JP2016527481A - 改善された治療リガンドの取得 - Google Patents

Abstract

高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別するステップを含む方法及び関連する装置であり、生物学的高分子のデータベースから抽出された、非結合性の分子内又は分子間の原子と原子との接触に関する情報を利用して、特定の原子種について結合部位に隣接した好ましい領域を識別するステップと、候補リガンドを修飾して、候補リガンドの原子と好ましい領域との間の交差を増加させるステップとを含む。本方法の１つ又は複数のステップは、コンピューターにより実施可能である。

Description

本発明は、特に、標的タンパク質上の結合部位におけるリガンドの結合を改善するために既存又は候補のリガンドをどのように修飾することができるかを決定することにより、又は治療薬の前駆体としての候補リガンドの新規設計を支援することにより、改善された治療リガンドを取得することに関する。

治療分子（リガンド）は、次の２つの異なるクラス：化学的実体（又は新規の化学的実体、ＮＣＥ：ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）及び生物学的製剤に分類される。前者は、化学的に合成された又は天然物から単離された、一般的に分子量５００ダルトン以下の低分子量有機化合物である。これらは一般的に、出発化学物質から誘導されるか、又は化学物質ライブラリー又は天然物ライブラリーをスクリーニングすることにより発見された「ヒット」である。かかるヒットが有する結合親和力は、標的に対して一般的に最適とは言えず、標的に対してより良好な親和力（一般的にマイクロモル以下の低い親和定数（Ｋ_Ｄ）を有する）を得るために、化学修飾についてかなりの試行錯誤を必要とする。ヒットは、後続する化学修飾物が５００ダルトンの限界値を上回ることがないように、低い分子量、例えば３００ダルトン以下を有するのが好ましい。このようなヒットは、多くの場合「フラグメント」と呼ばれる。候補治療薬分子又はリード分子が得られるようにヒットを最適化する場合、それは構造的な情報により；例えばヒット分子又はフラグメントと共複合体の状態にあるタンパク質についてＸ線結晶構造を得ることにより大幅に強化される。かかるデータは、標的タンパク質上で小分子がどこに結合するのかについて見識をもたらし、また重要なこととして両者間の原子相互作用がどのように結合に関与しているのかを示唆する。更に、結合したヒットの直近を取り巻くタンパク質表面の局所的な性質が明らかにされ、特にそれが裂溝又はポケットの場合には、その構造は、ポケット内の空間とより適切に嵌合するにはどのようにヒットを作り込めばよいか、及びどのようにタンパク質と更に相互作用させれば結合親和力及び特異性が改善されるかについて示唆する。

ヒットを化学的に作り込むために合理的な選択を行う際に、いくつかのコンピューターに基づくアルゴリズムが、医薬品化学者を支援するのに利用可能である。このアルゴリズムは、小分子とタンパク質との間の結合自由エネルギーについて、第一原理から計算を試みる物理学的方法（例えば、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア一式）、又はタンパク質−小分子構造のコレクションから抽出された原子相互作用のデータベースに立脚する統計ポテンシャル法（例えば、ＳｕｐｅｒＳｔａｒ）のいずれかである。

生物学的製剤は、大型のペプチド又はタンパク質分子（１０００ダルトンを上回る分子量）である。これは、多くの場合、標的分子を認識しこれと結合する抗体又は抗体様分子であり、通常、ＮＣＥと比較してそれよりも良好な親和性及び特異性を有する（Ｋ_Ｄはナノモル以下と低い）。また、これは、その他の種類のタンパク質分子、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、又は可溶性の受容体等の場合もある。

結合部位に対する候補生物学的治療分子の結合は、候補治療分子を突然変異させることにより修飾可能である。この場合、結合親和力を改善する、又は結合特異性を変更する必要があり得る。しかし、突然変異を実施し、また突然変異した分子の結合効率を試験するのに比較的時間がかかる。結合効率に改善が認められるまで、多くの異なる突然変異が必要とされ得る。

どのような種類の修飾が最も有効であり得るか予測するのに、コンピューターを使用することが公知である。しかし、所与の分子について修飾可能な方法は非常に多く、また実用的な期間内に、予測が確実に実現できるようにコンピューターを構成するのは困難である。

Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ Ｒ Ａ、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｍ、Ｈｕｍｂｌｅｔ Ｃ及びＳｉｎｇｈ Ｊ（１９９６年）「Ｘ−ＳＩＴＥ：タンパク質の結合部位における好ましい相互作用領域の識別を目的とした、実験的に導出された原子パッキング選好性の利用（Ｘ−ＳＩＴＥ：ｕｓｅ ｏｆ ｅｍｐｉｒｉｃａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｔｏｍｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２５９巻、１７５〜２０１頁は、タンパク質表面、例えば二量体界面、又は分子認識部位又は結合部位等において、原子種別に好ましい相互作用領域を識別するための、コンピューターに基づく方法を開示する。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらの予測は、高分解能タンパク質構造に認められた非結合性分子内接触に関する実験データからなるデータベースに基づく。

Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらのアプローチでは、２０種のアミノ酸が分解されて、合計４８８種の考え得る３原子フラグメントが得られる。これらは、化学的類似性を考慮すれば、データベースをさらに分割して一連の１６３種のフラグメントにまで低減される。各フラグメントは、第１の原子（「３位」と呼ぶ）を含有し、更なる２つの原子が三角測量（又は空間的正規化）位置を定義する。３原子フラグメントの第１の原子と非結合性の分子内接触状態にあることが判明した原子（「第２の原子」と呼ぶ場合もある）の様々な位置を記録することにより、密度関数が導かれる。

所与の原子種に関する予測された好ましい相互作用領域は、Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらの方法では、密度関数を結合部位に移植することにより得られる。各密度関数は、密度関数に対応する３原子フラグメントの３原子の座標が、結合部位内の対応する３原子フラグメントの座標と重なるように移植される。結合部位内の異なる３原子フラグメントに由来する密度関数が重なる場合、平均「密度」が、好ましい相互作用領域を予測するのに用いられる。

Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらのアプローチは、比較的複雑であり、有用となり得るデータも廃棄する。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらの密度関数は、フラグメントの種類毎に、第２の原子の接触位置に３Ｄグリッドを当てはめることにより取得される。異なるグリッドが、１６３種のフラグメント毎に用いられる。第２の原子種それぞれに関するデータは、次に数学的に変換されて、密度関数が得られる。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらのフラグメントの定義を用いて、フラグメントの種類は、同一残基上の異なる原子により、また異なる残基上の原子により共有され得る。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらのデータベースが、これらのフラグメントの種類について構築されたとき、密度関数を結合部位内に移植する段階において、重み付けを下げる必要のある余分な主鎖フラグメントが多量に存在する。更に、ある種のフラグメントは、結合長さ及び角度に微妙な差異を有するいくつかの実際のフラグメントを含む可能性があり、そのような区分内で統合されたときに隠蔽されてしまう付随性の差異を第２の原子の分布内に含み得る。

タンパク質内の狭域二次構造は、実験データを導くのにＬａｓｋｏｗｓｋｉらで用いられたが、これは、偏りをもたらすおそれがあり、また実験データが好ましい相互作用領域を示す有効性を減じる。

上記で議論した当技術分野が有する問題の少なくとも１つに対処することが、本発明の目的である。

本発明の態様によれば、高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法であって、
ａ）前記標的の結合部位の表面を形成する原子の標的リストを識別するステップと、
ｂ）前記標的リスト中の各原子を、特定のシータ原子種として識別するステップであって、前記原子は以後シータ原子と呼ばれる上記ステップと、
ｃ）生物学的高分子の構造データベースから、非結合性の分子内又は分子間の原子と原子との接触に関する情報を抽出するステップであって、接触している原子の組のうちの第１の原子が、特定のシータ原子種に属し、前記組のうち対向する第２の原子が、以後イオタ原子と呼ばれる特定のイオタ原子種に属し、前記情報が、前記シータ原子に対する前記イオタ原子の相対的な空間的データ及び／又は文脈データを含み、前記データベースに由来する所与のシータ原子種の複数の接触について収集された前記データは、以後シータ接触セットと呼ばれる上記ステップと、
ｄ）ステップｂ）の標的リストで識別されたシータ原子毎に、ステップｃ）で抽出された対応するシータ接触セットからの所与のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関係するデータを、前記標的の結合部位内又はその周辺に重ね合わせるステップと、
ｅ）前記所与のイオタ原子種又は前記事前に決定された関連するイオタ原子種の群が強い理論傾向を有する結合部位の１つ又は複数の好ましい領域が予測されるように、重ね合わせたデータを統合及び／又はパーシングするステップと、
ｆ）前記候補リガンドを前記結合部位内に概念的に嵌め込んで、前記候補リガンドの１つ又は複数の原子の種類及び位置を前記イオタ原子種毎に予測された好ましい領域と比較することにより、代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域の間で、より多くの交差を生成するような前記候補リガンドに対する修飾を、前記代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子に関して識別するステップであって、これにより非修飾候補リガンドと比較して、修飾された前記候補リガンドの前記結合部位に対する親和力の改善をもたらす上記ステップと
を含み、
前記データベース中の各非結合性の分子内又は分子間接触が、タンパク質フォールドの対向する残基の間、又は高分子フォールドの対向するモノマーユニットの間、又は２つの相互作用する高分子パートナーの間の接触として定義され、具体的には前記フォールドの一方の側にあるシータ原子又は第１の相互作用するパートナーと、反対側のイオタ原子又は第２の相互作用するパートナーとの間に位置し、ここで下記の条件：
ｓ−Ｒｗ≦ｔ（式中ｓは前記接触の２原子間の間隔であり、Ｒｗは前記接触の２原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離である）
が満たされる事例において、
前記シータ原子種が、所与のシータ原子をイオタ原子として含む接触に関するデータを除いて、所与のシータ原子種についてステップｃ）で抽出されたシータ接触セットのデータと、任意のその他のシータ原子種についてステップｃ）で抽出された任意のその他のシータ接触セットのデータとの間で交差が存在しないように、ステップｂ）で一義的に識別される、上記方法が提供される。

したがって、結合部位内の各標的原子種は一義的に分類され、また一義的な構造データベースから抽出される一連の接触に関する情報であって、任意のその他の原子種と関連した一連の接触とは重複しない情報と関連する（標的原子種それ自体がイオタ原子として含まれる接触を除く）。これは、所与のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群について、結合部位内の１つの標的原子に基づき求められた理論的場所の分布は、例えばイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群について１つ又は複数の好ましい領域の予測が改善するように、イオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群について、結合部位内の別の標的原子に基づき求められた理論的場所の分布とより効果的に（例えば、重み付けすることなしに）統合され得る（例えば、合算により）ことを意味する。また、結合部位内の各標的原子は、一義的に分類されるので、検討すべき結合長さ又は角度に変化はなく、したがって所与のイオタ原子の理論的場所はより正確である。

一実施形態では、単純な規則が、三角測量を目的として、隣接原子を一義的に識別するのに適用される。隣接原子の化学的性質について仮説は不要であり、それは、例えば接触の種類がＬａｓｋｏｗｓｋｉらの１６３種の３原子フラグメントに関して特徴づけられる場合に必要となる。

一実施形態では、ステップｃ）で抽出された空間的データは、シータ原子の位置及び第３と第４の原子の位置を幾何学的に参照することにより、シータ接触セット中で特定されたイオタ原子それぞれの位置を定義するが、但し第３の原子は、シータ原子と共有結合しており、また第４の原子は、第３の原子と共有結合している。かかる実施形態の例では、シータ接触セットで特定されたイオタ原子毎に、ステップｃ）で抽出された前記空間的データは、シータ原子の位置及び第３と第４の原子の位置を幾何学的に参照することにより、５番目及び６番目の原子の位置を更に定義するが、但し５番目の原子はイオタ原子と共有結合しており、また６番目の原子は５番目の原子又はイオタ原子のいずれかと共有結合している。

一実施形態では、ステップ（ｄ）の標的の部位内又はその周辺に重ね合わせる場合、下記：所与のイオタ原子種、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群を含む接触について空間的データを抽出するために、シータ接触セットをパーシングするステップと、ｉ）接触のシータ原子が、標的の結合部位内の対応するシータ原子の位置に存在する場合、及びｉｉ）接触の第３及び第４の原子が、標的の結合部位内の対応するシータ原子の第３及び第４の原子の位置に存在する場合、イオタ原子種それぞれ、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群それぞれがどこに位置するかを表す理論的場所を決定するために、この空間的データをプロッティングするステップとを含む。一実施形態では、プロッティングするステップの前に、空間的データは文脈データに対比してパーシングされる。

一実施形態では、イオタ原子種（又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群）に関する理論的場所の密度が、事前に決定された閾値を上回る領域が、好ましい領域の１つとして識別される。かかる実施形態の例では、所与のイオタ原子種、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関する理論的場所が、標的リスト上の複数のシータ原子について決定され、また累積的な理論的場所の密度が事前に決定された閾値を上回る領域が、好ましい領域の１つとして識別される。

したがって、理論的場所の密度が好ましい領域を予測する目的で得られる前に、理論的場所は結合部位内の異なる原子から重畳的に統合される。これは、結合部位内の関連する原子種すべてに由来する寄付を、比例的で偏りのない方法で考慮しているので、所与の場所に配置される所与のイオタ原子種の、又は所与の関連するイオタ原子種の群における確率について、より正確な統計的表示を実現する。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉらの場合、対照的に、密度関数は３原子フラグメントの群について導かれる。各原子は、３原子フラグメントからなる異なるいくつかの群と関連する可能性があり、したがって本発明の実施形態に匹敵するように密度関数を単純に一まとめにするのは不可能である。むしろ、密度関数を統合する前に、重み付け及び／又は平均化を実施する必要があり、それは複雑性を増加させる、及び／又は正確性を低減する。

一実施形態では、４残基以上互いに分離した原子間の接触のみが、好ましい領域を識別するのに用いられる。これにより、狭域二次構造に起因する偏りが大幅に低減する又は回避される。一実施形態では、接触データは、主として広域のフォールドにまたがるタンパク質データを表す。

本発明の更なる態様によれば、高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法において用いるために、データベースを作成する方法が提供され、同方法は、
タンパク質又は高分子の、シータ原子と呼ばれる第１の原子と、イオタ原子と呼ばれる第２の原子との間で非結合性の分子内接触が生ずる事例を識別するために、複数のタンパク質又はその他の生物学的高分子それぞれに存在する原子の相対的な位置を分析するステップと、
識別された接触毎に、シータ原子の種類、イオタ原子の種類、及びシータ原子に対するイオタ原子の相対的位置を特定するデータベースを作成するステップと
を含み、
非結合性の分子内接触が、下記の条件：
ｓ−Ｒｗ≦ｔ、式中ｓはシータ原子とイオタ原子との間の間隔であり、Ｒｗはシータ原子とイオタ原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離で、一般的に２．５オングストローム、好ましくは０．８オングストロームであること；並びに
タンパク質の場合、シータ原子及びイオタ原子は、直鎖状のポリペプチド上の互いに少なくとも４残基離れたアミノ酸残基上にあるか、又は別のポリペプチド鎖上にあること
を満たすものとして定義される。

本発明の更なる態様によれば、高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法において用いるために、データベースを作成する方法であって、
タンパク質又は高分子の、シータ原子と呼ばれる第１の原子とイオタ原子と呼ばれる第２の原子との間で非結合性の分子内接触が生ずる事例を識別するために、複数のタンパク質又はその他の生物学的高分子それぞれに存在する原子の相対的な位置を分析するステップと、
識別された接触毎に、シータ原子の種類、イオタ原子の種類、及びシータ原子に対するイオタ原子の相対的位置を特定するデータベースを作成するステップと
を含み、
非結合性の分子内接触が、下記の条件：
ｓ−Ｒｗ≦ｔ、式中ｓはシータ原子とイオタ原子との間の間隔であり、Ｒｗはシータ原子とイオタ原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離で、一般的に２．５オングストローム、好ましくは０．８オングストロームであること
を満たす事例として定義され、
前記方法が、データベースを細分化して識別された接触の群を形成するステップであって、その識別された接触の群において、シータ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子のうち一つのみであり、イオタ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を化学的類似性に基づき群に分類することにより取得された複数の非重複群のうち一つのみの群に含まれる上記ステップを含む、上記方法が提供される。

本発明の実施形態を事例目的に限定して、対応する参照記号が対応する部分を表す添付図面を参照しながらここで記載する。

座標の正規化で用いられる、非結合性の分子内又は分子間接触における原子及び隣接原子に関する命名法の例を示す概略図である。 非結合性の分子内又は分子間接触における原子の座標正規化プロセスについて説明する図である。 非結合性の分子内又は分子間接触における原子の座標正規化プロセスについて説明する図である。 非結合性の分子内又は分子間接触における原子の座標正規化プロセスについて説明する図である。 非結合性の分子内又は分子間接触における原子の座標正規化プロセスについて説明する図である。 非結合性の分子内又は分子間接触における原子の座標正規化プロセスについて説明する図である。 高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法におけるステップを示すフロー図である。 軽鎖トレオニン３０のアルギニン３０への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖アルギニン５４のセリン５４への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖セリン５６のイソロイシン５６への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖セリン６０のアスパラギン酸６０への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖トレオニン７２のアルギニン７２への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 抗体４９６ｉの軽鎖において、５つの突然変異を組み合わせ、その結果ＩＬ１７Ｆに対して親和力が１８０倍改善したことを表すコンピューターによって作成された可視化図である。 ＦａｂのＶＨ−ＶＬ界面における点突然変異の効果を予測する方法におけるステップを示すフロー図である。 重鎖トレオニン７１のアルギニン７１への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖セリン１０７のグルタミン酸１０７への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 軽鎖トレオニン１０９のイソロイシン１０９への突然変異を表すコンピューターによって作成された可視化図である。 Ｆａｂ Ｘにおいて３つの突然変異を組み合わせ、その結果８１．２℃のＴｍを実現したことを表すコンピューターによって作成された可視化図である。

国際蛋白質構造データバンク（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ：ｗｗＰＤＢ）は、国際社会で自由且つ公的に利用可能な高分子構造データの記録を維持する。２０１３年５月までに、このデータセットは構造件数９００００件の大台に到達した。これらの高分子のほとんどがタンパク質であり、その大部分はＸ線結晶構造解析により求められた。累積されたデータは、したがって個々のタンパク質構造を構成する個別の原子について、デカルト座標の形態で、原子レベルの３次元データを含有する。

本発明者らは、新規治療薬の設計を支援するのに適用可能な有用な情報を、この記録から抽出することができると推論した。新生タンパク質のポリペプチド鎖は、極めて再現性のある方式で複雑な３次元の３次及び４次構造に折り畳まれて成熟タンパク質となる。タンパク質の二次構造、例えばへリックス、ベータシート、及びターン等の要素の形成に影響を及ぼす相互作用は公知である。しかし、より高次のタンパク質フォールディングを予測する規則は十分に理解されていない。それにもかかわらず、本発明者らは、例えばタンパク質フォールドの対向する面上の同一分子内、又は異なる分子上で、非結合性ではあるが「接触性」の原子の相互作用を支配する精密な規則が存在するに違いないと認識した。

一実施形態では、生物学的高分子の構造データベース（例えば、ｗｗＰＤＢ）が、かかる規則を抽出するために分析され、そして当該規則は、創薬の促進に応用される。かかるプロセスの例を以下に記載する．

一実施形態では、接触原子の非結合性の組（それぞれ「シータ」及び「イオタ」原子と呼ぶ）が、高分子（例えば、タンパク質）、又は全高分子よりも少数のサブセット毎に、高分子の構造データベース（例えば、ｗｗＰＤＢ）内で識別される。かかる接触は、例えばタンパク質フォールドの対向する残基の間、又は高分子フォールドの対向するモノマーユニットの間（高分子構造の分離した鎖の間）、又は２つの相互作用性の高分子パートナーの間で生ずる可能性がある。各接触は、フォールドの１方の側又は第１の相互作用性パートナー上のシータ原子と反対側又は第２の相互作用性パートナー上のイオタ原子との間に存在するものとして分類される。

一実施形態では、非結合性の分子内又は分子間接触は、下記の条件：１）ｓ−Ｒｗ≦ｔ（式中ｓは接触の２原子間の間隔であり、Ｒｗは接触の２原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離である）を満たすものとして定義され；また、任意選択的に、下記の条件：２）接触の２原子が直鎖状のポリペプチド鎖に沿って互いに少なくとも４残基離れているか、又は別のポリペプチド鎖上にあることも挙げられる。一実施形態では、事前に決定された距離は、２．５オングストロームである。別の実施形態では、事前に決定された距離は、１．５オングストロームである。別の実施形態では、事前に決定された距離は、１．０オングストロームである。別の実施形態では、事前に決定された距離は、０．８オングストロームである。

下記の説明では、「接触」と記載する場合、いずれも上記定義によれば「非結合性の分子内接触又は分子間接触」を意味するものと理解される。

ｗｗＰＤＢ等のデータベースは、互いに非常に類似する、及び／又は関連した構造を有するタンパク質に関する情報を有し得る。一実施形態では、データベースは、かかる類似性／関連性により引き起こされる偏りを回避する／低減するためにパーシングされる。一実施形態では、パーシングは、一次配列の相同性に基づき、例えば類似する／関連するタンパク質の各ファミリーの代表的構造について１例のみが解析用に選択されるように実施される。追加的又は代替的に、１つ又は複数の更なる選択基準が利用可能であり、例えば高分解能及び低温因子構造が組み込まれ得る。

一実施形態では、生物学的高分子の（一次）構造データベース（例えば、ｗｗＰＤＢ）から開始して二次データベースが構築される。二次データベースは、非結合性の分子内又は分子間接触に関する情報を含む。一実施形態では、二次データベースは、１００万組を超える接触、任意選択的に５００万組を超える接触、任意選択的に１１００万組を超える接触に関する情報を含む。１つの実施形態では、二次データベースは、約２００００個の非相同的タンパク質から抽出された、１５００万組を超える接触原子に由来する情報を含む。

一実施形態では、二次データベースは、接触の組について正確な原子種に関する情報を含有する。一実施形態では、二次データベースは、イオタ原子に対するシータ原子の３次元的な関係を定義する空間的データを含有する。一実施形態では、二次データベースは、接触の局所的環境に関する文脈データも含有する。一実施形態では、文脈データは、各接触の組について局所的環境に関する情報を含有し、これには、二次構造、接触の組を構成するアミノ酸の種類又はその他のモノマーの種類、接触のいずれか一方の側にあるポリマー鎖内の隣接するモノマーユニット及び／又はそのローカルな幾何学的配置、接触のいずれか一方の側にあるポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸、前記隣接するモノマーユニット又はアミノ酸のローカルな幾何学的配置、シータ原子の温度因子、イオタ原子の温度因子、シータ原子の接近可能な表面積、イオタ原子の接近可能な表面積、特定のシータ原子に関する異なるイオタ原子の接触数、及びシータ原子と同一のモノマーユニット上にあるその他のシータ原子の数のうちの１つ又は複数が、任意の組み合わせで含まれる。

一実施形態では、接触の組の３Ｄ座標及び共有結合した隣接原子が、以下に記載するような一般データベース参照フレームに対して群として正規化される。これにより、潜在的に根底にある接触パターン又は規則に関するその後の解析、及び任意のかかる規則の薬物設計への適用が単純化される。

一実施形態では、シータ原子種は、タンパク質の２０種の天然アミノ酸構築ブロックを構成する１６７個の共有結合性原子種（水素を除く）（この場合、二次データベースは、これに応じて分割可能であり、最大２７８８９個、すなわち１６７×１６７個の異なる接触の種類に関する情報を含む）；及び／又はデオキシリボ核酸ポリマー（ＤＮＡ）の４種のヌクレオチド中に存在する８２個の非水素原子；及び／又はメチル化されたＤＮＡヌクレオチド、シチジンホスフェート、及びアデノシンホスフェート中に存在する４２個の非水素原子；及び／又はリボ核酸ポリマー（ＲＮＡ）の４種のヌクレオチドホスフェート中に存在する８５個の非水素原子；及び／又はＲＮＡの２−Ｏ’−メチル化リボースヌクレオチドホスフェート中に存在する８９個の非水素原子；及び／又は最も一般的な転写後塩基修飾されたＲＮＡ中に存在する４００個を超える非水素原子のうち一つのみとして識別される。

一実施形態では、イオタ原子種は、タンパク質の２０種の天然アミノ酸構築ブロックを構成する１６７個の共有結合性原子種（水素を除く）；及び／又はタンパク質に結合した、構造的に重要な水分子中に存在する酸素原子（一次データベース中の結晶構造は、多くの場合、構造的に重要な水分子を含む、すなわち特定のタンパク質の原子は、結合した水分子と一定の相互作用を示すので、これは有用であり得る）；及び／又はデオキシリボ核酸ポリマー（ＤＮＡ）の４種のヌクレオチド中に存在する８２個の非水素原子；及び／又はメチル化されたＤＮＡヌクレオチド、シチジンホスフェート、及びアデノシンホスフェート中に存在する４２個の非水素原子；及び／又はリボ核酸ポリマー（ＲＮＡ）の４種のヌクレオチドホスフェート中に存在する８５個の非水素原子；及び／又はＲＮＡの２−Ｏ’−メチル化リボースヌクレオチドホスフェート中に存在する８９個の非水素原子；及び／又は最も一般的な転写後塩基修飾されたＲＮＡ中に存在する４００個を超える非水素原子のうち一つのみとして識別される。

接触の組では、対向する原子が、接触のいずれかの側から眺望及び記録される。事例的実施形態における命名法を以下に記載し、また図１に図解する。

接触の参照側の原子はシータ原子１と呼ばれ、一方、対向する原子はイオタ原子２と呼ばれる。この事例では、３Ｄ座標を正規化するのに用いられる更なる原子は、以下のように定義される。シータ原子１が、そのアミノ酸のα−Ｃ原子の方向に共有結合している隣の原子は第３の原子３、またその隣の原子は第４の原子４と呼ばれる。第４の原子４は、第３の原子３と共有結合している。イオタ原子２が、各アミノ酸のα−Ｃ原子の方向に共有結合している、隣の原子は第５の原子５、またその隣の原子は第６の原子６と呼ばれる。第６の原子は、第５の原子又はイオタ原子２のいずれかと共有結合している。

一実施形態では、あいまいさを避けるために、特定されたシータ原子種毎に第３及び第４の原子が一義的に選択される。一実施形態では、第５及び第６の原子がやはり一義的に選択される。一実施形態では、下記の規約が適用される。シータ原子１が偶然にα−Ｃ原子である場合には、第３及び第４の原子はそれぞれ骨格カルボニルの炭素原子及び酸素原子である。シータ原子１が骨格カルボニル炭素である場合には、第３の原子３及び第４の原子４は、それぞれα−Ｃ炭素及び骨格窒素である。シータ原子１が骨格窒素である場合には、第３の原子３及び第４の原子４は、それぞれα−Ｃ炭素及び骨格カルボニル炭素である。シータ原子１がβ−Ｃ炭素原子の場合には、第３の原子３及び第４の原子４は、それぞれα−Ｃ炭素及び骨格カルボニル炭素である。フェニルアラニン及びチロシン側鎖では、第３及び第４の原子の位置について２つのイプシロン炭素原子の選択ができる場合、骨格窒素原子に最も近い原子が選択される。

一実施形態では、各接触の座標の正規化が、シータ、イオタ、第３、及び第４の原子について、また任意選択的に第５及び第６の原子についても、それらの３Ｄの関係が維持されるように、群として実施される。得られた正規化後の座標は、正規化された座標群と呼ばれる場合もある。一実施形態では、これは、図２〜６に示すように、下記のステップを順番通りに実施することにより達成される。

図２は、一次データベース（例えば、ｗｗＰＤＢ等）で与えられた座標に基づき、参照フレームに対して相対的に配置され、ｘ−、ｙ−、及びｚ−軸に対して定義された、非結合性の分子内又は分子間接触のシータ原子１、第３の原子３、及び第４の原子４について説明する。座標正規化プロセスの例の第１ステップでは、シータ原子１がゼロ座標となるように原子群の座標が翻訳される（図３）。次に、第３の原子３がｙ＝０となるまで、群全体をｚ−軸の周りで回転させる（図４）。次に、第３の原子がｙ＝０及びｚ＝０となるまで、群をｙ−軸の周りで回転させる（図５）。次に、第４の原子４がｙ＝０となり、且つ群全体がｘ−ｙ面内にくるまで、群をｘ−軸の周りで回転させる（３原子すべてがｙ＝０となる；図６）。このように、１６７個の第１の原子種それぞれが、その種類について重ね合わせることができ、そして二次データベースがそれに応じて細分化され得る。次に、第１の原子の各区分は、１６７個のイオタ原子種に細分化可能であり、各シータ原子種に対する各イオタ原子種の空間的分布の解析を容易にする。

一実施形態では、名目上異なるイオタ原子種に関する分布パターン間の類似性を識別するために、シータ原子と比較してイオタ原子の分布パターンが解析される。このように、固有のイオタ原子種（例えば、上記１６７個の共有結合性原子種）は、その後のデータ利用を単純化するために、いくつかの群（本明細書では、「事前に決定された関連するイオタ原子種の群」と呼ぶ）に統合され得る。分布パターンの類似性に基づき原子種をまとめて群分けすれば、例えば図７を参照しながら以下に記載する方法と関連した演算負荷が軽減されることから、スピードが高まり、及び／又はハードウェア出費が抑制される。

一実施形態では、このプロセスは、デカルト座標よりはむしろ極座標を用いることにより単純化される（一実施形態では、これは、例えば一次データベース中のデータが、デカルト座標を用いて提示される場合、デカルト座標と極座標との間で変換処理を実施することにより達成される）。一実施形態では、２次元極座標が用いられ、シータ原子とイオタ原子の相対的な位置を２つの極角Θ（シータ）及びΦ（ファイ）（球体の緯度と経度に対応する）のみで特定する。得られた２次元緯度−経度プロットは、シータ原子とイオタ原子との間の距離の変化について何らの情報も示さない。しかし、この距離は比較的一定であることが判明しており、したがってシータ−ファイプロットは、接触に関する重要情報の大半を含む。問題解析を三次元よりはむしろ二次元に低減する方が、後続する解析の効率は大幅に改善する。一実施形態では、等高線がイオタ原子の相対的な位置の変化を説明するのに用いられる。等高線は、シータ原子及びイオタ原子について、一定の「密度」又は確率の相対位置に関する線を提示し得る。

かかる極角プロットの解析から、イオタ原子頻度パターンを支配する特に重要な因子は、イオタ原子の元素的性質及び混成状態、すなわちＣｓｐ３、Ｃｓｐ２（芳香族）、Ｃｓｐ２（非芳香族）、Ｎｓｐ３、Ｎｓｐ２、Ｏｓｐ３、Ｏｓｐ２、又はＳであることが明らかにされた。その結果、これらの識別された８群に基づき、１６７個の原子種を群分けすることにより、解析効率を改善させることが可能である。その他の実施形態では、異なる群分けも利用可能である。

一般的に、接触周辺の環境因子、例えば隣接アミノ酸の性質等は、イオタ頻度パターンにそれほど大きな差異をもたらさないが、但し二次構造は例外である。予想されるように、骨格酸素イオタ原子に対する骨格アミド窒素シータ原子及びその逆の頻度パターンは、二次構造により、特にこれらがベータシートに由来するかしないかにより、歪を生じる。

一実施形態では、二次データベースは、接触データをローカルな二次構造タイプ（ヘリックス、ベータシート、又はランダムコイル）でタグ付けする。これは、接触パターンに対する二次構造のあらゆる潜在的影響を区別する基準を、後の段階において提供する。

一実施形態では、結合部位に対するリガンドの結合強度、又は親和力を改善する、リガンドに対する修飾の識別を支援する方法が、上記に基づき提供される。一実施形態では、ＮＣＥ又は生物学的薬物設計を支援するのに、本方法が用いられる。前者の場合、本方法は、標的タンパク質の潜在的薬物結合部位における「ホットスポット」又はファーマコフォア原子の位置を予測するのに役立ち得る。これは、新規薬物設計を促進し得る。結合部位に結合した化学的要素について利用可能な構造が存在するような状況では、本方法は、化学的性質を作り込んでより良好な結合特性を有するリガンドを得るための原子種及び位置を示唆し得る。抗体のようなタンパク質薬物の場合、本方法は、結合親和力又は特異性に改善をもたらす、タンパク質又は抗体の結合部位における突然変異を予測するのに利用可能である。本方法は、高分子構造内で修飾を行い、高分子の特質を改善するための位置を示唆するのにも利用可能である。例えば、下記の実施例セクションに示すように、本方法は、抗体の熱安定性を改善するために、抗体のＶＨ及びＶＬ鎖内の点突然変異を識別するのに利用可能である。突然変異は、異なる鎖上にあるが、なおも抗体高分子内にある。

図７は、高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法の例について説明する。

ステップＳ１では、標的タンパク質の標的の結合部位を表すデータが、例えばローカル又はリモートメモリーデバイス５から取得される。標的の結合部位の表面を形成する原子の標的リストが識別される。

ステップＳ２では、標的リスト中の各原子が、特定のシータ原子種として識別される。

ステップＳ３では、接触している原子の組の第１の原子が特定のシータ原子種であり、またその組の対向する第２の原子が特定のイオタ原子種である、非結合性の分子内又は分子間接触について、例えばローカル又はリモートメモリーデバイス７により提供される生物学的高分子の構造データベース（例えば、ｗｗＰＤＢ）から、情報が抽出される。抽出された情報は、シータ原子と関連するイオタ原子に関する空間的データ及び／又は文脈データを含む。データは、所与のシータ原子種の複数の接触について収集され、得られた一連のデータはシータ接触セットと呼ばれる。一実施形態では、シータ接触セットは、所与のシータ原子種のすべての利用可能な接触について収集されたデータを含む。抽出された情報は、上記で議論された「二次データベース」の例のようなデータベースを形成し得る。一実施形態では、ステップＳ３で抽出される情報は、シータ原子種毎に一つのみのシータ接触セットを含む二次データベース中で収集される。かかる実施形態の例では、二次データベースのシータ接触セットは、複数の非重複イオタ原子種又は非重複の関連するイオタ原子種の群に細分化される。かかる実施形態の例では、識別された接触の群が形成され、その接触では、第１の原子は、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子のうちの唯一無二であり、第２の原子は、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を化学的類似性に基づき群に分類することより取得された複数の非重複群のうち一つのみの群に含まれるように、データベースが細分化される。

ステップＳ４では、ステップＳ２の標的リストにおいて識別されたシータ原子毎に、ステップＳ３で抽出された対応するシータ接触セットからの所与のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関係するデータが、標的の結合部位内又はその周辺で重ね合わされる。一実施形態では、重ね合わせは下記：所与のイオタ原子種、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群を含む接触について空間的データを抽出するために、シータ接触セットをパーシングするステップと、ｉ）接触のシータ原子が、標的の結合部位内の対応するシータ原子の位置に存在する場合、及びｉｉ）接触の第３及び第４の原子が、標的の結合部位内の対応するシータ原子の第３及び第４の原子の位置に存在する場合、イオタ原子種それぞれ、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群それぞれがどこに位置するかを表す理論的場所を決定するために、この空間的データをプロッティングするステップとを含む。求められた理論的場所が結合部位の原子と干渉する、及び／又は標的タンパク質に埋まってしまう場合には、それは、更なる解析から除去され得る。例えば、個々のイオタ原子の理論的場所が、標的高分子の原子の場所とＲｗ−０．２オングストロームよりも接近して交差することが判明した場合には、当該イオタ原子は後続する解析から除外される。

ステップＳ５では、所与のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群が、強い理論傾向を有する結合部位の１つ又は複数の好ましい領域が予測されるように、重ね合わせたデータが統合される、及び／又はパーシングされる。

ステップＳ６では、候補リガンドが、結合部位内に概念的に嵌め込まれる。候補リガンドを定義するデータは、例えばローカル又はリモートメモリーデバイス９から提供され得る。次に、イオタ原子種毎に、候補リガンドの１つ又は複数の原子の種類及び位置が、予測された好ましい領域と比較される。当該比較に基づいて、代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域との間で、より多くの交差を生成するような候補リガンドに対する修飾が、前記代替的又は追加的な候補リガンド原子に関して識別され、これにより非修飾候補リガンドと比較して、修飾された候補リガンドの結合部位に対する親和力の改善がもたらされる。

ステップＳ７では、修飾された候補リガンドが、既存のリガンドに対する改善案として、又は新規リガンドに関する最初からの設計の一環として、アウトプットとなる。任意選択的にステップＳ７及びＳ６は、リガンドを更に修飾するために繰り返され得る。ローカル又はリモートメモリーデバイス５、７、及び９は、単体のハードウェア（例えば、単一のストレージデバイス）、又は２つ以上の異なる、分離したデバイスに導入され得る。

一実施形態では、修飾された候補リガンドが、ストレージ又は伝達用のアウトプットメモリーデバイス、及び／又は可視化用のディスプレイに対するアウトプットとなる。

一実施形態では、ステップＳ３において所与のシータ原子について情報が抽出される接触の群と、あらゆるその他のシータ原子種に関する接触の群の間で交差が存在しないように、所与のシータ原子の種類がステップＳ２で一義的に識別される（但し、所与のシータ原子種をイオタ原子として含む接触を例外とする）。

一実施形態では、ステップＳ５は、複数の異なるイオタ原子種及び／又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群毎に、１つ又は複数の好ましい領域を決定するステップを含む。かかる実施形態では、異なるイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群を含む修正についてそれが可能か識別するために、比較のステップＳ６が、複数の異なるイオタ原子種及び／又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群毎に反復され得る。

一実施形態では、ステップＳ２〜Ｓ７が、結合部位内の異なる複数の原子について実施される。一実施形態では、以下に記載するように、結合部位内の複数の異なる原子について導かれる場合と同様に、イオタ原子種の決定された理論的場所の分布を重畳的に統合すること（例えば、合算）により、好ましい領域はより正確に決定可能である。

一実施形態では、好ましい領域毎に、第５の原子の位置をその各イオタ原子に対して相対的に表示するベクトルが得られるように、解析を拡張する。領域内の理論的コンセンサスイオタ原子について、その共有結合の予測を表す好ましい結合ベクトルを識別するために、ベクトルについて解析が実施される。識別された好ましい結合ベクトルは、次に必要に応じて、候補リガンドの設計を洗練化させる、及び／又は候補リガンドに対する修飾を洗練化させるのに用いられ得る。識別された好ましい結合ベクトルは、例えば異なる好ましい領域内のイオタ原子が、どのように共に結合し得るかを示す、したがって複数の原子の付加又は置換を伴う修飾の識別を支援するのに利用可能である。一実施形態では、解析は、クラスター解析である。

理論的場所の分布から、特定のイオタ原子種（又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群）が、結合部位内の異なる場所において、どの程度好ましいか、その指標又は傾向が得られる。一実施形態では、理論的場所の密度が、事前に決定された閾値を超えている領域が、好ましい領域の１つとして識別される。理論的場所の密度は、例えば所与の空間容積内に認められる、決定された理論的場所の数の指標である。一実施形態では、イオタ原子の理論的場所は、結合部位内の複数の標的原子について決定され、そして複数の標的原子のイオタ原子（又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群）に関する累積的な理論的場所の密度が事前に決定された閾値を上回る領域が、好ましい領域の１つとして識別される。結合部位内の異なる標的原子について決定された理論的場所は、例えば累積的な理論的場所を得るために合算され得る。結合部位内の異なる原子の効果を考慮するこのアプローチは、演算上効率的であり、また候補リガンドと結合部位との間の相互作用に関する情報の損失を最低限に抑える。本アプローチは、単純な原子種の組又は事前に決定された単純な原子種の群のうちの原子と組み合わせた単純な原子種について、接触の特徴付けを行うことにより促進される。かかるアプローチは、接触が３原子フラグメントに関して特徴付けられる場合、例えばＬａｓｋｏｗｓｋｉらの場合には、有効ではない。

得られた理論的場所の分布は、確率密度関数、すなわち結合部位内の所与の位置における所与のイオタ原子種の選好に対する統計ポテンシャルを生み出す様々な方法で変換可能である。次に、確率密度関数は、電子密度と類似の方法で処理可能であり、また分子グラフィクスソフトウェア、例えばＰｙｍｏｌ内でかかるマップを可視化する標準的な方式であるｃｃｐ４ファイルに変換され得る。

一実施形態では、ステップＳ５において、１つ又は複数の好ましい領域が極座標で表され、任意選択的に参照フレームが、第３の原子３及び第４の原子４を参照することにより正規化される場合、任意選択的に極角及び方位角のみを含む。

一実施形態では、ステップＳ６は、候補リガンドの原子（修飾前に存在する、しないを問わず）と、結合部位内の同一種の原子に関する予測された好ましい領域との間の重複度を増加させるような、候補リガンドの修飾を識別するステップを含む。一実施形態では、作成された理論的場所の分布及び／又は好ましい領域が、例えばコンピューターソフトウェアにより又は手作業により、各候補リガンドと複合体を形成している標的高分子構造上での重ね合わせとして検査される。例えば候補リガンドが抗体に関係する場合には、抗体原子と、各イオタ原子の理論的場所の分布及び／又は当該原子について識別された好ましい領域との間の重複度を決定するために、抗体と標的高分子との間の界面を調べることができる。場合によっては、重複度はすでに高い。しかし、界面のその他の領域では、重複は低いと考えられる。抗体の隣接アミノ酸残基内の突然変異が、最も効果的に識別／提示され得る場所は、このような領域内にある。一実施形態では、１９種のその他の天然アミノ酸のそれぞれが、次に、この位置において、各回転異性体コンホメーションすべてにおいて検討され、そしていずれの場合にも、突然変異の案について最大の重複度を有する残基を選択するために、関連するイオタ原子の理論的場所の分布及び／又は好ましい領域との重複度が調査される。このように、選択された抗体において親和力の改善をもたらし得る合理的な突然変異選択手段が提供される。個々の点突然変異が、抗体−標的タンパク質界面の異なる領域において生成可能であり、親和力の改善をもたらすような点突然変異は、親和力に相乗的な増加をもたらす可能性がある２つ以上の点突然変異を組み合わせて試験可能である。

一実施形態では、ステップＳ６は、標的の結合部位と直接接触する、又は標的の結合部位近傍にあるリガンドの１つ又は複数の（任意選択的にすべての）アミノ酸残基のそれぞれを、他の１９種の天然アミノ酸から選択された１つ又は複数の（任意選択的にすべての）残基のそれぞれと置換するステップを含む。かかる置換のそれぞれは、本明細書では「残基置換」と呼び、また１つの残基を異なる残基で単一置換するリガンドの修飾を含む。一実施形態では、リガンド又は標的の隣接原子と干渉（例えば、置換残基の１つ又は複数の原子と標的又はリガンドの１つ又は複数のその他の原子との間の重複）を引き起こさないかかる残基置換毎に、置換残基の各原子の種類と位置を、各イオタ原子種の好ましい領域と比較して、オリジナルの残基の原子よりも多くの交差を生成するかどうか識別する。一実施形態では、リストがアウトプットとなり、オリジナルの残基の原子より多くの交差を生成するものと識別された残基置換を列挙する。一実施形態では、列挙された残基置換毎に、候補リガンドに突然変異をおこして、残基置換が組み込まれた単一残基突然変異修飾型リガンドを生成する。修飾されたリガンドそれぞれの標的の結合部位に対する親和力は、候補リガンドに最大の親和力改善をもたらす修飾を識別するために、実験により試験可能である。例えば、事前に決定された閾値を上回る残基置換を実現する、一群の残基置換が識別され得る。一実施形態では、事前に決定された閾値は、選択された群が親和力をある程度改善する残基置換のみから構成されるように、ゼロであり得る。候補リガンドについてより先進的な修飾が、次にこの情報に基づき実施可能である。例えば、一実施形態では、複数の残基置換、例えば最大の親和力改善をもたらすものとして個別に判定された複数のそのような残基置換が組み込まれるように、候補リガンドは修飾可能である。このように、単一残基のみの置換により可能な親和力よりも改善した親和力を有するリガンドの設計が可能である。

いくつかの実施形態では、オリジナルの残基の原子（ゼロ未満のΔＩＯＴＡスコアを有する）より多くの交差の提供を満足させる残基置換のリストが作成可能である。当該リストは、その他の基準に基づき更にランク付け可能である。例えば、リストは、ΔΔＧスコアに基づきフィルター処理することも可能である（下記を参照）。ゼロ未満ΔΔＧスコアによる残基置換は、オリジナルの残基と比較して、それより強い相互作用を意味する。したがって、残基が、ゼロ未満のΔＩＯＴＡスコア（負のΔＩＯＴＡスコア）、及びゼロ未満のΔΔＧ（負のΔΔＧ）の両基準を満たす場合、リストは作成され得る。これを下記の実施例２で説明する。

化学的要素では、例えば標的タンパク質のポケットに結合した低分子量化学フラグメントの結晶構造の場合、結合部位において提示されたイオタ原子の理論的場所の分布及び／又は好ましい領域は、より高い効力を有するプロトタイプＮＣＥを実現し得るフラグメント成長に関する原子種及び化学結合ベクトルを示唆する可能性がある。

一実施形態では、候補リガンドに対して複数の修飾が識別される。この場合、本方法は、例えば親和力の改善に関して最も効果的である可能性が高い修飾を識別するために、識別された修飾のサブセットを選択するステップを更に含み得る。選択は、代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域との間の交差が、非修飾の候補リガンドと比較して、それよりも多く存在する程度に基づき実施され得る。例えば、事前に決定された閾値を上回る交差の増加を引き起こすような修飾が選択され得るが、一方、事前に決定された閾値を下回る交差の増加を引き起こすような修飾は廃棄され得る。かかる選択プロセスの例は、下記の「実施例２」において議論される。「ΔＩＯＴＡスコア」は、代替的及び／又は追加的候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域との間の交差が、非修飾候補リガンドと比較して、それより多く存在する程度の指標の例である。代替的又は追加的に、選択は、修飾された候補リガンドが結合部位に結合し、これにより形成された複合体が有する総エネルギーに寄付する１つ又は複数の因子が、非修飾候補リガンドが結合した場合と比較して、それよりも減少する程度に基づき実施され得る。例えば、事前に決定された閾値を上回る１つ又は複数の因子の減少（例えば、１つ又は複数の因子の合計数の減少）を引き起こすような修飾が選択され得るが、一方、事前に決定された閾値を下回る１つ又は複数の因子の減少（例えば、１つ又は複数の因子の合計数の減少）を引き起こすような修飾は廃棄され得る。かかる選択プロセスの例は、下記の「実施例２」において議論される。「ロゼッタΔΔＧスコア」は、候補リガンドが結合部位に結合し、これにより形成された複合体の総エネルギーに寄付する１つ又は複数の因子が減少する程度に関する指標の例である。複合体の総エネルギーに寄付する因子の例として、以下で議論するように、Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ項、暗溶媒和項、配向依存性水素結合項、ＰＤＢに由来する側鎖及び骨格のトーションポテンシャル、知識ベースの狭域静電項、及び非フォールド状態をモデル化する２０種のアミノ酸毎の参照エネルギーが挙げられる。

一実施形態では、候補リガンドに対する修飾を識別する方法は、コンピューター式の実行法である。一実施形態では、ステップＳ１〜Ｓ７の任意の１つ又は複数のステップは、コンピューター上で実施される。一実施形態では、ステップＳ１〜Ｓ７のすべてのステップは、コンピューター上で実施される。更に、図１４（抗体のＶＨ−ＶＬ界面における点突然変異を予測するワークフローを示す）のステップＳ１０１〜Ｓ１０９の任意の１つ又は複数のステップは、自動化され得る。ステップＳ１０１〜Ｓ１０９の任意の１つ又は複数のステップは、コンピューター上で実施され得る。１つの実施形態では、ステップＳ１０１〜Ｓ１０９のすべてのステップは、自動化される。ステップＳ１０１〜Ｓ１０９のすべてのステップは、コンピューター上で実施され得る。

広範な標準的計算コンフィギュレーションが当業者にとって周知であり、本方法を実行するためのプラットフォームとして利用可能である。本方法は、特定のハードウェアコンフィギュレーション、オペレーティングシステム、又は本方法のステップを定義する、及び／又は実行するのに必要なソフトウェアを保管又は伝達する手段のいずれかに限定されない。一実施形態では、コンピューターに本方法を実施させるコンピューター読み取り可能なインストラクション（例えば、コンピュータープログラミング言語内のコード）を含むコンピューター読み取り可能なメディア又はシグナルが提供される。

一実施形態では、治療リガンドを製造する方法が提供される。一実施形態では、製造方法は、１つ又は複数の上記実施形態に基づき、新規リガンドを設計する、又は既存のリガンドを修飾するステップを含む。

（例１）
抗ＩＬ１７Ｆ抗体のＦａｂフラグメントにおける親和力の成熟
諸言
抗体親和力の成熟に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ法は周知されている（米国特許第８，３０３，９５３Ｂ２、第１３カラム、１９〜３３行を参照）。最近の例では、Ｆｕｊｉｎｏら（Ｆｕｊｉｎｏら（２０１２年）「界面に着目したハイスループット突然変異的スキャニングに基づく確実性のあるｉｎ ｖｉｔｒｏ親和力成熟戦略（Ｒｏｂｕｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ−ｆｏｃｕｓｅｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｓｃａｎｎｉｎｇ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、第４２８巻、３９５〜４００頁）は、抗体の識別された抗原界面残基５０個毎に、単一点突然変異体単一鎖Ｆａｂライブラリーについてリボソームディスプレイパニングを行い、これに基づくハイスループット突然変異スキャニング戦略により、２０００倍を超える親和力の改善を伴うＦａｂの識別を実現した、強化型バインダーのコンビナトリアルリボソームディスプレイがもたらされたことを報告する。かかる方法は、研究室に端を発する資源に大規模な投資を必要とし、したがって様々なグループ（Ｋｕｒｏｄａら（２０１２年）「コンピューター支援式抗体設計（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎ）」、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、第２５巻、５０７〜５２１頁によりレビューされた）が、親和力改善を目的として多数の突然変異した抗体変異体をスクリーニングするニーズを低減又は除去するために、抗体親和力の改善を予測するインシリコ法について調査した。これらのコンピューター支援式抗体設計プロトコールは、知見ベースである；すなわち、観察データに由来する統計ポテンシャルを用いる、又は物理学ベースである；すなわち、潜在的な物理的相互作用モデルに由来するエネルギー関数を用いる。Ｌｉｐｐｏｗら（２００７年）（Ｌｉｐｐｏｗら（２００７年）、「ｉｎ ｖｉｖｏ成熟を凌駕する抗体親和力改善の演算式設計（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｂｅｙｏｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第２５巻、１１７１〜１１７６頁）は、静電相互作用に基づく後者のアプローチを用いてそこそこの成功を実現したが、本発明者らの理解では、かかる方法のパラメタリゼーションはなおも完全からほど遠い。今日までの知見ベースの方法は、ランダムな突然変異原性について個々の抗体残基を識別する傾向を有し（例えば、Ｂａｒｄｅｒａｓら（２００８年）「インシリコモデリングにより支援を受けた抗体の親和力成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）」、ＰＮＡＳ、第１０５巻、９０２９〜９０３４頁）、この方法は研究室に端を発するかなりの努力をなおも必要とする。

本実施例では、知見ベースのアプローチを、米国特許第８，３０３，９５３Ｂ２号に記載されている抗ＩＬ１７Ｆ抗体のＦａｂフラグメントの親和力成熟に適用した。最終的な親和力成熟後の抗体は、完全長ＩｇＧ１分子として国際公開第２０１２／０９５６６２Ａｌ号に記載されている。しかし、この抗体の親和力成熟方法は、後者の出版物で開示されていない。

方法
ＩＬ１７Ｆエピトープを含む標的（シータ）原子の識別
国際公開第２００９／１３０４５９Ａ２号に記載されている、共結晶ＩＬ１７Ｆ／Ｆａｂ４９６複合体構造の座標を用いて、任意のＦａｂ４９６原子から６Å内のすべてのＩＬ１７Ｆ原子を、エピトープ原子として識別したが、これを表１に列記する。２０９個のシータ原子からなるこのリストには、特定のシータ原子種８６個が存在する。

イオタデータベースの構築
１１００万個を超える分子内原子接触データからなる二次データベースは、２００００個を超える非相同的タンパク質構造から抽出したが、その分解能は≦２Åであった。接触は、１Å＋２原子の各ファンデルワールス半径の合計、又はそれ以下の距離で隔てられたタンパク質フォールドの対峙する両側の任意の２原子として定義し、そして直鎖状のペプチド配列上で、少なくとも４残基離れた残基上の原子に限定した。接触する組の第１の原子をシータ原子、また第２の原子をイオタ原子と命名した。データベースを、シータ原子種に基づき１６７個の接触セットに分割し、タンパク質を構成する２０種の天然アミノ酸残基内には、１６７個の非水素原子種が存在する。接触セット中で、シータ−イオタ原子の組について座標を正規化した後、各イオタ原子位置の相対的な座標を記録した。正規化は、シータ原子をｘ，ｙ，ｚ＝０，０，０；次に、シータ原子に共有結合している原子（第３の原子）（ペプチド骨格の方向で）をｘ，ｙ，ｚ＝ｘ’，０，０、次にやはり共有結合している原子（第４の原子）をｘ，ｙ，ｚ＝ｘ’’，０，ｚ’に設定して行った。定義された第３及び第４の原子には、一定の規則を採用した。

各シータ接触セットを、１６７個のイオタ原子種に更に細分化したが、便宜上、これらをＥｎｇｈ及びＨｕｂｅｒの定義に基づく化学的タイプに従い、２６個のサブグループに統合した（Ｅｎｇｈ及びＨｕｂｅｒ（１９９１年）「Ｘ線タンパク質構造を洗練化させるための正確な結合及び角度パラメーター（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｂｏｎｄ ａｎｄ Ａｎｇｌｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）」、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．、Ａ４７、３９２〜４００頁）。

この実施例では、下記のイオタサブグループを採用した：
説明 原子
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
カルボニルＯ すべての骨格Ｏ、Ａｓｎ Οδ１、Ｇｌｎ Οε１
正四面体ＣＨ_２ すべてのＣβ９（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌを除く）Ａｒｇ Ｃδ，Ｃγ、Ｇｌｎ Ｃγ、Ｇｌｕ Ｃγ、Ｉｌｅ Ｃγｌ、Ｌｙｓ Ｃγ，Ｃδ，Ｃε、Ｍｅｔ Ｃγ
正四面体ＣＨ_３ Ａｌａ Ｃβ、Ｉｌｅ Ｃδ１，Ｃγ２、Ｌｅｕ Ｃδ１，Ｃδ２、Ｍｅｔ Ｃε、Ｔｈｒ Ｃγ２、Ｖａｌ Ｃγ１，Ｃγ２
ＮＨ すべての骨格Ｎ（Ｐｒｏを除く）、Ａｒｇ Νε、Ｈｉｓ Νδ１，Νε２、Ｔｒｐ Νε１
ヒドロキシルＯ Ｓｅｒ Ογ、Ｔｈｒ Ογ１、Ｔｙｒ Οη
カルボキシルＯ Ａｓｐ Οδ１，Οδ２、Ｇｌｕ Οε１，Οε２
ＮＨ_２ Ａｓｎ Ｎδ２、Ｇｌｎ Νε２

イオタデータのＩＬ１７Ｆエピトープ表面上への重ね合わせ
ＩＬ１７Ｆエピトープを構成する２０９個のシータ原子それぞれについて、対応するシータ接触セットをイオタデータベースから選択し、それから、適するイオタサブグループ、例えばカルボニル酸素を選択した。このサブグループに由来する相対的イオタ座標を、ＩＬ１７Ｆエピトープの所与のシータ原子の参照フレームと比較して変換した（表２は、事例的データを示す）。所与のサブグループに関するイオタデータセットは、したがってＩＬ１７Ｆエピトープ全体にわたり蓄積された。所与のイオタデータポイントの場所がＩＬ１７Ｆの原子と交差し、両者のファンデルワールス半径それぞれの合計−０．２Åより接近しているような場合には、次にこれらのデータポイントをデータセットから除外した。当該プロセスをすべての関連するイオタサブグループについて反復して、ＩＬ１７Ｆエピトープについて一連のイオタデータセットを作成した。

ＩＬ１７Ｆイオタデータセットの可視化
各イオタデータセットを、分子グラフィクスコンピューターソフトウェア、例えばＰｙｍｏｌ等を用いて、ＩＬ１７Ｆ／Ｆａｂ４９６構造に関連して可視化した。これは、イオタデータセットを個々のポイントとして直接プロッティングすることにより、又は最初にデータセットを密度関数に、そしてＩＬ１７エピトープ全体にわたりより高い密度の輪郭図が表示可能なように、分子グラフィックディスプレイに適合性を有するファイルフォーマット、例えばｃｃｐ４に数学的に変換することにより実施可能であった。

Ｆａｂ４９６パラトープ原子との交差に関するイオタ密度マップ検査
１残基毎にＦａｂ４９６原子それぞれと対応するイオタ密度マップとの間の交差の程度を判定するために、ＩＬ１７Ｆ／Ｆａｂ４９６界面を調べた。交差をまったく又はほとんど認めない残基を識別した。この場合、分子グラフィクスソフトウェアにより替わりの残基に置換して、より良好な交差が残基原子と関連するイオタ密度マップとの間で実現可能かどうか調べた。良好なイオタ密度マップとの交差を生成するアミノ酸置換を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ製造用として、及びＦａｂ４９６の無処理ＩｇＧバージョンと同様に、単一点突然変異として試験するために、候補リストに挙げた。

ＤＮＡ操作及び一般的な方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系統ＩＮＶαＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、形質転換及びルーチン培養増殖用として用いた。ＤＮＡ制限及び修飾酵素を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから取得した。プラスミドの調製を、Ｍａｘｉプラスミド精製キット（Ｍａｘｉ Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ）（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２１６５）を用いて実施した。ＤＮＡ配列決定反応を、ＡＢＩプリズムビッグダイターミネーター配列決定キット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｂｉｇ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）（カタログ番号４３０４１４９）を用いて実施し、ＡＢＩ ３１００自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で用いた。データを、プログラム自動アセンブラー（ｐｒｏｇｒａｍ Ａｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得した。ＩｇＧ濃度を、ＩｇＧアセンブリＥＬＩＳＡにより測定した。

抗体ＣＡ０２８_＿００４９６の親和力成熟
ＣＡ０２８_＿０４９６は、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆアイソフォームの両方に結合するヒト化中和抗体である。これは、ｇＬ７及びｇＨ９と呼ばれるグラフト化可変領域を含み、その配列は、国際公開第２００８／０４７１３４号に開示されている。この抗体の野生型Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ４９６）及び突然変異体を、以下の通り調製した：上記候補リストで特定された残基及び位置に基づき、軽鎖可変領域（ｇＬ７）内に単一点突然変異を導入するために、オリゴヌクレオチドプライマー配列を、設計及び構築した。突然変異した軽鎖それぞれを、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をエンコードするＤＮＡを含んだＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１内に、個別にサブクローン化した。不変の重鎖可変領域（ｇＨ９）配列を、ヒト重鎖γ−１定常領域、ＣＨ１をエンコードするＤＮＡを含んだＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈ発現ベクターｐＶｈｇｌＦａｂ６Ｈｉｓ内にサブクローン化した。製造業者の指示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ。カタログ番号１２３４７−０１９）に基づき、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）手順を用いて、重鎖及び軽鎖エンコードプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。１０〜１２日間培養後に、培養物上清に分泌されたＩｇＧ１抗体濃度を、ＥＬＩＳＡにより評価し、そして結合動力学を表面プラズモン共鳴により評価した（下記参照）。ＩＬ１７Ｆに対する改善又は類似した結合を示す突然変異体を、次に調製し、そして上記のように、二重、三重、四重、又は五重の軽鎖突然変異として組み合わせた状態で試験した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
すべてのＳＰＲ実験を、ＨＢＳ−ＥＰ泳動バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ；３ｍＭのＥＤＴＡ；０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）上、２５℃で実施した。ヤギＦ（ａｂ’）_２抗ＩｇＧ Ｆａｂ’特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ．製品コード１０９−００６−０９７）を、製造業者の推奨に従い、アミンカップリング法により、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面に共有結合させた。要するに、カルボキシメチルデキストラン表面を、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシミドと２００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとからなる新鮮な混合物を用いて、１０μｌ／分の流速で５分間活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０バッファー中に５０μｇ／ｍｌで含まれる抗Ｆａｂ抗体を同一の流速で６０秒間注入した。最終的に、１Ｍのエタノールアミン・ＨＣｌ、ｐＨ８．５で１０分間パルスすることにより表面を非活性化し、４０００〜５０００応答ユニット（ＲＵ）の固定化抗体がチップ上に得られた。参照フローセルを、タンパク質を除いた上記手順から同一チップ上に調製した。

野生型及び突然変異型４９６Ｆａｂを、３〜３０μｇ／ｍｌの範囲で培養物上清から採集し、そして未精製の上清を泳動バッファーで０．５〜２μｇ／ｍｌの範囲に稀釈した。ＩＬ１７Ｆに対する結合動力学を評価するために、１０μｌ／分で６０秒間注入することにより、各抗体を抗Ｆａｂ’表面上で最初に捕捉し、更に１５０〜２５０ＲＵシグナルを得た。組換えヒトＩＬ１７Ｆを、泳動バッファー中、１０ｎＭから用量を漸増し、そして３０μｌ／ｍｌで注入して、会合相を１８０秒超、その後に解離相を３００秒間生成した。各サイクルの終了時に、１０μｌ／分で４０ｍＭのＨＣｌによるパルスを６０秒間、その後に５ｍＭのＮａＯＨによるパルスを３０秒間行い、表面を再生した。ＩＬ１７Ｆ注入を泳動バッファーの注入に置き換えた際には、Ｆａｂ’毎に、コントロールサイクルを実施した。

参照フローセルシグナルを減じることにより、次にコントロールサイクルセンソグラムを減じることにより、Ｆａｂ’毎にセンソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を補正した。Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて、解離速度定数（ｋ_ｄ）及び会合速度定数（ｋ_ａ）をデータ近似させた。Ｆａｂ親和力（Ｋ_Ｄ）を、Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａとして計算した。

結果
イオタ密度マップとＦａｂ４９６原子との交差
ＩＬ１７Ｆとの界面を形成するＦａｂ４９６の表面部分を検査すると、多くのエリアで、所与のＦａｂ４９６原子と対応するイオタ密度マップとの間に完全な交差が認められることが明らかとなった。これは、Ｆａｂ４９６重鎖を構成するアミノ酸残基の場合に特に当てはまる。しかし、Ｆａｂ４９６原子と対応するイオタ密度マップについて、交差がまったく又はほとんど存在しない、軽鎖を構成するいくつかの領域も認められた（図８〜１３、パネルＡ）。替わりの残基を、このような位置でＦａｂ４９６構造中に置き換えることにより、置換後の残基の１つ又は複数の原子と対応するイオタ密度マップとの間で交差の実現が可能となった（図８〜１３、パネルＢ）。したがって、Ｆａｂ４９６軽鎖では、トレオニン３０ Ｃγ２原子はメチル炭素イオタ密度マップと交差せず、またΟγ１原子もヒドロキシル酸素イオタ密度マップと交差しない。しかし、トレオニン３０がアルギニンに突然変異すると、Νε原子と二級アミドイオタ密度マップとの間で交差が認められる（図８）。

図９は、軽鎖アルギニン５４周辺に分散する正四面体メチレンイオタ密度、及び二級アミドイオタ密度を示し、このアルギニン残基の各側鎖原子との交差は一切認められない。反対に、この位置でセリンに突然変異すると、ヒドロキシル酸素イオタ密度とセリン側鎖のγ酸素原子との良好な交差が認められる。軽鎖セリン５６γ酸素原子は、ヒドロキシル酸素イオタ密度と交差しない。しかし、この残基がイソロイシンに突然変異すると、イソロイシン側鎖のδ１メチル原子とメチルイオタ密度との交差が認められる（図１０）。セリン６０の場合、やはりγ酸素は、交差を実現するには隣接するヒドロキシル酸素イオタ密度から離れすぎているが（図１１）、この残基がアスパラギン酸に突然変異すると、側鎖のδ酸素原子とカルボキシル酸素イオタ密度との交差を引き起こす。

軽鎖トレオニン７２は、ＣＤＲ残基ではなく、フレームワーク３の一部であり、その側鎖メチル原子は、メチル炭素イオタ密度と交差せず、またその側鎖酸素原子もヒドロキシル酸素イオタ密度と交差しない。しかし、アルギニン７２に突然変異すれば、側鎖δ炭素原子とメチレン炭素イオタ密度、及び側鎖のη窒素原子とグアニジニウム窒素イオタ密度の両方について交差が可能となる。

抗体ＣＡ０２８＿００４９６上に生じたイオタ設計式突然変異の結合動力学に与える効果
Ｆａｂ４９６における５個のイオタ設計式単一点軽鎖突然変異、Ｔ３０Ｒ、Ｒ５４Ｓ、Ｓ５６Ｉ、Ｓ６０Ｄ、及びＴ７２Ｒは、結合親和力につき、１．７〜３．６倍の小さな改善を示した。非ＣＤＲ突然変異、Ｔ７２Ｒについて改善が認められたが、この位置の残基は抗原とは通常接触しないことから、それは驚きであった。これらの突然変異のうち、１つ（Ｓ６０Ｄ）を除きすべてにおいて、解離速度定数の低下によって改善が促進された（表３）。これらの突然変異を対で組み合わせると、その結果、結合に相乗的な改善を引き起し、解離速度定数は１／３．８〜１／７．５に低下したが、三重及び四重で組み合わせると、解離速度定数について更に段階的低下をもたらした（表３）。

５つの軽鎖突然変異すべてを組み合わせると、結合親和力に最大の改善をもたらし（表４）、ＩＬ１７Ｆに対して１１ｐＭの親和力値が得られ、オリジナルのＦａｂ４９６より約１８０倍良好であった。重要な所見として、ＩＬ１７Ａアイソフォームへの結合に対して有害効果は認められず、実際には、親和定数はオリジナルのＦａｂ４９６の１４ｐＭと比較して２ｐＭと改善したことが挙げられた。設計した突然変異を組み合わせると、親和力に相乗的増強をもたらすことは興味深いが、その１つの説明として、突然変異は、軽鎖パラトープ表面全体にわたり、しかるべき間隔で配置しており（図１３）、したがって負の相互作用効果が回避されることが挙げられる。

結論
Ｋ_Ｄが１１ｐＭとなり、親和定数が１８０倍改善したことから、対応する抗体Ｆａｂ４９６において、好ましい突然変異を予測するために、ＩＬ１７Ｆのエピトープ表面全体にわたり、イオタ密度マップを作成する方法について、その奏功性が証明された。この方法は、ＣＤＲの突然変異のみが利用可能であることを想定とするものではなく、フレームワーク領域の突然変異も親和力の成熟に重要であることを実証する。

（例２）
安定性改善を目的とした、Ａｂの重鎖／軽鎖間の領域における本発明の自動化プロセスの利用
方法
ＦａｂＸのＦｖ界面における重鎖及び軽鎖両方の標的（シータ）原子の識別
抗原と複合体形成した抗体Ｆａｂフラグメント、「ＦａｂＸ」の結晶構造座標を用いて、任意の軽鎖原子から６Å以内のすべての重鎖原子を、エピトープ原子として識別した（表５に列記する１６７個のシータ原子）。同様に、任意の重鎖原子から６Å以内のすべての軽鎖原子を、エピトープ原子として識別した（表５に列記する１５９個のシータ原子）。

重鎖及び軽鎖界面表面全体にわたるイオタデータの重ね合わせ
重鎖エピトープを構成する１６７個のシータ原子それぞれについて、対応するシータ接触セットをイオタデータベースから選択し、それから、適するイオタサブグループ、例えばカルボニル酸素を選択した。このサブグループに由来する相対的イオタ座標を、重鎖エピトープの所与のシータ原子の参照フレームと比較して変換した。所与のサブグループに関するイオタデータセットは、したがって重鎖エピトープ全体にわたり蓄積された。所与のイオタデータポイントの場所が重鎖原子と交差し、両者のファンデルワールス半径それぞれの合計−０．２Åより接近しているような場合には、次にこれらのデータポイントをデータセットから除外した。当該プロセスをすべての関連するイオタサブグループについて反復して、重鎖エピトープについて一連のイオタデータセットを作成した。

軽鎖エピトープを構成する１５９個のシータ原子それぞれについて、対応するシータ接触セットをイオタデータベースから選択し、それから、適するイオタサブグループ、例えばカルボニル酸素を選択した。このサブグループに由来する相対的イオタ座標を、重鎖エピトープの所与のシータ原子の参照フレームと比較して変換した。所与のサブグループに関するイオタデータセットは、したがって軽鎖エピトープ全体にわたり蓄積された。所与のイオタデータポイントの場所が軽鎖の原子と交差し、両者のファンデルワールス半径それぞれの合計−０．２Åより接近しているような場合には、次にこれらのデータポイントをデータセットから除外した。当該プロセスを、すべての関連するイオタサブグループについて反復して、軽鎖エピトープについて一連のイオタデータセットを作成した。

重鎖−軽鎖原子との交差に関するイオタ密度マップの検査
全プロセスを、突然変異可能位置の識別、単一点突然変異体の生成、低エネルギー回転異性体の状態列挙、定量的ＩＯＴＡスコア算出、ＶＨ−ＶＬ鎖結合エネルギーの見積り、及び点突然変異体優先順位付けを目的として、特別仕様で作成された社内特注Ｒｏｓｅｔｔａ ｐｙｔｈｏｎライブラリースクリプトを用いて自動的に実施した。

２つのスコアリング法を、突然変異体のランク付けに用いた：
１．ΔＩＯＴＡスコア
作成された上記イオタ密度マップを、突然変異可能な位置それぞれにおける残基の重原子それぞれと、近傍の対応する種類のマップ内の密度臨界点との間の空間的な交差値を算出するのに用いた。ＩＯＴＡスコアは、１残基の重原子と対応する種類の定義を有する最大ＩＯＴＡ密度との間の容積測定上のオーバーラップの合計であり、１残基毎のＦａｂＸ原子それぞれと、対応するイオタ密度マップとの間の交差度を反映する。ＩＯＴＡスコアは、数値上負であり、低い数値ほど、より多くの交差を意味する。ΔＩＯＴＡスコアは、突然変異体残基と野生型残基との間のＩＯＴＡスコアの変化である；同様に、ΔＩＯＴＡスコアの値が負であるほど、突然変異体は野生型より好ましいという意味合いが大きくなる。
２．ＲｏｓｅｔｔａΔΔＧスコア
Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数は、原子間相互作用の力、溶媒和効果、及びトーションエネルギーをモデル化する項の線型結合である。より具体的には、スコア１２は、Ｒｏｓｅｔｔａの完全原子エネルギー関数のデフォルト値であり、Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ項、暗溶媒和項、配向依存性水素結合項、ＰＤＢに由来する側鎖及び骨格のトーションポテンシャル、知見ベースの狭域静電項、及び非フォールド状態をモデル化する２０種のアミノ酸毎の参照エネルギーから構成される。２つの結合パートナー間の結合強度又はΔＧは、個々のパートナー単独のＲｏｓｅｔｔａスコアから２つのパートナーにより形成された複合体構造の同スコアを減じることにより算出可能である。ΔＧが小さいほど強い結合を示唆する。ΔΔＧは、突然変異体複合体と野生型複合体との間のΔＧの変化である；ΔΔＧの値が負であるほど、突然変異体の結合親和力は野生型の結合親和力より高いという意味合いが大きくなる。

図１４は、ＦａｂＸ構造のＶＨ−ＶＬ界面における点突然変異をインシリコ予測するためのワークフローについて説明する。

ステップＳ１０１では、任意の軽鎖重原子から８Å内に少なくとも１つの重原子を有する、重鎖上のすべての残基を、突然変異可能位置として識別した。同様に、任意の重鎖重原子から８Å内に少なくとも１つの重原子を有する、軽鎖上のすべての残基を、突然変異可能位置として識別した。

ステップＳ１０２では、野生型ＦａｂＸ結晶構造について、残基全体のＩＯＴＡスコア及び結合エネルギーΔＧをそれぞれ算出する。ステップＳ１０２．１では、対応するイオタ密度マップに隣接する現在の突然変異可能な位置上の野生型残基についてＩＯＴＡスコアが算出され、これを（ＩＯＴＡスコア_ｗｔ、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ）と呼ぶ；ステップＳ１０２．２では、Ｒｏｓｅｔｔａスコア１２関数を用いて、野生型ＦａｂＸのＶＨ鎖及びＶＬ鎖の結合エネルギーが算出され、これをΔＧ_ｗｔと呼ぶ。

ステップＳ１０３では、ステップＳ１０１において識別された現在の突然変異可能な位置上の野生型残基を、他の種類のアミノ酸に置換する（突然変異させる）。２０種の天然アミノ酸のうち、プロリン及びシステインを突然変異から除外する。その他の全１８種（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）を、野生型そのものを除き、各突然変異可能位置上で１つずつ突然変異させる。

ステップＳ１０４では、各突然変異可能な位置における突然変異残基の種類毎に、最低エネルギー（Ｒｏｓｅｔｔａスコアリング関数に関して）上位１００番の回転異性体の状態を、Ｒｏｓｅｔｔａを用いて作成する。他方の高エネルギー回転異性体の状態を廃棄する。

ステップＳ１０５では、Ｓ１０４で生成した突然変異体残基の回転異性体の状態それぞれについて、ＩＯＴＡスコアをステップＳ１０２と同様に算出し、これを（ＩＯＴＡスコア_{ｍｕｔａｎｔ}、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ、Ｔｙｐｅ_ｋ、Ｒｏｔａｍｅｒ_ｉ）と呼ぶ。

ステップＳ１０６では、回転異性体の状態、突然変異体残基の種類、及び突然変異可能な位置の現在の組み合わせに関するΔＩＯＴＡスコアを、（ＩＯＴＡスコア_ｗｔ、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ）から（ＩＯＴＡスコア_{ｍｕｔａｎｔ}、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ、Ｔｙｐｅ_ｋ、Ｒｏｔａｍｅｒ_ｉ）を減じることにより算出し、これを（ΔＩＯＴＡスコア、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ、Ｔｙｐｅ_ｋ、Ｒｏｔａｍｅｒ_ｉ）と呼ぶ。現在の突然変異体残基の種類及び突然変異可能な位置について、回転異性体の状態毎に、すべてのΔＩＯＴＡスコアを計算するために、ステップＳ１０５及びＳ１０６を反復した。

ステップＳ１０７では、ステップＳ１０７．１に示すように、現在の突然変異体残基の種類及び突然変異可能な位置について、その最適な回転異性体の状態を、最低のΔＩＯＴＡスコア値を用いて求める。ステップＳ１０２．２と同様に、ステップＳ１０７．２で、最適な回転異性体状態の突然変異体の結合エネルギーを算出し、これを（ΔＧ_{ｍｕｔａｎｔ}、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ_ｊ、Ｔｙｐｅ_ｋ）と呼ぶ。ステップＳ１０７．３では、突然変異体と野生型の間の結合エネルギーの変化ΔΔＧを、ΔＧ_ｗｔからΔＧ_{ｍｕｔａｎｔ}を減じることにより計算する。最適な回転異性体の状態について優先順位付けを行った後、現在の突然変異可能位置において、次の種類の突然変異体アミノ酸を対象に、ステップＳ１０３〜Ｓ１０７を反復した。

ステップＳ１０８では、現在の突然変異可能位置について、ΔＩＯＴＡスコア＜０及びΔΔＧ＜０の両基準を満たす候補突然変異体のみを、後のランク付けのために保持する。残りを廃棄する。すべての突然変異可能位置について網羅し、同一の基準を満たす候補突然変異体をすべて生成するために、ステップＳ１０２〜Ｓ１０８を反復した。

ステップＳ１０９では、すべての候補突然変異体構造を、後の可視化解析用としてアウトプットした。候補突然変異体の最終リストを、最低ΔＩＯＴＡスコア別に分類及びランク付けした。

使用した動作コマンド及びパラメーターは下記の通りであった：
軽鎖突然変異予測の場合、コマンドは下記の通りであった：
「ｐｙｔｈｏｎ ｍｕｌｔｉＲｏｔａｍｅｒｓＦａｂＩｎｔｅｒｆａｃｅＩＯＴＡＳｃａｎ．ｐｙ−−ｐｄｂ ＦａｂＸ．ｐｄｂ−−ｏｎｌｙ_＿ｃｈａｉｎｓ Ｌ−−ｒｅｇｉｏｎ ａｌｌ−−ｕｓｅＩＯＴＡ−−ＩＯＴＡｔｙｐｅ １６７−−ｏｕｔｐｕｔ_＿ｍｕｔａｎｔ」
重鎖突然変異予測の場合、コマンドは下記の通りであった：
「ｐｙｔｈｏｎ ｍｕｌｔｉＲｏｔａｍｅｒｓＦａｂＩｎｔｅｒｆａｃｅＩＯＴＡＳｃａｎ．ｐｙ−−ｐｄｂ ＦａｂＸ．ｐｄｂ−−ｏｎｌｙ_＿ｃｈａｉｎｓ Ｈ−−ｒｅｇｉｏｎ ａｌｌ−−ｕｓｅＩＯＴＡ−−ＩＯＴＡｔｙｐｅ １６７−−ｏｕｔｐｕｔ_＿ｍｕｔａｎｔ」
下記のコードを、「ｍｕｌｔｉＲｏｔａｍｅｒｓＦａｂＩｎｔｅｒｆａｃｅＩＯＴＡＳｃａｎ．ｐｙ」に付加して、Ｒｏｓｅｔｔａ関連のエキストラパラメーターを初期化した：
「ｉｎｉｔ（ｅｘｔｒａ_＿ｏｐｔｉｏｎｓ＝“−ｅｘｌ−ｅｘ２−ｓｃｏｒｅ：ｗｅｉｇｈｔｓ ｓｃｏｒｅ１２ −ｎｏ_＿ｈｉｓ_＿ｈｉｓ_＿ｐａｉｒＥ−ｃｏｎｓｔａｎｔ＿ｓｅｅｄ−ｅｄｅｎｓｉｔｙ：ｍａｐｒｅｓｏ ３．０−ｃｏｒｒｅｃｔ−ｍｕｔｅ ａｌｌ」

ＤＮＡ操作及び一般的方法
大腸菌系統ＩＮＶαＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、形質転換及びルーチン培養増殖用として用いた。ＤＮＡ制限及び修飾酵素を、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから取得した。プラスミドの調製を、Ｍａｘｉプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２１６５）を用いて実施した。ＤＮＡ配列決定反応を、ＡＢＩプリズムビッグダイターミネーター配列決定キット（カタログ番号４３０４１４９）を用いて実施し、ＡＢＩ ３１００自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で用いた。データを、プログラム自動アセンブラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得した。ＩｇＧ濃度を、ＩｇＧアセンブリＥＬＩＳＡにより測定した。

重鎖−軽鎖界面における親和力成熟によるＦａｂＸの熱安定性の改善
ＦａｂＸの野生型Ｆａｂフラグメント及び突然変異体を、以下の通り調製した：上記候補リストで特定された残基及び位置に基づき、重鎖及び軽鎖可変領域の両領域内に単一点突然変異を導入するために、オリゴヌクレオチドプライマー配列を、設計及び構築した。突然変異した軽鎖それぞれを、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をエンコードするＤＮＡを含んだＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１内に、個別にサブクローン化した。突然変異した重鎖可変領域配列それぞれを、ヒト重鎖γ−１定常領域、ＣＨ１をエンコードするＤＮＡを含んだＵＣＢ Ｃｅｌｌｔｅｃｈ発現ベクターｐＶｈｇ１Ｆａｂ６Ｈｉｓに個別にサブクローン化した。重鎖及び軽鎖をエンコードするプラスミドを、製造業者の指示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ。カタログ番号１２３４７−０１９）に基づき、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）手順を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。１０〜１２日間培養後に、培養物上清に分泌されたＩｇＧ１ Ｆａｂ抗体濃度を、ＥＬＩＳＡにより評価し、そして結合動力学を表面プラズモン共鳴により評価した（下記参照）。改善した熱安定性を示す突然変異体を次に調製し、そして上記のように二重又は三重の突然変異として組み合わせた状態で試験した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
すべてのＳＰＲ実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実施した。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントに特異的なＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、捕捉レベルが約５０００応答ユニット（ＲＵ）となるまで、アミンカップリング化学によりＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ｌ０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；０．１５ＭのＮａＣｌ；３ｍＭのＥＤＴＡ；０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、泳動バッファーとして流速１０μＬ／分で用いた。０．７５μｇ／ｍＬのＦａｂＸを１０μＬ注入して、固定化抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）_２による捕捉に利用した。様々な濃度（５０ｎＭ〜６．２５ｎＭ）の捕捉後のＦａｂＸに対して、抗原量を３０μＬ／分の流速で漸増した。１０μＬ／分の流速で、５０ｍＭのＨＣｌを２×１０μＬ注入し、その後に５ｍＭのＮａＯＨを５μＬ注入して表面を再生した。標準手順に準拠するＴ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を用いて、バックグラウンドを差し引いた結合曲線を解析した。動力学的パラメーターを、フィッティングアルゴリズムから求めた。

熱安定性アッセイ
精製された分子の熱安定性を評価するために、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを実施した。精製されたタンパク質（０．１ｍｇ／ｍｌ）をＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、そして当該混合物を３８４ＰＣＲ光学ウェルプレートに４回繰り返し分注した。サンプルを、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で、２０℃〜９９℃の温度範囲において、１．１℃／分の傾斜率で分析した。１ウェル当たりの蛍光強度変化を温度に対してプロットし、得られたスロープの変曲点を、Ｔ_ｍを生成するのに用いた。

結果
イオタ密度マップと界面の重鎖及び軽鎖原子の交差
Ｒｏｓｅｔｔａスキャンを用いる自動化された方法により、ＩＯＴＡスコア別にランク付けされた突然変異の表を作成した（表６）。

ＦａｂＸに関するイオタ設計式突然変異が熱安定性に与える効果
ＦａｂＸにおける６個のイオタ設計式単一点突然変異、Ｈ−Ｔ７１Ｒ、Ｈ−Ｔ７１Ｋ、Ｈ−Ｔ７１Ｎ、Ｈ−Ｔ７１Ｈ、Ｌ−Ｓ１０７Ｅ、及びＬ−Ｔ１０９Ｉは、野生型よりも０．５℃〜２．９℃の範囲で、熱安定性に小さな改善を示した（表７）。図１５、１６、及び１７は、このような単一点突然変異の効果を表すコンピューターによって作成された可視化表現を提示する。特に、これらの図は、Ｈ−Ｔ７１、Ｌ−Ｓ１０７、及びＬ−Ｔ１０９では密度の交差は認められないが、Ｈ−Ｒ７１はアミドの密度と交差し、Ｌ−Ｅ１０７はカルボン酸の密度と交差し、そしてＬ−Ｉ１０９はメチルの密度と交差することを示している。これらの突然変異を対で組み合わせると、その結果、熱安定性に相乗的な改善を引き起し、三重で組み合わせると、熱安定性について更に段階的改善をもたらした（表８）。

Ｈ−Ｔ７１Ｒ、Ｌ−Ｓ１０７Ｅ、及びＬ−Ｔ１０９Ｉを組み合わせると、突然変異により熱安定性に最大の改善がもたらされ（表８）、オリジナルのＦａｂＸより約５．８℃良好な８１．２℃のＴｍが得られた。これら３つの突然変異の組み合わせを図１８に示す。重要な所見として、その抗原に対する結合性に有意な損失が認められないことが挙げられた。

Claims (45)

1. 高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法であって、
   ａ）前記標的の結合部位の表面を形成する原子の標的リストを識別するステップと、
   ｂ）前記標的リスト中の各原子を、特定のシータ原子種として識別するステップであって、前記原子は以後シータ原子と呼ばれる上記ステップと、
   ｃ）生物学的高分子の構造データベースから、非結合性の分子内又は分子間の原子と原子との接触に関する情報を抽出するステップであって、接触している原子の組のうちの第１の原子が、特定のシータ原子種に属し、前記組のうちの対向する第２の原子が、以後イオタ原子と呼ばれる特定のイオタ原子種に属し、前記情報が、前記シータ原子に対する前記イオタ原子の相対的な空間的データ及び／又は文脈データを含み、前記データベースに由来する所与のシータ原子種の複数の接触について収集された前記データは、以後シータ接触セットと呼ばれる上記ステップと、
   ｄ）ステップｂ）の標的リストで識別されたシータ原子毎に、ステップｃ）で抽出された対応するシータ接触セットからの所与のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関係するデータを、前記標的の結合部位内又はその周辺に重ね合わせるステップと、
   ｅ）前記所与のイオタ原子種又は前記事前に決定された関連するイオタ原子種の群が強い理論傾向を有する結合部位の１つ又は複数の好ましい領域が予測されるように、重ね合わせたデータを統合及び／又はパーシングするステップと、
   ｆ）前記候補リガンドを前記結合部位内に概念的に嵌め込んで、前記候補リガンドの１つ又は複数の原子の種類及び位置を前記イオタ原子種毎に予測された好ましい領域と比較することにより、代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域の間で、より多くの交差を生成するような前記候補リガンドに対する修飾を、前記代替的及び／又は追加的な候補リガンド原子に関して識別するステップであって、これにより非修飾候補リガンドと比較して、修飾された前記候補リガンドの前記結合部位に対する親和力の改善をもたらす上記ステップと
   を含み、
   前記データベース中の各非結合性の分子内又は分子間接触が、タンパク質フォールドの対向する残基の間、又は高分子フォールドの対向するモノマーユニットの間、又は２つの相互作用する高分子パートナーの間の接触として定義され、具体的には前記フォールドの一方の側にあるシータ原子又は第１の相互作用するパートナーと、反対側のイオタ原子又は第２の相互作用するパートナーとの間に位置し、ここで下記の条件：
   ｓ−Ｒｗ≦ｔ、式中ｓは前記接触の２原子間の間隔であり、Ｒｗは前記接触の２原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離である
   が満たされる事例において、
   前記シータ原子種が、所与のシータ原子をイオタ原子として含む接触に関するデータを除いて、所与のシータ原子種についてステップｃ）で抽出されたシータ接触セットのデータと、任意のその他のシータ原子種についてステップｃ）で抽出された任意のその他のシータ接触セットのデータとの間で交差が存在しないように、ステップｂ）で一義的に識別される、上記方法。
2. ステップｃ）においてタンパク質メンバーの構造データベースから抽出された非結合性の分子内接触毎に、下記の条件：
   前記接触の前記シータ原子及び前記イオタ原子が、直鎖状ポリペプチドに沿って少なくとも４残基離れた異なる残基上にあるか、又は別のポリペプチド鎖上にあること
   も満たされる、請求項１に記載の方法。
3. 前記シータ原子種が、
   タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子、
   デオキシリボ核酸ポリマー（ＤＮＡ）の４種のヌクレオチド中に存在する８２個の非水素原子、
   メチル化されたＤＮＡヌクレオチド、シチジンホスフェート、及びアデノシンホスフェート中に存在する４２個の非水素原子、
   リボ核酸ポリマー（ＲＮＡ）の４種のヌクレオチドホスフェート中に存在する８５個の非水素原子、
   ＲＮＡの２−Ｏ’−メチル化リボースヌクレオチドホスフェート中に存在する８９個の非水素原子、
   最も一般的な、転写後塩基修飾されたＲＮＡ中に存在する４００個を超える非水素原子
   のうち一つのみとして識別される、請求項１又は２に記載の方法。
4. ステップｃ）で抽出された前記情報が、シータ原子種毎に、一つのみのシータ接触セットを含む二次データベース中で収集される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
5. 前記二次データベースのシータ接触セットのそれぞれが、複数の非重複イオタ原子種又は非重複の関連するイオタ原子種の群に細分化される、請求項４に記載の方法。
6. 前記イオタ原子種が、
   タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子、
   タンパク質に結合した、構造的に重要な水分子中に存在する酸素原子
   デオキシリボ核酸ポリマー（ＤＮＡ）の４種のヌクレオチド中に存在する８２個の非水素原子、
   メチル化されたＤＮＡヌクレオチド、シチジンホスフェート、及びアデノシンホスフェート中に存在する４２個の非水素原子、
   リボ核酸ポリマー（ＲＮＡ）の４種のヌクレオチドホスフェート中に存在する８５個の非水素原子、
   ＲＮＡの２−Ｏ’−メチル化リボースヌクレオチドホスフェート中に存在する８９個の非水素原子、及び／又は
   最も一般的な、転写後塩基修飾されたＲＮＡ中に存在する４００個を超える非水素原子
   のうち一つのみとして識別される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 事前に決定された関連するイオタ原子種の群が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を、類似した化学的種類の群に分類することにより取得された複数の非重複群の１つに該当する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
8. イオタ原子種が、原子種の元素的性質、原子種の混成状態のうちの１つ又は複数の因子に基づき、複数の非重複群に分類される、請求項７に記載の方法。
9. イオタ原子種が、Ｃｓｐ^３、Ｃｓｐ^２（芳香族）、Ｃｓｐ^２（非芳香族）、Ｎｓｐ^３、Ｎｓｐ^２、Ｏｓｐ^３、Ｏｓｐ^２、Ｓを含む複数の非重複群に分類される、請求項７又は８に記載の方法。
10. ステップｃ）で抽出された前記空間的データが、シータ原子の位置及び第３と第４の原子の位置を幾何学的に参照することにより、シータ接触セット中で特定された各イオタ原子の位置を定義し、
    第３の原子がシータ原子と共有結合しており、
    第４の原子が、第３の原子と共有結合している、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
11. シータ接触セット中で特定されたイオタ原子それぞれについて、ステップｃ）で抽出された前記空間的データが、シータ原子の位置及び第３と第４の原子の位置を幾何学的に参照することにより第５及び第６の原子の位置を定義し、
    第５の原子が、イオタ原子と共有結合しており、
    第６の原子が、第５の原子又はイオタ原子のいずれかと共有結合している、請求項１０に記載の方法。
12. ステップ（ｄ）の前記標的の部位内又はその周辺に重ね合わせるステップが、
    前記所与のイオタ原子種又は１つ若しくは複数の前記事前に決定された関連するイオタ原子種の群を含む接触について空間的データを抽出するために、シータ接触セットをパーシングするステップと、
    ｉ）前記接触のシータ原子が、前記標的の結合部位内の対応するシータ原子の位置に存在する場合、及びｉｉ）前記接触の第３及び第４の原子が、前記標的の結合部位内の対応するシータ原子の第３及び第４の原子の位置に存在する場合、イオタ原子種それぞれ、又は１つ若しくは複数の事前に決定された関連するイオタ原子種の群それぞれがどこに位置するかを表す理論的場所を決定するために、この空間的データをプロッティングするステップと
    を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 抽出された前記空間的データが、前記プロッティングするステップの前に、前記文脈データと対比してパーシングされる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記所与のイオタ原子種又は１つ若しくは複数の前記事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関する理論的場所の密度が事前に決定された閾値を上回るような領域が、前記好ましい領域の１つとして識別される、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記所与のイオタ原子種又は１つ若しくは複数の前記事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関する理論的場所が、前記標的リスト上の複数のシータ原子について決定され、累積的な理論的場所の密度が事前に決定された閾値を上回るような領域が、好ましい領域の１つとして識別される、請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の方法。
16. 個々のイオタ原子の前記理論的場所が、Ｒｗ−０．２オングストロームより接近して前記標的高分子の原子の場所と交差する場合には、前記イオタ原子が、後続する解析から除外される、請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第３及び第４の原子が、特定されたシータ原子種毎に一義的に選択される、請求項１１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第５及び第６の原子が、特定されたイオタ原子種毎に一義的に選択される、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
19. 好ましい領域毎に、前記第５の原子の位置をその各イオタ原子に対して相対的に表示するベクトルを得て、前記領域内の理論的コンセンサスイオタ原子について、その共有結合の予測を表す好ましい結合ベクトルを識別するために、前記ベクトルについて解析を実施し、識別された前記好ましい結合ベクトルを、前記候補リガンドの設計又は前記候補リガンドに対する修飾を洗練化するのに用いる、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
20. ステップ（ｃ）で抽出された前記文脈データが、シータ接触セット中の各接触の組について局所的環境に関する文脈情報を含有し、前記文脈情報には、二次構造、前記接触の組を構成するアミノ酸の種類又はその他のモノマーの種類、前記接触のいずれか一方の側にあるポリマー鎖内の隣接するモノマーユニット及び／又はそのローカルな幾何学的配置、前記接触のいずれか一方の側にあるポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸、前記隣接するモノマーユニット又はアミノ酸のローカルな幾何学的配置、シータ原子の温度因子、イオタ原子の温度因子、シータ原子の接近可能な表面積、イオタ原子の接近可能な表面積、特定のシータ原子に関する異なるイオタ原子の接触数、及びシータ原子と同一のモノマーユニット上にあるその他のシータ原子の数のうちの１つ又は複数が、任意の組み合わせで含まれる、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
21. ステップ（ｆ）が、前記候補リガンドの１つ又は複数の原子と、前記結合部位内のイオタ原子種又は事前に決定された関連するイオタ原子種の群に関する予測された好ましい領域（単数又は複数）との間の重複度を増加させるような、前記候補リガンドの修飾を識別するステップを含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
22. 前記候補リガンドに対する複数の修飾が、ステップ（ｆ）で識別され、前記方法が、１）前記代替的及び／又は追加的候補リガンド原子と各イオタ原子種の好ましい領域との間の交差の程度が、非修飾候補リガンドと比較してそれよりも大きいこと、並びに２）１つ又は複数の因子が修飾された前記候補リガンドが前記結合部位に結合することにより形成された複合体の総エネルギーに寄付する程度が、非修飾候補リガンドが結合した場合と比較してそれよりも減少することのうちの１つ又は両方に基づき、識別された修飾のサブセットを選択するステップを更に含む、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
23. ｔ＝２．５オングストロームである、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
24. ｔ＝０．８オングストロームである、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
25. ステップ（ｆ）で識別された修飾を表すデータをアウトプットするステップを更に含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
26. 前記リガンドが、タンパク質である、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
27. 前記リガンドが、抗体である、請求項２６に記載の方法。
28. ステップ（ｆ）が、前記標的の結合部位と直接接触する、又は前記標的の結合部位近傍にある前記リガンドの１つ又は複数のアミノ酸残基のそれぞれを、他の１９種の天然アミノ酸から選択された１つ又は複数の代替的残基のそれぞれと置換するステップであって、各置換は残基置換と呼ばれる上記ステップを含み、
    置換残基と前記リガンド又は標的の隣接原子との間に干渉を引き起こさない残基置換毎に、前記置換残基の各原子の種類及び位置を、各イオタ原子種の好ましい領域と比較して、前記置換残基がオリジナルの残基の原子より多くの交差を生成するかどうか識別する、請求項２６又は２７に記載の方法。
29. オリジナルの残基の原子より多くの交差を生成するものとして識別される残基置換のリストをアウトプットするステップと、
    リスト化された残基置換毎に、前記候補リガンドの突然変異を用いて、前記残基置換が組み込まれた修飾リガンドを生成するステップと、
    どの残基置換が事前に決定された閾値を上回る親和力の改善を引き起こすか判定するために、前記標的の結合部位に対する各修飾リガンドの親和力を試験するステップと
    を更に含む、請求項２８に記載の方法。
30. 事前に決定された閾値を上回る親和力の改善を引き起こすものと判定された複数の残基置換が組み込まれるように、前記候補リガンドを修飾するステップ
    を更に含む、請求項２９に記載の方法。
31. 請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法を、コンピューターに実施させるためのコンピューター読み取り可能なインストラクションを含むコンピューター読み取り可能なメディア又はシグナル。
32. 前記コンピューターに、少なくともステップ（ｃ）〜（ｅ）を実施させる、請求項３１に記載のメディア又はシグナル。
33. 前記コンピューターに、少なくともステップ（ｆ）を実施させる、請求項３１又は３２に記載のメディア又はシグナル。
34. 請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法に基づき、治療リガンドを設計するステップと、
    そのように設計された治療リガンドを製造するステップと
    を含む、治療リガンドの製造方法。
35. 請求項３４に記載の方法に基づき製造された治療リガンド。
36. 前記リガンドが、タンパク質である、請求項３４又は３５に記載の方法又はリガンド。
37. 前記タンパク質が、抗体である、請求項３６記載の方法又はリガンド。
38. 高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法において用いるために、データベースを作成する方法であって、
    タンパク質又は高分子のシータ原子と呼ばれる第１の原子と、イオタ原子と呼ばれる第２の原子との間で非結合性の分子内接触が生ずる事例を識別するために、複数のタンパク質又はその他の生物学的高分子それぞれに存在する原子の相対的な位置を分析するステップと、
    識別された接触毎に、シータ原子の種類、イオタ原子の種類、及びシータ原子に対するイオタ原子の相対的位置を特定するデータベースを作成するステップと
    を含み、
    非結合性の分子内接触が、下記の条件：
    ｓ−Ｒｗ≦ｔ、式中ｓはシータ原子とイオタ原子との間の間隔であり、Ｒｗはシータ原子とイオタ原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離で、一般的に２．５オングストローム、好ましくは０．８オングストロームであること、並びに
    タンパク質の場合、シータ原子及びイオタ原子は、直鎖状のポリペプチド上の互いに少なくとも４残基分離したアミノ酸残基上にあるか、又は別のポリペプチド鎖上にあること
    を満たすものとして定義される、上記方法。
39. 識別された接触の群が形成され、その接触では、シータ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子のうち一つのみであり、イオタ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を化学的類似性に基づき群に分類することより取得された複数の非重複群のうち一つのみの群に含まれるように、データベースを細分化するステップを含む、請求項３８記載の方法。
40. 高分子標的の結合部位に結合するリガンドを最初から設計するか、又は高分子標的の結合部位に対するリガンドの親和力を改善するためにリガンドに対する修飾を識別する方法において用いるために、データベースを作成する方法であって、
    タンパク質又は高分子のシータ原子と呼ばれる第１の原子と、イオタ原子と呼ばれる第２の原子との間で非結合性の分子内接触が生ずる事例を識別するために、複数のタンパク質又はその他の生物学的高分子それぞれに存在する原子の相対的な位置を分析するステップと、
    識別された接触毎に、シータ原子の種類、イオタ原子の種類、及びシータ原子に対するイオタ原子の相対的位置を特定するデータベースを作成するステップと
    を含み、
    非結合性の分子内接触が、下記の条件：
    ｓ−Ｒｗ≦ｔ、式中ｓはシータ原子とイオタ原子との間の間隔であり、Ｒｗはシータ原子とイオタ原子のファンデルワールス半径の合計であり、ｔは事前に決定された閾値距離で、一般的に２．５オングストローム、好ましくは０．８オングストロームであること
    を満たす事例として定義され、
    前記方法が、データベースを細分化して識別された接触の群を形成するステップであって、前記識別された接触の群において、シータ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子のうち一つのみであり、イオタ原子が、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を化学的類似性に基づき群に分類することより取得された複数の非重複群のうち一つのみの群に含まれる上記ステップを含む、上記方法。
41. 接触毎に、イオタ原子の位置が、シータ原子の位置及び第３と第４の原子の位置を幾何学的に参照することにより定義され、第３の原子がシータ原子と共有結合しており、第４の原子が第３の原子と共有結合しており、前記方法が、
    各接触のイオタ原子、シータ原子、第３の原子、及び第４の原子について、群としてそれらの座標を正規化して、正規化された座標の群を作成するステップと、
    １つ又は複数のシータ原子種毎に、シータ原子種及び所与のイオタ原子種を含む複数の接触について正規化された座標の群を用いて、所与のイオタ原子について、シータ原子と相対的に、緯度及び経度の方向でその方向の分布を表す２次元極座標プロットを作成するステップと、
    異なるイオタ原子種について上記ステップを繰り返すステップと、
    得られた２次元極座標プロットを比較して、類似した方向の分布が得られるようなイオタ原子種の群を識別し、そのような群を化学的類似性に基づく群として利用して、タンパク質の２０種の天然アミノ酸中に存在する１６７個の非水素原子を複数の非重複群に分類するステップと
    を更に含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
42. 少なくとも２０００種のタンパク質又はその他の生物学的高分子から接触情報を抽出するステップであって、抽出された前記情報が、少なくとも２００万例の接触原子の組に関する情報を含有する上記ステップを含む、請求項３８から４１までのいずれか一項に記載のデータベースを作成する方法。
43. 少なくとも１００００種のタンパク質又はその他の生物学的高分子から接触情報を抽出するステップであって、抽出された接触情報が、少なくとも１０００万例の接触原子の組に関する情報を含有する上記ステップを含む、請求項３８から４２までのいずれか一項に記載のデータベースを作成する方法。
44. 請求項１から４３までのいずれか一項に基づき作成されたデータベースを保管する、コンピューター読み取り可能なメディア。
45. 請求項１から３０までのいずれか一項に基づく方法、又は請求項３８から４３までのいずれか一項に基づき編纂されたデータベースを用いる方法であって、所与の抗体−抗原複合体について、抗原に対する抗体のより高い結合親和力を生成することが、抗体結合部位内又はその周辺のアミノ酸残基に対する特異的突然変異において予測される、上記方法。