JP2016527292A

JP2016527292A - 皮膚抗老化処置用組成物

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Publication number: JP2016527292A
Application number: JP2016532347A
Authority: JP
Inventors: スカルチフランチェスコ; イオブジュリアナ; メランフェデリコ
Original assignee: ポリケム・エスエイ
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2014-08-04
Publication date: 2016-09-08
Also published as: CN105555250A; AU2014304620A1; BR112016002580A2; WO2015018792A1; UY35695A; MX2016001686A; CA2919771A1; TW201536343A; AR097216A1; IL243759A0; WO2015018791A1; EP2835130A1; HK1220138A1; EP3030219A1; US20160175241A1

Abstract

【課題】皮膚抗老化処理用組成物【解決手段】本願発明は、ホップエキスを、ヒアルロン酸及びＣ1−Ｃ4アルカノールと組み合わせて含む組成物、及びヒトの皮膚の抗老化処置としての該組成物の使用に関する。本願発明の使用のためには、新規組成物は局所投与される。【選択図】なし

Description

本願発明は、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓ）抽出物を、ヒアルロン酸及びＣ₁−Ｃ₄アルカノールと組み合わせて含む組成物、及びヒトの皮膚に対する抗老化処置のための該組成物の用途に関する。本願発明の用途のために、前記新規組成物は経口投与される。

老化プロセスは、細胞の老化及び関連するストレスに対する反応能力の低下の生理学的結果である。この不可逆的プロセスは、身体に幾つかの変化を引き起こし、その一つが顔に皺が出現することに関する。

皮膚は２つの主要な層からできている。外部層は表皮であり、主に角化細胞からできており、環境損傷（病原菌、熱、ＵＶ照射及び水分喪失）に対抗するバリアー形成の任務を負っている。内部層は真皮であり、結合組織を含み；コラーゲン（皮膚に堅さを付与）、弾性繊維（皮膚に弾性を付与）及び細胞外基質（構造成分）等の構造成分からできている。皮下組織という第三の層も存在し、身体に断熱性を与える脂肪細胞を含んでいる。
皺は、生体分子の機能を損なう糖化プロセスに起因する皮膚の襞、隆線、または折り目である（非特許文献１）。老化プロセスが、皺出現の唯一の原因ではなく、他の要素が皺形成を促進しうる。すなわち、喫煙、太陽光曝露、皮膚のタイプ、環境要素及び遺伝である（非特許文献２）。

皮膚の皺の形成は皮膚構造の障害に本質があり、該皮膚構造の障害は、コラーゲンの欠乏、その修飾、菲薄化及び／又は断片化；あるいは、皮膚のある領域、特に顔面の伸長及び繰り返される伸展により引き起こされる（非特許文献３）。エラスチンの欠乏もまた、該プロセスに重要な役割を有している。その減少及びその結果である弾力性の喪失は、皮膚の体積を増加させ、二重顎のような現象を生じさせる。皮膚の足場材料におけるこれらすべての変化が組み合わさって、皺の外観を生じさせる。該皺の性質は、皮膚の性質及び筋肉収縮に依存する。この退化プロセスの結果、皮膚の脆弱性が増加し、表皮が利用できる養分の量が減少して、正常な皮膚の修復プロセスを妨げ、皺及び弛みをより顕著にする。

習慣的な顔の表情、従って筋肉の持続的収縮により、前記のような組織喪失に起因して皮膚に皺を生じさせる。さらに、重力の効果は、皺及び皮膚の弛みの外観の原因となる。これは顎肉の垂れや瞼の垂れ下がりを引き起こす。

このように老化は、皮膚に影響を及ぼす不可逆的なプロセスであり、前記層中における、あるいは不完全に再構成された繊維細胞中における構造性物質（主にコラーゲン）の減少、及びその他の皺形成を引き起こす多因子性の問題に起因する。

主にコラーゲン繊維細胞及びエラスチンを含む、喪失した繊維細胞の再生は、皺の処置及び予防の最善のターゲットである。

当該技術分野において、皺を改善するために有益な、医学的、外科的、及び化粧的解決策による多くの処置方法が存在する。これらの処置方法は、老化するコラーゲンの性質を変え、皮膚を伸ばし、皮膚の窪みを埋め、あるいは皮膚を皺にする筋肉を無力化することを意図している。

医学的処置方法の中には、以下のようなものがある。すなわち、ビタミンＡ酸（レチノイド）は皮膚細胞の代謝回転を増加させるが、充血、剥離、及び一般的な不快感を生じさせるかもしれない。アルファ−ヒドロキシ酸は、皮膚の最上層に浸透して、わずかではあるが改善を生み出すものの、軽度で一時的な炎症を引き起こす。抗老化漿液（ａｎｔｉ−ａｇｉｎｇｓｅｒｕｍ）は、皮膚を刺激し、真皮中のコラーゲン及びエラスチン網状組織を再構築することで、皮膚構造を再生し、皮膚の弾力性を改善し、皺を平滑にする。しかし、欠点として、関連費用；及び、非常に多くの場合、この化合物の本当の組成は、動物源から入手されるところ、特定されていないという事実がある。

外科分野においては、多くの手法がある。すなわち、皮膚剥離術及びレーザー・リサーフェシング（ｌａｓｅｒｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）は回転器具及びレーザーをそれぞれ用いて皮膚を滑らかにする。これらの処置方法は、たとえ優れた改善をもたらし得るとしても、重大な副作用、たとえば瘢痕化や皮膚の色の持続的変化等をも生じさせ得る。

老化の処置方法において良好な改善を与える他の手法として、形成外科法［外科的美容整形（ｓｕｒｇｉｃａｌｆａｃｅｌｉｆｔ）］；顔面の筋肉を弛緩させ、皺の線を消失させるボツリヌス毒素の注入；体積を増加させ、皺や襞を平坦化する充填物（コラーゲンまたはヒアルロン酸とカルシウム・ヒドロキシアパタイトでできた充填物、または自家脂肪移植）；熱及び高周波、が挙げられる。これらの改善は数ヶ月持続するが、その後は改善を維持するためには繰り返さないといけない。外科的方法の場合もやはり、組織細胞の再生プロセスとは逆であり、審美的な方法で作用するのみであり、皮膚再生の意味で作用するものではない。

化粧製品の中では、小皺及び瘢痕を滑らかにする作用を有する、表面上の、あるいはより深い剥離材（ｐｅｅｌｓ）；穏やかな剥脱材として働く、極小皮膚切除材（ｍｉｃｒｏｄｅｒｍａｂｒａｓｉｏｎ）が挙げられる。両方とも、皮膚の再生とは逆に作用し、大部分は皮膚層最上部を取り除くことで、皮膚の窪みを改善しようとするものである。

抗酸化剤は、コラーゲン分解の原因となるフリーラジカルを中和することで、太陽からの保護を提供する。このメカニズムによって、抗酸化剤は、皺形成の更なる悪化を阻止する上で非常に重要でありうる。

最後に、保湿剤は、皮膚に潤いを与え続けることで、皺を一時的により目立たなくすることができる。

結論として、皺形成を処置・予防する最善の製品は、１）組織細胞（その大部分はコラーゲン）を再生し、２）酸化に対抗し、３）皮膚を保湿するという意味で作用するべきである。

臨床的及び視覚的評価（ホウレイ線及び目尻の皺、頬部下垂、表面微小起伏、皮膚のくすみ、皮膚の堅さ、のレベルにおける皺の等級）は、計測による評価と共に、抗老化処置方法の効能を決定するのに必要とされる方法の典型である（非特許文献４）。ホウレイ線のレベルにおける皺及び目の周囲領域の皺は、臨床及び写真による２つの参照尺度によって決定され、皺の存在及び等級を特定または非特定し、結果を０（皺なし）から７（非常に際立った皺）に採点する。同様に顎下下垂が、臨床的写真尺度（非特許文献５）に従って、０（下垂なし−非常に規則的な卵形の顔）から５（非常に際立った下垂−非常に不規則的な卵形の顔）に採点される。頬の写真尺度を基礎にして、表面微小起伏もまた、１（非常に規則的）〜４（非常に不規則的）の採点を参照しつつ評価される。

顔全体の皮膚のくすみは、１（明るい皮膚）〜４（非状にくすんだ皮膚）の採点に従って、明度で評価する。同様に、皮膚の堅さは、締付（ｐｉｎｃｈｉｎｇ）に対する皮膚の抵抗性、牽引に対する抵抗性及び締付後の回復性を、頬（頬部）のレベルで、０（非常に重大）〜４（非常に弱い）の採点に従って見積もる。

当該技術分野において、Ｈｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓ（一般にはホップと呼ばれている）は、抗皺剤としてすでに知られている。しかし、後に見るように、非常に高い濃度においてである。これはアサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅｆａｍｉｌｙ）の植物種であり、多くのビール及び醸造酒の主要成分である。ホップの球果は、樹脂状の苦味成分（５〜３０％）を含んでおり、大部分はアルファ−苦味酸（フムロン２〜１０％）及ベータ苦味酸（ルプロン２〜１６％）及びそれらの酸化分解産物（２−メチル−３−ブテン−２−オール）；ポリフェノール縮合タンニン（２〜４％）；揮発油（０．３５〜１．０％）、主にモノテルペン及びセスキテルペン（ベータカリオフィレン、ファルネセン、フムレン、ベータミルセン）；カルコン（キサントフモール）；フラボノイド（ケンペロール、ケルセチン、ルチン）；フェノール酸；及びアミノ酸である（Ｂｒａｄｌｅｙ，１９９２；Ｂｒｕｎｅｔｏｎ，１９９５；ＥＳＣＯＰ，１９９７；ＬｅｕｎｇａｎｄＦｏｓｔｅｒ，１９９６；Ｎｅｗａｌｌｅｔａｌ．，１９９６；ＷｉｃｈｔｌａｎｄＢｉｓｓｅｔ，１９９４）。

薬剤用途には、植物エキスは、液体稠度の製剤（たとえば液体エキス、チンキ剤）、半固体稠度の製剤（軟エキス及び含油樹脂）または固体稠度の製剤（乾燥エキス）であり、それらの製造方法（抽出されるべき植物薬の状態、溶媒、抽出条件）及び仕様によって決定される。エキスは、適切な方法［たとえば、浸軟（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）、浸出（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ）］によって、薬局方の任意の関連する基準に従って、水、エタノールまたはその他の適切な有機溶媒を用いて調製される。抽出されるべき植物薬に予備的処理、たとえば、酵素不活性化、破砕または脱脂を施してもよい（非特許文献６）。
ホップは、薬草使用の実績を有し、主に、すでに知られた体や心に対する鎮静、鎮痛、強壮及び沈静効果のために使われてきた（非特許文献７）。

特許文献１には、更年期後の女性の膣の乾燥を防止するために、いかなるエストロゲン促進効果（ｐｒｏ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｅｆｆｅｃｔ）も避けることができるような低濃度で、ホップエキスを膣に使用することが開示されている。ホップを使用して、皮膚老化の兆候を緩和し、皺をより目立たなくする又は消失させることが、ある論文に開示された（非特許文献８）。該論文では、ホップ植物から抽出されたフラボノイドの一種であるキサントフモールが、２つの異なる濃度（０．１％及び１％）で、皮膚の構造と堅さの改善に有効な結果を与えている。キサントフモールは、ホップ薬の全量の１％を占め（非特許文献９）、非特許文献８で有効とされた２つの濃度は非常に高く、単純にチンキ剤母液（ｍｏｔｈｅｒｔｉｎｃｔｕｒｅ）またはエキスを使用することによっては、皺取りクレーム等には到達しえない。引用した先行技術における皺に有効な濃度に達するには、非常に高度で高価な方法を採用しなければならない。

皺に対抗するために使用される、もう一つの成分はヒアルロン酸である。これは、人体の上皮組織及び結合組織に見出すことができる天然成分である。これは、３つの主要機能を果たしている。すなわち、関節の間にある軟骨を機械的劣化から保護すること、それらを水和した状態に保ち、及び細胞移動を制御することである。また、白血球がいくつかのタイプの感染と戦うのを助けることによって、免疫応答刺激において基本的役割をも有している。その効果的な生物学的水和性と再生特性により、ヒアルロン酸は、多くの抗老化美顔クリームや美容液における主要成分として用いられている、しかし、本当に効果的ではあるためには、０．１％以上の濃度が必要とされている（非特許文献１０）。

エタノールは最も一般的な有機溶媒であり、家庭及び産業界において広く使用されている。同様な効果は、エタノールまたは他の低分子量アルコール、すなわち、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコールを用いることによって得られる。エタノール及び他の低級アルコールは、医療用拭き取り繊維等のヒトの皮膚に直接曝露される製品や、手に用いる非常に一般的な抗菌除菌ジェルに広く使用されている。これは、エタノール及び他の低級アルコールが、タンパク質を変性し、脂肪を溶解させることで有機体を殺すことができ、多くの細菌や菌類に対抗するのに効果的なことに起因する。逆に、エタノール、及びプロピルアルコールまたはイソプロピルアルコールは、皮膚再生／皺用組成物には薦められない。その脂肪溶解効果及び脱水効果が、皮膚を薄くかつ堅くすることによって、皮膚の老化及び皺の外観を悪化させるかもしれないからである。

国際公開第２００７／０８５３２７号（Ａ１）

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驚くべきことに今回、エタノールのようなＣ₁〜Ｃ₄アルコールが、ホップ及びヒアルロン酸との併用で相乗的に作用でき、老化した皮膚に適用した際のコラーゲン再生、抗酸化効果及び湿潤化という観点での、抗老化作用の達成に有益であることが見出された。

この相乗的組み合わせの更なる利点は、主要成分が非常に低い濃度で活性であるということである。たとえば、ホップエキスの１５重量％までの濃度、従って、いかなるエストロゲン効果をも避けるため非特許文献８において開示されているよりも、ずっと低い投与量のキサントフモールを含む濃度で活性である。同様に前記組み合わせは、非常に低い濃度のヒアルロン酸、５重量％までの濃度のヒアルロン酸で活性であり、この成分の高いコストを節約できる。

本願発明の対象は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルカノールを、ホップエキス及びヒアルロン酸と組合せて含む組成物、及びヒトの皮膚に対する抗老化処置としての前記組成物の使用である。

本願発明の抗老化処置として、低濃度のホップと、低濃度のヒアルロン酸及びＣ₁〜Ｃ₄アルコール（好ましくはエタノール）との組み合わせを、半固体または液体製剤の形態で局所適用する。前記製剤は、溶液、乳濁液または懸濁液、クリーム、ゲル、美容液及び軟膏の形態とすることができる。これらは、特に顔面に直接適用することによって抗老化効果を達成するのに適切である。

このようなホップエキスは、液体、半固体、または固体エキスとでき、好ましくは液体エキスであり、より好ましくは、新鮮な植物球果で調製されたチンキ剤、いわゆる「チンキ剤母液」（ｍｏｔｈｅｒｔｉｎｃｔｕｒｅ）である（非特許文献１１）。このようなエキスは、新鮮なホップの雌の球果を、室温（好ましくは２０〜２５℃）で２０〜３０日間、水及びエタノールの溶液に浸して柔らかくすることで得ることができる。水は通常、エタノールに対して、３５．０％から５５．０％の重量比率で用いられる。

ホップエキスは、０．１％〜１５％の濃度（ｗ／ｗ）で存在でき、より好ましくは０．２％〜５％、最も好ましくは０．５％〜２．５％である。

ヒアルロン酸は、そのもの自体を用いてもよいし、医薬上許容しうる塩又はエステルの形態で用いてもよい。医薬上許容しうる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩または天然アミノ酸との塩（たとえば、リジン、アルギニン、メチオニンまたはアスパラギン酸）から選択することができる。医薬上許容しうるエステルとしては、アスコルビルヒアルロネート、パルミトイルヒアルロネート、ベンジルヒアルロネート、ブチロイルヒアルロネートナトリウム、ブチロイル／フォルモイルヒアルロネートナトリウムから選択することができる。

好ましいヒアルロン酸のエステルは、ブチロイルヒアルロネートナトリウム、パルミトイルヒアルロネート及びアスコルビルヒアルロネートである。

ヒアルロン酸又は医薬上許容しうるその塩若しくはエステルは、０．０１％〜５％、より好ましくは０．０２５％〜４％、最も好ましくは０．０４％〜２．０％の濃度（ｗ／ｗ）で存在してよい。

前記Ｃ₁〜Ｃ₄アルカノールは、０．５％〜１５．０％、より好ましくは１．０％〜１０．０％。最も好ましくは３．０％〜７．０％、さらにより好ましくは２．０％〜６．０％の濃度（ｗ／ｗ）で存在してよい。これは、好ましくは、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールから選択され、エタノールが最も好ましい。

医薬組成物、医療装置及び化粧品は、慣用の手法で作製してよく、許容しうる賦形剤、アジュバント、及び／又は担体を含んでもよく、更に補充的または、ともかく有益な活性を有する一又は複数の活性成分と組み合わせてもよい。

本願発明の対象である組成物と組み合わせて用いることのできる活性成分としては、湿潤剤、皮膚軟化剤、抗酸化剤、及びビタミンが含まれるが、これらに限定されない。用いることのできる賦形剤としては、保湿剤、好ましくはプロピレングリコール、レオロジー添加剤、乳化剤、皮膚軟化剤、保存料、フォスファチジルコリンのリポソーム・ビヒクルのような浸透促進剤；天然、合成、及び半合成のポリマー及びコポリマー、シリコーン誘導体、組織化効果及び軟焦点（ｓｏｆｔ−ｆｏｃｕｓ）効果を有する粉末及び充填材が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい保湿剤であるプロピレングリコールは、１％〜５０％、より好ましくは２％〜３０％、最も好ましくは、５％〜２０％の濃度（ｗ／ｗ）で存在してよい。

好ましい合成及び半合成ポリマーは、カーボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ）として知られるアクリル酸の高分子量合成ポリマーである。カーボマーという用語は、ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーを意味することを意図する。カーボマーは、水を吸収、保持し、その元の体積の何倍にも膨潤する。これは、不溶性固体を液体中に分配または懸濁させるのに役立つ。これはまた、乳濁液がその油成分と液体成分に分離しないように保持するのにも使われる。カーボマーは、化粧品及びパーソナルケア製品の稠度と流動性を制御するのに頻繁に使われる。

カーボマーは、０．１％〜２％、より好ましくは０．２５％〜１．５％、最も好ましくは０．５％〜１％の濃度（ｗ／ｗ）で存在してよい。

本願発明の組成物の例としては、局所適用のための、クリーム、ゲル、軟膏、溶液、乳濁液、懸濁液を含む。

本願発明の医薬組成物及びその使用を以下の実施例でより詳細に説明する。しかし、このような実施例は説明のために提示されるものであり、限定として提示するものではないことには注意されたい。

実施例１
以下の組成（重量部、％）を用いて、ゲル形態製剤を調製する。
プロピレングリコール１２．００％
変性エタノール５．００％
ホップの水アルコールエキス１．００％
フォスファチジルコリン０．８５％
カーボマー^* ０．７５％
メチルパラベンナトリウム０．２６％
イミダゾリジニル尿素０．２０％
水酸化ナトリウム０．１２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％
ヒアルロン酸ナトリウム０．０５％
プロピルパラベンナトリウム０．０３％
ビタミンＥアセテート０．０２％
コレステロール０．０１％
精製水１００％とするのに必要な量
＊：「カーボマー」という用語は、ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーを意味することを意図する。

ａ）精製水（重量部）中に、次の成分を溶解させる。すなわち、プロピレングリコール１２％（重量部）−メチルパラベンナトリウム０．２６％−プロピルパラベンナトリウム０．０３％−ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％−カーボマー０．７５％である。
ｂ）エチルアルコール５％（重量部）中に、次の成分を溶解させる。すなわち、ビタミンＥアセテート０．０２％−フォスファチジルコリン０．８５％−コレステロール０．０１％
ｃ）ａ）及びｂ）を別個に６０℃に加熱してから混ぜ合わせ、適切なターボ・ミキサーで均質化する。混合物を４０℃に冷却してから、ホップ母液チンキ剤（ＬｕｐｕｌｕｓＭｏｔｈｅｒＴｉｎｃｔｕｒｅ）１％（重量部）を、穏やかに攪拌しながら添加する。予め全精製水の一部分と混合したヒアルロン酸ナトリウム０．０５％は均質なゲルを形成するが、これを攪拌下に前記混合物に添加する。
ｄ）予め全精製水の一部分と混合したイミダゾリジニル尿素０．２０％及び水酸化ナトリウム０．１２％を順に攪拌しながら添加し、均質なゲルが得られるまで十分に混合した。

比較例２
生物学的方法により、実施例１の組成物の相乗的活性を評価するため、以下の組成物を調製した。

比較組成物２
以下の組成（重量部、％）を用いて、ゲル形態製剤を調製する。
プロピレングリコール１２．００％
変性エタノール５．００％
フォスファチジルコリン０．８５％
カーボマー^* ０．７５％
メチルパラベンナトリウム０．２６％
イミダゾリジニル尿素０．２０％
水酸化ナトリウム０．１２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％
プロピルパラベンナトリウム０．０３％
ビタミンＥアセテート０．０２％
コレステロール０．０１％
精製水１００％とするのに必要な量

比較組成物３
以下の組成（重量部、％）を用いて、ゲル形態製剤を調製する。
プロピレングリコール１２．００％
変性エタノール５．００％
ホップの水アルコールエキス１．００％
フォスファチジルコリン０．８５％
カーボマー^* ０．７５％
メチルパラベンナトリウム０．２６％
イミダゾリジニル尿素０．２０％
水酸化ナトリウム０．１２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％
プロピルパラベンナトリウム０．０３％
ビタミンＥアセテート０．０２％
コレステロール０．０１％
精製水１００％とするのに必要な量

比較組成物４
以下の組成（重量部、％）を用いて、ゲル形態製剤を調製する。
プロピレングリコール１２．００％
変性エタノール５．００％
フォスファチジルコリン０．８５％
カーボマー^* ０．７５％
メチルパラベンナトリウム０．２６％
イミダゾリジニル尿素０．２０％
水酸化ナトリウム０．１２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％
ヒアルロン酸ナトリウム０．０５％
プロピルパラベンナトリウム０．０３％
ビタミンＥアセテート０．０２％
コレステロール０．０１％
精製水１００％とするのに必要な量

比較組成物５
以下の組成（重量部、％）を用いて、ゲル形態製剤を調製する。
プロピレングリコール１２．００％
ホップの水アルコールエキス１．００％
フォスファチジルコリン０．８５％
カーボマー^* ０．７５％
メチルパラベンナトリウム０．２６％
イミダゾリジニル尿素０．２０％
水酸化ナトリウム０．１２％
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１０％
ヒアルロン酸ナトリウム０．０５％
プロピルパラベンナトリウム０．０３％
ビタミンＥアセテート０．０２％
コレステロール０．０１％
精製水１００％とするのに必要な量

実施例１の組成物と比較すると、比較組成物２はホップエキスとヒアルロン酸の両方を欠いており；比較組成物３はヒアルロン酸を欠いており；比較組成物４はホップエキスを欠いており；最後に比較組成物５はエタノールを欠いている。実施例１の組成物はホップエキス、ヒアルロン酸及びエタノールを一緒に含む唯一のものである。

実施例３
実施例１の組成物と比較例２の比較組成物２〜５との間での抗酸化活性の相違を試験するため、試験サンプルの存在下あるいは不存在下において、紫外光Ａ（ＵＶＡ）曝露後の角化細胞上で測定される活性酸素種（ＲＯＳ）の種々の濃度（０．５００〜０．０１６ｍｇ／ｍｌ）で試験した。該試験では、ニュートラル・レッド摂取（ＮＲＵ）試験、すなわち試験サンプルの存在下あるいは不存在下において、単層培養で培養したヒト角化細胞を用いた細胞生存試験により、ＵＶＡストレス後の細胞生存能力を評価した。

調製
ヒト初期角化細胞は小児包皮に由来するものであり、倫理委員会の許可を得て、予め計画された所定の手術により採取した。表皮は、３つについてディスパーゼと共にインキュベートすることによって真皮から分離し、トリプシン処理により、単細胞懸濁液を得た。

角化細胞は、１０％子牛胎児血清（ｖ／ｖ）及び特定の強化剤で強化したダルベッコ改変イーグル培地及びハムＦ１２培地（３：１）中で培養した。

これらの細胞は、細胞単層になるまで培養物中で増殖させる。この研究では、細胞は９６−ウェルプレートに蒔かれ、２４時間で半密集（３０，０００細胞／ウェル）に達した。一旦、６０〜７０％の密集度に達したら、新鮮な培地（ｍｅｄｉｕｍ）を添加して、試験サンプルを定数倍（ｓｃａｌａｒ）希釈する。非処理細胞を陰性対照として使用する。この段階で、細胞培養は、試験品及び対照品について種々に希釈され、０．５〜０．０１６ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得た。それぞれの希釈について、３つの反復試験がなされた。産物を培地中に溶解させた。０．１５ｍｇ／ｍｌのビタミンＣを陽性対照として別個に添加する。細胞の一部について、ＮＲＵ試験によりその生存力を検査した。次いで、残りの細胞は、４’（１Ｊ／ｃｍ²）、８’（２Ｊ／ｃｍ²）、１２’（３Ｊ／ｃｍ²）の条件で曝露した。曝露期間の終わりに、細胞上澄み中のＲＯＳの形成を調査する。ＵＶＡ曝露後及びＵＶ曝露なしでの細胞の生存力を決定する。

細胞を試験サンプルに曝露した後、細胞培地を除き、細胞をＰＢＳ中で洗浄する。ジクロロフルオレセインアセテート（ＤＣＡ）の溶液を、各ウェルに添加する。ＤＣＡは培地中のフリーラジカルと反応して、蛍光性誘導体を生じさせ、蛍光光度計の数字を読むことで、細胞中のＲＯＳ量に関する定量データを得ることができる。

適切なインキュベーションの後、ＤＣＡ溶液を排出し、細胞を種々の回数でＵＶＡ照射に曝露し、その後すぐ、蛍光光度計の数字を読み取った（非特許文献１２）。

ＮＲＵ試験は、生体染色色素であるニュートラル・レッド（ＮＲ）を取り込み、そして結合する細胞の能力を基礎にしている。ＮＲＵは弱カチオン性染料であり、非イオン性拡散の機構で細胞膜に浸透して、リソソーム中、マトリックスアニオン性部位上に蓄積される。細胞及びリソソーム膜の改変は、リソソームの脆弱性と細胞中の漸次の不可逆的変化を引き起こす。生体異物により誘導されるこれらの変化は、ＮＲの取り込み（ｕｐｔａｋｅ）の減少及びＮＲのリソソームとの結合の減少を決定する。この方法は、生存細胞、損傷細胞または死滅細胞を区別することができる。細胞は、定数倍濃度の製品と共に、及びニュートラル・レッドの溶液と共に、インキュベートされる。もし膜が損傷すると、培地中に前記染料を放出する。

インキュベーション後、培地を新鮮な培地＋ＮＲ培地に置き換え、細胞を３７℃で４時間インキュベートする。次いで、過剰の染料廃棄物を取り除くのに必要な回数より多く、細胞を洗浄し、比色計の数字を読み取る。

結果を生存能力の観点で表現する。すなわち、
細胞の生存能力（％）＝ＯＤ処理細胞×１００／ＯＤ未処理対照細胞
である。

結果は表１に集約されているが、準毒性の試験濃度（０．０１６ｍｇ／ｍｌ及び０．０３１ｍｇ／ｍｌ）において、調査製品は、ＵＶＡストレス後（短時間での曝露）、ＲＯＳ産生を減少することができた。

＜１０％のＲＯＳ阻害を閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｑｕｏｔｅ）として選択すると、試験製品の抗ＲＯＳ効果は、ホップ、ヒアルロン酸及び／又はエタノールのない他の製剤と比較して優位性を示し、それどころか対照（０．１５ｍｇ／ｍｌのビタミンＣ、試験製品よりも１０〜５倍濃度が高い）よりも優位な効果を達成した。

実施例４
実施例１の組成物と比較例２の比較組成物２〜５との間のコラーゲン再生活性の相違を試験するため、試験組成物処理に曝したヒト皮膚繊維芽細胞におけるコラーゲン合成の体外での評価（ｉｎｖｉｔｒｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて、種々の濃度（２．５０％、１．２５％、０．６３％）で試験した。比色試験によってコラーゲンの当初合成（ｅｘ−ｎｏｖｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を測定した。

調製
試験製品を細胞培養培地中に溶解して、試験用に選択された最終濃度にした。製品は、２０％、１０％、５％、２．５０％、１．２５％、０．６３％及び０．３１％（Ｗ／ｖ）の濃度で、予備的細胞毒性試験を行った。毒性データ（ＩＣ₅₀＝６．７９％、非毒性）に従って、３つの異なる非細胞毒性濃度が試験継続のために選ばれた。効能試験用に選ばれた濃度は、２．５０％、１．２５％及び０．６３％（ｗ／ｖ）である。試験製品への細胞曝露を２４時間及び４８時間に延ばした。各実験時間の終わりに、細胞外基質成分の新規合成（ｎｅｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を評価した。

コラーゲン合成の決定は、定量的な染料結合法によって行う。試験に用いられる発色剤はシリウス・レッド（ダイレクト・レッド８０）である。これらの基がコラーゲンの塩基性アミノ酸の側鎖基と反応する。試験条件下における染料のコラーゲンに対する特異的親和性は、細長い染料分子が、無傷の三重螺旋組織を有する天然コラーゲンの長くて堅牢な構造に平行に並ぶことに起因する（染料親和性は、コラーゲンが変性するとかなり減少する）。コラーゲン濃度（培地２０μＬ中のμｇ）は、既知の増加するコラーゲン濃度で得られた標準曲線のデータ内挿により計算される。すべての試験濃度における製品試験は、非処理細胞と比較して、すべての観察した実験時間において、コラーゲン合成の増加速度に関して著しく効果的であった（０．６３％の研究製品で４８時間処理した細胞中のコラーゲン量の変動は、非処理細胞培養物中におけるコラーゲン量と比べて顕著ではない）。そして、ホップ、ヒアルロン酸及び／又はエタノールのない他の製剤と比較しても、著しく効果的であった。

前記増加は、投与量依存の傾向を有している。結果を表ＩＩに集約する。

Claims

ａ）ホップエキスと、
ｂ）ヒアルロン酸エステルと、
ｃ）Ｃ₁−Ｃ₄アルカノールと、
を含む組成物。
前記エキスは液体、半固体または固体である、請求項１に記載の組成物。
前記液体エキスが、母液チンキ剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記エキスの量が、全組成物重量の０．１〜１５％、好ましくは０．２〜５％であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
前記量が０．５〜２．５％であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
前記ヒアルロン酸のエステルが、アスコルビルヒアルロネート、パルミトイルヒアルロネート、ベンジルヒアルロネート、ブチロイルヒアルロネートナトリウム、ブチロイル／フォルモイルヒアルロネートナトリウムから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記ヒアルロン酸のエステルの量が、全組成物重量の０．０１〜５％、好ましくは０．０２５〜４％であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記量が、０．０４〜２．０％であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
前記Ｃ₁−Ｃ₄アルカノールがエタノールである、請求項１に記載の組成物。
前記Ｃ₁−Ｃ₄アルカノールの量が、全組成物重量の０．５〜１５％、好ましくは１〜１０％であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記量が３〜７％であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
更に、以下の成分、すなわち、保湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ）、皮膚軟化剤、抗酸化剤、リポソーム・ビヒクルやビタミンといった浸透促進剤、湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、レオロジー添加剤、乳化剤、皮膚軟化剤、保存料；天然、合成または半合成のポリマーまたはコポリマー、シリコーン誘導体、組織化効果及び軟焦点効果を有する粉末及び充填材、の１種または２種以上を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
皮膚老化及び／又は皺の処置及び予防における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
そのような処置の対象がヒトであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用のための組成物。