JP2016525095A - 神経変性疾患 - Google Patents

Abstract

アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。

Description

本発明は、神経変性疾患に関し、特に新規の組成物、治療法およびかような症状（例えば、アルツハイマー病）を治療する方法に関する。

アルツハイマー病は、主に６５歳以上の男女に発症し、実質的には加齢とともに疾患の増加が診断される可能性がある。今後４０年間で世界的に増加すると予測される６５歳以上の大人の割合は、２０１０年において２１００万ケースから２０５０年において５３００万ケースとなり、アルツハイマー病の発症率は２倍を超えると予測される（ｗｗｗ．ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇおよびｗｗｗ．ａｌｚ．ｏｒｇによる統計）。アルツハイマー病を示す予測患者数におけるこの指数関数的な増加は、医療ニーズが満たされていない主要領域を表すだけでなく、疾患を治療する完全に有効な方法が無いことから、治療および診断の重要な市場機会を提供する。

この１０年間、アルツハイマー病に対しても、より広くは神経変性に対しても、特異的に効く新薬は存在しない。その理由は、今のところ、結果として薬学的にターゲットとなりうる基礎的で根本的な脳メカニズムがまだ特定されていないことにある。神経変性の過程を説明する主要候補としては「アミロイド仮説」があり、神経死が、アミロイドの毒性蓄積による細胞膜の破壊に起因し、これは死後のアルツハイマー脳の特徴であり、アミロイド前駆体タンパク質の異常な切断によってもたらされる。しかしながら、この「アミロイド仮説」は、アルツハイマー病およびパーキンソン病で頻繁に観察される共同病理学を説明するものではないし、変性に弱い細胞の特徴的な選択性や、認知症の動物モデルにおけるアミロイド蓄積や、実際のところ、認知障害が顕著でない特定の脳領域におけるアミロイドの発生についても説明するものではない。この２０年間、薬学的なターゲットとしてアミロイド形成が注目されているにもかかわらず、これまでこの理論に基づく治療法で有効性を示したものは無い。さらに大きな可能性として、ひとたび神経変性が進行すれば、二次的にアミロイドがさらに生成し、より非特異的な効果を助長するであろう。

神経変性の主要なメカニズムを特定するための１つの手がかりとしては、唯一の多様な神経細胞群は主に脆弱であるということである。さらに、アルツハイマー病、パーキンソン病および運動ニューロン障害の傾向がある異なる細胞サブグループは、互いに隣接し、脳幹から前脳に拡張する連続的な「ハブ」を形成し、高次脳中心の上方および外方への拡散突出（ｄｉｆｆｕｓｅ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）を引き起こす。ゆえに、これらの伝達物質の不均一さにもかかわらず、これらの神経細胞群は、共同的に吹き替えられた（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｕｂｂｅｄ）「グローバル（Ｇｌｏｂａｌ）」ニューロンとなり、これらを小脳、視床、皮質など、脳の他部分における類似し局在する細胞回路と区別する。これらの選択的に脆弱なグローバルニューロンは、神経変性において重要として異なる術語（「等樹状コア（ｉｓｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｏｒｅ）」）を用いたにもかかわらず、数十年前には特定された。

グローバルニューロンのサブグループは、なぜこれらの細胞のみが進行性の死に屈する一方で脳内の他の同等部分は脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）により損傷を受けたときでさえも屈しないのかという不可解かつ未だ答え出されていない疑問を説明する、共通した特別な特徴を有している：これらは、成人期に向けてかつ成人期を通じて、堅牢な可塑性を保ち、成長「栄養因子」（ｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）を補助および維持する基質に対する特異的な感受性を伴う。発達中の脳において、栄養因子はカルシウムの流入を刺激することにより働き、細胞中の一連の事象を引き起こし、結果として選択的な分化および成長をもたらす。しかしながら、より高用量において、またはより長時間の暴露により、カルシウムの流入はニューロンによって有毒となりうる。最も著しくは、カルシウムの流入が栄養作用、毒性作用のいずれを引き起こすのかにおけるさらなる決定因子は年齢である：ニューロンが成熟するにつれて、細胞内カルシウムのかつての栄養レベルは致死的となる。

以前、本発明者は、神経変性過程は事実として異常に活性化した発達プロセスであることを提唱した。この仮説の裏付けにおいて、脳幹「ハブ」ニューロンの肥大は、アルツハイマー脳において実際に報告されている（Ｂｏｗｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．７：７２３−３０）。もしこのハブの大きな領域が損傷を受けると、アルツハイマー病およびパーキンソン病についてたびたび見られるが未だ説明されない共同病理学のケースにおいて起こるように、複数の神経変性疾患をその後発症するであろう。興味深いことに、グローバルニューロンの脆弱なハブにおける全てのニューロンは、伝達物質が不均一であるにもかかわらず、類似する酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含有する。ゆえに、かような細胞のサブグループは、ノルアドレナリン作動性青斑核、ドーパミン作動性黒質またはセロトニン作動性縫線核として、通常の基質であるアセチルコリンを決して含有しないため、ＡＣｈＥは通常の機能を発揮するのが不可能なニューロン内に存在する。通常の酵素の役割からさらに予期できない逸脱としては、おそらくそれ自体である種の細胞間メッセンジャーとして、ＡＣｈＥがグローバルニューロンから実際に放出されることがある。一般的に、ＡＣｈＥは、神経および非神経組織の両方において、多様な状況での様々な栄養活性を有するシグナル伝達分子として、現在、広く十分に確立されている。

本発明者は、以前に、ＡＣｈＥは、酵素作用とは独立した栄養媒介として機能し、実際にニューロンへのカルシウム流入を引き起こすことを示している。ゆえに、グローバルニューロンにおいて、ＡＣｈＥは、栄養−毒性軸（ａ ｔｒｏｐｈｉｃ−ｔｏｘｉｃ ａｘｉｓ）に沿って変わる二重の非古典的な作用を有する可能性があり、それは量、効用持続時間、および最も顕著には年齢に依存する。標準的なニューロンは、脳卒中のように成人期で損傷を受けても、他のものが機能的に補う。これとは対照的に、グローバルニューロンが再生するためには、それらの栄養資源を要求する。しかし、続いて起こるカルシウム流入は、老齢化した成熟細胞においては致死的であるので、もたらされる損傷は、神経変性を特徴づける悪性サイクルにおいて補おうとするさらなる試みを引き起こす。

アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、様々な形態における発達の異なる段階で発現し、その全ては同一の酵素活性を有するが、全く異なる分子構成を有する。「末端付加（ｔａｉｌｅｄ）」（Ｔ−ＡＣｈＥ）はシナプスで発現され、本発明者らはＣ末端から切断されうる２つのペプチドを以前特定し、一方は「Ｔ１４」と称され、他方は「Ｔ３０」として知られ、両者はβアミロイドの相当領域と強い配列相同性を有する（図１１および配列番号２〜５を参照）。ＡＣｈＥのＣ末端ペプチド「Ｔ１４」は、非加水分解作用の領域を担うＡＣｈＥ分子の突出部として特定されている。人工の１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち「Ｔ１４」）、続いてそれが埋め込まれたより大きく、より安定で、より強力なアミノ酸配列（すなわち「Ｔ３０」）は、Ｔ３０配列内の不活性残基（すなわち「Ｔ１５」）が効果を有しない「非コリン作動性（ｎｏｎ−ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ）」ＡＣｈＥとして報告されているものに匹敵する作用を示す。

Ｔ１４とＴ３０の急性効果としては、（ｉ）数ミリ秒から数時間スケールにわたって脳切片におけるニューロンへのカルシウム流入を調節する、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＣ１２細胞および神経細胞器官型培養の細胞生存性を補う、（ｉｉｉ）ニューロンおよびＰＣ １２細胞からの「代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）」カルシウム誘導性ＡＣｈＥ放出を調節する、（ｉｖ）脳切片の卵母細胞および神経細胞におけるカルシウムの流れを活性化する、（ｖ）毒性作用においてアミロイドと相乗作用を与える、および（ｉｖ）アミロイド前駆体タンパク質の産出およびアミロイドベータペプチドの放出に関与する。Ｔ１４とＴ３０の慢性効果としては、（ｉ）ニューロンの成長を抑制する、（ｉｉ）アポトーシスを誘導する、（ｉｉｉ）ＡＣｈＥ放出を増加させる、（ｉｖ）α７ニコチン性受容体に結合して調節する、および（ｖ）２４時間で細胞表面でのα７受容体の発現を促進し、それによりさらなる毒性に向かう正方向の（ｆｅｅｄｆｏｒｗａｒｄ）メカニズムを提供する。

Ｔ１４およびＴ３０は、毒性の誘導においてβアミロイドに比べて選択的であり、また、アミロイドの悪化した毒性と相乗的であるため、Ｔ１４またはＴ３０の影響を阻害するいかなる薬剤も、アミロイドの低選択的かつ後続する毒性効果を減少させるであろうと想定された。本発明者は、以前、Ｔ３０およびＴ１４ペプチドがα７ニコチン性受容体のアロステリック部位に結合し、栄養−毒性効果（ｔｒｏｐｈｉｃ−ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ）のスペクトルを誘導することを示している。この受容体は、脳の発達の重要な時期においてＡＣｈＥとともに発現し、成人の脳において密接に類似した分布を示し、脳において最も強力なカルシウムイオノフォアの一つである。（食事から得られる）コリンは、代替的な主リガンドとしての役割を果たしうるため、コリン作動性伝達から独立して機能しうる。また、この受容体は、アミロイドの作用に関連しているのと同様に、現行治療法であるガランタミン（レミニール（ＲＴＭ））のターゲットの一つとして、アルツハイマー病に関与している。

しかしながら、他のα７ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬はまだ臨床試験中であるが、ガランタミンの有効性は乏しいことが証明されている。ゆえに、アルツハイマー病の脳において、Ｔ３０ペプチドの内因性当量（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）が既に各受容体部位を占有している場合、ガランタミンは、非生理学的で、副作用が避けられない高用量で、かつ最も重要なこととしては疑わしい有効性で、供される必要がある。

したがって、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の治療のために改良された薬剤を提供する必要がある。

実施例で記載されているように、本発明者は、驚くべきことに、ＡＣｈＥのＣ末端に由来するペプチドの環状形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＣｈＥおよび／またはその末端ペプチドの非古典的な効果（すなわち酵素活性とは独立したＡＣｈＥの効果）を選択的に阻害し、神経変性疾患を効率良く治療するのに用いられうることを実証した。

したがって、本発明の第１の側面によれば、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

環状ポリペプチドは、アミノ酸の環状鎖を形成するペプチド結合によってＮ末端およびＣ末端自身が互いに連結されているが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列またはそのトランケーションを含む環状ペプチドは、今日に至るまで開発されていない。実施例で記載されているように、本発明者は、驚くべきことに、過酸化水素の非特異的な作用に対する保護が無効力であったことから、第１の側面の環状ポリペプチドの阻害作用がきわめて選択的かつ受容体媒介性であることが示唆されることを実証した。また、発明者は、本発明の環状ポリペプチドが、公知の直鎖状ペプチドであるＴ１４およびＴ３０の毒性作用に拮抗することを観察して非常に驚き、様々な試験において、これらはα７ニコチン性受容体のアロステリック部位（例えば、イベルメクチン感受性のアロステリック部位）を通じたカルシウムのさらなる流入を防止し、βアミロイドと同様に、直鎖状Ｔ１４およびＴ３０ペプチドの結合を効果的にアウトコンピート（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）することが示唆された。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、α７ニコチン性受容体の選択的拮抗薬（ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であってもよい。

しかしながら、本発明者らは、本発明の環状ポリペプチドが、Ｔ３０およびアミロイドベータペプチドの作用と拮抗するα７ニコチン性受容体の不活性なアロステリックモジュレーターとして作用することを示していた。したがって、好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、α７ニコチン性受容体の選択的アロステリックモジュレーターであり、より好ましくは、不活性な選択的アロステリックモジュレーターである。「不活性な（ｉｎｅｒｔ）」との語は、本発明のポリペプチドが、毒性化合物、すなわちＴ３０およびアミロイドベータペプチド（βアミロイド）の存在下において、受容体のアロステリックモジュレーターとしてのみ作用することを意味する。

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、αニコチン性受容体のアロステリック部位（最も好ましくは、イベルメクチン感受性のアロステリック部位）を通じてカルシウムのさらなる流入を防ぐ。環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、βアミロイドの結合をアウトコンピート（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅｓ）することが好ましい。

本発明のペプチドは、既に各受容体部位を占有するＴ３０ペプチドの内因性当量をアウトコンピート（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）することについて予測されていなかった。さらに、向上した環状ペプチドの安定性は、この効果的な置換を説明する。したがって、環状ポリペプチドは、直鎖状のＴ１４、Ｔ３０ペプチドおよびβアミロイドの以前に確立された毒性作用を防ぐことができる。ゆえに、本発明者は、本発明の環状ポリペプチドは、さらなる細胞喪失の安定化における神経変性疾患の治療のために多大な有用性を有するであろうと考えている。

「その誘導体または類似体」との語は、そのうちのアミノ酸残基が、類似する側鎖またはペプチド骨格の特性を有する残基（天然アミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸模倣体を問わず）に置換されるポリペプチドを意味する。

「に由来する」との語は、ＡＣｈＥのＣ末端内またはその一部に存在するかそれを形成するアミノ酸配列の誘導体または改変体であるアミノ酸配列を意味する。

「そのトランケーション」との語は、ＡＣｈＥに由来する環状ポリペプチドは、アミノ酸の除去によりサイズが減少することを意味する。アミノ酸の減少は、本発明の環状ポリペプチドへの環化前にペプチドのＣ末端またはＮ末端からの残基の除去によってなされるか、あるいは環化前にペプチドのコアからの１つ以上のアミノ酸の欠失によってなされる。

好ましくは、環状ポリペプチドは、精製および／または単離され、すなわち、それは天然で発見されない。

アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、当業者にとって周知である。脳で発見されるアセチルコリンエステラーゼの主要な形態は、末端付加（ｔａｉｌｅｄ）アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）として知られている。本発明は、神経変性疾患の治療と主に関係していることを考慮すると、環状ポリペプチドまたはこれらの誘導体もしくは類似体は、末端付加アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含むことが好ましい。

ヒト末端付加アセチルコリンエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６８１５１．１）の一態様のタンパク質配列は、長さが６１４アミノ酸であり、本明細書では配列番号１として以下のように提供される。

当然のことながら、配列番号１の最初の３１アミノ酸残基は、タンパク質が放出されることによって除去され、それによって５８３のアミノ酸配列が残る。したがって、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含み、この際、アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１で実質的に定義されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＮ末端の３１アミノ酸が除かれる。

好ましくは、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の３００、２００、１００または５０アミノ酸、またはそのトランケーションを含み、この際、アセチルコリンエステラーゼは配列番号１で実質的に定義されるアミノ酸配列を含む。環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、好ましくは、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の４０アミノ酸に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む。

環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、好ましくは８〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜２０アミノ酸を含む。図１１に示すように、本発明者は、βアミロイド（Ａβ）とＡＣｈＥのＣ末端に由来する３種類のペプチド（本明細書中、Ｔ３０、Ｔ１４およびＴ１５と称される）との間の配列アラインメントを作成した。βアミロイド（Ａβ）の一部のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２として以下のように提供される。

Ｔ３０（配列番号１の最後の３０アミノ酸残基に相当する）のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３として以下のように提供される。

Ｔ１４のアミノ酸配列（配列番号１の端部に向かって位置する１４アミノ酸残基に相当し、かつＴ３０において見られる最後の１５アミノ酸を欠く）は、本明細書では配列番号４として以下のように提供される。

Ｔ１５のアミノ酸配列（配列番号１の最後の１５アミノ酸残基に相当する）は、本明細書では配列番号５として以下のように提供される。

本発明者は、配列番号２−５に基づくコンセンサス配列を一般化し、本明細書では配列番号６として以下のように提供される。

好ましくは、配列番号６において、ｘ_１は、塩基性アミノ酸残基であってもよく、好ましくはヒスチジン（Ｈ）であってもよい；ｘ_２は、塩基性アミノ酸残基であってもよく、好ましくはアルギニン（Ｒ）であってもよい；ｘ_３は、芳香族アミノ酸残基であってもよく、好ましくはトリプトファン（Ｗ）であってもよい；ｘ_４は、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基であってもよく、好ましくはセリン（Ｓ）であってもよい；ｘ_５は、トリプトファン（Ｗ）またはメチオニン（Ｍ）であってもよい。

当然のことながら、配列番号２〜６として表されるいかなる配列も、容易に環化して、第１の側面の環状ポリペプチドを形成することができる。例えば、ペプチドの環化は、側鎖−側鎖、側鎖−骨格、または頭−尾（Ｃ末端−Ｎ末端）環化技術によってなされうる。好ましい一実施形態において、頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）環化は、環状ポリペプチドを製造するのに好ましい方法である。環状ポリペプチドは、古典的な溶液相での直鎖状ペプチドの環化、あるいは担体上での（ｒｅｓｉｎ−ｂａｓｅｄ）環化のいずれかを用いて合成することができる。環化のための好ましい方法は、実施例に記載されている。他の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、環化切断アプローチを用いて製造され、この際、段階的な直鎖状ペプチド合成後の環化によって環状ポリペプチドは合成される。この方法の利点は、側鎖が固定される必要が無いことであり、ゆえにより汎用的である。好ましくは、使用前に、環状ペプチドの合成サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析してもよい。

したがって、本発明に係る好ましいポリペプチドは、環状の配列番号３、４、５もしくは６、またはその機能的変異体もしくはフラグメントを含む。

一実施形態において、環状ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、Ｎ末端のリジン残基はＣ末端のロイシン残基に連結され、アミノ酸の環状鎖が形成される。他の実施形態において、環状ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、Ｎ末端のアラニン残基は、Ｃ末端のリジン残基に連結される。さらに他の実施形態において、環状ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、Ｎ末端のアスパラギン残基は、Ｃ末端のロイシン残基に連結される。他の実施形態において、環状ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、この際、ｘ_１は塩基性アミノ酸残基、好ましくはヒスチジン（Ｈ）であってもよく；ｘ_２は塩基性アミノ酸残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）であってもよく；ｘ_３は芳香族アミノ酸残基、好ましくはトリプトファン（Ｗ）であってもよく；ｘ_４は脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはセリン（Ｓ）であってもよく；ｘ_５はトリプトファン（Ｗ）またはメチオニン（Ｍ）であってもよく、Ｎ末端のアラニン残基は、Ｃ末端のヒスチジン残基に連結される。

本発明者は、環化した配列番号４（すなわち、本明細書中、「環化ＣＴ１４」、「ＣＴ１４」または「ＮＢＰ１４」と称される）が、驚くことに、α７ニコチン性受容体の真の拮抗薬として作用することを発見した。言い換えれば、環化した配列番号４は、直鎖状Ｔ１４、Ｔ３０およびβアミロイドの毒性から細胞を保護したということである。さらに、環化Ｔ１４は、直鎖状Ｔ１４およびＴ３０のこの毒性によって誘発される代償的なＡＣｈＥの放出を阻害する。加えて、彼らは、単独で与えられた環化Ｔ１４は、ラット脳切片におけるＣａ^２＋の濃度に対して顕著な影響を有しないが、βアミロイドの効果を阻害することを観察した。したがって、第１の側面の好ましい環状ポリペプチドは、環状の配列番号４またはその機能的変異体またはフラグメントを含む。

当業者であれば、機能的変異体および類似体は、実施例に記載されたいずれの実験おいても、環状Ｔ１４と実質的に同一の生物学的活性を保持することを理解するであろう。したがって、機能的変異体または類似体は、α７ニコチン性受容体のイベルメクチン感受性のアロステリック部位の拮抗活性に基づいて、またはＡＣｈＥの放出を阻害する程度により、または直鎖状Ｔ１４、Ｔ３０およびβアミロイドの毒性から細胞を守る程度により、またはラット脳切片におけるＣａ^２＋レベルを調節する程度により、選択することができる。

本発明者は、第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の環化によって提供される、観察された受容体拮抗作用が、当業者にとって明白でなかったのは驚くことではないと確信している。このように、本発明者は、いかなるポリペプチドの環化も、α７ニコチン性受容体などの受容体を拮抗するために使用することができると考えている。

ゆえに、第２の側面において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を含む、受容体拮抗薬が提供される。

さらに、第３の側面において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、受容体拮抗薬としての使用のために提供される。

上述したように、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の環状ポリペプチドが、Ｔ３０およびアミロイドベータペプチドの作用と拮抗するα７ニコチン性受容体の不活性なアロステリックモジュレーターとして作用することを示している。

ゆえに、第４の側面において、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を含む受容体アロステリックモジュレーターが提供される。

第５の側面において、受容体のアロステリックモジュレーターとしての使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、好ましくは、第１の側面に係るポリペプチド、その誘導体もしくは類似体である。受容体は、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体剤が拮抗するかアロステリックに調節するものであるが、α７受容体であることが好ましい。しかしながら、好ましくは、受容体は、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が拮抗するかアロステリックに調節するものであるが、α７ニコチン性受容体であることが好ましい。環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、受容体上のアロステリック部位、好ましくはイベルメクチン感受性アロステリック部位について拮抗するか調節することが好ましい。

本発明者らは、環状ポリペプチドが治療（例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療）に使用されうることを示すことが第一であると考えている。

したがって、さらなる側面において、治療または診断における使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

さらなる側面において、神経変性疾患の治療、改善または予防における使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体が提供される。

さらに別の側面において、患者における神経変性疾患を治療、改善または予防する方法が提供され、当該方法は、治療上有効な量の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を、かような治療を必要とする患者に投与することを含む。

上述したように、本発明者は、本明細書で記載されている環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または受容体拮抗薬、またはアロステリックモジュレーターは、神経変性疾患を治療するための基礎を形成するために使用されうると考えている。

ゆえに、本発明の第６の側面において、治療または診断における使用のための、第１の側面に係る環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体、第２の側面に係る受容体拮抗薬、第４の側面に係る受容体アロステリックモジュレーターが提供される。

第７の側面において、神経変性疾患の治療、改善または予防における使用のための、第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または第２の側面に係る受容体拮抗薬、または第４の側面に係る受容体アロステリックモジュレーターが提供される。

第８の側面において、患者における神経変性疾患を治療、改善または予防する方法が提供され、当該方法は、治療上有効な量の、第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または第２の側面に係る受容体拮抗薬、または第４の側面に係る受容体アロステリックモジュレーターを、かような治療を必要とする患者に投与することを含む。

好ましくは、神経変性疾患は、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン疾患；脊髄小脳１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ならびに前頭側頭型認知症からなる群より選択されるが、好ましくはアルツハイマー病である。

治療される神経変性疾患は、それぞれ「グローバル（Ｇｌｏｂａｌ）」ニューロンの損傷または死を特徴とするものであることが好ましい。例えば、神経変性疾患は、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン疾患；脊髄小脳１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭型認知症；ならびに統合失調症からなる群から選択される。

好ましくは、治療される神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、または運動ニューロン疾患である。最も好ましくは、治療される神経変性疾患は、アルツハイマー病である。

当然のことながら、本発明に係る環状ポリペプチドまたは受容体拮抗薬または受容体アロステリックモジュレーターは、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療、改善または予防するために、単剤療法（すなわち、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の使用）において用いられる薬剤に用いてもよい。あるいは、本発明に係る環状ポリペプチドまたは受容体拮抗薬または受容体アロステリックモジュレーターは、補助剤として、または、他のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤のようなアルツハイマー病の治療、改善、予防するための公知の治療法と組み合わせて用いてもよい。

本発明に係る環状ポリペプチドは、特に、組成物の使用方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物と組み合わせてもよい。ゆえに、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与してもよいその他の適切な形状の形態であってもよい。当然のことながら、本発明に係る薬剤の賦形剤は、投与される患者が耐えうるものであるべきであり、血液脳関門を通過して環状ポリペプチドを送達できることが好ましい。

当然のことながら、いかなる脳疾患の治療の有効性も、候補治療化合物の血液脳関門（ＢＢＢ）の通過能に左右される。本発明者は、環状Ｔ１４のサイズのペプチドは、以下の経口投与にすぐに利用できないと考えている。しかしながら、アルツハイマー病において、血液脳関門は透過性が増加し、環状１４が中枢神経系（実に理想的には、必要とされる、すなわちＢＢＢが支障をきたす（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）変性部位）まで到達可能となることが知られている。

環状Ｔ１４（すなわち、ＮＢＰ−１４）などの大きな分子を用いてＢＢＢを通過するために２つの主要な戦略を適用してもよく、以下を含む：（１）特に脳を標的とし、活性化合物を送達するためのトランスポーターとしてのナノ粒子の使用。この方法は、脳にペプチド、タンパク質および抗癌剤を送達するために使用実績がある；（２）カーゴペプチドの使用。特にＢＢＢを通過して輸送されるかようなペプチドを添加することで、環状ポリペプチドの移動が容易に可能となる。

本発明に係る環状ポリペプチドを含む薬剤は、多くの方法で使用することができる。例えば、経口投与は、錠剤、カプセルまたは液体形態において経口摂取されうる組成物に環状ポリペプチドが含まれる場合において、必要とされうる。鼻用スプレーによるペプチド投与は、経口投与または静脈投与よりも迅速かつ効率的に脳に到達することから（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｏｒｙｚｉｎｅ．ｃｏｍ／２０１０／０７／２６／ｎｏｓｅ−ｓｐｒａｙｓ−ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ−ｂａｒｒｉｅｒ−ｆａｓｔｅｒ−ａｎｄ−ｓａｆｅｒ／を参照）、環状Ｔ１４（すなわちＮＢＰ１４）を投与する代わりの選択肢として、鼻用スプレーが用いられるであろう。したがって、本発明に係る環状ポリペプチドを含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）により投与してもよい。また、組成物は、局所使用のために調合してもよい。例えば、クリームまたは軟膏は、（例えば、脳に隣接する）皮膚に適用してもよい。

本発明に係る環状ポリペプチドは、徐放デバイスまたは遅延放出デバイス（ａ ｓｌｏｗ− ｏｒ ｄｅｌａｙｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ ｄｅｖｉｃｅ）に組み込まれてもよい。例えば、かようなデバイスを皮膚上または皮内に挿入し、数週間または数ヶ月にわたって薬剤を放出してもよい。デバイスは治療部位（例えば、頭）に少なくとも隣接して配してもよい。本発明に係る環状ポリペプチドを用いた長期治療が必要であり、頻繁な投与（例えば、少なくとも連日注射）を通常的に要する場合において、かようなデバイスは特に有利である。

好ましい実施形態において、本発明に係る薬剤は、患者に対して、血流に、または直接治療を必要とする部位に注射することによって投与してもよい。例えば、薬剤は、少なくとも脳に隣接して注射してもよい。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）または皮内（ボーラスまたは点滴）であってもよい。

当然のことながら、必要とされる環状ポリペプチドの量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、投与様式、環状ポリペプチドの物理化学的性質、およびそれが単独療法または併用療法のいずれで使用されるのかに依存する。また、投与頻度は、治療される患者内の環状ポリペプチドの半減期に影響されるであろう。投与される最適用量は、当業者によって決定され、使用中の特定の環状ポリペプチド、薬剤組成物の強度、投与様式、および神経変性疾患の進行によって異なるであろう。治療される特定の患者に依存する追加因子は、患者の年齢、体重、性別、食事および投与時間を含み、これによって用量を調整する必要性が生じる。

一般的に、治療、改善または予防するために、本発明に係る環状ポリペプチドは、０．００１μｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇの一日用量で使用されてもよく、使用する環状ポリペプチドによる。一日用量は、より好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ体重である。

環状ポリペプチドは、神経変性疾患の発症前、発症中または発症後に投与してもよい。毎日の用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射または鼻腔スプレーの吸入）として与えられてもよい。あるいは、環状ポリペプチドは、１日２回以上の投与を必要としてもよい。一例として、環状ポリペプチドは、（すなわち、体重７０ｋｇを仮定して）０．０７μｇ〜７００ｍｇの量で、１日２回（または、治療される神経変性疾患の重症度によってはそれ以上）投与してもよい。治療を受ける患者は、（２回投与の場合）起床時に１回目の投与を、夕方またはそれから３〜４時間空けて２回目の投与を受けてもよい。あるいは、複数回投与を必要としない患者に対して、最適な用量の本発明に係る環状ポリペプチドを提供するために、徐放デバイスを用いてもよい。

本発明に係る環状ポリペプチドの特定の配合や（薬剤の一日用量や投与頻度などの）正確な治療計画を形成するのに、製薬業界で従来採用されているものなど公知の方法（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）を用いてもよい。本発明者は、本発明に係る環状ポリペプチドの使用に基づき、自らが抗神経変性疾患組成を提案した第一人者であると考えている。

したがって、本発明の第９の側面において、治療上有効な量の第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または第２の側面に係る受容体拮抗薬、または第４の側面に係る受容体アロステリックモジュレーターと、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬剤組成物が提供される。

薬剤組成物は、好ましくは、抗神経変性疾患組成物、すなわち、アルツハイマー病などの患者の神経変性疾患の治療改善、予防または治療において使用される医薬製剤である。

また、本発明は、第１０の側面において、第９の側面に係る薬剤組成物の製造方法を提供する。当該方法は、治療上有効な量の第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または第２の側面に係る受容体拮抗薬、または第４の側面に係る受容体アロステリックモジュレーターと、薬学的に許容される賦形剤とを組み合わせることを含む。

環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、ここで開示されている環状Ｔ１４（すなわち、ＮＢＰ１４）、すなわち配列番号４であることが好ましい。

「患者」は、脊椎動物、哺乳類または家畜であってもよい。したがって、本発明に係る薬剤は、いかなる哺乳動物、例えば家畜（例えば馬）、ペットを治療するのに使用してもよく、または他の獣医学用途において使用してもよい。しかしながら、最も好ましくは、患者はヒトである。

本明細書で称される、環状ポリペプチドの「治療上有効な量」は、患者に投与した際、神経変性疾患の症状を治療し、所望の効果を生じるのに必要とされる活性剤量である任意量である。

例えば、使用される環状ポリペプチドの治療上有効な量は、約０．００１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであってもよい。環状ポリペプチドの量は、約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇであることが好ましい。

本明細書で称される、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者にとって薬剤組成物を処方するのに有用であると知られている、公知の化合物または公知の化合物の組み合わせである。

一実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容可能な賦形剤は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮補助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、コーティング剤または錠剤崩壊剤として作用しうる１つ以上の物質を含む。また、賦形剤は、封止材（ａｎ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）であってもよい。粉末において、賦形剤は、本発明に係る微細な活性剤との混合物である微細固体である。錠剤において、活性剤（すなわち、モジュレーター）を、圧縮特性を有する賦形剤と適当な割合で混合し、所望の形状・大きさに圧縮してもよい。粉末および錠剤は、活性物質を９９％以下含むことが好ましい。好適な固体賦形剤としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂がある。他の実施形態において、薬学的賦形剤はゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。

しかしながら、薬学的賦形剤は液体であってもよく、薬剤組成物は溶液の形態であってもよい。液体賦形剤は、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物を調製するのに使用される。本発明に係る活性剤（環状ポリペプチド）は、水、有機溶媒、それらの混合物または薬学的に許容される油または脂など、薬学的に許容される液体賦形剤に溶解または懸濁してもよい。液体賦形剤は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香料、懸濁化剤、増粘剤、色素、粘度調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤などの他の適当な医薬品添加物を含有してもよい。経口および非経口投与向けの液体賦形剤の好適例としては、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一部含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびその誘導体、ならびに油（（例えば、分留ヤシ油およびラッカセイ油）。また、非経口投与の場合、賦形剤は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルとすることができる。滅菌された液体賦形剤は、非経口投与向けの滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物向けの液体賦形剤は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤とすることができる。

滅菌された溶液または懸濁液である液体薬剤組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注射によって利用することができる。環状ポリペプチドは、滅菌水、生理食塩水または他の好適な滅菌注射用媒体を用いて投与する際、溶解または懸濁されうる滅菌固体組成物として調製することができる。

本発明の環状ポリペプチドおよび組成物は、他の溶質や懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびエチレンオキシドと共重合したその無水物）などを含む、滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与されてもよい。また、本発明に係る使用される環状ポリペプチドは、液体または固体の組成物形態で経口投与することができる。経口投与に好適な組成物は、ピル、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液などの液体形態を含む。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。

本発明者らは、その拮抗的性質のために、第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体または類似体に驚くべき治療効果があることを実証したが、設計された非臨床関連実験においてα７ニコチン性受容体の構造および／または機能を調査するのに有用であろうと考えている。

したがって、さらなる側面において、α７ニコチン性受容体を調査するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの分析方法における、第１の側面に係る環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の使用方法が提供される。

好ましくは、当該方法は、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位の探索を含む。好ましくは、当該方法は、α７ニコチン性受容体を通じたカルシウムのさらなる流入を防止するために環状ペプチドを使用することを含む。環状ペプチドは、アンタゴニストとして機能し、カルシウムイオンを阻害することが好ましい。

当然のことながら、本発明は、核酸またはペプチドまたはその変異体、誘導体または類似体にまで拡張するものであり、その機能性変異体または機能性フラグメントを含む、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸または核酸配列を実質的に含む。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能性変異体」および「機能性フラグメント」は、例えば配列番号１−６で定義される配列と４０％の同一性であるなど、本明細書で言及されるいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列である。

また、言及される配列のいずれかと６５％超、好ましくは７０％超、よりこのましくは７５％超、さらにより好ましくは８０％超である配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列についても想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有し、言及される配列のいずれかと、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性である。

当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性割合の計算方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性割合（ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を計算するためには、まず２つの配列のアラインメントを準備し、配列同一性値を計算する。２つの配列の同一性割合は、（ｉ）配列をアラインするために使用される方法（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施した）または３Ｄ比較による構造アラインメント）、および（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ（例えば、ローカル対グローバルアライメント、ペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、ギャップペナルティ（例えば、関数形式や定数））に依存して、異なる値をとる。

アライン後、２つの配列間の同一性割合を計算する方法は多数ある。その一つとして、例えば、一致数（ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を（ｉ）最短配列長さ、（ｉｉ）アラインメント長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置数、または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置数で除してもよい。さらに、当然のことながら、同一性割合は、長さにも大きく依存する。ゆえに、配列の短いペアでは、より高い配列同一性が偶然に発生することが予想される。

したがって、当然のことながら、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスである。有名な多重アラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明に合致したタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを生成する上で好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに好適なパラメータは下記のとおりである：ＤＮＡアラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝アイデンティティ。タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質のアラインメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝−１およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれらおよび他のパラメータを変更することが必要なことに気づくであろう。

好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性割合の計算は、その後、（Ｎ／Ｔ）^＊１００などのアラインメントから計算してもよく、この際、Ｎは、同一の残基を共有する配列における位置の数であり、Ｔは、ギャップを含みオーバーハングを除いて比較した位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性割合を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記のように、好適な一連のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを作成し、および（ｉｉ）ＮおよびＴを次式に挿入する：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）^＊１００。

類似する配列を特定するための他の方法は、当業者にとって公知である。例えば、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件は、ヌクレオチドが約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズさせた後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、配列番号１−６で示される配列とは、少なくとも１アミノ酸、しかし５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸が異なっていてもよい。

遺伝コードの縮退により、これによってコードされるタンパク質配列に実質的に影響を及ぼすことなく、本明細書に記載されるいかなる核酸配列は変異または変化して、その機能性変異体を提供してもよいことは明白である。好適なヌクレオチド変異体は、配列内で同一のアミノ酸をコードし、ゆえにサイレントな変化を生む異なるコドンの置換によって変更された配列を有するものである。他の好適な変異体は、対応するヌクレオチド配列を有するが、置換されるアミノ酸と同様の生物物理学的性質の側鎖を有するアミノ酸をコードする、異なるコドンの置換によって変更される配列の全部または一部を含むものであり、保守的な変化を生む。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。ゆえに、いずれのアミノ酸が同様の生物物理学的性質を有するアミノ酸で置換されてもよいか当然に理解され、当業者であればこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知るであろう。

（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）ここで記載された特徴のすべて、および／または開示された方法またはプロセスの過程のすべては、少なくともかような特徴および／または過程の一部が相互に排他的である場合を除き、上記の側面のいずれと組み合わせてもよい。

本発明をより理解するため、および本発明の実施形態を有効に実施することができる方法を示すために、参照として、図面を添付する。

処理１時間後、環状Ｔ１４単独ではＰＣ１２細胞生存率に対して効果が無いことを示す棒グラフである。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６を表す。 環状Ｔ１４存在下または非存在下において、（増加した濃度の基質の切断能によって決定される）ＡＣｈＥ酵素活性が変化しないことを示さないグラフである。対照的に、ガランタミンは、酵素活性に対してきわめて顕著な競合阻害を示す。データは、平均±ＳＤ、Ｎ＝４を表す。 細胞生存率に対する、Ｈ_２Ｏ_２（１００μＭ）単独の非特異的毒性効果、および環状Ｔ１４（１００ｎＭ）と組み合わせた際のその持続を示す棒グラフである。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６である。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 （Ａ）βアミロイド（１０μＭ）、（Ｂ）Ｔ１４（１０μＭ）および（Ｃ）Ｔ３０（１０μＭ）を単独で、または０時間で環状Ｔ１４（１００μＭ）と組み合わせて、１時間処理した後の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１２を表す。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 （Ａ）βアミロイド（１０μＭ）、（Ｂ）Ｔ１４（１０μＭ）および（Ｃ）Ｔ３０（１０μＭ）を単独で、または０時間で環状Ｔ１４（１００μＭ）と組み合わせて、１時間処理した後の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１２を表す。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 （Ａ）βアミロイド（１０μＭ）、（Ｂ）Ｔ１４（１０μＭ）および（Ｃ）Ｔ３０（１０μＭ）を単独で、または０時間で環状Ｔ１４（１００μＭ）と組み合わせて、１時間処理した後の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１２を表す。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 Ｔ３０（１０μＭ）単独で、Ｔ１４（１０μＭ）単独で、または環状Ｔ１４（１００ ｎＭ）と組み合わせて、ＰＣ１２細胞を処理した後のＡＣｈＥ活性を示す棒グラフである。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６を表す。＊対コントロール、＊＊＊Ｐ＜０．００１；グループ内の＃、＃＃＃Ｐ＜０．００１である。 ＰＣ１２細胞膜中のβアミロイド、Ｔ３０およびＴ１４による［^３Ｈ］イベルメクチン結合阻害の競合曲線を示し、ラット脳膜においても示されている。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝３を表す。 ＰＣ１２細胞中の環状Ｔ１４およびガランタミンによる結合［^３Ｈ］イベルメクチン結合阻害の競合曲線を示し、ラット脳膜においても示されている。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６を表す。 細胞生存率における、βアミロイド（１０μＭ）に対するガランタミン（１００ｎＭ）および環状Ｔ１４（１ｎＭ）の最低有効濃度を示す棒グラフである。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６を表す。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５である。 細胞生存率における、βアミロイド（１０μＭ）に対する環状Ｔ１４（１ｎＭ）の用量応答効果を示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６を表す。＊対コントロール；＊Ｐ＜０．０５である。 異なる処理２時間後のラット脳切片中のＣａ^２＋の細胞内レベルを示す棒グラフである。データは平均±ＳＥＭ、Ｎ＝４を表す。 ペプチド、Ｔ３０、Ｔ１５、Ｔ１４およびβアミロイド（Ａβ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。 ペプチド、Ｔ３０、Ｔ１５、Ｔ１４およびβアミロイド（Ａβ）のアミノ酸配列アラインメントを示す。 α７−ｎＡＣｈＲにおけるβアミロイドおよびＴ３０の結合部位を示す概略図である。 Ｔ３０によって誘導されるカルシウム流入に対する、異なる濃度のＮＢＰ−１４（５、７、９、１０、２０、５０、７０、１０００、５０００ｎＭ）の保護効果を示すグラフである。値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、Ｔ３０の応答に対する阻害剤濃度の対数、ＮＢＰ−１４の非線形曲線にフィッティングした。 Ｔ３０によって誘導されるＡＣｈＥ放出に対する、異なる濃度のＮＢＰ−１４（５、７、９、１０、２０、５０、７０、１０００、５０００ｎＭ）の保護効果を示すグラフである。値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、Ｔ３０の応答に対する阻害剤濃度の対数、ＮＢＰ−１４の非線形曲線にフィッティングした。 Ｔ３０によって誘導される細胞生存率に対する、異なる濃度のＮＢＰ−１４（５、７、９、１０、２０、５０、７０、１０００、５０００ｎＭ）の保護効果を示すグラフである。値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、Ｔ３０の応答に対する阻害剤濃度の対数、ＮＢＰ−１４の非線形曲線にフィッティングした。 異なるＴ３０濃度下での視床電気刺激に対する全体的な皮質応答を示すグラフである。（Ａ）蛍光強度の分数変化として測定されるニューロン集団活動の同調性。（Ｂ）アクティブピクセル数として測定される集団活動の広がり−対象領域内の任意の単一ピクセルによって発せられる最大強度の２０％超を示す画素として定義される。 図１６からわかるように、異なるＴ３０濃度下でのアセンブリの広がりの上昇期の分離および線形分析を示す。Ｔ３０の濃度が増加することで、アセンブリの伝播速度に相当する線形勾配が用量依存的に減少することを示す。 図１６からわかるように、異なるＴ３０濃度下でのアセンブリの広がりの上昇相の分離および線形分析を示す。Ｔ３０の濃度が増加することで、アセンブリの伝播速度に相当する線形勾配が用量依存的に減少することを示す。 Ｔ３０およびＮＢＰ−１４の処理下での、視床−皮質が誘発する（ｔｈａｌａｍｏ−ｃｏｒｔｉｃａｌｌｙ−ｅｖｏｋｅｄ）神経アセンブリの広がりダイナミクス分析を示す（ｎ＝３）。上昇期（左パネル）の分析は、伝播の傾き（速度）の増加におけるＴ３０の潜在効果を示す。傾きは、初期のＴ３０灌流後わずか約４５〜６０分で顕著な増加を示している（黄色バー、５ｎＭ ＮＢＰ−１４での橙色灌流中に効果が顕著となる）。この急激な増加傾向は、１００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流中（赤色バー）に低下した後、最後の３００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流中（黒色バー）にベースラインレベルまで戻る。プラトー期分析（右パネル）は、同様の効果プロファイルを示している。上のパネルは、異なる薬剤処理下でアセンブリの広がりの挙動を平均化したボックスおよびウィスカープロットを示す：上昇期勾配分析において見られたものと同様の傾向であり、有意ではないものの、記録浴（１００ｎＭ）に到達する十分に高いＮＢＰ−１４濃度までＴ３０が誘発されるアセンブリの広がりを徐々に増加するという傾向は維持され、３００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流（黒色）では、この興奮傾向はコントロールレベル（青色）にまで戻る。 Ｔ３０およびＮＢＰ−１４の処理下での、視床−皮質が誘発する（ｔｈａｌａｍｏ−ｃｏｒｔｉｃａｌｌｙ−ｅｖｏｋｅｄ）神経アセンブリの広がりダイナミクス分析を示す（ｎ＝３）。上昇期（左パネル）の分析は、伝播の傾き（速度）の増加におけるＴ３０の潜在効果を示す。傾きは、初期のＴ３０灌流後わずか約４５〜６０分で顕著な増加を示している（黄色バー、５ｎＭ ＮＢＰ−１４での橙色灌流中に効果が顕著となる）。この急激な増加傾向は、１００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流中（赤色バー）に低下した後、最後の３００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流中（黒色バー）にベースラインレベルまで戻る。プラトー期分析（右パネル）は、同様の効果プロファイルを示している。上のパネルは、異なる薬剤処理下でアセンブリの広がりの挙動を平均化したボックスおよびウィスカープロットを示す：上昇期勾配分析において見られたものと同様の傾向であり、有意ではないものの、記録浴（１００ｎＭ）に到達する十分に高いＮＢＰ−１４濃度までＴ３０が誘発されるアセンブリの広がりを徐々に増加するという傾向は維持され、３００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流（黒色）では、この興奮傾向はコントロールレベル（青色）にまで戻る。 ＮＢＰ−１４濃度の増加（０．１、５、１００および３００ｎＭ）に対してＴ３０の効果を試験した３種類の実験（すなわち、左、中央、右の列）から定性的な結果を示す。上のパネルは、２つの主な平均化データのグラフを示す：左−蛍光シグナル強度、および右−誘発されるアセンブリの広がり。下のパネルは、各灌流条件につき、時間（合計３１０ｍｓ、ｘ軸）に対する対象領域に横たわる一列のピクセルの活性（ｙ軸）をマッピングする「時空間」マップを示す。強度グラフにあるように、Ｔ３０およびＮＢＰ−１４の共灌流（ｃｏ−ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の結果として、蛍光強度の劇的な減少が顕著に表れた。注：時空マップは、それぞれの灌流（左）を標識化し、強度（右）および広がり（左）のグラフの両方において対応する軌跡を色分けした。 ＮＢＰ−１４のｉｎ ｖｉｖｏ試験中に準拠される手順の概略を示す。手術前日、障害を明らかにするために、全ての動物について試験する。手術当日は、観察０日目とみなす。１日目に、賦形剤またはＮＰＢ−１４を注射するために、肢配置試験（ａ ｐａｗ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）により最適な２４個体のうち１６個体を選択した。２日目に肢配置試験を行った。 肢配置試験における、ベースラインおよび６ＯＨＤＡ単独と比較した、６−ＯＨＤＡに対するＮＢＰ−１４の効果を示す。６−ＯＨＤＡ ＊＊Ｐ＜０．０１、および６ＯＨＤＡ＋ＮＢＰ１４ ＊＊＊Ｐ＜０．００１対ベースライン（Ｎ＝８）。 細胞内のＴ３０の効果に起因する一連の事象を示す。 全長ＡＰＰはＮＢＰ−１４によって減少することを示す。データは、３種類の異なる処理を１時間行った後、可溶化したＰＣ１２細胞におけるＡＰＰの発現を表す。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝２として表される。 そして、グラフで表されるウェスタンブロットによる免疫検出を示している。３種類の処理は、ＡＰＰの異なる発現レベルを示す（図２４で示される値）。各条件につき、タンパク質はＧＡＰＤＨレベルで補正されている。 Ｔ３０はＡβ４２の放出を誘導し、ＮＢＰ１４によって反転される効果であることを示す。グラフは、コントロール条件下、Ｔ３０存在下ならびにＴ３０およびＮＢＰ−１４存在下における、Ａβ４２の放出を示す。結果は、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝４）として表される。

ここで、配列番号４は、「環化（ｃｙｃｌａｔｅｄ）Ｔ１４」、「ＣＴ１４」または「ＮＢＰ１４」を意味するものとする。

＜材料および方法＞
［ペプチドの環化］
直鎖状ペプチドの環化を達成するために、ここで記載される３つの技術、すなわち側鎖−側鎖、側鎖−主鎖および頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）（Ｃ末端−Ｎ末端）環化を用いた。頭−尾環化は、広く研究されており、（１分子あたり２つ以下の）指向された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド環化に関与しうる。反応を注視することで、確実に１００％環化される。合成には、（１）高希釈濃度下での古典的な溶液相での直鎖状ペプチド環化および（２）担体上での（ｒｅｓｉｎ−ｂａｓｅｄ）環化の２つの主要なアプローチが用いられる。固相合成（１）において、２つの異なるプロトコールを採用した：
（ａ）イミダゾール、３酸、４アミン’またはアルコールなどの側鎖官能基を介して固定されたペプチドの担体上環化を行った。ペプチドをＣ末端でエステルとして直交に（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）保護した後、通常のＢｏｃまたはＦｍｏｃ合成を通じて結合し、ケン化、環化および切断した。

（ｂ）用いた他のプロトコールは、環化切断アプローチであり、段階的な直鎖状ペプチド合成を行った後、環化により環状ペプチドを合成した。この方法の１つの長所は、側鎖を固定する必要が無いことであり、（ａ）より汎用的なアプローチとなっている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｉ Ｋ．Ｙｕｄｉｎ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３；Ｖａｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．５３，７６−６７；Ｌｉｈｕ Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｇｒｅｇ Ｍｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４０，８１９７−８２００；Ｐａｒｖｅｓｈ Ｗａｄｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７１，５５−６１）。

環状ペプチドの生成サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。

［ＰＣ１２細胞培養］
ＰＣ１２細胞はクローンであり、副腎髄質由来の褐色細胞腫細胞株である（Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７３：２４２４−２４２８；Ｍｉｚｒａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７：６１６１−６１６５）。これらは容易に培養でき、すぐに実験的操作に用いることができる。クロム親和性細胞は神経堤に由来するが、アクセス可能な末梢器官（副腎髄質）の中心に存在するため、これらは脳への「窓」を提供すると記述されている（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １７：３５４−３５８）。当該細胞は、神経変性における未知の主要プロセスの研究のために、強力で、新規であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして役立ち、これが当該プロジェクトで有用な理由は以下のとおりである：アルツハイマー患者の副腎髄質は、ＣＮＳにおいて見られるものとよく似た多様な病理学的特徴を示し、例えば、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の発現と同様に、多数のＬｅｗｙ小体様封入物、神経原線維変化および一対のらせん状フィラメントがある（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ １６８：５７−６０）。さらに、ＡｐｐｌｅｙａｒｄおよびＭａｃｄｏｎａｌｄ（１９９１，Ｌａｎｃｅｔ ３３８：１０８５−１０８６）は、おそらく促進された血漿中への分泌に起因し、ＡＣｈＥの可溶な（すなわち放出可能な）形態のみがＡＤの副腎から選択的に除去されることを実証しており、ＡＤ患者ではこれが上昇している（Ａｔａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８５， Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ７０：１−１２；Ｂｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｒａｉｎ １３１：１０９−１１９）。

野生型ＰＣ１２細胞は、シグマアルドリッチ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より提供された。培養は、コラーゲン（２μｇ／ｃｍ^２）でコートされた１００ｍｍディッシュ（コーニング社）中に規定通りに置き、熱失活１０％ウマ血清（ＨＳ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグル必須最小培地（ＭＥＭ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１：４００のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を用いた培地で成長状態を維持した。細胞は、加湿雰囲気５％ＣＯ_２内にて３７℃で保ち、培地を２日ごとに交換した。継代（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）のため、ピペットと培地とを用いて細胞をディッシュから引き剥がし、これらの一部を新しい培養ディッシュに移した。細胞は、１２〜２５継代のものを使用した。

［細胞膜の調製］
結合アッセイを行うため、ＰＣ１２膜を得た。ＰＣ１２細胞を１００ｍｍプレート上でコンフルエントになるまで成長させた。成長培地を除去し、４．５μｇ／μｌアプロチニンおよび０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を添加した。細胞を機械的に脱離させ、４℃で４分間遠心分離（１０４０×ｇ）しペレット化した。ペレットをＰｏｌｙｔｒｏｎでホモジナイズし、４℃で２０分間遠心分離（１３０００×ｇ）した。ペレットを新しいバッファー中で再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートし、内在性の神経伝達物質を除いた。続いて、サンプルを再懸濁した。最終ペレットをバッファー中で再懸濁し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてタンパク質濃度を算出した。細胞膜の調製は−８０℃で保管した。

［βアミロイドの調製］
提供元（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）が示すように、βアミロイド（１−４２）線維を調製した。βアミロイド（１−４２）１ｍｇを１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）２１２μｌおよびＮＨ_４ＯＨ １０μｌ中に溶解した。超音波処理およびチューブあたり１０μｌずつ分けた後、高速真空乾燥機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）で乾燥し、−２０℃で保管した。実験のため、サンプルをＤＭＳＯ（５ｍＭ）２μｌおよびＨＣｌ（０．０１Ｎ）９８μｌ中に希釈して繊維形成させ、３７℃で一晩インキュベートした。

［［^３Ｈ］イベルメクチン結合アッセイ］
ＰＣ１２膜との結合のため、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に希釈した異なる濃度のＡＣｈＥペプチドＴ３０、βアミロイドまたは環状Ｔ１４非存在下または存在下（０．１、０．５、０．７、１、２、１０μＭ）で、最終量０．５ｍｌとし、５ｎＭ［^３Ｈ］イベルメクチン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）とともに（ＰＣ１２膜５０μｇを含有する）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中に希釈した膜０．２５ｍｌを含有するポリスチレンチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）内で、４℃で２時間インキュベーションをそれぞれ行った。その後、サンプルを、Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｂｒａｎｄｅｌ；ＭＤ，ＵＳＡ）により０．５％ ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｎｅ）中に予め浸漬したＢｒａｎｄｅｌ ＧＢガラス繊維フィルター（ＭＤ，ＵＳＡ）を通して濾過した。チューブを氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで３回洗浄した。３００ＳＬ液体シンチレーションカウンター（Ｌａｂｌｏｇｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ）を用いて、シンチレーションスペクトロメトリーにより、チューブ内の放射能をカウントした。全てのチューブについて、非特異（３０μＭイベルメクチンで処理した細胞）値を差し引くことにより、特異的結合を算出した。

［細胞生存アッセイ］
用いた細胞生存アッセイは、毒性スクリーニング向けのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）比色アッセイである。実験前日、コラーゲンコート９６ウェルプレート上に、４０，０００細胞／ウェルの濃度で細胞を播種した。細胞濃度は、Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌチャンバーにより測定した。環状Ｔ１４（０．１〜１００μＭ）ならびにＴ３０、Ｔ１４およびＡβ（１０μＭ）を単独で、または環状Ｔ１４（０．１および０．７μＭ）と組み合わせて含有するＭＥＭで試薬を調製した。処理後、培地を交換し、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）１００μｌを添加して４℃で１時間置くことにより、細胞を固定した。その後、細胞を水で洗浄し、０．０５７％ＳＲＢの１％酢酸（ＨＡｃ）溶液１００μｌを用いて、室温で３０分間染色した。染色後、過剰なＳＲＢを除去するために細胞を１％ＨＡｃで洗浄した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ塩基（ｐＨ１０．５）２００μｌでインキュベートして５分間振とうし、タンパク質に結合した染色剤を可溶化した。吸光度測定は、Ｖ_Ｍａｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）内で、４９０ｎｍで行った。

［アセチルコリンエステラーゼ活性アッセイ］
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性に起因するチオール基の存在を測定するＥｌｌｍａｎ試薬を用いて測定した。細胞生存アッセイのため、実験前日に細胞を播種した。細胞を、異なる濃度の環状Ｔ１４（０．１−１００μＭ）ならびにＴ３０、Ｔ１４およびＡβ １０μＭを単独で、または環状Ｔ１４（０．１および０．７μＭ）と組み合わせて処理した。処理後、各処理の上清（灌流液）を回収し、各条件につき２５μＬを新しい平底９６ウェルプレートに添加し、Ｅｌｌｍａｎ試薬（溶液Ａ：１３９ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４および７９．６６ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０；溶液Ｂ（基質）：１１．５ｍＭヨウ化アセチルチオコリン；溶液Ｃ（試薬）：８ｍＭ ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）および１５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）１７５μｌを添加した。３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比で３種類の溶液の混合物としてＥｌｌｍａｎ試薬を調製した。吸光度測定は、実験を通して通常の間隔（３、１０、３０および６０分）で、４０５ｎｍで測定した。

［カルシウム蛍光測定］
Ｆｌｕｏ−４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＫ）をロードした細胞内の蛍光変化を測定することにより、細胞内Ｃａ^２＋増加をモニターした。脳切片を、βアミロイド、環状Ｔ１４、またはβアミロイド＋環状Ｔ１４を含有する、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３．７ｍＭ ＫＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１．３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４および１０ｍＭグルコース；ｐＨ：７．１内で２時間インキュベートした。２時間後、下記を含有するロード培地１．２ｍｌ／ウェルとともに、切片を暗所下室温で４０分間インキュベートした：Ｔｙｒｏｄｅ塩溶液（ＴＳＳ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１２．０ ＮａＨＣＯ_３、５．５グルコース、ｐＨ７．４）、Ｆｌｕｏ−４（２μＭ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（０．０２％）およびプロベネシド（２ｍＭ）。プロベネシドは、マルチドラッグ耐性タンパク質の阻害剤、イオントランスポーターであり、細胞からの蛍光分子の排出を妨げる。インキュベーション後、切片をＴＳＳで洗浄し、１２００μｌ／ウェルのＴＳＳおよびプロベネシドを含有する脱エステル化培地を添加した。切片を２２℃の暗所下で２０分間インキュベートした。蛍光測定（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３８ｎｍ）は、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ，ＵＫ）プレートリーダー内で記録した。

［薬および試薬］
ＭＥＭ、培養血清、抗生物質、コラーゲン、スルホローダミンＢ、イベルメクチンおよびバッファー試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。Ｔ３０、Ｔ１４、ＡＣｈＥペプチドおよび環状Ｔ１４は、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）により合成された。ペプチドのストックは、蒸留水で希釈した。

［データ分析］
異なる技術のそれぞれにおいて、１２以上の実験の百分率値の平均によって統計分析を行った。多重処理群および同一コントロール間での比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＧｒａｐｈＰＡＤ Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰＡＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＴｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験により行った。これらの試験は、各処理の平均と各他処理の平均とを比較する；すなわち、全ての一対比較のセットに同時に適用し、２平均間の相違が標準誤差よりも大きいことが許容されうる場所を特定する。統計的有意性は、Ｐ値＜０．０５で取られた。グラフは、ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰＡＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてプロットした。結合実験の場合、結果は、１分あたりのカウント（ｃｐｍ）として得て、コントロールに対する割合に変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、結果を一部位競合結合（ｏｎｅ ｓｉｔｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）モデルにフィッティングした。カルシウムの結果の場合には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、非線形回帰曲線を用いた単一部位Ｈｉｌｌ式（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｉｔｅ Ｈｉｌｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ）に対する実験データポイントの対数をフィッティングすることにより、ＥＣ５０値を算出した。

〔実施例１〕Ｔ１４の環化
本発明者は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体のアロステリック部位を選択的に標的とし、Ｔ１４／Ｔ３０との結合に対して競合（ｃｏｍｐｅｔｅ）し、またβアミロイドに拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｅ）する物質を合成した。当該物質は、Ｃ末端のリジン残基に連結されるＮ末端のアラニン残基とともに、アミノ酸配列ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ［配列番号：４］を有するＴ１４の環形態である。Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒａｎｃｅ）は、直鎖状ペプチドをＮ末端へＣ末端ラクタムに変換することにより、環化を行った。以下の実験では、いかにして環状Ｔ１４ペプチドが確立されたＴ３０ペプチドおよびアミロイドのｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性効果を阻害するのかについて、初めて実証する。

〔実施例２〕環状Ｔ１４は単独で適用された際に毒性を有しない
細胞生存検出法としてスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を用いて、実施例１で製造した環状Ｔ１４でＰＣ１２細胞を１時間処理した。その結果、細胞生存において変化が観察されず、１００μＭ（１００ｎＭ：９８．７６±１５．１５；７００ｎＭ：１０６．９４±１９．９２；１μＭ：１０４．８２±１０．９；１００μＭ：９３．５８±１１．６２）の濃度では毒性を有しないことが示唆された（図１参照）。

〔実施例３〕環状Ｔ１４はＡＣｈＥ酵素活性に影響を及ぼさない
次に、本発明者は、環状Ｔ１４がアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の酵素活性に影響を及ぼすのか否かを確かめることにした。ＡＣｈＥ酵素活性は、アセチルコリンエステラーゼ活性アッセイを用いて測定した。本発明者は、環状Ｔ１４（２μＭ）が存在しても、アセチルコリンエステラーゼの酵素活性に影響を及ぼさないのに対し、ガランタミン（２μＭ）は強力に阻害することを発見した（図２参照）。

〔実施例４〕環状Ｔ１４は過酸化水素による非特異的毒性に効かない
次に、本発明者は、環状Ｔ１４が過酸化水素による非特異的毒性効果からＰＣ１２細胞を保護するのか否かを究明した。図３で見られるように、Ｈ_２Ｏ_２を単独または環状Ｔ１４と組み合わせて供した場合、顕著な差が見られなかった。

〔実施例５〕環状Ｔ１４は細胞をＴ１４、Ｔ３０およびβアミロイドの毒性から保護する
細胞生存検出法としてＳＲＢを用いて、（４Ａ）βアミロイド、（４Ｂ）直鎖状Ｔ１４、もしくは（４Ｃ）Ｔ３０を単独で、または環状Ｔ１４（１００ｎＭ）と組み合わせて用いて、ＰＣ１２細胞を１時間処理した。図４に示すように、３つのペプチド単独では、細胞生存率の減少をもたらしたが（Ａβ：６９．８７５±４．３８；Ｔ１４：８３．０２±５．３８５およびＴ３０：６８．３９５±３．０９５）、環状Ｔ１４と組み合わせた場合は、細胞が驚くほどに死から守られた（Ａβ＋Ｃ１４：９４．４７５±７．４；Ｔ１４＋Ｃ１４：９９．４±１２．４７５；Ｔ３０＋Ｃ１４：８８．５９±８．７８５）。

〔実施例６〕環状Ｔ１４はＴ１４およびＴ３０によって誘導されるＡＣｈＥの放出を阻害する
比色Ｅｌｌｍａｎアッセイを用いて、毒刺激後の代償的応答（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）としてのＡＣｈＥ活性を評価した。直鎖状Ｔ１４およびＴ３０（１０μＭ）を単独で、または環状Ｔ１４（１００μＭ）と組み合わせて用いて、細胞を１時間処理した（図５参照）。全てのペプチドは、ＡＣｈＥ活性の増加を誘導し（Ｔ３０：１２９．１０±１．１８；Ｔ１４：１２３．０±０．６２）、環状Ｔ１４と組み合わせた場合において部分的に阻害された（Ｔ３０＋Ｃ１４：１１０．５８±０．８０；Ｔ１４＋Ｃ１４：１１２．３０±１．３９）。

〔実施例７〕βアミロイド、Ｔ３０およびＴ１４は［３Ｈ］イベルメクチンの結合を置き換える
ここで用いられる準備のために、βアミロイド、Ｔ３０およびＴ１４にとって、α７ｎＡＣｈＥ（α７ニコチン性アセチルコリン受容体）が標的であることを実証するため。［^３Ｈ］イベルメクチン結合アッセイは、ＰＣ細胞膜上で行い、対数用量−応答によりリガンド［^３Ｈ］イベルメクチンが結合する受容体のアロステリック部位のアフィニティーの減少を実証した（表１、図６参照）。

〔実施例８〕環状Ｔ１４はガランタミンよりも優れた有効性で［３Ｈ］イベルメクチンの結合を置き換える
低μＭ濃度の環状Ｔ１４は、ガランタミンに類似したアフィニティーで、しかしそれよりも顕著に優れた有効性で、［^３Ｈ］イベルメクチンを置き換えた。

〔実施例９〕環状Ｔ１４はガランタミンよりも優れた有効性でβアミロイドの毒性から細胞を保護する
細胞生存検出法としてＳＲＢを用いて、βアミロイドを単独で、または環状Ｔ１４（１ｎＭ）もしくはガランタミン（１００ｎＭ）と組み合わせて用いて、ＰＣ１２細胞を１時間処理した。図８に示すように、環状Ｔ１４は、ガランタミン（９８．７９±１４．２１）に比べて、用量として２桁低いオーダーでＡβ毒性から保護した（９７．３４±９．５７）。

〔実施例１０〕βアミロイドからの１００％保護に必要な環状Ｔ１４の最低濃度
細胞生存検出法としてＳＲＢを用いて、βアミロイドを０．５ｎＭから１００ｎＭまで濃度を増加させた環状Ｔ１４と組み合わせて用いて、ＰＣ１２細胞を１時間処理した（０．５：８８．４９±１０；１：９７．３４±９．５７；１０：１０２．２８±８．５３；５０：１０１．７９±１３．９９；１００：１０３．６８±６．３４）。全保護のための閾値用量は１ｎＭであった（図９）。

〔実施例１１〕環状Ｔ１４はラット脳切片中のＣａ^２＋レベルを低減する
蛍光測定を用いて、１μＭ 環状Ｔ１４、１０μＭ βアミロイド、およびその組み合わせを用いて、２時間処理後のカルシウムレベル変化を検出した。環状Ｔ１４は細胞内カルシウム基準レベルを変化させなかったのに対し、βアミロイドは細胞内カルシウムレベルの増加を誘導し、これは環状Ｔ１４によってベースラインに戻されている（図１０参照）。

〔実施例１２〕Ｔ３０はα７ニコチン性受容体のアロステリック部位に対して高い結合アフィニティーを示す
生存試験を用いて、本発明者は、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位に対し、現在臨床使用されている薬（例えば、ガランタミン（１０μＭ））に比べ、Ｔ３０は約３桁高い結合アフィニティーを有することを示した（５ｎＭ）。

＜一般的考察＞
環状Ｔ１４は、Ｔ３０およびアミロイドベータペプチドの働きに拮抗するα７ニコチン性受容体の、新規のα７ニコチン性受容体不活性アロステリックモジュレーターである。環状Ｔ１４は、新規のα７ニコチン性受容体拮抗薬である。非特異剤である過酸化水素からの保護が無効力であったことから、環状Ｔ１４の阻害作用は選択的であり受容体媒介性であることが示唆される。環状Ｔ１４は、多様な試験においてＴ３０の毒性効果に拮抗することから、環状Ｔ１４は、アミロイドに対するのと同様に、Ｔ３０に対する結合と競合することにより、α７ニコチン性受容体上のアロステリック部位を通じたカルシウムのさらなる流入を防止することが示唆される。この有効な置換は、環状ペプチドの向上した安定性によって説明されるであろう。

［なぜ環状Ｔ１４系薬は現在用いられている処理に比べて有効なのであろうか？］
本発明者は、α７受容体上のアロステリック部位に対して、現在臨床で使用されている薬（例えば、ガランタミン（１０μＭ））に比べ、Ｔ３０が約３桁高い結合アフィニティー（５ｎＭ）を有することを直近で示している。実際、この観察から、なぜ上記のかような薬が比較的期待外れであるのか（表１参照；Ｋｒａｍｐ＆Ｈｅｒｒｌｉｎｇ，２０１１，Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓ ８，４４−９４）が示唆されるであろう：アルツハイマー患者の脳において過剰である内在性Ｔ３０が重要な部位を既に占有している場合、低アフィニティー競合によって置換されないであろう。しかしながら、ここで示唆されるように、非常に類似するまたは優れた結合アフィニティーを有する薬によって阻害されるであろう（図７参照）。ゆえに、そのような薬は、きわめて有効な薬である可能性を有する。

環状Ｔ１４のさらなる利点は、ガランタミンと異なり、ＡＣｈＥ阻害剤でもあり、受容体に結合する以外に、他の生物学的作用を有さないことである。発明者のこれまでの研究（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１３，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０３（３）：５４３−６）が示唆するように、神経変性疾患においてＴ３０がきわめて重要なシグナル分子である場合、その拮抗作用は、最も基本的かつ特異的なレベルでこれらの疾患を打ち負かす（ｃｏｍｂａｔ）であろう。いずれにせよ、正確な役割にかかわらず、アミロイドは神経変性疾患に関与するので、この新規物質がアミロイドと拮抗するという観察は、臨床において大変興味深いものであろう。他の治療的候補はβアミロイドの有効性（例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤）を標的とするのに対し、これは有効なアミロイド毒性遮断の初めての例である。

本発明者は、現在の結果から、環状Ｔ１４の形成によって、特定ターゲットであるα７ニコチン性受容体への結合が可能になると示唆されると考えている。図１２について、α７ニコチン性受容体の概略図を示す。単量体受容体は、同一のα７サブユニットを５つ有し、受容体が活性化した際、Ｎａ^＋やＣａ^２＋などのイオンが通過する中心孔の周囲にそれぞれ対称的に配置されている。各α７サブユニットは、オルソステリック結合部位（ｏｒｔｈｏｓｔｅｒｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）（すなわち、活性部位）およびアロステリック結合部位を含む。通常の受容体の生理学的活性化は、１つのアセチルコリン分子が２つのα７サブユニットの界面にこれらのオルソステリック部位を介して結合することによってなされる。他の公知のオルソステリック部位のリガンドとしては（これに制限されないが）コリンおよびメチルリカコチニン（Ｍｅｔｈｙｌｌｙｃａｃｏｎｉｔｉｎｅ）（ＭＬＡ）が含まれる。アロステリック部位のリガンドとしては（これに制限されないが）直鎖状および環状Ｔ１４、環状および直鎖状Ｔ３０、ガランタミン、イベルメクチンならびにＰＮＵ１２が含まれる。

図１０に示すように、この理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、βアミロイド（Ａβ）が（ｉ）α７ニコチン性受容体のオルソステリックおよびアロステリック結合部位の両方に同時に結合すること、または（ｉｉ）これらの部位のいずれか１つに非特異的に結合することのいずれかが可能であると考えている。本発明者は、環状Ｔ１４がアロステリック部位においてアンタゴニストとして作用することを発見した。

［創薬］
本発明者は、環状Ｔ１４の特定の構造を用いて、環状Ｔ１４の三次元形態を模倣しつつ、血液脳関門をより速やかに通過できるような、より小さな化合物を設計することが可能となるであろうと考えている。

〔実施例１３〕環状Ｔ１４（すなわち、「ＮＢＰ１４」と称する）の物理化学的特性分析
＜背景＞
水および有機溶媒における化合物の溶解性は、それが胃や腸などの体内の生理学的障壁を越える能力に強く影響を及ぼす。薬が脳疾患（例えば認知症）をターゲットとしている場合、さらなる障壁を越える必要があり、それが血液脳関門である。ＬｏｇＰとしても知られる分配係数は、化合物が水または有機溶媒中で可溶化する能力を評価し、化合物が異なる生理学的障壁を越える能力に関連する。

＜詳細な方法＞
［溶媒の調製］
下記のとおり、溶媒の飽和を行った。水存在下で１−オクタノールを室温で２４時間撹拌した。１−オクタノール存在下でｍＱ水を室温で２４時間撹拌した。その後、溶液を静置して、室温で一晩平衡化した。シリンジと針を用いて飽和溶媒を回収し、さらに使用時まで室温で保管した。

［撹拌チューブ法］
飽和水および飽和１−オクタノールをガラス管内に下記の比で置いた：各チューブは環状Ｔ１４を０．２５ｍｇ当量含有した。その後、全てのチューブを室温で４時間混合した。撹拌後、チューブを室温で静置して平衡化した。

［検量線］
検量線のための環状Ｔ１４の濃度は、０．５ｍｇ．ｍｌ^−１、０．２５ｍｇ．ｍｌ^−１、０．１３ｍｇ．ｍｌ^−１、０．０６６ｍｇ．ｍｌ^−１、０．０３３ｍｇ．ｍｌ^−１および０．０１６ｍｇ／ｍｌ^−１であった。検量線の吸光度を２８０ｎｍで測定した。

［サンプル分析］
各サンプルのいずれの分画についても、針付きのシリンジを用いて別個に回収した。２８０ｎｍで全分画の吸光度を測定し、検量線に基づいて全分画の濃度を算出した。下記式により、環状Ｔ１４の分配係数を計算した。

環状Ｔ１４のＬｏｇＰを得るために、各条件の結果を平均化した。

＜結果およびこれらの示唆＞
環状Ｔ１４の平均ＬｏｇＰは、−０．５８９９であった。ＬｏｇＰが負の値であることは、化合物が親水的であることを意味する。しかしながら、ＬｏｇＰが０に近いことは、化合物が親油性環境においても同様に可溶であることに対応する。ゆえに、ＮＢＰ１４がＢＢＢを越えることが説明できる。

〔実施例１４〕ＰＣ１２細胞におけるＴ３０および環状Ｔ１４（すなわち、ＮＢＰ１４）の効果
ＮＢＰ１４のＴ３０毒性に対するさらなる保護効果を特徴づけるため、本発明者は、下記の方法セクションで述べるように、３種類のｉｎ ｖｉｔｒｏ系（（Ａ）カルシウム流入；（Ｂ）ＡＣｈＥ放出；（Ｃ）細胞生存率）に効果をもたらす濃度を算出した。

＜方法＞
［（Ａ）カルシウム流入］
実験前日、９６ウェルプレートの成長培地２００μｌ中にＰＣ１２細胞を播種する。実験当日、（提供元のプロトコールのとおりに）Ｆｌｕｏ−８溶液（Ａｂｃａｍ）を調製する。次に、成長培地１００μｌを除去し、Ｆｌｕｏ−８溶液１００μｌを添加する。Ｔ３０およびＮＢＰ−１４を用いた処理を加え、インキュベーター内で３０分間および室温で３０分間インキュベートする。

１時間後、プレートを蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ）内に置く。蛍光を読み取る前に、１００μＭアセチルコリン（ＡＣｈ）を調製し、Ｆｌｕｏｓｔａｒインジェクター内に配する。各ウェルにつき、ベース蛍光によって読み取りを行い、ニコチン性受容体を介したカルシウムの増加を誘導するであろうアセチルコリンをインジェクトする。その後、Ｔ３０およびＮＢＰ−１４の効果を評価する。

［（Ｂ）ＡＣｈＥ放出］
ＡＣｈＥ活性の変化を検出するのに用いたプロトコールは、上記したものと同様である。

［（Ｃ）細胞生存率］
以前用いたＳＲＢ技術の改善として、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）を用いた。きわめて水に可溶なテトラゾリウム塩であるＷＳＴ−８を用いることにより、電子輸送体存在下での還元により、ＣＣＫ−８は水に可溶なホルマザン染料を産生する。ＷＳＴ−８は細胞内でデヒドロゲナーゼにより還元され、黄色を呈した生成物（ホルマザン）が生成し、これは組織培養培地に可溶である。細胞内でのデヒドロゲナーゼ活性によって産生されるホルマザン染料の量は、生存細胞数に直接的に比例する。実験前日、９６ウェルプレートの成長培地２００μｌにＰＣ１２細胞を播種する。Ｔ３０およびＮＢＰ−１４を用いた処理を加え、インキュベーター内で１時間インキュベートする。

次に、成長培地１００μｌを除去し、ＣＣＫ−８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８）溶液１０μｌを添加する。プレートをインキュベーター内で２時間インキュベートした後、吸光度プレートリーダー内に置く。吸光度は４５０ｎｍで測定しなければならない。

＜（Ａ）カルシウム流入＞
上記のように、Ｔ３０は、αニコチン性受容体の陽性アロステリックモジュレーターである。ゆえに、第一のアゴニストであるアセチルコリンを用いて、コントロールカルシウム流入を１００％とした基準に従って評価した。Ｔ３０（５μＭ）は、この効果を１７１．０５％±６．２１％；Ｎ＝３まで促進した。ＮＢＰ−１４濃度を増加させ（５、７、９、１０、２０、５０、７０、１０００、５０００ｎＭ）、これらＴ３０誘導型増加の拮抗作用を決定した。（各）値（％）は、１３４．２４９７±６．８５、１２０．８６１２±８．６５、１１３．９１６２±８．８２、１４０．７７６±１２．１６、１１５．８３±７．６７、１１０．３２１３±１３．２１、１２５．９５９６±０．１、９９．８５±０．３２、１１５．１９４２±９．８４、７９．９９±１４．０４である。図１３は、ＮＢＰ−１４が濃度に応じてＴ３０効果を阻害し、低ｎＭ範囲で保護的であることを示している。

＜（Ｂ）ＡＣｈＥ放出＞
上記のように、ＰＣ１２細胞は、「代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）」反応（すなわち、放出されるＡＣｈＥ活性の増加：１６９．４５％±２．１１％；Ｎ＝３）を伴って、Ｔ３０の毒性効果に応答する。本発明者は、５μＭ Ｔ３０に対するＮＢＰ−１４の用量依存的な効果を見つけた。本結果（図１４）は、高ｎＭ濃度でＮＢＰ−１４がＡＣｈＥの代償効果から保護することを示す。（各）値（％）は、１３０．７３±１．８４、１１１．６８±２．２６、９２．７８±０．９９、８２．５６±２．３８、６８．９０±０．９２、６５．１２±１．３２、６１．０４±０．９７、７９．４３±１．６９±１．２４、８３．９１±１．２４、８９．５５±１．２５である。

＜（Ｃ）細胞生存率＞
Ｔ３０（５μＭ）は、２５％の細胞生存率の減少（７４．３０９％±２．８７％；Ｎ＝３）をもたらし、ＮＢＰ−１４によって濃度−効果により次第に阻害された（図１５）。（各）値（％）は、７６．２５±７．５１、６７．０４±４．３５、７６．０４±４．２２、７１．３６±１．６４、７９．０２±１０．２２、７５．１±３．９、６２．４３±３．０１、７８．１０±２．１６、１１６．６５±３．６２、１０７．７９±５．１０である。ＮＢＰ−１４は、高ｎＭ範囲でＴ３０誘導型細胞死から保護する。

〔実施例１５〕ｉｎ ｖｉｔｒｏラット脳切片皮質ネットワークにおけるＴ３０および環状Ｔ１４（すなわちＮＢＰ−１４）の効果
＜背景＞
Ｔ３０ペプチドは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の３０アミノ酸セグメントであり、そこからＴ１４が切断される。両方とも同一の効果をもたらすことから、これらの活性配列はＴ１４に、および同様にＴ３０に存在することが示唆される。高度に調節的な物質としての哺乳類脳切片のＴ１４の生物活性は、既に研究で示されている。異なる濃度で、興奮および抑制の両方を含む皮質ネットワークを調節するＴ１４の効果が報告されている：低濃度では、ペプチドがα７受容体を介してカルシウム流入増加のトリガーとなるが、高濃度では、ニューロンの可塑性を誘発する（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）のと同様に、チャネルを不活性化させる過剰量のカルシウムをもたらし（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｏｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２００３）。

Ｔ１４／３０の全皮質ネットワークに対する作用についてさらなる理解を得るため、ミリ秒（ｍｓ、生理学的事象と同等である）およびマイクロメーター（μｍ）の一時的スケールで、脳切片における集合ニューロン集団活性（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、「ニューロンアセンブリ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）」のダイナミクスをモニターするために、比較的最近の技術である電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いた。かような技術は、電位が変化する蛍光コアを含有する特定の親油性分子の感受性（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００）を利用する。これらの親油性特性により、これらの色素分子は細胞膜内に埋め込まれ、ミリ秒解像度の高速カメラで捉えられる特定の膜を通じた電位について蛍光読み取りを変える。その結果、電位感受性色素を用いたイメージングは、比類なき時空解像度でニューロン細胞を通じた電位変化の直接およびオンラインでの読み出しを提供する。

この技術を用いて、本発明者は、（ａ）任意の領域における応答強度などの広範囲にわたるニューロン集団活性のデータを得ることができ、そこから（ｂ）誘発されるニューロンアセンブリの広がりが測定され、このパラメータから、広がりの勾配として（ｃ）開始点（ｄ）からの活性波面の伝播速度が測定される。これらの各パラメータは、これまで行われた、１）Ｔ３０の増加した濃度（０．５、０．７５、１および５μＭ）によって誘導される皮質ネットワーク活性および応答に対する効果の研究、ならびに２）単一で比較的高（１μＭ）Ｔ３０濃度に対するＮＢＰ−１４の拮抗効果の評価の２つの実験について独立して測定される。

・使用技術：視床皮質（ＴＣ）ｐｃ１４ラット（Ｗｉｓｔａｒ）脳切片の電位感受性色素イメージング（Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ）
・刺激パラダイム：（視床皮質の反復刺激に一致する）４０Ｈｚ二連（ｐａｉｒｅｄ）パルス刺激
・灌流パラダイム：２段階で実行された時期（ｅｐｏｃｈ）−各薬剤灌流（コントロール、０．１μＭ Ｔ３０などという）につき、新しい灌流を行い、薬剤が実際の濃度に到達するまでの時間があるよう、記録期間（同様に１５分間）前に１５分間灌流させ、濃度依存的な効果を誘導して一旦記録した。一つの灌流時期を３０分続行し、各灌流時期について最後１５分間のみを考慮して読み取った。

＜詳細な方法＞
［脳切片の調製］
雄のウィスターラット（１４〜１７日齢；全１５個体）を、イソフルランで麻酔した：１００％ｗ／ｗイソフルラン１０ｍＬを、麻酔チャンバー（ガラスボックス２０×１５×１５ｃｍ）底部のコットンベッドに注ぎ、ラットを麻酔効果が発現するまで４５秒以下置いた。各麻酔ラットの後足をつまみ、適切な麻酔深度であるか確認した。一度麻酔が確認されたら、速やかにラットの首をはね、脳を酸素化した氷冷人工脳脊髄液（「切片化する（ｓｌｉｃｉｎｇ）」ａＣＳＦ ｍｍｏｌ換算：１２０ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、２０ ＮａＨＣＯ_３、２．４ ＣａＣｌ_２、２ ＭｇＳＯ_４、１．２ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０ グルコース、６．７ ＨＥＰＥＳ塩および３．３ ＨＥＰＥＳ酸；ｐＨ：７．１）に７〜８時間浸漬し、脳を切片化する時間を設けた。Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ）を用いて、視床（ＶＰＮ）および第一体性感覚皮質（バレル領域）を含む脳のブロックから傍矢状の切片（４００μｍ厚さ）を切り出し、室温でａＣＳＦを含有するバブラーポット（ｂｕｂｂｌｅｒ ｐｏｔ）に移し（「記録する（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）」ａＣＳＦ ｍｍｏｌ換算：１２４ ＮａＣｌ、３．７ ＫＣｌ、２６ ＮａＨＣＯ_３、２ ＣａＣｌ_２、１．３ ＭｇＳＯ_４、１．３ ＫＨ_２ＰＯ_４および１０ グルコース；ｐＨ：７．１）、これは電気生理学記録およびＶＳＤＩで用いたものと同一であった。切片を酸素化（９５％Ｏ_２−５％ＣＯ_２）「記録（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）」ａＣＳＦに置き、ＶＳＤ染色前に最低１時間再灌流した。

［ＶＳＤセットアップ］
切片を暗所の９５％Ｏ_２−５％ＣＯ_２でバブリングしたａＣＳＦで満たした高湿度チャンバー内に置いた。色素溶液（４％ ０．２ｍＭ スチリル色素ピリジニウム４−［２−［６−（ジブチルアミノ）−２−ナフタレニル］−エチニル］−１−（３−スルホプロピル）ヒドロキシド（Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００）の４６％ａＣＳＦ溶液、ウシ胎児血清４６％、ＤＭＳＯ３．５％およびクレモフォール（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）ＥＬ０．４％）を上記の切片に注いだ（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＶＳＤ記録開始に際し、切片を小さな濾紙上に記録浴内に置き、切片が生存するように保ち、切片の上に置かれた家庭用のプラスチック枠を用いて大まかに秤量した。蛍光ＶＳＤであるため、光毒性および漂白の有害な影響を最小限に保つため、Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ染色中および染色後における全て切片の取り扱いは、ほぼ完全な暗所で行った。（刺激電極が置かれる）ＶＰＮを、海馬の先端から内包の側面までの距離について特定した。

（１０００Ｈｚで測定される）インピーダンス：５００ｋΩを有する刺激電極をＶＰＮ内に置き、Ｓｐｉｋｅ ２ Ｖ６．０（ＣＥＤ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて、４０Ｈｚの二連パルス（ｐａｉｒｅｄ−ｐｕｌｓｅ）刺激（持続時間２×１００μｓ；刺激間インターバル−ＩＳＩ−二連パルス ２５ミリ秒）を誘発し、適切なＩＳＩに対して神経支配されるバレル内の急速な活性伝播波を惹起した。デジタルカメラ（Ｂｒａｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ＭｉＣＡＭ Ｕｌｔｉｍａ Ｒ３−Ｖ２０ Ｍａｓｔｅｒ）に連結したＭｉＣＡＭ Ｕｌｔｉｍａ超高速イメージングシステムと、Ｕｌｔｉｍａ ２００４／０８イメージングソフトウェア（Ｂｒａｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ）とを用いて、１ｍｓの解像度で１６ビット画像を取得することにより、かような一時的な「ニューロンアセンブリ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）」を記録した。Ｏｓｒａｍハロゲンキセノフォット（ｘｅｎｏｐｈｏｔ）６４６３４ ＨＬＸ ＥＦＲ Ｄｉｓｐｌａｙ／Ｏｐｔｉｃランプを用いて光を生成し、ＭＨＦ−Ｇ１５０ＬＲ （Ｍｏｒｉｔｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、フィルターをかけて緑色光（５３０±１０ｎｍ）を発光した。発光蛍光を、前述したように（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ；Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ；Ｇｒａｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ダイクロイックミラーおよび＞５９０ｎｍハイパスフィルターに通した。

［薬剤の調製および塗布］
Ｔ３０溶液およびＮＢＰ−１４溶液は、各実験開始時に新鮮なように調製し、小分けのストック溶液を「記録（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）」ａＣＳＦに適量添加し、Ｍｉｎｉｐｕｌｓｅ ３ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ，Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて毎分１．５ｍＬの定速での灌流に適用した。灌流条件は２つに分けた：前半は記録しない１５分間灌流で構成され、適切な濃度に達した後、後半の灌流条件を開始し、ここでは次の１５分間の灌流について記録をとり（平均３０スナップショット）、灌流条件あたり全部で３０分間とした。

［データ分析および統計］
ＶＳＤＩが製造した４×４ｍｍ（１００×１００ピクセル）二次元画像から、全体的な誘発シグナルである、活性化タイムコース、広がりおよび強度などの重要なデータを抽出した。各ＶＳＤＩ実験について、ピーク応答を包含する、刺激後０〜２００ｍｓの間の各スナップショットデータは、各条件（Ｔ３０およびＴ３０対ＮＢＰ−１４実験の両方とも、１条件につき全部で３０スナップショットである）に対して、測定および平均化されたこれらのパラメータを有する。これを達成するため、活性領域から対象領域（ＲＯＩ）を選択し、対象領域内で記録された最大活性の２０％より高い活性を示すものとして、アクティブピクセルを隔離する閾値でフィルターした後の最大応答幅を取り囲んだ。その後、かようなデータを蓄積して、記録された効果を測定するための定性的な「時空」マップ（図１９）とともに、活性化強度範囲の詳細な定量的グラフ（図１６、１７、１８）を作成し、同様に、得られた時空データの正確な視覚表示を作成した。全てのデータの取り扱いおよび分析はＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ ８（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）を用いて行い、全ての統計データ（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ−ＡＮＯＶＡ）は、Ｒ Ｓｔｕｄｉｏを用いたデータに適合する非線形複合効果モデル（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｍｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｏｄｅｌｓ）を用いて行った。全ての統計試験について、Ｐ＜０．０５は有意であるとみなした。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表す。

＜結果および考察＞
図１６は、（Ａ）発光蛍光強度、および（Ｂ）アクティブピクセルの広がりに対するＴ３０の用量増加効果を示す。各ピクセルは、４０×４０μｍの寸法を有し、１０未満の別個のニューロンの活性に起因する特異的な蛍光を意味する。記録浴内のＴ３０濃度が増加することで、アクティブピクセルから発する蛍光強度が減少する。これは、単一ピクセル量からより高い蛍光読み取りに至る相当な同時に起きるニューロン膜の非局在として、誘起されるニューロン集団活性の非同期を示唆しており、ここでは反対の効果が見られている（より低い同調性）。さらに、強度グラフ（図１６Ａ）からわかるように、ここでは４０Ｈｚ二連パルス刺激パラダイムが用いられる。当該結果より、Ｔ３０処理に起因して全体的な蛍光が減少するだけでなく、（４０Ｈｚ二連パルスで、７５ｍｓ（第１パルスの２５ｍｓ後）に誘起される）第２パルスは最初のパルスの規模に比べて促進が大幅に減少することもわかる。

さらに、広がりグラフ（図１６Ｂ）で見られるように、皮質アセンブリの広がりは、きわめて高レベル（５μＭ）に達するまではＴ３０処理によって顕著に影響されず、これは皮質ネットワーク全体に対してＴ３０が調節剤として作用するとの理論を裏付ける。伝播速度、蛍光の広がりや強度など、ＶＳＤＩによって強調される異なるパラメータが、必ずしも関連しない皮質ダイナミクスの根本原理にたびたび依存し、これらのパラメータは別々に分析しなければならないこと、ならびに、これらの結果はまず互いに独立に解釈しなければならないことついて、留意しておくことも重要である。

図１７は、アセンブリダイナミクスの開始に対する増加するＴ３０適用の効果を示し、伝播を詳細に調べた。図１７より、Ｔ３０はニューロン活性伝播速度（ここでは上昇期の傾きとして得られる）の減少をもたらし、図１６で見られるような皮質ネットワークの協調性の低下と一致し、５μＭ Ｔ３０処理下では伝播速度が最大３．５倍減少した。以上の結果および以前の実験から、５μＭ Ｔ３０濃度は、十分なカルシウム流入をもたらすには高すぎるため、イオンチャネルの非活性化における閾値となりえず、ゆえに、以前報告されたように（Ｂｏｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２００３）、特定の調剤（ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の感受性に依存する興奮／抑制効果の複合をもたらすものと結論づけられた。ゆえに、本発明者は、より低い、しかし十分に可能性のある濃度である１μＭ Ｔ３０を用いて以降の実験を行い、ＮＢＰ１４の可能な拮抗効果を調査した。このＴ３０濃度は、依然として高いが、ペプチドが脳切片に浸透する際に希釈効果が必然的に起こると考えられる本研究の特性から選択した。ちなみに、ＮＰＢ１４については、これまでのＰＣ１２細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究において、Ｔ３０に比べてα７ニコチン性アセチルコリン受容体に対して高アフィニティーであることが示唆されたため、０．１、５、１００および３００ｎＭ、すなわち、Ｔ３０濃度より２〜４桁低い濃度で増加させて用いた。

図１８は、ＮＢＰ−１４濃度増加によるＴ３０効果の拮抗作用を示す。図は、Ｔ３０灌流によってもたらされるニューロン集団の調節効果に対するＮＢＰ−１４の拮抗特性を示す。考慮すべき重要なこととしては、Ｔ３０が切片に浸透する際の希釈因子であり、切片は、プロテアーゼ、神経伝達物質の取り込みや細胞外マトリックスの密度など、脳切片中に潜在的に依然存在しかつ活性である全ての生理学的プロセスを含む；ゆえに、濃度１μＭのＴ３０は十分な効果をもたらすのに時間を要する可能性が高い（上記のデータから４５−６０分と示唆される）。これを念頭に置き、Ｔ３０によってもたらされた傾向はベースラインに向かって逆行した（青色線／バー）後、５ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流中のＴ３０の効果は顕著となる（橙色線／バー）。

ＮＢＰ−１４が非活性であり、自身に対していかなる調節効果も誘起しないことを示すことについても留意することが重要であり、ここで見られる効果は第一にＴ３０に起因し、ＮＢＰ−１４濃度の増加による拮抗作用に対するこれらの反転であることを示唆する。重要なことに、３００ｎＭ ＮＢＰ−１４灌流下では、Ｔ１４効果の大部分はコントロールレベルに向かって減少する一方、濃度１０００ｎＭにおいてもＴ３０は灌流される。このことから、Ｔ３０に比べ、ＮＢＰのターゲットに対するアフィニティーが顕著に高いことが示唆される。

図１９は、ＮＢＰ−１４の濃度増加（０．１、５、１００および３００ｎＭ）に対するＴ３０（１μＭ）効果を試験した３つの実験（すなわち、左、中央、右カラム）からの定性結果を示す。上のパネルは、２つの主要な平均化データグラフを示す：左−蛍光シグナル強度、右−誘起されるアセンブリの広がり。下のパネルは、各条件について、時間（全部で３１０ｍｓ、ｘ軸）に対して、対象領域に横たわる一列のピクセルの活性（ｙ軸）をマッピングした「時空」マップである。Ｔ３０およびＮＢＰ−１４を共灌流（ｃｏ−ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）した結果、強度グラフ上で蛍光強度の劇的な減少が明らかに表れる。注：時空マップは、それぞれの灌流（左）を標識化し、強度（右）および広がり（左）のグラフの両方において対応する軌跡を色分けした。

＜参考文献＞
Ｂａｄｉｎ，Ａ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｒａｉｆｅｊ， ａｎｄ Ｓ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２０１３．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット眼窩前頭皮質の光学イメージングによって明らかにされた新規ペプチドの高分解能時空生物活性：神経変性疾患のための可能な含意．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．７３Ｃ：１０−１８．
Ｂｏｎ， Ｃ．Ｌ．， ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２００３．アセチルコリンエステラーゼ由来ペプチドの生物活性：モルモット海馬における電気生理学的特性評価．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：１９９１−１９９５．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．Ｆ．，Ｅ．Ｏ．Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｒ．Ｈｉｌｌ，Ｅ．Ｊ．Ｄｏｍｍｅｔｔ， ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２００７．ニューロンアセンブリのダイナミクスは麻酔ではなく鎮痛薬によって調節される．Ｅｕｒ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．２４：６０９−６１４．
Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ，Ｉ．Ｍ．，Ｅ．Ｊ．Ｄｏｍｍｅｔｔ，Ｔ．Ｈ．Ｇｒａｎｄｙ，Ａ．Ｃ．Ｈａｌｌｉｄａｙ， ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２０１０ａ．同時電気生理学的記録およびｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングによって明らかにされるように、環境的な充実はラットバレル皮質における感覚誘発活動の特定の構成要素を分化的に修飾する．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．１７０：６６２−６６９．
Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ，Ｉ．Ｍ．，Ｔ．Ｈ．Ｇｒａｎｄｙ，Ｅ．Ｊ．Ｄｏｍｍｅｔｔ， ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２０１０ｂ．複合光学イメージングおよび電気生理学によって明らかにされたラットバレル皮質における感覚処理に対するウレタン麻酔の影響．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２：７８６−７９７．
Ｇｒａｎｄｙ，Ｔ．Ｈ．，Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， ａｎｄ Ｉ．Ｍ．Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ．２０１２．ｉｎ ｖｉｖｏでの電位感受性色素の評価：脳脈動アーチファクトを効果的に除去した後の薬理学的副作用とシグナルノイズ比．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１０８：２９３１−２９４５．
Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ａ．，Ｔ．Ｄａｙ，Ｅ．Ｏ．Ｍａｎｎ， ａｎｄ Ｉ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ．２００４．新規ペプチドはアルファ７ニコチン性受容体の応答を調節する：脳における可能な栄養毒性のメカニズムの含意．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９０：３２５−３３１．
Ｍａｎｎ，Ｅ．Ｏ．，Ｔ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｍ．Ｉｃｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．２００５．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの海馬活動の時空間パターンのコリン作動性変調．４８：１１８−１３３．
Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔ．，Ｙ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｈ．Ｙａｍａｄａ，Ｇ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， ａｎｄ Ｍ．Ｉｃｈｉｋａｗａ．２０００．Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ染色ラット海馬切片の神経活動における電気生理学的シグナルおよび光シグナルの定量化．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．１０２：１１−２３．。

〔実施例１６〕自由に動けるラットにおけるＮＢＰ１４の効果
＜背景＞
アルツハイマー病患者の動物モデルとは異なり、一部のパーキンソン病のラットは十分に確立されており、容易に定量化できる。したがって、片側の線条体内にＴ３０注射を投与し、毒の行動的影響を観察した。以降の実験では、注入側のＤＡニューロン喪失を誘発し、反対側のＤＡニューロンには作用しない公知の神経毒である６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）に対するＮＢＰ１４の潜在的な保護効果を観察した。埋め込んだカニューレを介して内側前脳束（ＭＦＢ）にＮＢＰ−１４を投与した。６−ヒドロキシドーパミンは、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。

＜詳細な方法＞
ケタミン（１０％：０．１ｍｌ／ｋｇ体重）およびキシラジン（２％；０．０１ｍｌ／ｋｇ）で動物を麻酔した。その後、２０ｍｇ／ｍｌ ６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸溶液）２μＬを動物のＭＦＢに定位的に注射した。病変座標は、前頂（ｂｒｅｇｍａ）および硬膜（ｄｕｒａ）についてｃｍ単位で設定される：Ｌ−１．７ｍｍ；ＡＰ−３．６ｍｍ；ＤＶ−８．０ｍｍ。注射（注射速度２μｌ／５ｍｉｎ）後、１分間注射針を残して逆流を回避した後、ゆっくりと引っ込めた。

肢配置試験（シリンダーテスト）：この試験では、シリンダー状の囲いの壁に対して体を支持するラットの各前肢の使用を評価する。当該試験は、後肢で立って囲いの壁に向かってもたれることにより新たな環境を探索するという、動物固有の動きの利点を利用したものである。この試験を行うため、ラットを個別にガラスシリンダー（直径２１ｃｍ、高さ３４ｃｍ）内に置き、壁探索を３分間記録した。記録に先立ち、シリンダーへの習慣作用は許容されない。壁探索は、無傷の肢（Ｒ）および損傷した肢（Ｌ）の比で表れ、損傷した左＋両前肢の値で除した無傷の右＋両前肢の値（Ｒ／Ｌ）として計算される。肢配置試験は、ベースラインを得るために１日目に、選択のために１日目に、および２日目に行った。

選択基準（１日目）：肢配置試験について、この研究では、統計的に肢間で顕著な差が見られる全動物が含まれる（無傷の肢（Ｒ）および損傷した肢（Ｌ）の比は、損傷した左＋両前肢の値で除した無傷の右＋両前肢の値（Ｒ／Ｌ）として表される。）
全試験の結果は、平均（ＭＥＡＮ）群値±ＳＥＭとして表されるであろう。一元ＡＮＯＶＡによるデータの分析およびＴｕｋｅｙ試験により、処理効果の有意性を調べた。この研究は、実験動物の取扱いおよび使用における倫理的行動委員会に対して、本研究が規則および規制を遵守することを掲げる申請書を提出して承認を得た上で行った。

図２０は、ＮＢＰ−１４のｉｎ ｖｉｖｏ試験中に準拠される手順を要約している。

＜結果＞
［ＮＢＰ１４効果］
肢配置試験のＲ／Ｌ比の分析は、運動機能の片側のみの損傷を反映する。２日目（すなわち、６−ＯＨＤＡ注射から２日後かつＮＢＰ−１４注射から１日後）、６−ＯＨＤＡ賦形剤で処理したときとの間で、肢配置のＲ／Ｌ比に顕著な差があった：それぞれ、７．５４±１．６３対３．６２±０．５５（ｐ＜０．０５）。肢配置試験で見られたように、ＮＢＰ−１４で処理した場合、１回用量後に損傷した前肢の運動性が改善した（図２１）。

〔実施例１７〕ＡＰＰおよびアミロイドに対するＴ３０およびＮＢＰ１４の効果
＜背景＞
過剰なカルシウムが、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の異常な切断、ゆえにアミロイドベータ（Ａβ）の放出を引き起こすことについては、既に確立されている（Ｈａｒｔｉｇａｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９９；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本発明者は、Ｔ３０がＰＣ１２細胞内でカルシウム流入を約７０％増加させることを示しており、かようなカルシウムの増加は、アミロイドの産生および全長ＡＰＰ分子の結果的な減少を引き起こす可能性がある。

＜詳細な方法論：ＡＰＰの検出＞
［タンパク質可溶化プロトコール］
ＰＣ１２膜内でＡＰＰを検出するのに十分なタンパク質を得るため、ペトリ皿にＰＣ１２細胞を成長培地とともに１週間置き、タンパク質を可溶化する前に、Ｔ３０およびＮＢＰ−１４で１時間処理した。細胞が９０％コンフルエンスに達するまで成長させ、成長培地を除去し、ＨＢＳＳ２ｍｌで再懸濁した。細胞懸濁液を１５ｍｌチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。その後、上清を捨て、プロテアーゼインヒビター（１μｌ：１ｍｌ ＰＭＳＦおよび３μｌ：１ｍｌ アプロチニン）を加えたＬｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８）にペレットを再懸濁し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎを用いて１０秒間粉砕した。次に、粉砕したペレットを１．５ｍｌエッペンドルフに分け、４℃で２時間回転または撹拌した。２時間後、エッペンドルフを１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を取った。Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を用いて、各エッペンドルフに含まれるタンパク質を定量した。

［電気泳動プロトコール］
ＡＰＰ検出のため、約２５μｇのタンパク質を用いた。プロトコールを開始する前に、試薬を以下のとおり調製した：
下部ゲル（１０％）（重合２０分）
１０ｍｌ（２ゲル）：３．６ｍｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ、２．４２ｍｌ アクリルアミドおよび１．３ｍｌ ビスアクリルアミド、２．５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １．５Ｍ ｐＨ８．８、０．１１ｍｌ ＳＤＳ １０％、０．０６ｍｌ 過硫酸アンモニウム １０％、６．６７μｌ ＴＥＭＥＤ（最終構成要素）
上部ゲル（５％）（重合２０分）
５ｍｌ（２ゲル）：３．６７ｍｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ、０．４８ｍｌ アクリルアミドおよび０．２６ｍｌ ビスアクリルアミド、０．６２５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ｈＣｌ １Ｍ ｐＨ６．８、０．０５ｍｌ ＳＤＳ １０％、２５μｌ 過硫酸アンモニウム １０％、５μｌ ＴＥＭＥＤ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １．５Ｍ ｐＨ８．８
１００ｍｌ：１８．１６ｇｒ Ｔｒｉｓ塩基、ｑｓｐ １００ｍｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ、ｐＨ８．８
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ６．８
１００ｍｌ：１２．１ｇｒ Ｔｒｉｓ塩基、ｑｓｐ １００ｍｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ、ｐＨ６．８
サンプルバッファー（４Ｘ）
８ｍｌ：３．２ｍｌ ＳＤＳ １０％、１．６ｍｌ グリセロール、２ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ６．８、０．８ｍｌ Ｂ−メルカプトエタノール、０．４ｍｌ ブロモフェノールブルー ０．１％またはレッド（実験には１Ｘを使用）
ランニングバッファー（１０Ｘ）
１Ｌ：３０．３ｇ Ｔｒｉｓ塩基、１４４ｇｒ グリシン、１０ｇｒ ＳＤＳ、ｑｓｐ １Ｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ（実験には１Ｘを使用）。

電気泳動のステップは以下のとおりである：
ａ）下部および上部アクリルアミドゲルを調製する。ＡＰＰゲルの％は、１０％下部ゲルおよび５％スタッキングゲルである。

ｂ）（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで算出した）２５μｇの濃度でサンプル２４μｌを調製し（β−メルカプトエタノール＋タンパク質＋ｌｉｓｉｓ含有６μｌ ＳＢ ４Ｘ）、１００℃で５分間加熱して変性させる。

ｃ）タンパク質マーカーおよびサンプルをゲルのウェルに入れる（２０−３０μＬ）。

ｄ）泳動を実行する：３５ｍＡ（約１時間）。

［ウェスタンブロットプロトコール］
プロトコールを開始する前に、試薬を以下のとおり調製する：
転写バッファー（１Ｘ）
１Ｌ：３．０３ｇ Ｔｒｉｓ塩基、１４．４ｇｒ グリシン、２００ｍｌ メタノール、ｑｓｐ １Ｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ
ＴＢＳバッファー（４Ｘ）
１Ｌ：２４．２５ｇｒ Ｔｒｉｓ塩基、６０ｇｒ ＮａＣｌ、ｑｓｐ １Ｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ、ｐＨ７．５
ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー
１Ｌ：２５０ｍｌ ＴＢＳ ４Ｘ、０．５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ２０、ｑｓｐ １Ｌ Ｈ_２Ｏ ＭＱ。

電気的転写およびタンパク質の免疫検出の２つの段階があり、以下の段階を参照する：
１）電気的転写
ａ）ＰＶＤＦメンブレンを活性化する：ＭｅＯＨ中で１分間、ＭＱ Ｈ_２Ｏ中で２分間
ｂ）ＰＶＤＦメンブレン、紙、スポンジを転写バッファーに１０分間つける
ｃ）サンドイッチを作製し、ゲルからＰＤＶＦメンブレンへのタンパク質の転写を実行する：０．２Ａで２時間。

２）タンパク質の免疫検出
ａ）メンブレンの非特異部位を（ＴＢＳ−Ｔに溶解した）５％ミルクでブロックする
ｂ）１：５００希釈（２０μｌ：１０ｍｌ）の（ＴＢＳＴ／ミルク５％に溶解した）一次抗体：抗アミロイド前駆タンパク質（ａｂ２０７２、ウサギ）とともに、４℃で一晩インキュベーション
ｃ）ＴＢＳ−Ｔでメンブレンを洗浄する（５分×２）
ｄ）１：５０００希釈（２０μｌ：１０ｍｌ）の（ＴＢＳ−Ｔに溶解した）二次抗体：抗ウサギＨＲＰ（ヤギ）とともに、室温で４５分間インキュベーション
ｅ）ＴＢＳ−Ｔでメンブレンを洗浄する（５分×２＋１０分×１）
ｆ）Ｃｈｅｍｉｂｏｘオプション（白色光）を用いて写真を撮影し、マーカーバンドの位置を参照する
ｇ）抗体検出のためＥＣＬ試薬（ＨＲＰ）を添加し（各コンポーネントにつき１ｍｌ）、Ｃｈｅｍｉｂｏｘオプション（光無し）を用いて数枚撮影する。

＜詳細な方法論：細胞培養培地におけるＡβ_４２の検出＞
処理１時間後、培養培地を回収し、培養培地を希釈剤として用いて１：１００に希釈した。その後、４連の各希釈サンプルを、ＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥＬＩＳＡ検出キットで提供されるプレート内に置いた。その後、製造元のプロトコールに従って検出を行った。簡潔には、検出抗体５０μｌ存在下でサンプルを４時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄溶液で７回洗浄し、キットで提供されている３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに１５分間インキュベートした。サンプルを呈示した後、停止溶液で反応を停止し、４５０ｎｍにおける光学濃度を読み取った。

図２２は、細胞内でのＴ３０の効果に起因する一連の事象の概略図を示す：（１）Ｔ３０が受容体のアロステリック部位に結合して、チャネルの開口を促進し、細胞内にＣａ^２＋が流入する（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．２００４）。（２）カルシウムの流入は、非局在および電位依存的な（Ｌ−ＶＯＣＣ）チャネルの開口をもたらし、より多くのＣａ^２＋を細胞内に流入させる（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。（３）これにより、細胞内のカルシウムはＴ３０を含むＡＣｈＥ Ｇ４の放出増加を誘発する（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１３）。（４）また、カルシウムは、Ｔ３０に対するより多くの標的を提供することにより、より多くのＣａ^２＋を細胞内へ流入させるであろうα７ニコチン性受容体の上方制御を誘起する（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００９）。（５）カルシウムは、（ａ）タウ（Ｔａｕ）を増加させ、（ｂ）細胞外の毒性を有するアミロイドの切断を引き起こすγ−セクレターゼ／β−セクレターゼを活性化する酵素（すなわちＧＳＫ−３）を活性化し、（ｃ）Ｔ３０は毒性量のＣａ^２＋の細胞内への流入をさらに促進する（Ｈａｒｔｉｇａｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９９），Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｔｅｓ ｅｔ ａｌ（２０１３））。

したがって、免疫検出を用いて、本発明者は、Ｔ３０（５μＭ）およびＮＢＰ１４（０．５μＭ）の投与による（ｉ）ＡＰＰレベルおよび（ｉｉ）アミロイドの放出を発見した。

＜結果＞
（ｉ）図２３に示すように、Ｔ３０はＰＣ１２細胞膜における全長ＡＰＰのレベルを減少させ、これはＮＢＰ１４によって反転する効果であった。値は、コントロール（１００％±１０．９８）；Ｔ３０ ５μＭ（６７．８２％±６．２３％）およびＴ３０＋ＮＢＰ−１４ ０．５μＭ（１２６％±１．１２％）である。

図２４は、グラフで表されるウェスタンブロットによる免疫検出を示す。３種類の異なる処理は、ＡＰＰの異なる発現レベル（図２４に表される値）を示す。各条件につき、タンパク質はＧＡＰＤＨレベルで補正されている。

ＡＰＰの産生はＴ３０ペプチドによって減少し、これはＮＢＰ−１４によって反転される効果である。このことから、ＡＰＰは切断され、アミロイドβ１−４２ペプチド（Ａβ_４２）を放出することが示唆される。

（ｉｉ）Ａβ_４２の放出を決定するため、我々は市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、溶液中に存在するＡβ４２を測定した。この試験では、Ｔ３０はＡβ４２の放出をコントロールに比べて約１７５％まで増加させ、ＮＢＰ−１４はＡβ_４２の放出をコントロールに近い値にもたらすことが示された（図２５参照）。

Claims (31)

1. 治療または診断における使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
2. 神経変性疾患の治療、改善または予防における使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
3. 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン疾患；脊髄小脳１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ならびに前頭側頭型認知症からなる群より選択され、好ましくはアルツハイマー病である、請求項２に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
4. アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
5. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、α７ニコチン性受容体の選択的アロステリックモジュレーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
6. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位を通じたカルシウムのさらなる流入を防止する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
7. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、βアミロイドの結合をアウトコンピート（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
8. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、単離または精製されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
9. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、末端付加（ｔａｉｌｅｄ）アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の環状ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体。
10. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の３００、２００、１００または５０アミノ酸に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
11. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端を形成する最後の４０アミノ酸に由来するアミノ酸配列、またはそのトランケーションを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
12. 前記アセチルコリンエステラーゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を実質的に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
13. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、８〜４０アミノ酸残基、または１０〜３０アミノ酸、または１２〜２０アミノ酸を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
14. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状の配列番号３、４、５もしくは６、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
15. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状の配列番号６、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含み、この際、ｘ_１は塩基性アミノ酸残基、好ましくはヒスチジン（Ｈ）であり；ｘ_２は塩基性アミノ酸残基、好ましくはアルギニン（Ｒ）であり；ｘ_３は芳香族アミノ酸残基、好ましくはトリプトファン（Ｗ）であり；ｘ_４は脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはセリン（Ｓ）であり；およびｘ_５はトリプトファン（Ｗ）またはメチオニン（Ｍ）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
16. 前記環状ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状の配列番号４、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
17. 環状ポリペプチド、その誘導体または類似体を含む、受容体アロステリックモジュレーター。
18. 受容体アロステリックモジュレーターとしての使用のための、環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
19. 前記環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体または受容体は、請求項１〜１６のいずれか１項で定義される、請求項１７に記載の受容体アロステリックモジュレーター、または請求項１８に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
20. 治療または診断における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または請求項１７に記載の受容体アロステリックモジュレーター。
21. 神経変性疾患の治療、改善または予防における使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または請求項１７に記載の受容体アロステリックモジュレーター拮抗薬。
22. 治療される前記神経変性疾患は、「グローバル（Ｇｌｏｂａｌ）」ニューロンの損傷または死を特徴とする、請求項２１に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
23. 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン疾患；脊髄小脳１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ならびに前頭側頭型認知症からなる群より選択される、請求項２１または２２に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
24. 治療される前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、または運動ニューロン疾患である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
25. 治療される前記神経変性疾患は、アルツハイマー病である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体。
26. 前記ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状の配列番号４、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または受容体アロステリックモジュレーター。
27. 治療上有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または請求項１７に記載の受容体アロステリックモジュレーターと、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤と、を含む薬剤組成物。
28. 治療上有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体もしくは類似体、または請求項１７に記載の受容体アロステリックモジュレーターと、薬学的に許容される賦形剤と、を組み合わせることを含む、請求項２７に記載の薬剤組成物の製造方法。
29. 前記ポリペプチド、その誘導体または類似体は、環状の配列番号４、またはその機能性変異体もしくはフラグメントを含む、請求項２７に記載の組成物または請求項２８に記載の方法。
30. α７ニコチン性受容体を探索するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの分析法における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の環状ポリペプチド、その誘導体または類似体の使用方法。
31. 前記方法は、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位を調査することを含み、必要に応じて、前記方法はα７ニコチン性受容体を通じたカルシウムのさらなる流入を防止することを含む、請求項２６に記載の使用方法。