JP2016526924A - lincRNA欠失非ヒト動物 - Google Patents
lincRNA欠失非ヒト動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016526924A JP2016526924A JP2016533448A JP2016533448A JP2016526924A JP 2016526924 A JP2016526924 A JP 2016526924A JP 2016533448 A JP2016533448 A JP 2016533448A JP 2016533448 A JP2016533448 A JP 2016533448A JP 2016526924 A JP2016526924 A JP 2016526924A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lncrna
- nucleic acid
- locus
- human animal
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 180
- 108091007460 Long intergenic noncoding RNA Proteins 0.000 title claims description 122
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title description 2
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 claims abstract description 389
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 198
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 113
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 284
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 241
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 172
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 124
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 124
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 84
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 84
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 82
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 80
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 80
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 76
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 70
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 70
- 108091092889 HOTTIP Proteins 0.000 claims description 49
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 46
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 39
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 35
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 32
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 31
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 31
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 claims description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 29
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 29
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 29
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 27
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 26
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 24
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 24
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 21
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 20
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 20
- 208000000875 Spinal Curvatures Diseases 0.000 claims description 18
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 18
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 17
- 108091023288 HOTAIR Proteins 0.000 claims description 16
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 claims description 16
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 claims description 15
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 claims description 15
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 14
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 claims description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 14
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 13
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 claims description 7
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 claims description 7
- 108091005943 CyPet Proteins 0.000 claims description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 7
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010976 emerald Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 7
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 claims description 7
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 6
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000036244 malformation Effects 0.000 claims description 6
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 6
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 claims description 6
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000545067 Venus Species 0.000 claims description 5
- 230000004641 brain development Effects 0.000 claims description 5
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims description 4
- 230000007040 lung development Effects 0.000 claims description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 116
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 26
- 230000002028 premature Effects 0.000 abstract description 3
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 abstract 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 92
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 92
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 92
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 73
- 230000006870 function Effects 0.000 description 72
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 62
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 54
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 40
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 38
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 28
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 27
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 26
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000011161 development Methods 0.000 description 25
- 238000013461 design Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 108091007417 HOX transcript antisense RNA Proteins 0.000 description 19
- 206010063493 Premature ageing Diseases 0.000 description 19
- 208000032038 Premature aging Diseases 0.000 description 19
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 17
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 13
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 10
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 10
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 10
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 9
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 9
- 210000000982 limb bud Anatomy 0.000 description 9
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 6
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 6
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 5
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 5
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 5
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010062344 Congenital musculoskeletal anomaly Diseases 0.000 description 4
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 description 3
- 101000687343 Mus musculus PR domain zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000019975 dosage compensation by inactivation of X chromosome Effects 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 3
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- -1 target genomic loci Substances 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 108010045123 Blasticidin-S deaminase Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101150007884 Gata6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101001126085 Homo sapiens Piwi-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700029495 HoxA Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 2
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100029364 Piwi-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000002272 Polycomb Repressive Complex 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010000597 Polycomb Repressive Complex 2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 2
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 208000028752 abnormal posture Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 2
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 2
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 206010045458 umbilical hernia Diseases 0.000 description 2
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000028651 Abnormal lung morphology Diseases 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710085033 Beta-galactosidase LacZ Proteins 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- 101100518995 Caenorhabditis elegans pax-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100022167 E3 ubiquitin-protein ligase NEURL3 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000973224 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase NEURL3 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101150002416 Igf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036429 KCNQ1OT1 Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101150040658 LHX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006835 Lamins Human genes 0.000 description 1
- 108010047294 Lamins Proteins 0.000 description 1
- 208000007623 Lordosis Diseases 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101100518997 Mus musculus Pax3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001300 Perinatal Death Diseases 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 101001023863 Rattus norvegicus Glucocorticoid receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003562 Small Cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 108091007416 X-inactive specific transcript Proteins 0.000 description 1
- 108091035715 XIST (gene) Proteins 0.000 description 1
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 1
- 241001433070 Xiphoides Species 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 208000033571 alveolar capillary dysplasia with misalignment of pulmonary veins Diseases 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008049 biological aging Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 208000028831 congenital heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000005053 lamin Anatomy 0.000 description 1
- 101150115794 lhx5 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 238000010234 longitudinal analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000002617 middle hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008043 neural expression Effects 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000003094 perturbing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 210000003492 pulmonary vein Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001202 rhombencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 210000005245 right atrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 210000002417 xiphoid bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
- JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N γ Benzene hexachloride Chemical compound ClC1C(Cl)C(Cl)C(Cl)C(Cl)C1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
- A61D19/04—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo transplantation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
- A01K2217/077—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out heterozygous knock out animals displaying phenotype
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本願は、2013年8月7日に出願の米国仮出願第61/863,147号の優先権を主張するもので、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
配列表の公式の写しは、448071SEQLIST.TXTと名付けられ、2014年8月7日に作成され、かつサイズが1キロバイトであるASCII形式の配列表として、EFSウェブを通して電子的に提出されるとともに、本明細書と同時に出願される。このASCIIフォーマットされた書類に含まれる配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
長鎖非コードRNA(「lcnRNA」)に1または複数の欠失を含む、非ヒト動物、細胞、および組織、ならびに、それらを作る方法。非機能性lncRNAあるいは1または複数のlncRNAのノックアウトを含む、非ヒト動物とそれを作る方法。早期老化に一致する表現型を示す、遺伝子改変された非ヒト動物。
長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)として知られている長鎖非RNA(lncRNA)およびサブクラスは、それらの遺伝子の構造、合成、およびクロマチンの特徴という点でmRNAに類似している哺乳動物において、約15,000の多様な転写産物を含む。特定のlncRNAに関連した機能または表現型は、同定されたlncRNAの大多数については知られていない。lncRNAの一部は、動物における転写の活性化因子または抑制因子として転写制御に関与すると考えられ、その他のものは後翻訳的に機能またはある種の別のメカニズムよって機能すると思われる。したがって、lncRNAを操作する能力は、lncRNAの同一性と機能とに応じて、着目の表現型を表すためのツールを提供することが可能である。当技術分野では、lncRNAを操作する方法および組成物が求められており、またlncRNA操作を通して非ヒト動物の表現型を生成することが求められている。
一実施形態では、改変が、Pint遺伝子座の全RNAコード配列の欠失である。一実施形態では、改変が、ターゲッティングベクターをPint遺伝子座に挿入して、動物がもはや機能性Pintを作れなくなるようにすることを、含む。
一実施形態では、多能性細胞がヒト誘導多能性細胞(iPS)である。
語彙の説明
用語「胚性幹細胞」または「ES細胞」は、胚への導入の際に、発生する胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性または多能性細胞を含む。「多能性細胞」という用語は、複数の分化した細胞型に発達する能力を保つ未分化細胞を含む。
非ヒト動物、細胞、組織、および胚は、lncRNA機能喪失を含むものとして提供され、このよう機能喪失として、限定されるものではないが、1または複数のlncRNAの破壊またはノックアウトが挙げられる。lncRNA発現を操作するための方法および方法が提供される。lncRNAを改質またはノックアウトするためのターゲティング組成物もまた、提供される。1または複数のlncRNAの非機能に関連した表現型を示す非ヒト動物、細胞、および組織が提供される。以下の説明はある特定のlncRNAの調査に関連しているが、方法および組成物は、いかなあるlncRNAによっても実施可能である。
lncRNAの機能喪失は、lncRNA遺伝子での標的遺伝子改変(すなわち、調節領域、コード領域、エクソン、および/またはイントロン等での遺伝子改変)から生じ得る。そのような標的化改変として、限定されるものではないが、1または複数のヌクレオチドの付加、1または複数のヌクレオチドの欠失、1または複数のヌクレオチドの置換、lncRNA遺伝子座の破壊、lncRNA遺伝子座またはその一部のノックアウト、lncRNA遺伝子座またはその一部のノックイン、非相同核酸配列による内在性lncRNA核酸配列またはその一部の置換、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。具体的な実施形態では、少なくとも1、2、3、4、5、7、8、9、10、50、100、400、またはそれ以上のヌクレオチドを変化させて標的化ゲノム改変を形成する。
本明細書中に提供される方法および組成物で用いられる非ヒト動物、細胞、組織、および胚は、少なくとも1つのlncRNAの機能喪失をもたらす遺伝子改変を有する。
lncRNAは、200ヌクレオチドを上回る長鎖非コードRNAである。lncRNAのサブグループ、長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)は、遺伝子間のものであり、タンパク質コード領域とは重なっていない。
本明細書中で提供されるものは、 非ヒト動物、細胞、組織、または胚の少なくとも1つのlncRNA遺伝子座の遺伝子改変の方法および組成物である。
ノックアウト等の改変lncRNA対立遺伝子の設計および構築は、いくつかの技術的問題により複雑である。例えば、複数のlncRNAの間の構造機能的相関関係が一般的に欠如しており、さらに、lncRNA遺伝子座はオープンリーディングフレームを持たない。したがって、タンパク質コード配列を改変するための対立遺伝子の設計(例えば、ノックアウト)を誘導する同じ戦略をlncRNAに適用できない場合がある。さらに、lncRNA遺伝子間の境界が十分定まっておらず、そのことがノックアウト等の改変IncRNA対立遺伝子の設計をさらに複雑にしている。lncRNAノックアウト設計におけるこれらの技術的困難さとそれらのハードルをうまく克服するために本明細書中で使用される戦略との非限定的な例を、以下、本明細書中に詳細に説明する。
(mcmanuslab.ucsf.edu/microrna_knockout)は、技術を非コードRNAに適用する価値を示している。
本明細書中の他の場所に説明されているように、lncRNA遺伝子座の遺伝子改変は、挿入核酸をlncRNA遺伝子座もしくはその一部と置換、または、lncRNA遺伝子座もしくはその一部に挿入/付加することを、含み得る。場合によっては、挿入核酸は、レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、レポーター遺伝子は内在性lncRNAプロモーターに作動可能に連結されているlncRNA遺伝子座の中に配置される。そのような改変は、内在性lncRNAプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現を可能にする。あるいは、レポーター遺伝子は、内在性lncRNAプロモーターと作動可能に連結された状態で配置されない。
lncRNA遺伝子の遺伝子改変によって、本明細書中で提供される非ヒト動物における様々な表現型をもたらすことが可能である。そのような表現型として、例えば、早期老化関連表現型、脳、骨格、筋肉、または肺を含む種々の器官の欠陥、胚発生の欠陥、周産期または胚死亡率、脱毛、早期の成長停止、脊椎湾曲、あるいは異常な姿勢を挙げることが可能である。
(a)野生型対照よりも遅い発育速度、(b)筋力の低下、(c)繊維形成、(d)野生型対照よりも低い体脂肪含有量、(e)野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、(f)野生型対照と比較して減少した筋肉量、(g)寿命中位数の減少、(h)脊椎湾曲、(i)器官萎縮、または(j)それら(a)〜(i)のいずれかの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる。
非ヒト動物、細胞、組織、または胚のlncRNA遺伝子座を遺伝学的に改変する方法は、本明細書中で提供される。
本明細書に提供される遺伝子改変された非ヒト動物、細胞、組織、または胚を作る方法で用いられるターゲッティングベクターまたは標的コンストラクトがさらに提供される。
「挿入核酸」または「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座で組み込むことが望まれるDNAのセグメントを含む。一実施形態では、挿入核酸は、1または複数の着目のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入核酸は1または複数の発現カセットを含む。所定の発現カセットは、着目のポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、および/またはレポーター遺伝子を、発現に影響する様々な調節構成要素とともに含む。
そのようなレポーター遺伝子は、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子または細胞に対して内在性であるプロモーター、レポーター遺伝子または細胞に対して非相同であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、あるいは発生学的段階特異的プロモーターであり得る。
本明細書中で提供されるものは、 ポリヌクレオチドまたは核酸分子であり、これは、lncRNA遺伝子座(すなわち、ヌクレアーゼ因子、認識部位、挿入核酸、着目のポリヌクレオチド、レポーター配列、ターゲティングベクター、選択マーカー、および他の構成要素の任意の1つまたは任意の組み合わせ)を標的化する、本明細書に提供される標的化ゲノム組み込み系で用いられる様々な構成要素を含む。
ターゲッティングベクターは、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、ラット、またはハムスター核酸の着目のlncRNA遺伝子座の中へ挿入核酸を導入するために、用いられる。ターゲッティングベクターは、挿入核酸を含み、さらに、挿入核酸を挟む5’ホモロジーアームと3’ホモロジーアームとを含む。挿入核酸を挟むこれらのホモロジーアームは、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、ラット、またはハムスター核酸の標的化lncRNA遺伝子座内の領域に対応する。参照の容易さのために、標的化ゲノム遺伝子座内の対応する同族ゲノム領域を「標的部位」という。例えば、ターゲッティングベクターは、第1の標的部位と第2の標的部位とに相補的な第1のホモロジーアームと第2のホモロジーアームとで挟まれた第1の挿入核酸を含み得る。このように、ターゲッティングベクターは、細胞のゲノム内でホモロジーアームと相補的標的部位と間で生ずる相同組換えを介して、標的遺伝子座核酸の中に挿入核酸を組み込む際の助けになる。
用語「大きいターゲッティングベクター」またはLTVEC」には、相同性ターゲッティングの実施を意図した他のアプローチよって概ね使用される核酸配列よりも大きい核酸配列に一致かつそれに由来するホモロジーアームロジーアームを含む、および/または、細胞における相同組換えターゲッティングの実行を意図した他のアプローチによって概ね使用される核酸配列よりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、大きいターゲティングベクターが含まれる。具体的な実施形態では、LTVECのホモロジーアームおよび/または挿入ポリヌクレオチドドは、真核細胞のゲノム配列を含む。LTVECの大きさは、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング、ロングレンジ(例えば、1kb〜5kb)PCRによってターゲッティングを行う場合のスクリーニングを可能にするにはあまりにも大きい。LTVECの例として、限定されるおのではないが、細菌人工染色体(BAC)由来のベクター、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体(YAC)が挙げられる。LTVECおよびそれを作る方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第6,586,251号、第6,596,541号、第7,105,348号、およびWO2002/036789(PCT/US01/45375)に記載されている。これらの各々を本明細書中に参照により援用する。
上記で概説されたように、方法および組成物は、1または複数のlncRNA遺伝子座の標的遺伝子改変を可能にするべく、本明細書中に提供される。さらに認められたことは、さらなる標的遺伝子改変がなされ得ることである。これらの標的遺伝子改変を可能にするそのような系は、様々な構成要素を用いることができ、また、参照しやすいように、本明細書中では、用語「標的化ゲノム組み込み系」は、概して、組み込みをおこなう場合に必要とされる構成要素すべて(すなわち、着目する、様々なヌクレアーゼ因子、認識部位、挿入DNA、ポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、標的ゲノム遺伝子座、およびポリヌクレオチド)を含む。
本明細書に説明する様々な方法は、細胞内のlncRNA遺伝子座を改変するためのゲノム遺伝子座ターゲッティング系を用いる。そのような細胞として、大腸菌(E.coli)などの細菌細胞、酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、あるいは、限定されるものではないが、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ニワトリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)細胞、およびその他の哺乳動物細胞、ならびに、家畜哺乳動物の細胞または農耕哺乳動物の細胞が挙げられる。一部の細胞は、非ヒト細胞、具体的には非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、適切に遺伝学的に改変可能な多能性細胞が容易に入手可能ではないそれらの哺乳動物については、他の方法を用いて、体細胞を多能性細胞に再プログラムする。例えば、体細胞に、多能性誘導因子の組み合わせを導入することによって、なされる。それらの因子として、限定されるものではないが、Oct3/4、Sox2、KLF4、Myc、Nanog、LIN28、およびGlis1が挙げられる。そのような方法では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非ヒト細胞、齧歯動物、ラット、マウス、ハムスター由来の細胞、線維芽細胞、または任意の他の宿主細胞でもあり得る。他の実施形態では、細胞は多能性細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、非ヒト胚性幹(ES)細胞である。そのような細胞として、多能性細胞が挙げられ、それらとして、例えば、誘導多能性幹(iPS)細胞、ヒトiPS細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、ラット胚性幹(ES)細胞、ヒト胚性(ES)細胞、または発生学的制限ヒト前駆細胞、齧歯動物胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、またはラット胚性幹(ES)細胞が挙げられる。
前述のように、マウスのカスタム遺伝子変異の迅速かつハイスループットの生成を可能にするVelociGene(登録商標)方法を用いた(VAlenzuela, D.M.他、(2003b),Nat Biotchnol 21:652−659)。簡単に言えば、BacVecの大きいターゲッティングベクター(LTVEC)を、マウスbMQ(129S7/SvEv Brd−Hprt b−m2)またはRP23 BACライブラリー(Adams, D.J.他、(2005)、Genomics 86:753−758)由来のBACクローンを使用して生成した。lacZ/neorレポーター/選択カセット(図1)は、lacZ部分のβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端が改変さてATG開始コドンおよびKozakコンセンサス配列(Kozak, M. (1987) nucleic acids research 15:8125−8148)を含むことを除いて、NIH KOMP(www.velocigene.com/komp/detail/10020.で入手可能な配列)に利用されるZEN−Ub1カセットと同一であった。
LTVECを、3.3×106細胞、0.67μgDNA、0.125ml容量のエレクトロポレーション緩衝液(Millipore)中で、マルチウェルエレクトロポレーション装置(Harvard Apparatus、Boston、MA)により、VGF1ハイブリッド(129S6SvEvTAc/C57BL6NTac)ES細胞(Poueymirou他、(2007); Valenzuela他、(2003a))に導入した後、15cmゼラチンコートプレート上で培養した。G418を含む選択培地を、エレクトロポレーションの48時間後に添加し、その後、毎日交換した。薬物耐性コロニーをエレクトロポレーションの10日後、ピックアップし、ゼラチンコート96穴プレートで少なくとも3日間、DNA抽出及び生成の前に培養した。正確に標的ES細胞クローンを、対立遺伝子欠失アッセイ(Frendewey他、(2010), Methods in enzymology 476:295−301: Valenzuela他、(2003a), Nat. Biotechnol. 21:652−659)によって、同定した。
VelociMouse(登録商標)方法(Dechiara, T.M., (2009), Methods Mol Biol 530−311−324: Poueymirou他、(2007)、Nat. Biotechnol. 25:91−99)を用いた。この方法では、圧縮されていない(uncompacted)8細胞期Swiss Webster胚に標的ES細胞を注射して、lincRNAノックアウト突然変異を有する、ES細胞に完全に由来するF0世代マウスを作った。雄VelociMouse(登録商標)を、lacZ発現プロファイリングに直接使用し、または、C57BL/6NTac雌と交配させて、LacZ分析用の胚もしくは成体を作り、または、F1ブリーダーを作り、表現型の検討をN2F1マウスで実施した。膣栓が確認される朝を0.5日目(E0.5)と設定することにより、時限交配を実行した。
ホールマウント染色用に、E9.5およびE14.5胚を回収し、PBSで染色し、新しい0.2%グルタールアルデヒド溶液で15〜60分間インキュベートした。遺伝子タイピング用に卵黄嚢を採取した。固定後、胚を洗浄用緩衝液で洗い、37℃、1〜24時間にわたってX−gal(1mg/mL)でインキュベートした。染色後、組織を洗浄用緩衝液でリンスし、4%パラホルムアルデヒドで後固定し、少なくとも24時間にわたって70%エタノールでインキュベートした。e9.5〜e11.5胚を直ちに写真撮影する一方、e12.5胚およびそれより古いものを、ddH2O中増量グリセロールと減量1%KOHを含む一連の溶液中で透明化にした。写真撮影は、Nikon SMZ800立体顕微鏡を用いておこなった。Fendrr e13.5胚由来の胚を透明化後の写真用に解剖した。
N2F1マウスの表現型検討を週齢6〜8週目に開始した。時限交配について、方法を、膣栓が確認される朝を胎生0.5日目(E0.5)と設定して実施した。lincRNA KOおよび野生型の同腹仔を、検討のために69〜74F、湿度40〜60%で、1日あたり12時間照明で収容した際に、誕生から発生過程の様々な節目(発育不良、呼吸、顔面および四肢の異常、皮膚の色、姿勢、立ち直り、および開眼)について、週齢約6〜8週目まで、観察した。すべての実験を週齢約6〜8週目に開始し、すべての動物処置を、Regeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得たプロトコールに従って実施した。
量子FXマイクロCT前臨床in vivoイメージングシステム(Perkin Elmer)を用いて、3D骨格イメージングの視覚化をおこなった。マウスの麻酔を、酸素/イソフラン吸入を用いて、イソフルオラン流量2.5L/分および酸素流量1.5L/分でおこなった。走査過程中、ノーズコーンを通して0.25L/分の酸素流入速度で、麻酔を維持した。走査は、後肢に対しては30mm視野で、脊柱に対しては60mm視野で、90kVおよび160μAで実施した。骨密度、全骨量、ならびに赤身および脂肪の量の分析用に、頭部を除く全身に対して60mm視野で走査を連続して2回実行した。骨密度を測定するために、右大腿部を手作業で分離した。右大腿部の赤身および脂肪の総量をすべてAnalyze 11.0ソフトウェア(Mayo Clinic)を用いて測定し、設定密度に基づいて質量に変換した。走査の後、マウスをケージに戻し、Regeneron IACUCプロトコールに従って回復をモニターした。
尾懸垂時、マウスは後肢を拡げて(「後肢開脚(hindlimb splay)」としばしば呼ばれる)安全に着陸するための準備をおこなう。マウスを10秒間にわたり尾で懸架させ、なんらかの異常な把持の表現型について観察した。
マウスの評価を、ワイヤグリッド(約2mmのワイヤ厚)から逆さまにぶら下がる能力により、筋肉障害の徴候に関して、週齢5、7、および10週目におこなった。マウスを個々に、ワイヤグリッド上に置いた。この際、このワイヤグリッドをゆっくりと振とうさせると、グリッドが反転することから、マウスがグリッドを把持するようにする。マウスが手放すまでの時間(最大い60秒まで)を記録した。できるだけ長く保持するようにマウスを3回試行させ、また最大時間を統計的比較のために記録した。
マウスをCO2吸入によって安楽死させた後、頸椎脱臼させた。前脛骨筋(TA)、四頭筋、腓腹筋(GA)の筋肉を切除して重さを量った。すべての収集した筋肉および器官を凍結し、将来の検査のために−80℃に保った。組織構造に関して、筋肉をOCTで凍結させ、12μmの厚さっで斜めに凍結切断して、外側および内側の頭部、ヒラメ筋、および足底筋を露出させた。隣接した切片をH&E、ラミン、およびMHC Slow Stainで染色した。この染色を、Aperio Scanscopeを用いて、デジタル画像化した。線維の大きさと計数を、Spectraソフトウェアを用いて決定した。すべてのデータは平均値±標準誤差(エラーバーで表示)として表した。分散分析(ANOVA)を、STATVIEWおよび/またはPRISMというプログラムを用いて実施した。統計学的有意差を、P値0.05未満で設定した。皮膚組織構造に関して、背側および腹側の皮膚領域を剃って切除し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で少なくとも24時間にわたって固定し、さらに70%エタノールに移した。パラフィン包埋、切り出し、および皮膚切片に対するヘマトキシリンおよびエオシン染色を、Histoserv Labs, Inc., Germanton, MD.によって実行した。
動物を52週間にわたり観察し、Regeneron IACUCプロトコールに従って、病的状態の徴候をモニターした。本研究のマウスは、病的状態ガイドラインに基づく52週間の時点の前に犠牲になる必要はなかった。生存曲線およびログランクテストを、Graphpad PRISM 6ソフトウェアを用いて決定した。
切断lncRNAを有する20のマウス系統における多様な表現型および特異的転写パターン
長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)の生物学的機能を調べるために設計された20のノックアウトマウス系統の調査において、我々は、周産期致死から、早期老化に関連した欠陥と肺、骨格、および筋肉における形態学的および機能的異常とに至るまでの、様々な表現型を見出した。各々の突然変異対立遺伝子は、lacZレポーターを持っており、その発現プロファイルは、我々の表現型分析を通知する胚および成体における空間時間的および組織特異的転写パターンが広範囲に及ぶことを強調しており、これらの遺伝子の将来の調査のためのガイドとしての役割をするであろう。我々の研究は、lincRNAがコード化された分子の新たなクラスであることを示しており、そのような分子は、タンパク質と同様に、哺乳動物の広範囲な組織および器官の胚発生、生理学、およびホメオスタシスにおける必須かつ重要な機能的役割を担う。
表1は、この研究で標的化された10本の異なる染色体上の20個のlincRNAと、作成された26個のノックアウト欠失対立遺伝子とを列挙する。我々は、長鎖遺伝子間非コードRNAクラスの仲間を突然変異用に選択した。なぜなら、定義上は、複数のlincRNA遺伝子が隣接タンパク質コード遺伝子から単離され、それらの転写産物は重複しない(Guttman他、(2009)Nature 458: 223―227)。この特徴は、我々が、隣接する遺伝子の発現によって干渉される可能性を少なくとも有する欠失対立遺伝子の設計を可能にした。我々は、神経発現に重点を置いて、またその潜在的な開発への関与と遺伝子発現の調節とのために、標的lincRNA遺伝子が選択されて、様々な発現パターンを反映させた(Khalil AM他、(2009)Proceedings of the National Academy of Scieneces of the United States of America 106: 11667−11672; Cabili MN他、(2011) Genes & Development 25: 1915−1927)。
20個の標的lincRNA遺伝子の発現パターンを調査するためにβ−ガラクトシダーゼ活性のX−gal染色を胚全体または成熟マウスの全載組織および器官に対して適用した。標的lincRNA遺伝子は、様々な独特のレポーター遺伝子発現パターン(図11の表2)を示し、主要な器官系および組織型のほとんどを表した。例えば、成体組織において、Pantr2、Kantr、およびPerilの発現は、脳に制限された。MannrおよびFendrrは肺に発現され、Eldrは尿生殖器系で発現され、さらに、Halr1は胸郭で発現された。1つのlincRNA遺伝子であるPintは、すべての組織でユビキタス発現を示した。我々は、調べた成体組織のHotair、Ptgs2os2、およびHaglr遺伝子の発現を、調べた成体組織のいずれも、検出しなかった。
標的化された20個のlincRNA遺伝子の中でも、Pintのみが全体に及ぶ全身発現パターンを示しており、このことは主に出生後に制限された(図11の表2)。Pintに固有なことは、齢に伴う発現の増加が観察されたことである(図4)。日齢3日目の新生仔において、Pint転写活性は低(脳)または検出不可(胸郭筋)であったが、3週齢マウスでは徐々に見られるようなり、週齢8日目までに強くてユビキタスなものになった。Pint発現の強度およびタイミングは器官や組織が異なると変わるが、一般的な傾向として出生してから発現が安定的に増加して成熟期においてプラトーに達した。我々の知る限りでは、加齢による動的な発現パターンは新規なものである。我々は、数百ものタンパク質コード遺伝子ノックアウトのlacZプロファイリング実験において類似のプロファイルを観察することはなかった(Valenzuela DM他、(2003) Nature Biotechnology 21: 652−659)。
20のlincRNAノックアウトマウス系統の中でも、Peril−/−およびFendrr−/−マウスが周産期致死を示した。我々のFendrrノックアウト対立遺伝子は、エクソン2から最後のアノテーション付けされたエクソンまでの26kbの欠失を有する(図1)。E12.5ホモ接合体胚のX−gal染色は、前頭鼻突起、上気道、肺、および後大動脈−生殖原基−中腎(AGM)領域でのlacZ発現を示し(図6A)、これはヘテロ接合体胚(不図示)およびホモ接合体胚の両方で同一であり、極めて正常な器官形成を示している。E13.5で発生中の肺のみの観察は、ノックアウト胚の欠陥を明らかにした。肺は小さく、肺葉は、球状になり、組織が破壊された(図6B)。Fendrr遺伝子の欠失がホモ接合であるマウスは出生まで生存したが、明らかな呼吸上の問題の直後に死亡した。Fendrr突然変異体周産期致死表現型は、2つの異なる遺伝的背景のマウス、すなわち、ここでレポートされたC57BL6/129雑種と、マウスにおいて、さらには別の飼育上の問題があるC57BL/6に対してさらに戻し交配したマウスにおけるものとで、同じであった((Sauvageau M他、(2013) Elife 2: e01749)。
HotairおよびHOTTIP遺伝子の胚性X−gal染色は、後および遠位の肢芽での発現が制限されることを示した(図2A).これらの発生学的に制限された発現パターンに合わせて、HotairおよびHOTTIP遺伝子の欠失は、成熟マウスの尾部および後肢における形態学的奇形を生じた。我々が観察したHotair−/−マウスでは、第4尾椎の明らかなホメオティックなトランスフェクションを観察した。これは、解剖学的に第3尾椎と解剖学的に類似するようになった(図7)。HOTTIP−/−マウスは、野生型同腹仔と比較して、異常な後肢把持姿勢を示した(図8A)。この行動的異常は、逆さまになったワイヤーケージでマウスが懸垂した状態を保ち続ける試験によって測定される把持持続力の消失によって達成される。野生型およびHOTTIP+/−突然変異体は、それらのホモ接合性同腹仔が10〜20秒内に把持を止めるのに対して、約1分間にわたって保ち続ける(図8B)。この明らかな握力の減少は、腓腹筋の筋肉量の消失と関係しているが、前脛骨筋または四頭筋のそれには関係していない(図8C)。我々は、腓腹筋の繊維数が約40%減少していることを観察したが、それらの平均的サイズの減少は観察しなかった(図8DおよびE)。HOTTIPノックアウトマウスにおける筋肉欠陥に加えて、後肢骨格奇形、すなわち後肢踵骨の長さの減少もみられた(図10)。
Claims (40)
- 非ヒト動物であって、そのゲノム内に、少なくとも1つの改変長鎖非コードRNA(lncRNA)遺伝子座を含み、前記少なくとも1つの改変lncRNA遺伝子座がlncRNAをコードする核酸配列内に機能喪失型変異を含む、非ヒト動物。
- 前記lncRNAが長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)である、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 前記機能喪失型変異が少なくとも1つのlncRNA機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる、請求項1または2のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記改変lncRNA遺伝子座が前記lncRNAまたはその一部をコードする1または複数のエクソンの欠失を含む、請求項3に記載の非ヒト動物。
- 前記破壊またはノックアウトが、
(a)lncRNA遺伝子座の第2のエクソン内で始まるlncRNA遺伝子内に1または複数のエクソンの欠失、
(b)lncRNA遺伝子座の第1のエクソン内で始まるlncRNA遺伝子座内に1または複数のエクソンの欠失、あるいは、
(c)lncRNA遺伝子座の全RNAコード領域の欠失を含む、請求項4に記載の非ヒト動物。 - 前記破壊またはノックアウトが前記lncRNA遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換することを含む、請求項3に記載の非ヒト動物。
- 前記挿入核酸が、レポーターをコードする第1のヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記第1のヌクレオチド配列が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、請求項7に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記レポーターをコードする前記第1のヌクレオチド配列が、内在性lncRNAプロモーターに作動可能に連結されているlncRNA遺伝子座内に位置し、前記内在性lncRNAプロモーターが前記ヌクレオチド配列の発現を駆動する、請求項7に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記核酸配列の発現がlncRNAの発現パターンに従う、請求項9に記載の非ヒト動物。
- 前記第1のヌクレオチド配列がKozakコンセンサス配列を含む、請求項7に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記置換が、
(a)lncRNA遺伝子座の第2のエクソン内で始まる前記lncRNA遺伝子座内の1または複数のエクソンを前記挿入核酸で置換すること、
(b)lncRNA遺伝子座の第1のエクソン内で始まる前記lncRNA遺伝子座内の1または複数のエクソンを前記挿入核酸で再置換すること、あるいは
(c)lncRNA遺伝子座の全RNAコード領域を前記挿入核酸で置換することを含む、請求項6〜11のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 - 前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、増強黄色蛍光タンパク質(EYFP)、Emerald、CyPet、シアン蛍光タンパク質(CFP)、Cerulean、T−Sapphire、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項6〜12のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第2の核酸配列をさらに含み、前記第2の核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項6〜13のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび/または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む、請求項14に記載の非ヒト動物。
- 前記lncRNAが、Pint、Celrr、Crnde、Eldr、Fendrr、Halr1、Hotair、HOTTIP、Hoxa11os、Pantr1、Pantr2、Ptgs2os2、lincenc1、Trp53cor1、lincppara、Mannr、Haglr、Peril、Kantr、Tug1、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、以下の表現型、すなわち、
(a)早期老化関連表現型、
(b)周産期致死、
(c)肺発生の欠陥、
(d)尾部および後肢の形態学的奇形、
(e)1または複数の組織での筋肉量の消失、または
(f)(a)〜(e)のいずれかのそれらの組み合わせの、1または複数を持つことによって特徴づけられる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の非ヒト動物。 - 前記lncRNAがPintであり、前記非ヒト動物が、
(a)野生型対照よりも遅い発育速度、
(b)筋力の低下、
(c)繊維形成、
(d)野生型対照よりも低い体脂肪含有量、
(e)野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、
(f)野生型対照と比較して減少した筋肉量、
(g)寿命中位数の減少、
(h)脊椎湾曲、
(i)器官萎縮、または
(j)(a)〜(i)のいずれかのそれらの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる、請求項1に記載の非ヒト動物。 - 前記非ヒト動物が脳の発達の欠陥を示す、請求項1〜15のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記lncRNAが、Pantr2、Kantr、Peril、Celrr、Pantr1、Crnde、lincenc1、Pint、lincppara、またはTug1である、請求項19に記載の非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が哺乳類である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記哺乳動物が齧歯動物である、請求項21に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記哺乳動物がマウス、ラット、またはハムスターである、請求項22に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞、組織、または胚。
- 着目のlncRNA遺伝子座と相同組換えし得る5’ホモロジーアームと3’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む、ターゲッティングベクター。
- 前記挿入核酸が、レポーターをコードする第1の核酸配列を含む、請求項25に記載のターゲッティングベクター。
- 前記着目のlncRNA遺伝子座との相同組換えに続いて、前記レポーターをコードする前記第1の核酸配列が、前記lncRNA遺伝子座でlncRNAの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている、請求項26に記載のターゲッティングベクター。
- 前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J−Red、DsRed、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、増強黄色蛍光タンパク質(EYFP)、Emerald、CyPet、シアン蛍光タンパク質(CFP)、Cerulean、T−Sapphire、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項26〜27のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
- 前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第2の核酸配列をさらに含み、前記第2の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項25〜28のいずれか一項に記載のターゲッティングベクターコンストラクト。
- 前記レポーターをコードするセグメントおよび/または前記選択マーカーの核酸をコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位をさらに含む、請求項29に記載のターゲッティングベクター。
- 前記第1の核酸配列および/または前記第2の核酸配列がKozakコンセンサス配列をさらに含む、請求項25〜30のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
- 前記挿入核酸が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項25〜31のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
- 少なくとも1つのlncRNA遺伝子座内の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作る方法であって、
(a)5’ホモロジーアームと3’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させることであり、前記標的コンストラクトが前記細胞のゲノム内のlincRNA遺伝子座と相同組換えを行って改変多能性細胞を形成すること、
(b)前記改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、
(c)前記宿主胚を代理母に懐胎させることであり、前記代理母が改変lncRNA遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、
前記遺伝子改変が前記少なくとも1つのlncRNAの機能喪失をもたらす、方法。 - 前記lncRNAがlincRNAである、請求項33に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が少なくとも1つのlncRNA機能の破壊またはノックアウトを含む、請求項33〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記lncRNAが、Pint、Celrr、Crnde、Eldr、Fendrr、Halr1、Hotair、HOTTIP、Hoxa11os、Pantr1、Pantr2、Ptgs2os2、lincenc1、Trp53cor1、lincppara、Mannr、Haglr、Peril、Kantr、Tug1、またはそれらの組み合わせを含む、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性細胞内のlncRNA遺伝子座を改変する方法であって、
(a)多能性細胞内に、lincRNA遺伝子座と相同組み換えを起こし得る5’ホモロジーアームと3’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、
(b)lncRNA遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、
前記遺伝子改変がlncRNA機能の機能喪失をもたらす、方法。 - 前記多能性細胞がヒトiPS細胞である、請求項37に記載の方法。
- 前記多能性細胞がマウスまたはラット胚性幹(ES)細胞である、請求項37に記載の方法。
- 前記lncRNAが、Pint、Celrr、Crnde、Eldr、Fendrr、Halr1、Hotair、HOTTIP、Hoxa11os、Pantr1、Pantr2、Ptgs2os2、lincenc1、Trp53cor1、lincppara、Mannr、Haglr、Peril、Kantr、Tug1、またはそれらの組み合わせを含む、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361863147P | 2013-08-07 | 2013-08-07 | |
US61/863,147 | 2013-08-07 | ||
PCT/US2014/050178 WO2015021298A2 (en) | 2013-08-07 | 2014-08-07 | Lincrna-deficient non-human animals |
Related Child Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017037511A Division JP6192865B2 (ja) | 2013-08-07 | 2017-02-28 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2018235716A Division JP2019037253A (ja) | 2013-08-07 | 2018-12-17 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2020070279A Division JP2020108409A (ja) | 2013-08-07 | 2020-04-09 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016526924A true JP2016526924A (ja) | 2016-09-08 |
JP2016526924A5 JP2016526924A5 (ja) | 2017-09-14 |
JP6998656B2 JP6998656B2 (ja) | 2022-02-04 |
Family
ID=52449819
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016533448A Active JP6998656B2 (ja) | 2013-08-07 | 2014-08-07 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2017037511A Active JP6192865B2 (ja) | 2013-08-07 | 2017-02-28 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2018235716A Withdrawn JP2019037253A (ja) | 2013-08-07 | 2018-12-17 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2020070279A Pending JP2020108409A (ja) | 2013-08-07 | 2020-04-09 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2022109170A Pending JP2022125255A (ja) | 2013-08-07 | 2022-07-06 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
Family Applications After (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017037511A Active JP6192865B2 (ja) | 2013-08-07 | 2017-02-28 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2018235716A Withdrawn JP2019037253A (ja) | 2013-08-07 | 2018-12-17 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2020070279A Pending JP2020108409A (ja) | 2013-08-07 | 2020-04-09 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
JP2022109170A Pending JP2022125255A (ja) | 2013-08-07 | 2022-07-06 | lincRNA欠失非ヒト動物 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9554564B2 (ja) |
EP (2) | EP3178928B1 (ja) |
JP (5) | JP6998656B2 (ja) |
KR (3) | KR102350200B1 (ja) |
CN (2) | CN105518132B (ja) |
AU (3) | AU2014305873B2 (ja) |
BR (1) | BR112016002385A2 (ja) |
CA (1) | CA2917714A1 (ja) |
DK (1) | DK3178928T3 (ja) |
ES (1) | ES2812242T3 (ja) |
HK (1) | HK1220990A1 (ja) |
IL (2) | IL243581B (ja) |
MX (3) | MX369452B (ja) |
MY (1) | MY182065A (ja) |
NZ (1) | NZ716168A (ja) |
RU (1) | RU2721855C2 (ja) |
SG (2) | SG11201600036QA (ja) |
WO (1) | WO2015021298A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201600170B (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110461146A (zh) * | 2017-02-27 | 2019-11-15 | 再生元制药公司 | 视网膜劈裂的非人类动物模型 |
US20200246488A1 (en) * | 2017-07-17 | 2020-08-06 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for treating inflammatory bowel diseases |
EP3684929A1 (en) | 2017-09-19 | 2020-07-29 | Tropic Biosciences UK Limited | Modifying the specificity of non-coding rna molecules for silencing gene expression in eukaryotic cells |
WO2019118879A1 (en) * | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Donald Danforth Plant Science Center | Homologous recombination via transcriptional activation |
CN108728545A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-02 | 汕头大学医学院附属肿瘤医院 | 结直肠癌长链非编码rna-hotair分子标志物及其应用 |
CN108950000B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-08-04 | 青岛泱深生物医药有限公司 | lncRNA在直肠腺癌诊疗中的应用 |
CN108866198B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-08-11 | 青岛泱深生物医药有限公司 | 标志物loc105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用 |
CN108950001B (zh) * | 2018-08-31 | 2020-08-11 | 青岛泱深生物医药有限公司 | 一种与直肠腺癌发生发展相关的分子标志物 |
CN111218451B (zh) * | 2020-02-05 | 2021-08-10 | 华中农业大学 | 一种提高猪肌肉量的方法 |
RU2752663C1 (ru) * | 2020-05-18 | 2021-07-29 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "СберМедИИ" | Способ квантификации статистического анализа альтернативного сплайсинга в данных рнк-сек |
CN113999873B (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-20 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013509192A (ja) * | 2009-10-29 | 2013-03-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 多機能性対立遺伝子 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
CA2827654C (en) | 2004-10-19 | 2019-04-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method for generating an animal homozygous for a genetic modification |
CN101633923B (zh) * | 2009-07-10 | 2011-04-13 | 四川大学 | 人黑色素瘤细胞相关的长非编码rna及其用途 |
CN101619312B (zh) | 2009-07-10 | 2011-04-20 | 四川大学 | 人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码rna序列及其用途 |
RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
WO2011020014A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette |
US20120004278A1 (en) | 2010-06-18 | 2012-01-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Linc rnas in cancer diagnosis and treatment |
WO2012018881A2 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the regulation of rna |
WO2013134558A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | The Texas A & M University System | Cancer treatment targeting non-coding rna overexpression |
BR112015019950B1 (pt) | 2013-02-20 | 2023-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método para gerar linhagem de células-tronco embrionárias (es) de rato, e, cultura in vitro |
DK3456831T3 (da) | 2013-04-16 | 2021-09-06 | Regeneron Pharma | Målrettet modifikation af rottegenom |
MX2017011918A (es) * | 2015-03-16 | 2018-05-22 | Regeneron Pharma | Animal no humano que muestra una disminucion de la funcion de las motoneuronas superiores e inferiores y de la percepcion sensorial. |
-
2014
- 2014-08-07 EP EP17152034.9A patent/EP3178928B1/en active Active
- 2014-08-07 US US14/454,464 patent/US9554564B2/en active Active
- 2014-08-07 IL IL243581A patent/IL243581B/en unknown
- 2014-08-07 MX MX2016001682A patent/MX369452B/es active IP Right Grant
- 2014-08-07 AU AU2014305873A patent/AU2014305873B2/en active Active
- 2014-08-07 SG SG11201600036QA patent/SG11201600036QA/en unknown
- 2014-08-07 CN CN201480042722.1A patent/CN105518132B/zh active Active
- 2014-08-07 BR BR112016002385A patent/BR112016002385A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-08-07 WO PCT/US2014/050178 patent/WO2015021298A2/en active Application Filing
- 2014-08-07 JP JP2016533448A patent/JP6998656B2/ja active Active
- 2014-08-07 MY MYPI2016700017A patent/MY182065A/en unknown
- 2014-08-07 CA CA2917714A patent/CA2917714A1/en active Pending
- 2014-08-07 DK DK17152034.9T patent/DK3178928T3/da active
- 2014-08-07 NZ NZ716168A patent/NZ716168A/en unknown
- 2014-08-07 KR KR1020207021344A patent/KR102350200B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-07 KR KR1020177001244A patent/KR101853466B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-07 ES ES17152034T patent/ES2812242T3/es active Active
- 2014-08-07 EP EP14834544.0A patent/EP3030653A4/en active Pending
- 2014-08-07 IL IL294443A patent/IL294443A/en unknown
- 2014-08-07 KR KR1020167002367A patent/KR102138723B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-07 CN CN202110062319.7A patent/CN112715485A/zh active Pending
- 2014-08-07 SG SG10201803766UA patent/SG10201803766UA/en unknown
- 2014-08-07 RU RU2016107434A patent/RU2721855C2/ru active
-
2016
- 2016-01-08 ZA ZA2016/00170A patent/ZA201600170B/en unknown
- 2016-02-05 MX MX2022013409A patent/MX2022013409A/es unknown
- 2016-02-05 MX MX2019013309A patent/MX2019013309A/es unknown
- 2016-07-29 HK HK16109080.4A patent/HK1220990A1/zh unknown
- 2016-11-30 US US15/365,250 patent/US11547100B2/en active Active
-
2017
- 2017-01-11 AU AU2017200183A patent/AU2017200183C1/en active Active
- 2017-02-28 JP JP2017037511A patent/JP6192865B2/ja active Active
-
2018
- 2018-01-12 AU AU2018200281A patent/AU2018200281B2/en active Active
- 2018-12-17 JP JP2018235716A patent/JP2019037253A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-04-09 JP JP2020070279A patent/JP2020108409A/ja active Pending
-
2022
- 2022-07-06 JP JP2022109170A patent/JP2022125255A/ja active Pending
- 2022-11-16 US US18/056,118 patent/US20230189771A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013509192A (ja) * | 2009-10-29 | 2013-03-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 多機能性対立遺伝子 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
DEVELOPMENT, vol. 137, no. 16, JPN6018026380, 2010, pages 2643 - 2652, ISSN: 0004291531 * |
DEVELOPMENTAL CELL, vol. 24, no. 2, JPN6018026378, January 2013 (2013-01-01), pages 206 - 214, ISSN: 0004291530 * |
ELIFE, vol. vol.2,e01749, JPN6020021545, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 1 - 24, ISSN: 0004291533 * |
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 21, no. 6, JPN6018026384, 2003, pages 652 - 659, ISSN: 0004037297 * |
PLOS GENETICS, vol. Vol.7, Issue.9, e1002248, JPN6018026375, 2011, pages 1 - 14, ISSN: 0004291529 * |
TRANSGENIC RESEARCH, vol. 23, JPN6018026382, February 2013 (2013-02-01), pages 201 - 250, ISSN: 0004291532 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6192865B2 (ja) | lincRNA欠失非ヒト動物 | |
US20210392865A1 (en) | Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception | |
JP2004242557A (ja) | 筋ジストロフィー症の病態モデル哺乳動物、及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170801 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170801 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180622 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180710 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181010 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181217 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20181217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190521 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190821 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20191227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200409 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200409 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200416 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200417 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20200626 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20200630 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20210108 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20210408 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20210604 |
|
C28A | Non-patent document cited |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C2838 Effective date: 20210604 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210903 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210928 |
|
C302 | Record of communication |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C302 Effective date: 20211110 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20211112 |
|
C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20211209 |
|
C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20211209 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211221 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6998656 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |