JP2016515203A - スペクトル・アンミキシング - Google Patents

Abstract

広帯域信号および他の望ましくない信号を走査画像の成分信号から識別し、対象の信号を含むことが分かっている画像の選択領域を処理することによって、望ましくない信号を削除しつつ所望の信号を抽出または識別することにより、蛍光顕微鏡検査によって取得した画像を処理する。１つ以上の広帯域信号は、それらの一意のシグネチャー、および画像にわたって遍在する散乱によって認識される。走査画像の領域には、広帯域優勢信号から成るとしてタグを付けることができ、スペクトル・アンミキシング・プロセスの間無視される。画像の残りの領域、即ち、所望の信号を含むことが分かった画像の選択領域をアンミックスし、複数の基準スペクトルを成分から減算して、ターゲット信号を抽出または識別することができる。１組のターゲット信号は、例えば、同様の材料からの既知のまたは理想的な複数組の信号と比較されることによって、既知のノイズ源または明白なノイズ源を排除することによって、１組のターゲット信号を精緻化することができる。

Description

本主題の開示は、蛍光顕微鏡検査におけるスペクトル・アンミキシング(spectral unmixing)に関する。更に特定すれば、本主題の開示は、画像の広帯域優勢領域(predominantly broadband region)のために基準スペクトルを推定し、基準スペクトルを使用して画像の望ましい領域をアンミックスすることに関する。

組織切片、血液、細胞培養等のような生体試料の分析では、１つ以上の蛍光体によって染色された生物試料の画像を生成するために、蛍光顕微鏡検査が使用される。人の被験者からの組織切片のような生物試料は、タンパク質、タンパク質小片、または試料における他のターゲットに結合する抗体に接合された有機蛍光体を含有する染料によって処理することができる。例えば、試料は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色することができる。次いで、染色された試料は光で照明され、染料は蛍光を発する。次いで、試料の画像を取り込むために、顕微鏡に取り付けられたディジタル・カメラが使用される。蛍光体／抗体結合が対象のターゲットに結合(bind)されたエリア（例えば、癌細胞によって生成された増殖タンパク質）が、試料の画像において着色領域として現れ、試料に加えられた蛍光体の蛍光スペクトルによって、そのエリアの色が決められる。可視スペクトルに加えて、特定の蛍光体の発光スペクトルによっては、赤外線または紫外線領域において、蛍光信号が検出されることもある。２つ以上の蛍光体を含有する染料を試料に加えることもできる。これらの方法は、疾病の診断、処置に対する応答の評価、疾病と闘うための新たな薬品の開発を含む、種々の使用を有する。「量子ドット」として知られるナノ結晶発光性半導体材料が、生物学的染色および撮像用途として近年増々使用されることにより、従前の有機蛍光体に対して様々な利点が得られる。これらの利点には、狭い発光帯域ピーク、広い吸収スペクトル、強い信号、および退色または他の劣化に対する強い耐性が含まれる。

被観察信号(observed signal)は、通例、線形にミックスされた多数の信号の混合である。これらをアンミックスする、即ち、被観察信号から元の成分に戻るという問題は、得られた画像またはその一部をスペクトル的にアンミックスすることによって解決される。これは、標準的な線形代数問題であり、蛍光体によって発光されるような、正（または負でない）信号に適正に適用される。つまり、非負線形最少二乗法(non-negative linear least squares method)が通例使用される。例えば、医療用撮像では、各位置が１６個の信号を含む場合を考えると、目標は６〜１０個の所望の信号、あるいは量子ドットまたは他のターゲット信号に対応することが分かっている信号を分離することである。しかしながら、画像における各点または画素には信号の混合がある。したがって、１６チャネルを有する１０，０００×１０，０００画像では、アンミキシング・プロセスは、リソース集約的で厄介となるであろう。従前では、線形方程式解答プログラム(linear equation solver)を使用して、各位置または画素においてアンミックスしていた。しかしながら、自己蛍光およびＤＡＰＩが、検出された信号のスペクトル内にあるときに、複雑さが生じる。これらは、広帯域信号であり、ノイズが多く、量子ドットを隠す。自己蛍光およびＤＡＰＩは画像毎にそして位置毎に変化し、その結果、集約的な計算や不明瞭な結果となる。更に、これは、種々の臓器および有機体からの組織というような、サンプル種類の多様性によって複雑化される。既知の広帯域シグネチャーであっても、特定のサンプルに例外なく適用されるときは、これらの基準スペクトルが画像全域で固定されるという仮定に基づいており、そのために不完全な結果が生ずる。例えば、ＤＡＰＩは、核を染色し画像のコンテキストを得るためにのみ有用である。また、ＤＡＰＩは広帯域信号であり、他の信号を圧倒し、広い領域において生ずる。これは、赤血球（ＲＢＣ）およびリポフスチンにも該当し、これらはそれぞれ非常に広帯域な信号（ＲＢＣ）および自己蛍光（リポフスチン）を有する。これらの信号は、診断の観点からは殆ど不要であり、これらが除去されることが望まれる。

主題の開示は、走査された画像の成分信号から自己蛍光等のような広帯域信号を識別し、広帯域信号から基準信号を生成し、基準信号を使用して、対象信号、または「ターゲット信号」を含有することが分かっている画像の選択領域をアンミックすることによって、蛍光顕微鏡検査によって取得された画像を処理する。受け取られた画像は、１つ以上の広帯域信号とミックスされた、量子ドットのような、１つ以上のターゲット信号を含む、様々な蛍光チャネルの混合を含む可能性がある。１つ以上の広帯域信号は、それらの一意のシグネチャーおよび画像にわたって遍在する散乱(ubiquitous dispersion)によって認識される。遍在的に散乱する広帯域信号は、それらのシグネチャーと、既知の広帯域信号からの既知のシグネチャーとの比較に基づいて認識される。１つ以上の基準信号（または基準スペクトル）は、画像において測定された広帯域信号に基づいて、そして既知の信号との比較に部分的に基づいて、生成することができる。ターゲット信号を含有することが分かっておりその画像から選択された「ターゲット領域」を、基準信号を使用してアンミックし、その結果からターゲット信号を抽出することができる。非負線形最少二乗法のような、線形スペクトル・アンミキシング・プロセスは、ターゲット領域において成分蛍光チャネル(component fluorescent channel)を分離するために利用することができる。広帯域信号で主に（優勢に、predominantly）構成される追加領域は、基準信号に基づいて識別することができ、スペクトル・アンミキシング・プロセスによって無視されてもよく、またはスペクトル・アンミキシング・プロセスから除外されるというタグが付けられてもよい。結果的に得られた１組のターゲット信号は、例えば、同様の素材からの既知のまたは理想的な複数組の信号と比較することによって、既知のまたは明らかなノイズ源を排除することによって、精度を高める(refine)こともできる。したがって、本システムは、広帯域信号や望ましくない蛍光アーチファクトが全くない、実質的に所望のターゲット信号で構成された画像の生成を可能にし、効率的な画像分析、構造の識別、高精度な診断等を可能にする。

一実施形態例では、本主題の開示は、動作を実行するためにプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納する非一時的コンピュータ読み取り可能媒体であり、信号の混合を含む画像を受け取る動作であって、信号の混合が、更に、測定された広帯域信号とターゲット信号とを含む、動作と、画像の第１領域の位置を検出する動作であって、第１領域が、測定された広帯域信号を主に含み、検出が、測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づく、動作と、測定された広帯域信号に基づいて、画像に対する基準信号を推定する動作と、基準信号を利用して、混合をスペクトル的にアンミックスする動作とを含む。

他の実施形態では、本主題の開示は、動作を実行するためにプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納する非一時的コンピュータ読み取り可能媒体であり、画像の広帯域優勢領域を検出する動作であって、画像が広帯域信号とターゲット信号との混合を含む、動作と、広帯域優勢領域から基準信号を推定する動作と、ターゲット信号を抽出するために、基準信号を使用して混合をアンミックする動作とを含む。

更に他の実施形態例では、本主題の開示は組織試料の診断システムである。このシステムは、プロセッサとメモリとを含むコンピュータと、メモリ上において、画像の第１領域の位置を検出する基準スペクトル判定モジュールであって、画像が、測定された広帯域信号とターゲット信号との混合を含み、第１領域が測定された広帯域信号を主に含み、検出が、測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づき、更に測定された広帯域信号に基づいて画像に対する基準信号を推定する、基準スペクトル判定モジュールと、メモリ上において、基準信号を含む行列を混合に適用し、ターゲット信号を導き出すために行列を使用して混合をアンミックスするアンミキシング・モジュールとを含む。

更に他の実施形態例では、本主題の開示は、スペクトル・アンミキシング方法であって、走査画像を生成するために、蛍光顕微鏡を使用して染色された材料のサンプルを保持するスライドを走査するステップであって、材料が、１つ以上の異なる蛍光体を含有する染料の塗布によって染色され、走査画像が信号の混合を含み、信号の混合が、更に、測定された広帯域信号とターゲット信号とを含む、ステップと、画像の第１領域の位置を検出するステップであって、第１領域が測定された広帯域信号を主に含み、検出が、測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づく、ステップと、測定された広帯域信号に基づいて、画像に対して基準信号を推定するステップと、基準信号を利用して、混合をスペクトル的にアンミックするステップとを含む。

図１は、本主題の開示の実施形態例による、改良スペクトル・アンミキシング・システムを示す。 図２は、本主題の開示の実施形態例による、改良スペクトル・アンミキシング方法を示す。 図３は、本主題の開示の実施形態例にしたがって基準スペクトルを推定する方法を示す。 図４は、本主題の開示の実施形態例による、走査画像の領域にタグを付けるためのユーザ・インターフェースを示す。 図５は、本主題の開示の実施形態例にしたがって、所望の信号を精緻化する方法を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、本主題の開示の実施形態例による検出された発光スペクトルの初期画像および処理後の画像(before and after images)を示す。 図７は、本主題の開示の実施形態例による、複数の正規化基準スペクトルを示す。 図８Ａは、本主題の開示の実施形態例によるアンミキシングの結果として示される、複数の推定スペクトルを示す。 図８Ｂは、本主題の開示の実施形態例によるアンミキシングの結果として示される、複数の推定スペクトルを示す。 図８Ｃは、本主題の開示の実施形態例によるアンミキシングの結果として示される、複数の推定スペクトルを示す。 図８Ｄは、本主題の開示の実施形態例によるアンミキシングの結果として示される、複数の推定スペクトルを示す。

主題の開示は、走査された蛍光画像を処理して、この走査された画像の成分信号を分離、即ち、「アンミックス」し、所望の信号を抽出または識別する一方で、望ましくない信号を無視する。例えば、主題の開示は、取り込まれた蛍光チャネル・データを処理して、成分信号を分離、即ち、「アンミックス」し、所望の信号を抽出または識別する一方で、望ましくない広帯域成分信号を無視する。本願において説明するスペクトル・アンミキシング方法は、二次元画像データ（蛍光顕微鏡または全スライド・スキャナ上で取り込まれたデータ）に適用されるが、一次元データ（例えば、質量スペクトル分光分析によって得られたデータ）および三次元データ（例えば、立体走査によって取り込まれたデータ）にも応用可能である。

本発明によれば、蛍光顕微鏡を使用して、走査画像(scanned image)を生成するためにサンプル材料を保持するスライドを走査することができる。画像は、コンピュータ読み取り可能媒体上に格納され、１つ以上の広帯域信号とミックスされた１つ以上の所望の即ちターゲット信号を含む、様々な蛍光チャネルの混合を含む。１つ以上の広帯域信号は、それらの一意のシグネチャーおよび画像にわたって遍在する散乱によって認識される。遍在的に散乱する広帯域信号は、それらのシグネチャーと既知の広帯域信号からの既知のシグネチャーとの比較に基づいて認識される。広帯域プロファイルまたはシグネチャーを有する成分信号を判定すると、このシグネチャーを、分析対象のサンプル材料に特定的な既知の広帯域信号と比較することができる。例えば、解剖または臨床病理学用システムは、組織サンプルの走査画像を、同様の組織サンプルを保持する較正スライドと比較することができる。各サンプルの広帯域信号間に大まかな一致があると、走査画像における広帯域信号の確実な識別(positive identification )の起点となることができる。

１つ以上の基準信号（または基準スペクトル）は、画像において測定された広帯域信号に基づいて、そして既知の信号との比較に部分的に基づいて、生成することができる。基準スペクトルは、アレイまたは行列として格納し、後に画像全体、またはターゲット信号を含むことが分かっているまたは予想される(suspect)、画像の選択領域に適用することができる。画像から選択されたターゲット領域は、基準スペクトルを使用してアンミックスされ、その結果からターゲット信号を抽出することができる。非負線形最少二乗法のような、線形スペクトル・アンミキシング・プロセスは、ターゲット領域において成分蛍光チャネルを分離するために利用することができる。広帯域信号で主に（優勢に、predominantly）構成される追加領域は、スペクトル・アンミキシング・プロセスによって無視されてもよく、またはスペクトル・アンミキシング・プロセスから除外されるというタグが付けられてもよい。画像のノイズ優勢領域のこのような認識は、残りの領域のみ、即ち、ユーザに関心があると識別された領域の選択的スペクトル・アンミキシングを可能にする。

例えば、領域選択インターフェースを採用して、広帯域信号で主に構成される走査画像の領域を選択するのでも、または領域にタグを付けるのでもよい。タグが付けられた領域は、無視される、またはスペクトル・アンミキシング・アルゴリズムによる処理から除外されるのでもよく、画像を構成する成分信号の混合からの所望の即ちターゲット信号の抽出高速化を可能にする。ノイズのあるまたは不要なスペクトルが全くない、したがって分析に相応しい画像を生成するために、１組のターゲット信号を再現することができる。更に、この１組のターゲット信号は、例えば、同様の材料からの既知のまたは理想的な複数組の信号と比較することによって、既知のまたは明白なノイズ源を排除することによって、更に精度を高めることができる。他の高精度化プロセスは、特定の範囲を強調するために強度の最小値または最大値を調節すること、ならびにこの範囲外の信号を排除すること、より動的な範囲を見るためにコントラストを調節すること、更に他の撮像動作を含む。

したがって、開示するシステムおよび方法は、広帯域ノイズや望ましくない蛍光アーチファクトが全くなく、所望の信号または正確な信号で実質的に構成される画像の生成を可能にする。例えば、自己蛍光、ＤＡＰＩ、および他の望ましくないシグネチャーを、特定の組織サンプルの走査画像について識別し、生物学的に関連のある情報を含有することが分かっている画像の領域の成分信号から除去することができる。更に、一旦広帯域シグネチャーが、特定のスライドまたは１組のスライドに対して判定されたなら、広帯域優勢領域をアンミックスする必要はなく、その結果、アンミキシング・プロセスの集約性が低下する。したがって、開示する特徴は、効率的な画像分析、構造の識別、高精度な診断等を可能にする。

以下の説明では、図面にわたって最も対応付けて付番された構造（例えば、１３２および２３２等）は、同じ特性を保有し、同じ構造および機能に従うと仮定することができる。対応付けて付番されたエレメント間に指摘されない相違があり、この相違の結果、特定の実施形態についてエレメントの対応しない構造または機能が生ずる場合、その特定の実施形態に与えられた、矛盾する説明が優先される(govern)こととする。

図１は、本主題の開示の実施形態例によるスペクトル・アンミキシング・システム１００を示す。システム１００は、蛍光画像を生成するソース１０１を含む。例えば、ソース１０１は、スペクトル・カメラ、スキャナ、蛍光染料で染色された材料のサンプルを収容するスライドを撮像するために使用されるスキャナまたはスペクトル・カメラに関連付けられたまたは含む蛍光顕微鏡であってもよい。ソース１０１は、メモリ１１０と通信可能であり、メモリ１１０は、コンピュータ１２０に結合されたプロセッサ１２５によって実行される複数の処理モジュールまたは論理命令を含む。例えば、生体試料のようなサンプルを、メモリ１１０に結合されたカメラまたは顕微鏡による撮像の目的のために、スライドあるいは他の基板またはデバイス上に載せ、本開示によるメモリ１１０に格納された複数のモジュールの内１つ以上を実行するプロセッサ１２５によって、サンプル画像の分析を実行することができる。この分析は、サンプルの識別および研究のためでもよい。例えば、生物学または病理学システムが、サンプルを研究して、癌または他の疾病を示すタンパク質、タンパク質小片、または他のマーカの存在を求める、あるいはゲノムのＤＮＡ検出、メッセンジャＲＮＡ検出、タンパク質検出、ウィルスの検出、遺伝子の検出、またはその他というような、他の目的のためであってもよい。

サンプルは、１つ以上の異なる蛍光体（１つまたは複数）を含有する染料の塗布によって染色されてもよい。サンプルに塗布される蛍光体の数Ｎは、異なることができるが、通例２ないし１０の間である。蛍光体は、１つ以上のナノ結晶半導体蛍光体（即ち、量子ドット）を含むことができ、各々、異なる波長範囲においてピーク発光応答を生成する。量子ドットは、周知であり、Invitrogen Corp.、Evident Technologiesおよびその他から商業的に入手できる。例えば、サンプルは、様々な異なる量子ドット、例えば、５６５、５８５、６０５、および６５５ｎｍにおいてピーク発光応答を生成する量子ドットで処理することができる。サンプルに塗布される蛍光体の内１つ以上が有機蛍光体１４（例えば、ＤＡＰＩ、テキサス・レッド）であってもよく、これらは当技術分野では周知であり、少なくとも本願と所有者および譲受人が同一である米国特許第８，２９０，２３６号に記載されている。その内容は、この特許をここで引用したことにより、その全体が本願にも含まれるものとする。

このように、システム１００は、単に量子ドットで染色されたサンプル、従来の有機蛍光体と組み合わせた量子ドットで染色されたサンプル、または単に従来の有機蛍光体で染色されたサンプルとでも使用することができる。更に、典型的なサンプルは、量子ドットおよび／または有機蛍光体を含有する染料をサンプルに塗布する自動化染色／測定プラットフォームにおいて処理される。染色／測定プラットフォームとして使用するのに適した種々の商用製品が市場にあり、その一例は、本願の譲受人であるVentana Medical Systems, Inc.の Discovery（商標）製品である。暫定的な組織の処理および染色の後、サンプルはカメラ・システムに供給される。カメラ・システムは、スペクトル・ソース、例えば、試料に塗布された蛍光体から発光応答を生成することを意図した波長においてサンプルを照明する光源を含む。量子ドットの場合、光源は、広域スペクトル光源とすればよい。あるいは、光源は、レーザのような狭域光源を含んでもよい。また、カメラ・プラットフォームは、１つ以上の対物レンズおよびディジタル撮像素子、ならびに１組のスペクトル・フィルタを有する顕微鏡も含むことができる。異なる波長において画像を取り込む他の技法が使用されてもよい。染色生体試料を撮像するのに適したカメラ・プラットフォームは、当技術分野では周知であり、Zeiss、Canon、Applied Spectral Imaging、およびその他から商業的に入手可能であり、このようなプラットフォームは、既に、本主題の開示のシステム、方法、および装置における使用に適応可能である。

画像は、顕微鏡１０１とコンピュータ１２０との間におけるケーブル接続を介して、コンピュータ・ネットワークを介して、またはコンピュータ間でディジタル情報を転送するために一般に使用される任意の他の媒体を使用して、コンピュータ読み取り可能媒体１１０に供給することができる。また、画像は、コンピュータ１２０による格納および後の引き出しのために、ネットワーク・サーバまたはデータベースに、ネットワークを通じて供給することもできる。プロセッサ１２５およびメモリ１１０の他に、コンピュータ１２０は、キーボード、マウス、スタイラス、およびディスプレイ／タッチスクリーンのような、入力および出力デバイスも含む。以下の論述において説明するように、プロセッサ１２５は、メモリ１１０上に格納された論理命令を実行して、画像の分析、このような画像から得られる画像または画像データの形態的処理、定量分析、および定量的な／図式的な結果の、コンピュータ１２０を操作するユーザへの表示を実行する。

例えば、先に説明したように、サンプル材料を保持するスライドがソース１０１において走査され、１つ以上の広帯域信号とミックスされた１つ以上の所望の信号またはターゲット信号を含む様々な蛍光チャネルの混合を含む走査画像を生成する。この画像は、画像取得モジュール１１１によって受け取られる。この画像は、未だ生成されなくてもよく、単に信号の混合が画像取得モジュール１１１によって取得され、その後広帯域検出モジュール１１３によって処理されるのでもよい。この信号の混合内にある１つ以上の広帯域信号は、その一意のシグネチャーおよび画像にわたって遍在する散乱によって、認識することができる。この画像のある領域が、自己蛍光等のような、広帯域信号を主に含むまたは広帯域信号のみを含むと判定されることもあり得る。これらの信号の広帯域プロファイルは、画像にわたって遍在するその散乱と共に、これらの領域が所望の信号からのピークのような有用な情報を全く含まない可能性が非常に高いという仮定を支持する。

更に、広帯域シグネチャーを有するコンポーネントを判定したとき、成分信号を、分析対象のサンプル材料に特定的な既知の広帯域シグネチャーと比較することもできる。例えば、解剖または臨床病理学用システムが、組織サンプルの走査スライドを、既知の広帯域シグネチャーを有する同様の組織サンプルを含む較正スライドの画像と比較して、走査画像において広帯域信号を識別することもできる。既知の広帯域シグネチャーは、基準スペクトル・データベース１１４に格納することができる。例えば、人の１つの組織試料が赤血球（ＲＢＣ）に対応する広帯域シグネチャーを含むことが知られていることもある。基準スペクトル・データベース１１４は、ＲＢＣについての既知のシグネチャー、および組織の種類、自己蛍光等に対応するＤＡＰＩシグネチャーのような、生物学的情報を含むことができる。既知の広帯域シグネチャーは、画像の領域と比較され、前記領域内における広帯域優勢信号を認識することができる。例えば、広帯域シグネチャーを主に含むことが分かっている画像の領域を、既知のサンプル種についての対応する先験的情報と比較することができ、同様の基礎形状またはシグネチャーに基づいて、これらの領域は既知の広帯域シグネチャーに対応すると仮定される。

更に、測定された広帯域信号および既知の広帯域信号のシグネチャーの比較に基づいて、 複数の基準信号または基準スペクトルを推定することもできる。基準スペクトル推定モジュール１１５は、基準スペクトル・データベース１１４からの既知の広帯域信号に基づいて、測定された広帯域信号に対して処理を実行し、複数の基準スペクトルを生成することができる。これらの基準スペクトルは、広帯域信号を主に含むまたは広帯域信号から成る画像の追加領域を更に識別するために使用することができる。これらの領域は、有用な成分またはターゲット信号を有さないものとして、選択される、または「タグが付けられる」のでもよい。タグ付けは、領域選択インターフェース・モジュール１１７によって可能にすることができ、ユーザまたは本システムが、広帯域信号で主に構成された走査画像の領域を選択するまたは「タグ付けする」ことを可能にする。タグ付けされた領域は、無視されても、またはスペクトル・アンミキシング・モジュール１１９による処理から除外されてもよく、画像を構成する成分信号の混合からの所望のまたはターゲット信号の抽出を高速化することが可能になる。広帯域信号は、通例、１つの画像を通じて一定であるか緩やかに変化するので、ノイズ優勢領域には、領域選択インターフェース１１７によって自動的にタグを付けることができ、ある対象領域からタグを外す選択肢がユーザには与えられる。更に、ユーザは、量子ドットのような追加の信号または有用な信号を含むことが分かっている画像の領域を、スペクトル・アンミキシング・モジュール１１９によって処理されることが指定された領域として、予め選択すること、またはタグを付けることもできる。この望ましいまたは望ましくないとしての領域のタグ付けは、広帯域信号で主に構成され、したがって有用ではないかもしれない、またはノイズが多いと考えられ得る、画像の複数の領域を識別する。画像のこのようなノイズ優勢領域の認識は、残りの領域、即ち、ユーザに関心があると識別された領域のみの選択的なスペクトル・アンミキシングを可能にする。

領域選択に続いて、スペクトル・アンミキシング・モジュール１１９を呼び出して、画像の所望領域の成分信号をアンミックスすることができる。基準スペクトル推定モジュールによって推定された基準スペクトルは、画像におけるターゲット信号に対応する狭帯域信号を含む、複数の既知の信号を含むアレイまたは行列内に格納することができる。この行列は、画像の残りの領域をアンミックするために適用することができ、以下で更に詳細に示すように、１つ以上のターゲット信号の抽出を可能にする。例えば、線形スペクトル・アンミキシング・プロセスを利用して、推定された基準スペクトルを使用して走査信号における成分蛍光チャネルを分離し、信号抽出モジュール１２１を実行して、１組の１つ以上のターゲット信号を引き出すことができる。マルチチャネル画像における１つの画素のスペクトル・シグネチャーは、全ての異なる蛍光体のスペクトル・シグネチャーの線形組み合わせとして得られ、各シグネチャーは、その画素における各蛍光体の対応する重みによって重み付けされる。マルチチャネル画像では、蛍光体の組み合わせ毎に個々の重みを得る手段(access)が全くないことがあり得る。しかしながら、各画素のスペクトル・シグネチャーを引き出すことができる。各画素におけるスペクトル・シグネチャーを仮定して、各蛍光体の重みを画像画素毎に計算する数学的プロセスは、スペクトル・アンミキシングとして知られている。引き出された１組のスペクトルまたはターゲット信号を再現して、ノイズまたは望ましくないスペクトルが全くなく、したがって分析に適した画像を生成することができる。

更に、１組のターゲット信号は、後処理／高精度化モジュール１２３によって精度を高めることができる。後処理／高精度化モジュール１２３は、例えば、既知のノイズ源または明白なノイズ源を、同様の材料からの既知のまたは理想的な１組の信号と比較することによって、これらを排除する。例えば、２つの特定の量子ドットは、あるサンプル材料内には共存できないことが知られているということがあり得る。この「不可能性」は、後処理モジュール１２３によって認識され、妨害信号を除去することによって考慮され、後に、１組の精緻化したターゲット信号を残すことができる。既知の不可能性は、基準スペクトル・データベース１１４から、システムと通信する任意の他のデータ・ストア、あるいは病理医または見識のある技師というような、習熟したシステムの操作者から引き出すことができる。更に、強度の最小値または最大値を調節するというような、他の高精度化動作も、ターゲット信号に適用して、特定の範囲を強調し、その範囲外の信号を排除することができる。１組のターゲット信号から得られた画像は、ターゲット信号の一層動的な範囲を見るために、そのコントラストを調節することもできる。例えば、スペクトル・アンミキシングの後に得られるデータは、そのダイナミック・レンジに関して分解能が十分でないこともあり、したがって、明るさまたはコントラストの調節（アンミックスされたチャネルについて、画像コンテンツのダイナミック・レンジを人工的に広げる）によって、画像における異なる画素において、アンミックスされたチャネルがどの位強いか知覚することを、視覚的に一層容易にすることができる。このような調節は、アンミックスされたチャネルからの出力を研究することを可能にし、画像の理解を高める。他の撮像動作が実行されてもよく、得られる画像はいずれも、メモリ１１０に格納されたモジュールを実行および操作するためのインターフェースと共に、コンピュータ１２０のディスプレイ上に表示される。

前述のように、モジュールは、プロセッサ１２５によって実行されるロジックを含む。「ロジック」とは、ここでそして本開示全域で使用される場合、プロセッサの動作に影響を及ぼすために適用することができる命令信号および／またはデータの形態を有する任意の情報を指す。ソフトウェアは、このようなロジックの一例である。プロセッサの例は、コンピュータ・プロセッサ（処理ユニット）、マイクロプロセッサ、ディジタル信号プロセッサ、コントローラ、およびマイクロコントローラ等である。ロジックは、メモリ１１０のようなコンピュータ読み取り可能媒体上に格納された信号から形成することができる。メモリ１１０は、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、消去可能／電気的消去可能プログラマブル・リード・オンリ・メモリ（ＥＰＲＯＭＳ／ＥＥＰＲＯＭＳ）、フラッシュ・メモリ等を含む。また、ロジックは、ディジタルおよび／またはアナログ・ハードウェア回路、例えば、論理ＡＮＤ、ＯＲ、ＸＯＲ、ＮＡＮＤ、ＮＯＲ、およびその他の論理演算を含むハードウェア回路も含むことができる。ロジックは、ソフトウェアおよびハードウェアの組み合わせで形成されてもよい。ネットワーク上では、ロジックは、サーバまたはサーバの複合体上でプログラミングされてもよい。特定の論理ユニットは、ネットワーク上における１つの論理位置には限定されない。

図２は、本主題の開示の実施形態例によるスペクトル・アンミキシング方法を示す。図２の方法は、図１に示したモジュールに類似するモジュールを実行するコンピュータによって実行することができる。この方法は、ソースからサンプルの画像を受け取ることから開始する（Ｓ２３０）。ソースは、スキャナまたはスペクトル・カメラに関連付けられたまたは含む蛍光顕微鏡、あるいはある範囲の周波数において画像コンテンツを取り込むことができ、画像エネルギが多数の周波数において取り込まれる、ハイパースペクトル(hyperspectral)または蛍光撮像を可能にする任意のソース等である。前述のように、サンプルは、１つ以上の異なる蛍光体を含有する染料の塗布によって染色され、例えば、光源によって照明され、カメラによって画像が取り込まれるとよい。この画像は、コンピュータに供給され、コンピュータは、本方法例において説明する動作を実行するために、メモリ上に格納された論理命令を実行する。例えば、自己蛍光のような、画像における広帯域信号に対する基準スペクトルを推定する（Ｓ２３１）。このステップは、１つ以上の広帯域信号を、それらの一意のシグネチャーおよび画像にわたって遍在する散乱に基づいて認識する動作を含む。この画像のある領域は、自動蛍光等のような、広帯域信号を主に含む、または広帯域信号のみを含むと判定されることもあり得る。これらの信号の広帯域プロファイルは、画像にわたって遍在するその散乱と共に、これらの領域がターゲット信号からのピークのような有用な情報を全く含まない可能性が非常に高いという仮定を支持する。広帯域シグネチャーを有するコンポーネントを判定したとき、成分信号を、分析対象のサンプル材料に特定的な既知の広帯域シグネチャーと比較することもできる。例えば、 解剖または臨床病理学用システムが、組織サンプルの走査スライドを、既知の広帯域シグネチャーを有する同様の組織サンプルを含む較正スライドの画像と比較して、走査画像において測定された広帯域信号を識別することもできる。この判定は、更に、分析対象サンプルの種類に対する既知の広帯域シグネチャーに対応する複数の基準スペクトルを格納する基準スペクトル・データベースを参照することによって、可能にされてもよい。次いで、測定された広帯域信号から基準スペクトルを推定し、行列に格納することができる。

広帯域信号を主に含む、または広帯域信号から成る複数の領域が識別される。測定された広帯域信号から判定された基準スペクトルは、これらの領域を識別するために使用することができる。これらの領域には、無視されるまたは望ましくないとしてタグ付けすることができる（Ｓ２３３）。これらの領域に、アンミックスから除外するとしてタグ付けすることによって、画像を構成する成分信号の混合から、所望の信号またはターゲット信号の抽出の高速化を可能にする。広帯域信号は、通例、１つの画像を通じて一定であるかまたは緩やかに変化するので、ノイズ優勢領域には、自動的にタグを付けることができ、またはユーザによって選択されてもよい。更に、量子ドット等のような追加の信号または有用な信号を含むことが分かった画像の領域には、任意に、スペクトル・アンミキシングによって処理されることが指定されたものとして、タグ付けすることもできる（Ｓ２３５）。この望ましいまたは望ましくないという領域のタグ付けは、広帯域信号で主に構成され、したがって有用ではないかもしれない、またはノイズが多いと考えられ得る、画像の複数の領域を識別する。画像のこのようなノイズ優勢領域の認識は、残りの領域、即ち、ユーザに関心があると識別された領域のみの選択的なスペクトル・アンミキシングを可能にする。更に、画像の領域を選択するためのユーザ・インターフェースについて、図４を参照しながら説明する。

領域の選択に続いて、関心があることが示された画像の領域を、スペクトル・アンミキシング・プロセスによって、アンミックスしてそれらの成分信号を得ることができる（Ｓ２３７）。例えば、最小二乗法を使用する線形スペクトル・アンミキシング・プロセスを利用して、走査画像における成分蛍光チャネルを分離することもできる。スペクトル・アンミキシング・プロセスは、複数の基準信号を収容する行列、またはステップＳ２３１において判定された基準スペクトルを、測定された信号の混合に適用して、画像の複数のアンミックスされた成分信号を得る。例えば、基準スペクトルおよびターゲット信号に対応する複数の狭帯域信号が収容された行列を信号の混合に適用して、１組の成分信号を得ることができる。得られた１組の成分信号は、広帯域信号およびターゲット信号を含み、ターゲット信号を抽出することができる（Ｓ２３９）。１組の所望の信号を再現して、ノイズのあるスペクトルや望ましくないスペクトルが全くなく、したがって分析に適した画像を生成することができる。本明細書において説明したように、後処理／高精度化等のような、他の処理を１組の所望の信号に対して実行してもよい。

ミキシングおよびアンミキシングのためのプロセス例は、以下のようにすることができる。
Y = A*Xとし、ここで、ＹはＭ×Ｎ行列、ＡはＭ×Ｐ行列、そしてＸはＰ×Ｎ行列であり、走査画像はＭ個の画素を含み、スペクトル・シグネチャーはＮ個の周波数帯域にわたって測定されたので、Ｎ次元ベクトルであり、ミキシング・プロセスに寄与するＰ個の蛍光体がある。周波数は性質上物理的であるので、非負ミキシング・モデル(non-negative mixing model)を仮定し、Ａにおける各要素が負でないと仮定する。

１つの画素（ｉ番目の画素）について考えると、線形ミキシング・プロセスは以下のようになる。
y_i = Σa_ij x_j ここで、 1 <= j <= P（蛍光体の数）、y_iは、ｉ番目の画素のスペクトル・シグネチャーであり、Ｎ次元ベクトルである。 x_jは、ｊ番目の蛍光体のスペクトル・シグネチャーであり、Ｎ次元ベクトルである。そして、a_ijは、ｊ番目の蛍光体からｉ番目の画素への線形組み合わせ係数(linear combination factor)であり、ｉ番目の画素に対するスペクトル・シグネチャー y_i を構築する。これは物理的プロセスであるので、a_ij >= 0と仮定する。

アンミキシング・プロセスは次の通りである。尚、ミキシング項a_ijが非負であるとは仮定せず、Ａを推定する線形最小二乗解は、A’ = Y^†Xとなり、ここで、Y = AXであり、Y^† はＹの擬似逆数(pseudo-inverse)である。しかしながら、この解は、推定された行列Ａ’における各項が非負であることを保証しない。したがって、非負線形最少二乗法を呼び出す。ｉ番目の画素に対して、y_i = Σa_ij x_j となり、推定されたＡの項が {a’_ij}であると仮定する。次いで、||y_i - {Σ_{j=1, j=P} a’_ij x_j}||₂は、ｉ番目のスペクトル・シグネチャー y_i と、推定されたＡの項を使用して再現されたスペクトル・シグネチャー {Σ_j=1,j=P a’_ij x_j } との間におけるＬ_２ノルム距離であり、これについて考えると、最良の解は、ノルム ||y_i - {Σ_{j=1, j=P} a’_ij x_j}||₂ を最少化する１組のａ’項、{ a’_ij}_j=1,j=P となる。

ａ’項を得るための解モードは、以下の通りである。最初に、|| y_i - {Σ_{j=1, j=P} a’_ij x_j} ||₂ を最少化するために、制約のない最少二乗を実行し、解空間において、ａ’におけるどの項が非負であり、どの項が負であるか観察する。次いで、解空間において、Ｌ_２ノルムを最少化するようなａ’項（非負である次元は維持されるが、非負でない次元は０に減らされる）を求める。各事例について、正しいインデックスを保存するためにラグランジュ乗数に基づく定式化を使用する（{a’_ij}における項について検討し、ここで、1<=j<=Pであり、ラグランジュ乗数のフォーマットにおいて、対応する乗数を、負項に対してマイナス無限大に設定する）。非負線形最少二乗回答プログラムにおける解決プロセスは、繰り返しプロセスとなる。各繰り返しにおいて、非負であり他の次元をゼロにする{a’_ij}における次元（Ｐ個の項以外）について検討し、この非負集合を使用して中間解を得る。各集合において、解ベクトルを非負にするように、現在の解ベクトルに適用される摂動を決定するために、この中間解が使用される。非負線形最小二乗解決プロセスについての更なる詳細は、Lawson, C.L. and R.J. Hanson, Solving Least Squares Problems（最少二乗問題の解決法）, Prentice-Hall, 1974, Chapter 23, p. 161において見出すことができる。

図３は、本主題の開示の実施形態例にしたがって基準スペクトルを推定する方法を示す。図３の方法は、図１に示したモジュールと同様のモジュールを実行するコンピュータによって実行することができる。この方法は、蛍光顕微鏡のようなソースによって供給されたサンプルの画像を使用して開始する（Ｓ３４０）。前述のように、このサンプルは、１つ以上の異なる蛍光体を含有する染料の塗布によって染色され、光源によって照明され、カメラによって画像を取り込むことができる。画像はコンピュータに供給され、コンピュータは、この方法例において説明する動作を実行するためにメモリに格納された論理命令を実行する。例えば、サンプルの種類を判定することができる（Ｓ３４１）。これは、ユーザ等によって入力された、画像に関連付けられたタグまたはメタデータを調べることによって行うことができる。サンプルの種類は、データベース参照が、特定のサンプル種類に対して既知の広帯域シグネチャーを引き出すことを可能にする（Ｓ３４３）。基準スペクトル・データベース３１４は、ステップＳ３４１において識別されるような、分析対象サンプルの種類に類似した組織種類に対応する複数の既知の広帯域シグネチャーを格納することができる。例えば、解剖または臨床病理学用システムが、組織サンプルの走査スライドを、同様の組織サンプルに対する既知の広帯域シグネチャーと比較して、走査画像において広帯域信号を識別することもできる。

その後、例えば、分析対象サンプル材料に特定的な既知の広帯域または狭帯域シグネチャーとの比較に基づいて、広帯域プロファイルを有する画像の測定された成分信号を判定することができる（Ｓ３４５）。例えば、前立腺組織が所与の周波数範囲にわたって分析されている場合、種々の蛍光体に対する既知の広帯域または狭帯域信号を、既存の前立腺組織サンプルから収集することができる。胸部または結腸のような他の組織サンプルでは、ＤＡＰＩスペクトルが多少異なる可能性があり、したがって、信頼性のあるアンミキシングのために、「正しい」サンプル（この例の場合、前立腺サンプル）から、既知の広帯域スペクトルを抽出するとよい。更に、狭帯域スペクトル（量子ドットのような）は、基準スペクトルにおいて無視できるばらつきを有し、したがって、既知のシグネチャーが何らかの他のサンプルから抽出される場合、これは殆ど問題にならない。言い換えると、結腸／胸部からの量子ドット・スペクトルは、前立腺からの量子ドット・スペクトルと類似する。

次いで、画像において測定された広帯域信号から、複数の基準信号を推定する（Ｓ３４７）。このプロセスは、較正スライドに対する基準スペクトルの生成に類似する。例えば、画像の広帯域優勢領域内にある複数の画素の広帯域シグネチャーを平均して、画像に対する基準信号を判定してもよい。このプロセスは、特定の組織種類に対する自己蛍光のように、複数の広帯域信号毎に繰り返すことができる。このような広帯域信号は、特定のスライドにわたって実質的に均一であるか、または緩やかに変化すると考えられ、それらの一意のシグネチャーとステップＳ３４３において引き出されたシグネチャーとの比較、および画像にわたって遍在する散乱に基づいて認識し、基準スペクトルを推定するために使用することができる。推定された基準スペクトルは、スケーリングされたバージョンの推定基準スペクトルおよびターゲット信号に対する複数のシグネチャーを含む基準行列を満たすために使用することができる（Ｓ３４９）。この基準行列は、非負線形最小二乗法を使用して、観察された信号の混合をアンミックスし、画像の複数のアンミックス成分信号に到達するために使用することができる。

例えば、１６の蛍光チャネルから成る被観察信号をＹとする。基準行列Ｘは、６つまでの既知のシグネチャーに対して複数の基準スペクトルを含む。基準行列Ｘを被観察信号Ｙに適用し、被負最少二乗法に基づく最小化フレームワーク(minimizer framework)を使用すると、所望の結果 A が得られる。（A = {a_j} 、ここで、 a_jはｊ番目の蛍光体のこの現在の画素に対する寄与を示し、６つの蛍光体がアンミキシングのために考慮されるとき 1<=j<=6である）。言い換えると、Ｙ＝ＡＸであり、ここで、Ｙは１×１６行列であると考えることができ（この現在の画素における観察ベクトルは、１６の周波数帯域に対して得られ、１６次元スペクトルを生成する）、基準スペクトル行列Ｘは、例えば、６×１６行列とすることができ、各行は、例えば、１×１６とすることができ、ある蛍光体の基準スペクトルに対応する。

図４は、本主題の開示の実施形態例による、走査画像の領域にタグ付けするためのユーザ・インターフェース４５０を示す。ユーザ・インターフェース４５０は、コンピュータ４２０のディスプレイ上に表示することができ、図１において説明したモジュールの内の１つのようなアプリケーションであり、コンピュータ４２０に結合されたプロセッサによって実行することができる。インターフェース４５０は、サンプルを保持するスライドの画像４５１を示す。サンプルは、例えば、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織サンプルのような、人間または動物の被験者から得られた組織切片の形態をなす。サンプルは、生体細胞組織、冷凍細胞、腫瘍細胞、血液、咽喉培養、またはその他でもよく、サンプルの種類や性質は特段重要ではない。図４に示すサンプル画像４５１は、背景上に重ねられた構造を含む。インターフェース４５０は、マウスまたはキーボードのような入力デバイスによって操作することができる。図示のように、マウスが領域４５７を選択しており、応答して、選択肢４５９の提示が表示される。選択肢４５９は、選択された領域から信号を抽出する、選択された領域を基準として設定する、既存の基準を選択された領域に適用する、アンミキシングのために領域にタグ付けする、またはアンミキシングの間無視する領域にタグ付けするというような、インターフェース４５０によって実行することができる複数のアクションを示す。

例えば、この実施形態例は、領域４５３および４５５を、それぞれ、ＲＥＦ１およびＲＥＦ２とタグ付けして示す。これは、ユーザ、またはソフトウェア自体が、領域４５３および４５５を、広帯域信号を主に含むと認識していることを意味する。このタグ付けは、これらの領域から信号を抽出するコマンド、およびこれらの信号のこの種のサンプルに対する既知のシグネチャーとの相関付けに続いて実行することができる。例えば、画像４５１は、組織切片の画像であってもよく、領域４５３は、自己蛍光性が優勢な組織の一部であり、領域４５５は広帯域優勢アーチファクトである。更に、対象領域が、領域４５５と背景との間にある領域であってもよく、ユーザによって領域４５７として選択される。ここで、ユーザは、領域４５７から信号を抽出する選択肢を有し、この選択肢は基準信号に基づいてこの領域の成分信号をアンミキシングすることを含むことができる。ユーザは、領域ＲＥＦ２ ４５５およびＲＥＦ１ ４５３からの広帯域信号に基づいて、基準信号を設定してあってもよい。ユーザは、ノイズの多い広帯域信号を排除しターゲット信号を抽出するように、ＲＥＦ１およびＲＥＦ２の内１つ以上を、領域４５７上におけるアンミキシング・プロセスに適用することができる。更に、ユーザは、単に、領域４５７がアンミックスされる１つであるとしてタグ付けし、画像４５１内にある追加領域に基づいて、タグ付けを継続する、あるいは基準スペクトルを抽出するまたは設定するのでもよい。ユーザ・インターフェース４５０には他の選択肢も設けることができ、本開示を読めば当業者には他の選択肢は明白であろう。

図５は、本主題の開示の実施形態例にしたがって、所望の信号を精緻化する方法を示す。図５の方法は、図１に示したモジュールのようなモジュールを実行するプロセッサによって実行することができる。この方法は、１つ以上の所望の信号の抽出を可能にするために、基準スペクトル行列を使用して、画像または画像の領域のスペクトル・アンミキシングから導き出される複数の成分信号の受け取り時に開始する（Ｓ５７０）。続いて、サンプル種類を判定する（Ｓ５７１）。これは、ユーザ等によって入力された、画像に関連付けられたタグまたはメタデータを調べることによって、行うことができる。サンプルの種類は、データベースを参照することによって、一例として、特定のサンプル種類に対する既知のターゲット成分信号を引き出すことを可能にする（Ｓ５７３）。既知のターゲット信号は、特定のサンプル種類以外の何かに基づくこともできる。例えば、ターゲット信号は、考慮対象の周波数帯域に、そして組織にも依存する。同じ組織サンプルについて、１つの構成におけるフィルタ帯域が非常に少数であり、および他の(another other)構成におけるフィルタ帯域が非常に多数である場合、これら２つの構成によって得られる２つのスペクトル間には、なんらかの些細な変化または微弱な変化が生ずる場合がある。同じスペクトル構成、即ち、同じ１組のフィルタ帯域に対して、撮像される組織が、スペクトル・シグネチャーが多少ばらつく原因となる可能性がある。以前に説明したように、既知の広帯域スペクトルは、異なる種類の組織から取得されるとき、多少変化する可能性がある。

データベース５１４は、例えば、分析対象のサンプルの種類に対応する、１組以上の既知の所望のターゲット信号またはターゲット信号を格納することができる。引き出された複数組の既知の成分は、測定された成分信号と比較され、ノイズまたは不可能なスペクトルが存在するか否か判定することができる（Ｓ５７５〜Ｓ５７７）。例えば、解剖または臨床病理学用システムは、組織サンプルの画像において測定された量子ドットを、既知の量子ドット集合と比較して、その組織サンプルにおいて共存することができない量子ドットのノイズ成分または同時発生(co-incidence)が存在するか否か判定することができる。何らかのノイズが発見された場合、本方法は、妨害成分信号を除去することによって、既知のノイズ源または明らかなノイズ源を排除する（Ｓ５７６）。更に、データベース５１４から引き出された既知の成分を使用して、不可能性が存在するか否か判定する（Ｓ５７７）。例えば、２つの特定的なマーカ、例えば、量子ドットが、あるサンプル材料においては共存できないことが分かっていることもある。また、共通の問題の１つに、細胞（ＤＡＰＩで染色された）の境界上で発見されることが多い自己発光があり、このような発生が純粋にアンミキシングのアーチファクトであることが分かっている場合、妨害成分（この場合、自己蛍光）を除去することができる。また、量子ドットは、一般に、ＤＡＰＩ染料を含有する細胞核上に現れる。したがって、重要性が低い量子ドット（蛍光体a_ij の寄与が大きいとき、これを重要性が高い寄与と呼ぶ）が分離(isolation)において発見された場合（ＤＡＰＩではない）、これは誤った量子ドット検出であり、この量子ドットを破棄することによって、この誤りを正すことができる。また、２つの量子ドット、例えば、量子ドットＡおよび量子ドットＢが共存することが知られていないこともある。このような場合、重要度が低い量子ドットＡの検出、および重要度が高い量子ドットＢの検出があったとき、量子ドットＡの検出が、アンミキシングのアーチファクトである可能性が高く、ノイズ成分（量子ドットＡ）は排除される。量子ドットの振幅は、その蛍光体の影響を無視するために、他の蛍光体よりもＸ倍大きくてもよい。例えば、Ｘ＝２０であり、量子ドット強度が、測定されたスペクトル重要度の３００単位である場合（即ち、ハイパースペクトル画像の画素強度に関して）、アンミキシングの後、いずれかの蛍光体が（３００／２０＝１５）未満の値を有することが発見された場合、その蛍光体の影響を無視することができる。

これらおよびその他の不可能性は、妨害信号を除去し、１組の精緻化した所望の信号を後に残すことによって、認識し考慮に入れることができる（Ｓ５７８）。既知の不可能性は、データベース５１６、５１４、またはシステムと通信する任意の他のデータ・ストア、あるいは、病理医または見識のある技師というような、習熟したシステムの操作者から引き出すことができる。言い換えると、分析対象サンプルの種類について分かっていることは、データベースによってまたはシステムの操作者によって提供することができ、このような先験的な知識は、ノイズを排除し、結果を精緻化し、そして今後の分析または診断に適した明白な画像を生成するときに有用である。

図６Ａおよび図６Ｂは、本主題の開示の実施形態例による、検出された発光スペクトルの初期画像および処理後の画像を示す。図６Ａは、スペクトル・アンミキシングまたは他のプロセスによってアンミックスされた複数の成分信号を表すグラフ６８０を示す。複数の成分信号は、広帯域信号６８１および６８２、ならびに量子ドット信号６８４、６８５、６８６、６８７、および６８８を含む。広帯域除去および後処理に続いて、図６Ｂは、診断または分析のための画像を生成するために使用することができる、精緻化したターゲット信号だけを表すグラフ６９０を示す。例えば、サンプル種類に依存して、量子ドット６８４および６８７は共存できないが、量子ドット６８４、６８５、６８６、および６８８は全て特定のサンプル種類に対して共存できることが分かっていることもある。したがって、図５に示したような後処理高精度化方法は、このような不可能性を示し、妨害信号６８７を、精度が高められた１組の信号から除去する。その結果、特定のサンプルについての既知の情報が、一層明確な画像の生成、および一層高い精度の分析を可能にすると考えられる。

図７は、主題の開示の実施形態例による、複数の正規化基準スペクトルを示す。正規化基準スペクトルは、４００〜８００ｎｍの周波数帯域について示され、異なる蛍光体は、キー７９１において識別されるように、量子ドット５６５（ｑｄ５６５）、量子ドット５８５（ｑｄ５８５）、量子ドット６０５（ｑｄ６０５）、量子ドット６５５（ｑｄ６５５）、ＤＡＰＩ、ＲＢＣ（赤血球）、およびスライド背景（SlideBK）を含む。この実施形態によれば、量子ドット・スペクトルは非常に狭い帯域のスペクトルであり、例えば、ｑｄ６５５は、非常に狭帯域なスペクトルであり、６５５ｎｍにおいてピークに達するが、その帯域幅（ピーク値の１０％未満に落ちるとき）は１００ｎｍ未満である。量子ドット・スペクトルは狭帯域であるが、ＤＡＰＩ、ＲＢＣ、およびSlideBKは広帯域スペクトル・シグネチャーを有することが分かる。また、ミキシング・プロセスに関与する多くの蛍光体が広帯域スペクトルを有するという事実は、線形アンミキシングにおいて、即ち、ミキシング・プロセスに関係する重み項を正確に復元するときに問題を生ずる。スペクトル・シグネチャーが存在し、各シグネチャーが他よりも異なる程、基準シグネチャー間において、識別性が高くなり、更にアンミキシングの精度が高くなる。

図８Ａ〜図８Ｄは、本主題の開示の実施形態例によるアンミキシングの結果として示される、複数の推定スペクトルを示す。各事例において、被観察スペクトルがプロットされ、本明細書において開示した方法にしたがって、スペクトル・アンミキシングが実行され、蛍光体毎のスペクトル・シグネチャーがプロットされ、スペクトル・アンミキシングによって得られた重み付け項によって重み付けされ、推定スペクトルがプロットされる。推定スペクトルは、蛍光体の基準スペクトルの線形組み合わせとして得られ、スペクトル・アンミキシングの後に得られた重み付け項が使用される。ソースと推定スペクトルとの間の緊密性は、本明細書において説明したアンミキシング・プロセスの有効性を示す。

したがって、開示したシステムおよび方法は、広帯域ノイズや望ましくない蛍光アーチファクトが全くない、実質的に所望の信号または正確な信号から成る画像の生成を可能にする。例えば、自己蛍光、ＤＡＰＩ、およびその他の望ましくないシグネチャーを、組織サンプルの操作画像から削除し、生物学的に関連がある情報だけを後に残すことができる。更に、一旦特定のスライドまたは１組のスライドに対して広帯域またはノイズ支配領域が判定されたなら、これらの領域をアンミックする必要はなく、アンミックス・プロセスの集約性が低下する。したがって、開示した特徴は、効率的な画像分析、構造の識別、および高精度な診断等を可能にする。ＲＢＣのようなアーチファクトからの広帯域信号、リポフスチンからの自己蛍光等は、もはや量子ドット等のような所望の蛍光信号を隠すことも、圧倒することもできない。解剖または臨床病理学、前立腺／肺癌診断等のような医療用途以外にも、地質学または天体学データの遠隔検知等というような、他の種類のサンプルを分析するためにも、同じ方法を実行することができる。更に、開示した方法は、結果を精緻化するために、繰り返し反復することもできる。大きなまたは多数のスライド／画像分析、あるいは１つ以上の画像キューブを分析するために、本明細書において説明した動作をハードウェア・グラフィクス処理ユニット（ＧＰＵ）に移植することもでき、マルチスレッド並列の実施態様が可能になる。

本主題の開示の実施形態例の以上の開示は、例示および説明の目的に限って提示されたのである。これは、網羅的であることも、開示した形態そのものに主題の開示を限定することも意図していない。本明細書において説明した実施形態の多くの変形および変更は、以上の開示を考慮すれば、当業者には明白であろう。主題の開示の範囲は、添付された特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定められるものとする。

更に、本主題の開示の代表的な実施形態を説明するにあたり、本明細書は、本主題の開示の方法および／またはプロセスを、特定のステップのシーケンスとして紹介したこともあった。しかしながら、本方法およびプロセスが本明細書において明記された特定の順序には頼らないのであるからには、本方法またはプロセスは、説明した特定のステップのシーケンスには限定されなくてしかるべきである。他のステップのシーケンスが可能である場合もあることは、当業者には認められよう。したがって、本明細書において明記された特定のステップの順序は、特許請求の範囲に対する限定と解釈してはならない。加えて、本主題の開示の方法および／またはプロセスに向けられた請求項は、記載された順序でそのステップを実行することに限定されなくてしかるべきであり、シーケンスは異なってもよく、それでもなお本主題の開示の主旨および範囲内に該当し続けることは、当業者には容易に認めることができよう。

Claims (38)

1. 動作を実行するためにプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納する非一時的コンピュータ読み取り可能媒体であって、
   信号の混合を含む画像を受け取る動作であって、前記信号の混合が、更に、測定された広帯域信号とターゲット信号とを含む、動作と、
   前記画像の第１領域の位置を検出する動作であって、前記第１領域が、前記測定された広帯域信号を主に含み、前記検出が、前記測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づく、動作と、
   前記測定された広帯域信号に基づいて、前記画像に対する基準信号を推定する動作と、
   前記基準信号を利用して、前記混合をスペクトル的にアンミックスする動作と
   を含む、非一時的コンピュータ読み取り可能媒体。
2. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記既知の広帯域信号が、較正画像から受け取られる、コンピュータ読み取り可能媒体。
3. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記比較が、前記測定された広帯域信号のシグネチャーを、前記既知の広帯域信号のシグネチャーと比較する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
4. 請求項３記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記画像の複数の画素をサンプリングし、各画素から画素シグネチャーを抽出し、前記抽出した画素シグネチャーを平均して前記測定された広帯域信号のシグネチャーを判定することによって、前記測定された広帯域信号のシグネチャーが判定される、コンピュータ読み取り可能媒体。
5. 請求項４記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記第１領域の位置を検出する動作が、更に、前記測定された広帯域信号のシグネチャーを前記画像に適用する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
6. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記動作が、更に、前記第１領域に、アンミキシングから除外されるとしてタグ付けする動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
7. 請求項６記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記タグ付けが、ユーザ・インターフェースを介して行われる、コンピュータ読み取り可能媒体。
8. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体であって、更に、前記基準信号を含む行列を生成する動作を含み、前記行列が、前記混合をスペクトル的にアンミックするために使用される、コンピュータ読み取り可能媒体。
9. 請求項８記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記行列が、更に、前記ターゲット信号に対応する狭帯域信号を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
10. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記測定された広帯域信号が、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）信号、および自己発光信号の内１つ以上を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
11. 請求項１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記ターゲット信号が、複数のターゲット信号の内の１つであり、前記動作が、更に、１組の精緻化したターゲット信号を抽出するために、前記複数のターゲット信号を精緻化する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
12. 請求項１１記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記精度を高める動作が、更に、既知のノイズおよび不可能性の内１つ以上を、前記複数のターゲット信号から排除する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
13. 請求項１１記載のコンピュータ読み取り可能媒体であって、更に、前記１組の精緻化したターゲット信号から第２画像を生成する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
14. 動作を実行するためにプロセッサによって実行されるコンピュータ実行可能命令を格納する非一時的コンピュータ読み取り可能媒体であって、
    画像の広帯域優勢領域を検出する動作であって、前記画像が、広帯域信号とターゲット信号との混合を含む、動作と、
    前記広帯域優勢領域から基準信号を推定する動作と、
    前記ターゲット信号を抽出するために、前記基準信号を使用して前記混合をアンミックする動作と
    を含む、非一時的コンピュータ読み取り可能媒体。
15. 請求項１４記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記動作が、更に、前記広帯域優勢領域のシグネチャーを、既知の広帯域信号のシグネチャーと比較する動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
16. 請求項１４記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記広帯域優勢領域が、前記アンミキシングから除外される、コンピュータ読み取り可能媒体。
17. 請求項１６記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記動作が、更に、アンミキシングのために、前記画像のターゲット領域の選択を受け取る動作を含む、コンピュータ読み取り可能媒体。
18. 請求項１４記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記基準信号が、行列の一部である、コンピュータ読み取り可能媒体。
19. 請求項１８記載のコンピュータ読み取り可能媒体において、前記行列が、前記混合をアンミックスするために使用される、コンピュータ読み取り可能媒体。
20. 組織試料の診断システムであって、
    プロセッサとメモリとを含むコンピュータと、
    前記メモリ上において、画像の第１領域の位置を検出する基準スペクトル判定モジュールであって、前記画像が、測定された広帯域信号とターゲット信号との混合を含み、前記第１領域が前記測定された広帯域信号を主に含み、前記検出が、前記測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づき、更に前記測定された広帯域信号に基づいて前記画像に対する基準信号を推定する、基準スペクトル判定モジュールと、
    前記メモリ上において、前記基準信号を含む行列を前記混合に適用し、前記ターゲット信号を導き出すために前記行列を使用して前記混合をアンミックスするアンミキシング・モジュールと
    を含む、システム。
21. スペクトル・アンミキシング方法であって、
    走査画像を生成するために、蛍光顕微鏡を使用して染色された材料のサンプルを保持するスライドを走査するステップであって、前記材料が、１つ以上の異なる蛍光体を含有する染料の塗布によって、染色され、前記走査画像が、信号の混合を含み、前記信号の混合が、更に、測定された広帯域信号とターゲット信号とを含む、ステップと、
    前記画像の第１領域の位置を検出するステップであって、前記第１領域が前記測定された広帯域信号を主に含み、前記検出が、前記測定された広帯域信号と既知の広帯域信号との比較に基づく、ステップと、
    前記測定された広帯域信号に基づいて、前記画像に対して基準信号を推定するステップと、
    前記基準信号を利用して、前記混合をスペクトル的にアンミックするステップと
    を含む、スペクトル・アンミキシング方法。
22. 請求項２１記載の方法において、前記既知の広帯域信号が、較正画像から引き出される、方法。
23. 請求項２１記載の方法において、前記比較が、前記測定された広帯域信号のシグネチャーを、前記既知の広帯域信号のシグネチャーと比較する動作を含む、方法。
24. 請求項２３記載の方法において、前記画像の複数の画素をサンプリングし、各画素から画素シグネチャーを抽出し、前記抽出した画素シグネチャーを平均して前記測定された広帯域信号のシグネチャーを判定することによって、前記測定された広帯域信号のシグネチャーが判定される、方法。
25. 請求項２４記載の方法において、前記第１領域の位置を検出するステップが、更に、前記測定された広帯域信号のシグネチャーを前記画像に適用するステップを含む、方法。
26. 請求項２１記載の方法であって、更に、前記第１領域に、アンミキシングから除外されるとしてタグ付けするステップを含む、方法。
27. 請求項２６記載の方法において、前記タグ付けが、ユーザ・インターフェースを介して行われる、方法。
28. 請求項２１記載の方法であって、更に、前記基準信号を含む行列を生成するステップを含み、前記行列が、前記混合をスペクトル的にアンミックスするために使用される、方法。
29. 請求項２８記載の方法において、前記行列が、更に、前記ターゲット信号に対応する狭帯域信号を含む、方法。
30. 請求項２１記載の方法において、前記測定された広帯域信号が、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）信号、および自己発光信号の内１つ以上を含む、方法。
31. 請求項２１記載の方法において、前記ターゲット信号が、複数のターゲット信号の内の１つであり、前記方法が、更に、１組の精緻化したターゲット信号を抽出するために、前記複数のターゲット信号を精緻化するステップを含む、方法。
32. 請求項３１記載の方法において、前記精度を高めるステップが、更に、既知のノイズおよび不可能性の内１つ以上を、前記複数のターゲット信号から排除するステップを含む、方法。
33. 請求項３１記載の方法であって、更に、前記１組の精緻化したターゲット信号から第２画像を生成するステップを含む、方法。
34. 請求項２１〜３３のいずれか１項記載の方法において、前記サンプルが生物学的サンプルである、方法。
35. 請求項３４記載の方法において、前記生物学的サンプルが、組織サンプル、任意に前立腺組織サンプル、胸部組織サンプル、または結腸組織サンプルである、方法。
36. 請求項２１〜３５のいずれか１項記載の方法において、前記１つ以上の異なる蛍光体の数が、２ないし１０である、方法。
37. 請求項３６記載の方法において、前記蛍光体が、１つ以上のナノ結晶半導体蛍光体を含み、前記ナノ結晶半導体蛍光体の各々が、異なる波長領域において、ピーク発光応答を生成する、方法。
38. 請求項３７記載の方法において、前記ナノ結晶半導体蛍光体が、１つ以上の量子ドットを含む、方法。

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