JP2016515816A - デングウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン - Google Patents

Abstract

本発明の態様は、哺乳類内でデングウイルスの２種以上のサブタイプに対する免疫反応を誘発する共通デングｐｒＭＥなどのポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクト、及びその使用方法に関する。さらに、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を生じさせることができるＤＮＡプラスミドワクチンであって、ＤＮＡプラスミドと製薬上許容できる賦形剤とを含むＤＮＡプラスミドワクチン、及びその使用方法が存在する。当該ＤＮＡプラスミドは、４つ全てのデングサブタイプに対して交差反応性である、哺乳類内で免疫反応を誘発するのに有効な量の共通デング抗原を哺乳類の細胞内で発現させることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、改善されたデングワクチン、免疫反応を誘導するための、並びに個体をデングウイルスに対して予防的に及び／又は治療的に免疫するための改善された方法に関する。

デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、デング熱（ＤＦ）及び重篤な生命を脅かす疾病であるデング出血熱／デング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）を引き起こす新興蚊媒介病原体である。ＤＥＮＶは、フラビウイルス科のフラビウイルス属に属する、小さな、エンベロープを有する、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。４種の異なるサブタイプ又は血清型のデングウイルス（ＤＶ−１〜ＤＶ−４）が、ネッタイシマカ及びヒトスジシマカ種の蚊にかまれることを通してヒトに伝染する。毎年５０００万〜１億例のＤＦ及び２５０，０００〜５０００００例のＤＨＦが発生すると推定されている。世界の人口の５分の２がデング熱の流行地で生活しており、年間５０００万〜１億例のデング熱感染が発生しているため、デング熱は重要な国際的公衆衛生問題となっている。さらに、２５億人が、有効な介入の存在しない、世界の亜熱帯及び熱帯地方において、感染する危険性がある。

１００を超える熱帯の国々が風土性のデングウイルス感染症を有しており、ＤＨＦは６０を超えるこれらの国々で記録されている。ＤＦ／ＤＨＦのサーベイランスは大部分の国で不満足なものであり、過去において主にＤＨＦに焦点をあてたものである；よって毎年発生するＤＦ症例の数は推定でしかあり得ない。しかしながら、１９９８年に、アジア及びアメリカ全体で広範囲にわたって病気が流行し、１２０万例を超えるＤＦ／ＤＨＦが世界保健機関（ＷＨＯ）に報告された。ＤＨＦの地球的規模の報告は、過去２０年間で平均して５倍増加している。２１世紀の初頭には、流行の活動性に応じて、毎年５０００万〜１億例のＤＦ及び数十万例のＤＨＦが発生すると推定される。国によって致死率（ＣＦＲ）は変動するが、ある国では１０〜１５％と高く、他の国では１％未満である場合もある。

デングウイルスには４種のサブタイプ：デング−１（ＤＶ−１）、デング−２（ＤＶ−２）、デング−３（ＤＶ−３）、及びデング−４（ＤＶ−４）が存在する。これらのサブタイプはそれぞれ、フラビウイルス科内で抗原性の異なるサブグループを形成する。それらは１０個のタンパク質：３つの構造タンパク質と７個の非構造タンパク質をコード化している、エンベロープを有するＲＮＡウイルスである。構造タンパク質は、カプシド（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ）、及び前膜前駆体（ｐｒｅＭ）である。ＤＶの細胞内ライフサイクルは、ウイルスの細胞内への受容体媒介エンドサイトーシスから始まり、続いてウイルスエンベロープタンパク質が後期エンドソーム膜と融合し、これにより複製のためにウイルスゲノムが細胞質に放出される。

ＤＶによる感染は、無症候性である場合もあり、又は発熱、悪寒、前頭部痛、筋肉痛、関節痛、及び発疹を特徴とする場合もある。続いて異なる血清型に感染すると、血漿漏出又は出血（デング出血熱）及びショック（デング熱ショック症候群）を伴う、より重篤な疾患の徴候が生じる場合がある。ＤＥＮＶ感染の病原性を理解するために、長年にわたって広範囲な研究が行われてきたが、特異的抗ＤＶ化合物の開発はほとんど進展していない。現在、米国で承認されているデング感染に対する特異的抗ウイルス剤又はワクチンは存在しない。

成熟デングウイルス粒子の表面上に存在する主な構造タンパク質である、エンベロープ（Ｅ）グリコシル化タンパク質は、Ｉ型内在性膜タンパク質である。成熟デングのＥタンパク質は、逆平列方式で（頭−尾配向）ホモダイマーを形成することが実証されている。各モノマーは３つの異なるドメイン、つまりドメインＩ（ＤＩ、主要なＮ−末端ドメイン）、ドメインＩＩ（ＤＩＩ、二量体化ドメイン）、及びドメインＩＩＩ（ＰＲＭ／Ｅ、免疫グロブリン（Ｉｇ）様Ｃ−末端タンパク質）に折り畳まれる。Ｅタンパク質のＰＲＭ／Ｅドメインは、Ｃ末端の１００アミノ酸（残基３０３〜３９５）から成る。このドメインは、受容体認識及び結合ドメインであることが示唆されている。ＰＲＭ／Ｅタンパク質に存在するＩｇ様折り畳みは、一般的に付着機能を有する構造に会合する。このドメインは、先端がＥタンパク質の他の部分のいずれよりも、ウイルス粒子表面からさらに突出した状態で、ウイルス表面に対して垂直に延在する。加えて、組み換えＰＲＭ／Ｅタンパク質及びフラビウイルスのＥタンパク質のＰＲＭ／Ｅに対して生成された抗体はともに、標的細胞内へのフラビウイルスの侵入を阻害し得ることが研究により実証されている。さらに、Ｅタンパク質のＰＲＭ／Ｅに突然変異を有するフラビウイルスは、弱毒性、又は免疫中和を免れる能力を示す。

デングウイルス感染に対する安全かつ有効なワクチンの開発は、依然として主な公衆衛生の目的である。デングウイルスに対する免疫と主に関連のあるのが中和抗体の存在であると考えられるならば、ワクチン候補を比較し、最適化するための必須条件は、ワクチンにより誘発される中和抗体反応を正確に測定する能力である。４種全ての血清型に由来する弱毒化生ウイルスを含有するワクチンの組み合わせは、いくつかの合併症を生じさせることが示されている（Ｇｕｙ Ｂ， Ａｌｍｏｎｄ ＪＷ， Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ２００８ Ｍａｒ；３１（２−３）：２３９−５２）。さらに、デング抗原のアデノウイルスに基づいた送達に関する報告がわずかしかない。それにもかかわらず、アデノウイルス系に関してよく認識されている問題は、人口の大部分がアデノウイルスの１種に対する抗体を有することが知られており、このような既存の抗体がこれらのアデノ由来ワクチンを無効にする可能性があることである。

したがって、複数の、好ましくはデングウイルスの４種の血清型全てに対する広い免疫、又は普遍的免疫を提供するワクチン、好ましくは全ての血清型にわたる経済的かつ有効なワクチンの開発が依然として必要である。さらに、予防的に又は治療的に、デングウイルスに対する免疫を提供するために、ＤＮＡワクチン又はＤＮＡプラスミドワクチンのようなワクチンを哺乳類に投与する有効な方法も依然として必要である。

本発明の１つの態様は、デングウイルスの２種以上のサブタイプに対して、哺乳類内で免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクトを提供する。核酸コンストラクトは、コード化ヌクレオチド配列と、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモータとを含む。該コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも２種の異なるデングウイルスサブタイプに由来するエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩ（ＰＲＭ／Ｅドメイン又はＰＲＭ／Ｅ）を含むポリペプチドを発現させる。該プロモータは、哺乳類内における該ポリペプチドの発現を調節する。

本発明の別の態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を生じさせ得るＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で共通デング抗原を発現させ得るＤＮＡプラスミドと、製薬上許容できる賦形剤とを含む。ＤＮＡプラスミドは、共通デングＰＲＭ／Ｅ抗原をコード化するコード配列に機能的に連結しているプロモータを含む。共通デング抗原は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４の共通ＰＲＭ／Ｅドメインを含む。

本発明の別の態様は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達することを含む工程であって、前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内でウイルスの複数のサブタイプに由来する複数の共通抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の共通抗原がウイルスの少なくとも２種の異なるサブタイプに由来する抗原ドメインを含む工程と、定電流でエネルギーのパルスを用いて組織の細胞を電気穿孔処理して、ＤＮＡプラスミドの細胞への侵入を可能にする工程と、を含む、哺乳類内でウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法を提供する。

ＤＵを接種したマウスに由来する血清に対するＤ１ｐｒＭＥを接種したマウスに由来する血清の、サブタイプ１由来の全てのデングＰＲＭ／Ｅドメインに対する結合力価を示す。 ＤＵを接種したマウスに由来する血清に対するＤ２ｐｒＭＥを接種したマウスに由来する血清の、サブタイプ２由来の全てのデングＰＲＭ／Ｅドメインに対する結合力価を示す。 ＤＵを接種したマウスに由来する血清に対するＤ３ｐｒＭＥを接種したマウスに由来する血清の、サブタイプ３由来の全てのデングＰＲＭ／Ｅドメインに対する結合力価を示す。 ＤＵを接種したマウスに由来する血清に対するＤ４ｐｒＭＥを接種したマウスに由来する血清の、サブタイプ４由来の全てのデングＰＲＭ／Ｅドメインに対する結合力価を示す。 血清型１、２、３、又は４由来のＰＲＭ／Ｅドメインを用いて免疫化したマウスの、ｐｒＭＥタンパク質Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４の種類に対して作製された結合抗体を示す染色ゲルを示す。 対照のモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 ＤＵ―ＤＩＩＩモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 Ｄ１〜Ｄ４ ｐｒＭＥのモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す（１つの混合物に４つ全てのワクチンを組み合わせ、まとめて投与する）。 Ｄ１〜Ｄ４ ｐｒＭＥのモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す（各ワクチンを別々に投与する）。 Ｄ１ ｐｒＭＥモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 Ｄ２ｐｒＭＥモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 Ｄ３ｐｒＭＥモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 Ｄ４ｐｒＭＥモルモットの血清について、デングＰＲＭ／Ｅタンパク質（１型〜４型）のそれぞれ１つに対する中和抗体を示すグラフを示す。 ４つ全てのＤ１〜Ｄ４のｐｒＭＥを接種した動物由来の血清について、デング１ウイルスに対する中和抗体を示すグラフを示す。 ４つ全てのＤ１〜Ｄ４のｐｒＭＥを接種した動物由来の血清について、デング２ウイルスに対する中和抗体を示すグラフを示す。 ４つ全てのＤ１〜Ｄ４のｐｒＭＥを接種した動物由来の血清について、デング３ウイルスに対する中和抗体を示すグラフを示す。 ４つ全てのＤ１〜Ｄ４のｐｒＭＥを接種した動物由来の血清について、デング４ウイルスに対する中和抗体を示すグラフを示す。

以下の簡潔にした、又は短縮した定義を、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために提供する。本明細書に提供される簡潔した定義は、決して排他的ではなく、技術分野又は辞書の意味において理解される定義とも矛盾しない。簡潔にした定義は、当該技術分野において知られている定義を補足する又はより明確に定義するために本明細書に提供される。

定義
本明細書で使用するとき、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）、及びＰＡＵＰ^* ４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて決定することができる。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌの略語である）は、配列の類似性を決定するのに好適である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似性の尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間の一致が偶発する可能性の指標を提供する。例えば、試験核酸と他の核酸との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸に類似しているとみなされる。「類似性の百分率」は、ＰＡＵＰ^* ４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算することができる。共通配列の平均類似性は、系統樹中の全ての配列を比較して計算される。

本明細書で使用するとき、用語「核酸コンストラクト」は、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列、つまり「コード化核酸配列」は、核酸分子が投与される個体の細胞内で発現を指示することができるプロモータ及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能的に連結した開始及び終結シグナルを含んでもよい。

本明細書で使用するとき、用語「発現可能形」とは、個体の細胞内に存在するとき、コード配列が発現するように、タンパク質をコード化しているコード配列に機能的に連結している必須調節エレメントを含む核酸コンストラクトを指す。

用語「定電流」は、組織に送出される電気パルスの持続中、同じ組織、若しくは前記組織を画定する細胞が受ける又は感じる電流を定義するために、本明細書で使用される。該電気パルスは、本明細書に記載する電気穿孔装置から送出される。この電流は、電気パルスが維持されている間、前記組織内で一定のアンペア数を保つ、なぜなら本明細書で提供する電気穿孔装置が好ましくは即時フィードバックを有するフィードバックエレメントを有するためである。該フィードバックエレメントは、パルスの持続している間中、組織（又は細胞）の抵抗を測定し、同じ組織内で電気パルスの間中（マイクロ秒の単位で）、及びパルスとパルスの間、電流を一定に保つよう、電気エネルギーの出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ことができる。いくつかの実施形態では、該フィードバックエレメントはコントローラを含む。

用語「フィードバック」又は「電流フィードバック」は互換的に用いられ、提供される電気穿孔装置の能動的応答を意味し、これは電極間の組織内における電流を測定し、電流を一定水準に維持するために適宜ＥＰ装置により送出されるエネルギーの出力を変化させることを含む。この一定水準は、パルスシーケンス又は電気処理の開始前に、ユーザによって予め設定される。好ましくは、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、コントローラにより達成される、なぜならその中の電気回路が電極間の組織内の電流を継続的にモニタし、モニタした電流（又は組織内の電流）と予め設定した電流とを比較し、継続的にエネルギー出力調整を行って、モニタした電流を予め設定した水準に維持するためである。いくつかの実施形態では、フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、即時的である。

用語「電気穿孔」、「電気透過処理」、又は「界面動電エンハンスメント（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、本明細書では互換的に用いられ、生体膜において微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を指し、それらの微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、及び／又は水が、細胞膜の片側から他の側に通過することが可能になる。

用語「分散電流」は、本明細書では、本明細書に記載する電気穿孔装置の種々の針電極アレイから送出される電流パターンを定義するために使用され、前記パターンは電気穿孔される組織のあらゆる領域において電気穿孔に関連する熱応力の発生を最小限に抑える、又は好ましくはなくす。

用語「フィードバック機構」は、本明細書で使用するとき、ソフトウェア又はハードウェア（又はファームウェア）のいずれかにより実行されるプロセスを指し、このプロセスは所望の組織のインピーダンス（エネルギーのパルスの送出前、中、及び／又は後）を受け、現在の値、好ましくは電流と比較し、送出されるエネルギーのパルスを調整して、予め設定した値を得る。用語「インピーダンス」は、本明細書ではフィードバック機構について論じるとき使用され、オームの法則にしたがって電流値に変換して、それにより予め設定した電流との比較を可能にすることができる。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路により実行される。

用語「免疫反応」は、本明細書で使用され、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンを介した、デング抗原、例えば、ユニバーサルデング抗原の導入に応答した、宿主の、例えば、哺乳類の免疫系の活性化を意味する。該免疫反応は、細胞性若しくは体液性応答の形、又はその両方であってもよい。

用語「共通」又は「共通配列」は、本明細書で使用され、特定のデングサブタイプの複数の菌株の配列比較の分析（これによりサブタイプ−１、サブタイプ−２、サブタイプ−３、サブタイプ−４の共通デング配列、及び以下に記載するユニバーサルデングが得られる）に基づいて構築された、合成核酸配列又は対応するポリペプチド配列を意味する。該共通ユニバーサルデングを用いて、デングウイルスの複数のサブタイプ又は血清型に対して広く免疫を誘導することができる。

用語「アジュバント」は、本明細書で使用され、本明細書に記載するＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、以後記載するＤＮＡプラスミド及びコード化核酸配列によりコード化されるデング抗原の抗原性を高める任意の分子を意味する。

用語「サブタイプ」又は「血清型」は、本明細書では互換的に用いられ、ウイルス、例えば、デングウイルスに関連し、あるサブタイプが異なるサブタイプとは別の免疫系により認識されるような、ウイルス抗原の遺伝的変異体を意味する。例えば、デングウイルスのサブタイプ１は、デングウイルスのサブタイプ２とは免疫学的に区別できる。

本発明の１つの態様は、デングウイルスの２種以上のサブタイプに対する哺乳類の免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクトを提供する。該核酸コンストラクトは、コード化ヌクレオチド配列と、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモータとを含む。該コード化ヌクレオチド配列は、デングウイルス少なくとも２種の異なるサブタイプのＰＲＭ／Ｅドメインを含むポリペプチドを発現させる。該プロモータは、哺乳類内における該ポリペプチドの発現を調節する。

いくつかの実施形態では、当該核酸コンストラクトはさらに、コード配列のＮ−末端に機能的に連結しており、プロモータに機能的に連結しているＩｇＥリーダー配列を含んでもよい。好ましくは、ＩｇＥリーダーは配列番号１１の配列を有する。当該核酸コンストラクトはまた、コード配列のＣ末端に付着したポリアデニル化配列を含んでもよい。好ましくは、当該核酸コンストラクトはコドンが最適化されている。

いくつかの実施形態では、該コード化配列は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルスサブタイプ−３、及びデングウイルスサブタイプ−４に由来するＰＲＭ／Ｅドメインを含むポリペプチドをコード化する。好ましい実施形態では、該コード化ヌクレオチド配列は、
配列番号 記載
１ Ｄｅｎ１−ｐｒＭＥ ＤＮＡ配列
２ Ｄｅｎ１−ｐｒＭＥ タンパク質配列
３ Ｄｅｎ２−ｐｒＭＥ ＤＮＡ配列
４ Ｄｅｎ２−ｐｒＭＥ タンパク質配列
５ Ｄｅｎ３−ｐｒＭＥ ＤＮＡ配列
６ Ｄｅｎ３−ｐｒＭＥ タンパク質配列
７ Ｄｅｎ４−ｐｒＭＥ ＤＮＡ配列
８ Ｄｅｎ４−ｐｒＭＥ タンパク質配列
からなる群から選択される。

本発明の別の態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を生じさせ得るＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。該ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で共通デング抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドと、製薬上許容できる賦形剤とを含む。該ＤＮＡプラスミドは、共通デング抗原をコード化するコード配列に機能的に連結しているプロモータを含む。該共通デング抗原は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４の共通ＰＲＭ／Ｅドメインを含む。好ましくは、該ＤＮＡプラスミドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８からなる群から選択される、共通デング抗原をコード化する共通デング抗原を含む。

いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは該コード配列のＮ−末端に結合し、プロモータに機能的に連結しているＩｇＥリーダー配列をさらに含む。好ましくは、該ＩｇＥリーダーは配列Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒを有する。

当該ＤＮＡプラスミドは、該コード配列のＣ末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含んでもよい。好ましくは、当該ＤＮＡプラスミドはコドンが最適化されている。

いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤はアジュバントである。好ましくは、該アジュバントは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質であり、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸である。好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸の濃度は、６ｍｇ／ｍＬ未満である。好ましくは、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍＬ以上の全ＤＮＡプラスミド濃度を有する。

いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは、それぞれがｐｒＭ／Ｅのデングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４を含むポリペプチドをコード化する複数の独特なＤＮＡプラスミドを含む。

当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、コード化ヌクレオチド配列：配列番号２をコード化するヌクレオチド配列である配列番号１、配列番号４をコード化するヌクレオチド配列である配列番号３、配列番号６をコード化するヌクレオチド配列である配列番号５、配列番号７、及び配列番号８を含むＤＮＡプラスミドを含むことができる。

いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、デングウイルスｐｒＭＥを発現する少なくとも２種の異なるＤＮＡプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、４種の共通デングウイルスｐｒＭ／Ｅドメイン（サブタイプ１〜４）を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンが免疫反応を生じさせる哺乳類は、霊長類である。好ましくは、哺乳類は霊長類である。該免疫反応は、体液性応答又は細胞性応答のいずれであってもよく、好ましくは両方である。

本発明の別の態様は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達する工程と、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程と、を含む、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、当該ＤＮＡプラスミドワクチンを、皮内、皮下、又は筋肉組織に注入する、送達工程を含む。

いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、組織に送出されるのに望ましい電流を予め設定する工程と、予め設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程と、をさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、電気穿孔処理された細胞のインピーダンスを測定する工程と、電気穿孔処理された細胞内において定電流を維持するために、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調整する工程と、をさらに含む。測定及び調整工程は、好ましくはエネルギーのパルスの存続期間内に行う。

いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、分散パターンのエネルギーのパルスを送出するパルスシーケンスパターンにしたがって、複数の電極にエネルギーのパルスを送出する工程を含む。

本発明のいくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンはアジュバントをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、該アジュバントは、シグナル配列が欠失し、所望によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６から成る群から選択される。有用なアジュバントである可能性のある他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能的断片をコード化しているものが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、又はＭＥＣから選択される。

いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤はトランスフェクション促進剤であり、これは免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンのような小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、又は脂質である。好ましくは、該トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度でＤＮＡプラスミドワクチン中に存在する。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチン中のポリ−Ｌ−グルタミン酸濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。

いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは哺乳類に送達されて、免疫反応を誘発することができ、好ましくは該哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、又はフェレットである。より好ましくは、該哺乳類はヒト霊長類である。

本発明の１つの態様は、哺乳類内でウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する諸方法に関する。これらの方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達する工程と、ＤＮＡプラスミドの細胞への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程とを含む。当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内でウイルスの複数のサブタイプに由来する複数の共通抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の共通抗原はウイルスの少なくとも２種の異なるサブタイプに由来する抗原ドメインを含む。

本発明の１つの態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する諸方法に関する。これらの方法は、哺乳類の組織にＤＮＡプラスミドワクチンを送達する工程であって、当該ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内で共通デング抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドを含み、共通デング抗原が、少なくとも２種のデングサブタイプ、好ましくは４種全てのデングサブタイプに由来するｐｒＭＥタンパク質をコードする共通配列を含む工程を含む。該デングサブタイプとしては、サブタイプ−１、サブタイプ−２、サブタイプ−３、及びサブタイプ−４が挙げられる。免疫反応の誘発方法は、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は送達工程を含み、これはＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、又は筋肉組織に注入することを含む。好ましくは、これらの方法は、インビボ電気穿孔装置を用いて、組織に送達されることが望ましい電流を予め設定する工程と、予め設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程とを含む。いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、電気穿孔処理された細胞のインピーダンスを測定する工程と、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギー水準を調整して、電気穿孔処理された細胞内で定電流を維持する工程とをさらに含み、前記測定及び調整工程はエネルギーのパルスの存続期間内に行う。

いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、分散パターンでエネルギーのパルスを送出するパルスシーケンスパターンにしたがって複数の電極にエネルギーのパルスを送出することを含む。

本発明はまた、デングウイルスの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発することができるポリペプチドをコード化する複数のＤＮＡ断片を含む。これらのＤＮＡ断片は、配列番号２をコード化するヌクレオチド配列である配列番号１、配列番号４をコード化するヌクレオチド配列である配列番号３、配列番号６をコード化するヌクレオチド配列である配列番号５、配列番号７及び８を含む、本発明の様々なコード化核酸配列の少なくとも１つから選択され、本明細書に提供される特定のコード化核酸配列として適用する際、以下に記載の複数のＤＮＡ断片のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３２０個以上、３４０個以上、又は３６０個以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列のコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３２０個未満、３４０個未満、又は３６０個未満のヌクレオチドを含んでもよい。

本発明は、コード化ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドを含み、配列番号２、４、６、及び８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。本発明はまた、デングの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発することができるポリペプチド断片を含む。これらのポリペプチド断片は、本明細書で提供する特定のポリペプチド配列に適用するとき、配列番号２、４、６、及び８を含む、本発明の種々のポリペプチド配列の少なくとも１つから選択され、以下に記載のポリペプチド断片のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、１５個以上、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１００個以上、１１０個以上、又は１２０個以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、３０個未満、４５個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１００個未満、１１０個未満、又は１２０個未満のアミノ酸を含んでもよい。

デングの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発する機能的断片の決定は、当業者により容易に決定できる。該断片はまた、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のような、公的に入手可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも１つ、好ましくはさらに多い抗原エピトープを含むように分析され得る。加えて、免疫反応研究は、以下の実施例に示すように、マウス、並びに抗体力価及びＥＬＩスポット分析を用いて、日常的に評価することができる。

ワクチン
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質、及びタンパク質をそれに対して免疫反応が誘発され得る免疫原として特に有効にするエピトープを有するタンパク質をコード化する遺伝子コンストラクトを提供することにより、改善されたワクチンを提供する。したがって、ワクチンは、治療的又は予防的免疫反応を誘導するために提供できる。

本発明のいくつかの実施形態によると、本発明によるワクチンは、個体に送達されて、個体の免疫系の活性を調節し、それによって免疫反応を高める。タンパク質をコード化する核酸分子が個体の細胞に取り込まれると、ヌクレオチド配列が細胞内で発現し、それによりタンパク質が個体に送達される。本発明の態様は、プラスミドのような、核酸分子上のタンパク質のコード配列を送達する方法を提供する。

本発明のいくつかの態様によると、予防的に及び／又は治療的に個体を免疫する組成物及び方法が提供される。

細胞に取り込まれたとき、ＤＮＡプラスミドは、別個の遺伝物質として細胞内に留まることができる。あるいは、ＲＮＡを細胞に投与してもよい。また、セントロメア、テロメア、及び複製起点を含む直線状ミニ染色体として遺伝子コンストラクトを提供することも意図される。遺伝子コンストラクトは、核酸分子の遺伝子発現に必須である調節エレメントを含む。該エレメントとしては、プロモータ、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。加えて、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコード化する配列の遺伝子発現にはエンハンサが必要であることが多い。これらのエレメントが、所望のタンパク質をコード化する配列に機能的に連結し、調節エレメントが投与された個体内で機能することが必要である。

開始コドン及び終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、核酸コンストラクトが投与される哺乳類内で機能することが必要である。これらの開始及び終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。

用いられるプロモータ及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能しなければならない。

特にヒト用の遺伝子ワクチンの生成において、本発明の実施に有用なプロモータの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）のようなヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ＣＭＶ前初期プロモータのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモータが挙げられるが、これらに限定されず、他の実施形態では、プロモータは天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモータのような組織特異的プロモータであってもよい。このようなプロモータの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載され、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。

特にヒト用の遺伝子ワクチンの生成において、本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれる、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）内のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いてもよい。

ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントもＤＮＡ分子に含まれてよい。このような追加エレメントとしては、エンハンサが挙げられる。当該エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、並びにＣＭＶ、ＲＳＶ、及びＥＢＶ由来のもののようなウイルスエンハンサが挙げられるが、これらに限定されない群から選択してもよい。

遺伝子コンストラクトは、コンストラクトを染色体外に維持し、細胞内で複数コピーのコンストラクトを生成させるために、哺乳類の複製起点を備えてもよい。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）製のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、及びｐＲＥＰ４は、エプスタインバーウイルスの複製起点、及び組み込み無しでハイコピーエピゾーム複製を生じさせる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。

タンパク質の産生を最大化するために、コンストラクトが投与される細胞内における遺伝子発現に非常に適した調節配列を選択してもよい。さらに、宿主細胞内で最も効率よく転写される前記タンパク質をコード化するコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能するＤＮＡコンストラクトを作製することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結している核酸コンストラクトを提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結している。

タンパク質が用いられるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、周知の技術を用いて本発明のタンパク質を産生及び単離することができる。タンパク質が用いられるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ分子を挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質を産生させるために用いてもよい。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、例えば、酵母の出芽酵母株における産生に用いてもよい。市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、例えば、昆虫細胞における産生に用いてもよい。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞における産生に用いてもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクター及び系、又は他のものを用いて、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質によりタンパク質を産生させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。よって、所望のタンパク質は、核細胞及び真核細胞系の両方において調製することができ、これによりタンパク質のプロセシングされた形態のスペクトルが生じる。

当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を用いてもよく、又は周知の方法及び容易に入手可能な出発物質を用いてベクターを作製してもよい。プロモータ及びポリアデニル化シグナルのような必須制御配列、好ましくはエンハンサを含む発現系は、容易に入手可能であり、種々の宿主について当該技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。遺伝子コンストラクトは、コンストラクトがトランスフェクトされる、細胞株又は標的組織の細胞内で機能するプロモータに機能的に連結しているタンパク質コード配列を含む。構成的プロモータの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はＳＶ４０由来のプロモータが挙げられる。誘導性プロモータの例としては、マウス乳房白血病ウイルス又はメタロチオネインプロモータが挙げられる。当業者は、容易に入手可能な出発物質から、細胞に、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡをトランスフェクトするのに有用な遺伝子コンストラクトを容易に作製することができる。タンパク質をコード化するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、続いて培養され、外来ＤＮＡが発現する条件下で維持される、適合性宿主を形質転換する。

産生されたタンパク質を、細胞を溶解させることにより培養物から、又は必要に応じて、かつ当該技術分野において既知である培養培地から回収する。当業者は、周知の技術を用いて、このような発現系を用いて産生されたタンパク質を単離することができる。上記のような特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、天然材料由来のタンパク質を精製する方法を同様に適用して、組み換えＤＮＡ方法論により産生されたタンパク質を精製してもよい。

組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動ペプチド合成機を使用して、単離された本質的に純粋なタンパク質を作製することもできる。このような技術は当業者に周知であり、ＤＮＡがコード化しているタンパク質の産生において置換を有する誘導体が提供されない場合有用である。

核酸分子は、インビボ電気穿孔処理、リポソームに媒介される、ナノ粒子で促進される、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス及び組み換えワクチニアウイルスのような組み換えベクターを伴う又は伴わない、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含むいくつかの周知技術のどの技術を用いて送達してもよい。好ましくは、本明細書に記載するＤＮＡプラスミドのような核酸分子は、インビボ電気穿孔処理とともに、ＤＮＡ注入を介して送達される。

投与経路としては、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、及び経口、並びに局所的、経皮的、吸入若しくは坐薬により、又は膣、直腸、尿道、口腔、及び舌下組織のような粘膜組織の洗浄等による投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、及び皮下注入が挙げられる。遺伝子コンストラクトは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、又は電気穿孔（ＥＰ）、「流体力学法」、若しくは超音波のような他の物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない手段により投与できる。

本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置及び電気穿孔法の例としては、米国特許第７，２４５，９６３号（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉら）、米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（Ｓｍｉｔｈら）に記載されているものが挙げられ、これらの全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。また、２００７年１０月１７日に出願された同時係属及び共同保有米国特許出願第１１／８７４０７２号（米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて２００６年１０月１７日出願の米国仮出願第６０／８５２，１４９号、及び２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対する利益を請求する）（これら全ての全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）に提供されているＤＮＡワクチンの送達を促進するための電気穿孔装置及び電気穿孔法も好ましい。

米国特許第７，２４５，９６３号（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉら）は、体内又は植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム、及びその使用について記載している。当該モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極に導電性連結を提供する電気コネクタ、及び電源を備える。オペレータは、支持体構造上に実装された複数の針電極を掴握し、それを体内又は植物内の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、皮下針を介して、生体分子を選択された組織に送達する。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の生体分子の細胞内への導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。

米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（Ｓｍｉｔｈら）は、体内又は植物内の選択された組織への生体分子の細胞内への導入を有効に促進するために用いることができる電気穿孔装置について記載している。当該電気穿孔装置は、その操作がソフトウェア又はファームウェアにより定められる動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。該ＥＫＤ装置は、ユーザ制御及びパルスパラメータの入力に基づいて配列された電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じさせ、電流波形データの保存及び獲得を可能にする。当該電気穿孔装置はまた、一連の針電極、注射針用の中心注入チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクを有する置換可能な電極ディスク備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。

米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載の電極アレイ及び方法は、筋肉のような組織だけでなく、他の組織又は器官へも深く浸透するよう適応している。電極アレイの構成に起因して、注射針（選択した生体分子を送達するための）はまた、標的器官に完全に挿入され、注射は電極により予め線引きされた領域において、標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載されている電極は、好ましくは長さ２０ｍｍの２１ゲージである。

以下は、本発明の方法の例であり、上述の参考特許でより詳細に論じられている：電気穿孔装置は、哺乳類の所望の組織に、ユーザが予め設定した電流入力に類似する定電流を生じさせるエネルギーのパルスを送出するよう構成することができる。該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント及び電極アセンブリ又はハンドルアセンブリを備える。該電気穿孔コンポーネントは、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンス試験機、波形自動記録装置、入力エレメント、状況報告エレメント、通信ポート、記憶コンポーネント、電源、及び電源スイッチを含む、電気穿孔装置の１つ若しくは複数の種々のエレメントを含んでもよく、組み込んでもよい。該電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つのエレメントとして機能することができ、他のエレメントは、電気穿孔コンポーネントと通信している別のエレメント（又はコンポーネント）である。いくつかの実施形態では、該電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上のエレメントとして機能することができ、これは電気穿孔コンポーネントから離れた電気穿孔装置のさらに他のエレメントと通信できる。本発明は、エレメントが１つの装置又は互いに通信する別個のエレメントとして機能することができるので、１つの電気機械的又は機械装置の一部として存在する電気穿孔装置のエレメントにより制限されない。当該電気穿孔コンポーネントは、所望の組織で定電流を生じさせるエネルギーのパルスを送出することができ、フィードバック機構を含む。該電極アセンブリは、空間的配置で複数の電極を有する電極アレイを含み、前記電極アセンブリは電気穿孔コンポーネントからエネルギーのパルスを受け取り、それを電極を通して所望の組織に送出する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送出中中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔コンポーネントに伝える。該フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信することができ、電気穿孔コンポーネントにより送出されたエネルギーのパルスを調整して、定電流を維持することができる。

いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送出することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下で電極の制御を通して分散パターンでエネルギーのパルスを送出することができ、前記プログラムされたシーケンスはユーザにより電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順に送出される複数のパルスを含み、前記複数のパルスの各パルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極により少なくとも２つの活性電極により送出され、前記複数のパルスの次のパルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極により少なくとも２つの活性電極のうち異なる１つにより送出される。

いくつかの実施形態では、該フィードバック機構は、ハードウェア又はソフトウェアのいずれか一方により実施される。好ましくは、該フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、又は１μｓ毎に生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は同時（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技術により決定したとき、実質的に同時）である。いくつかの実施形態では、中性電極は所望の組織におけるインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをフィードバック機構に伝え、該フィードバック機構は該インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して、予め設定した電流に類似する値に定電流を維持する。いくつかの実施形態では、該フィードバック機構は、定電流をエネルギーのパルスの送出中継続的かつ即座に維持する。

製薬上許容できる賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤のような機能分子を含んでもよく、これらの分子は既知であり一般に容易に入手可能である。好ましくは、製薬上許容できる賦形剤は、アジュバント又はトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子、又はＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能強化剤又は遺伝子ワクチン促進剤（つまりトランスフェクション促進剤）の投与と併せて、細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能強化剤は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）に記載されており、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、米国仮特許出願第０２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されており、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として核酸分子と併せて投与されてもよく、又は核酸分子の投与と同時に、その前若しくは後に、別々に投与されてもよい。トランスフェクション促進剤の例としては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、並びにスクアレン及びスクアレンのような小胞が挙げられ、ヒアルロン酸を遺伝子コンストラクトと併せて投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、レシチンリポソーム又はＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、国際公開第９３２４６４０号を参照）のような当該技術分野において既知である他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子のようなトランスフェクション促進剤、又は他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、又は脂質である。

いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは、このような標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子であるアジュバントとともに送達される。このような遺伝子の例は、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びシグナル配列が欠失し、所望によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５のような他のサイトカイン及びリンホカインをコード化するものである。有用である可能性のある他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能的断片をコード化しているものが挙げられる。

本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約１ナノグラム〜１０ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、又は好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、又はより好ましくは約１００マイクログラム〜約１ミリグラムの量のＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡを含む。

本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、用いられる投与方式に応じて製剤化される。ＤＮＡプラスミドワクチンが注入可能な組成物である場合、それらは無菌である、及び／又はピロゲンを含まない、及び／又は微粒子を含まない。等張製剤が好ましくは用いられる。一般に、等張化剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げることができる。いくつかの場合には、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ＬＧＳ若しくは他のポリカチオン、又はポリアニオンのような、製剤が室温又は周囲温度で長期間安定であることを可能にする安定剤が製剤に添加される。

いくつかの実施形態では、哺乳類内で共通デング抗原に対する免疫反応を誘発する方法としては、粘膜の免疫反応を誘導する方法が挙げられる。このような方法としては、上記のような共通デング抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み込わせられた、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びそれらの機能的断片、又はそれらの発現可能なコード配列のうち１種若しくは複数種を哺乳類に投与することが挙げられる。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びそれらの機能的断片のうち１種若しくは複数種は、本明細書で提供するＤＮＡプラスミドデングワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される１種若しくは複数種のタンパク質をコード化する単離核酸分子を哺乳類に投与する。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のためだけに提供されることを理解すべきである。上記議論及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を解明し、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の種々の変更及び修正を行って、それを種々の用途及び条件に適合させることができる。よって、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の記載から当業者に明らかになる。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。

好ましくは、本明細書に記載の筋肉又は皮膚ＥＰ装置とともに用いるためのＤＮＡ製剤は、高いＤＮＡ濃度を有し、好ましくは、皮膚への送達に最適である少容量、好ましくは小注入容量、理想的には２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、１マイクログラム〜数十ミリグラムの量、好ましくはミリグラムの量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上（ｍｇ（ＤＮＡ）／製剤の容量）のような高いＤＮＡ濃度を有する。より好ましくは、当該ＤＮＡ製剤は、２００μＬのフォーミュラ中にグラムの量のＤＮＡ、より好ましくは１００μＬのフォーミュラ中に１グラムの量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。

本発明のＥＰ装置とともに用いるためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置及び技術の組み合わせを用いて製剤化又は製造することができるが、好ましくは２００９年１月１日に、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号として公開された、米国特許出願第１２／１２６６１１号に記載されている、最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例では、これらの研究で用いられたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化してもよい。製造技術はまた、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号に記載されているもの、及び２００７年７月３日に発行された、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものに加えて、当業者に一般に知られている種々の装置及びプロトコルを含む、又は組み込む。本明細書に記載されているＥＰ装置及び送達技術とともに用いられる高濃度のプラスミドにより、合理的低容量でＩＤ／ＳＤ空間にプラスミドを投与することが可能になり、発現及び免疫効果を高めるのに役立つ。刊行物、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号、及び米国特許第７，２３８，５２２号は、その全文が本明細書に組み込まれる。

実施例
実施例１
ｐｒＭは、非感染性の未成熟なウイルス粒子の、ｐｒＭ−Ｅヘテロ二量複合体を形成することにより、ウイルス成熟の最中のＥタンパク質の早期融合を防止する。未成熟な粒子は、ゴルジ体領域の低ｐＨ環境を介して移動し、可逆的な立体構造の変化が、ｐｒＭの処理の前にＥタンパク質で起こる。トランスゴルジ網における細胞性セリンプロテアーゼによるｐｒＭのＭに対する切断の後に、結果として中和エピトープの完全性を維持するＥにおける不可逆的な立体構造の変化が起こる。

Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、及びＤ４ｐｒＭＥは、血清型Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４それぞれにについて、ｐＲＭ（プレ膜（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）前駆体）タンパク質及びＥ（エンベロープ）タンパク質の両方の共通配列を含む抗原をコード化するコンストラクトであった。

ＤＵは、血清型Ｄ１のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ２のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ３のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、及び血清型Ｄ４のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列を含む抗原をコード化するコンストラクトであり、それぞれがリンカーにより分かれている。タンパク質分解切断配列により分かれている４つ全てのＤＩＩＩドメイン（ユニバーサル、あるいはユニバーサルＤＩＩＩ）を組み合わせたコンストラクトが構築され、ＤＵ（配列番号９）と呼んだ。配列番号１０を有する共通ＤＩＩＩドメインＤＵは、４つのサブタイプのＤＩＩＩのそれぞれと連結するリンカー配列（ＤＶ−ｌ−ＤＩＩＩ、ＤＶ−２−ＤＩＩＩ、ＤＶ−３−ＤＩＩＩ、及びＤＶ−４−ＤＩＩＩ）からなる。このリンカーは、配列ＲＧＲＫＲＲＳを有し、これによりＤＵの切断を特異的なサブタイプの別々のＤＩＩＩ配列で行うことが可能となる。しかしながら、リンカー配列は、類似する特徴を有する当業者が入手可能な他のいずれかのリンカー配列とすることができ、現在使用しているＲＧＲＫＲＲＳのようなリンカーと交換することは、当業者の通常の知識の範囲内である。

マウスを、１００μｇのＤ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、Ｄ４ｐｒＭＥ、又はＤＵを用いて免疫化した。３Ｐ Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ（ＩＤ）を用いてマウスに３回免疫化を行い、それぞれの免疫化を３週間離して行い、同一の注射部位で３週間毎に出血させた。各グループは、５匹の動物（ｎ＝５）を含んだ。

段階希釈（１：５０、１：１５０、１：４５０、１：１３５０、及び１：４０５０）を、各マウス由来の血清から作製した。この血清を、４つの血清型Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４のそれぞれに由来するＤＩＩＩ（エンベロープタンパク質ＥのドメインＩＩＩ）と接触させた。ＤＩＩＩタンパク質に対する血清中の抗体の結合性を、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。ＢＳＡを対照として使用した。

実験設計の概略は以下の通りである。

この結果を、図１〜５に示す。図１に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥで免疫化した全てのマウスは、Ｄ１由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生し、ＤＵで免疫化した全てのマウスも同様に、Ｄ１由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生した。図２に示すように、Ｄ２ｐｒＭＥで免疫化した全てのマウスは、Ｄ２由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生し、ＤＵで免疫化した全てのマウスも同様に、Ｄ２由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生した。図３に示すように、Ｄ３ｐｒＭＥで免疫化したマウス３、４、及び５は、Ｄ３由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生したが、図１及び２に示すような結合性ではなかった。Ｄ３ｐｒＭＥで免疫化したマウス１及び２は、Ｄ３由来のＤＩＩＩと良好に結合した抗体を産生しなかった。ＤＵで免疫化した全てのマウスは、Ｄ３由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生した。図４に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥで免疫化したマウス４及び５は、Ｄ４由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生したが、マウス１、２、及び３では、この抗体を産生しなかった。ＤＵで免疫化した全てのマウスは、Ｄ４由来のＤＩＩＩと結合した抗体を産生した。

Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥで免疫化したマウス由来の血清を、タンパク質Ｅ及びタンパク質ｐｒＭに関するウェスタンブロット解析を用いて解析した。図５に示すように、タンパク質Ｅ及びｐｒＭは分離されており、全てのマウス由来の血清に存在していた。

実施例２：デング Ｌｉ−Ｃｏｒアッセイ
モルモットを、１００μｇのＤ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、Ｄ４ｐｒＭＥ、又はＤＵを用いて免疫化した。このうち一部のグループでは、以下に示すように、各モルモットを、４つ全てのＤ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥを用いて、単一又は別々の免疫部位のいずれかで免疫化した。単一投与部位では、４つ全てが単一投与においてまとめて混合された。別々の免疫部位では、それぞれを別々に投与した。実施例２の場合、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、及びＤ４ｐｒＭＥは、血清型Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４それぞれに由来するｐＲＭタンパク質（プレ膜前駆体）タンパク質及びＥ（エンベロープ）タンパク質の両方を含む抗原をコード化するコンストラクトであった。ＤＵは、血清型Ｄ１のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ２のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ３のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、及び血清型Ｄ４のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列を含む抗原をコード化するコンストラクトであり、それぞれが実施例１に示されるようにリンカーにより分かれている。

段階希釈（１：５０、１：１５０、１：４５０、１：１３５０、及び１：４０５０）を、各モルモット由来の血清から作製した。デングウイルスに対する血清中の抗体の結合性を、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。

血漿の２倍の段階希釈物を作製し、ウェルあたり５０μｌで９６ウェルプレートに配置した。５０ｐｆｕ（ウェルあたり５０μｌ）のデングウイルスを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、血清由来の抗体でウイルスの中和を可能にした。全混合物（１００μｌ）をＶＥＲＯ細胞（播種１．５×１０⁴／ウェル）に添加した。プレートを３７℃で４日間インキュベートした。細胞を、３．７％のホルムアルデヒドを使用して３０分間固定した。細胞を洗浄し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを使用して透過処理した。細胞系ＥＬＩＳＡを、マウスの４Ｇ２ ｍＡｂを用いて実施し、ビオチン化した抗マウスＩｇＧ及びＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン＋５ｍＭ ＤＲＡＱ５カクテル溶液（ｃｏｃｋｔａｉｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して実施した。プレートを洗浄し、乾燥させ、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ａｅｒｉｕｓシステムを使用してスキャンした。８００ｎｍ／７００ｎｍの比率を計算した。

結果を、図６〜１３に示す。図６に示すように、２匹の対照モルモット（免疫化無し）由来の血清は、Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４の血清型由来のＤＩＩＩと結合しなかった。図７に示すように、ＤＵで免疫化したモルモットのうち、モルモット４のみがＤｌ、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４血清型由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。図８に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ１ｐｒＭＥ、１００μｇのＤ２ｐｒＭＥ、１００μｇのＤ３ｐｒＭＥ、及び１００μｇのＤ４ｐｒＭＥの混合物を用いて、合計４００μｇ全てをモルモットあたり１つの免疫部位で免疫化した。全てのモルモットは、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。しかしながら、２匹のモルモットのみ、Ｄ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合する抗体を産生し、この結合性は他の血清型と比較して弱かった。図９に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ１ｐｒＭＥ、１００μｇのＤ２ｐｒＭＥ、１００μｇのＤ３ｐｒＭＥ、及び１００μｇのＤ４ｐｒＭＥを、モルモットあたり合計４００μｇで用いて、４つの別々の部位で免疫化した。全てのモルモットは、Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。しかしながら、３匹又は４匹のモルモットのみが、Ｄ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生し、この結合は他の血清型と比較して弱かった。図１０に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ１ｐｒＭＥを用いてそれぞれ免疫化した。全てのモルモットは、Ｄ１由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。しかしながら、数匹のモルモットのみが、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生し、この結合性はＤ１と比較して弱かった。図１１に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ２ｐｒＭＥを用いてそれぞれ免疫化した。全てのモルモットは、Ｄ２由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。しかしながら、１匹のモルモットのみが、Ｄ１由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生し、この結合性はＤ１と比較して弱かった。いずれのモルモットも、Ｄ３又はＤ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生しなかった。図１２に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ３ｐｒＭＥを用いてそれぞれ免疫化した。全てのモルモットは、Ｄ１及びＤ３由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。しかしながら、１匹のモルモットのみが、Ｄ２由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。いずれのモルモットも、Ｄ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生しなかった。図１３に示すように、５匹のモルモットを、１００μｇのＤ４ｐｒＭＥを用いてそれぞれ免疫化した。４匹のモルモットが、Ｄ４由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。モルモット１が、Ｄ１及びＤ２由来のＤＩＩＩタンパク質と結合した抗体を産生した。数匹のモルモットのみが、Ｄ２及びＤ３由来のＤＩＩＩタンパク質と（最小限に）結合した抗体を産生した。

図７と図８及び９との比較により、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、及びＤ４ｐｒＭＥの組み合わせを用いた免疫化は、別々又は混合物中での免疫化であっても、ＤＵを用いた免疫化を行ったＤＩＩＩに対して良好な免疫原性をもたらしたことを示した。

実施例３：デングＰＲＮＴ₅₀及びＦＲＮＴアッセイ
モルモットを、１００μｇのＤＵ、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥを用いて免疫化した。このうち一部のグループでは、以下に詳細に示すように、各モルモットを、４つ全てのＤ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥを用いて、単一又は別々の免疫部位のいずれかで免疫化した。実施例２及び３では、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、及びＤ４ｐｒＭＥは、血清型Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、又はＤ４それぞれに由来するｐＲＭ（プレ膜前駆体）タンパク質及びＥ（エンベロープ）タンパク質の両方を含む抗原をコード化するコンストラクトであった。ＤＵは、血清型Ｄ１のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ２のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、血清型Ｄ３のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列、及び血清型Ｄ４のＥ（エンベロープ）タンパク質のＤＩＩＩドメインの共通配列を含む抗原をコード化するコンストラクトであり、それぞれが実施例２に示されるようにリンカーにより分かれている。

ＰＲＮＴ５０アッセイでは、ＶＥＲＯ細胞を、６ウェルの形式（７．５×１０⁵〜１．０×１０⁶細胞／ウェル）で１日目にプレーティングした。２日目に、５０ｐｆｕのデングウイルス／ウェルを、モルモット由来の血清と共に、３７℃で１時間インキュベートした。使用したデングウイルスは、ハワイ、ＮＧＣ、Ｈ８７、又はＨ２４１のうちの１つであった。この混合物をプレート内の細胞の単一膜に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１％のメチルセルロースを含む２％の１９９培地を用いてオーバーレイを行った。感染させてから５日間、細胞を３７℃でインキュベートした。７日目に、細胞を固定し、クリスタルバイオレット／２０％メタノール混合物を用いて染色した（２時間のインキュベーション）。プレートを、ｄＨ₂Ｏで洗浄し、乾燥させた。プラークの数を計測した。中和力価を、血清を用いなかった対照と比較して、５０％超のプラーク計数を減少させる最も高い血清の希釈物の逆数として定義した。

Ｆｏｃｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のＦＲＮＴアッセイでは、２４ウェルプレートを、４倍希釈の血清と共に使用した。プレートを４日間インキュベートした。イムノフォーカス（Ｉｍｍｕｎｏｆｏｃｕｓ）を使用して、プラークの発生を判定及び計測した。

以下の表２及び図１４〜１７に結果を示す。図１４に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥコンストラクトの全てで免疫化したモルモット、及びＤ１ｐｒＭＥのみと免疫化したモルモット由来の血清は、ハワイデングウイルス由来のタンパク質と結合する抗体を産生した。ＤＵを用いた免疫化ではみられなかった。図１５に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥコンストラクトの全てで免疫化したモルモット、及びＤ２ｐｒＭＥのみで免疫化したモルモット由来の血清は、ＮＧＣデングウイルス由来のタンパク質と結合した抗体を産生した。ＤＵを用いた免疫化ではみられなかった。図１６に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥコンストラクトの全てで免疫化したモルモット、及びＤ３ｐｒＭＥのみで免疫化したモルモット由来の血清は、Ｈ８７デングウイルス由来のタンパク質と結合した抗体を産生した。ＤＵを用いた免疫化の後に観察した力価は最小限であった。図１７に示すように、Ｄ１ｐｒＭＥ、Ｄ２ｐｒＭＥ、Ｄ３ｐｒＭＥ、又はＤ４ｐｒＭＥの全てを用いて免疫化したモルモット、及びＤ４ｐｒＭＥのみを用いて免疫化したモルモットは、Ｈ２４１デングウイルス由来のタンパク質と結合した抗体を産生した。ＤＵを用いた免疫化ではみられなかった。

Claims (34)

1. ポリペプチドを発現するコード化ヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが少なくとも２種の異なるデングウイルスサブタイプに由来するＰＲＭ／Ｅドメインを含む配列と、
   哺乳類内における前記ポリペプチドの発現を調節し、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結するプロモータと
   を含む、哺乳類内でデングウイルスの２種以上のサブタイプに対する免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクト。
2. 前記コード配列のＮ−末端に機能的に連結し、前記プロモータに機能的に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
3. 前記コード配列のＣ−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
4. 前記核酸コンストラクトのコドンが最適化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
5. 前記コード化ヌクレオチド配列が、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、若しくはデングウイルス−サブタイプ４、又はこれらの組み合わせに由来するＤＩＩＩドメインを含むポリペプチドをコード化する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
6. 前記コード化ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
7. 哺乳類内で免疫反応を誘発するのに有効な量の共通デング抗原を哺乳類の細胞内で発現させることができるＤＮＡプラスミドであって、前記共通デング抗原が、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、若しくはデングウイルス−サブタイプ４、又はこれらの組み合わせの共通ＤＩＩＩドメインを含むＤＮＡプラスミドと、
   製薬上許容できる賦形剤と
   を含む、哺乳類内で複数のデングウイルスサブタイプに対する免疫反応を生じさせることができるＤＮＡプラスミドワクチンであって、
   前記ＤＮＡプラスミドが、前記共通デング抗原をコード化するコード配列に機能的に連結するプロモータを含む、ＤＮＡプラスミドワクチン。
8. 前記ＤＮＡプラスミドが、前記コード配列のＮ−末端に結合し、プロモータに機能的に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む、請求項７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
9. 前記ＤＮＡプラスミドが、前記コード配列のＣ−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項７〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
10. 前記ＤＮＡプラスミドのコドンが最適化されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
11. 前記製薬上許容できる賦形剤がアジュバントである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
12. 前記アジュバントが、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５から成る群から選択される、請求項１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
13. 前記製薬上許容できる賦形剤がトランスフェクション促進剤である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
14. 前記トランスフェクション促進剤が、ポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質である、請求項１３に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
15. 前記トランスフェクション促進剤が、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のポリ−Ｌ−グルタミン酸である、請求項１３に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
16. 前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、１ｍｇ／ｍＬ以上の全ＤＮＡプラスミド濃度を有する、請求項７〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
17. 前記ＤＮＡプラスミドが複数の独特なＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の独特なＤＮＡプラスミドのそれぞれが、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、若しくはデングウイルス−サブタイプ４、又はこれらの組み合わせに由来するＰＲＭ／Ｅドメインを含むポリペプチドをコード化する、請求項７〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
18. 前記コード化ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５を含む、請求項７〜１７のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
19. デングウイルスＰＲＭ／Ｅドメインを発現する少なくとも２種の異なるＤＮＡプラスミドを含み、前記プラスミドが、
    共通デングウイルス−サブタイプ１ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
    共通デングウイルス−サブタイプ２ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
    共通デングウイルス−サブタイプ３ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、及び
    共通デングウイルス−サブタイプ４ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド
    からなる群から選択される、
    請求項７〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
20. 前記共通デングウイルス−サブタイプ１ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
    前記共通デングウイルス−サブタイプ２ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
    前記共通デングウイルス−サブタイプ３ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、及び
    前記共通デングウイルス−サブタイプ４ ＰＲＭ／Ｅドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド
    を含む、請求項７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
21. 前記共通デングウイルス−サブタイプ１ ＰＲＭ／Ｅドメインが配列番号１である、請求項７〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
22. 前記共通デングウイルス−サブタイプ２ ＰＲＭ／Ｅドメインが配列番号２である、請求項７〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
23. 前記共通デングウイルス−サブタイプ３ ＰＲＭ／Ｅドメインが配列番号３である、請求項７〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
24. 前記共通デングウイルス−サブタイプ４ ＰＲＭ／Ｅドメインが配列番号４である、請求項７〜２３のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
25. 前記哺乳類がヒト以外の霊長類である、請求項７〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
26. 前記免疫反応が体液性反応である、請求項７〜２５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
27. 前記免疫反応が細胞性反応である、請求項７〜２５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
28. 前記免疫反応が、体液性反応と細胞性反応との組み合わせである、請求項７〜２５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
29. ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達することであって、前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳類の細胞内でウイルスのサブタイプに由来する複数の共通抗原を発現させて、哺乳類内で免疫反応を誘発することができるＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の共通抗原がウイルスの少なくとも２種の異なるサブタイプに由来する抗原性ドメインを含むことと、
    前記ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理することと
    を含む、哺乳類内でウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法。
30. 前記ウイルスが西ナイルウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、インフルエンザウイルス、又はデングウイルスを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記送達工程が、前記ＤＮＡプラスミドワクチンを、経皮、皮下、又は筋肉組織に注入することを含む、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記組織に送達されるのに望ましい電流を予め設定することと、
    前記予め設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスにより前記組織の細胞を電気穿孔処理することと、
    をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記電気穿孔処理工程が、
    前記電気穿孔処理された細胞内のインピーダンスを測定することと、
    前記測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調整して、前記電気穿孔処理された細胞内で定電流を維持することと
    をさらに含み、
    前記測定及び調整工程がエネルギーのパルスの存続期間内に行われる、
    請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記電気穿孔処理工程が、分散パターンでエネルギーのパルスを送出するパルスシーケンスパターンにしたがって複数の電極にエネルギーのパルスを送出することを含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。