KR20160019504A

KR20160019504A - 개선된 치료용 리간드 획득

Info

Publication number: KR20160019504A
Application number: KR1020167000533A
Authority: KR
Inventors: 지예 시; 테렌스 세와드 베이커; 알라스테어 데이비드 그리피스 로슨; 시아오펭 리우
Original assignee: 유씨비 바이오파마 에스피알엘
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-02-19
Also published as: US20210005277A1; AU2014280055A1; RU2016100234A3; WO2014198951A3; GB201310544D0; US20160125124A1; EP3008648B1; MX2015016822A; SG10201707917UA; CA2914726A1; BR112015031171A2; WO2014198951A2; CL2015003591A1; JP2016527481A; SG11201510084TA; EP3008648A2; CN105308602B; US11942188B2; RU2016100234A; HK1218579A1

Abstract

거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하는 것을 포함하는 방법 및 관련 장치, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위해 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법 및 관련 장치로서, 생체 거대분자의 데이터베이스로부터 추출되는, 비결합, 분자 내 또는 분자 간 원자 대 원자 접촉들에 대한 정보를 사용하여 특정 원자 형태를 위한 결합 부위에 인접한 우선 영역을 확인하고, 후보 리간드를 변형시켜 후보 리간드의 원자와 우선 영역 사이에 교차를 증가시키는 것을 포함한다. 방법들 중 1 단계 이상은 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다.

Description

개선된 치료용 리간드 획득{OBTAINING AN IMPROVED THERAPEUTIC LIGAND}

본 발명은 특히 현존 또는 후보 리간드가 표적 단백질 위 결합 부위에 리간드의 결합을 개선하기 위해 어떻게 변형될 수 있는 지를 결정함으로써 또는 전구체로서 후보 리간드의 치료용 리간드로 데 노버(de novo) 디자인을 도움으로써 개선된 치료용 리간드 획득에 관한 것이다.

치료용 분자(리간드)는 2종의 별개 부류: 화학 물질(또는 신규 화학 물질, NCE) 및 생물 제제로 나뉜다. 전자는 화학적으로 합성되거나 천연 산물로부터 단리된, 전형적으로 분자량이 500 돌턴 이하인 저 분자량 유기 화합물이다. 이들은 전형적으로 화학 라이브러리 또는 천연 산물 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견되는 출발 화학 제품 또는 '히트'(hit)로부터 유도된다. 이러한 히트는 전형적으로 표적에 차선의 결합 친화성이 있으며, (전형적으로 마이크로몰 이하의 낮은 친화 상수(K_D)의) 표적에 대한 양호한 친화성을 얻기 위해 화학적 개질에서 상당한 시행착오가 필요하다. 히트는 분자량이 더 낮아서, 말하자면 300 돌턴 이하이어서, 후속 화학적 개질이 500 돌턴 한계를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이들 히트는 흔히 '단편'(fragment)으로서 언급된다. 후보 치료용 또는 선도 분자를 얻는 히트의 최적화는 구조 정보에 의해; 예를 들어 히트 분자 또는 단편과 공착물(co-complex)에서 단백질의 x 선 결정 구조를 얻음으로써 크게 향상된다. 이러한 데이터는 표적 단백질 위에 소형 분자가 어디에 결합하는 지에 대해 통찰력을 제공하며, 중요하게는 둘 사이의 원자 상호 작용이 결합에 대해 어떻게 설명하지는 지를 나타낸다. 또한 결합된 히트를 즉시 둘러싸는 단백질 표면의 지형 특성을 드러내며; 특히 이것이 클레프트(cleft) 또는 포켓인 경우, 구조는 히트가 포켓 내 공간을 더 잘 충전하도록 정교해질 수 있는 방법 및 단백질과 추가 상호 작용하고, 따라서 결합 친화성과 특이성을 개선하는 방법을 제시할 것이다.

히트의 화학적 정교화를 위해 합리적 선택을 하는데 있어서 의약품 화학자를 돕는데 이용 가능한 다수의 컴퓨터 이용 알고리듬이 있다. 이들은 제1 원리(예를 들어 소프트웨어식 슈뢰딩거(RTM))로부터 소형 분자와 단백질 사이의 결합 자유 에너지를 계산하려는 물리학 이용 방법 또는 단백질 - 소형 분자 구조의 컬렉션(예를 들어 슈퍼스타(SuperStar))로부터 추출된 원자 상호 작용의 데이터베이스를 필요로 하는 통계 퍼텐셜 방법이다.

생물 제제는 대형 펩티드 또는 단백질 분자이다(분자량이 1000 돌턴보다 크다). 이들은 흔히 표적 분자를 인식하고, 이에 결합하는, 통상 NCE(나노몰 이하의 낮은 K_D)와 비교하여 더 좋은 친화성과 특이성이 있는, 항체 또는 항체와 같은 분자이다. 이들은 또한 다른 형태의 단백질 분자 예컨대 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 또는 가용성 수용체일 수 있다.

후보 생물 치료용 분자의 결합 부위에 결합은 후보 치료용 분자를 돌연변이시킴으로써 개질될 수 있다. 이는 결합 친화성을 개선하거나 결합 특이성을 변경하는데 필요할 수 있다. 그러나 돌연변이를 수행하고, 돌연변이 분자의 결합 효능을 시험하는 것은 비교적 시간 소모적이다. 결합 효능 개선을 얻기 전에 많은 상이한 돌연변이가 필요할 수 있다.

어느 종류의 개질이 가장 효과적일 수 있는지를 예상하는데 컴퓨터를 사용하는 것이 알려져 있다. 그러나 제공된 분자는 대다수의 방식으로 개질될 수 있으며, 실제 기간에 예상이 확실히 달성될 수 있도록 컴퓨터를 구성하는 것이 어렵다.

문헌[Laskowski R A, Thornton J M, Humblet C & Singh J (1996) "X-SITE: use of empirically derived atomic packing preferences to identify favourable interaction regions in the binding sites of proteins", Journal of Molecular Biology, 259, 175-201]에서는 단백질의 표면에서, 예컨대 이합체 인터페이스에서 또는 분자 인식 또는 결합 부위에서 상이한 원자 형태(atom type)에 대한 유리한 상호 작용 영역을 확인하기 위한 컴퓨터 이용 방법을 개시하고 있다. 라스코우스키(Laskowski) 외 그의 공동 연구가의 예상은 고 해상 단백질 구조에서 관찰된 비결합 분자 내 접촉(contact)에 대한 실험 데이터의 데이터베이스를 기초로 한다.

라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 접근법에서, 총 488개의 가능한 3 원자 단편을 얻는데 20개의 아미노산이 분해된다. 화학적 유사성을 고려하여 이들은 데이터베이스를 다시 나누는 163 단편 형태의 세트로 감소된다. 단편은 각각 제1 원자("위치 3"으로서 언급됨)를 함유하며, 2개의 추가 원자는 삼각 측량(또는 공간적 표준화) 위치를 한정한다. 밀도 함수는 한 원자("제2 원자"로서 언급될 수 있는)가 3 원자 단편의 제1 원자와 비결합 분자 내 접촉 상태에 있다고 알려지는 다양한 위치를 기록함으로써 유도된다.

제공된 원자 형태에 대한 예상된 유리한 상호 작용 영역은 밀도 함수를 결합 부위에 이식함으로써 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 문헌에서 얻어진다. 밀도 함수에 상응하는 3 원자 단편의 3개 원자의 좌표를 결합 부위에서 상응하는 3 원자 단편의 좌표에 중첩되도록 밀도 함수를 각각 이식한다. 결합 부위에서 상이한 3 원자 단편으로부터 밀도 함수가 겹치는 경우, 유리한 상호 작용 영역을 예상하는데 평균 "밀도"가 사용된다.

라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 접근법은 비교적 복잡하며, 잠재적으로 유용한 데이터를 버린다. 라스코우스키 외 그의 공동 연구가 문헌의 밀도 함수는 3-D 그리드에 각 단편 형태에 대한 제2 원자 접촉 위치를 추가함으로써 얻어진다. 상이한 그리드가 163개 단편 형태의 각각에 대해 사용된다. 그 후 제2 원자 형태에 대한 데이터를 수학적으로 전환시켜 밀도 함수를 제공한다. 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 단편 정의를 사용하여, 단편 형태를 동일 잔기 위 상이한 원자 및 상이한 잔기 위 원자가 분담할 수 있다. 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 데이터베이스가 이들 단편 형태에 조성된 경우, 밀도 함수를 결합 부위로 이식하는 단계에서 감량(down-weighting)을 필요로 하는 주쇄 단편의 과다가 존재한다. 또한, 제공된 단편 형태는 결합 길이와 각도에서 미세한 차이 및 이들 분할에서 조합될 때 차단되는 제2 원자 분포에서 수반하는 차이가 있는 일부 실제 단편을 포함할 수 있다.

라스코우스키 외 그의 공동 연구가 문헌에서 실험 데이터를 유도하는데 사용된 단백질에서 짧은 범위의 이차 구조는 치우칠 수 있으며, 실험 데이터가 유리한 상호 작용 영역을 나타내는 효율을 줄인다.

본 발명의 목적은 상기에 설명한 기술이 가진 문제점 중 적어도 하나를 다루는 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하기 위한, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위해 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법으로서,

(a) 표적 결합 부위의 표면을 형성하는 원자의 표적 리스트를 확인하는 단계;

(b) 표적 리스트에서, 이하 세타(theta) 원자로서 언급되는, 각 원자를 특정 세타 원자 형태로서 확인하는 단계;

(c) 생체 거대분자의 구조 데이터베이스로부터, 비결합, 분자 내 또는 분자 간 원자 대 원자 접촉들에 대한 정보를 추출하는 단계로서, 접촉하는 원자 쌍에서 제1 원자는 특정 세타 원자 형태이며, 이하 요타(iota) 원자로서 언급되는, 상기 쌍의 상대(opposing), 제2 원자는 특정 요타 원자 형태이고, 상기 정보는 세타 원자에 대한 요타 원자에 관한 공간 및/또는 전후상황(contextual) 데이터를 포함하며, 상기 데이터베이스로부터 제공된 세타 원자 형태의 다수 접촉을 위해 수집된 상기 데이터는 이하 세타 접촉 세트로서 언급되는 단계;

(d) 단계 (b)에서 표적 리스트 중 확인된 각 세타 원자에 대해, 단계 (c)에서 추출되는 상응하는 세타 접촉 세트로부터, 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 관한 데이터를 표적 결합 부위에서 또는 이 주위에 중첩시키는 단계;

(e) 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹이 높은 이론 경향(theoretical propensity)을 가지는 결합 부위의 1 이상의 우선 영역을 예상하는 방식으로 상기 중첩된 데이터를 조합하고/하거나 분석하는 단계; 및

(f) 결합 부위에 개념적으로 도킹된(docked) 후보 리간드를 이용하여, 후보 리간드의 1개 이상의 원자의 형태 및 위치를 각 요타 원자 형태에 대해 예상되는 우선 영역과 비교하여, 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 면에서 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이에 더 많은 교차를 생성할 후보 리간드에 대한 개질을 확인하는 단계로서, 개질되지 않은 후보 리간드와 비교하여 결합 부위에 대한 개질된 후보 리간드의 친화성에서 개선을 유도하는 단계를 포함하며,

데이터베이스에서 각 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉이 단백질 접힘(fold)의 상대 잔기 사이 또는 거대분자 접힘의 상대 단량체 단위 사이 또는 2개의 상호 작용하는 거대분자 파트너 사이의 접촉으로서 정의되고, 구체적으로 접힘의 일 측에서의 세타 원자 또는 제1 상호 작용 파트너와 상대 측에서의 요타 원자 또는 제2 상호 작용 파트너 사이이며;

한 경우에 하기 조건이 충족되고:

s -Rw≤t

(상기 식에서 s는 2개 접촉 원자 사이의 간격이며, Rw는 2개의 접촉 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 미리 결정된 한계 거리임);

세타 원자 형태는, 요타 원자로서 제공된 세타 원자를 수반하는 접촉에 관한 데이터를 제외하고, 제공된 세타 원자 형태에 대해 단계 (c)에서 추출되는 세타 접촉 세트의 데이터와 임의의 다른 세타 원자 형태에 대해 단계 (c)에서 추출되는 임의의 다른 세타 접촉 세트의 데이터 사이에 교차가 존재하지 않도록 단계 (b)에서 유일하게 확인되는 방법이 제공된다.

따라서 결합 부위에서 각 표적 원자 형태는 유일하게 분류되며, 특이하고, 임의의 다른 원자 형태(요타 원자로서 표적 원자 형태 자신을 포함하는 이들 접촉을 제외하고)와 관련되는 접촉 세트와 겹치지 않는, 구조 데이터베이스로부터 추출된 접촉 세트에 대한 정보와 연관된다. 이는 결합 부위에서 한 표적 원자를 기초로 결정되는, 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 대한 이론 위치의 분포가 예를 들어 결합 부위에서 또 다른 표적 원자를 기초로 결정되는, 요타 원자 형태, 또는 관련 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 대한 이론 위치의 분포와 더 효과적으로(예를 들어 증량 없이) 조합되어(예를 들어 합계함으로써) 요타 원자 형태 또는 관련 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 대한 1 이상의 우선 영역의 향상된 예상을 제공할 수 있다. 또한 결합 부위에서 표적 원자가 각각 유일하게 분류되므로, 결합 길이 또는 각도에서 고려할 변화가 없으며, 따라서 제공된 요타 원자의 이론 위치가 더 정확하다.

일 실시형태에서, 삼각 측량의 목적으로 인접하는 원자들을 유일하게 확인하는데 간단한 규칙이 적용된다. 예를 들어 접촉 형태가 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 163개 3 원자 단편 형태 면에서 특징이 있는 곳에 필요한, 인접하는 원자들의 화학 특성에 대해 어떠한 가정도 필요하지 않다.

일 실시형태에서, 단계 (c)에서 추출되는 공간 데이터는 세타 원자의 위치 및 제3 원자 및 제4 원자의 위치를 기하학적으로 참조함으로써 세타 접촉 세트에 규정되는 요타 원자 각각의 위치를 한정하며, 여기서 제3 원자는 세타 원자에 공유 결합되고, 제4 원자는 제3 원자에 공유 결합된다. 이러한 실시형태의 일예에서, 세타 접촉 세트에 규정되는 각 요타 원자에 대해, 단계 (c)에서 추출되는 상기 공간 데이터는 세타 원자의 위치 및 제3 원자 및 제4 원자의 위치를 기하학적으로 참조함으로써 제5 원자 및 제6 원자의 위치를 추가로 한정하며, 여기서 제5 원자는 요타 원자에 공유 결합되며, 제6 원자는 제5 원자 또는 요타 원자에 공유 결합된다.

일 실시형태에서, 단계 (d)의 표적 부위에서 또는 이 주위에서 중첩은 세타 접촉 세트를 분석하여 제공된 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 1 이상을 포함하는 접촉을 위한 공간 데이터를 추출하는 단계; 및 i) 접촉 세타 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 위치에서 발견되었고; ii) 접촉 제3 원자 및 제4 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 제3 원자 및 제4 원자의 위치에서 발견되었다면 이러한 공간 데이터를 플로팅(plotting)하여 각 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상이 각각 발견될 곳을 나타내는 이론 위치를 정하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 공간 데이터는 플로팅 단계 전에 전후상황 데이터에 대해 분석된다.

일 실시형태에서, 요타 원자 형태(또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상)를 위한 이론 위치 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역이 우선 영역 중 한 영역으로서 확인된다. 이러한 실시형태의 일예에서, 제공된 요타 원자 형태를 위한, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상을 위한 이론 위치는 표적 리스트 위 다수의 세타 원자를 위해 결정되며, 누적 이론 위치 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역이 우선 영역 중 한 영역으로서 확인된다.

따라서 이론 위치는 이론 위치 밀도가 우선 영역을 예상하는 목적으로 얻어지기 전에 결합 부위에서 상이한 원자로부터 누적적으로 조합된다. 이는 제공된 위치에 정해지는, 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 제공된 그룹의 확률에 대한 더 정확한 통계적 표시를 얻으며, 그 이유는 이것이 균형 잡히고, 편향되지 않은 방식으로 결합 부위에서 모든 관련 원자 형태로부터 기여를 고려하기 때문이다. 비교하여, 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 문헌에서, 밀도 함수는 3 원자 단편의 그룹에 대해 유도된다. 각 원자는 3 원자 단편의 몇몇 상이한 그룹과 관련될 수 있으며, 따라서 본 발명의 실시형태와 비교할만한 방식으로 밀도 함수를 함께 간단히 더하는 것이 가능하지 않다. 대신에, 밀도 함수를 조합하기 전에 증량 및/또는 평균화를 수행하는 것이 필요하며, 이는 복잡성을 증가시키고/시키거나 정확도를 줄인다.

일 실시형태에서 4개 이상의 잔기에 의해 서로 분리되는 원자 사이의 접촉만이 우선 영역을 확인하는데 사용된다. 이는 짧은 범위의 이차 구조로 인한 바이어스를 상당히 줄이거나 방지한다. 일 실시형태에서, 접촉 데이터는 두드러지게 긴 범위의, 전반적인 접힘 단백질(across-fold protein) 데이터를 나타낸다.

본 발명의 추가 양태에서, 거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하기 위한, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위해 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법에 사용하기 위한 데이터베이스 생성 방법으로서,

단백질 또는 거대분자 중 세타 원자로서 언급되는 제1 원자, 및 요타 원자로서 언급되는 제2 원자 사이에 비결합 분자 내 접촉의 경우를 확인하기 위해 다수의 단백질 또는 다른 생체 거대분자에서 각각 원자의 상대 위치를 분석하는 단계; 및

각 확인된 접촉에 대해 세타 원자의 형태, 요타 원자의 형태, 및 세타 원자에 대해 요타 원자의 위치를 명기하는 데이터베이스를 생성하는 단계를 포함하며;

비결합 분자 내 접촉은 하기 조건이 충족되는 경우로서 정의되며:

s -Rw≤t

(상기 식에서 s는 세타 원자와 요타 원자 사이의 간격이며, Rw는 세타 원자와 요타 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 전형적으로 2.5 옹스트롬 및 바람직하게는 0.8 옹스트롬의 미리 결정된 한계 거리임);

단백질의 경우에, 세타 원자 및 요타 원자는 선형 폴리펩티드 위 적어도 4개 잔기에 의해 서로 분리되는 아미노산 상에 있거나 별도의 폴리펩티드 사슬 상에 있는 방법이 제공된다.

s -Rw≤t

데이터베이스를 다시 나누어 세타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자 중 유일하고, 요타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자를 분류함으로써 얻어지는 다수의 겹치지 않는 그룹 중 유일한 확인된 접촉 그룹을 화학적 유사성에 기초한 그룹으로 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

이제 본 발명의 실시형태를 상응하는 부호가 상응하는 부분을 나타내는 첨부 도면과 관련하여 단지 예로서 설명할 것이며, 여기서
도 1은 좌표 표준화에 사용되는, 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉에서 원자들 및 인접하는 원자들에 대한 본보기 명명의 개략도이며;
도 2-6은 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉에서 원자에 대한 좌표 표준화 방법을 도시하고;
도 7은 거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하거나, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위해 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법에서 단계를 도시하는 플로차트이며;
도 8은 경쇄 트레오닌 30의 아르기닌 30으로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이고;
도 9는 경쇄 아르기닌 54의 세린 54로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이며;
도 10은 경쇄 세린 56의 이소류신 56으로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이고;
도 11은 경쇄 세린 60의 아스파르테이트 60으로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이며;
도 12는 경쇄 트레오닌 72의 아르기닌 72로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이고;
도 13은 IL17F에 대한 180배 향상된 친화성을 얻는 항체 496i 경쇄에서 5개 돌연변이의 조합을 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이며;
도 14는 Fab의 VH-VL 인터페이스에서 점 돌연변이의 효과를 예상하는 방법에서 단계를 도시하는 플로차트이고;
도 15는 중쇄 트레오닌 71의 아르기닌 71로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이며;
도 16은 경쇄 세린 107의 글루탐산 107로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이고;
도 17은 경쇄 트레오닌 109의 이소류신 109로 돌연변이를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이며;
도 18은 81.2℃의 Tm을 얻는 Fab X에서 3개 돌연변이의 조합을 도시하는 컴퓨터 생성 가시화이다.

세계 단백질 데이터 뱅크(wwPDB, Worldwide Protein Data Bank)에서는 국제 사회가 자유롭고, 공개적으로 이용 가능한 거대분자 구조 데이터의 보관소를 유지하고 있다. 2013년 5월까지 이러한 데이터세트는 90,000 구조의 이정표에 도달하였다. 이들 거대분자 대부분은 대다수가 X선 결정학에 의해 측정된 단백질이다. 따라서 기탁 데이터는 각 단백질 구조를 구성하는 개별 원자의 직교 좌표의 형태로 원자 수준에서 3차원 데이터를 포함한다.

본 발명자들은 신규 치료법의 디자인에 도움이 되도록 적용될 수 있는 이러한 보관소로부터 유용한 정보를 추출하는 것이 가능하다고 가정하였다. 초기 단백질의 폴리펩티드 사슬은 현저히 재현 가능한 방식으로 복잡한 3차원 3차 및 4차 구조로 접혀 성숙 단백질을 얻었다. 단백질의 이차 구조, 나선, 베타 시트(beta-sheet) 및 회전(turn)과 같은 요소의 형성에 영향을 미치는 상호 작용이 알려져 있다. 그러나 고차의 단백질 접힘을 예상하는 규칙은 잘 이해되고 있지 않다. 그럼에도 본 발명자들은 동일한 분자 내에서, 예를 들어 단백질 접힘의 상대 면 위에서, 또는 상이한 분자 위에서 비결합하지만 "접촉하는" 원자의 상호 작용을 지배하는 정확한 규칙이 있어야 한다고 파악하였다.

일 실시형태에서, 생체 거대분자의 구조 데이터베이스(예를 들어 wwPDB)를 분석하여 이러한 규칙을 추출하고, 약물 발견을 용이하게 하는데 규칙을 적용한다. 이러한 방법의 예가 하기에 기재된다.

일 실시형태에서, 접촉 원자(각각 "세타" 원자 및 "요타" 원자로서 언급됨)의 비결합 쌍이 거대분자의 구조 데이터베이스(예를 들어 wwPDB)에서 각 거대분자(예를 들어 단백질), 또는 모든 거대분자보다 더 작은 서브세트에 대해 확인된다. 이러한 접촉은 예를 들어 단백질 접힘의 상대 잔기들 사이에서 또는 거대분자 접힘의 상대 단량체 단위들 사이에서(거대분자 구조의 별도 사슬 사이에서) 또는 2개의 상호 작용하는 거대분자 파트너 사이에서 일어날 수 있다. 각 접촉은 접힘의 한 면 위 세타 원자 또는 제1 상호작용 파트너 및 상대 면 위 요타 원자 또는 제2 상호작용 파트너 사이에 있는 것으로서 분류된다.

일 실시형태에서, 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉은 하기 조건이 충족되는 경우로서 정의된다: 1) s -Rw≤t, 상기 식에서 s는 2개 접촉 원자 사이의 간격이며, Rw는 2개의 접촉 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 미리 결정된 한계 거리임; 및 임의로 또한 하기 조건: 2) 2개의 접촉 원자는 선형 폴리펩티드 사슬을 따라 적어도 4개 잔기에 의해 서로 분리되거나 별도의 폴리펩티드 사슬 상에 있음. 일 실시형태에서, 미리 결정된 거리는 2.5 옹스트롬이다. 또 다른 실시형태에서, 미리 결정된 거리는 1.5 옹스트롬이다. 또 다른 실시형태에서, 미리 결정된 거리는 1.0 옹스트롬이다. 또 다른 실시형태에서, 미리 결정된 거리는 0.8 옹스트롬이다.

하기 설명에서, "접촉"에 대한 어떠한 언급도 상기에 제공된 정의에 따라 "비결합 분자 내 접촉 또는 분자 간 접촉"을 의미하는 것으로 이해된다.

wwPDB와 같은 데이터베이스는 서로 매우 유사하고/하거나 관련 구조를 가지는 단백질에 대한 정보를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 데이터베이스는 이러한 유사성/관계에 의해 야기되는 경향을 피하고/줄이기 위해 분석된다. 일 실시형태에서, 서열 상동성에 기초하여, 예를 들어 유사한/관련 단백질의 각 패밀리의 단지 하나의 대표 구조가 분석을 위해 선택되도록 수행된다. 추가로 또는 대안으로, 1 이상의 추가 선택 기준이 사용될 수 있으며, 예를 들어 고 해상 및 저온 인자 구조가 일체화될 수 있다.

일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 생체 거대분자의 (일차) 구조 데이터베이스(예를 들어 wwPDB)로부터 출발하여 구성된다. 이차 데이터베이스는 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉에 대한 정보를 포함한다. 일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 1백만 초과의 접촉 쌍, 임의로 5백만 초과의 접촉 쌍, 임의로 1천 1백만 초과의 접촉 쌍에 대한 정보를 포함한다. 일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 대략 20,000 비상동 단백질로부터 추출된 1천 5백만 초과의 접촉 원자 쌍으로부터 정보를 포함한다.

일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 접촉 쌍의 정확한 원자 형태에 대한 정보를 포함한다. 일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 요타 원자에 대한 세타 원자의 3차원 관계를 한정하는 공간 데이터를 포함한다. 일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 또한 접촉의 국소 환경에 관한 전후상황 데이터를 포함한다. 일 실시형태에서, 전후상황 데이터는 이차 구조, 접촉 쌍을 포함하는 아미노산 형태 또는 다른 단량체 형태, 접촉 양측에서 중합체 사슬 내 인접 단량체 단위 및/또는 이의 국소 형상, 접촉 양측에서 폴리펩티드 사슬에서 인접 아미노산, 상기 인접 단량체 단위 또는 아미노산의 국소 형상, 세타 원자의 온도 인자, 요타 원자의 온도 인자, 세타 원자의 접근 가능한 표면적, 요타 원자의 접근 가능한 표면적, 특정 세타 원자에 대한 상이한 요타 원자 접촉 수 및 세타 원자와 동일한 단량체 단위 위 다른 세타 원자 수 중 1 이상을 임의 조합으로 포함하여, 각 접촉 쌍의 국소 환경에 관한 정보를 포함한다.

일 실시형태에서, 접촉 쌍 및 공유 결합된 인접 원자의 3-D 좌표는 그룹으로서 하기에 기재된 바와 같이 공통 데이터베이스 기준 좌표계로 표준화된다. 이는 가능한 기본적인 접촉 패턴 또는 규칙의 후속 분석 및 임의의 이러한 규칙의 약물 디자인에 적용을 단순화한다.

일 실시형태에서, 세타 원자 형태는 단백질의 20개 천연 아미노산 구성 단위를 구성하는 167개 공유 원자 형태(수소 제외)(이 경우에 이차 데이터베이스는 따라서 분할될 수 있으며, 27889(167 x 167) 이하의 상이한 접촉 형태에 대한 정보를 포함할 수 있다); 및/또는 데옥시리보핵산 중합체(DNA)의 4개 뉴클레오티드에 존재하는 82개 비수소 원자; 및/또는 메틸화 DNA 뉴클레오티드, 시티딘 인산 및 아데노신 인산에 존재하는 42개 비수소 원자; 및/또는 리보핵산 중합체(RNA)의 4개 뉴클레오티드 인산에 존재하는 85개 비수소 원자; 및/또는 RNA의 2-O'-메틸화 리보스 뉴클레오티드 인산에 존재하는 89개 비수소 원자; 및/또는 가장 흔한 전사 후 염기 변형 RNA에 존재하는 400개 초과 비수소 원자 중에서 유일한 것으로서 확인된다.

일 실시형태에서, 요타 원자 형태는 단백질의 20개 천연 아미노산 구성 단위를 구성하는 167개 공유 원자 형태(수소 제외); 및/또는 구조적으로 관련 있는, 단백질 결합 물 분자(이는 유용할 수 있으며, 그 이유는 일차 데이터베이스에서 결정 구조는 흔히 구조적으로 관련 있는 물 분자를 함유하며, 즉 특정 단백질 원자는 결합된 물 분자와 한정된 상호작용을 보여주기 때문임)에 존재하는 산소 원자; 및/또는 데옥시리보핵산 중합체(DNA)의 4개 뉴클레오티드에 존재하는 82개 비수소 원자; 및/또는 메틸화 DNA 뉴클레오티드, 시티딘 인산 및 아데노신 인산에 존재하는 42개 비수소 원자; 및/또는 리보핵산 중합체(RNA)의 4개 뉴클레오티드 인산에 존재하는 85개 비수소 원자; 및/또는 RNA의 2-O'-메틸화 리보스 뉴클레오티드 인산에 존재하는 89개 비수소 원자; 및/또는 가장 흔한 전사 후 염기 변형 RNA에 존재하는 400개 초과 비수소 원자 중에서 유일한 것으로서 확인된다.

접촉 쌍에서 상대 원자가 접촉 위 양측으로부터 관찰되고, 기록된다. 본보기 실시형태에서 명명이 하기에 기재되며, 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

접촉 기준 측면 위 원자는 세타 원자(1)로 일컬어지며, 반면에 상대 원자는 요타 원자(2)로 일컬어진다. 이러한 예에서, 3-D 좌표를 표준화하는데 사용되는 추가 원자는 다음과 같이 정의된다. 세타 원자(1)가 이 아미노산의 C 알파 원자의 방향으로 공유 결합되는 다음 원자는 제3 원자(3)로서 언급되며, 다시 다음 원자는 제4 원자(4)로서 언급된다. 제4 원자(4)는 제3 원자(3)에 공유 결합된다. 요타 원자(2)가 각 아미노산의 C 알파 원자의 방향으로 공유 결합되는 다음 원자는 제5 원자(5)로 일컬어지며, 다시 다음 원자는 제6 원자(6)로 일컬어진다. 제6 원자는 제5 원자 또는 요타 원자(2)에 공유 결합되고 있다.

일 실시형태에서, 모호의 경우를 피하기 위해, 제3 원자 및 제4 원자가 각각 규정된 세타 원자 형태에 대해 유일하게 선택된다. 일 실시형태에서, 제5 원자 및 제6 원자가 또한 유일하게 선택된다. 일 실시형태에서, 하기 관례가 적용된다. 세타 원자(1)가 우연히 C 알파 원자인 경우, 제3 원자와 제4 원자는 각각 주쇄 카르보닐 탄소 원자와 산소 원자이다. 세타 원자(1)가 주쇄 카르보닐 탄소인 경우, 제3 원자(3)와 제4 원자(4)는 각각 C 알파 탄소 및 주쇄 질소이다. 세타 원자(1)가 주쇄 질소인 경우, 제3 원자(3)와 제4 원자(4)는 각각 C 알파 탄소 및 주쇄 카르보닐 탄소이다. 세타 원자(1)가 C 베타 탄소 원자인 경우, 제3 원자(3)와 제4 원자(4)가 각각 C 알파 탄소 및 주쇄 카르보닐 탄소이다. 제3 원자 및 제4 원자 위치에 대한 2개의 입실론 탄소 원자의 선택인 페닐알라닌과 티로신 측쇄에서, 주쇄 질소 원자에 가장 가까운 원자가 선택된다.

일 실시형태에서, 각 접촉에 대한 좌표 표준화는 세타, 요타, 제3 원자 및 제4 원자, 임의로 또한 제5 원자 및 제6 원자 위에서 그룹으로서 수행되며, 그 결과 이들의 3-D 관계가 유지된다. 얻어진 표준화 좌표는 표준화 좌표 그룹으로 언급될 수 있다. 일 실시형태에서, 이는 도 2-6에 도시된 바와 같이, 하기 단계들을 차례차례 수행함으로써 달성된다.

도 2에서는 일차 데이터베이스(예컨대 wwPDB)에서 제공된 좌표에 따라, x 축, y 축 및 z 축에 관해 정의되는, 기준 좌표계에 대해 위치한 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉 중 세타 원자(1), 제3 원자(3) 및 제4 원자(4)를 도시한다. 본보기 좌표 표준화 방법의 제1 단계에서, 원자 그룹 좌표가 옮겨져서 세타 원자(1)가 제로 좌표에 놓인다(도 3). 다음에, 제3 원자(3)가 y=0에 있을 때까지 그룹을 전체적으로 z 축에 대해 회전시킨다(도 4). 다음에, 제3 원자가 y=0 및 z=0에 있을 때까지 y 축에 대해 그룹을 회전시킨다(도 5). 다음에, 제4 원자(4)가 y=0에 있을 때까지 그룹을 x 축에 대해 회전시키고, 그룹은 전체적으로 x-y 평면에 놓인다(세 원자 모두 y=0에 놓임; 도 6). 이러한 방식으로 167개 제1 원자 형태는 각각 그 형태에 대해 중첩될 수 있으며, 따라서 이차 데이터베이스는 다시 나누어질 수 있다. 차례로 제1 원자 분할은 각각 167개 요타 원자 형태로 다시 나누어질 수 있으며, 각 세타 원자 형태에 대해 각 요타 원자 형태의 공간 분포에 대한 분석을 용이하게 할 수 있다.

일 실시형태에서, 명목상 상이한 요타 원자 형태에 대한 분포 패턴 사이의 유사성을 확인하기 위해 세타 원자에 대해 요타 원자의 분포 패턴을 분석한다. 이러한 방법으로, 특이한 요타 원자 형태(예를 들어 상기에 언급된 167개 공유 원자 형태)가 다수의 그룹(여기서 "관련 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹"으로 언급됨)으로 조합되어 데이터의 후속 사용을 단순화할 수 있다. 분포 패턴의 유사성에 따라 원자 형태를 함께 그룹화 함으로써 예를 들어 도 7에 관해 하기에 기재된 방법과 관련된 계산 부하를 줄이며, 따라서 속도를 증가시키고/시키거나 하드웨어 비용을 줄인다.

일 실시형태에서, 이 방법은 직교 좌표보다 극 좌표를 사용함으로써 단순화된다(일 실시형태에서, 이는 예를 들어 일차 데이터베이스의 데이터가 직교 좌표를 사용하여 표시되는 곳에서 직교 좌표와 극 좌표 사이에 전환 프로세싱을 수행함으로써 달성된다). 일 실시형태에서, 2차원 극 좌표가 사용되며, 세타 원자와 요타 원자의 상대 위치를 단지 2개의 편각 θ(세타) 및 φ(파이)(구 위에서 위도와 경도에 상응함) 면에서 규정한다. 얻어진 2차원 위도-경도 플롯은 세타 원자와 요타 원자 사이의 거리에서 변화에 대해 어떠한 정보도 보여주지 않는다. 그러나 이러한 거리는 비교적 일정하다고 알려져 있으며, 그 결과 세타-파이 플롯은 접촉에 관한 대부분의 관련 정보를 포함한다. 3차원이 아니라 2차원에서 문제에 대한 분석을 줄이는 것은 후속 분석의 효능을 크게 향상시킨다. 일 실시형태에서, 요타 원자의 상대 위치에서 변화를 예시하는데 등고선이 사용된다. 등고선은 세타 원자 및 요타 원자의 상대 위치 결정에 대한 일정한 "밀도" 또는 확률의 선을 나타낼 수 있다.

이러한 편각 플롯의 분석으로 요타 원자 주파수의 패턴을 좌우하는 특히 중요한 인자가 요타 원자의 원소 특성과 혼성 상태, 즉 C sp3, C sp2(방향족), C sp2(비방향족), N sp3, N sp2, O sp3, O sp2 또는 S라는 사실이 밝혀졌다. 그 결과, 이들 확인된 8개 그룹에 따라 167개 원자 형태를 그룹화 함으로써 분석 효능을 개선하는 것이 가능하다. 다른 실시형태에서, 상이한 그룹화가 사용될 수 있다.

일반적으로, 접촉 주위에서 환경 요인, 예컨대 인접 아미노산의 특성은 이차 구조를 제외하고, 요타 주파수 패턴에 대해 차이가 없게 한다. 예상될 수 있는 바와 같이 주쇄 아미드 질소 세타 원자 대 주쇄 산소 요타 원자 및 그 반대의 주파수 패턴은 이차 구조에 의해, 특히 이들이 베타 시트 유래인지 여부에 관해 왜곡된다.

일 실시형태에서, 이차 데이터베이스는 접촉 데이터에 국소 이차 구조 형태(나선, 베타 시트 또는 랜덤 코일)를 부가한다. 이는 후기 단계에서 접촉 패턴에 대한 이차 구조의 잠재적인 영향을 차별화하기 위한 근거를 제공한다.

일 실시형태에서, 상기를 근거로 결합 부위에 리간드의 결합 강도, 또는 친화성을 향상시키는 리간드에 대한 변화의 확인을 돕는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 이 방법은 NCE 또는 바이오 의약품 디자인을 돕는데 사용된다. 전자에 관해서, 이 방법은 표적 단백질의 잠재적인 약물 결합 부위에서 '핫스폿' 또는 약리작용단 원자 위치를 예상하는데 유용할 수 있다. 이는 데 노버 약물 디자인을 용이하게 할 수 있다. 결합 부위에서 결합된 화학 물질의 이용 가능한 구조가 있는 상황에서, 이 방법은 화학의 정교화를 위한 원자형태와 위치를 제안하여 결합 특성이 더 양호한 리간드를 얻을 수 있다. 항체와 같은 단백질 약물의 경우에, 이 방법은 결합 친화성 또는 특이성에서 향상을 유도할 단백질 또는 항체 결합 부위에서 돌연변이를 예상하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 거대분자의 특성을 향상시키는 거대분자 구조 내 변형을 위한 위치를 제안하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 섹션에서 예시되는 바와 같이, 이 방법은 항체의 내열성을 개선하기 위해 항체 VH 및 VL 사슬 내에 점 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 돌연변이가 별도 사슬 상에 있지만, 여전히 항체 거대분자 내에 있다.

도 7에서는 거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하거나, 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 향상시키기 위한 리간드에 대한 변형을 확인하는 본보기 방법을 도시한다.

단계 S1에서, 예를 들어 국소 또는 원격 메모리 디바이스(5)로부터 표적 단백질의 표적 결합 부위를 나타내는 데이터가 얻어진다. 표적 결합 부위의 표면을 형성하는 원자의 표적 리스트가 확인된다.

단계 S2에서, 표적 리스트 중 각 원자는 특정 세타 원자 형태로서 확인된다.

단계 S3에서, 원자의 접촉하는 쌍에서 제1 원자가 특정 세타 원자 형태이고, 쌍의 상대, 제2 원자가 특정 요타 원자 형태인 비결합, 분자 내 또는 분자 간 접촉에 대해, 예를 들어 국소 또는 원격 메모리 디바이스(7)에 의해 제공되는, 생체 거대분자의 구조 데이터베이스(예를 들어 wwPDB)로부터 정보가 추출된다. 추출된 정보는 세타 원자에 대해 요타 원자에 관한 공간 및/또는 전후상황 데이터를 포함한다. 데이터는 제공된 세타 원자 형태의 다수 접촉을 위해 수집되며, 얻어진 데이터 세트는 세타 접촉 세트로 언급된다. 일 실시형태에서, 세타 접촉 세트는 제공된 세타 원자 형태의 모든 이용 가능한 접촉을 위해 수집된 데이터를 포함한다. 추출된 정보는 상기에 설명된 "이차 데이터베이스"의 예인 데이터베이스를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 단계 S3에서 추출된 정보는 각각의 세타 원자 형태를 위한 유일한 세타 접촉 세트를 포함하는 이차 데이터베이스에서 수집된다. 이러한 실시형태의 예에서, 이차 데이터베이스의 세타 접촉 세트는 다수의 겹치지 않는 요타 원자 형태 또는 관련 요타 원자 형태의 겹치지 않는 그룹으로 다시 나누어진다. 이러한 실시형태의 예에서, 데이터베이스는 다시 나누어져서 제1 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재한 167개 비수소 원자 중 유일하고, 제2 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재한 167개 비수소 원자를 분류함으로써 얻어진 다수의 겹치지 않는 그룹 중 유일한 확인된 접촉 그룹을 화학적 유사성에 기초한 그룹으로 형성한다.

단계 S4에서, 단계 S2의 표적 리스트 중 확인된 각 세타 원자에 대해, 단계 S3에서 추출된 상응하는 세타 접촉 세트로부터 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 관한 데이터가 표적 결합 부위에서 또는 이 주위에 중첩된다. 일 실시형태에서, 중첩은 세타 접촉 세트를 분석하여 제공된 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 1 이상을 포함하는 접촉을 위한 공간 데이터를 추출하는 단계; 및 i) 접촉 세타 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 위치에서 발견되었고; ii) 접촉 제3 원자 및 제4 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 제3 원자 및 제4 원자의 위치에서 발견되었다면 이러한 공간 데이터를 플로팅하여 각 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상이 각각 발견될 곳을 나타내는 이론 위치를 정하는 단계를 포함한다. 결정된 이론 위치가 결합 부위 원자와 충돌하고/하거나 표적 단백질 내에 묻혀 있는 경우, 이들은 추가 분석으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어 개별 요타 원자의 이론 위치가 Rw - 0.2 옹스트롬보다 더 가까운 표적 거대분자의 원자 위치와 교차하면, 요타 원자는 후속 분석으로부터 배제된다.

단계 S5에서, 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹이 높은 이론 경향을 가지는 결합 부위의 1 이상의 우선 영역을 예상하는 방식으로 중첩된 데이터를 조합하고/하거나 분석한다.

단계 S6에서, 후보 리간드는 개념적으로 결합 부위에 도킹된다. 후보 리간드를 한정하는 데이터는 예를 들어 국소 또는 원격 메모리 디바이스(9)로부터 제공될 수 있다. 그 후 후보 리간드의 1개 이상의 원자의 형태와 위치 사이에 각 요타 원자 형태에 대한 예상된 우선 영역과 비교가 이루어진다. 비교에 근거하여, 교체 또는 추가 후보 리간드 원자 면에서 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이에 더 많은 교차를 생성할 후보 리간드에 대한 개질을 확인하며, 개질되지 않은 후보 리간드와 비교하여 결합 부위에 개질된 후보 리간드의 친화성에서 개선을 유도한다.

단계 S7에서, 개질된 후보 리간드는 현존 리간드에 대한 제안된 개선으로서 또는 신규 리간드의 처음부터 디자인의 일부로서 출력된다. 임의로 단계 S7과 S6은 반복되어 리간드를 추가로 개질할 수 있다. 국소 또는 원격 메모리 디바이스(5, 7 및 9)는 단일 부분의 하드웨어(예를 들어 단일 저장 디바이스)로 또는 2개 이상의 상이한, 별도 디바이스로 실시될 수 있다.

일 실시형태에서, 개질된 후보 리간드는 저장 또는 전송을 위한 출력 메모리 디바이스로 및/또는 가시화를 위한 디스플레이로 출력된다.

일 실시형태에서, 제공된 세타 원자의 형태는 단계 S2에서 제공된 세타 원자에 대해 단계 S3에서 정보가 추출되는 접촉 그룹과 임의의 다른 세타 원자 형태에 대해 접촉 그룹(요타 원자로서 제공된 세타 원자 형태를 포함하는 접촉 제외) 사이에 교차가 없도록 유일하게 확인된다.

일 실시형태에서, 단계 S5는 다수의 상이한 요타 원자 형태 및/또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 각각에 대해 1 이상의 우선 영역을 정하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 상이한 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹을 포함하는 잠재적인 개질을 확인하기 위해, 다수의 상이한 요타 원자 형태 및/또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹의 각각에 대해 비교 단계 S6이 반복될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 S2-S7은 결합 부위에서 다수의 상이한 원자에 대해 수행된다. 일 실시형태에서, 하기에 기재한 바와 같이, 우선 영역은 결합 부위에서 다수의 상이한 원자에 대해 유도된 요타 원자 형태의 결정된 이론 위치의 분포를 누적하여 조합(예를 들어 합계)함으로써 더 정확히 결정될 수 있다.

일 실시형태에서, 각 우선 영역에 대해, 제5 원자의 위치를 그의 각 요타 원자에 대해 기술하는 벡터가 유도되도록 분석이 확대된다. 분석이 벡터에 수행되어 영역에서 이론 공통(consensus) 요타 원자의 공유 결합에 대한 예상을 나타내는 우선 결합 벡터(bond vector)를 확인한다. 게다가 확인된 우선 결합 벡터는 적용되는 경우 후보 리간드의 디자인을 세련하고/하거나 후보 리간드의 개질을 세련하는데 사용될 수 있다. 확인된 우선 결합 벡터는 예를 들어 상이한 우선 영역에서 요타 원자가 어떻게 함께 결합될 수 있는 지를 나타내는데 사용될 수 있으며, 따라서 원자의 복수 추가 또는 교환을 포함하는 개질의 확인을 도울 수 있다. 일 실시형태에서 분석은 클러스터(cluster) 분석이다.

이론 위치의 분포는 특정 요타 원자 형태(또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹)가 결합 부위 내 상이한 위치에서 어떻게 우선이 될 것인 지에 대한 척도 또는 경향을 제공한다. 일 실시형태에서, 이론 위치의 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역이 우선 영역 중 하나로서 확인된다. 이론 위치의 밀도는 예를 들어 제공된 공간 체적에서 발생하는 결정된 이론 위치의 수에 대한 척도이다. 일 실시형태에서, 요타 원자 이론 위치는 결합 부위에서 다수의 표적 원자에 대해 결정되며, 다수의 표적 원자를 위한 요타 원자(또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹)에 대한 누적 이론 위치의 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역이 우선 영역 중 하나로서 확인된다. 결합 부위에서 상이한 표적 원자에 대해 결정된 이론 위치는 예를 들어 누적 이론 위치를 얻기 위해, 합계될 수 있다. 결합 부위에서 상이한 원자의 효과를 고려하는 것에 이러한 접근은 계산적으로 효율적이며, 후보 리간드와 결합 부위 사이의 상호작용에 대해 정보 손실을 최소화한다. 이 접근은 단순 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 원자와 조합하여 단순 원자 형태 쌍 또는 단순 원자 형태 면에서 접촉의 특성화에 의해 촉진된다. 이러한 접근은 예를 들어 라스코우스키 외 그의 공동 연구가의 경우와 같이, 접촉이 3 원자 단편 면에서 특징이 되는 경우 유효하지 않다.

얻어진 이론 위치 분포는 다양한 방식으로 전환되어 확률 밀도 함수, 즉 결합 부위 내 제공된 위치에서 제공된 요타 원자 형태의 바람직함에 대한 통계 퍼텐셜을 생성할 수 있다. 다음에, 확률 밀도 함수는 전자 밀도에 대한 유사한 방식으로 처리될 수 있으며, 분자 그래픽 소프트웨어, 예를 들어 피몰(Pymol) 내에서 이러한 맵을 가시화하는 표준 방식인 ccp4 파일로 전환될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 S5에서, 1 이상의 우선 영역은 편각과 방위각만을 포함하는 극 좌표로 표시되며, 임의로 기준 좌표계는 제3 원자 및 제4 원자(3,4)에 참조함으로써 표준화된다.

일 실시형태에서, 단계 S6은 후보 리간드의 원자(개질 전에 존재하든지 아니든지) 및 결합 부위에서 동일한 형태의 원자에 대한 예상된 우선 영역 사이의 중복도를 증가시키는 후보 리간드의 개질을 확인하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 생성된 이론 위치 분포 및/또는 우선 영역은 예를 들어 컴퓨터 소프트웨어에 의해 또는 수동으로 각 후보 리간드와 복합체로 표적 거대분자 구조 위 중첩으로서 검사된다. 예를 들어 후보 리간드가 항체에 관련되는 경우, 항체와 표적 거대분자 사이의 인터페이스는 항체 원자 및 각 요타 원자 이론 위치 분포 및/또는 이 원자에 대해 확인된 우선 영역 사이에 중복도를 결정하도록 시험될 수 있다. 일부 경우에 중복도는 이미 클 것이다. 그러나 인터페이스의 다른 영역에서 중복은 적을 수 있다. 항체의 인접 아미노산 잔기에서 돌연변이가 가장 효과적으로 확인되고/제안될 수 있는 곳은 이들 영역이다. 일 실시형태에서 19개의 다른 천연 아미노산은 각각 차례로 이 위치에서 고려되며, 이들의 각 회전 이성체 배좌 모두에서 그리고 각 경우에 제안된 돌연변이에 대한 최대 중복도를 가진 이들 잔기를 선택할 목적으로 관련 요타 원자 이론 위치 분포 및/또는 우선 영역에 의한 중복도가 시험된다. 이러한 방식으로, 선택된 항체에서 친화성 개선을 생성할 수 있는, 돌연변이를 선택하는 합리적인 수단이 제공된다. 항체의 상이한 영역 - 표적 단백질 인터페이스에서 개별 점 돌연변이가 생성될 수 있으며; 친화성 개선으로 유도되는 것들이 친화성의 상승 증가를 제공할 수 있는 2종 이상의 조합으로 시험될 수 있다.

일 실시형태에서, 단계 S6은 표적 결합 부위와 직접 접촉하거나, 표적 결합 부위와 아주 근접해 있는 리간드 중 1종 이상의(임의로 모두의) 아미노산 잔기를 각각 나머지 19개 천연 아미노산으로부터 선택된 1종 이상의 잔기로 각각 치환하는 단계를 포함한다. 이러한 치환은 각각 본원에서 "잔기 치환"으로 언급되며, 한 잔기의 상이한 잔기로 단일 치환에 의해 리간드의 개질을 포함한다. 일 실시형태에서, 리간드 또는 표적의 인접 원자와 충돌(예를 들어 치환 잔기 중 1개 이상의 원자와 표적 또는 리간드의 1개 이상의 다른 원자 사이에 중복)을 일으키지 않는 이러한 잔기 치환 각각에 대해, 치환 잔기 중 각 원자의 형태와 위치는 각 요타 원자 형태 우선 영역과 비교되어 이들이 원래 잔기의 원자보다 더 많은 교차를 생성할 것인지 확인한다. 일 실시형태에서 리스트는 게다가 원래 잔기의 원자보다 더 많은 교차를 생성하는 것으로서 확인되는 잔기 치환의 출력이다. 일 실시형태에서, 리스트된 잔기 치환의 각각에 대해, 후보 리간드는 게다가 돌연변이 되어 잔기 치환을 포함시키는 개질된, 단일 잔기 돌연변이 리간드를 생성한다. 표적 결합 부위에 대한 각 개질된 리간드의 친화성은 게다가 후보 리간드에 대해 가장 큰 친화성 개선을 제공하는 이들 개질을 확인하기 위해 실험에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 한계보다 더 큰 잔기 치환을 얻는 잔기 치환의 그룹이 확인될 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 한계는 제로일 수 있으며, 그 결과 선택된 그룹은 친화성을 어느 정도 개선하는 잔기 치환만으로 이루어진다. 게다가 후보 리간드의 더 고도의 개질은 이러한 정보를 기초로 수행될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서 후보 리간드는 다수의 잔기 치환, 예를 들어 가장 큰 친화성 개선을 제공하는 것으로서 개별적으로 결정된 다수의 이들 잔기 치환을 일체화하도록 개질될 수 있다. 이러한 방식으로 단일 잔기만을 치환함으로써 가능한 것보다 더욱더 개선되는 친화성을 가지는 리간드를 디자인하는 것이 가능하다.

일부 실시형태에서, 원래 잔기의 원자보다 더 많은 교차를 제공하는 것을 충족하는(ΔIOTA 점수가 제로 미만인) 잔기 치환의 리스트를 생성할 수 있다. 리스트는 추가로 다른 기준을 기초로 등급화될 수 있다. 예를 들어, 리스트는 또한 ΔΔG 점수를 기초로 걸러질 수 있다(하기 참조). ΔΔG 점수가 제로 미만인 잔기 치환은 원래 잔기와 비교하여 더 강한 상호작용을 수반한다. 따라서 제로 미만의 ΔIOTA 점수(음 ΔIOTA 점수), 및 제로 미만의 ΔΔG(음 ΔΔG)의 양쪽 기준을 잔기가 충족하는 리스트를 생성할 수 있다. 이는 하기 실시예 2에 예시된다.

화학 물질, 예를 들어 표적 단백질의 포켓에 결합된 저 분자량 화학 단편의 결정 구조의 경우에, 요타 원자 이온 위치 분포 및/또는 결합 부위에 표시된 우선 영역은 효능이 더 높은 원형 NCE를 얻을 수 있는 단편 성장을 위한 원자 형태와 화학 결합 벡터를 제안할 수 있다.

일 실시형태에서, 후보 리간드에 대한 다수의 개질이 확인된다. 이 경우에, 이 방법은 예를 들어 친화성 향상 면에서 가장 효과적일 듯 한 개질을 확인하기 위해, 확인된 개질의 서브세트를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 선택은 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이의 교차가 개질 안 된 후보 리간드와 비교하여 더 많은 정도를 기초로 수행될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 한계를 넘는 교차 증가를 얻는 개질이 선택될 수 있으며, 미리 결정된 한계 아래인 교차 증가를 얻는 개질이 폐기될 수 있다. 이러한 선택 방법의 예가 "실시예 2"의 문맥에서 하기에 설명되어 있다. "ΔIOTA 점수"는 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이의 교차가 개질 안 된 후보 리간드와 비교하여 더 많은 정도의 척도에 대한 예이다. 대안으로 또는 추가로, 선택은 결합 부위에 개질된 후보 리간드의 결합에 의해 형성된 복합체의 총 에너지에 기여하는 1개 이상의 요인이 개질 안 된 후보 리간드가 결합하는 경우와 비교하여 줄어드는 정도에 기초하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 한계를 넘는 1개 이상의 요인에서 감소(예를 들어 1개 이상의 요인의 합에서 감소)를 얻는 개질이 선택될 수 있으며, 미리 결정된 한계 아래인 1개 이상의 요인에서 감소(예를 들어 1개 이상의 요인의 합에서 감소)를 얻는 개질이 폐기될 수 있다. 이러한 선택 방법의 예는 "실시예 2"의 문맥에서 하기에 설명되어 있다. "로제타(Rosetta) ΔΔG 점수"는 결합 부위에 후보 리간드의 결합에 의해 형성된 복합체의 총 에너지에 기여하는 1개 이상의 요인이 줄어드는 정도의 척도에 대한 예이다. 복합체의 총 에너지에 기여하는 요인의 예는 하기에 설명되는 바와 같이, 레나드 존즈(Lennard-Jones) 조건, 내재하는 용매화 조건, 배향 의존 수소 결합 조건, PDB로부터 유도된 측쇄 및 주쇄 비틀림 퍼텐셜, 단기 지식 기반(short-ranged knowledge-based) 정전 조건, 및 펼친 상태에 입체감을 주는 20개 아미노산 각각에 대한 기준 에너지를 포함한다.

일 실시형태에서, 후보 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법은 컴퓨터 실행 방법이다. 일 실시형태에서, 단계 S1-S7 중 임의의 1 단계 이상이 컴퓨터 위에서 수행된다. 일 실시형태에서, 단계 S1-S7 모두가 컴퓨터 위에서 수행된다. 추가로, 도 14(항체의 VH-VL 인터페이스에서 점 돌연변이를 예상하기 위한 작업 흐름을 도시하는)의 단계 S101-109 중 임의의 1 단계 이상이 자동화될 수 있다. 단계 S101-S109 중 임의의 1 단계 이상이 컴퓨터 위에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 모든 단계 S101-109가 자동화된다. 모든 단계 S101-S109가 컴퓨터 위에서 수행될 수 있다.

통상의 기술자에게 잘 알려진, 광범위한 표준 계산 구성이 이 방법을 실시하는 플랫폼으로서 사용될 수 있었다. 이 방법은 방법 단계를 한정하고/하거나 실시하는데 필요한 소프트웨어를 저장하거나 전송하기 위한, 임의의 특정 하드웨어 구성, 운영 체계 또는 수단에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 컴퓨터가 이 방법을 수행하게 하기 위한 컴퓨터 판독 가능한 명령(예를 들어 컴퓨터 프로그래밍 언어에서 코드)을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체 또는 신호가 제공된다.

일 실시형태에서, 치료용 리간드의 제조 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 제조 방법은 상기에 기재한 실시형태 중 1개 이상에 따라 새로운 리간드를 디자인하거나 현존 리간드를 개질하는 것을 포함한다.

실시예 1: 항 IL17F 항체의 Fab 단편의 친화성 성숙

서론

항체 친화성 성숙의 시험관 내 방법이 잘 알려져 있다(미국특허 제8 303 953 B2호 13 컬럼 19 내지 33행 참조). 최근 예에서 후지노(Fujino) 외 그의 공동 연구가(Fujino et al (2012) "Robust in vitro affinity maturation strategy based on interface-focused high-throughput mutationalscanning", Biochem. Biophys. Res. Comm., 428, 395-400)는 항체의 50개 확인된 항원 인터페이스 잔기에서 각각 단일 점 돌연변이체 단일 사슬 Fab 라이브러리의 리보솜 디스플레이 패닝(panning), 이어서 친화성 향상이 2000배 넘는 Fab의 확인으로 된 향상된 결합제의 조합 리보솜 디스플레이를 기초로 고 처리량 돌연변이 스캐닝 전략을 공표한다. 이러한 방법은 실험실 베이스 자산에서 대규모 투자를 필요로 하며, 따라서 다양한 그룹(reviewed by Kuroda et al (2012) "Computer-aided antibody design", Prot. Eng. Design & Selection, 25, 507-521)이 개선된 친화성을 위해 대다수의 돌연변이된 항체 변이체를 스크리닝하는 필요성을 줄이거나 제거하도록 항체 친화성에서 향상을 예상하는 인 실리코(in silico) 방법을 연구하였다. 이들 컴퓨터 이용 항체 디자인 프로토콜은 지식 기반; 즉 관찰 데이터로부터 유도된 통계 퍼텐셜을 사용하거나 물리학 기반, 즉 기본적인 물리적 상호작용의 모델로부터 유도된 에너지 함수를 사용한다. 립포우(Lippow) 외 그의 공동 연구가(2007)(Lippow et al (2007), "Computational design of antibody-affinity improvement beyond in vivo maturation", Nat Biotech., 25, 1171-1176)는 정전 상호작용을 기초로 한 후자 접근법에 의해 보통의 성공을 달성하였지만, 이러한 방법의 파라미터화에 대한 본 발명자들의 이해는 여전히 완성되어 있지 않다. 지금까지 지식 기반 방법은 랜덤 돌연변이 생성을 위해 개별 항체 잔기를 확인하는 경향이 있으며(예를 들어 Barderas et al (2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modelling", PNAS, 105, 9029-9034), 이들은 여전히 상당한 실험실 기반 노력을 수반한다.

본 실시예에서, 미국특허 제8 303 953 B2호에 기재된 항 IL17F 항체의 Fab 단편을 친화성 성숙시키는데 지식 기반 접근법이 적용되었다. 최종 친화성 성숙 항체는 전장 IgG1 분자로서 국제특허출원 공개 제2012/095662 A1호에 기재되어 있다. 그러나 이러한 항체가 친화성 성숙된 방법은 후자의 공보에 개시되어 있지 않다.

방법

IL17F 항원 결정부를 포함하는 표적( 세타 ) 원자의 확인

국제특허출원 공개 제2009/130459 A2호에 기재된 공결정 IL17F/Fab 496 복합체 구조의 좌표를 사용하여, 임의 Fab 496 원자 중 6Å 내 모든 IL17F 원자를 항원 결정부 원자로서 확인하였고, 표 1에 리스트한다. 209개 세타 원자의 이 리스트 중에서 86개의 특이 세타 원자 형태가 있다.

[표 1]

IOTA 데이터베이스의 생성

1천 1백만 초과 분자 내 원자 접촉 데이터의 이차 데이터베이스를 해상도가 ≤2Å인 20000 초과 비상동 단백질 구조로부터 추출하였다. 접촉은 1Å+임의 2개 원자 각각의 반 데르 발스 반경의 합 이하의 거리에 의해 분리된 단백질 접힘의 상대 측면 위 임의 2개 원자로서 정의되었고, 선형 펩티드 서열 위에 적어도 4개 잔기가 떨어져 있는 전기 위 원자에 한정되었다. 접촉하는 쌍의 제1 원자는 세타 원자로 지정되었고, 제2 원자는 요타 원자로 지정되었다. 데이터베이스를 세타 원자 형태에 따라 167개 접촉 세트로 분할하였고, 20개의 천연 아미노산 잔기 포함 단백질 내에 167개 비수소 원자 형태가 있었다. 접촉 세트 내에 각 요타 원자 위치의 상대 좌표를 세타-요타 원자 쌍 좌표의 표준화 후 기록하였다. 후자는 세타 원자를 x,y,z=0,0,0으로 설정하고; 세타 원자에 공유 결합된 다음 원자(제3 원자)(펩티드 주쇄의 방향으로)를 x,y,z=x',0,0으로 설정하며; 다시 공유 결합된 다음 원자(제4 원자)를 x,y,z=x",0,z'으로 설정함으로써 달성되었다. 정의된 제3 원자와 제4 원자에 일관된 관례가 사용되었다.

각 세타 접촉 세트를 추가로 167개 요타 원자 형태로 다시 나누었지만, 편의상 이들을 엥과 후버의 정의(Engh and Huber (1991) "Accurate Bond and Angle Parameters for X-ray Protein Structure Refinement", Acta Cryst., A47, 392-400)에 기초한 화학 형태에 따라 26개 하위 그룹으로 연결시켰다.

본 실시예에서 하기 요타 하위 그룹이 사용되었다:

IL17F 항원 결정부 표면에 걸쳐 요타 데이터의 중첩

IL17F 항원 결정부를 포함하는 209개 세타 원자의 각각에 대해, 상응하는 세타 접촉 세트를 IOTA 데이터베이스로부터 선택하였고, 이로부터, 적절한 요타 하위 그룹, 예를 들어 카르보닐 산소를 선택하였다. 이러한 하위 그룹으로부터 상대 요타 좌표를 IL17F 항원 결정부의 제공된 세타 원자의 기준 좌표계에 대해 전치시켰다(표 2에서는 본보기 데이터를 예시한다). 따라서 제공된 하위 그룹에 대한 요타 데이터세트가 전체 IL17F 항원 결정부에 걸쳐 축적되었다. 제공된 요타 데이터 포인트의 위치가 IL17F의 원자와 이들의 각 반 데르 발스 반경 합 마이너스 0.2Å보다 더 가깝게 교차한 경우에, 이들 데이터 포인트는 데이터세트로부터 배제되었다. 이 방법이 모든 관련 요타 하위 그룹에 대해 반복되어 IL17F 항원 결정부에 대한 일련의 요타 데이터세트를 생성하였다.

[표 2]

IL17F 요타 데이타세트의 가시화

피몰과 같은 분자 그래픽 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 IL17F/Fab 496 구조에 관해 각 요타 데이터세트를 가시화하였다. 이는 개별 포인트로서 요타 데이터세트의 직접 플로팅에 의해 또는 처음에 수학적으로 데이터세트를 밀도 함수 및 분자 그래픽 디스플레이용으로 적합한 파일 포맷 예를 들어 ccp4로 전환함으로써 수행될 수 있으며, 그 결과 더 높은 밀도의 등고선 맵이 IL17 항원 결정부에 걸쳐 표시될 수 있다.

Fab 496 파라토프( paratope ) 분자와 교차를 위한 요타 밀도 맵의 검사

IL17F/Fab 496 인터페이스를 시험하여 잔기당 개별 Fab 496 원자와 상응하는 요타 밀도 맵 사이의 교차도를 결정하였다. 교차가 전혀 없거나 거의 없는 잔기를 확인하였다. 이들 경우에 분자 그래픽 소프트웨어를 통해 교체 잔기를 치환하여 잔기 원자와 관련 요타 밀도 맵 사이에 더 양호한 교차가 달성될 수 있는 지를 결정하였다. 양호한 요타 밀도 맵 교차를 나타내는 아미노산 치환을 시험관 내 생성과 Fab 496의 순수 IgG 버전과 같이 단일 점 돌연변이로서 시험을 위해 선발 리스트하였다.

DNA 조작 및 일반 방법

형질전환과 일상적인 배양 증식을 위해 대장균(E. coli) 균주 INVαF(인비트로겐(Invitrogen))를 사용하였다. DNA 제한 및 수식 효소를 로슈 다이어그나스틱스사(Roche Diagnostics Ltd.)와 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 얻었다. 맥시 플라스미드 정제 키트(퀴아겐(Qiagen), 카탈로그 번호 12165)를 사용하여 플라스미드 조제를 수행하였다. ABI 프리즘 빅 다이 터미네이터(Prism Big Dye terminator) 염기서열 결정 키트(카탈로그 번호 4304149)를 사용하여 DNA 염기서열 결정 반응을 수행하였고, ABI 3100 자동화 염기서열 분석기(Applied Biosystems) 위에서 가동하였다. 프로그램 오토 어셈블러(Auto Assembler)(Applied Biosystems)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 올리고뉴클레오티드를 인비트로겐으로부터 얻었다. IgG 어셈블리 ELISA에 의해 IgG의 농도를 측정하였다.

항체 CA028 _00496의 친화성 성숙

CA028_0496은 IL17A와 IL17F 아이소형을 둘 다 결합하는 인간화 중화 항체이다. 이것은 gL7 및 gH9로 칭하는, 이식된 가변 영역을 포함하며, 이들의 서열이 국제특허출원 공개 제2008/047134호에 개시되어 있다. 이러한 항체의 야생형 Fab' 단편(Fab 496) 및 돌연변이체를 다음과 같이 제조하였다: 상기 선별 리스트에서 결정된 잔기와 위치에 따라 경쇄 가변 영역(gL7)에 단일 점 돌연변이를 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 디자인하고, 구성하였다. 돌연변이된 경쇄를 각각 별도로 UCB 셀텍(Celltech) 인간 경쇄 발현 벡터 pKH10.1로 서브클로닝하였고, 이는 인간 C-카파 정상 영역을 코딩하는 DNA(Km3 알로타입(allotype))를 함유하였다. 변경되지 않은 중쇄 가변 영역(gH9) 서열을 인간 중쇄 감마-1 정상 영역을 코팅하는 DNA, CH1을 함유한 UCB 셀텍 발현 벡터 pVhg1Fab6His로 서브클로닝하였다. 제조업자의 설명서(InVitrogen 카탈로그 번호 12347-019)에 따라 293fectin^TM 과정을 사용하여 중쇄 및 경쇄 코딩 플라스미드를 HEK293 세포에 동시 형질감염시켰다. 배양 10 내지 12일 후 배양 상청액에 분비된 IgG1 항체 수준을 ELISA에 의해 평가하였고, 결합 반응속도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다(하기 참조).

그 후 IL17F에 대해 향상되거나 유사한 결합을 나타내는 돌연변이체를 제조하여 상기와 같이 이중, 삼중, 사중 또는 오중 경쇄 돌연변이로서 조합하여 시험하였다.

표면 플라스몬 공명( SPR )

HBS-EP 영동(running) 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl 3mM EDTA 0.005% (v/v) 계면활성제 P20, Biacore AB)을 사용하여 25℃에서 Biacore 3000 시스템(Biacore AB)에서 모든 SPR 실험을 수행하였다. 제조업자가 추천한 바와 같이, 아민 커플링 방법에 의해 염소 F(ab')2 항-IgG Fab' 특이 항체(Jackson Labs. 제품 코드 109-006-097)를 CM5 센서 칩(GE Healthcare)의 표면에 공유 결합하였다. 간단히 말하자면, 카르복시메틸 덱스트란 표면을 50 mM N-히드록시숙시미드 및 200 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드의 신선한 혼합물로 10 μl/min의 유속에서 5분간 활성화하였다. 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 완충액 중 50 ㎍/ml에서 항 Fab 항체를 동일 유속에서 60초간 주입하였다. 끝으로 표면을 1 M 에탄올아민.HCl pH 8.5의 10분 펄스로 비활성화하였고, 칩 위에 400 내지 5000 반응 단위(RU)의 고정화 항체를 남겼다. 상기 과정에서 단백질을 생략함으로써 동일 칩 위에 기준 플로 셀(reference flow cell)을 준비하였다.

야생형 및 돌연변이된 496 Fab를 3 내지 30 ㎍/ml 범위에서 배양 상청액으로부터 수확하였고, 미정제 상청액을 영동 완충액에서 0.5 내지 2 ㎍/ml 범위로 희석하였다. IL17F에 대한 결합 반응 속도를 평가하기 위해, 항체를 각각 처음에 10 μl/min에서 60초간 주입에 의해 항-Fab' 표면에 포획하여 추가 150 내지 250 RU 신호를 얻었다. 재조합 인간 IL17F를 영동 완충액에서 10 nM로부터 적정하고, 30 μl/ml에서 주입하여 180초에 걸쳐 결합 단계(association phase) 이어서 300초의 해리 단계를 생성하였다. 각 사이클의 종료 시에 표면을 40 mM HCl의 60초 펄스 이어서 5 mM NaOH의 30초 펄스로 10 μl/min에서 재생하였다. 각 Fab'에 대해 제어 사이클을 수행하였고, 여기서 IL17F 주입이 영동 완충액의 주입으로 대체되었다.

기준 플로 셀 신호의 공제에 의해, 그 후 각 Fab'에 대한 제어 사이클 센소그램(sensogram)을 공제함으로써 센소그램을 보정하였다. 비아이벨류에이션(Biaevaluation) 소프트웨어(Biacore AB)를 사용하여 해리 속도 상수(k_d)와 결합 속도 상수(k_a)를 데이터에 맞추었다. Fab 친화성(K_D)을 K_D = k_d/k_a로서 계산하였다.

결과

Fab 496 원자와 요타 밀도 맵의 교차

IL17F와 인터페이스를 형성하는 Fab 496의 표면 중 그 부분의 검사로 많은 영역에서 제공된 Fab 496 원자와 상응하는 요타 밀도 맵 사이에 완전한 교차가 있었음이 판명되었다. 이는 특히 Fab 496 중쇄를 포함하는 아미노산 잔기에 대한 경우이었다. 그러나 Fab 496 원자와 상응하는 요타 밀도 맵의 교차가 전혀 없거나 거의 없는 경쇄를 포함하는 다수의 영역이 있었다(패널 A, 도 8 내지 13).

교체 잔기를 Fab 496 구조로 이들 위치에서 치환함으로써 치환된 잔기의 1개 이상의 원자와 상응하는 요타 밀도 맵 사이에 교차를 달성하는 것이 가능하였다(패널 B, 도 8 내지 13). 따라서 Fab 496 경쇄 위에서 트레오닌 30 Cγ2 원자는 메틸 탄소 요타 밀도 맵과 교차하지 않으며, Oγ1 원자는 히드록실 산소 요타 밀도 맵과교차하지 않는다. 그러나 트레오닌 30이 아르기닌으로 돌연변이될 때, Nε 원자와 이차 아미드 요타 밀도 맵 사이에 교차가 있다(도 8).

도 9에서는 경쇄 아르기닌 54 주위에 이 잔기의 각 측쇄 원자와 어떠한 교차도 없이 분산된, 사면체 메틸렌 요타 밀도 및 이차 아미드 요타 밀도를 보여준다. 반대로 이 위치에서 세린으로 돌연변이될 때 히드록실 산소 요타 밀도 및 세린 측쇄의 감마 산소 원자의 양호한 교차가 있다. 경쇄 세린 56 감마 산소 원자는 히드록실 산소 요타 밀도와 교차하지 않는다. 그러나 이 잔기가 이소류신으로 돌연변이될 때 이소류신 측쇄의 델타 1 메틸 원자 및 메틸 요타 밀도의 교차가 있다(도 10). 세린 60의 경우에, 다시 감마 산소는 인접한 히드록실 산소 요타 밀도로부터 너무 멀어서 교차를 달성하지 못하지만(도 11), 이 잔기를 아스파르테이트로 돌연변이하면 카르복실 산소 요타 밀도와 측쇄 델타 산소 원자의 교차를 일으킨다.

경쇄 트레오닌 72는 CDR 잔기가 아니라 프레임워크(framework) 3의 일부이며, 이의 측쇄 메틸 원자는 메틸 탄소 요타 밀도와 교차하지 않거나 이의 측쇄 산소 원자는 히드록실 산소 요타 밀도와 교차하지 않는다. 그러나 아르기닌 72 돌연변이는 메틸렌 탄소 요타 밀도와 측쇄 델타 탄소 원자 및 구아니디늄 질소 요타 밀도와 측쇄 에타 질소 원자 양쪽의 교차를 허용한다.

결합 반응속도에 대한 항체 CA028 _00496 위 요타 디자인된 돌연변이의 효과

Fab 496에서 5개 요타 디자인된 단일 점 경쇄 돌연변이, T30R, R54S, S56I, S60D 및 T72R은 1.7 내지 3.6배 범위의 결합 친화성에서 약간의 개선을 보여주었다. 비 CDR 돌연변이, T72R에 의해 관찰된 개선은 놀라웠으며, 그 이유는 이 위치에서 잔기가 항원에 정상적으로 접촉하지 못하기 때문이다. 이들 돌연변이 중 하나(S60D)를 제외한 모두에 대해, 개선은 해리 속도 상수의 감소에 의해 추진되었다(표 3). 이들 돌연변이의 쌍 조합으로 해리 속도 상수에서 3.8 내지 7.5배 감소와 함께 결합에서 상승적인 향상을 얻었고; 삼중 및 사중 조합으로 해리 속도 상수에서 추가 단계 감소를 나타냈다(표 3).

모든 5개 경쇄 돌연변이의 조합은 결합 친화성에서 최대 개선을 나타내어(표 4) IL17F에 대한 11 pM의 친화성 값을 제공하였고, 일부는 초기 Fab 496보다 180배 더 양호하였다. 중요한 발견은 IL17A 아이소형에 대한 결합에 유해 효과가 없었으며, 초기 Fab 496에 대해 14 pM과 비교하여 2 pM에서 친화성 상수로서 사실상 개선이 있었다는 사실이었다. 디자인된 돌연변이의 조합이 친화성에 대해 상승적 향상을 나타낸다는 사실이 흥미로우며; 한 가지 해석은 이들이 경쇄 파라토프 표면 전체에 걸쳐 합리적으로 떨어져 있으며(도 13), 따라서 부정적인 상호작용 효과를 피한다는 것이다.

[표 3]

[표 4]

결론

상응하는 항체, Fab 496에서 유리한 돌연변이를 예상하기 위해 IL17F의 항원 결정부 표면에 걸쳐 요타 밀도 맵을 생성하는 방법은 친화성 상수가 11 pM의 K_D로 180배 향상되었다는 점에서 성공적임을 입증하였다. 이러한 방법은 CDR 돌연변이만이 사용될 수 있다고 추정하지 않지만 프레임워크 영역 돌연변이가 또한 친화성 성숙을 위해 중요하다는 사실을 입증한다.

실시예 2: 안정성을 개선하기 위해 Ab 의 중쇄 / 경쇄 사이 영역에서 본 발명의 자동화 방법의 이용

방법

Fab X의 Fv 인터페이스의 중쇄 및 경쇄 양쪽의 표적( 세타 ) 원자 확인

항원과 착체 형성된 항체 Fab 단편 "Fab X"의 결정 구조 좌표를 사용하여, 임의 경쇄 원자 6Å 이내 모든 중쇄 원자를 항원 결정부 원자(표 5에 열거한 167개 세타 원자)로서 확인하였다. 유사하게도, 임의 중쇄 원자 6Å 이내 모든 경쇄 원자를 항원 결정부 원자(표 5에 열거한 159개 세타 원자)로서 확인하였다.

[표 5]

중쇄 및 경쇄 인터페이스 표면에 걸쳐 요타 데이터의 중첩

중쇄 항원 결정부를 포함하는 167개 세타 원자의 각각에 대해, 상응하는 세타 접촉 세트를 IOTA 데이터베이스로부터 선택하였고, 이로부터, 적절한 요타 하위 그룹, 예를 들어 카르보닐 산소를 선택하였다. 이러한 하위 그룹으로부터 상대 요타 좌표를 중쇄 항원 결정부의 제공된 세타 원자의 기준 좌표계에 대해 전치시켰다. 따라서 제공된 하위 그룹에 대한 요타 데이터세트가 전체 중쇄 항원 결정부에 걸쳐 축적되었다. 제공된 요타 데이터 포인트의 위치가 중쇄의 원자와 이들의 각 반 데르 발스 반경 합 마이너스 0.2Å보다 더 가깝게 교차한 경우에, 이들 데이터 포인트는 데이터세트로부터 배제되었다. 이 방법이 모든 관련 요타 하위 그룹에 대해 반복되어 중쇄 항원 결정부에 대한 일련의 요타 데이터세트를 생성하였다.

경쇄 항원 결정부를 포함하는 159개 세타 원자의 각각에 대해, 상응하는 세타 접촉 세트를 IOTA 데이터베이스로부터 선택하였고, 이로부터, 적절한 요타 하위 그룹, 예를 들어 카르보닐 산소를 선택하였다. 이러한 하위 그룹으로부터 상대 요타 좌표를 경쇄 항원 결정부의 제공된 세타 원자의 기준 좌표계에 대해 전치시켰다. 따라서 제공된 하위 그룹에 대한 요타 데이터세트가 전체 경쇄 항원 결정부에 걸쳐 축적되었다. 제공된 요타 데이터 포인트의 위치가 경쇄의 원자와 이들의 각 반 데르 발스 반경 합 마이너스 0.2Å보다 더 가깝게 교차한 경우에, 이들 데이터 포인트는 데이터세트로부터 배제되었다. 이 방법이 모든 관련 요타 하위 그룹에 대해 반복되어 경쇄 항원 결정부에 대한 일련의 요타 데이터세트를 생성하였다.

중쇄 경쇄 원자와 교차를 위한 요타 밀도 맵의 검사

돌연변이가 일어나기 쉬운 위치 확인, 단일 점 돌연변이체 생성, 저 에너지 회전 이성체 상태 열거, 정량적 IOTA 점수 계산, VH-VL 사슬 결합 에너지 추산, 및 점 돌연변이체 우선 순위 결정에 맞춰진 내부 주문 설정된 로제타 파이톤 라이브러리 스크립트에 의해 전체 방법을 자동으로 수행하였다.

돌연변이체 순위를 위해 2종의 득점법을 사용하였다:

1. ΔIOTA 점수

각각의 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치에서 잔기의 각 중 원자 및 상응하는 형태의 맵 근처에서 밀도 한계점 사이에 공간 교차 값을 계산하는데 이전에 언급된, 생성된 IOTA 밀도 맵을 사용하였다. IOTA 점수는 상응하는 형태 정의가 있는 IOTA 밀도의 최대치와 한 잔기의 중 원자 사이 체적 중복의 합계이며, 이는 잔기당 개별 Fab X 원자 및 상응하는 요타 밀도 맵 사이의 교차도를 반영한다. IOTA 점수는 숫자상으로 음성이며, 여기서 더 작은 값은 더 많은 교차를 시사한다. ΔIOTA 점수는 돌연변이체 잔기와 야생형 잔기 사이의 IOTA 점수 변화이며; 유사하게도, ΔIOTA 점수 값이 더 음성적일수록 돌연변이체가 야생형 잔기보다 더 유리해진다는 의미가 커진다.

2. 로제타 ΔΔG 점수

로제타 에너지 함수는 원자 사이의 상호작용 힘, 용매화 효과, 및 비틀림 에너지를 설계하는 조건의 선형 결합이다. 더 구체적으로는, 점수 12는 로제타에서 디폴트 완전 원자 에너지 함수로서 레나드 존즈 조건, 내재하는 용매화 조건, 배향 의존 수소 결합 조건, PDB로부터 유도된 측쇄 및 주쇄 비틀림 퍼텐셜, 단기 지식 기반 정전 조건, 및 펼친 상태에 입체감을 주는 20개 아미노산 각각에 대한 기준 에너지로 이루어진다. 결합 파트너 사이 결합 강도, 또는 ΔG는 개별 파트너 단독 로제타 점수를 2개 파트너에 의해 형성된 복합 구조의 점수로 공제함으로써 계산될 수 있다. 더 낮은 ΔG는 더 강한 결합을 시사한다. ΔΔG는 돌연변이 복합체와 야생형 복합체 사이의 ΔG에 대한 변화이며; ΔΔG 값이 더 음성일수록 돌연변이체 결합 친화성이 야생형 친화성보다 크다는 의미가 더 커진다.

도 14에서는 Fab X 구조의 VH-VL 인터페이스에서 점 돌연변이를 인 실리코 예상하기 위한 작업 흐름을 도시한다.

단계 S101에서, 임의 경쇄 중 원자의 8Å 이내에 적어도 하나의 중 원자가 있는 중쇄 위 모든 잔기가 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치로서 확인되었다. 유사하게도, 임의 중쇄 중 원자의 8Å 이내에 적어도 하나의 중 원자가 있는 경쇄 위 모든 잔기가 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치로서 확인되었다.

단계 S102에서, 야생형 Fab X 결정 구조에 대해, 잔기별 IOTA 점수와 결합 에너지 ΔG가 각각 계산된다. 단계 S102.1에서, 현 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치 위 야생형 잔기에 대해 근처에서 상응하는 IOTA 밀도 맵에 의한 IOTA 점수가 계산되고, (IOTA 점수_wt, 위치 _j )로서 지칭되며; 단계 S102.2에서, 야생형 Fab X VH 및 VL 사슬의 결합 에너지는 로제타 점수 12 함수로서 계산되고, ΔG_wt로서 지칭된다.

단계 S103에서, 단계 S101에서 확인된 현 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치 위 야생형 잔기를 다른 아미노산 형태에 의해 교체한다(돌연변이한다). 20개의 천연 아미노산 중에서, 프롤린과 시스테인을 돌연변이로부터 배제한다. 야생형 자체를 제외한 모든 다른 18개 형태(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린)를 돌연변이가 일어나기 쉬운 각각의 위치에서 하나씩 돌연변이시킨다.

단계 S104에서, 돌연연이가 일어나기 쉬운 각각의 위치에서 각각 돌연변이된 잔기 형태에 대해, 로제타를 사용하여 상위 100개의 최저 에너지(로제타 득점 함수 면에서) 회전 이성체 상태를 생성한다. 다른 고 에너지 회전 이성체 상태를 폐기한다.

단계 S105에서, S104에서 생성된 돌연변이체 잔기의 각 회전 이성체 상태에 대해, IOTA 점수를 단계 S102의 동일한 방식으로 계산하여, (IOTA 점수_mutant, 위치_j, 형태 _k , 회전 이성체 _i )로서 지칭한다.

단계 S106에서, 회전 이성체 상태, 돌연변이체 잔기 형태, 및 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치의 현 조합에 대해 ΔIOTA 점수는 (IOTA 점수_wt, 위치 _j )를 (IOTA 점수_mutant, 위치 _j , 형태 _k , 회전 이성체 _i )로 공제함으로써 계산하고, 이를 (ΔIOTA 점수, 위치 _j , 형태 _k , 회전 이성체 _i )로서 지칭한다. 단계 S105와 S106을 반복하여 현 돌연변이체 잔기 형태와 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치에 대한 각 회전 이성체 상태를 위한 ΔIOTA 점수 모두를 계산하였다.

단계 S107에서, 현 돌연변이체 잔기 형태와 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치에 대한 최적 회전 이성체 상태를 단계 S107.1에서 제시한 바와 같이, 최저 ΔIOTA 점수에 의해 결정한다. 최적 회전 이성체 상태가 있는 돌연변이체의 결합 에너지를 단계 S102.2와 동일한 방식으로 단계 S107.2에서 계산하고, (ΔG_mutant, 위치 _j , 형태 _k )로서 지칭한다. 단계 S107.3에서, 돌연변이체와 야생형 사이 결합 에너지 변화 ΔΔG를 ΔG_mutant로서 ΔG_wt의 공제에 의해 계산한다. 최적 회전 이성체 상태의 우선 순위가 결정된 후, 단계 S103 내지 S107을 현 돌연변위가 일어나기 쉬운 위치에서 다음 돌연변이체 아미노산 형태에 대해 반복하였다.

단계 S108에서, 현 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치에 대해, ΔIOTA 점수 < 0 및 ΔΔG < 0의 양쪽 기준을 충족하는 후보 돌연변이체만을 후 등급화를 위해 보존한다. 나머지를 폐기한다. 단계 S102 내지 S108을 반복하여 모든 돌연변이가 일어나기 쉬운 위치를 조사하였고, 동일한 기준을 충족하는 모든 후보 돌연변이체를 생성하였다.

단계 S109에서, 모든 후보 돌연변이체 구조를 후 가시화 분석을 위해 출력하였다. 후보 돌연변이체의 최종 리스트를 분류하였고, 최저 ΔIOTA 점수에 의해 등급화하였다.

사용된 실행 명령과 파라미터는 하기와 같았다:

경쇄 돌연변이 예상을 위해, 명령은

"python multiRotamersFabInterfaceIOTAScan.py --pdb FabX.pdb --only_chains L -- region all --useIOTA --IOTAtype 167 --output_mutant"이었다.

중쇄 돌연변이 예상을 위해, 명령은

"python multiRotamersFabInterfaceIOTAScan.py --pdb FabX.pdb --only_chains H -- region all --useIOTA --IOTAtype 167 --output_mutant"이었다.

보조 로제타 관련 파라미터는

"multiRotamersFabInterfaceIOTAScan.py"에 하기 코드를 추가함으로써 초기화되었다:

"init(extra_options = "-ex1 -ex2 -score:weights score12 -no_his_his_pairE - constant_seed -edensity:mapreso 3.0 -correct -mute all"

DNA 조작 및 일반 방법

형질전환과 일상적인 배양 증식을 위해 대장균 균주 INVαF(인비트로겐)를 사용하였다. DNA 제한 및 수식 효소를 로슈 다이어그나스틱스사와 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 얻었다. 맥시 플라스미드 정제 키트(퀴아겐, 카탈로그 번호 12165)를 사용하여 플라스미드 조제를 수행하였다. ABI 프리즘 빅 다이 터미네이터 염기서열 결정 키트(카탈로그 번호 4304149)를 사용하여 DNA 염기서열 결정 반응을 수행하였고, ABI 3100 자동화 염기서열 분석기(Applied Biosystems) 위에서 가동하였다. 프로그램 오토 어셈블러(Applied Biosystems)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 올리고뉴클레오티드를 인비트로겐으로부터 얻었다. IgG 어셈블리 ELISA에 의해 IgG의 농도를 측정하였다.

중쇄 경쇄 인터페이스의 친화성 성숙을 통한 Fab X의 내열성 개선

Fab X의 야생형 Fab' 단편 및 돌연변이체를 다음과 같이 제조하였다: 상기 선별 리스트에서 결정된 잔기와 위치에 따라 중쇄 및 경쇄 가변 영역 양쪽에 단일 점 돌연변이를 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 디자인하고, 구성하였다. 돌연변이된 경쇄를 각각 별도로 UCB 셀텍 인간 경쇄 발현 벡터 pKH10.1로 서브클로닝하였고, 이는 인간 C-카파 정상 영역을 코딩하는 DNA(Km3 알로타입)를 함유하였다. 돌연변이된 중쇄 가변 영역 서열을 각각 인간 중쇄 감마-1 정상 영역을 코팅하는 DNA, CH1을 함유한 UCB 셀텍 발현 벡터 pVhg1Fab6His로 별도로 서브클로닝하였다. 제조업자의 설명서(InVitrogen 카탈로그 번호 12347-019)에 따라 293fectin^TM 과정을 사용하여 중쇄 및 경쇄 코딩 플라스미드를 HEK293 세포에 동시 형질감염시켰다. 배양 10 내지 12일 후 배양 상청액에 분비된 IgG1 Fab 항체 수준을 ELISA에 의해 평가하였고, 결합 반응속도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다(하기 참조).

그 후 개선된 내열성을 나타내는 돌연변이체를 제조하여 상기와 같이 이중, 또는 삼중 돌연변이로서 조합하여 시험하였다.

표면 플라스몬 공명( SPR )

Biacore T200(GE Healthcare)에서 모든 SPR 실험을 수행하였다. 아민 커플링 화학을 통해 약 5000 반응 단위(RU)의 포획 수준으로 CM5 센서 칩에 아피니푸어(Affinipure) F(ab')₂ 단편 염소 항 인간 IgG, F(ab')₂ 단편 특이(Jackson ImmunoResearch)를 고정하였다. HBS-EP 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % 계면활성제 P20, GE Healthcare)을 유속이 10 μL/min인 영동 완충액으로서 사용하였다. 고정화 항 인간 IgG-F(ab')₂에 의한 포획을 위해 0.75 ㎍/mL에서 Fab X의 10 μL 주입을 사용하였다. 30 μL/min의 유속에서 다양한 농도(50 nM 내지 6.25 nM)에 항원을 포획된 Fab X에 대해 적정하였다. 50 mM HCl의 2 x 10 μL 주입에 의해, 이어서 10 μL/min의 유속에서 0.5 mM NaOH의 5 μL 주입에 의해 표면을 재생하였다. 표준 과정 후 T200이벨루에이션 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 백그라운드 감산 결합 곡선을 분석하였다. 조정 알고리듬으로부터 동태 파라미터(kinetic parameter)를 결정하였다.

내열성 시험

서모플루오르(thermofluor) 시험을 수행하여 정제된 분자의 열 안정성을 평가하였다. 정제된 단백질(0.1 mg/ml)을 SYPRO® 오렌지 염료(Invitrogen)와 혼합하였고, 혼합물을 384 PCR 광학 웰 플레이트에 4겹으로 분배하였다. 샘플을 7900HT 패스트 리얼 타임(Fast Real-Time) PCR 시스템(Agilent Technologies)에서 20℃ 내지 99℃의 온도 범위에 걸쳐 1.1℃/min의 램프 속도로 분석하였다. 웰당 형광 강도 변화를 온도에 대해 플로팅하였고, 얻어진 경사의 변곡점을 사용하여 T_m을 생성하였다.

결과

인터페이스의 중쇄 및 경쇄 원자에 의한 요타 밀도 맵의 검사

로제타 스캔을 사용한 자동화 방법으로 IOTA 점수에 의해 등급화된 돌연변이 표를 만들었다(표 6).

내열성에 대한 Fab X 위 요타 디자인된 돌연변이의 효과

Fab X에서 6개의 요타 디자인된 단일 점 돌연변이, H-T71R, H-T71K , H-T71N, H-T71H, L-S107E 및 L-T109I는 야생형에 비해 0.5℃ 내지 2.9℃ 범위의 내열성에서 약간의 개선을 보여주었다(표 7). 도 15, 16 및 17에서는 단일 점 돌연변이의 효과를 도시하는 컴퓨터 생성 가시화를 제공한다. 특히, 이들 도면에서는 H-T71, L-S107 및 L-T109가 밀도 교차가 없지만, H-R71은 아미드 밀도와 교차하고, L-E107은 카르복실레이트 밀도와 교차하며, L-I109는 메틸 밀도와 교차하는 것을 보여준다. 이들 돌연변이의 쌍 조합은 내열성에서 상승적인 향상을 얻었고; 삼중 조합으로 내열성에서 추가 단계 향상을 나타냈다(표 8).

H-T71R, L-S107E 및 L-T109I 돌연변이의 조합은 내열성에서 최대 향상을 나타내어(표 8) 81.2℃의 Tm을 제공하였고, 초기 Fab X보다 대략 5.8℃ 더 양호하였다. 3개 돌연변이의 이러한 조합은 도 18에 도시되어 있다. 중요한 발견은 이의 항원에 대한 결합에 대해 상당한 손실이 없었다는 사실이었다.

[표 6]

[표 7]

[표 8]

Claims

거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하기 위한, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위해 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법으로서,
(a) 표적 결합 부위의 표면을 형성하는 원자의 표적 리스트를 확인하는 단계;
(b) 표적 리스트에서, 이하 세타(theta) 원자로서 언급되는, 각 원자를 특정 세타 원자 형태로서 확인하는 단계;
(c) 생체 거대분자의 구조 데이터베이스로부터, 비결합, 분자 내 또는 분자 간 원자 대 원자 접촉(contact)들에 대한 정보를 추출하는 단계로서, 접촉하는 원자 쌍에서 제1 원자는 특정 세타 원자 형태이며, 이하 요타(iota) 원자로서 언급되는, 상기 쌍의 상대, 제2 원자는 특정 요타 원자 형태이고, 상기 정보는 세타 원자에 대한 요타 원자에 관한 공간 및/또는 전후상황(contextual) 데이터를 포함하며, 상기 데이터베이스로부터 제공된 세타 원자 형태의 다수 접촉을 위해 수집된 상기 데이터는 이하 세타 접촉 세트로서 언급되는 단계;
(d) 단계 (b)에서 표적 리스트 중 확인된 각 세타 원자에 대해, 단계 (c)에서 추출되는 상응하는 세타 접촉 세트로부터, 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 관한 데이터를 표적 결합 부위에서 또는 이 주위에 중첩시키는 단계;
(e) 제공된 요타 원자 형태, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹이 높은 이론 경향(theoretical propensity)을 가지는 결합 부위의 1 이상의 우선 영역을 예상하는 방식으로 상기 중첩된 데이터를 조합하고/하거나 분석하는 단계; 및
(f) 결합 부위에 개념적으로 도킹된(docked) 후보 리간드를 이용하여, 후보 리간드의 1개 이상의 원자의 형태 및 위치를 각 요타 원자 형태에 대해 예상되는 우선 영역과 비교하여, 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 면에서 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이에 더 많은 교차를 생성할 후보 리간드에 대한 개질을 확인하는 단계로서, 개질되지 않은 후보 리간드와 비교하여 결합 부위에 대한 개질된 후보 리간드의 친화성에서 개선을 유도하는 단계를 포함하며,
데이터베이스에서 각 비결합 분자 내 또는 분자 간 접촉이 단백질 접힘(fold)의 상대 잔기 사이 또는 거대분자 접힘의 상대 단량체 단위 사이 또는 2개의 상호 작용하는 거대분자 파트너 사이의 접촉으로서 정의되고, 구체적으로 접힘의 일 측에서의 세타 원자 또는 제1 상호 작용 파트너와 상대 측에서의 요타 원자 또는 제2 상호 작용 파트너 사이이며;
한 경우에 하기 조건이 충족되고:
s -Rw≤t
(상기 식에서 s는 2개 접촉 원자 사이의 간격이며, Rw는 2개의 접촉 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 미리 결정된 한계 거리임);
세타 원자 형태는, 요타 원자로서 제공된 세타 원자를 수반하는 접촉에 관한 데이터를 제외하고, 제공된 세타 원자 형태에 대해 단계 (c)에서 추출되는 세타 접촉 세트의 데이터와 임의의 다른 세타 원자 형태에 대해 단계 (c)에서 추출되는 임의의 다른 세타 접촉 세트의 데이터 사이에 교차가 존재하지 않도록 단계 (b)에서 유일하게 확인되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서 단백질 구성원의 구조 데이터베이스로부터 추출되는 비결합 분자 내 접촉 각각에 대해 하기 조건이 또한 충족되는 것인 방법:
접촉 세타 원자와 요타 원자가 선형 폴리펩티드를 따라 적어도 4개 잔기에 의해 분리되는 상이한 잔기 상에 있거나 별도의 폴리펩티드 사슬 상에 있음.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세타 원자 형태가
단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자;
데옥시리보핵산 중합체(DNA)의 4개 뉴클레오티드에 존재하는 82개 비수소 원자;
메틸화 DNA 뉴클레오티드, 시티딘 인산 및 아데노신 인산에 존재하는 42개 비수소 원자;
리보핵산 중합체(RNA)의 4개 뉴클레오티드 인산에 존재하는 85개 비수소 원자;
RNA의 2-O'-메틸화 리보스 뉴클레오티드 인산에 존재하는 89개 비수소 원자;
가장 흔한 전사 후 염기 변형 RNA에 존재하는 400개 초과 비수소 원자 중에서 유일한 하나로서 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 추출되는 정보가 세타 원자 형태 각각에 대해 유일한 세타 접촉 세트를 포함하는 이차 데이터베이스에서 수집되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 이차 데이터베이스 세타 접촉 세트는 각각 다수의 겹치지 않는 요타 원자 형태 또는 관련 요타 원자 형태의 겹치지 않는 그룹으로 다시 나누어지는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 요타 원자 형태가
단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자;
구조적으로 관련된, 단백질 결합 물 분자에 존재하는 산소 원자;
데옥시리보핵산 중합체(DNA)의 4개 뉴클레오티드에 존재하는 82개 비수소 원자;
메틸화 DNA 뉴클레오티드, 시티딘 인산 및 아데노신 인산에 존재하는 42개 비수소 원자;
리보핵산 중합체(RNA)의 4개 뉴클레오티드 인산에 존재하는 85개 비수소 원자;
RNA의 2-O'-메틸화 리보스 뉴클레오티드 인산에 존재하는 89개 비수소 원자; 및/또는
RNA의 가장 흔한 전사 후 변형 염기에 존재하는 400개 초과 비수소 원자 중에서 유일한 하나로서 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 관련된 요타 원자 형태의 상기 미리 결정된 그룹이, 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자를 유사한 화학 형태의 그룹으로 분류함으로써 얻어지는 다수의 겹치지 않는 그룹 중 하나인 방법.
제7항에 있어서, 요타 원자 형태는 원자 형태의 원소 특성, 원자 형태의 혼성 상태 요인 중 1개 이상에 따라 다수의 겹치지 않는 그룹으로 분류되는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 요타 원자 형태는 C sp³, C sp²(방향족), C sp²(비방향족), N sp³, N sp², O sp³, O sp², S를 포함하는 다수의 겹치지 않는 그룹으로 분류되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)에서 추출되는 상기 공간 데이터는 세타 원자의 위치 및 제3 원자 및 제4 원자의 위치를 기하학적으로 참조함으로써 세타 접촉 세트에 규정되는 각 요타 원자의 위치를 한정하며;
제3 원자는 세타 원자에 공유 결합되고;
제4 원자는 제3 원자에 공유 결합되는 것인 방법.
제10항에 있어서,
세타 접촉 세트에 규정되는 각 요타 원자에 대해, 단계 (c)에서 추출되는 상기 공간 데이터는 세타 원자의 위치 및 제3 원자 및 제4 원자의 위치를 기하학적으로 참조함으로써 제5 원자 및 제6 원자의 위치를 한정하며;
제5 원자는 요타 원자에 공유 결합되고;
제6 원자는 제5 원자 또는 요타 원자에 공유 결합되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 단계 (d)의 표적 부위에서 또는 이 주위에서 중첩은
세타 접촉 세트를 분석하여, 제공된 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 1 이상을 포함하는 접촉을 위한 공간 데이터를 추출하는 단계; 및
i) 접촉 세타 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 위치에 발견되었고; ii) 접촉 제3 원자 및 제4 원자가 표적 결합 부위에서 상응하는 세타 원자의 제3 원자 및 제4 원자의 위치에서 발견된 경우, 이러한 공간 데이터를 플로팅하여, 각 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상이 각각 발견될 곳을 나타내는 이론 위치를 정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 추출된 공간 데이터가 상기 플로팅 단계 전에 상기 전후상황 데이터에 대해 분석되는 것인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 제공된 요타 원자 형태를 위한, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상을 위한 이론 위치 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역은 우선 영역 중 한 영역으로서 확인되는 것인 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 요타 원자 형태를 위한, 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹 중 1 이상을 위한 이론 위치는 표적 리스트 상의 다수의 세타 원자에 대해 결정되며, 누적 이론 위치 밀도가 미리 결정된 한계를 넘는 영역은 우선 영역 중 한 영역으로서 확인되는 것인 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 요타 원자의 이론 위치가 Rw - 0.2 옹스트롬보다 더 가까운 표적 거대분자의 원자 위치와 교차하면, 상기 요타 원자는 후속 분석으로부터 배제되는 것인 방법.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 원자 및 제4 원자가 각각 규정된 세타 원자 형태에 대해 유일하게 선택되는 것인 방법.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 원자 및 제6 원자가 각각 규정된 요타 원자 형태에 대해 유일하게 선택되는 것인 방법.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각 우선 영역에 대해, 벡터는 제5 원자의 위치를 그의 각 요타 원자에 대해 기술하도록 유도되며, 분석은 상기 영역에서 이론 공통(consensus) 요타 원자의 공유 결합에 대한 예상을 나타내는 우선 결합 벡터(bond vector)를 확인하기 위해 상기 벡터에 대해 수행되고, 상기 확인된 우선 결합 벡터는 후보 리간드의 디자인 또는 후보 리간드의 개질을 개선하는데 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 추출되는 상기 전후상황 데이터는 이차 구조, 접촉 쌍을 포함하는 아미노산 형태 또는 다른 단량체 형태, 접촉 양측에서 중합체 사슬 내 인접 단량체 단위 및/또는 이의 국소 형상, 접촉 양측에서 폴리펩티드 사슬에서 인접 아미노산, 상기 인접 단량체 단위 또는 아미노산의 국소 형상, 세타 원자의 온도 인자, 요타 원자의 온도 인자, 세타 원자의 접근 가능한 표면적, 요타 원자의 접근 가능한 표면적, 특정 세타 원자에 대한 상이한 요타 원자 접촉 수 및 세타 원자와 동일한 단량체 단위 상의 다른 세타 원자 수 중 1 이상을 임의 조합으로 포함하여, 세타 접촉 세트에서 각 접촉 쌍의 국소 환경에 관한 전후상황 정보를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)는 후보 리간드의 1개 이상의 원자 및 결합 부위에서 요타 원자 형태 또는 관련된 요타 원자 형태의 미리 결정된 그룹에 대해 예상되는 우선 영역 또는 영역들 사이의 중첩도를 증가시키는 후보 리간드의 개질을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 리간드에 대한 다수의 개질이 단계 (f)에서 확인되고, 방법은 1) 교체 및/또는 추가 후보 리간드 원자 및 각 요타 원자 형태 우선 영역 사이의 교차가 개질 안 된 후보 리간드와 비교하여 더 많은 정도; 및 2) 결합 부위에 개질된 후보 리간드의 결합에 의해 형성된 복합체의 총 에너지에 기여하는 1개 이상의 요인이 개질 안 된 후보 리간드가 결합하는 경우와 비교하여 줄어드는 정도 중 하나 또는 둘 다에 기초하여 확인된 개질의 서브세트를 선택하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, t = 2.5 옹스트롬인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, t = 0.8 옹스트롬인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서 확인된 개질을 나타내는 데이터를 출력하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 단백질인 방법.
제26항에 있어서, 리간드가 항체인 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 단계 (f)는 표적 결합 부위와 직접 접촉하거나, 표적 결합 부위와 아주 근접해 있는 리간드 중 1종 이상의 아미노산 잔기를 각각 나머지 19개 천연 아미노산으로부터 선택된 1종 이상의 교체 잔기로 각각 치환하는 단계로서, 각 치환이 잔기 치환으로 언급되는 단계를 포함하며,
치환 잔기 및 리간드 또는 표적의 인접 원자 사이에서 충돌을 일으키지 않는 각 잔기 치환에 대해, 치환 잔기 중 각 원자의 형태와 위치를 각 요타 원자 형태 우선 영역과 비교하여 이들이 원래 잔기의 원자보다 더 많은 교차를 생성할 것인지 확인하는 것인 방법.
제28항에 있어서,
원래 잔기의 원자보다 더 많은 교차를 생성하는 것으로서 확인되는 잔기 치환 리스트를 출력하는 단계;
리스트된 잔기 치환의 각각에 대해, 후보 리간드의 돌연변이를 사용하여 잔기 치환을 포함시키는 개질된 리간드를 생성하는 단계;
어느 잔기 치환이 미리 결정된 한계를 넘는 친화성 개선을 얻는지를 결정하기 위해 표적 결합 부위에 대한 각 개질된 리간드의 친화성을 시험하는 단계를 더 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 후보 리간드를 개질하여, 미리 결정된 한계를 넘는 친화성 개선을 얻는다고 결정된 다수의 잔기 치환을 포함시키는 단계를 더 포함하는 방법.
컴퓨터가 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법을 수행하게 하는 컴퓨터 판독 가능한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체 또는 신호.
제31항에 있어서, 컴퓨터가 적어도 단계 (c) - (e)를 수행하게 하는 것인 매체 또는 신호.
제31항 또는 제32항에 있어서, 컴퓨터가 적어도 단계 (f)를 수행하게 하는 것인 매체 또는 신호.
치료용 리간드의 제조 방법으로서,
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 따라 치료용 리간드를 디자인하는 단계; 및
이와 같이 디자인된 치료용 리간드를 제조하는 단계를 포함하는 방법.
제34항의 방법에 따라 제조된 치료용 리간드.
제34항 또는 제35항에 있어서, 리간드가 단백질인 방법 또는 리간드.
제36항에 있어서, 단백질이 항체인 방법 또는 리간드.
거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하기 위한, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위한 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법에 사용하기 위한 데이터베이스 생성 방법으로서,
단백질 또는 거대분자 중 세타 원자로서 언급되는 제1 원자, 및 요타 원자로서 언급되는 제2 원자 사이의 비결합 분자 내 접촉의 경우를 확인하기 위해 다수의 단백질 또는 다른 생체 거대분자 각각에서 각각 원자의 상대 위치를 분석하는 단계; 및
각 확인된 접촉을 위해 세타 원자의 형태, 요타 원자의 형태, 및 세타 원자에 대한 요타 원자의 위치를 명기하는 데이터베이스를 생성하는 단계를 포함하며;
비결합 분자 내 접촉은 하기 조건이 충족되는 경우로서 정의되며:
s -Rw≤t
(상기 식에서 s는 세타 원자와 요타 원자 사이의 간격이며, Rw는 세타 원자와 요타 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 전형적으로 2.5 옹스트롬 및 바람직하게는 0.8 옹스트롬의 미리 결정된 한계 거리임);
단백질의 경우에, 세타 원자 및 요타 원자는 선형 폴리펩티드 상의 적어도 4개 잔기에 의해 서로 분리되는 아미노산 잔기 상에 있거나 별도의 폴리펩티드 사슬 상에 있는 방법.
제38항에 있어서, 데이터베이스를 다시 나누어 세타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자 중 유일한 하나이고, 요타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자를 분류함으로써 얻어지는 다수의 겹치지 않는 그룹 중 유일한 하나에 있는 확인된 접촉 그룹을 화학적 유사성에 기초한 그룹으로 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
거대분자 표적의 결합 부위에 결합할 리간드를 처음부터 디자인하기 위한, 또는 거대분자 표적의 결합 부위에 대한 리간드의 친화성을 개선하기 위한 리간드에 대한 개질을 확인하는 방법에 사용하기 위한 데이터베이스 생성 방법으로서,
단백질 또는 거대분자 중 세타 원자로서 언급되는 제1 원자, 및 요타 원자로서 언급되는 제2 원자 사이의 비결합 분자 내 접촉의 경우를 확인하기 위해 다수의 단백질 또는 다른 생체 거대분자 각각에서 원자의 상대 위치를 분석하는 단계; 및
각 확인된 접촉에 대해 세타 원자의 형태, 요타 원자의 형태, 및 세타 원자에 대한 요타 원자의 위치를 명기하는 데이터베이스를 생성하는 단계를 포함하며;
비결합 분자 내 접촉은 하기 조건이 충족되는 경우로서 정의되며:
s -Rw≤t
(상기 식에서 s는 세타 원자와 요타 원자 사이의 간격이며, Rw는 세타 원자와 요타 원자의 반 데르 발스 반경 합이고, t는 전형적으로 2.5 옹스트롬 및 바람직하게는 0.8 옹스트롬의 미리 결정된 한계 거리임);
데이터베이스를 다시 나누어, 세타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자 중 유일한 하나이고, 요타 원자가 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자를 화학적 유사성에 기초한 그룹으로 분류함으로써 얻어지는 다수의 겹치지 않는 그룹 중 유일한 하나에 있는 확인된 접촉 그룹을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서,
각 접촉에 대해, 요타 원자의 위치는 세타 원자의 위치 및 제3 원자와 제4 원자의 위치를 기하학적으로 참조함으로써 한정되며, 제3 원자는 세타 원자에 공유 결합되고, 제4 원자는 제3 원자에 공유 결합되며, 방법은
각 접촉의 요타 원자, 세타 원자, 제3 원자, 및 제4 원자의 좌표를 표준화 좌표 그룹을 생성하는 그룹으로서 표준화하는 단계;
1개 이상의 세타 원자 형태 각각에 대해, 세타 원자 형태 및 제공된 요타 원자 형태를 포함하는 다수 접촉을 위한 표준화 좌표 그룹을 사용하여, 세타 원자에 대해, 위도 및 경도 면에서, 제공된 요타 원자의 방향 분포를 나타내는 2차원 극 플롯(polar plot)을 생성하는 단계;
상이한 요타 원자 형태에 대해 상기 단계를 반복하는 단계;
생성된 2차원 극 플롯을 비교하여 유사한 방향 분포를 얻는 요타 원자 형태의 그룹을 확인하고, 이들 그룹을 화학적 유사성에 기초한 그룹으로서 사용하여 단백질의 20개 천연 아미노산에 존재하는 167개 비수소 원자를 다수의 겹치지 않는 그룹으로 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2000개 단백질 또는 다른 생체 거대분자로부터 접촉 정보를 추출하는 단계를 포함하며, 추출된 정보가 적어도 2백만 접촉 원자 쌍에 대한 정보를 포함하는 것인 데이터베이스 생성 방법.
제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10000개 단백질 또는 다른 생체 거대분자로부터 접촉 정보를 추출하는 단계를 포함하며, 추출된 접촉 정보가 적어도 1천만 접촉 원자 쌍에 대한 정보를 포함하는 것인 데이터베이스 생성 방법.
제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따라 생성된 데이터베이스를 저장하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따라 컴파일된 데이터베이스를 사용하는 방법으로서, 제공된 항체-항원 복합체에 대해, 항체 결합 부위에서 또는 이 주위에서 아미노산 잔기에 대한 특정 돌연변이가 항원에 대한 항체의 더 높은 결합 친화성을 생성한다고 예상되는 것인 방법.