｍａｋｉｂａｙａｓｈｉら、（２００１年）Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．、１５８巻、１７３３〜１７４１頁）；（１αＯＨ−２，１９−ノル−２５ヒドロキシビタミンＤ３）および（１，３−デオキシ−２−ＣＨＣＨ２ＯＨ−１９−ノル−２５−ヒドロキシビタミンＤ３）（Ｐｏｓｎｅｒら、（２００５年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻、２９５９〜２９６６頁）およびＲｅｙら、（１９９９年）Ｊ． Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．、６４巻、３１９６〜３２０６頁に開示されているビタミンＤ類似体のいずれか；ならびに胆汁酸誘導体、例えば、リトコール酸（ＬＣＡ）およびウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）（例えば、Ｎｅｈｒｉｎｇら、（２００７年）ＰＮＡＳ、１０４巻、１０００６〜１０００９頁；Ｍａｋｉｓｈｉｍａら、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、１３１３〜１３１６頁；Ｃｏｐａｃｉら、（２００５年）Ｒｏｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１４巻、２５９〜２６６頁を参照されたい）が含まれる。これらの参照は各々、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる。
ビタミンＤ前駆物質：酵素によってビタミンＤ受容体のアゴニストに変換することができるあらゆる化合物。ある非限定的な例では、この酵素はＣＹＰ２７Ｂ１である。ビタミンＤ前駆物質の特定の、非限定的な例には、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ならびにビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびその前駆物質が含まれる。
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）：ステロイドホルモンファミリーの核内受容体のメンバー。ＶＤＲは、共通の核内受容体構造を有し、例えば、Ｎ−末端活性化ドメイン、亜鉛フィンガードメインを２つ有するＤＮＡ結合性領域（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、およびリガンド結合性ドメイン（ＬＢＤ）からなる。ＶＤＲが活性化する遺伝子転写は、インポーチン−αによる最初の核転座、ＲＸＲとのヘテロ二量体化、および標的遺伝子に存在する応答エレメントに対する結合を必要とする。ＶＤＲは、腸および腎臓におけるカルシウムおよびホスフェートのホメオスタシスの維持に関連する遺伝子を制御することが知られている。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体によって開始するシグナルは、同時活性化性（ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）または同時抑制性（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）のタンパク質の会合によって変調され、核のコンパートメントにおける他のシグナル伝達パートナーにもよる。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体は、ＲＸＲリガンドの存在または非存在はＶＤＲ応答に影響を及ぼさないことが知られている点で、非許容性である。
最近まで、ＶＤＲに対する唯一の公知の生理学的リガンドは１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（カルシトリオール）であった。しかし、ＬＣＡおよびいくつかの誘導体などの特定の胆汁酸（ＬＣＡ−アセテート、ＬＣＡ−ホルメート、３−ケトＬＣＡ）もＶＤＲを活性化することができる。
ＣＸＣＬ−１２活性による障害を処置または防止する方法
Ａ．概要
膵管腺癌（ＰＤＡ）において臨床成績が劣るのは、化学療法に対する固有の抵抗性および増殖許容性の腫瘍の微小環境に起因するものであった。膵臓星状細胞（ＰＳＣ）の静止状態から活性化への変換は、ＰＤＡを特徴付ける重篤な間質反応を駆動する上で主要なスイッチであると考えられている。本明細書において、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）は、活性化されたヒト膵臓腫瘍の間質で、およびＰＤＡに対する公知のリスク因子である膵炎のｉｎ ｖｉｖｏモデルで発現されることが示されている。特に、ＶＤＲリガンドであるカルシポトリオールでの処置は、膵炎、およびＶＤＲノックアウトマウスに発症する疾患のより明白な形態の疾患の間、炎症および線維症を顕著に低減した。ＶＤＲは、静止状態を再現するＰＳＣの主要な転写制御因子として働き、その結果、リガンドが誘発する間質の再構築はｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍内ゲムシタビンレベルを５倍増大し、腫瘍体積を低減することが示されている。よって、間質のＶＤＲ活性化は、化学療法の薬物抵抗性を弱める。本開示は、腫瘍の間質の転写の再プログラミングが化学療法の応答をレスキュー／助長する分子戦略を記載するものであり、ＰＤＡに対する補助療法としてビタミンＤの再評価を提唱するものである。
腫瘍の間質の、がんに対する「燃料供給ライン」としての新しい役割は、がん細胞自体に対する着目からの重要な進歩を提供するものである。実際、間質を転写的に再プログラムし、炎症性サイトカイン、増殖因子、および血管新生を含めた複数の経路に同時に影響を及ぼす、本明細書に開示するＶＤＲを標的化するアプローチにより、ＰＤＡにおけるゲムシタビン処置の有効性が増大した。さらに、ＶＤＲリガンドは、急性および慢性両方のマウス膵炎における線維症および炎症を低減する。膵炎にはいかなる機構ベースの療法がなく、膵臓がんに対する公知のリスク因子であるため、これは意義深い。近年、ＶＤＲ活性化が、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達を阻止することによって、活性化された星状細胞における線維形成性のプログラムを阻害する、「シストロミックアンタゴニズム（ｃｉｓｔｒｏｍｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）」が実証された（Ｄｉｎｇら、２０１３年）。これらの結果は、本明細書に示すデータと一緒に、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路に従事する創傷修復応答は、がん細胞、炎症、または他の細胞ストレッサーからのパラクリンシグナル伝達により膵臓星状細胞において活性化され、すなわちゲノムレベルではＶＤＲシグナル伝達によって制限されることを実証する。これらの対立する経路間のバランスは、慢性的な組織損傷により、またはビタミンＤ欠乏により都合悪く傾くことがあり、これは部分的に、血漿ビタミンＤレベルまたはビタミンＤ摂取と膵臓がんのリスクとの間の逆相関（Ｓｋｉｎｎｅｒら、２００６年；Ｗｏｌｐｉｎら、２０１２年）、およびビタミンＤ欠乏と慢性膵炎との間のリンク（Ｍａｎｎら、２００３年）を説明し得る。
ＶＤＲ活性化による、膵臓腫瘍の間質の転写の再構築は、ＰＳＣが腫瘍の増殖を支持する能力を広く損なう。ＶＤＲにより負に制御される腫瘍−間質の相互作用の主要な特徴には、細胞外マトリクス（Ｊａｃｏｂｅｔｚら、２０１３年；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、２０１２年）、Ｓｈｈ経路（Ｏｌｉｖｅら、２００９年）、ＩＬ６およびその他などのサイトカイン／ケモカイン（Ｆｕｋｕｄａら、２０１１年；Ｉｊｉｃｈｉら、２０１１年；Ｌｅｓｉｎａら、２０１１年）、ならびにＣＴＧＦなどの増殖因子（Ａｉｋａｗａら、２００６年）が含まれる。これは、間質由来の生存因子であるＣＴＧＦを阻害するとゲムシタビンに対する抗腫瘍応答が増強されることを実証する、最近の研究に鑑みて重要性を獲得している（Ｎｅｅｓｓｅら、２０１３年）。間質の除去と間質の再構築との治療戦略間には、違いが存在する。「正常の」微小環境の細胞および構造上の構成成分が腫瘍抑制性の力およびシグナルを発揮するという概念は以前に論じられているが（ＢｉｓｓｅｌｌおよびＨｉｎｅｓ、２０１１年）、これは膵臓において未だ実証されていない。ＶＤＲリガンドは、活性化されたＰＳＣをより静止状態の、「正常な」表現型に向かって押し動かすため、再構築されたＰＳＣがこのようなホメオスタシスの制御を発揮して、腫瘍の増殖を負に制御し、または分化を促進することが考えられ、これは間質を全体的に除去することによって抑止され得ない利点である。
ＰＤＡの間質はまた、薬物送達を阻止することにより化学療法の有効性を制限するが、これは高密度の細胞外マトリクスに部分的に起因する重篤な低血管分布（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ）の結果である。ＶＤＲリガンドは、腫瘍の線維性構成成分を大幅に低減し、腫瘍内脈管構造を増大した。本明細書において、活性化されたＰＳＣは、ＰＤＡを特徴付ける低血管分布に寄与することが予想される、トロンボスポンジン−１などの抗血管新生因子を発現することが示される。ＰＳＣ活性化シグネチャー遺伝子の抗血管新生のサブセットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＤＲリガンドによって抑制され、重要なことに、併用療法はｉｎ ｖｉｖｏで、腫瘍の血管分布および薬物送達の改善を誘発した。腫瘍内血流およびゲムシタビンの送達を増大するマトリクス分解の戦略は、ＰＤＡにおける生存を改善することが示されている（Ｊａｃｏｂｅｔｚら、２０１２年；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、２０１２年）。しかし、長期の腫瘍増殖および転移の潜在性に関する、ＶＤＲが媒介する間質の再構築および血管分布の改善の重要性は、現在調査中である。実際、膵臓がんにおいてゲムシタビンと併用したＳｈｈ経路阻害の治療潜在性を探索する臨床試験の最近の失敗は、現在の処置戦略の状況における間質の枯渇療法の潜在的な限界を明るみに出すものである。概念的には、腫瘍の間質を開口し、機能的な脈管構造を増大することにより、治療剤送達に対する窓口を作り出し、血流を介した播種に対する潜在性を高める二重効果が示唆される。これらの警告に関わらず、本明細書に提供するデータは、間質の薬剤は、がん細胞を速やかに死滅させる強力な標的化療法と対にすると臨床成績の改善を示すことを指摘するものである。
膵炎および膵臓がんにおける間質の、シグナル依存的な転写の再構築に対するメカニズムとしてＶＤＲ活性化を考慮することは、これらの疾患の治療選択肢が非常に制限されているため、重要である。急性および慢性両方の膵炎モデルにおいてＶＤＲ活性化により誘発される線維症および炎症の顕著な低減は、ＰＤＡモデルにおけるカルシポトリオール＋ゲムシタビン処置の治療有効性の増大と組み合わされて、甚だしく必要とされる治療代替物を開発するためにこの経路を同定するものである。現在の化学療法に対するがん細胞固有の抵抗性は依然として主要な障壁であるが、本明細書に表すＶＤＲが媒介する間質の再構築のパラダイムは、新生物自体を直接標的化する新規な療法と併用した場合、好ましいものであり得る。腫瘍および非腫瘍の構成成分を同時に標的化することは、単純であり、膵臓癌および他の間質関連のがんにおける化学療法抵抗性を克服するのに潜在的に広く応用できる戦略である。
本明細書に提供するデータに基づき、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）の生物学的活性を低減するための方法を提供する。一部の例では、このような方法は、星状細胞（例えば、ＣＸＣＬ１２を発現および分泌する細胞）を、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと接触させ、それによりＣＸＣＬ１２の生物学的活性（例えば、その生成および／または分泌）を低減するステップを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、ＣＸＣＬ１２を発現する培養物中の細胞を、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと接触させるステップにより）、またはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、被験体に１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップにより）行うことができる。一部の例では、処置する被験体は、ヒト被験体など、哺乳動物被験体である。
生物学的活性は、ＣＸＣＬ１２核酸発現（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ発現）、ＣＸＣＬ１２タンパク質発現、細胞（例えば、星状細胞）によるＣＸＣＬ１２分泌、ＣＸＣＬ１２タンパク質安定性、腫瘍細胞に対するＣＸＣＬ１２結合、腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ４シグナル伝達、および腫瘍細胞に対するＴ細胞結合のＣＸＣＬ１２による防止の１つまたは複数を含むことができる。ＣＸＣＬ１２タンパク質の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＣＸＣＬ１２タンパク質活性を完全に阻害する必要はない。一部の例では、このような化合物は、ＣＸＣＬ１２タンパク質の活性を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。
よって、一例では、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、ＣＸＣＬ１２核酸発現（例えば、星状細胞によるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ発現）を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、ＣＸＣＬ１２タンパク質発現（例えば、星状細胞によるタンパク質発現）を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、細胞による（例えば、星状細胞による）ＣＸＣＬ１２の分泌を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、ＣＸＣＬ１２タンパク質の安定性を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２タンパク質の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腫瘍細胞（例えば、肝臓、膵臓、肺、前立腺、胆管、または腎臓のがん細胞）に対するＣＸＣＬ１２の結合を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腫瘍細胞（例えば、肝臓、膵臓、肺、前立腺、胆管、または腎臓のがん細胞）におけるＣＸＣＬ４のシグナル伝達を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、ＣＸＣＬ１２タンパク質の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腫瘍細胞（例えば、肝臓、膵臓、肺、前立腺、胆管、または腎臓のがん細胞）をＴ細胞から「隠し」または「マスキングする」ＣＸＣＬ１２の能力を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。よって、一部の例では、ＣＸＣＬ１２タンパク質の生物学的活性を低減するＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腫瘍細胞に結合し、または認識するＴ細胞の能力を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大することができる。
被験体における、星状細胞に関連するがんなどの腫瘍を処置する方法を提供する。このような方法は、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニスト、および治療有効量の１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤（例えば、モノクローナル抗体）を、被験体に投与するステップを含むことができる。使用される１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、被験体が有する腫瘍に基づいて慣例的な技量で決定することができる。例えば、腫瘍が膵臓がん（例えば、膵管腺癌、ＰＤＡ）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、およびタンパク質が結合したパクリタキセル（例えば、Ｎａｂ−パクリタキセル、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））の１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、メトトレキセート、ゲムシタビン、パクリタキセル、シスプラチン、アザシチジン、およびエンチノスタット（ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）の１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が腎臓がん（例えば、腎細胞癌）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、エベロリムス、アルデスロイキン、エバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アキシチニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブトシル酸塩、パゾパニブ塩酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、およびテムシロリムスの１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が前立腺がんである場合、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、アビラテロン酢酸塩、ビカルタミド、カバジタキセル、デガレリクス、デノスマブ、エオセタキセル（ｅｏｃｅｔａｘｅｌ）、エンザルタミド、ゴセレリン酢酸塩、ロイプロリド酢酸塩、プレドニゾン、二塩化ラジウム２２３、シプロイセル−Ｔ、およびドセタキセルの１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が肝臓がん（例えば、肝細胞癌）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、ソラフェニブ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、シスプラチン、インターフェロン、ドキソルビシン、およびフルオロウラシルの１つまたは複数（例えば、ＰＩＡＦ：シスプラチン、インターフェロン、ドキソルビシン、およびフルオロウラシル）を含む。一例では、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与した後、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤を投与することができる。別の例では、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤と併行して（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）投与する。
特定の一例では、腫瘍はＰＤＡであり、１つまたは複数の化学療法薬剤は（ａ）ゲムシタビン、（ｂ）ゲムシタビンおよびエルロチニブ、または（ｃ）ゲムシタビンおよびタンパク質が結合したパクリタキセルを含む。よって、本開示は、（１）ＰＤＡを有する哺乳動物被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップ、および（２）フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、タンパク質が結合したパクリタキセル、またはこれらの組合せからなる群より選択される治療有効量の化学療法を投与し、それにより被験体における膵管腺癌を処置するステップを含む方法によって膵管腺癌を処置する方法を提供する。特定の一例では、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストは、カルシポトリオールまたはパリカルシトールであり、化学療法は、（ａ）ゲムシタビン（例えば、最高７週間、週１回、３０分かけてゲムシタビン１０００ｍｇ／ｍ２、引き続き１週間の休薬、次いで４週ごとに３週間週１回）、（ｂ）ゲムシタビンおよびエルロチニブ、または（ｃ）ゲムシタビンおよびタンパク質が結合したパクリタキセルを含む。
本明細書では、ＧＬＰ−１アゴニストなどのグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）アゴニストによって誘発される膵炎など、膵炎の処置のための、治療有効量の１つまたは複数のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニスト（カルシトリオールまたはカルシポトリオールまたはこれらの前駆物質もしくは類似体、および他のＶＤＲリガンド、ビタミンＤ前駆物質、ビタミンＤ類似体、１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、ＶＤＲリガンド、およびＶＤＲアゴニストの前駆物質を含む）を使用する方法も提供する。膵炎は、急性でも、または慢性でもよい。よって、本明細書には、２型糖尿病などの糖尿病を処置するために１つまたは複数のＧＬＰ−１アゴニストを受けている被験体などの、被験体におけるＧＬＰ−１アゴニストによって誘発される膵炎を処置する方法を記載する。一部の例では、方法は、ＧＬＰ−１アゴニストで現在処置されている、または以前に処置された２型糖尿病を有する被験体を選択することを含む。いくつかの場合において、このような被験体は、膵炎を有するか、もしくは膵炎を発症するリスクがある。特定の例では、本開示は、ＧＬＰ−１アゴニストの投与による膵炎の特徴または症状を有するヒト患者に、ＶＤＲアゴニストを含む治療用組成物を提供するステップ、および前記特徴または症状（例えば、嘔吐、内出血、血圧上昇、疼痛、または腫脹）が低減するような条件下で患者に治療用組成物を投与するステップを含む。一部の例では、被験体は、ＧＬＰ−１アゴニストの投与による膵炎を発症するリスクがあり、治療用組成物を予防的に投与する。一実施形態では、ＶＤＲアゴニストの予防的投与により、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の症状の開始が遅くなる。例えば、ＶＤＲアゴニストの予防的投与により、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の１つまたは複数の症状または特徴の開始を防止する。
ＧＬＰ−１アゴニスト（文献中でＧＬＰ−１摸倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）およびインクレチン摸倣物とも呼ばれる）は血中グルコース濃度を下げる１クラスの薬物であり、よって２型糖尿病を処置または管理するのに使用される。スルホニル尿素またはメグリチニドなどの古いインスリン分泌促進薬に比べて、ＧＬＰ−１アゴニストは低血糖を引き起こすリスクが低い。しかし、このような化合物には、膵炎などの有害作用があることもある。例示的なＧＬＰ−１アゴニストには、それだけには限定されないが、エキセナチド、タスポグルチド、インスリングラルギン、ピオグリタゾン、アルビグルチド、リキシセナチド、サキサグリプチン、リラグルチド、リナグリプチン、アログリプチン、シタグリプチン、およびメトホルミン／シタグリプチンが含まれる。Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）（エキセナチド、Ｍｅｒｃｋ）は通常、１日２回皮下投与し、タスポグルチド（Ｒｏｃｈｅ）は通常、毎週皮下投与し、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）は通常、毎日皮下投与し、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ（登録商標）、Ｔａｋｅｄａ）は通常、毎日経口投与し（例えば、１５ｍｇ、３０ｍｇ、または４５ｍｇ）、アルビグルチド（Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は通常、毎週１回皮下投与し、リキシセナチド（Ｌｙｘｕｍｉａ（登録商標）Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）は通常、注射により毎日投与し（例えば、１４日間１日あたり１０μｇ、次いで２０μｇ／日）、Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）（エキセナチド、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は通常、注射により毎週投与し、Ｏｎｇｌｙｚａ（登録商標）（サキサグリプチン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）は通常、毎日経口投与し（例えば、２．５ｍｇまたは５ｍｇ）、Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）（リラグルチド、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は通常、毎日皮下投与し（例えば、０．６、１．２、または１．８ｍｇ）、Ｔｒａｄｊｅｎｔａ（登録商標）（リナグリプチン、ＥｌｉＬｉｌｌｙおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）は通常、毎日経口投与し（例えば、５ｍｇ）、Ｎｅｓｉｎａ（登録商標）（アログリプチン、Ｔａｋｅｄａ）は通常、毎日経口投与し（例えば、２５ｍｇ）、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）（シタグリプチン）および関連のＪａｎｕｍｅｔｏ（登録商標）（メトホルミンとシタグリプチンとの混合物、Ｍｅｒｃｋ）は通常、毎日経口投与する（例えば、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）では、２５、５０、または１００ｍｇ、ならびにＪａｎｕｍｅｔｏ（登録商標）またはＪａｎｕｍｅｔＸＲ（登録商標）では、シタグリプチン５０または１００ｍｇ、およびメトホルミン塩酸塩１０００または２０００ｍｇ）。一部の例では、ＧＬＰ−１アゴニスト（例えば、上記に列挙したもの）を、毎日、１日２回、隔週、または週１回のベースで、皮下または経口投与する。
特定の例における方法は、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを、ＧＬＰ−１アゴニストによって誘発される膵炎を有するか、もしくは膵炎を発症するリスクのある被験体に投与し、それにより膵炎を処置または防止するステップを含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞と接触させ、または被験体に投与するＶＤＲアゴニストは、薬学的に許容される担体中に存在することができる。一部の例では、ＶＤＲアゴニストは、天然に存在しないアゴニストである。天然に存在しないＶＤＲアゴニストの例には、それだけには限定されないが、ＫＨ１０６０（レキサカルシトール）、ＢＸＬ−６２８（エロカルシトール）、ＭＣ１２８８、ＣＢ９６６、Ｂ＼ＣＢ １０９３、ＧＳ １５５８、ＴＸ５２７（［１９−ノル−１４，２０−ｂｉｓｅｐｉ−２３−イン−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、ＥＤ−７１（エルデカルシトロール）、ＢＸＬ−０１−００２９、ドキセルカルシフェロール、ＥＢ１０８９（セオカルシトール（ｓｅｏｃａｌｃｉｔｏｌ））、パリカルシトール、カルシポトリオール、およびこれらの組合せが含まれる。他の例には、マキサカルシトール（ＯＣＴ）、タカルシトール、アルファカルシドール、ＳＭ−１０１９３、ＥＢ１０７２、ＥＢ１１２９、ＥＢ１１３３、ＥＢ１１５５、ＥＢ１２７０、ＭＣ１２８８、ＥＢ１２１３、ＣＢ１０９３、ＶＤ２６５６、ＶＤ２６６８、ＶＤ２７０８、ＶＤ２７１６、ＶＤ２７２８、ＶＤ２７３６、ＧＳ１５００、ＧＳ１５５８、ＫＨ１０６０、ＺＫ１６１４２２、およびこれらの組合せが含まれる。いくつかの構造を以下に示す。
例示的なＶＤＲアゴニストには、それだけには限定されないが、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆物質、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆物質、またはこれらの組合せが含まれる。ある特定の実施形態では、処置は、ＶＤＲアゴニスト前駆物質、例えば、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、またはこれらの組合せである。ある特定の実施形態では、処置は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）などのＶＤＲのアゴニストリガンドである。よって、一部の例では、ＧＬＰ−１によって誘発される膵炎を有するか、もしくは膵炎を発症するリスクのある被験体を、開示される方法での処置に（例えば、既存の膵炎を処置するために、または膵炎の発症を防止し、もしくは遅らせるために）選択する。他の例では、星状細胞に関連する腫瘍を有する被験体を、開示された方法での処置に（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、胆管、または前立腺のがんを処置するために）選択する。
一例では、ＶＤＲアゴニストは、カルシトリオールまたはビタミンＤの合成の誘導体であるカルシポトリオールである。カルシポトリオールは、カルシウムのホメオスタシスに対して最小の効果を有する。カルシポトリオールは、ＤＭＳＯ中に１００ｍＭまで、エタノール中に１００ｍＭまで可溶である。一例では、カルシポトリオールは以下の構造：
を有する。
一例では、ＶＤＲアゴニストはパリカルシトール（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）２−ビタミンＤ２）である。パリカルシトールは以下の構造を有する：
一部の例では、ＶＤＲアゴニストとして１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、またはビタミンＤ前駆物質もしくは類似体を使用する。有益な治療効果を達成するのに、最も生物学的に活性な形態のビタミンＤを使用する必要はない。ビタミンＤ受容体の天然に存在するリガンドはカルシトリオールである。一実施形態では、カルシトリオールの前駆物質（例えば、カルシジオール）を被験体に投与し、前駆物質は、次いで標的細胞集団内でカルシトリオールに変換される。このアプローチには、大用量の前駆物質を投与した場合でも、カルシトリオールの、局所的な腸の効果およびカルシウムホメオスタシスに対する全身効果を大幅に避けることができるという利点がある。
一実施形態では、標的細胞集団におけるより有効で、より長く持続するＶＤＲ活性化を達成するために、ＣＹＰ２４Ａ１による非活性化に抵抗性である、ＶＤＲリガンド、または他のＶＤＲアゴニストもしくはアゴニスト前駆物質が使用される。特定の例では、ＶＤＲリガンドはＣＹＰ２７Ｂ１によって活性化され得るが、ＣＹＰ２４Ａ１による非活性化に抵抗性であるものである。これにより、膵臓における標的細胞集団におけるＶＤＲ活性化は可能になり、カルシウムのホメオスタシスに対する望ましくない全身効果は最小になる。
一実施形態では、ＧＬＰ−１の投与による膵臓における傷害のプロセスを防止または減弱するために、ＶＤＲに結合し、活性化することができるＶＤＲリガンドまたは他のＶＤＲアゴニストが使用される。一部の実施形態では、ＶＤＲのリガンドは単独で使用され、他の実施形態では、ＶＤＲのリガンドは、膵炎を処置するのに慣例的に使用される他の組成物と併用して使用される。
一部の実施形態では、膵炎またはがんに対するＶＤＲアゴニストの効果を、血液、血清、血漿のアミラーゼまたはリパーゼ、ならびに臓器機能の試験（例えば、膵臓の外分泌および内分泌の機能）によってモニタリングする。他の実施形態では、膵炎またはがんを、それだけには限定されないが、放射線学、核医学、超音波、および磁気共鳴を含めた画像化技術によってモニタリングする。
ある例では、投与には、ＶＤＲアゴニストの経口または非経口（例えば、経口、腹腔内、または静脈内）投与が含まれる。特定の例では、ＶＤＲアゴニストは、少なくとも５ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１００ＩＵ、少なくとも１０００ＩＵ、少なくとも５０００ＩＵ、少なくとも１０，０００ＩＵ、少なくとも５０，０００ＩＵ、少なくとも１００，０００ＩＵ、または少なくとも５００，０００ＩＵ、例えば５ＩＵから約５０，０００ＩＵ、５ＩＵから１０，０００ＩＵ、１０から１０００ＩＵ、または５０，０００ＩＵから５００，０００ＩＵなど、少なくとも１国際単位（ＩＵ）の用量を投与するビタミンＤ前駆物質である。一般的に、ＩＵは、国際組織によって規定され、国際的に認められた、特定の生物学的活性または効果に基づいた、ビタミンＤ前駆物質などの物質の量に対する尺度の単位である。一部の例では、ビタミンＤでは、１ＩＵは、コレカルシフェロール／エルゴカルシフェロール０．０２５μｇの生物学的同等物である。
ある例では、被験体は、ヒト、または他の霊長類、またはウマ、イヌ、もしくはネコなどの哺乳動物被験体である。例えば、被験体は、自身の糖尿病の処置もしくは管理にＧＬＰ−１アゴニストを受けている被験体など、２型糖尿病を有する被験体であってよく、またはＧＬＰ−１アゴニストで以前に処置された被験体であってよい。一例では、被験体は、腎臓、肝臓、膵臓、前立腺、胆管、または肺のがんなど、腫瘍を有する被験体である。一部の例では、哺乳動物などのこのような被験体に、少なくとも１日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３０日、少なくとも６０日、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、または少なくとも５年の期間にわたって、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与する。
別の例では、被験体（例えば、ヒト、またはラット、マウス、もしくは非ヒト霊長類などの実験用哺乳動物）に、ＶＤＲの発現を増大するのに十分な濃度の、およびＶＤＲの発現を増大するのに十分な期間にわたって、ＶＤＲアゴニストを投与することができる。一例では、哺乳動物に、少なくとも１日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３０日、少なくとも６０日、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、または少なくとも５年の期間にわたって１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与する。一部の例では、哺乳動物に、少なくとも５ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１０ＩＵ、少なくとも１００ＩＵ、少なくとも１０００ＩＵ、少なくとも５０００ＩＵ、少なくとも１０，０００ＩＵ、少なくとも５０，０００ＩＵ、少なくとも１００，０００ＩＵ、少なくとも５００，０００ＩＵ、例えば５ＩＵから約５０，０００ＩＵ、５ＩＵから１０，０００ＩＵ、１０ＩＵから１０００ＩＵ、１０００ＩＵから５００，０００ＩＵ、または５０，０００ＩＵから５００，０００ＩＵなど、少なくとも１国際単位（ＩＵ）の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与する。
Ｂ．関連する星状細胞を有する腫瘍を処置する方法
本明細書において、関連する星状細胞を有する腫瘍またはがんを処置するのに使用することができる、星状細胞における／星状細胞によるＣＸＣＬ１２の生成および／または分泌など、ＣＸＣＬ１２活性を低減する方法を提供する。本明細書に提供する方法で処置することができるがんの例には、腎臓、肝臓、膵臓、前立腺、胆管、および肺のがんが含まれる。一部の実施形態では、本方法を使用して膵臓がんを処置することができる。一例では、がんは膵管腺癌である。このような方法には、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニスト（例えば、カルシポトリオールまたはパリカルシトール）、および治療有効量の１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤（例えば、モノクローナル抗体）を被験体に投与することを含むことができる。開示された方法を、開示された方法で腫瘍を処置した後の外科手術、または開示された方法で処置する前の外科手術など、がんを処置するための外科切除と併用してもよい。
使用する１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、被験体が有する腫瘍に基づいて慣例的な技量で決定することができる。例えば、腫瘍が膵臓がん（例えば、膵管腺癌、ＰＤＡ）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、およびタンパク質が結合したパクリタキセル（例えば、Ｎａｂ−パクリタキセル、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））の１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、メトトレキセート、ゲムシタビン、パクリタキセル、シスプラチン、アザシチジン、およびエンチノスタットの１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が腎臓がん（例えば、腎細胞癌）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、エベロリムス、アルデスロイキン、エバシズマブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブトシル酸塩、パゾパニブ塩酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、およびテムシロリムスの１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が前立腺がんである場合、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、アビラテロン酢酸塩、ビカルタミド、カバジタキセル、デガレリクス、デノスマブ、エオセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリン酢酸塩、ロイプロリド酢酸塩、プレドニゾン、二塩化ラジウム２２３、シプロイセル−Ｔ、およびドセタキセルの１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が胆管がん（例えば、胆管癌）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン、ゲムシタビン プラス シスプラチン、イリノテカン、カペシタビン、およびエルロチニブ（例えば、５−フルオロウラシル＋ロイコボリンまたはゲムシタビン＋シスプラチン）の１つまたは複数を含むことができ；腫瘍が肝臓がん（例えば、肝細胞癌）である場合、１つまたは複数の化学療法薬剤は、ソラフェニブ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、シスプラチン、インターフェロン、ドキソルビシン、およびフルオロウラシルの１つまたは複数（例えば、ＰＩＡＦ：シスプラチン、インターフェロン、ドキソルビシン、およびフルオロウラシル）を含む。特定の一例では、腫瘍はＰＤＡであり、１つまたは複数の化学療法薬剤は、（ａ）ゲムシタビン、（ｂ）ゲムシタビンおよびエルロチニブ、または（ｃ）ゲムシタビンおよびタンパク質が結合したパクリタキセルを含む。よって、本開示は、（１）ＰＤＡを有する哺乳動物被験体に治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップ、および（２）フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、タンパク質が結合したパクリタキセル、またはこれらの組合せからなる群より選択される治療有効量の治療有効量の化学療法を投与し、それにより被験体における膵管腺癌を処置するステップを含む方法によって膵管腺癌を処置する方法を提供する。
一実施形態では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤（例えば、モノクローナル抗体）両方の併用は、１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の効果を相乗的に増強する。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＶＤＲアゴニストの使用により、ＣＸＣＬ１２の星状細胞生成は低減し、それによりＣＸＣＬ１２による腫瘍細胞のＴ細胞からの「マスキング」が低減すると提唱される。加えて、ＶＤＲアゴニストは、血管新生の負の制御因子であり、腫瘍を化学療法薬剤または生物学的薬剤に対してより接近可能とする細胞外マトリクス構成成分であるＣＴＧＦまたはＰＤＧＦなどの生存促進性因子の、星状細胞による生成を低減し、よって腫瘍をこのような薬剤に対してより脆弱にする。
よって、一部の例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤両方の併用は、腎臓（例えば、ＲＣＣ）、肝臓（例えば、ＨＣＣ）、膵臓（例えば、ＰＤＡ）、前立腺、胆管、および肺（例えば、ＮＳＣＬＣ）のがんの、さらなる増殖を阻害し、体積またはサイズを低減し、転移を低減し、徴候または症状を低減し、腫瘍細胞の数を低減し、または増殖の速度を低減する。一部の例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながんの増殖または増殖の速度を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながんの体積を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながんのサイズを、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながんの転移を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながんの徴候または症状を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、このようながん細胞の数を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。
一例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腫瘍細胞（例えば、肝臓、膵臓、肺、前立腺、胆管、または腎臓のがん細胞）をＴ細胞から「隠し」または「マスキングする」ＣＸＣＬ１２の能力を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。よって、一部の例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の両方の投与は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合し、または認識する能力を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大することができる。
一部の例では、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物製剤薬剤の両方の併用は、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、腎臓（例えば、ＲＣＣ）、肝臓（例えば、ＨＣＣ）、膵臓（例えば、ＰＤＡ）、前立腺、胆管、および肺（例えば、ＮＳＣＬＣ）のがんにおける化学療法剤または生物製剤の量を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大する。
腫瘍の増殖および化学療法剤／生物製剤の濃度のこのようなパラメータを測定する方法は公知であり、本明細書に提供するものであり、このようなアッセイを使用して、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストおよび１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤両方の併用を決定することができる。腫瘍を測定またはモニタリングするための例示的な方法には、それだけには限定されないが、診断用画像化（例えば、ＣＴスキャン、エックス線、超音波など）、顕微鏡画像化（例えば、光学顕微鏡検査、免疫蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリーなど）、腫瘍の生検、および血液診断（例えば、ＨＣＣのマーカーとしてＡＦＰ、ＰＤＡの生物マーカーとしてＣＡ１９−９、前立腺がんの生物マーカーとしてＰＳＡの測定など）が含まれる。他の例示的な診断方法を、以下の実施例に提供する。
ＶＤＲアゴニストおよび化学療法剤／生物製剤のあらゆる投与様式を使用することができる。一部の例では、ＶＤＲアゴニストおよび化学療法剤／生物製剤に対して異なる投与様式を使用する。一例では、ＶＤＲアゴニストを経口、腹腔内、または静脈内投与し、化学療法剤または生物製剤を静脈内投与する。一例では、例えば、腫瘍があるか、もしくは腫瘍を取り除いた領域、または腫瘍が発生しやすいと疑われる領域に化合物を適用することにより、ＶＤＲアゴニストおよび化学療法剤／生物製剤の部位特異的投与を使用することができる。一部の実施形態では、持続的な腫瘍内投与（または腫瘍付近）を使用する。
Ｃ．ＧＬＰアゴニストが誘発する膵炎を処置または防止する方法
本明細書において、活性化した星状細胞からの炎症性サイトカインおよび線維性タンパク質の生成を低減することにより、慢性および急性膵炎において誘発される炎症性および線維性の応答を低減する方法を提供し、これを使用して膵炎を処置または防止することができる。加えて、活性化した星状細胞の処置により、ＣＸＣＬ１２の生成および／または分泌も低減する。例えば、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニスト（例えば、カルシトリオールまたはカルシポトリオールまたは他の天然に存在しないＶＤＲアゴニスト）を使用して、膵炎、例えばＧＬＰ−１アゴニストなどのＧＬＰアゴニストによって誘発される膵炎を処置することができる。このような被験体は、２型糖尿病など、糖尿病の処置のために１つまたは複数のＧＬＰ−１アゴニストを受容している被験体であってもよい。特定の一例では、処置には、ＧＬＰ−１アゴニストによる膵炎の特徴または症状を有するヒト患者に、前記特徴または症状（例えば、背部に放散する上腹部もしくは右上腹部（ｒｉｇｈｔ ｕｐｐｅｒ ｑｕａｄｒａｎｔ）における疼痛、軽度黄疸、嘔吐、内出血、血圧上昇、疼痛、または腫脹）を低減するような条件下、ＶＤＲアゴニストを含む治療用組成物を投与することを含む。
一部の例では、開示された方法は予防的である。よって、処置する被験体は、ＧＬＰアゴニスト（例えば、ＧＬＰ−１アゴニスト）の投与により膵炎を発症するリスクのある被験体であってよく、治療用組成物を予防的に投与する。一実施形態では、ＶＤＲアゴニストの予防的投与は、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の症状の開始を遅らせる。
星状細胞の活性化を低減し、それにより炎症性サイトカインおよびＣＸＣＬ１２の生成を低減するＶＤＲアゴニストは、膵炎を処置または防止するために星状細胞の活性化を完全に阻害および／または逆転する必要はない。一部の例では、このような化合物は、星状細胞の活性化を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。よって、一例では、星状細胞の活性化を低減するＶＤＲアゴニストは、嘔吐を、膵炎を有するか、もしくはそのリスクのある被験体において、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、星状細胞の活性化を低減するＶＤＲアゴニストは、内出血を、膵炎を有するか、もしくはそのリスクのある被験体において、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、星状細胞の活性化を低減するＶＤＲアゴニストは、血圧を、膵炎を有するか、もしくはそのリスクのある被験体において、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、星状細胞の活性化を低減するＶＤＲアゴニストは、膵臓の腫脹または炎症を、膵炎を有するか、もしくはそのリスクのある被験体において、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。一例では、星状細胞の活性化を低減するＶＤＲアゴニストは、膵臓の線維症を、膵炎を有するか、もしくはそのリスクのある被験体において、ＶＤＲアゴニストの非存在に比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。
膵炎のこのような症状および特徴を測定する方法は公知であり、本明細書に提供するものであり、このようなアッセイを使用して、ＶＤＲアゴニストがこのような症状または特徴を低減するか否かを決定することができる。例示的な方法には、それだけには限定されないが、診断用画像化（例えば、放射線学、核医学、超音波、および磁気共鳴、例えば、ＣＴスキャンもしくはエックス線）、ならびに血液、血清、血漿のアミラーゼ、またはリパーゼ、ならびに膵臓の外分泌および内分泌機能の試験（例えば、白血球数、グルコースレベル）が含まれる。例えば、エビデンスは、膵臓機能の改善、疼痛の低減、膵臓機能の保持、または被験体の膵臓における構造上の変化であってよい。よって、例えば、医師は、被験体におけるＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の１つまたは複数の指標を、処置の開始の直前、または開始時に、ならびに処置間および処置後に再び、測定することができる。ある特定の実施形態では、処置を、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の軽減、治癒、または防止のエビデンスが達成されるまで継続する。他の実施形態では、処置を、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の軽減、治癒、または防止のエビデンスが得られた後、継続する。一部の例では、このような処置は、被験体におけるＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の処置の期間、または被験体の生涯にわたり続く。
膵臓の内分泌および／または外分泌機能を測定する試験を、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎をモニタリングするのに使用することができる。一部の実施形態では、膵不全は、臨床上の三徴候である膵臓の石灰化、糖尿病、および脂肪便の存在によって診断される。膵臓の外分泌機能の試験には、それだけには限定されないが、ＣＣＫ／セクレチン刺激試験、Ｌｕｎｄｈ食事試験、ＥＲＣＰおよび膵臓の吸引、糞便脂肪および窒素または糞便のトリプシンおよびキモトリプシンの測定、ならびにベンチロミド試験およびパンクレオラウリル試験（ｐａｎｃｒｅｏｌａｕｒｙｌ ｔｅｓｔ）、ならびに血中のトリプシノーゲン、リパーゼ、または膵アミラーゼの測定が含まれる。
ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の重症度を診断および測定する他の方法は当業者には公知であり、これらの方法のいずれか１つを使用してＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の処置の有効性を評価することができることが企図される。
Ｄ．ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）
ＶＤＲは共通の核受容体構造を有し、例えば、Ｎ末端活性化ドメイン、亜鉛フィンガードメインを２つ有するＤＮＡ結合性領域（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、およびリガンド結合性ドメイン（ＬＢＤ）からなる。ＶＤＲが活性化する遺伝子転写は、インポーチン−αによる最初の核転座、ＲＸＲとのヘテロ二量体化（Ｙａｓｍｉｎら、２００５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８０巻（４８）、４０１５２〜６０頁）、および標的遺伝子に存在する応答エレメントに対する結合を必要とする。ＶＤＲは、腸および腎臓におけるカルシウムおよびホスフェートのホメオスタシスの維持に関連する遺伝子を制御する。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体によって開始するシグナルは、同時活性化性または同時抑制性のタンパク質の会合により変調され、核のコンパートメントにおける他のシグナル伝達パートナーにも依存する（Ｅｂｅｒｔら、２００６年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２４８巻（１〜２）、１４９〜５９頁）。ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体は、ＲＸＲリガンドの存在または非存在がＶＤＲ応答に影響を及ぼさない点で、非許容性である（Ｓｈｕｌｍａｎら、２００４年、Ｃｅｌｌ、１１６巻（３）、４１７〜２９頁）。最近まで、ＶＤＲに対する唯一の公知の生理学的リガンドはカルシトリオールであった。しかし、ＬＣＡおよびいくつかの誘導体などの特定の胆汁酸（ＬＣＡ−アセテート、ＬＣＡ−ホルメート、３−ケトＬＣＡ）はＶＤＲを活性化し得る。これらの胆汁酸ＶＤＲアゴニストは、胆汁酸の毒性および発がん効果に対抗する腸の主要な防御反応を提供し得る、腸管粘膜におけるスルホコンジュゲーションを行う（ｓｕｌｆｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）フェーズＩＩ酵素であるＳＵＬＴ２Ａ１発現を誘導することが示されている（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４００巻、１６５〜９１頁）。
Ｅ．例示的なＶＤＲアゴニスト
上記に記載した通り、ＶＤＲアゴニストの投与を使用して、活性な星状細胞を有するがんを処置し、ＧＬＰ−１が誘発する膵炎を処置または防止することができる。例示的なＶＤＲアゴニストには、ＶＤＲを活性化することができる分子が含まれる。薬剤がＶＤＲアゴニストであるか否かを決定する方法は慣例的である。例えば、ＣＹＰ２４Ａ１発現の誘発は、薬剤と接触させたＶＤＲ発現細胞において測定することができ、この場合、ＣＹＰ２４Ａ１発現が増大（例えば、発現における１０倍から２０倍の増大）すれば、薬剤がＶＤＲアゴニストであることが示される。他の方法には、トランスフェクトされたレポーター遺伝子の構築物およびＦＲＥＴアッセイが含まれる。一部の例では、精製したＬＢＤに対するアゴニストの結合を、コアクチベーターペプチド（例えば、ＬＸＸＬＬ）に対する動員の誘発を測定することにより検出する。例えば、ＶＤＲアゴニストは、ＶＤＲ発現細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１発現を、アゴニストの非存在に比べて、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、またはさらに（ｏｖｅｎ）少なくとも１０００％もしくはそれを超えて増大することができる。
ＶＤＲアゴニストには、ＶＤＲに結合し、活性化することができる分子、例えば、１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３ならびにその前駆物質および類似体、ＶＤＲリガンド、ならびにＶＤＲアゴニスト前駆物質が含まれる。本開示は、特定のビタミンＤアゴニストに制限されない。多様な生物学的に活性なビタミンＤアゴニストが企図される。例示的な薬剤は当技術分野において公知である。一例におけるＶＤＲアゴニストは、天然に存在しないＶＤＲアゴニストである。
ＶＤＲアゴニストには、ビタミンＤ化合物、その前駆物質、および類似体が含まれる。本明細書に提供する方法に有用なビタミンＤ化合物には、それだけには限定されないが、少なくとも１つの以下の特徴を有する化合物が含まれる：Ｄ環に付着しているあらゆる側鎖と一緒にビタミンＤの５，７ジエン二重結合系によって相互接続されている、ビタミンＤのＣ環、Ｄ環、および３β−ヒドロキシシクロヘキサンＡ環（例えば、「ビタミンＤ核」、ならびにＤ環に付着している側鎖と一緒に、ビタミンＤに典型的な５，７ジエン二重結合系によって相互接続されている、置換されている、または非置換のＡ環、Ｃ環、およびＤ環を有する化合物）。
ビタミンＤ類似体には、セコステロイドカルシトリオールの様々な活性を模倣することができる非セコステロイド化合物が含まれる。このような化合物の例には、それだけには限定されないが、ＬＧ１９００９０、ＬＧ１９０１１９、ＬＧ１９０１５５、ＬＧ１９０１７６、およびＬＧ１９００１７８が含まれる（Ｂｏｅｈｍら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻、２６５〜２７５頁、１９９９年を参照されたい）。
ビタミンＤ化合物には、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に活性であり、または化合物がｉｎ ｖｉｖｏで活性になるように哺乳動物被験体に作用する、ビタミンＤ化合物およびビタミンＤ類似体を含む化合物が含まれる。このような化合物の例には、それだけには限定されないが、ビタミンＤ、カルシトリオール、およびこれらの類似体［例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ３（１α−ＯＨ−Ｄ３）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ２）、１α−ヒドロキシビタミンＤ２（１α−ＯＨ−Ｄ２）、１α，２５−（ＯＨ）２−１６−エン−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−オキソ−１６−エン−Ｄ３、１α，２４Ｒ（ＯＨ）２−Ｄ３、１α，２５（ＯＨ）２−２２−オキサ−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２４ｂ，−ジホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２６ａ，２７ａ，−トリホモ−１α２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、１，２５−（ＯＨ）２−１６，２３Ｅ−ジエン−２６−トリフルオロ−１９−ノル−Ｄ３、および非セコステロイド（ｎｏｎｓｅｃｏｓｔｅｒｏｉｄａｌ）ビタミンＤ模倣体（ｍｉｍｉｃ）が含まれる。
一例では、ＶＤＲアゴニストは以下の１つまたは複数である：ビタミンＤ、１，α２５ジヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５−（ＯＨ）２−１６−エン−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−オキソ−１６−エン−Ｄ３、１α，２４Ｒ（ＯＨ）２−Ｄ３、１α，２５（ＯＨ）２−２２−オキサ−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２４ｂ，−ジホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ａ，２６ａ，２７ａ，−トリホモ−１α２５（ＯＨ）２−Ｄ３、２０−エピ−２２−オキサ−２４ホモ−１α，２５（ＯＨ）２−Ｄ３、および１，２５−（ＯＨ）２−１６，２３Ｅ−ジエン−２６−トリフルオロ−１９−ノル−Ｄ３。好ましい一実施形態では、生物学的に活性なビタミンＤ化合物は、１，α２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシ−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−ビタミンＤ３、および１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−ビタミンＤ３、および非セコステロイドビタミンＤ模倣体から選択される。付加的な一例では、生物学的に活性なＶＤＲアゴニストは、以下の式：
によって表される類似体から選択され、
式中、Ｘ１およびＸ２は各々、水素およびアシルからなる群より選択され、Ｙ１およびＹ２はＨであってもよく、または一方はＯ−アリールもしくはＯ−アルキルであってもよく、他方は水素であり、βもしくはα立体配置を有してもよく、Ｚ１およびＺ２は両方ともＨであり、またはＺ１およびＺ２は一緒になってＣＨ２であり、Ｒは、アルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはフルオロアルキル基であり、またはＲは以下の側鎖：
を表してもよく、
式中、（ａ）はＳまたはＲ立体配置を有してもよく、Ｒ１は、水素、ヒドロキシ、またはＯ−アシルを表し、Ｒ２およびＲ３は各々、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群より選択され、または、一緒になった場合は−（ＣＨ２）ｍ−基を表し、ｍは２から５までの値を有する整数であり、Ｒ４は、水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群より選択され、Ｒ５は、水素、ヒドロキシ、フッ素、アルキル、ヒドロキシアルキル、およびフルオロアルキルからなる群より選択され、またはＲ４およびＲ５は一緒になって二重結合した酸素を表し、Ｒ６およびＲ７は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ８はＨまたはＣＨ３であってよく、ｎは１から５までの値を有する整数であり、側鎖における２０、２２、または２３位のいずれか一つにおける炭素はＯ、Ｓ、またはＮ原子によって置き換えられてもよい。
一例では、本明細書に提供する方法において使用するＶＤＲアゴニストは、被験体に投与した場合、高カルシウム血症の症状を起こさない。別の例では、ＶＤＲアゴニストは、被験体に投与した場合、血漿カルシウム上昇性の応答（ｃａｌｃｅｍｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をカルシトリオールに比べてそれほど産生しない（すなわち低度）。一例では、ＶＤＲアゴニストは、カルシトリオールに比べて低い血漿カルシウム上昇性の応答の特徴を有する。別の実施形態では、これらの化合物は、１α，２５−（ＯＨ）２−２４−エピ−Ｄ２、１α，２５−（ＯＨ）２−２４ａ−ホモ−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２２４ａ−ジホモ−Ｄ３、１α，２５−（ＯＨ）２−１９−ノル−Ｄ３、および２０−エピ−２４−ホモ−１α，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３から選択される。別の実施形態では、ＶＤＲアゴニストは、カルシトリオールまたはパリカルシトールである。
本明細書に提供する方法において使用することができる他の例示的なＶＤＲアゴニストを、表１に提供する。
一部の例では、それだけには限定されないが、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−ガンマ（ＰＰＡＲ−γ、ＮＲ１Ｃ３）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−アルファ（ＰＰＡＲ−α、ＮＲ１Ｃ１）、およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−デルタ（ＰＰＡＲ−δ、ＮＲ１Ｃ２）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ、ＮＲ１Ｈ４）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、アンジオテンシン変換酵素インヒビター、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、クルクミン、それだけには限定されないがビタミンＥ、ビタミンＡなどのレチノイドを含めた抗酸化物、ならびに病的なＥＣＭを分解するために肝臓にプロテアーゼを送達する療法を含めた、１つまたは複数の核受容体リガンドなどの他の治療薬剤と組み合わせた処置に、ＶＤＲアゴニストを使用する。
Ｆ．ビタミンＤ受容体アゴニストの医薬品中への組入れ
がんを処置し、または膵炎を処置／防止する開示された方法には、被験体への、薬学的に許容される担体中の、および被験体における膵炎の発症、進行、または出現を阻害するのに（例えば、軽減、治癒、回復、または防止するのに）有効な量の、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、カルシポトリオール、パリカルシトール、ビタミンＤ前駆物質（例えば、２５−ヒドロキシ−Ｄ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、またはビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール））、ビタミンＤ類似体、およびＶＤＲアゴニスト前駆物質などの１つまたは複数のＶＤＲアゴニストの投与が含まれる。本開示はまた、１つを超えるＶＤＲアゴニスト、および他の療法（例えば、本明細書に提供するがんを処置するための化学療法および／または生物製剤療法）と併用したＶＤＲアゴニストを含む治療用組成物の投与も企図するものである。
ＶＤＲアゴニストを送達するビヒクルは、当業者には周知である方法を使用した、化合物の薬学的に許容される組成物を含むことができる。滅菌食塩水またはグルコース溶液などのいずれかの一般的な担体を利用することができる。ビヒクルは、例えば、浸透圧を調整するための薬学的に許容される塩、シクロデキストリンなどの脂質担体、血清アルブミンなどのタンパク質、メチルセルロースなどの親水性薬剤、洗剤、緩衝液、保存剤などの、従来の製薬上の補助材料も含むことができる。非経口投与用の製薬上の担体のより完全な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版、１９９５年）のチャプター９５に見出すことができる。
他の医薬組成物の実施形態は、当業者であれば知っている通り、従来の薬学的に許容される担体、補助剤、および対イオンと調製することができる。一部の実施形態では、組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、散剤、液剤、溶液剤、または懸濁剤など、固体、半固体、および液体の剤形中の単位用量の形態である。
一部の実施形態では、有効量のＶＤＲアゴニストを含む徐放の医薬調製物が有益である。緩慢に放出する製剤は当業者には公知である。例示により、有効成分が不溶性物質のマトリクス中に埋め込まれ、したがって溶解する薬物がマトリクス中の穴を介して徐々に出現するように、徐放錠剤を製剤化することができる。いくつかの製剤では、薬物が最初にマトリクス中に溶解し、次いで外側表面を介して出るように、マトリクスが物理的に膨潤してゲルを形成する。
一例では、本発明の方法に好ましいＶＤＲアゴニストの用量は、患者が許容することができ、重症の高カルシウム血症を発症しない最大量である。一実施形態では、ＶＤＲアゴニスト化合物の治療的投与は、軽度の高カルシウム血症を引き起こすにすぎない。別の例では、ＶＤＲアゴニストは高カルシウム血症の症状を引き起こさない。
一部の実施形態では、ビタミンＤ２およびＤ３の治療有効用量は、約５０ＩＵから約５０，０００ＩＵまでの範囲である。一部の実施形態では、例えば、約７５ＩＵ、約１００ＩＵ、約２５０ＩＵ、約５００ＩＵ、約７５０ＩＵ、約１，０００ＩＵ、約１，５００ＩＵ、約２，０００ＩＵ、約２，００ＩＵ、約５，０００ＩＵ、約７，５００ＩＵ、約１０，０００ＩＵ、約１５，０００ＩＵ、約２０，０００ＩＵ、約２５，０００ＩＵ、約４０，０００ＩＵ、または約５０，０００ＩＵ未満、またはこれらを超えるなどの経口用量のビタミンＤ２および／またはＤ３を投与する。他の実施形態では、０．００１から１０マイクログラムまでの用量のカルシトリオールを投与する。例えば、一部の実施形態では、約０．０１μｇ、約０．０５μｇ、約０．１μｇ、約０．２５μｇ、約０．５μｇ、約１μｇ、約５μｇ、または約１０μｇの用量のカルシトリオールを投与する。一実施形態では、ＶＤＲアゴニストは、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも２５μｇ／ｋｇ、少なくとも５０μｇ／ｋｇ、少なくとも６０μｇ／ｋｇ、または少なくとも１００μｇ／ｋｇ、例えば１から１０００μｇ／ｋｇ、１から１００μｇ／ｋｇ、１から７５μｇ／ｋｇ、１０から８０μｇ／ｋｇ、３０から７５μｇ／ｋｇ、または５０から７０μｇ／ｋｇ、例えば１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１１０μｇ／ｋｇ、または１２０μｇ／ｋｇの用量で投与されるカルシポトリオールである。一部の例では、このような用量のカルシポトリオールを、腹腔内または静脈内の注射によって投与する。一実施形態では、ＶＤＲアゴニストは、少なくとも０．１μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも５０μｇ、または少なくとも１００μｇ、例えば、１から２０μｇ、５から１５μｇ、または８から１２μｇ、例えば、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、または２０μｇの用量で投与されるパリカルシトールである。一部の例では、このような用量のカルシポトリオールを、毎週３回静脈内注射により投与する。一部の実施形態では、より大用量のＶＤＲアゴニストを、膵臓、肝臓、腎臓、肺、または前立腺など、目的の臓器を標的化する送達経路により投与する。このような標的化方法を、以下にさらに十分に記載する。
ある特定の実施形態では、ＶＤＲアゴニストを、単一の、または分割した用量などにおいて、経口投与する。経口投与では、組成物を、例えば、処置されている被験体に対して投与量を症候性に調整するために有効成分を、１日あたり少なくとも７５ＩＵ、少なくとも１００ＩＵ、少なくとも２５０ＩＵ、少なくとも５００ＩＵ、少なくとも７５０ＩＵ、少なくとも８００ＩＵ、少なくとも１，０００ＩＵ、少なくとも１，５００ＩＵ、少なくとも２，０００ＩＵ、少なくとも２，５００ＩＵ、少なくとも５，０００ＩＵ、少なくとも７，５００ＩＵ、少なくとも１０，０００ＩＵ、少なくとも１５，０００ＩＵ、少なくとも２０，０００ＩＵ、少なくとも２５，０００ＩＵ、少なくとも４０，０００ＩＵ、または少なくとも５０，０００ＩＵ、例えば、１日あたり５０ＩＵから２０００ＩＵ、１日あたり１００ＩＵから１０００ＩＵ、例えば、１日あたり８００ＩＵまたはそれを超えるなど、有効成分１．０から１０００ｍｇを含む錠剤の形態において提供する。
有効な非経口用量は、化合物に応じて約０．００１μｇから約１０μｇの範囲など、より低いことが予想され得る。投与量および投与量レジメンは、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物の併用、ならびに療法を受ける宿主の状態の重症度などを考慮に入れて、健全な専門的な判断に従って各被験体の場合に個々に考慮しなければならないため、場合によってより低い用量が望ましく、場合によってより多い用量が必要とされる。
別の実施形態では、ＶＤＲアゴニストが１α−ヒドロキシ化合物ではない場合、１６０ポンド（７２．６ｋｇ）の患者１人１日あたり１．０から１００μｇの間の、例えば、１６０ポンドの患者１人１日あたり５．０から５０μｇの間の１日量を投与する。異なる一実施形態では、生物学的に活性なビタミンＤ化合物が１α−ヒドロキシ化合物である場合、１６０ポンドの患者１人１日あたり０．１から２０μｇの間の１日用量を投与し、好ましい用量は１６０ポンドの患者１人１日あたり０．５から１０μｇの間である。特定の一例では、用量は１日あたり３〜１０μｇの間である。
一例では、ＶＤＲアゴニストはコレカルシフェロールまたはカルシジオールである。一部の例では、毎週５０，０００から５００，０００単位など、通常より高い用量をより低い頻度で投与する。
本開示は、ビタミンＤ受容体アゴニストの、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の処置に有用である１つまたは複数の他の薬剤との併用も含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＤＲアゴニストを、有効用量の他の薬品および医薬品と併用して投与する。一部の実施形態では、１つまたは複数の公知の抗膵炎薬が、ビタミンＤ受容体アゴニストと一緒に含まれる。
本開示は、ＶＤＲアゴニストの、化学療法剤および／または生物製剤など、がんの処置において有用な１つまたは複数の他の薬剤との併用も含む。例えば、一部の実施形態では、ＶＤＲアゴニストを、他の医薬および製剤上の、有効用量の化学療法薬剤および／または生物製剤薬剤と併用して（例えば、同時に、併行して、または次々と）投与する。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法薬剤および／または生物製剤薬剤がＶＤＲアゴニストと一緒に含まれる。
Ｇ．例示的な化学療法および生物製剤療法
活性な星状細胞（ＣＸＣＬ１２活性を有するものなど）を有するがんを処置する開示された方法は、ＶＤＲアゴニストを、化学療法および生物療法などの他の治療薬剤と併用して使用することができる。化学療法および生物療法には、抗新生物性の化学療法薬剤、抗生物質、アルキル化剤および抗酸化剤、キナーゼインヒビター、ならびに抗体などの他の薬剤が含まれ得る。このような薬剤の方法および治療投与量は当業者には公知であり、熟練した医師によって決定することができる。以下の１つまたは複数の分類に該当し得、または該当し得ない、抗腫瘍薬剤などの他の治療薬剤も、記載するＶＤＲアゴニストとの併用の投与に適する。このような薬剤の選択および治療投与量は当業者には公知であり、熟練した医師によって決定することができる。例えば、１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと併用した処置において使用される化学療法および／または生物製剤は、処置しようとするがんに基づいて選択することができる。
一例では、化学療法または生物療法は、がん細胞の死滅を増大（またはがん細胞の生存性を低減）する。このような死滅は、がん細胞の１００％の低減をもたらす必要はなく、例えば、生存性のがん細胞の数を、（例えば、がんの化学療法または生物療法での処置なしと比べて）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の低減をもたらすがんの化学療法を、本明細書に提供する方法において使用することができる。例えば、がんの化学療法または生物療法は、がん細胞の増殖を、（例えば、化学療法または生物療法なしと比べて）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。
使用することができる化学療法薬剤の特定の例には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン、葉酸（例えば、メトトレキセート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン、植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）；微小管結合性薬剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）ビンクリスチン、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、リゾキシン、ならびにこれらの誘導体および類似体）、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ならびにこれらの誘導体および類似体）、ＤＮＡ合成インヒビター（例えば、メトトレキセート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、およびこれらの類似体）；アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）；代謝拮抗薬、例えば、細胞毒性／抗腫瘍抗生物質、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、およびマイトマイシン；トポイソメラーゼインヒビター、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、メチルアミノレブリネート、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン、酵素、酵素インヒビター（例えば、カンプトテシン、エトポシド、フォルメスタン、トリコスタチン、ならびにこれらの誘導体および類似体）、キナーゼインヒビター（例えば、イマチニブ、ゲフィニチブ、およびエルロチニブ（ｅｒｏｌｉｔｉｎｉｂ））、遺伝子調節剤（ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（例えば、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン、ならびにこれらの誘導体および類似体）；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブ、およびトレチノインが含まれる。
一例では、生物療法は、ヒト化抗体などの抗体を含み、または抗体からなる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、またはキメラの抗体であってよい。上記に記述した通り、特定の標的に特異的な抗体を作成する方法は慣例的である。一部の例では、治療用抗体を毒素とコンジュゲートする。例示的な生物療法には、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、およびトラスツズマブが含まれる。
生物療法の他の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムなどの阻害性の核酸分子が含まれる。標的の核酸を特異的に標的化し、その発現を制御するあらゆるタイプのアンチセンス化合物が、使用に企図される。アンチセンス化合物は、標的の核酸分子と特異的にハイブリダイズし、その核酸分子の発現を変調する化合物である。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝、またはヘアピン状の化合物として導入することができ、内部または末端のバルジまたはループなどの構造エレメントを含むことができる。二本鎖のアンチセンス化合物は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした二本の鎖でも、または完全にもしくは部分的に二本鎖の化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する一本鎖でもよい。一部の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的のｍＲＮＡに対してハイブリダイズする場合、二重鎖がＲＮａｓｅＨによって認識され、ｍＲＮＡの切断をもたらすような、一本鎖アンチセンス化合物である。他の例では、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子発現を制御するｍＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的である、約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。さらなる例では、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに切断される、緊密なヘアピンを形成するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ分子は一般的に、長さ約２０〜２５ヌクレオチドであり、３’末端上に２ヌクレオチドのオーバーハングを有してもよく、または平滑末端でもよい。一般的にｓｉＲＮＡの一本の鎖は、標的の核酸に対して少なくとも部分的に相補的である。遺伝子を特異的に標的化するアンチセンス化合物は、ｍＲＮＡ配列など標的のヌクレオチド配列に対して相補的である化合物をデザインすることによって調製することができる。アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズし、標的の配列を制御するのに、標的の核酸分子に対して１００％相補的である必要はない。例えば、アンチセンス化合物、または化合物のアンチセンス鎖は、二本鎖化合物の場合、標的の核酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％相補的であってよい。アンチセンス化合物を特異性に対してスクリーニングする方法は周知である（例えば、米国公開第２００３−０２２８６８９を参照されたい）。加えて、阻害性の核酸分子をデザインし、調製し、使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。
Ｈ．投与経路
本開示は、ＶＤＲアゴニスト、化学療法、および生物療法の特定の投与様式に制限されないものとされる。静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸膜内、髄腔内、経口、直腸、経皮、吸入、および局所を含めた、多様な投与様式が企図される。ある特定の実施形態では、治療用組成物を坐剤によって、または経口送達用の錠剤もしくはカプセル製剤において投与する。一実施形態では、治療用組成物の投与は夜に生じる。別の実施形態では、複数回用量（例えば、３または４回）を、２４時間の期間に提供する。さらなる一実施形態では、治療用組成物の投与は、パルス静脈内療法による。一例では、治療用組成物を経皮パッチ（皮膚パッチ）により投与する。
例えば、ＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法を、一実施形態では、食塩水媒体などの任意の従来の静脈注射用媒体において、または血漿媒体において静脈内に投与する。他の実施形態では、投与は、液剤または丸剤などとして、経口のものである。他の実施形態では、投与は、ＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法を含む坐剤によるなど、直腸のものである。なお他の実施形態では、投与は、肺、腎臓、膵臓、前立腺、または肝臓の動脈内へのＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法を含む医薬組成物の直接注入による。さらに他の実施形態では、標的の送達技術を使用して、組成物を、肺、腎臓、膵臓、前立腺、または肝臓などの標的組織に送達する。特定の非限定的な一例では、ＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法は、標的組織によって吸収されるようにデザインされており、または標的細胞による取込みを促進する標的特異的な担体分子に連結されている。例えば、星状細胞では、ＶＤＲアゴニストは、低密度および／または高密度リポタンパク質に対する受容体（ＬＤＬおよび／またはＨＤＬ受容体）に対してコンジュゲートしていてよい。
本開示は、ＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法を含む治療用組成物を含む経皮パッチも提供する。一実施形態では、経皮パッチは、治療有効量のＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法を含む。別の実施形態では、経皮パッチは、単一のポリマーまたは複数のポリマーをさらに含む。一例では、経皮パッチは、ポリウレタンアクリル共重合体をさらに含む。一実施形態では、経皮パッチは、シリコーンもしくはポリイソブチレン（ｐｏｌｙｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ）、または両方をさらに含む。一実施形態では、経皮パッチは、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎を発症するリスクのある被験体によって装着される。別の実施形態では、経皮パッチは、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の症状を有する被験体によって装着される。別の実施形態では、経皮パッチは、ＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の症状を低減するような条件下で、ＶＤＲアゴニストを被験体に持続的に送達する。一実施形態では、経皮パッチは、肺、腎臓、膵臓、前立腺、または肝臓のがんを有する被験体によって装着される。
処置期間を通しておよそ同じ用量の、漸増用量レジメンにおける、または負荷用量レジメン（例えば、負荷用量が維持用量の約２から５倍である負荷投与量レジメン）における、本開示によるＶＤＲアゴニスト、化学療法、および／または生物療法の医薬組成物を投与することができる。一部の実施形態では、用量は、処置する被験体の状態、疾患または状態の重症度、療法に対する見かけの応答、および／または当業者が判断する他の要因に基づいて、処置の経過の間に変動する。一部の実施形態では、例えば、被験体におけるＧＬＰ−１アゴニストが誘発する膵炎の再発を防止または低減するために、薬物での長期間の処置が企図される。
（実施例１）
実験手順
細胞株
ヒト膵臓がん細胞株ＭｉａＰａＣａ−２（ＣＲＬ−１４２０）、ＢｘＰＣ−３（ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＣ（ＣＲＬ−２１１９）、Ｐａｎｃ１（ＣＲＬ−１４６９）、およびＡｓＰＣ１（ＣＲＬ−１６８２）を、ＡＴＣＣから取得し、供給元の指示に従い培養した。マウス膵臓がん細胞株ｐ５３ ２．１．１、ｐ５３ ４．４、およびＩｎｋ ２．２を、ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、Ｔｒｐ５３ｌｏｘ／ｌｏｘ、Ｐｄｘ１−ＣｒｅマウスまたはＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｌｏｘ／ｌｏｘ、Ｐｄｘ１−ＣｒｅマウスにおけるＰＤＡから誘導し（Ｂａｒｄｅｅｓｙら、２００６年；Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎら、２０１１年）、以前に記述された通り培養した（Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎら、２０１１年；Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎら、２０１２年）。自然発生の不死化ヒト膵星細胞株ｈＰＳＣを、以前に記述された通り、外科的切除後に膵臓がん患者から単離し、樹立した（Ｍａｎｔｏｎｉら、２０１１年）。
初代膵星細胞の単離および培養
マウスＰＳＣ単離
膵星細胞（ＰＳＣ）を、Ａｐｔｅらにより記述の方法を修正したものにより、８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの膵臓から単離した（Ａｐｔｅら、１９９８年）。簡潔に述べると、膵臓組織をハサミで細かく刻み、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中の０．０２％プロナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、０．０５％コラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１％ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で、３７℃で２０分間消化した。次に、消化された組織を１００μｍナイロンメッシュで濾過した。細胞をＧＢＳＳで１回洗浄し、ペレット化し、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＧＢＳＳ９．５ｍｌおよび２８．７％ナイコデンツ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；溶液のおよその密度は１．０７０）８ｍｌ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、０．３％ＢＳＡを含有するＧＢＳＳの下に層化し、１４００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離した。目的の細胞を、下部のナイコデンツ溶液および上部の水性溶液の界面から回収した。単離ＰＳＣをＧＢＳＳで洗浄し、１０％特徴付けＦＢＳ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。細胞を、７％ＣＯ２の加湿雰囲気中に３７℃で維持した。８０％コンフルエンスに到達後、細胞を短時間トリプシン処理（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、継代培養した。
ヒトＰＳＣ単離
肝臓におけるＳｃｈａｆｅｒらにより記述の方法を修正したものにより、膵臓星状細胞を単離した（Ｓｃｈａｆｅｒら、１９８７年）。簡潔に述べると、ヒト膵臓がんからの膵臓組織をハサミで細かく刻み、０．０２％プロナーゼ、０．０５％コラゲナーゼＰ、および０．１％ＤＮａｓｅで２０分間、３７℃で消化した。組織片を洗浄し、ゲイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）９．５ｍｌ中に再懸濁させた。第２の洗浄後、組織片を、１０％ウシ胎仔血清、４ｍＭグルタミン、および抗生物質（ペニシリン１００ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）を含有するイスコーブ変法ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）中に再懸濁させ、プラスチック６ウェル培養プレート内に上述の通りウシ胎仔血清、グルタミン、および抗生物質を有するダルベッコ培地中で播種し、一晩接着させた。組織を、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中に３７℃で維持し、星状細胞が現れるまで維持した（６０〜８０％コンフルエンスに到達するのに３から５週間）。ＰＳＣが約２０％コンフルエントのときに、組織片を除去した。培地を週に１回補充し、細胞は、回収され液体窒素中で凍結される前に８０％コンフルエンスにまで増殖した。
動物
ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ−Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ（ＫＰＣ）マウス（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、２００５年）が、Ｖｄｒ−／−マウス（Ｙｏｓｈｉｚａｗａら、１９９７年）と同様に、以前に記述されてきた。
ＲＮＡ−Ｓｅｑ
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオンカラムＤＮａｓｅ消化を伴うＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用して、ヒトおよびマウスＰＳＣからの全ＲＮＡを単離した。生物学的４連物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）をヒト試料について使用し、生物学的３連物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）をマウス試料について使用した。ＶＤＲ活性化でのトランスクリプトーム研究のため、ＰＳＣをビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオール（Ｔｏｃｒｉｓ）で処理し、所定の時点で回収した。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造者のプロトコールに従い使用して、１００〜５００ｎｇ全ＲＮＡから配列決定ライブラリーを調製した。ＲＮＡ−ＳｅｑデータのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓの受託番号は、ＧＳＥ４３７７０である。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
製造者の指示に従い、トリゾール抽出後に全ＲＮＡを精製した。ｉＳｃｒｉｐｔ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡ合成を実施し、ＣＦＸ３８４検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を使用してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。検量線法を使用して相対発現値を決定した。プライマー配列を表２に見出すことができる。
脂肪滴蓄積アッセイ
初代ヒトＣＡＰＳＣを、ガラスカバースリップ上に播種した。一晩の付着後、細胞をビヒクル（ＤＭＳＯ）または１００ｎＭカルシポトリオールで４８時間処理した。培地を吸引し、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、１０％緩衝ホルマリン中室温で１５分間固定した。固定剤を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次に、細胞を４，４−ジフルオロ−１，３，５，７，８−ペンタメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）１μｇ／ｍｌで１時間室温で染色し、光から保護した。染料を除去して、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にベクタステイン封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して封入した。Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００Ｂ蛍光顕微鏡上のＧＦＰフィルターを通じて蛍光を視覚化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量を実施した。
馴化培地実験
初代ＣＡＰＳＣを、１００％コンフルエンシーまで増殖させた。新鮮な培地を培養物に添加し、この時点で、ＣＡＰＳＣを１００ｎＭカルシポトリオールで処理した。４８時間後、馴化培地を回収し、０．４５μｍの細孔を通して滅菌濾過し、５０〜６０％コンフルエンシーの膵臓がん細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ＰＣＣ）に添加した。馴化培地インキュベーションの開始時に、ＰＣＣを１００ｎＭカルシポトリオールで直接処理した。４８時間後、ＰＣＣを回収し、ＲＮＡおよびタンパク質を解析のため単離した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生存度アッセイ
ＭｉａＰａＣａ−２細胞を、９６ウェルプレート（１×１０４細胞／ウェル）内にＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で播種した。一晩のインキュベーション後、細胞を洗浄し、培地を、１００ｎＭカルシポトリオールを有するもしくは有しないＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、または馴化培地（ＣＭ）回収前に４８時間１００ｎＭを有してもしくは有さずにインキュベートされたＣＡＰＳＣからのＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）に変えた。細胞を２４時間インキュベートし、次に示された用量のゲムシタビン（Ｓｉｇｍａ）またはビヒクルのみで処理した。４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光ベース生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い使用して生存度を測定した。実験を３連で行った。
同所移植／同種移植モデル
使用された同所移植モデルは、以前に記述されていた（Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎら、２０１２年）。簡潔に述べると、５０％マトリゲル中の１×１０３個のｐ５３ ２．１．１細胞を、６〜８週齢ＦＶＢ／ｎマウス内に同所注射した。７日目の生物発光画像化後、マウスを４つの処置群、すなわち生理食塩水、カルシポトリオール（６０μｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．、ＱＤＸ２０）、ゲムシタビン（２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．、Ｑ３ＤＸ４）、またはカルシポトリオール＋ゲムシタビンのうちの１つへと無作為に分けた。組合せ処置マウスについては、カルシポトリオール処置を７日目に開始し、ゲムシタビン処置を１４日目に開始した。マウスを２６日目または苦しんだときに安楽死させ、膵臓を回収し、スライスし、液体窒素中で急速冷凍するか、または直ちにホルマリン中で固定した。
ＰＨ３定量
膵臓を亜鉛含有中性緩衝ホルマリン（Ａｎａｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、５μｍ切片へと切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置いた。圧力鍋内でのクエン酸塩媒介性抗原回復の後、内因性ペルオキシダーゼを３％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳ中で１５分間クエンチした。切片を一連のキシレン／エタノールにより脱パラフィンし、水分補給した。ベクタステインＥｌｉｔｅ ＡＢＣ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して、残りのステップを実施した。一次抗体を１：１００で使用した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍（ｎ＝５）ごとに６枚の２００×画像をキャプチャーして、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ．Ｍ２顕微鏡上でスコアリングした。Ｎｕａｎｃｅ ３．０．１．２マルチスペクトル画像化ソフトウェアを使用して画像を取得し、ｉｎＦｏｒｍ １．４．０ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して陽性細胞を同定し、スコアリングした。
ＫＰＣ研究デザイン
以前に記述された通り、腫瘍サイズに基づき膵管腺癌を有するＫＰＣマウスを使用した（Ｏｌｉｖｅら、２００９年）。本研究において、登録は、高解像度超音波画像化により決定される６から９ｍｍｍの間の平均直径の腫瘍を有するマウスに制限された。好適なマウスを処置群、すなわちゲムシタビン、カルシポトリオール、またはゲムシタビンとカルシポトリオールとの組合せに割り付けた。ゲムシタビンを、食塩溶液として１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射により３日に１回投与し、適切であれば、最終用量を安楽死の２時間前に与えた。カルシポトリオールを、食塩溶液として毎日６０μｇ／ｋｇで腹腔内注射により投与した。処置の９日後または臨床兆候、例えば腹水症、重度の悪液質、有意な体重減少または不活動性の発症時にマウスを安楽死させた。腫瘍を高解像度超音波により９日間の処置研究中に２度まで画像化した。
ＫＰＣ腫瘍の画像化および定量
以前に記述された通り、３５ＭＨｚ ＲＭＶ走査ヘッドを備えるＶｅｖｏ ７７０システム（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、マウス膵臓の高解像度超音波画像化を実施した（ＤｏｗｅｌｌおよびＴｏｆｔｓ、２００７年）。連続３Ｄ画像を、０．２５ｍｍ間隔で収集した。統合Ｖｅｖｏ ７７０ソフトウェアパッケージを使用して、腫瘍は、各２Ｄ画像上で輪郭が描かれ、３Ｄ体積を測定するために再構築された。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる腫瘍内ｄＦｄＣ、ｄＦｄＵ、およびｄＦｄＣＴＰの定量
Ｂａｐｉｒｏらにより記述された通り、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施した（Ｂａｐｉｒｏら、２０１１年）。秤量された腫瘍試料（１０ｍｇ）を、２５μｇ／ｍｌテトラヒドロウリジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する氷冷５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）２００μｌ中で均質化した。ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ ２４（ＭＯ ＢＩＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）内のセラミックビーズチューブ内で、２回の３０秒パルスで、３０００ｒｐｍで均質化を実施した。−８０℃での短期貯蔵後、試料を氷上で解凍し、パワーレベル２に設定されたＳｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ ５５０超音波ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で単回３秒パルスでさらに均質化した。次に、５０μｌの組織ホモジネートを、内部標準［１３Ｃ９ １５Ｎ３ ＣＴＰ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、１３Ｃ１５Ｎ２ ｄＦｄＣ（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１３Ｃ１５Ｎ２ ｄＦｄＵ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）］を含有する２００μｌの氷冷アセトニトリル（５０％、ｖ／ｖ）と組み合わせ、ボルテックスし、１５，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。２００μｌの上清を乾燥させ、水１００μｌ中に再懸濁させ、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂガードカラム（１０×２．１、５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着した１５μｌをＨｙｐｅｒｃａｒｂカラム（１００×２．１ ＩＤ、５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に注入した。検体を、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ１０中のアセトニトリルの勾配を使用して分離し、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ−ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して検出した。薬物回収率を、内部標準を使用して正規化し、記述された未処置組織ホモジネートから生成された較正標準を使用して定量した（Ｂａｐｉｒｏら、２０１１年）。
免疫組織化学
処置ＫＰＣマウスから回収された腫瘍を、緩衝ホルマリン中で直ちに固定した。固定組織を、パラフィン内に包埋し、５μｍ切片へと切断した。圧力鍋内で１０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０を使用して抗原回復を実施してＣＣ３をアンマスクし、または圧力鍋内で１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を使用してＣＤ３１をアンマスクした。メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２を使用して、内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。上述のベクタステインＡＢＣキットを使用して、ＣＣ３のため（一次抗体１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＣＤ３１のため（一次抗体１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の免疫組織化学的染色を実施した。Ｎｕａｎｃｅ ３．０．１．２マルチスペクトル解析ソフトウェアを使用して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ．Ｍ２顕微鏡上で、腫瘍ごと（ゲムシタビン：ｎ＝４、カルシポトリオール：ｎ＝７、ゲムシタビン＋カルシポトリオール：ｎ＝７）に６枚の４００×フィールドをキャプチャーした。Ｎｕａｎｃｅソフトウェアを使用して、各切片におけるＣＤ３１陽性領域を定量した。ＣＣ３定量については、ｉｎＦｏｒｍ １．４．０ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアをトレーニングして（ｔｒａｉｎ）腫瘍を間質から区別するために、ヘマトキシリンのみで染色した切片を使用した。腫瘍細胞総数をフィールドごとに定量し、同時にＣＣ３陽性腫瘍細胞総数およびパーセントをフィールドごとに定量した。フィールドごとの腫瘍細胞総数の変動のために、ＣＣ３陽性細胞のパーセントとしてデータをプロットした。
免疫染色
マウス膵臓
組織をＯ．Ｃ．Ｔ．に包埋し、凍結切片を氷冷メタノール中で−２０℃で２０分間固定した。切片をＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ブロッキング溶液）中で１時間室温でブロッキングした。ブロッキング溶液中の一次抗体希釈物は、以下の通りである。すなわち、抗ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、１：１００（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗コラーゲンＩ、１：５００（Ａｂｃａｍ）、抗ＧＦＡＰ、１：１００（Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ４５、１：１００（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。一次抗体インキュベーションを加湿チャンバー内で４℃で一晩実施した。切片をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回洗浄し、次に二次抗体中で１時間室温でインキュベートし、光から保護した。使用された二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ラットＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれ、ブロッキング溶液中１：２５０で使用した。切片をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩを有するまたは有しないベクタステイン封入剤で封入した。Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００Ｂ蛍光顕微鏡上で蛍光を視覚化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した。
ヒトＰＤＡ
１）免疫組織化学的染色
ＰＤＡの手術を受けている患者から膵臓組織を除去し、４％パラホルムアルデヒド中に一晩４℃で浸漬することにより固定した。標本を標準的なパラフィンワックス中に包埋し、４μｍ切片へと切断した。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合検出キット（ベクタステインＥｌｉｔｅ ＡＢＣラットＩｇＧキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＶＤＲの免疫組織化学的染色を実施した。簡潔に述べると、組織切片を脱パラフィンし、ＰＢＳ中で再び水分補給した。標的回復溶液（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）での抗原回復後に、内因性ペルオキシダーゼ活性を０．３％過酸化水素でのインキュベーションによりブロッキングした。希釈した正常ウサギ血清中での浸漬後、切片をラット抗ＶＤＲ抗体（１：１００の希釈度、Ａｂｃａｍ）とともに一晩４℃でインキュベートした。スライドをビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体とともに、続いてビオチン化酵素コンジュゲート化アビジンとともにインキュベートした。最後に、スライドを数分間ジアミノベンジジン（同仁化学研究所、熊本、日本）とともにインキュベートすることにより発色させた。
２）免疫蛍光染色
組織切片を脱パラフィンし、ＰＢＳ中で再び水分補給した。標的回復溶液での抗原回復後、スライドを３％ＢＳＡでブロッキングし、ウサギ抗α−ＳＭＡ抗体（１：２００の希釈度、Ａｂｃａｍ）およびラット抗ＶＤＲ抗体（１：１００の希釈度）とともに一晩４℃でインキュベートした。洗浄後、スライドを１時間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００の希釈度、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（１：２００の希釈度、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。洗浄後、一体型蛍光顕微鏡（ＢｉｏＺｅｒｏ ＢＺ−９０００、キーエンス、大阪、日本）を使用してスライドを蛍光について解析した。ＤＡＰＩを使用して核の対比染色を実施した。
ｓｉＲＮＡ
ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＶＤＲ ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、ＣＡＰＳＣにおいてＶＤＲノックダウンを標的化しない対照とともに実施した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１試薬を製造者の指示に従い使用して、細胞にｓｉＲＮＡプールをトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後にカルシポトリオール処理を開始し、処理４８時間後（トランスフェクション７２時間後）に細胞を回収した。
膵臓組織サブタイプにおける遺伝子発現解析
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
膵臓を８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから回収し、直ちにＯ．Ｃ．Ｔ．中に包埋し凍結した。各膵臓の断片をＰＳＣ単離（下）のために貯蔵した。組織を５μｍ厚で切断し、固定し、一連のエタノールにより水分補給し、Ｈ＆Ｅで染色し、次に一連のエタノールおよびキシレンにより清澄化した。切片を完全に乾燥させ、次に画像化してＭＭＩ ＣｅｌｌＣｕｔレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムを使用して顕微解剖した。腺房、管、および島を同定し、動物ごと（ｎ＝５）に約１０〜２０個の切片に顕微解剖した。
遺伝子発現解析
上述のレーザーキャプチャーされた試料から、および同じ動物に由来するＰＳＣから、これら細胞のクリーンなレーザーキャプチャーは困難であることが知られているので、密度遠心分離により、ｑＲＮＡを抽出した。ＡＢＩ Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＴ Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡ試料（２０ｎｇ）を逆転写した。低収量のため、次にｃＤＮＡ試料をＴａｑｍａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従い使用し、適切なプライマー対を使用した事前増幅にかけ、続いてプライマーオリゴヌクレオチドをＥｘｏＩ（ＮＥＢ）で消化した。次に、事前増幅されたｃＤＮＡを、Ｖｄｒおよび適切な対照遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲのために使用した。
ＲＮＡ−Ｓｅｑ
試料調製
簡潔に述べると、ｍＲＮＡを精製し、断片化し、第１の、次に第２の鎖のｃＤＮＡ合成のために使用し、続いて３’末端をアデニル化した。独自のアダプターに試料をライゲーションし、ＰＣＲ増幅にかけた。次に、２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してライブラリーを検証し、正規化し、配列決定のためにプールした。ヒト正常およびがん関連ＰＳＣを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩプラットフォーム上で４１ｂｐのリード長で配列決定し、一方でマウスＰＳＣおよびヒトＭｉａＰａＣａ−２細胞を、バーコード化多重化および５１ｂｐのリード長を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００上で配列決定した。
データ解析
ＴｏｐＨａｔ２ ｖ２．０．４を使用して、初期マッピングのために２５ｂｐ ５’セグメントシード（２５ ｂｐ ５’ ｓｅｇｍｅｎｔ ｓｅｅｄ）を使用して、リードアラインメントおよびジャンクションマッピングを遂行し、続いてＣｕｆｆｄｉｆｆ ｖ２．０．２を使用して差次的遺伝子発現解析を行い、リードを参照ゲノムアノテーション、ＮＣＢＩマウスｂｕｉｌｄ ３７．２およびヒトｂｕｉｌｄ ３７．２にマッピングした（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１２年）。複製試料ごとの配列決定リード収量の中央値は、ＭｉａＰａＣａ−２細胞が４９．２Ｍ、マウスＰＳＣが２５．４Ｍ、ヒトＰＳＣが５３．８Ｍだった。データは、マッピングされた１００万個の断片あたりのエクソンの１キロベースあたりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｍａｐｐｅｄ：ＦＰＫＭ）として表現した。Ｃｕｆｆｄｉｆｆ出力からＣｕｍｍｅＲｂｕｎｄ ｖ２．０．０を使用してボルケーノプロットを生成した（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２０１２年）。
薬物調製
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからセルレインを購入し、無菌生理食塩水中に１０μｇ／ｍｌで再懸濁させ、−２０℃で６ヶ月まで貯蔵した。カルシポトリオール（Ｔｏｃｒｉｓ）を濃縮保存溶液として１００ｍＭでＤＭＳＯ中に再懸濁させ、次に無菌生理食塩水中で２０μＭまで希釈した。カルシポトリオールの希釈アリコートを、光から保護して６ヶ月まで−２０℃で貯蔵した。ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を無菌生理食塩水中に５ｍｇ／ｍｌ ｄＦｄＣで再懸濁させ、室温で貯蔵した。
慢性膵炎モデル
８週齢で始めて野生型Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおいて慢性膵炎を誘導した。コホートごとに１０匹の動物が、生理食塩水、５０μｇ／ｋｇセルレイン、またはセルレイン＋４０μｇ／ｋｇカルシポトリオールの腹腔内注射を受けた。セルレイン注射は、１時間ごとの６回の注射を１週間に２回、１２週間投与し、最終セルレイン注射の１週間後に解析したが、これは以前の研究から適合させたものである（Ｓａｈら、２０１３年；Ｔｒｅｉｂｅｒら、２０１１年；Ｙｏｏら、２００５年）。慢性膵炎研究の期間中、カルシポトリオール注射を１週間に３回投与した。急性膵炎研究については、８週齢野生型またはＶｄｒ−／−マウスが、毎日単回の４０μｇ／ｋｇカルシポトリオールの注射ありまたはなしで、１時間ごとに６回の５０μｇ／ｋｇセルレインの腹腔内注射を、１日目、３日目、および５日目に受けた。マウスを６日目に屠殺した。剖検において、膵臓を回収し、ＰＳＣ単離のため上述の通り消化し、または本明細書に記載の組織学的解析のために調製した。
マッソン三色染色
ホルマリン固定、パラフィン包埋組織を５μｍ切片へと切断し、マッソン三色染色キット（ＩＭＥＤ Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコールに従い使用して染色した。線維性領域の定量のため、マルチスペクトル画像化を実施し、Ｎｕａｎｃｅ ３．０．１．２ソフトウェアを使用してアニリンブルー陽性領域を決定して定量した。試料ごとに６つの独立のフィールドをキャプチャーした。
シリウスレッド染色
組織学的切片をホルマリン固定組織から７μｍ厚で切断し、シリウスレッド／ファストグリーン染色（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を製造者の指示に従い実施した。画像を得て、Ｎｕａｎｃｅ ３．０．１．２ソフトウェアを使用してシリウスレッド陽性領域の定量を実施した。試料ごとに６つの独立のフィールドをキャプチャーした。
イムノブロッティング
全細胞抽出物を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液中で調製した。以前に記述された通りイムノブロッティングを実施した（Ｓｈｅｒｍａｎら、２０１０年）。使用された一次抗体には、ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）１：１０００（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＶＤＲ Ｄ−６ １：１０００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびアクチン１：５０００（Ｓｉｇｍａ）が含まれた。抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体１：５０００として使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降のためにｈＰＳＣ細胞株を利用したが、これは以前に記述されている（Ｂａｒｉｓｈら、２０１０年）。簡潔に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒド中で固定し、核を単離し、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、およびプロテアーゼインヒビターを含有する緩衝液中で溶解させ、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで２００〜１０００塩基対のクロマチン断片サイズへと剪断した。クロマチンをＶＤＲ（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＳＭＡＤ３（Ａｂｃａｍ）、またはウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体で免疫沈降させた。
（実施例２）
ＰＳＣにおけるがん関連遺伝子シグネチャーの同定
ＰＳＣにおけるがん関連変化を特徴付けるため、ＰＳＣトランスクリプトームの超並列配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を活性化の様々な段階で実施した。培養物中の初代ＰＳＣの進行性活性化（Ｏｍａｒｙら、２００７年）を用いて、健常マウス膵臓から単離された活性化前（３日培養）および活性化（７日培養）ＰＳＣのトランスクリプトームを解析した（図１Ａおよび図２Ａ〜図２Ｃ）。この解析は、活性化中にＰＳＣが、脂質貯蔵および脂質代謝に関わる遺伝子の発現を減少させることを明らかにしたが、これは、静止状態と関連する脂肪滴表現型の喪失と一致する。活性化はまた、サイトカイン、増殖因子、ＥＣＭ成分およびシグナル伝達分子、例えばＷｎｔを含む、腫瘍支持能（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と以前に関連付けられていた一群の遺伝子の発現の増加をもたらした。炎症遺伝子の同時誘導を特に目的とした。なぜなら、間質によるサイトカイン誘導は、パラクリン的に膵臓がんの開始および進行を促進することが示されてきたからである（Ｆｕｋｕｄａら、２０１１年；Ｌｅｓｉｎａら、２０１１年）。
培養物における分化転換により生じるＰＳＣ「活性化シグネチャー（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」に加えて、ＰＳＣ「がんシグネチャー（ｃａｎｃｅｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」を解析し、がん関連ＰＳＣ表現型をさらに定義した。ＰＤＡを有する患者から単離されたヒトＰＳＣ（ＣＡＰＳＣ）または良性状態について切除を受けている患者から単離されたヒトＰＳＣもまた、トランスクリプトーム解析を受けた（図１Ｂ）。これらのヒトＰＳＣを、１５日間培養（したがって培養活性化）し、適切な収量および純度を達成した。活性化非がん関連ＰＳＣとがん関連ＰＳＣとのこの比較は、腫瘍微小環境への曝露により生じる活性化表現型への変化を明らかにする。活性化シグネチャーおよびがんシグネチャーの両方が、ＰＤＡにおける不良な生存度および化学療法抵抗性を予測する、以前に同定された間質シグネチャー（ｓｔｒｏｍａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）からの遺伝子クラスを含む（Ｇａｒｒｉｄｏ−Ｌａｇｕｎａら、２０１１年）。加えて、脂質貯蔵遺伝子、例えば脂肪酸結合タンパク質は、両方のシグネチャーにおいて下方制御され、コレステロール生合成および取込み経路に関わる遺伝子の発現の増加を伴ったが、これは増殖能の増加と一致する。特に間質領域内での乏しい血液供給およびＰＤＡの重度の無血管性を鑑みると、負の血管新生調節因子の相互誘導および血管新生誘導因子の抑制は好ましいものである（図１Ｃ）。特に、よく記述されている強力な血管新生の内因性インヒビターであり、固形腫瘍のマーカーであるトロンボスポンジン−１（Ｔｈｂｓ１）（Ｌａｗｌｅｒ、２００２年）の誘導が観察された。両方の遺伝子シグネチャーが、ＥＣＭ成分、細胞接着分子、炎症媒介因子、パラクリン増殖および生存因子、脂質／コレステロール代謝に関わる遺伝子ならびにシグナル伝達のモジュレーターを含む。
（実施例３）
ＶＤＲはＰＳＣ活性化ネットワークを調節する
これらの解析はまた、ＰＳＣが予想外にも、以前は膵外分泌部では発現しないと考えられていた（Ｚｅｉｔｚら、２００３年）高レベルのビタミンＤ受容体（ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＤＲ）を発現することを明らかにした（図１Ｄ、図１Ｅ、図２Ｄおよび図２Ｅ）。がん関連ＰＳＣにおけるＶＤＲ発現を維持した（図１Ｆ）。密接に関連する肝星細胞において線維形成遺伝子ネットワークの重要な調節因子としてＶＤＲが関わる先行研究に照らして（Ｄｉｎｇら、２０１３年）、また１，２５（ＯＨ）２Ｄ３およびその類似体の確立された抗炎症性（Ｃａｎｔｏｒｎａら、１９９６年、１９９８年；Ｃａｎｔｏｒｎａら、２０００年；Ｍａら、２００６年；Ｎａｇｐａｌら、２００５年；Ｄｅｅｂら、２００７年）作用により、このドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）受容体を試験した。本研究とまた密接な関係があるのは、血漿ビタミンＤレベルと膵臓がんリスクとの間の強い逆相関（Ｗｏｌｐｉｎら、２０１２年）であり、これは説明されないまま残っている関係性である。さらに、ビタミンＤ欠乏症が慢性膵炎と関連付けられてきた（Ｍａｎｎら、２００３年）。
強力で非高カルシウム血性のビタミンＤ類似体であるカルシポトリオール（Ｃａｌ）を使用してＶＤＲ誘導を制御した（Ｎａｖｅｈ−ＭａｎｙおよびＳｉｌｖｅｒ、１９９３年）。手術後ＣＡＰＳＣには一切存在しない一方で、驚くべきことに、Ｃａｌ処置は、１９／２７の一次患者試料において脂肪滴形成を誘導し（図３Ａおよび４Ａ）、２４／２７の患者試料においてαＳＭＡ（ＡＣＴＡ２）の発現を減少させた（図３Ｂ）のであり、これは静止状態の復帰と一致する。
ＰＳＣにおけるＶＤＲ活性化のゲノム規模の効果を評価するため、ＶＤＲリガンドの存在または非存在下で増殖させた活性化前および活性化ＰＳＣのトランスクリプトーム解析を実施した。Ｃａｌ処置は活性化前ＰＳＣにおける遺伝子発現に影響した（３０７個および４３１個の遺伝子の発現のそれぞれ有意な増加および減少）一方で、ＶＤＲ活性化は、活性化ＰＳＣにおいてより広範な転写応答を有していた（６６４個および１６１６個の遺伝子のそれぞれ有意な発現の増加および減少）。ＰＳＣにおける活性化およびがんシグネチャーのＣａｌ依存性阻害が観察され（図３Ｃ、表３）、これは、血管新生の負の調節因子、例えばＴｈｂｓ１の抑制および血管新生の正の調節因子、例えばＭｍｐ９の誘導を含んでいた（Ｂｅｒｇｅｒｓら、２０００年）（図３Ｄ）。
Ｃａｌ処置の類似の効果が、ヒトＣＡＰＳＣにおける選択された候補遺伝子において観察された（図３Ｅ）。さらに、これらの効果はＶＤＲに依存していた。なぜなら、受容体のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンがＣａｌ誘導性の発現変化を妨害したからである（図３Ｆ）。ＶＤＲがＰＳＣ活性化プログラムに与える広範な影響を部分的に説明するため、ＶＤＲとＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路との間のゲノムクロストークを評価し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００１年、Ｙａｎａｇｉｓａｗａら１９９９年）、これは、以前に肝星細胞において実証された（Ｄｉｎｇら、２０１３）。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達に対する阻害効果と一致して、Ｃａｌは線維形成遺伝子のプロモーター領域におけるＶＤＲ結合を増加させた一方で、ＳＭＡＤ３結合を減少させた（図４Ｂおよび図４Ｃ）。
ＶＤＲ活性化がＰＳＣ活性化をｉｎ ｖｉｖｏで減少させたかどうかを決定するため、本発明者らはコレシストキニン類似体であるセルレインを使用して野生型マウスにおいて実験的慢性膵炎を誘導し（Ｗｉｌｌｅｍｅｒら、１９９２年）、疾患進行を通じてＣａｌを同時投与した。セルレインのみを受けたマウスと比較して、Ｃａｌ処置動物は、炎症および線維症の減弱を示したが、これはＰＳＣ活性化の減少と一致する（図５Ａおよび図５Ｂ）。活性化およびがんシグネチャー遺伝子の発現は、対照と比較して、Ｃａｌで処置されたマウスから単離されたＰＳＣにおいて減少した（図６Ａ）。ＥＣＭ成分、炎症性サイトカインおよび増殖因子を含む、腫瘍微小環境において機能的に重要な活性化シグネチャー遺伝子において、減少が観察された。加えて、細胞の運動性と関連付けられるＡｃｔａ２発現が下降傾向だった。さらに、Ｃａｌ処置マウスにおいて、ホスホＳｔａｔ３の誘導の減少が観察され（図６Ｂ）、これは間質からの炎症性シグナル伝達の減少と一致する。特に、Ｓｔａｔ３活性化は、炎症性傷害とＰＤＡの開始との間の機構的関係として確立されてきた（Ｆｕｋｕｄａら、２０１１年；Ｌｅｓｉｎａら、２０１１年）。
野生型マウスにおける急性膵炎中のＣａｌ処置は、ＰＳＣ遺伝子発現における活性化関連変化を同様に損なわせ（図３Ｃ）、白血球浸潤および線維症を減少させた（図３Ｄおよび図３Ｅ）。Ｃａｌ処置時のＰＳＣ活性化の印象的な阻害を鑑みると、ＰＳＣ状態は、機能的ＶＤＲを欠損するマウスにおいて決定される。驚くべきことに、Ｖｄｒ−／−マウスからの膵臓は、自発的な腺房周囲および管周囲の線維症を示し（図５Ｃ）、ＰＳＣ活性化と対立するＶＤＲの役割をさらに支持した。この着想と一致して、ＰＳＣ遺伝子発現における活性化関連変化は、Ｖｄｒ−／−マウスにおけるセルレイン誘導急性膵炎において増大し（図６Ｆ）、線維症の増加を伴った（図６Ｇ）。さらに、Ｖｄｒ−／−マウスからの培養活性化ＰＳＣのＣａｌ処置は、観察された遺伝子変化のＶＤＲ依存性を実証した（図６Ｈ）。
合わせて、これらの結果は、ＶＤＲがＰＳＣ活性化プログラムの主たるゲノム調節因子として作用し、リガンドによるＶＤＲ誘導が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において静止状態であるＰＳＣ状態を回復および促進することを示す。
（実施例４）
間質性ＶＤＲ活性化は、腫瘍支持シグナル伝達事象を阻害する
ＰＳＣにおけるＶＤＲ活性化が腫瘍細胞とのクロストークに与える影響が決定された。ＣＡＰＳＣは一貫してＶＤＲを発現し、リガンドに応答した一方で、膵臓がん細胞株は、様々なＶＤＲ発現を示し、典型的にはＶＤＲ活性が低かった（図７Ａおよび図７Ｂ）。これはまた、ヒトＰＤＡ試料において観察された（図７Ｃ）。
上皮コンパートメントに対する間質性ＶＤＲ活性化の貢献を具体的に評価するため、きわめて低いＶＤＲ発現を有しＶＤＲリガンドに対する有意な応答を有しない、ＭｉａＰａＣａ−２細胞株に対するＣＡＰＳＣ由来分泌因子の効果を試験した（図７Ａおよび図７Ｂ）。初代ＣＡＰＳＣをコンフルエンシーまで増殖させ、培養の最後の４８時間、Ｃａｌの存在または非存在下で培養した。次に、ＣＡＰＳＣ馴化培地（ＣＭ）をこれらの培養物から回収し、ＭｉａＰａＣａ−２細胞に４８時間移した。ＣＡＰＳＣ ＣＭ中でインキュベートされたＭｉａＰａＣａ−２細胞における遺伝子発現のボルケーノプロット解析は、広範な変化を明らかにし（中央パネル）、これはＣａｌ処置ＣＡＰＳＣからのＣＭが使用されたときに大きく妨害された（右パネル）（図８Ａ）。ＣＡＰＳＣ ＣＭは、増殖（表４）、生存、上皮間葉移行、および化学療法抵抗性に関わる、上皮細胞における遺伝子発現変化を誘導した。
これらの変化は、上皮性ではなく間質性ＶＤＲ活性化により広範に阻害された（図８Ｂ）が、膵臓がん細胞におけるＶＤＲ活性化の直接的な抗増殖性およびアポトーシス促進性効果が、他の実験系において報告されてきた（Ｐｅｒｓｏｎｓら、２０１０年；Ｙｕら、２０１０年）。上皮性ではなく間質性ＶＤＲ活性化に対するこの感受性は、ＶＤＲ発現が変動する膵臓がん細胞株において再現された（図８Ｃ〜図８Ｇ）。間質性ＶＤＲ活性化は、ＣＳＦ２発現を有意に減少させ、これは膵臓腫瘍進行および抗腫瘍免疫の回避と近年関わってきた（Ｂａｙｎｅら、２０１２年；Ｐｙｌａｙｅｖａ−Ｇｕｐｔａら、２０１２年）。遺伝子発現変化は、ホスホＳＴＡＴ３の誘導の減少（図８Ｈ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学療法に対する抵抗性の減少（図８Ｉ）を伴った。
これらの結果は、ＰＳＣにおけるＶＤＲ活性化が、腫瘍支持ＰＳＣセクレトームを負に調節することを実証する。
（実施例５）
ＶＤＲリガンド＋ゲムシタビンは、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤＡに対する有効性を示す
上の結果は、ヒトＰＤＡの処置における単剤「ビタミンＤ療法」の見かけ上の失敗は、間質のみの処置が、治療上の利益を達成するには不十分であり得ることを反映しているかもしれないことを示す。加えて、腫瘍を直接標的化する薬剤は、腫瘍の低血管分布と関連付けられる内因性の化学療法抵抗性により、限定的な影響しか有さないことがあり得る。ＰＳＣ標的化療法の主な目的は、腫瘍−間質クロストークの阻害を、細胞毒性（または免疫性）剤の有効性を増強するために活用することであり、これはゲムシタビンの場合には、標準的治療であるとはいえ、ＰＤＡ患者に対して最小限（１．５ヶ月）の利益しか与えない（Ｂｕｒｒｉｓら、１９９７年）。
ビタミンＤ併用療法の可能性を実証するため、免疫応答性宿主を利用する同所同種移植モデルにおけるＣａｌ処置を試験した（Ｃｏｌｌｉｓｓｏｎら、２０１２年）。移植のための腫瘍細胞は、内因性変異体Ｋｒａｓを条件的に発現し、膵臓におけるｐ５３を欠損し（Ｂａｒｄｅｅｓｙら、２００６年）、低レベルのＶｄｒを発現するマウスに由来した（図９Ａおよび図９Ｂ）。２つの他のマウスＰＤＡ由来細胞株も同様に、低ＶＤＲ発現および活性を実証した（図９Ａおよび図９Ｂ）。これは、観察された治療効果がいずれも、宿主由来間質性ＶＤＲ活性化により生じた可能性が高いことを示すが、上皮コンパートメントからのある程度の貢献は排除されない。ＰＤＡの移植モデルにおける間質性反応が、自発的ＫＰＣ（ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ−Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ）モデル（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、２００５年；Ｏｌｉｖｅら、２００９年）と比較して抑えられているとはいえ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、およびＡｃｔａ２の測定可能なＰＳＣ活性化が、同種移植レシピエントにおいて線維症を伴って観察された（図９Ｃおよび図９Ｄ）。Ｃａｌ処置は、移植マウスにおける間質性活性化および線維症を減少させた（図９Ｅ）。移植モデルはゲムシタビンに対して応答性であるとはいえ、ゲムシタビンで処置したマウスを、ゲムシタビンとＣａｌとの組合せで処置したものと比較した。重要なことに、併用療法レシピエントにおいて、ＰＳＣ活性化について観察されたシグネチャーから、増殖の阻害ならびに間質性および上皮性遺伝子の発現に関して、ゲムシタビン応答性の明確な改善が観察された（図９Ｆおよび図９Ｇ）。
ゲムシタビン＋Ｃａｌ併用療法の有効性を、ゲムシタビンの取込みおよび応答が乏しいヒトＰＤＡを再現したＫＰＣモデルにおいて試験した（Ｏｌｉｖｅら、２００９年）。併用療法は、約７０％のマウスにおいて観察された一過性または持続性腫瘍退縮とともに腫瘍体積を有意に減少させた（図１０Ａおよび図１１Ａ）。間質性リモデリングの誘導と一致して、対照と比較して併用療法を受けたマウスにおいて、腫瘍関連線維症の減少が観察された（図１０Ｂ）。さらに、併用処置マウスは、ＰＳＣ活性化と関連する間質性および上皮性遺伝子シグネチャーからの有意に改変された遺伝子の発現を実証した（図１０Ｃ）。
ＰＳＣ活性化遺伝子の発現の減少および静止状態マーカーＦａｂｐ４の誘導は、腫瘍関連ＰＳＣが、活性化状態から静止状態へとシフトしていることを示す。薬物処置レジメンに対する個々の遺伝子の観察された感受性の違いは、ｉｎ ｖｉｖｏでの間質−腫瘍パラクリンシグナル伝達に対する特異的な摂動の結果であり得る。
併用療法はまた、ゲムシタビンのみと比較して併用療法を受けたマウスにおいて、ゲムシタビンの腫瘍内濃度および有効性を増加させ（図１０Ｄおよび図１１Ｂ）、ゲムシタビンの活性代謝物であるｄＦｄＣＴＰの濃度中央値において約５００％の上昇があった。ゲムシタビン分解酵素であるシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ：Ｃｄａ）または律速デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ｄＣＫ）の発現レベルの薬物誘導変化は観察されなかった（図１２Ａ）が、アロステリック効果があり得る。ｄＦｄＣＴＰの増加は、アポトーシスマーカーＣＣ３の陽性の増加を伴ったが、これは化学療法有効性の改善を示す（図１０Ｅ）。
さらに、併用療法により腫瘍内脈管構造は有意に増加したが、これはＣＤ３１陽性および見かけ上の血管開通の増加により証明された（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）。腫瘍切片の免疫組織化学的解析は、ＰＤＡを特徴付ける崩壊した血管ネットワークが、併用療法後に顕著に再活性化したことを示したが、これは腫瘍内ゲムシタビン濃度が薬物送達の改善により増加したことを示す。Ｃａｌとゲムシタビンとの組合せが治療有効性を顕著に改善した一方で、ＣａｌはＫＰＣモデルにおいて単剤として測定可能な有益な効果を示さなかった（図１３）。
（実施例６）
切除可能な膵臓がんにおける微小環境を標的化するネオアジュバントであるパリカルシトールの無作為化フェーズＩＩ／薬力学的／ゲノム研究
本実施例は、従来化学療法または免疫療法に対して抵抗性であったがんを処置するために、ＶＤＲアゴニストを化学療法剤と組み合わせる相乗効果を実証するために使用される方法を記述する。膵臓がんのための特定のＶＤＲアゴニストおよび化学療法剤が開示されるとはいえ、当業者は、特定のがん、例えば肺、腎臓、前立腺、胆管または肝臓のがんのために他のＶＤＲアゴニストを他の化学療法または生物製剤療法（例えば、それぞれについて既知の投与量および投与様式を使用すること）と組み合わせることができることを認識する。
切除可能な膵臓がんの手術前に、パリカルシトールを伴うまたは伴わない１サイクルのゲムシタビン／アブラキサンで処置された患者の腫瘍におけるＶＤＲ転写経路を標的化することの効果を、細胞マーカーおよび画像化マーカーの評価を通じて決定できる。これらの方法はまた、切除可能な膵臓がんにおける原発腫瘍におけるネオアジュバント化学療法に対する腫瘍応答について、パリカルシトールを伴うまたは伴わないゲムシタビン／アブラキサンの効果を決定し、ＶＤＲに調節された膵星細胞遺伝子発現プログラムに対するパリカルシトールの効果を同定し、このネオアジュバントアプローチの安全性を決定し、パリカルシトール処置患者における内皮細胞機能および酸化ストレスの循環するマーカーを解析するために実施された。
アブラキサン（ｎａｂ−パクリタキセル）は、ヒト血清アルブミンで安定化されたナノ粒子パクリタキセルのクレモフォール非含有製剤である（１３０ｎｍ粒子）。この薬物は、ｇｐ６０アルブミン受容体媒介性内皮トランスサイトーシスを通じて腫瘍浸透の増強を達成し、これは血管内皮の通過を可能にし、活性パクリタキセルを腫瘍に利用可能とする。さらなる薬力学的検討事項は、アルブミン足場がまた、腫瘍関連タンパク質であるＳＰＡＲＣと結合することであり、これは腫瘍組織におけるこの分子の局在化をさらに増強し得る。予備データは、ＳＰＡＲＣ発現腫瘍がアブラキサンに対してより良好な応答を有し得ることを示唆する。ゲムシタビン／アブラキサンのフェーズＩＩ治験において、５８人の評価可能患者のなかで、２３の部分応答があり（４０％）、同数の患者が４ヶ月またはそれ超の安定病態（ｓｔａｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＳＤ）を有し、生存中央値は１０．３ヶ月だった（Ｖｏｎ Ｈｏｆｆら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１１年；２９巻：４５４８〜５４頁）。毒性は一般に十分に耐容性を示したが、ゲムシタビンのみで予期されたよりも大きかった。投薬遅延は主に、血液／骨髄処置に関連するＡＥ（ほとんどの場合好中球）による。処置関連ＡＥによるｎａｂ−パクリタキセル投薬中断はなかったが、ゲムシタビンについて投薬中断が２例あった（皮膚科／皮膚：注射部位反応）。また、２人の患者で、血液／骨髄（好中球および血小板）と関連する、全部で３回の処置関連ＡＥがあり、それにより用量低減をもたらし、２つの処置関連ＡＥは投薬中止をもたらした（消化管：下痢および感染：全身性）。処置中に発生した３つのＡＥがあって死亡した（肺感染、全身感染、および消化管閉塞）が、全身感染のみが処置関連とみなされた。ゲムシタビンと組み合わせてｎａｂ−パクリタキセルで処置された患者は一定レベルの骨髄抑制があり、これはタキサンでの処置後に予期されるものと一致する（Ｖｏｎ Ｈｏｆｆら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１１年；２９巻：４５４８〜５４頁）。
ネオアジュバント設定は、標的化がん療法の重要問題に取り組むために、臨床的結果および発展した組織バイオマーカーを組み合わせる枠組みを提供する。選択された固形腫瘍、他の上皮がんと同様に膵臓がんにおける標的療法により提供される発展にも関わらず、過去１０年の進歩はささやかなものだった。１つの発展は、手術後ではなく手術前の全身療法および放射線療法の適用においてだった。このネオアジュバントアプローチの利点は多く、以下が含まれる。すなわち、通常は全身性（すなわち局所性でない）疾患であるものの、より早期の全身療法；より多くの患者が療法の全用量および期間を受けることを可能にする、手術後設定においてよりも良好な化学療法および化学放射線治療の耐容性；組織平面が手術により破壊されていないときの、より小さな放射線照射野（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄ）；外科的切除を容易にする原発腫瘍の収縮；ならびに、手術により利益を受ける患者の損失がないこと、すなわち潜在的に手術可能な患者を手術不能にするこのフェーズ中の進行がないこと。ネオアジュバント療法は現在、肺、乳房、消化管、頭頸部、泌尿器、および婦人科由来の局所進行がんにおいて広く使用されている。
この治験において、膵臓がんの初期療法における、星状細胞におけるＶＤＲ活性化の効果の解析が実施される。腎臓透析を受けている患者におけるカルシウムおよびビタミンＤ恒常性の管理における１０年にわたるその広範な使用に基づいて、パリカルシトール（２５μｇ）用量が選択された。パリカルシトールは、化学的には１９−ノル−１α，３β，２５−トリヒドロキシ−９，１０−セコエルゴスタ−５（Ｚ），７（Ｅ），２２（Ｅ）−トリエンと表され、高カルシウム血症活性をほとんど有しない非代謝性ビタミンＤ類似体である。かかるものとしてそれは、星状細胞における所望の転写変化を実現する良好な例示的化合物である。パリカルシトールの推奨される開始用量は、０．０４μｇ／ｋｇ（または１回用量あたり約３μｇ）であるが、１５〜３０μｇの１週あたりの総用量が、安全性の懸念なく文献において報告されており（Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏら、ＢＭＣ ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、１３巻：１５９頁、２０１２年；Ｋｅｔｔｅｌｅｒら、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２７巻（８号）：３２７０〜８頁、２０１２年；Ｔｏｎｂｕｌら、Ｒｅｎ Ｆａｉｌ．３４巻（３号）：２９７〜３０３頁、２０１２年）、乳がん患者におけるタキソールと組み合わせた治験は、１日あたり７μｇまでを１２週間与えた（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、１４巻：４７６〜８０頁、２０１３年）。したがって、週３回のＩＶスケジュール（膵臓がん患者における経口吸収に関する懸念を鑑みて）が、１０μｇの均一用量で提供される。６００人超の患者を含む詳細な集団薬物動態解析は、１．７５ｌ／ｈの平均血漿クリアランス、ならびに処置の最初の３０日における安定的なリンおよびカルシウムレベルを示した（Ｎｏｅｒｔｅｒｓｈｅｕｓｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２巻（８号）：１１６２〜７３頁、２０１２年）。この解析は、ここで選択された用量およびスケジュール、ならびに毎週の電解質モニタリングのスケジュールに支持を与える。
この研究において、手術前日までビタミンＤ調製物を継続しつつ、処置前化学療法（１サイクル、４週）単独または静脈内パリカルシトール週３回との組合せが解析される。このアプローチは療法の完了時に評価され、成功は９０％超の患者が手術を受けることにより定義される。主たる目的であるエンドポイントは、腫瘍に対する効果であり、すなわち、検査された以前の腫瘍と比較して、線維症（定性的、免疫組織化学による）、または腫瘍細胞の外観もしくは割合、または浸潤性リンパ球の差の証拠があるかどうかである。パリカルシトール処置腫瘍においてＶＤＲ調節シグネチャーを検出することを目的として、星状細胞は遺伝子発現プロファイリングのために顕微解剖される。星状細胞は、腫瘍断片から培養され、ゲノム的および機能的に解析される。間隔を置いて免疫学的評価および炎症評価を実施できる。
患者は登録時、以前に未処置の、見かけ上切除可能な膵臓の腺癌を有する。がんを有すると考えられ、その手術が必要とされる少数の患者は、腺癌を有しないと判明するかもしれず（これらの患者は、増加全体の目的（ｔｏｔａｌ ａｃｃｒｕａｌ ｇｏａｌ）のために置き換えられるが、可能であれば、本研究のエンドポイントのために原発腫瘍の試料が得られる）、または、切除不能性について以前には認識されていなかった基準を有するかもしれない（これらの患者は、進行の非存在下でゲムシタビン／アブラキサン／パリカルシトールでの処置が継続され、その転帰が記録される）ことが認識される。患者は１８歳またはそれ超であり、０〜２のＥＣＯＧ一般状態を有する。
療法は以下の通り投与される。
いくつかの例において、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）が最初に与えられる。ゲムシタビン（２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩）投与は、３０分にわたる（ラベルにある通り）か、または別の所で推奨される通り、１０ｍｇ／ｍ２／分の速度であってもよい（Ｔｅｍｐｅｒｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２１巻（１８号）：３４０２〜８頁、２００３年）。したがって、用量修正は、後者のアプローチが使用された場合に、注入時間の変化をもたらし得る。このサイクルは、４週ごとに２サイクル反復される（すなわち、全部で８週の手術前療法である）。（スケジュールが許せば）化学療法の最終投薬の４週間以内に手術は行われる。手術後のアジュバント化学療法は、処置する医師の裁量である。患者は、化学療法に関連する悪心および嘔吐の発生および重症度を減少させるため、化学療法の投与前に、デキサメタゾン１０〜２０ｍｇ ＩＶおよび選択された５−ＨＴ３剤（すなわち、オンダンセトロンまたはグラニセトロン）を通常は含む、適切な制吐レジメンを受ける。臨床的に指示される場合、薬物、例えばロラゼパムもまた使用できる。
患者は、１０μｇで週３回の静脈内パリカルシトールでの処置を開始する。用量漸増はないと考えられるが、５０％の用量減少を要するであろうカルシウムまたはリンの増加を検出するため、毒性を毎週モニタリングできる（カルシウムについて＞１１．５、正常に戻るまで療法を停止する）。
用量制限毒性（Ｄｏｓｅ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ）は、本研究の最初の４週中に生じる毒性により定義される。ＤＬＴは、最適な制吐療法で処置されなかった悪心および嘔吐を除いて、処置関連である可能性が高いと研究者により判断されるグレード３またはそれ超の任意の非血液学的ＡＥとみなされる。以下の血液毒性は、いずれも第１のサイクルで生じる場合にはＤＬＴとみなされる。
１）７日を超えて持続するグレード４の好中球減少症、
２）発熱性好中球減少症、
３）１０，０００／ｍｍ３未満の血小板数。
レジメンの耐容性は、患者５人ごとに本治験の研究者と協議した後、毒性の解析により決定される。
患者は、手術前日まで化学療法の２サイクルを通じてゲムシタビン／アブラキサン／パリカルシトールを継続する。手術後の処置は、処置する医師の裁量である。
腫瘍は、手術時に病理部門において切除され、診断の検証後に腫瘍塊の一部が様々な研究室に割り当てられる。試料は、星状細胞単離の詳細な免疫組織化学的染色のため、ならびにＣＧＨおよび配列決定のために割り当てられる。
化学療法の各サイクルの開始２週間以内に得られる慣例的な試験のための全ての研究室測定が許容可能である。
腫瘍サイズおよび療法効果の従来のマーカーに対する効果全体を決定するため、ネオアジュバント化学療法の１サイクル後の画像化により患者を評価できる。腹部／骨盤および胸部（胸部疾患がある場合）のＣＴまたはＭＲＩを、手術後最初の年は６ヶ月間隔、その後は１年間隔で得る。
ＮＣＩのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）上で利用可能なＮＣＩ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａを使用して、毒性をグレード付ける。ゲムシタビン／アブラキサンの組合せについて報告される主な毒性は、好中球減少症、悪心／嘔吐、肝臓酵素の可逆的増加、およびニューロパチーである。ビタミンＤ調製物について報告される主な毒性は、高カルシウム血症であり、これは毎サイクル試験される。
第２および以降の過程の処置の日における研究上の異常は、処置決定において検討される。研究の適格基準から逸脱する値は、回復が生じる３週までの遅延を引き起こし得る。そのときまでに異常が解消しなかった場合、患者は通常は研究から外されるべきである。例外があってもよい。
以下の表に特定されるように、用量修正は経験された最悪のグレードの毒性に基づくべきである。任意の用量低減が次の全てのサイクルで継続され、したがって、用量低減後の用量の再漸増は認められない。毒性のためゲムシタビンおよびアブラキサンの両方の中止を要する患者は、プロトコール療法を中止し、手術がスケジューリングされる。
ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセル
用量除外および修正スケジュールに関する規則
１日目の投薬がない：停止されたまたはなかった投薬が次のサイクルの１日目に与えられる場合、次のサイクルは、第１の用量が実際に患者に投与される日まで開始するとはみなされない（すなわち、１−２−３−休み、Ｘ−１−２−３−休み、等）。
８日目の投薬がない：プロトコールに従ってサイクルは継続し、１回用量が与えられない（すなわち、１−２−３−休み、１−Ｘ−３−休み、１−２−３−休み、等）。カウントおよび化学作用が許す場合には、１５日目はサイクルカレンダーに従い投与される。
１５日目の投薬がない：その週は休みの週となる。次の投薬（カウントおよび化学作用が許す場合）は、新しいサイクルの１日目となり、患者はｘ２ｑ３（２１日）サイクルを経たものとみなされる（すなわち、１−２−３−休み、１−２−Ｘ、１−２−３−休み、等）。
血液毒性および他の非血液毒性のために用量を低減する。用量調整は、最大の毒性度を示す系に従いなされる。ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０を使用して、毒性をグレード付ける。
スケジューリングされたｎａｂ−パクリタキセルおよびゲムシタビン投薬の遅延を≧１４日間要する研究薬物関連毒性を経験する患者は、さらなる本研究への参加が中止される。用量低減が任意のサイクルの１日目に必要とされるとき、研究処置の期間中に用量再漸増は許されない。
１日目の用量修正
ＡＥまたは血液毒性によりサイクルの最初に用量修正が必要な場合、ｎａｂ−パクリタキセルおよび／またはゲムシタビンの用量およびスケジュールは、下の表６および表７に詳述する通り調整できる。
化学療法関連毒性を解消するための投薬遅延の場合、ＨＣＱ投薬はスケジューリングされた通り継続すべきである。
処置サイクル内での用量調整
毒性により処置サイクル内で患者が処置を遅延させなければならない場合、サイクル中に停止された用量は補完されない。処置サイクル内での血液毒性（下の血球数および毒性により表される）による用量修正は、表８に概括される通り調整されるべきである。
非好中球減少性敗血症の有意なリスクゆえに、摂氏＞３８．５度の発熱の最初の発症時、好中球数に関わらず、シプロフロキサシン（５００ｍｇを経口で１日２回）またはアモキシシリン／クラブリネート（オーグメンチン、５００ｍｇを経口で１日２回または３回）のいずれかを設けるべきである。研究処置の開始時、患者は何らかの抗生物質の処方を提供され、３８．５℃もしくはそれ超の発熱の最初の観察時か、または発熱していると感じて体温計を利用できない場合に、処置を開始するよう指示されるべきである。彼らは、血球数評価についての明確な計画、および感染についての臨床的評価、および／または入院の必要性に従うべきである。
発熱患者は、回復（１００Ｆ未満の体温が＞３日間）まで処置を中断され、この障害の標準的実施に従い管理される。医師の裁量でＨＣＱ投薬は継続できる。この状態の解消時、アブラキサンおよびゲムシタビン療法を次の最も低い用量で再開できる。用量修正はまた、サイクル内で表９に特定される通り非血液毒性についてなされてもよい。
ｎａｂ−パクリタキセル処置は、≧グレード３末梢性ニューロパチーを経験する患者において差し控えることができる。この期間中、研究者の裁量でゲムシタビン投与は継続できる。ｎａｂ−パクリタキセル処置は、末梢性ニューロパチーが≦グレード１に改善した後に、後続のサイクルにおいて次のより低い用量レベルで再開できる。末梢性ニューロパチーを経験する患者は、スケジューリングされたｎａｂ−パクリタキセル投薬における長期の遅延を要し得るが、ゲムシタビン／ＨＣＱについて残ることができ、上の通りニューロパチーが改善した場合、後続のサイクルで‘ｎａｂ−パクリタキセルが再導入されるはずである。低減された用量のｎａｂ−パクリタキセルを受ける患者が、その用量レベルで≧グレード３末梢性ニューロパチーを経験し、≧２１日間の投薬遅延を要して≦グレード１に解消することがない場合、‘ｎａｂ−パクリタキセルを中止すべきである。
他の臨床試験において観察される通り、ｎａｂ−パクリタキセルと関連する≧グレード３ニューロパチーは、処置の後の方のフェーズ（サイクル６およびその後）で通常は観察される。≧グレード３ニューロパチーが初期の処置サイクルにおいて生じる場合、患者のニューロパチーの素因となる他の因子が存在しているかもしれない（例えば、糖尿病、アルコール消費、併用薬）。最初の６つの処置サイクル中の用量強度を維持するため、これらの素因が存在するときには注意深く検討すべきである。
グレード２または３皮膚毒性を発症する患者は、その用量を、両方の薬物の次のより低い用量レベルに減少させるべきである。患者がこれらの反応を経験し続ける場合、処置を中止すべきである。グレード４皮膚毒性を発症する患者は、処置を中止すべきである。
グレード３粘膜炎または下痢が生じる場合、≦グレード１に解消するまで研究薬物を差し控え、その後、両方の薬物の次のより低い用量レベルで再び行うべきである。グレード４粘膜炎または下痢を発症する患者は、処置を中止すべきである。
好中球数を支持するための増殖因子の使用は、さもなければ好中球減少症によりアブラキサン用量を１００ｍｇ／ｍ２未満まで低減する必要がある場合、サイクル１後に許容可能である。ＧＣＳＦもまた、上述の発熱性好中球減少症の場合に、機関の実施に従い治療的投与のために検討されてもよい。
したがって、いくつかの例において、パリカルシトールは５または１０μｇで週３回、手術前２〜３週間ＩＶ投与される。ゲムシタビン／アブラキサンの１サイクルが手術前に与えられ、１〜２週またはそれより長い間隔をカウント回復を可能にするために使用できる。計画された手術の前、およそ２８日間にわたり、パリカルシトールを与えることができ、手術前日まで継続できる。なぜなら、この微量栄養素には関係する毒性がないからである。最終投薬は、手術２４時間前であり得る（手術が延期された場合、手術前日に至るまで、療法の追加の日数を与えることができる）。手術後には、手術後およそ４〜８週に始まり、患者をゲムシタビン／アブラキサン．パリカルシトールで、全部で３〜５サイクル処置できる。
患者をカルシウム非上昇性ビタミンＤ類似体（パリカルシトール）で２８日間、手術前に与えられるゲムシタビン／アブラキサンの１サイクルとともに、カウント回復を可能にするために１〜２週またはそれより長い間隔で処置した。手術前に有害な臨床的効果は示されなかった（カルシウムレベルの上昇なし）。とりわけ、膵臓腫瘍のためのマーカーとして一般に使用される患者の血清ＣＡ１９−９レベルは、１２０Ｕ／ｍＬから４０Ｕ／ｍＬに減少した（正常な非がん患者レベルの範囲は、０〜３７Ｕ／ｍＬである）。外科的再切開は、腫瘍が正常よりも軽いことを明らかにした。続く組織学的解析は、わずかながん細胞を伴う肉芽腫を明らかにした。マクロファージとして知られている免疫細胞の集合である肉芽腫の存在は、ゲムシタビン／アブラキサンの細胞毒性の有効性を増加させるのに加えて、この治療アプローチがまた、多くの場合膵臓がんにおいてブロッキングされる免疫応答を達成したことを示す。これらの結果は、膵臓がんを処置するための新規で効果的な治療経路を記述する。
本開示の原理を適用できる多くの可能な実施形態を鑑みると、例示された実施形態は本開示の例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではないことが認められるべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲により定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および趣旨内に収まる全てを、自らの発明として主張する。

Claims (23)

  1. Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）の生物学的活性を低減する方法であって、ＣＸＣＬ１２を発現する星状細胞を、治療有効量の１つまたは複数のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニストと接触させ、それによりＣＸＣＬ１２の前記生物学的活性を低減するステップを含む、方法。
  2. ＣＸＣＬ１２の前記生物学的活性が、ＣＸＣＬ１２核酸発現、ＣＸＣＬ１２タンパク質発現、前記星状細胞によるＣＸＣＬ１２タンパク質分泌、ＣＸＣＬ１２タンパク質安定性、腫瘍細胞に対するＣＸＣＬ１２結合、腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ４シグナル伝達経路の活性化、および腫瘍細胞に対するＴ細胞結合のＣＸＣＬ１２による防止の１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法がｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であり、前記星状細胞を治療有効量の前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと接触させるステップが、前記ＣＸＣＬ１２を発現する培養物中の星状細胞を前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと接触させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記方法がｉｎ ｖｉｖｏの方法であり、前記星状細胞を治療有効量の前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストと接触させるステップが、前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを被験体に投与するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記方法が、前記被験体における腫瘍を処置する方法であり、そして前記方法が、治療有効量の１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤を前記被験体に投与するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記腫瘍が膵管腺癌であり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤が、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、およびタンパク質が結合したパクリタキセルの１つもしくは複数を含み、
    前記腫瘍が肺がんであり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤が、メトトレキセート、ゲムシタビン、パクリタキセル、シスプラチン、アザシチジン、エンチノスタットの１つもしくは複数を含み、
    前記腫瘍が腎細胞癌であり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤もしくは生物学的薬剤が、エベロリムス、アルデスロイキン、エバシズマブ（ｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アキシチニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブトシル酸塩、パゾパニブ塩酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、およびテムシロリムスの１つもしくは複数を含み、
    前記腫瘍が前立腺がんであり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤もしくは生物学的薬剤が、アビラテロン酢酸塩、ビカルタミド、カバジタキセル、デガレリクス、デノスマブ、エオセタキセル（ｅｏｃｅｔａｘｅｌ）、エンザルタミド、ゴセレリン酢酸塩、ロイプロリド酢酸塩、プレドニゾン、二塩化ラジウム２２３、シプロイセル−Ｔ、およびドセタキセルの１つもしくは複数を含み、
    前記腫瘍が胆管のがんであり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤もしくは生物学的薬剤が、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、ゲムシタビン、ゲムシタビン プラス シスプラチン、イリノテカン、カペシタビン、およびエルロチニブの１つもしくは複数を含み、または
    前記腫瘍が肝細胞癌であり、前記１つもしくは複数の化学療法薬剤が、ソラフェニブ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、シスプラチン、インターフェロン、ドキソルビシン、およびフルオロウラシルの１つもしくは複数を含む、
    請求項５に記載の方法。
  7. 前記腫瘍が膵管腺癌であり、前記１つまたは複数の化学療法薬剤が、（ａ）ゲムシタビン、（ｂ）ゲムシタビンおよびエルロチニブ、または（ｃ）ゲムシタビンおよびタンパク質が結合したパクリタキセルを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 膵管腺癌を有する哺乳動物被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与するステップと、
    前記哺乳動物被験体に、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エルロチニブ、タンパク質が結合したパクリタキセル、またはこれらの組合せからなる群より選択される治療有効量の化学療法を投与し、それにより前記被験体における前記膵管腺癌を処置するステップと
    を含む、膵管腺癌を処置する方法。
  9. 前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストがカルシポトリオールまたはパリカルシトールであり、
    前記化学療法が、（ａ）ゲムシタビン、（ｂ）ゲムシタビンおよびエルロチニブ、または（ｃ）ゲムシタビンおよびタンパク質が結合したパクリタキセルを含む、
    請求項８に記載の方法。
  10. 前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストが、前記１つまたは複数の化学療法薬剤または生物学的薬剤の前に、または併行して投与される、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
  11. 前記方法が、膵炎を処置または防止する方法であり、前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストが投与される被験体は、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）アゴニストを受けている、請求項４に記載の方法。
  12. 膵炎を処置または防止する方法であって、前記方法は、哺乳動物被験体に、治療有効量の１つまたは複数のＶＤＲアゴニストを投与し、それにより前記被験体における膵炎を処置または防止するステップを含み、ここで前記被験体はグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）アゴニストを受けている、方法。
  13. 前記被験体が２型糖尿病を有する、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記被験体が、２型糖尿病を処置するためにＧＬＰ−１アゴニストを受けている、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記ＧＬＰ−１アゴニストが、エキセナチド、タスポグルチド、インスリングラルギン、ピオグリタゾン、アルビグルチド、リキシセナチド、サキサグリプチン、リラグルチド、リナグリプチン、アログリプチン、シタグリプチン、またはメトホルミン／シタグリプチンである、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記ＶＤＲアゴニストが、ビタミンＤ、ビタミンＤ前駆物質、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ受容体リガンド、ビタミンＤ受容体アゴニスト前駆物質、またはこれらの組合せである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記ビタミンＤ前駆物質が２５−ヒドロキシ−Ｄ３（２５−ＯＨ−Ｄ３）（カルシジオール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、またはこれらの組合せである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ビタミンＤ受容体リガンドが１，α２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記ＶＤＲアゴニストが合成ＶＤＲアゴニストである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  20. 前記合成ＶＤＲアゴニストが、ＫＨ１０６０（レキサカルシトール）、ＢＸＬ−６２８（エロカルシトール）、ＭＣ１２８８、ＣＢ９６６、Ｂ＼ＣＢ １０９３、ＧＳ １５５８、ＴＸ５２７、ＥＤ−７１（エルデカルシトロール）、ＢＸＬ−０１−００２９、ドキセルカルシフェロール、ＥＢ１０８９、パリカルシトール、およびカルシポトリオールの１つまたは複数である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストの投与が、前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストの、経口、腹腔内、または静脈内投与を含む、請求項４〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 前記１つまたは複数のＶＤＲアゴニストが、カルシポトリオールまたはパリカルシトールである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記被験体がヒト被験体である、請求項４〜２２のいずれかに記載の方法。
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