JP2016512441A - 正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングするためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングするためのシステムおよび方法に関する。【解決手段】正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングするためのシステムおよび方法が提供される。【選択図】図５

Description

関連出願に対する相互参照
[0001] 本出願は、ＭＯＤＥＬＩＮＧ ＴＨＥ ＢＲＡＩＮ ＤＹＮＡＭＩＣＳ ＩＮ ＮＯＲＭＡＬ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＤ ＳＴＡＴＥＳという表題の２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願公開第６１／７５９，３６３号に対する優先権を主張し、その内容全体が、全ての目的で参照により本明細書に援用される。

連邦支援の研究または開発に関する記述
[0002] 本発明は、国立衛生研究所により授与される助成金番号第ＥＢ００８７３８の下で政府支援により行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

[0003] 本発明は概して、脳動態（brain dynamics）をモデリングするための、より詳細には正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングするためのシステムおよび方法に関する。

[0004] 正常状態、および神経学的に罹患状態に関する脳ネットワーク機能動態は、ほとんど未知である。本発明は、関連する脳ネットワーク機能動態の高精度の知見を伴う疾患モデルを創出するために、および脳機能ネットワーク動態を長期にわたって（longitudinally）証明するために、設計された新たな方法論を提供し、定量的設計および治療選択肢の評価を可能にする。このアプローチを使用して、特定の脳動態を変更させることを直接的に目的とするように、治療法を設計および評価した。例えば、このアプローチは、薬物、神経刺激、局所手術、細胞および遺伝子治療の開発の利益を享受し得る。

[0005] 神経学的疾患を研究するための従来の動物モデルは、機械的損傷、薬物送達、電気刺激および遺伝子変化を使用して作製される。続いて、動物モデルは、行動アッセイ、電気的記録、解剖学的評価およびｅｘ ｖｉｖｏでの免疫組織化学により特徴付けられる。本発明のアプローチは有益であり、従来のモデリングの様々な欠点を克服する。

[0006] 提唱される本発明は、その正確な細胞型特異的脳機能に基づいて、神経学的障害を創出、規定および分類するための特有の初めての機会を創出する。さらに、有効性を評価するために治療法が施されると同時に、提唱される本発明は、長期にわたって正確にモニタリングされ得る。提唱される本発明はまた、評価に加えて、罹患された脳機能を変更させるための治療法の有効な設計を可能にする。

[0007] オプトジェネティック刺激および機能的磁気共鳴画像法の読み出しを使用して、正確な起源および相当する脳ネットワーク動態を有する動物モデルを創出する方法を同定し得る。発作および他の罹患状態に関連したモデルが創出され得る。

[0008] 提唱される本発明の各種態様は、ヒト療法開発を導くための前臨床方法として使用され得る。

[0009] 本発明の各種態様は、正確な起源および関連ネットワーク、アルツハイマー病ネットワーク、パーキンソン病嗜癖ネットワークを有する発作モデル、ごくわずかに意識のある患者に関連したＤＢＳ標的ネットワークならびに他の正常状態および罹患状態を有する発作モデルを研究および同定するのに使用されている。

[0010] 本発明の各種態様は、正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法であって、脳における罹患状態モデルを創出する工程と、オプトジェネティック刺激および機能的磁共鳴画像法（ｆＭＲＩ）画像に基づいてモデルを分類する工程とを含む方法に関する。

[0011] 本方法は、さらなる測定を行って、光応答性刺激中の分類に基づいて脳波（ＥＥＧ）測定を解釈する工程をさらに含み得る。

[0012] さらなる測定は、ＥＥＧを使用して行われ得る。

[0013] 罹患状態モデルは、発作のモデルであり得る。

[0014] 罹患状態モデルは、発作の動物モデルであり得る。

[0015] 発作は、背側ＣＡ１刺激、中間ＣＡ１刺激、腹側ＣＡ１刺激または海馬台の少なくとも１つから発生し得る。

[0016] 本方法は、神経刺激および薬物設計に関して発作の動物モデルを使用する工程をさらに含み得る。

[0017] 本発明の各種態様は、正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法をであって、細胞型特異性を用いたオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）により、迷走神経刺激（ＶＮＳ）の作用機序を同定する工程と、別個の発作型を発生させ、いずれの発作型か同定するために各発作型に関してＶＮＳの有効性を評価して、各発作型に関する特有の脳波（ＥＥＧ）の形跡を同定する工程と、ＥＥＧおよび発作と同期されたｆＭＲＩにより患者におけるＥＥＧの形跡を同定する工程とを含む方法を提供する。

[0018] 本方法は、ＶＮＳの作用機序を確認するために、ＶＮＳと同期されたｏｆＭＲＩを行う工程をさらに含み得る。

[0019]本発明の各種態様は、正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法であって、脳における罹患状態モデルを創出する工程と、オプトジェネティック刺激および機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）画像に基づいてモデルを分類する工程とを含む方法を提供する。

[0020] 本方法は、さらなる測定を行って、光応答性刺激中の分類に基づいて脳波（ＥＥＧ）を解釈する工程をさらに含み得る。

[0021] さらなる測定は、ＥＥＧを使用して行われ得る。

[0022] 罹患状態モデルは、発作のモデルであり得る。

[0023] 罹患状態モデルは、発作の動物モデルであり得る。

[0024] 発作は、背側ＣＡ１刺激、中間ＣＡ１刺激、腹側ＣＡ１刺激または海馬台刺激のうちの少なくとも１つから発生し得る。

[0025] 本方法は、神経刺激および薬物設計に関して発作の動物モデルを使用する工程をさらに含み得る。

[0026] 本発明の各種態様は、正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法を提供し、この方法は、細胞型特異性を用いたオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）により、神経刺激の作用機序を同定する工程と、別個の発作型を発生させ、いずれの発作型か同定するために、各発作型に関して神経刺激の有効性を評価して、各発作型に関する特有の脳波（ＥＥＧ）の形跡を同定する工程と、ＥＥＧおよび発作と同期されたｏｆＭＲＩにより患者におけるＥＥＧの形跡を同定する工程とを含む。

[0027] 本方法は、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、深部脳刺激（ＤＢＳ）および応答性神経刺激（ＲＮＳ）のうちの１つであり得る神経刺激をさらに含み得る。

[0028] 本方法は、神経刺激の作用機序を確認するために、神経刺激と同期されたｏｆＭＲＩを行う工程をさらに含み得る。

[0029] 神経刺激は、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、深部脳刺激（ＤＢＳ）および応答性神経刺激（ＲＮＳ）のうちの１つであり得る。

[0030] 本発明の各種態様は、正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法を提供し、この方法は、背内側、内側、腹内側および／または外側ＣＡ１領域において、錐体ニューロンをオプトジェネティック的に刺激する工程と、オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）を用いて、連関した脳ネットワークを通じて発作をモニタリングする工程と、ｏｆＭＲＩ活動の位置での局所電場電位および単一ユニット記録を測定する工程とを含む。

[0031] オプトジェネティック的に刺激する工程は、阻害性介在ニューロンまたは通路の線維（fibers of passage）の直接的な刺激を起こすことなく遂行され得る。

[0032] オプトジェネティック的に刺激する工程は、短期持続活動(short lasting activity)を発生するように２０Ｈｚ未満の周波数刺激を利用して遂行され得る。

[0033] オプトジェネティック的に刺激する工程は、短期持続活動を発生するように６〜１０Ｈｚの周波数刺激を利用して遂行され得る。

[0034] オプトジェネティック的に刺激する工程は、２０Ｈｚを超える周波数刺激を用いて遂行され得る。

[0035] オプトジェネティック的に刺激する工程は、長期持続活動を発生するように２０〜６０Ｈｚの周波数刺激を利用して遂行され得る。

[0036] オプトジェネティック的に刺激する工程は、４０Ｈｚの光刺激を用いて遂行され得る。

[0037] 本方法は、錐体ニューロンを刺激および阻害するために、ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰまたはＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙの少なくとも１つを注射する工程と、ニューロンをオプトジェネティック的に誘発するために、青色および黄色光の少なくとも１つを適用する工程とをさらに包含し得る。

[0038] 青色光が、毎秒１、１０、６０または１００サイクルで送達され得る。

[0039] 青色光が、脳をスキャンしながら、毎秒１０、６０または１００サイクルで、毎分２０秒間で総計６分間送達され得る。

[0040] 本発明の方法および装置は、本明細書中に組み込まれる添付の図面および本発明のある特定の原理を説明するのにともに役立つ以下の発明を実施するための形態から明らかであるか、またはそれらでより詳細に記載される他の特色および利点を有する。

[0041]図１ａおよび図１ｂは、背側ＣＡ１における興奮性ニューロンから発生する発作を示す図である。エレクトログラフ発作（electrographic seizure）は、行動出力をもたない。発作は、前頭皮質へ伝播せず、また視床前部（Anterior Thalamus）に関与しない。 [0042] 図２ａおよび図２ｂは、腹側ＣＡ１における興奮性ニューロンから発生する発作を示す図である。強直間代性(tonic-clonic)行動発作を伴うエレクトログラフ発作。発作は、前頭皮質へ伝播するが、視床前部に関与しない。 [0043]図３ａは、視床前部（ＡＶ）が図２と同じ発作型に関与しないことを示す。図３ｂは、海馬台における興奮性ニューロンに由来する、観察された明らかな関与を示す。 [0044] 図４ａおよび図４ｂは、ＶＮＳと同期されたｆＭＲＩを示す。 [0045]錐体背側ＣＡ１細胞のオプトジェネティックシータ周波数励起が、頑強なＢＯＬＤおよびＥＥＧ応答を駆動させることを示す。図５ａは、形質導入された細胞（三角形）、光および冠状スライス（１...20）の位置を示す。図５ｂは、背側ＣＡ１におけるＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現の蛍光（左）画像および共焦点（右）画像を示す。矢印は、ＥＹＦＰ発現を示す細胞を指し示す。図５ｃは、頭蓋骨ＥＥＧおよび光学的刺激の位置を示し、ここで参照電極は、ブレグマの前方３ｍｍ、および右に２．０ｍｍに配置され、記録電極は、背側ＣＡ１上の大脳皮質の最上部上に配置される。図５ｄは、３台のカメラを有するダイヤモンド形状のチャンバーが、微妙な顔面および身体の動きの詳細な表示とともに行動を記録するように特注設計されたことを示す。図５ｅは、６Ｈｚの光学刺激に呼応して示される誘起されたＥＥＧスパイクを示す。図５ｆは、ＢＯＬＤ活性化が、同側性背側海馬体（ＨＦ）、同側性視床（Ｔ）および同側性脳梁膨大後部皮質（ＲＳＣ）で優勢に観察されることを示す（Ｐ＜０．００１、逆三角形：光学刺激部位）。ｏｆＭＲＩデータセットは、５匹の動物において６回の独立した実験から平均化される。それぞれの実験は、６回のｆＭＲＩスキャンで構成される。図５ｇは、左側は、各青色光刺激に応答して示される７５０ｍｓ時間的分解能スライドウィンドウ再構築ｏｆＭＲＩ血行動態応答（全ての有効なボクセルにわたって平均化される）を、右側は、光学刺激内のＢＯＬＤシグナルピークを示す単一エポックトレースを示し、これは、刺激を停止した後に著しい減衰を伴う。 [0046]錐体背側ＣＡ１細胞のガンマ周波数励起が、両側性動員を伴う進行性(evolving)エレクトログラフ発作を発生させることを示す。図６ａは、背側ＣＡ１が４０Ｈｚの光学刺激を受ける場合に示される進行性ＥＥＧ発作パターンを示す。誘起されたスパイクは、より高電圧ポリスパイク徐波に変換される。発作性活動は、刺激よりも長く続く。図６ｂは、背側ＣＡ１の６Ｈｚの刺激と比較して、４０Ｈｚの刺激が、両側性背側海馬体、両側性視床、同側性脳梁膨大後部皮質および中隔でより広範なＢＯＬＤ活性化を受けることを示す（Ｐ＜０．００１、逆三角形：光学刺激部位）。図６ｃは、左側は、４０Ｈｚの背側ＣＡ１刺激が、青色光学刺激と同期されている長期ＢＯＬＤ ＨＲＦを誘起することを示し、右側は、単一エポックＨＲＦが、ｏｆＭＲＩにおける持続性活性化を示し、これは、発作性活動が４０Ｈｚの光刺激よりも長く続くというＥＥＧの結果と一致する。 [0047]錐体腹側ＣＡ１細胞のシータ周波数励起が、頑強なＢＯＬＤおよびＥＥＧ応答を付与することを示す図である。図７ａは、形質導入された細胞（三角形）、光およびｏｆＭＲＩ冠状スライス（１...20）の位置を示す。図７ｂは、腹側ＣＡ１におけるＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現の蛍光（左）画像および共焦点（右）画像を示す。矢印は、ＥＹＦＰ発現を示す細胞を指し示す。図７ｃは、６Ｈｚの腹側海馬刺激が、刺激と同期的な誘起されたＥＥＧスパイク波をもたらすことを示す。図７ｄは、ＢＯＬＤシグナルが、対側性背側海馬体よりも多く同側性で観察され、対側性視床、両側性外側中隔核および同側性脳梁膨大後部よりも多く同側性で観察されることを示す（Ｐ＜０．００１、逆三角形：光学刺激部位）。ｏｆＭＲＩデータセットは、４匹の動物において６回の独立した実験から平均化される。それぞれの実験は、６回のｆＭＲＩスキャンで構成される。 [0048]錐体腹側ＣＡ１細胞のガンマ周波数励起が、広範なＢＯＬＤシグナルを伴ってＥＥＧおよび行動発作を発生することを示す。図８ａは、２０ｓ、４０Ｈｚの刺激が、刺激よりも長く続く進行性ＥＥＧ発作パターンをもたらしたことを示す。激しい震え、顔面攣縮、間代性発作および疾走−跳躍を含む行動が、異なるげっ歯類被検体で頑強に観察される。図８ｂは、６Ｈｚの刺激と比較して、広範なＢＯＬＤ活性化が種々の領域で観察されることを示す：腹側海馬形成、視床および中隔領域が、より持続性の応答を示す一方で、背側海馬および帯状回皮質は、より短い持続応答を示す。 [0049]興奮性ニューロンにおいて特異的な発現を示すＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰの免疫組織化学的特徴付けを示す。ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰ：興奮性マーカーＣａＭＫＩＩａ、阻害性マーカーＧＡＢＡおよび核マーカーＤＡＰＩに関して共染色。ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（左）、ＣａＭＫＩＩａおよびＧＡＢＡ（中央）、ＤＡＰＩ＋オーバーレイ（右）が示される。ＣａＭＫＩＩ、ＧＡＢＡおよびＤＡＰＩを伴うｅＹＦＰのオーバーレイは、ＣａＭＫＩＩａ陽性細胞（図９ａ、白矢印）を示したが、ＧＡＢＡ陽性細胞は、ｅＹＦＰを同時発現しなかった（図９ｂ）。ｅＹＦＰを発現する細胞の９８％が、ＣａＭＫＩＩに関して陽性であった（１７４５／１７８６、ｎ＝５匹の動物）。０．５ｍｍ^３のオプシン発現ＣＡ１領域で計数されるＣａＭＫＩＩ細胞全ての５１％（１７８６／３４７９、ｎ＝５匹の動物）がＹＦＰ陽性であった。 [0050]ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰが背側海馬ＣＡ１および解剖学的に結合された領域で発現されることを示す蛍光画像および共焦点画像を示す。図１０ａは、背側海馬ＣＡ１、対側性ＣＡ１、運動皮質、海馬采、中隔核および視床におけるＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰ発現を示す蛍光画像である。図１０ｂは、ウイルス注射の部位（背側海馬ＣＡ１領域、上の行の左パネル）付近に位置する細胞体で、およびそれらの細胞体から突出する軸索線維全体にわたって発現されるＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰを示す共焦点画像である。ｅＹＦＰを発現する、体側性背側海馬ＣＡ１領域および運動皮質層ＶＩにおけるほんの一部の細胞体が、注射部位に隣接して観察される（２％未満）。しかしながら、これらの領域は、刺激の部位へ直接突出しないため、これらの位置における細胞体によるニューロンからのＣｈＲ２の線維発現は予想されず、したがって、ＣＡ１において細胞体によりニューロンのみを直接的に刺激するという目標を妨害しない。ｅＹＦＰ発現は、海馬采、中隔核および視床における軸索に限定される。 [0051]背側および腹側海馬刺激のＥＥＧおよび行動を示す。図１１ａ：背側海馬での６Ｈｚおよび１０Ｈｚの刺激が、刺激よりも長く続かない誘起されたスパイクを生じた。対比して、２０、４０および６０Ｈｚでの刺激は、６回の実験（１０回の実験、２匹の動物）で、進行性海馬発作性エレクトログラフ事象および正常な行動をもたらした。丸の中の数字は、刺激周波数を示す。図１１ｂ：腹側海馬での６Ｈｚの刺激は、刺激中のスパイク波の３回のエピソードおよび１回の進行性発作を生じる。６Ｈｚの腹側実験では、それぞれ１つが正常な行動と、２つが激しい震えと、そして１つが慢性発作と相関された。対比して、１０、２０、４０、６０Ｈｚでの６回の刺激は、激しい震え、顔面攣縮、間代性発作または疾走−跳躍発作を含む完全に進行性発作性パターンおよび発作行動をもたらす（２１回の実験、３匹の動物）。発作パターンの反復可能性は、各実験の開始の５分後、１０分後および１５分後に３回の２０秒の一連の光刺激を送達することにより評価した。ＥＥＧおよび行動パターンは、３回の連続した刺激それぞれに関して類似していた（最も長期的な電子記録発作のみが、データ概要、通常第１に関してスコア付けられた）。第１の発作に関するＥＥＧ変化の持続期間は、８０．８±４４．１秒であり、第２の発作の持続期間は、４０．９±３４．３秒であり、第３の発作の持続期間は、６６．０±５６．９秒であった。第１の発作は、第２の発作よりも長い持続期間を有した（ｐ＝０．００００２、対応のある両側ｔ検定）が、第３の発作ではそうではなかった（ｐ＝０．２１）。背側海馬発作の平均持続時間は、腹側発作に関する８６．９±４４．０秒に対して、６４．７±４２．２秒であった（ｐ＝０．０８）。ｏｆＭＲＩが、Ｏ_２（３５％）、Ｎ_２Ｏ（６３．５％）およびイソフルラン（およそ１．２〜１．５％）の吸入で麻酔をしたラットで記録されたので、さらなるビデオ−ＥＥＧを、同じ混合物を吸入させた３匹の動物における３回の実験で解析した。光刺激前のベースラインＥＥＧは全て、麻酔から予想されるように爆発的な阻害を示した一方で、６、１０、２０、４０および６０Ｈｚでの光刺激は、覚醒しているラットにおけるＥＥＧ事象からの持続時間およびパターンと識別不可能な、エレクトログラフ進行性発作を誘起した。 [0052]腹側海馬ＣＡ１および結合された領域で発現されるＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰを示す蛍光画像および共焦点画像を示す。図１２ａ：蛍光画像は、ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰが腹側海馬ＣＡ１、対側性ＣＡ１、歯状回、体性感覚皮質、海馬采および視床において発現されることを示す。図１２ｂ：ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩ：：ｈＣｈＲ２−ｅＹＦＰは、ウイルス注射の部位（腹側海馬ＣＡ１領域、上の行の左パネル）付近に位置する細胞体で、およびそれらの細胞体から突出する軸索線維全体にわたって発現されるが、但し、注射部位に隣接する体性感覚皮質層ＶＩにおけるわずかな細胞体が、ｅＹＦＰを発現した（１％未満）。しかしながら、体性感覚皮質ニューロンは、刺激の部位へ直接突出せず、本発明者らは、体性感覚皮質において細胞体によるニューロンからのＣｈＲ２の任意の線維発現を予想せず、したがって、ＣＡ１における細胞体によりニューロンのみを直接的に刺激するという目標を妨害しない。ｅＹＦＰ発現は、対側性海馬ＣＡ１、歯状回、海馬采および視床における軸索に限定される。 [0053]ＡＮＴ刺激が発作を低減させることを示す図である。１１０名の患者に、ＡＮＴにおいて電極を両側で移植して、１カ月間記録した。次の３カ月間、患者は、５Ｖ（丸、実線）または０Ｖ（四角形、点線）での刺激に対して無作為化し、それらの処理群は知らされていなかった。有意に少ない発作（ｐ＜０．０４）は、５Ｖ能動的刺激(active stimulation)を受けた群で見られた。 [0054]ｏｆＭＲＩを示す図である：規定のげっ歯類の新皮質細胞における光駆動型局所励起が、正のＢＯＬＤを駆動させる。図１４ａは、形質導入された細胞（三角形）、ならびにカニューレ移植および刺激部位でのＭ１において示される青色光送達の概略図である。冠状画像スライスは、「１..９」としてマークした。図１４ｂは、Ｍ１におけるＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現の共焦点画像を示し（左）、より高倍率により、形質導入されたニューロン細胞体および突起が明らかとなる（右）。図１４ｃは、４７３ｎｍの光学刺激中の細胞外オプトロード記録を示す。図１４ｄ、ＢＯＬＤ活性化が、光学刺激の部位付近で観察される（矢印：注射／刺激部位）。冠状スライスは、連続的であり、０．５ｍｍ厚である。図１４ｅは、光学刺激の６回の連続的なエポック中のｏｆＭＲＩ血行動態応答を示し（左）、刺激パラダイムは、６０秒毎に反復される２０秒の２０Ｈｚ／１５ｍｓの４７３ｎｍの光刺激であった（青色バー）。血行動態応答は、運動皮質において０．３５を上回るコヒーレンス係数を伴って全てのボクセルにわたって平均化され、全ての刺激エポックの平均値であり（右）、ベースラインは、平均刺激前シグナル規模に相当する。 [0055]ｏｆＭＲＩ回路マッピング：従来のＢＯＬＤおよび通過帯域ｂＳＳＦＰ−ｆＭＲＩを示す。予想されるように、Ｍ１におけるＣａＭＫＩＩａ：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの注射は、運動皮質、線条体および視床、すなわち注射の原発部位および発現しているニューロンの軸索が突出する部位において、オプシン発現をもたらす（左）。従来のＢＯＬＤ ｆＭＲＩ活動マップは、適切な解剖学的画像およびアトラス画像上に重ね合わせた。通過帯域ｂＳＳＦＰ−ｆＭＲＩ活動マップは、より完全に回路レベル活動を捉えている適切な解剖学的画像およびアトラス画像上に重ね合わせた。 [0056]ｏｆＭＲＩ中の位置、遺伝的同一性および配線を示す。図１６ａは、ＭＶ５−ＣａＭＫＩＩａ：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰのＭ１注射および視床の光学刺激を示す。図１６ｃに示される冠状スライスは、「１..６」および「７..１２」としてマークした。図１６ｂは、皮質ニューロンにおける発現（左）および皮質−視床の突出を確認するＣｈＲ２発現パターンを示す。図１６ｃは、視床（上）および皮質（下）で得られるＢＯＬＤ ｏｆＭＲＩデータを示す。図１６ｄは、視床における皮質−視床線維の光学刺激により惹起される皮質（灰色）および視床（黒色）ＢＯＬＤシグナルに関するｏｆＭＲＩ−ＨＲＦを示す。ｏｆＭＲＩ−ＨＲＦはともに、図１３における皮質内の結果と比較すると、徐々に傾斜している。 [0057]海馬発作伝播に関連するパペッツの回路を示す。内側（１）および外側（２）海馬は、描かれていない遠心性神経よりもとりわけ脳弓（３）において流出を集積する。脳弓（３）は、後視床下部の乳頭体および視床前核の前腹側核（８）における直接脳弓結合（４）シナプスと結合する。乳頭体は、内側核群（５）および外側核群（６）を有する。乳頭体は、ＭＴＴ（７）を介してＡＮＴ（８）へ突出し、続いて脳梁膨大後部帯状回皮質（９）に突出する。帯状束（１０）は、海馬台および海馬へのループバックを完了させる。 [0058]ＡＮＴ（ＡＶ）へのセロトニン作動性およびコリン作動性突出を示す。図１８ａは、セロトニン作動性末端染色が、前腹側視床で顕著であることを示す。図１８ｂは、コリン作動性マーカーが、前腹側視床の後側部分において特に濃いことを示す。 [0059]海馬へビククリンを注射することにより生じるラットの左海馬における局所発作を示す。スパイク波は、海馬電極において明確である。 [0060]周波数依存性細胞型特異的活動を誘起する海馬における錐体ニューロン刺激によるｏｆＭＲＩを示す図である。図２０ａは、内側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の１０Ｈｚの刺激が、注射部位に対して頭側および尾側の両方の側頭葉領域の動員を惹起することを示す。図２０ｂは、誘導された活動が、増強された頭側、尾側および両側伝播をもたらす２０Ｈｚの刺激を示す。１０Ｈｚを示す図２０ｃに関する活性ボクセルの数は、活動解剖学的領域に関してプロットされた。２０Ｈｚを示す図２０ｄに関する活性ボクセルの数は、活動解剖学的領域に関してプロットされた。２０Ｈｚの刺激は、より大きな活性化容量および相をもたらす。海馬台は、特に大きな位相差を有する。図２０ｅは、６、１０、２０、４０、６０Ｈｚの刺激周波数に関してプロットした海馬台でのｏｆＭＲＩ−ＨＲＦを示す。２０Ｈｚよりも高い刺激は、刺激オフセット後におよそ２０秒間、持続性応答を付与する。図２０ｆは、５、１０、２０秒の２０Ｈｚの刺激に関する海馬台でのＭＲＩ−ＨＲＦを示す。刺激の持続期間にも関わらず、それらは全て、刺激オフセット後におよそ２０秒の持続性応答を付与する。 [0061]ＬＦＰおよび単一ユニット記録が、ｏｆＭＲＩの結果を適合させる周波数依存性を示す図である。図２１ａは、光学刺激中にＬＦＰ増加をもたらす内側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の１０Ｈｚの刺激を示す。図２１ｂは、対照的に、刺激オフセット後に持続する持続性ＬＦＰを付与する２０Ｈｚの刺激を示す。図２１ｃは、刺激中のスパイク率増加を示す１０Ｈｚの刺激中の単一ユニット記録を示す。図２１ｄは、刺激オフセット後の持続性神経スパイキングをもたらす２０Ｈｚの刺激を示す。図２１ｅは、刺激オフセット後の持続性神経スパイキングをもたらす６０Ｈｚの刺激を示す。図２１ｆは、興味深いことに、刺激時の阻害が、刺激オフセット後に持続される細胞を示す、４０Ｈｚの刺激によるＣＡ１における対側性記録である。 [0062]外側ＣＡ１における錐体ニューロン刺激がパペッツ回路を動員することを示す。図２２ａは、前葉体領域の動員、ならびにパペッツの回路における他の回路要素を惹起する外側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の６０Ｈｚの刺激を示す。図２２ｂは、プロットされる各領域における活性ボクセルの数を示す。相は、内側ＣＡ１刺激と比較して、より大きな多様性を示す。 [0063]発作のＰＴＺモデルにおけるＡＮＴの電気的刺激を示す。図２３ａ：ＡＮＴの刺激は、皮質発作活動を停止させる。図２３ｂ：ＡＮＴ刺激は、間代性発作を生じるのに必要なＰＴＺの量を増加させることが示されている。 [0064]圧縮されたセンシング通過帯域ｂ−ＳＳＦＰ ｆＭＲＩを示す。図２４ａ：通常獲得および再構築された通過帯域ｂ−ＳＳＦＰ ｆＭＲＩ。図２４ｂ：圧縮されたセンシング再構築通過帯域ｂ−ＳＳＦＰ ｆＭＲＩを伴うサンプリングよりも劣る(under-sampled)高分解能獲得により、同じ獲得時間で６倍小さなボクセル容量を達成する。 [0065]例示的な研究タイムラインを示す。 [0066]ｏｆＭＲＩの精密な時空間的測定を示すｏｆＭＲＩ活動部位での電気生理学的記録を示す。図２６ａ ６、１０、２０、４０、６０Ｈｚでの背内側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の刺激による海馬台でのｏｆＭＲＩ−ＨＲＦ。２０Ｈｚよりも高い刺激は、刺激オフセット後におよそ２０秒間、持続性応答を付与する。図２６ｂ、５、１０、２０秒の２０Ｈｚの刺激に関する海馬台でのＭＲＩ−ＨＲＦを示す。刺激の持続期間にも関わらず、およそ２０秒の持続性応答が、刺激オフセット後に観察される。図２６ｃおよび図２６ｄは、２０秒の６Ｈｚおよび１０Ｈｚの刺激が光学刺激中にＬＦＰ増加をもたらすことを示す。図２６ｅおよび図２６ｆは、対照的に、刺激オフセット後に持続する持続性ＬＦＰを付与する２０Ｈｚおよび４０Ｈｚの刺激を示す。図２６ｇは、刺激中にスパイク率増加を示す１０Ｈｚの刺激中の単一ユニット記録を示す。図２６ｈでは４０Ｈｚの刺激が、図２６ｉでは６０Ｈｚの刺激が、刺激オフセット後に持続性神経スパイキングをもたらす。図２６ｊは、４０Ｈｚの刺激によるＣＡ１における対側性記録であり、刺激時に阻害を伴う細胞が刺激オフセット後に持続されることを示す。これらの見解により、時間的神経活動パターンを表す際のｏｆＭＲＩ−ＨＲＦシグナルの精度を実証する。 [0067]背側ＣＡ１のオプトジェネテッィク刺激中のＥＥＧおよび行動を示す。上部の４つのトレースは、トランスフェクトした海馬のオプトジェネテッィク光刺激直前、オプトジェネテッィク光刺激中、およびオプトジェネテッィク光刺激後の連続的なＥＥＧを示す。光刺激は、黒矢印でマークされた「光オンセット」時間で適用された。全体的なトレースは、８０秒のＥＥＧ記録を示す。下部の画像は、発作中のビデオのスクリーンショット示す。 [0068]発作モデル＃１を示す。背内側ＣＡ１における錐体ニューロンの高周波数刺激は、海馬を通じた限られた神経活動伝播により発作を誘起する。図２８ａは、内側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の４０Ｈｚの刺激が、注射部位に対して頭側および尾側の両方の前頭葉領域のより大きな動員を惹起することを示す（青色スター、＋２．０ｍｍ、−４．８ｍｍ、−３．５ｍｍ）。上部左角：パキシノアトラススライス番号。図２８ｂは、活動解剖学的領域に関してプロットされた活性ボクセルの数を示す（５匹の動物）。行動試験は、修飾ラシーヌスケールＡおよびＥＥＧスコア３を示す。 [0069]発作モデル＃２を示す。腹外側ＣＡ１における錐体ニューロンの高周波数刺激は、パペッツの古典的な回路を通じた神経活動伝播により発作を誘起する。図２９ａは、腹外側ＣＡ１錐体ニューロンの２０秒の４０Ｈｚの刺激が、パペッツの古典的な回路の別個の動員を惹起することを示す（注射部位：青色スター、＋５．４ｍｍ、−６．６ｍｍ、−４．２ｍｍ）。図２９ｂは、活動解剖学的領域に関してプロットされた活性ボクセルの数を示す（５匹の動物）。行動試験は、修飾ラシーヌスケール５を示す。 [0070]海馬における変性神経突起およびアミロイド斑の形成、前脳基底核におけるコリン作動性神経突起長、容量および分岐の低減、海馬におけるＬＴＰの低減、および物体認識障害を示すＡＤのトランスジェニックマウスモデルを示す図であり、これらは全て、新規薬物候補であるＬＭ１１Ａ−３１の投与により有意に救出される。図３０ａは、表示するようにビヒクルまたはＬＭ１１Ａ−３１を付与したＡＰＰＬ／Ｓマウスの海馬における変性神経突起に関するＡＰＰ免疫標識（左）およびアミロイド斑に関するチオフラビンＳ染色（右）の顕微鏡写真である。スケールバー＝２５μｍ。図３０ｂは、コリンアセチルトランスフェラーゼで免疫染色した前脳基底核切片の顕微鏡写真である。ＬＭ１１Ａ−３１によるＡＰＰＬ／Ｓマウスの処理は、コリン作動性神経突起の長さ、容量および分岐の増加に関連付けられた。図３０ｃは、ＬＭ１１Ａ−３１がＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＬＴＰを標準化することを示す：ＡＰＰ／ＰＳ１−ビヒクル対ｗｔ−ビヒクル、ｐ＝０．００３、ＡＰＰ／ＰＳ１−ビヒクル対ＡＰＰ／ＰＳ１−ＬＭ１１Ａ−３１、ｐ＝０．０２、ｗｔ−ビヒクル対ｗｔ−ＬＭ１１Ａ−３１、言及なし。図３０ｄは、ＬＭ１１Ａ−３１がＡＰＰＬ／Ｓマウスにおける物体認識障害を防止したことを示す。統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡおよび事後スチューデント−ニューマン−コイルス検定を使用して決定した。 [0071]マウス脳コリン作動系を示す。前脳基底核におけるＭＳＤＢＢは、解剖学的に海馬へ突出することが知られている。本発明により、コリン作動性ニューロンは、ＡＤにおける海馬に関連する著しい記憶喪失に起因して、ＭＳＤＢＢにおいて刺激された。 [0072]前脳基底核におけるコリン作動性ニューロン特異的刺激によるｏｆＭＲＩが、海馬を含む全般的なネットワーク動員を明らかにすることを示す。図３２ａは、刺激に関して選択的に標的とされた前脳基底核ＭＳＤＢＢにおけるコリン作動性ニューロンを示す。図３２ｂは、図３２ｃにおける画像スライス２付近のカニューレ移植の位置を示す解剖学的ＭＲＩ画像である。図３２ｃは、海馬を含む大きな野の動員をもたらすＭＳＤＢＢにおけるコリン作動性ニューロンのガンマ（４０Ｈｚ）周波数刺激である。活動領域としては、Ｍ２（補足運動皮質）、Ｃｇ（帯状回皮質）、中隔核、ＶＨＣ（腹側海馬交連）、ＨＦ（海馬体）およびＲＳＣ（脳梁膨大後部皮質）が挙げられる。グレースケールは、活動の相、すなわち持続期間、ピークタイミングを表す。白逆三角形は、刺激の位置を指し示す。 [0073]歯状回の顆粒細胞への入力を示す。分子層における顆粒細胞樹状突起は、嗅内皮質錐体細胞からの興奮性入力を受ける。さらに、縫線からのセロトニン入力および前脳基底核からのコリン作動性入力は、顆粒細胞を神経支配する。コリン作動性またはセロトニン作動性ニューロン（緑色の軸索により示される）においてＣｈＲ２を選択的に発現するトランスジェニック動物を使用して、また歯状回に光学刺激ファイバー（青色光）を配置させることにより、歯状回へ特異的に突出するコリン作動性またはセロトニン作動性ニューロンが、選択的に活性化される。 [0074]ｏｆＭＲＩ中の位置、遺伝的同一性および配線により規定される細胞の制御を示す。図３４ａは、ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ＥＹＦＰのＭ１注射および視床の光学刺激を示す。冠状スライスは、「１..６」および「７..１２」としてマークする。図３４ｂは、視床（上）および皮質（下）で得られるＢＯＬＤ ｏｆＭＲＩデータを示す。この研究は、ＣｈＲ２を発現する軸索線維の刺激によるｏｆＭＲＩが頑強なシグナルを惹起し得ることを実証する。 [0075]前脳基底核におけるコリン作動性ニューロン特異的刺激によるｏｆＭＲＩが、海馬を含む全般的なネットワーク動員を明らかにすることを示す。図３５ａは、刺激に関して選択的に標的とされた前脳基底核におけるコリン作動性ニューロンを示す。全脳に及ぶ２３個のスライスから選択される１２個の冠状画像スライスが、脳の略図の下のドットにより標識される。図３５ｂは、ｃにおける画像スライス２付近のカニューレ移植の位置を示す解剖学的ＭＲＩ画像を示す。図３５ｃは、海馬を含む広範囲のネットワーク動員をもたらす前脳基底核におけるコリン作動性ニューロンのガンマ（４０Ｈｚ）周波数刺激を示す。活動領域としては、Ｍ２（補足運動皮質）、Ｃｇ（帯状回皮質）、中隔核、ＶＨＣ（腹側海馬交連）、ＤＧ（歯状回）を含むＨＦ（海馬体）およびＲＳＣ（脳梁膨大後部皮質）が挙げられる。色は、活動の相、すなわち持続期間、ピークタイミングを表す。白逆三角形は、刺激の位置を指し示す。

[0076] ここでは、本発明（複数可）の各種実施形態について、言及が詳細になされ、その例は、添付の図面で説明され、また以下で説明される。本発明（複数可）は、例示的な実施形態と併せて説明される一方で、この説明が、それらの例示的な実施形態に対して本発明（複数可）を限定すると意図されないことが理解されよう。むしろ、本発明（複数可）は、単に例示的な実施形態だけでなく、様々な代替物、修飾、等価物および他の実施形態も網羅すると意図され、これらは、併記の特許請求の範囲により規定されるような本発明の精神および範囲内に包含され得る。

[0077] 本発明の各種態様は、様々な含意を有する。

[0078] 第１に、てんかんの分野の観点から、本発明は、治療法がどのように設計され得るかに関する根本的な変革を示す。

[0079]例えば、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓは、てんかんにおける深部脳刺激（ＤＢＳ）療法に関する臨床試験に２億ドルを費やした。この治療法は、ＦＤＡにより不十分であると判断された有効性およそ４０％に起因して、米国では認可されなかった。

[0080]この治験における刺激に関する標的およびパラメーターは、視床前部の刺激が、海馬に由来する発作を逆行的に阻害する潜在力を有することを示す証拠に基づいて、経験的に選択された。このことは妥当であり、てんかんを伴う多くの患者に対して有効な治療をもたらすことも示された一方で、それは、患者の大部分において有効ではなかった。

[0081]重要なことに、以下の実施例Ａおよび実施例Ｂにおいて概説されるアプローチは、この様々な有効性に対する直接的な説明を提供する。例えば、本発明によるモデリングは、海馬から発生する発作の多くのタイプが、それらの発作ネットワークの一部として視床前部に関与しないことを示している。したがって、視床前部刺激は、これらの経路を包含する発作を停止させる可能性が低い。しかしながら、海馬で発生する発作の代替的なサブセットは、それらの伝播経路として視床前部を利用する。したがって、これらの発作は、視床前部刺激療法に応答する。本発明により取り組まれた本発明者らの研究により現在利用可能なかかる証拠が、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓが臨床試験に関与する以前に利用可能であった場合には、より効率的な標的および患者集団の選択が可能になっており、何億ドルものコストを無駄にすることがなかったと同時に、緊急の必要性を要する患者へより有効な治療法をより迅速に伝えることが可能であったであろう。

[0082] したがって、非常に正確な発作を発生して、またそれらのネットワーク関与を追跡する能力は、本発明による治療法の設計の根本的な変革(fundamental transformation)を可能にする極めて力強いアプローチである。さらに、本発明による治療上の標的を同定するためのｏｆＭＲＩアプローチは、てんかんだけでなく、パーキンソン病、うつ病、アルツハイマー病、妄想強迫疾患および疼痛を含む多くの他の神経学的疾患にも普遍的な影響を潜在的に与え得る。

[0083] 第２に、機能的脳画像法の観点から、本発明は、刺激パラメーター（周波数）の単純な変化が、脳ネットワークの区別できる空間的動員をもたらすという、脳の動的性質を捉えるための機能的脳画像法の能力の初の実証である。本発明の各種態様は、シータ対ガンマ周波数刺激を示す提示（showing）を提供する。

[0084] 本発明の各種態様は、刺激周波数が空間的ネットワーク要素における動員をどのように変化させるかだけでなく、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）血行動態反応機能（ＨＲＦ）により捕捉され得る各位置での種々の時間的動態をどのようにしてもたらすかの初の提示を提供する。進行性発作からのＨＲＦは、長期的な持続性応答を明らかに示す。

[0085] 本発明の各種態様は、多重シナプスにわたる全脳におけるネットワーク応答を追跡するｏｆＭＲＩ技術の能力の初の提示を提供する。例えば、図４および図４は、前頭皮質野におけるネットワーク関与を示し、それらは明らかに、海馬から直接的に突出しない。慎重に選択された標的と組み合わせて、本発明による刺激の正確性および高品質画像法により、初めてかかる能力の明らかな実証が可能となった。

[0086] 第３に、迷走神経刺激（ＶＮＳ）に対する神経刺激療法効果の直接的可視化の分野の観点から、本発明のオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）は、神経刺激療法がどのようにして、その治療上の有効性に関して設計および評価され得るかに関する根本的な変革を提供する。上述するように、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓは、米国で認可されなかった治療法に２億ドルを費やした。

[0087] 本発明によるｏｆＭＲＩ実験は、この様々な有効性に対する直接的な説明を提供する。海馬から発生する発作の多くのタイプが、それらの発作ネットワークの一部として視床前部に関与しない。したがって、視床前部刺激は、これらの経路を包含する発作を停止させる可能性が低い。例えば、図１および図２は、視床前部に関与しない海馬に由来する発作を示す。しかしながら、本発明によるモデリングは、海馬で発生する発作の代替的なサブセットが、それらの伝播経路として視床前部を利用することを示している（図３を参照）。したがって、これらの発作は、視床前部刺激療法に応答する。本原稿により概説される本発明者らの研究により現在利用可能なかかる証拠が、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓが臨床試験に関与する以前に利用可能であった場合には、より効率的な標的および患者集団の選択が可能になっており、何億ドルものコストを無駄にすることがなかったと同時に、緊急の必要性を要する患者へより有効な治療法をより迅速に伝えることが可能であったであろう。

[0088] この実施例からわかるように、本発明による、非常に正確な発作を発生させて、またそれらのネットワーク関与を追跡する能力は、本発明らが治療法の設計の根本的な変革を可能にする極めて力強いアプローチである。同様に、かかるアプローチは、治療上の刺激の影響を正確に追跡することができる。治療上の標的を同定して、それらの影響を評価するための本発明によるｏｆＭＲＩアプローチは、てんかんだけでなく、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、妄想強迫疾患および疼痛を含む多くの他の神経学的疾患にも普遍的な影響を与え得る。

[0089] 神経学的治療法開発のためのかかる高い影響の潜在性に起因して、本発明によるかかるアプローチは、失敗した治験に関する数億ドルを排除し、最適な治療上の標的へと本発明者らを即座に導く潜在性を有する。さらに、本発明によるかかるアプローチは、患者群を選別し、これにより各患者に対する治療法を最適化するためのＥＥＧの形跡についての知見であり得る。

[0090] ＶＮＳに関する基本的な作用機序の理解のために、また有効な成果を伴う標的集団を同定するために、本発明の各種態様は、
１）細胞型特異性を用いたげっ歯類におけるオプトジェネティックｆＭＲＩにより、ＶＮＳ作用機序を同定することと、
２）別個の発作型を発生させ、各型に関してＶＮＳの有効性を評価して、発作ＶＮＳのいずれの発作型が有効であるかを同定し、各発作型に関する特有のＥＥＧの形跡を同定することと、
３）ＥＥＧおよび発作と同期されたＭＲＩにより患者におけるＥＥＧの形跡を同定し、ＶＮＳと同期されたｆＭＲＩを行って、ＶＮＳ作用機序を確認することと
を提供する。

[0091] ＶＮＣと同期されたｆＭＲＩの実現可能性は、以前に示されており、ＶＮＳデバイスのＭＲＩとの適合性を実証することを示している（図４を参照）。基本的な作用機序を完全に理解するには、情報が十分に詳細でない可能性があるが、本発明の各種態様は、統合された動物ｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよびヒトｆＭＲＩを利用した統合されたアプローチにより、標的選択および患者選択プロセスの展望を完全に変革する十分に詳細な作用機序を提供することを目的としている。

実施例Ａ−オプトジェネティックｆＭＲＩを用いた正確な起源の発作ネットワークの発見
[0092] てんかんは、高い有病率の支障を来す神経障害であり、世界で２６人のうち１人が罹患しており、そのうちのおよそ３分の１が、既存の治療法に対して不耐性または不応性である。さらに、その不均一な病態生理学、ならびに発作オンセットおよび伝播に関連付けられる直接的な神経経路を現在は観察することができないことが、より有効な治療の開発に特に難題を課している。本発明のオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）を利用して、発作は、細胞型、位置、時間的発火パターンおよびオンセット時間を含むそれらの起源の正確な知識により初めて発生する一方で、関連する全脳下流伝播ネットワークが同定される。シータ周波数を用いた背側海馬でのＣＡＭＫＩＩａ発現ニューロンの特異的な刺激は、主に海馬体に制限される短期持続期間の血行動態応答をもたらす。より高いガンマ周波数での刺激は、中隔を含む脳のより広範囲の野で刺激よりも長く続く、より長い持続期間の血行動態応答を生じる。シータ刺激のビデオ脳波（ＥＥＧ）モニタリングが、誘起されたＥＥＧ応答を示す一方で、ガンマ刺激は、より長い持続期間の血行動態応答に相当するエレクトログラフ発作を誘導する。しかしながら、行動発作は、背側海馬を刺激することからは誘導されない。対比して、腹側海馬でのＣａＭＫＩＩａ発現ニューロンのガンマ周波数刺激は、行動発作を付随するエレクトログラフ発作をもたらす。相当するｏｆＭＲＩにより同定されるネットワークは、前面皮質野の関与を示す。重要なことに、これらの観察は、ｏｆＭＲＩの、多重シナプスにわたる全脳動態ネットワーク機能を明らかにする能力を示している。臨床上のてんかんは、より複雑なプロセスを表し得る一方で、正確な起源の繰り返し可能な発作伝播経路の直接的な可視化は、発作に関与するネットワークを系統的に精査して、投薬、局所手術および神経刺激に関する標的とされる治療戦略の設計を可能にする前例のない機会を提供する。

[0093] てんかんは、自発的再発性発作に対する感受性を増加させる様々な遺伝的病因および後天性病因に起因する。解剖学的に、かかる病因は、あまり描かれていない下流神経ネットワーク活動を用いて、局所または散在性病巣に転換する。行動モニタリング、ＥＥＧ、構造的または機能的ＭＲＩおよびＰＥＴ画像法のような従来のてんかん診断方法は、臨床環境および研究環境で非常に重要であるが、それらは、特異的なタイプの発作の基礎を成す脳ネットワークを一意的に規定することに限界がある。現在では、発作メカニズムを研究するのに使用される動物モデルとしては、とりわけ、急性または慢性電気刺激、局所的に適用されるか、または全身投与される化学けいれん薬、局所的損傷または遺伝的近交系動物が挙げられる。これらのモデルは、極めて重要な洞察を提供して、重要な治療法の開発を導いてきた一方で、概念的および実践的課題が依然として存在する。第１に、多くのモデルでは、発作オンセットは、あまり局在化されず、典型的には通路の線維および混合興奮性−阻害性細胞集団を含む不均一解剖学的集団を包含し、より乏しい再現性で大きな可変性を誘導する。第２に、発作は、予測不可能な時間で起こり、ネットワーク伝播の追跡のような時間依存的な現象の研究を複雑にする。第３に、各発作における全脳の機能的関与を正確に可視化する方法を用いずに、その正確なネットワーク活動に基づいて発作を規定することは難しい。

[0094] 本発明の各種態様は、特異的解剖学的および細胞型の起源の発作により活性化されるネットワークを正確に同定することができるアプローチを提供する。そのアプローチは、上述の課題の多くを解決する先駆的技術であるオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）を利用する。本発明の各種態様は、ＣＡ１の背側または歯領域のいずれかで海馬錐体ニューロンを修飾させて、それらを青色光により興奮性にすることにより、別の面では健常および非てんかん性ラットにおいて発作を発生および追跡する方法を提供する。発作は、ミリ秒の時間精度で誘発させることができ、続いて、それらの伝播パターンを、発作病巣から全脳にまで下流へ追跡することができる。活性化されたネットワークが、起源の部位に、および刺激の周波数に依存する。発作はそれぞれ、ＥＥＧおよびビデオ記録された動物行動の偽対照比較により検証される。

[0095] 第１に、成体ラットの背側海馬ＣＡ１領域に、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩａ：：ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰを注射した。これにより、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩａ（ＣａＭＫＩＩａ）を発現する海馬錐体ニューロンにおいて特異的にチャネルロドプシン（ＣｈＲ２）の特異的発現が生じるが、ＧＡＢＡ作動性またはグリア細胞では生じない。背側海馬ウイルス注射部位はまた、ＥＥＧ、行動および血液酸素化レベル依存性（ＢＯＬＤ）ｆＭＲＩ研究に関して光学刺激部位として使用された（図５ａ）。蛍光（図５ｂ、左）画像および共焦点（図５ｂ、右）画像を撮り、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの発現を検証した（増強された黄色蛍光タンパク質を増強）。図５ｃに示されるプローブ位置、および顔面攣縮のような微妙な動きを捉えるように３台のカメラを用いて設計されたダイヤモンド形状行動チャンバーを用いて、ＥＥＧおよび行動研究を行った（図５ｄ）。ＥＥＧおよび行動研究に関して、波長４７３ｎｍの光が、２０分間の総実験持続期間で、５、１０および１５分で２０秒間送達される。ＥＥＧおよび行動のビデオは、実験中に連続的に記録された。ビデオ−ＢＥＧ記録は、ラットおよびヒト両方のビデオ−ＥＥＧを経験したことのある委員会が許可した脳波記録者（electroencephalographer）により盲検的にスコア付けされた。

[0096] 低周波数刺激の影響を検討するために、６Ｈｚでの青色波長４７３ｎｍレーザーパルスを、青色バー（図５ｅ）により示される時間で背側ＣＡ１に送達させて、各刺激と呼応させて、誘起されたスパイクのみをもたらした。これらの刺激パラメーターを用いて、刺激中および刺激後に、正常な行動のみが観察された（補足図７ａ）。関連ネットワーク機能を評価するために、連続した０．５ｍｍ冠状スライスを用いて、ｏｆＭＲＩ画像を獲得し、ウイルス注射の少なくとも１０日後に撮った（図Ｉｆ）。５匹の動物における６回の独立した実験から平均化されるｆＭＲＩシグナルは、同側性背側海馬体、同側性視床および脳梁膨大後部皮質で主に観察された。全ての活性ボクセルから平均化されたｏｆＭＲＩ血行動態応答機能（ｏｆＭＲＩ−ＨＲＦ）は、各青色光刺激に応答して示される（図５ｇ、左）。単一エポックトレース（図５ｇ、右）は、ＢＯＬＤシグナルが、刺激の時間内でピークとなり、光刺激の終結直後に減衰することを示す。

[0097] 背側ＣＡ１における４０Ｈｚでの青色波長４７３ｎｍレーザーパルスは、進行性ＥＥＧ発作パターンを生じ、誘起されたスパイクに始まり、電圧を増加させて、多棘徐波へ、続いて迅速なスパイクに変換する（図６ａ）。発作性活動は、光刺激よりも長く続く。発作性ＥＥＧパターンにも関わらず、目に見える行動の変化は、このエレクトログラフ発作に付随して起きなかった（補足図７ａ）。５匹の動物における６回の独立した実験から平均化される背側海馬ＣＡ１での４０Ｈｚの刺激に対するＢＯＬＤ応答は、図６ｂに示される。より広域の活性化が、６Ｈｚの刺激（図５ｆ）と比較して観察され、ここで両側性背側海馬体、両側性視床および同側性脳梁膨大後部皮質、および中隔を包含する。色分けは、応答の相（タイミング）を反映し、より初期のピーク応答は、赤色マークにより、より後期の応答は、黄色または緑色で示される。４０Ｈｚに関するｏｆＭＲＩ−ＨＲＦ（図６ｃ）は、同じ位置での６Ｈｚの刺激（図５ｇ）と比較した場合に、有意に長期のＢＯＬＤシグナルを示す。これは、４０Ｈｚの刺激に関する光刺激よりも長く続く発作性活動を示すＥＥＧ活動に良好に相当する。このことにより、ｏｆＭＲＩ−ＨＲＦ形状と基本的な神経活動との間に強力な相関関係が実証される。

[0098] 次の研究では、成体ラットに、腹側海馬ＣＡ１領域で注射して、カニューレを挿入した（図７ａ）。蛍光（図７ｂ、左）画像および共焦点（図７ｂ、右）画像を撮り、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの発現を検証する。６Ｈｚでの青色レーザーパルスによる刺激は、毎秒６でＥＥＧスパイク波を誘起させて、２０秒間の刺激を続け（図７ｃ）、実験の大部分に関してビデオ記録において明らかな行動変化を伴わない。腹側海馬における６Ｈｚの刺激を用いた４回の実験で、ＥＥＧは、３回でスパイク波を示し、１回で進行性発作を示す。相当する行動は、１回で標準的であり、２回で激しい震えが見られ、１回で間代性前肢および頭部けいれんが見られる（補足図７ｂ）。６Ｈｚで背側海馬において刺激した４匹の動物における６回の平均化した実験からのｏｆＭＲＩは、対側性海馬体よりも多く同側性海馬体で、対側性視床、両側性外側中隔核および同側性脳梁膨大後部皮質よりも多く同側性視床で、ＢＯＬＤ活性化を示す（図７ｄ）。

[0099] ４０Ｈｚでの腹側海馬刺激は、光刺激中および光刺激後に、進行性ＥＥＧ発作パターンを生じる（図８ａ）。相当する行動としては、顔面攣縮、間代性発作または疾走−跳躍発作が挙げられる（補足図７ｂ）。ＥＥＧ読み取りと一致して、４匹の動物における６回の平均化される実験からの４０Ｈｚの腹側海馬刺激ＢＯＬＤシグナルもまた、広域である（図８ｂ）。両側性活性化は、腹側海馬および背側海馬、中隔核、腹側線条体、およびブローカの水平バンドで観察される。一側性活性化は、前障、前帯状回皮質、前辺縁領域、腹側および外側眼窩皮質、前島領域および扁桃体野を含む脳の吻側領域で見られる。あまり顕著ではない活性化または遅延活性化が、脳梁膨大後部皮質および体性感覚領域で起こる。

[00100] 本発明の各種態様は、既知の起源およびオンセット時間のオプトジェネティック的に誘発される発作により全脳をわたる脳ネットワーク活性化を追跡することの実現可能性を実証する。「高特異的」起源を用いた場合、示される発作の電気的行動性の徴候は、他の動物モデルで見られる徴候に、またヒトエレクトログラフ発作に匹敵する一方で、起源の細胞型および刺激パラメーターに対する再現性のある依存性を有する。本発明によれば、ネットワーク動員の４つの別個のパターンは、シータおよびガンマ周波数での背側または腹側海馬刺激で見られる。背側海馬刺激を用いた場合、ガンマ周波数刺激は、シータ周波数刺激と比較して、より長い持続期間のｏｆＭＲＩ−ＨＲＦおよびＢＥＧ検出されるエレクトログラフ発作を伴って、より広域のネットワーク動員をもたらす。しかしながら、腹側海馬刺激は、実行機能および運動機能に関与する脳の前領域および皮質下野を活性化することはできない。ｏｆＭＲＩで観察される限られたネットワーク関与は、これらの動物における発作性行動の欠如と良好に一致する。特に４０Ｈｚでの腹側海馬の刺激は、前皮質領域および皮質下領域を包含する構造の広域セットを動員させる。広域の活性化は、完全に発現される間代性発作と一致する。腹側海馬から誘起されるエレクトログラフ発作は常に、行動的にサイレントである背側海馬における発作と対比して、運動発作行動で現れる。背側または腹側海馬刺激によるｏｆＭＲＩ活性化のパターンはまた、海馬のこれらの２つの領域の解剖学的結合性に相当する。したがって、ｏｆＭＲＩによる発作のネットワークマッピングは、ネットワーク構成要素、および特異的な細胞集団に由来する発作の電気臨床的徴候の精査を可能にする。

[00101] ｏｆＭＲＩ可視化ネットワークが、神経血管カップリングの不完全な理解および可視化に必要な最小代謝活性化に関する不確実性に起因して、発作に関与する全ての要素を表すことを想定すべきではない。それにも関わらず、ｏｆＭＲＩマップとＢＥＧ／行動記録との間の強力な相関関係は、ｏｆＭＲＩを使用した神経学的疾患ネットワークの研究に関して最高の定義および忠実度を表す。本発明によれば、ＥＥＧ記録は、発作活動の単純な検証のために、刺激部位付近の単一チャネルから行われた。しかしながら、多チャネルＥＥＧと組み合わせたさらなる研究は、ｏｆＭＲＩシグナルによるＥＥＧ記録を空間的に相関させるのに有用である。

[00102] 正確に送達されるオプトジェネティック刺激およびこれに続く、時間を固定した(time-locked)高分解能ｆＭＲＩ経路画像法は、高度に局所的なニューロン集団に始まる発作に関連付けられる種々のネットワーク活性化を明らかにする。発作中に活性化されるネットワークは、高度に再現性があり、ＥＥＧおよび行動観察と良好に相関する。血行動態学応答機能の持続期間は、ネットワーク活性化の時間的な持続期間を正確に反映し、空間的な情報を提供することに加えて、ｏｆＭＲＩ技術の、時間的神経活動パターンを研究する能力を示す。腹側海馬と多シナプス的に結合されることが知られている野の動員もまた、多重シナプスにわたる動的ネットワーク活動を明らかにするｏｆＭＲＩの能力を実証する。臨床上の発作が、混合および複雑な細胞集団から生じる可能性が高い一方で、本発明によるアプローチは、複雑な発作の構成要素の系統的精査および解析を容易とする。外科的病巣、局所神経刺激または局所薬物塗布のような正確な解剖学的知識に依存する治療法は、様々な電気臨床的パターンと関与する特異的な脳ネットワークのより明確な理解の利益を享受する。

方法の概要
オプトジェネティックｆＭＲＩデータ獲得および解析
[00103] 麻酔をかけた（およそ１．０〜１．５％イソフルラン）動物を４７３ｎｍレーザーに結合して、７Ｔ小動物専用ＭＲＩスキャナーを使用してグラジエントリコールエコー（ＧＲＥ）ＢＯＬＤ画像配列によりスキャンしながら刺激した。獲得したデータを、７５０ｍｓ毎に再構築させて、動きを補正して、平均化のために共通の選択画像に整列させた。続いて、平均化したデータセットを、刺激に同期的な周波数構成要素の有意性をコンピュータ計算する周波数ドメイン解析により解析した。

ＥＥＧおよび行動研究
[00104] ｏｆＭＲＩ研究後に、各げっ歯類被検体に頭蓋骨ＥＥＧ電極を移植した。次に、動物を順化させて、３台のカメラを有するダイヤモンド形状の箱で試験して、行動を記録した。全ての実験において、被検体は、ベースライン獲得の５分後に、データ獲得の開始から５、１０および１５分で２０または４０秒間刺激した。ＥＥＧシグナルは、１ｋＨｚのサンプリングレートで記録した。６、１０、２０、４０Ｈｚ刺激を有する５つの異なるタイプの施行を実施した。

オプシン発現の検証および免疫組織化学
[00105] 脳スライスを、光学顕微鏡および免疫顕微鏡および免疫組織化学用に調製して、オプシン発現の特異性、感受性および空間的分布を検証した。被検体の脳をまず抽出して、４％ＰＦＡ中で一晩固定して、４℃で、ＰＢＳ中の１０％、２０％および３０％ショ糖中で平衡化させた。冠状切片（５０μｍ）を凍結用ミクロトーム上で調製して、連続した切片（５００μｍ間隔で）をオプシン発現に関して検査した。共焦点蛍光画像を、油浸対物レンズを使用してレーザー共焦点顕微鏡で獲得した。

実施例Ｂ
[00106] 下記実施例は、図９〜図１２を参照して記載する。

アデノ随伴ウイルス産生および形質導入
[00107] ｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰプラスミドは、ＭｌｕｌおよびＥｃｏＲＩ制限部位を使用して、ｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰをＡＡＶ主鎖中にクローニングすることにより構築した。マップは、ｗｗｗ.ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ.ｏｒｇ．にてオンラインで入手可能である。組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５コートタンパク質を用いて血清型決定して、ノースカロライナ大学ウイルスベクターコアによりパッケージングした。力価は、２×１０個の粒子／ｍＬであった。

ウイルスの定位注射およびカニューレ配置
[00108] ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰウイルスベクターは、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ研究室から入手して、ノースカロライナ大学ベクターコアでパッケージングして、−８０℃で保管した。ＡＡＶ５は、それが順行性標識を生成して、注射の部位で細胞体を有するニューロンを選択的に標的とするため選択した。ＣａｍＫＩＩαプロモーターを使用して、ＣａｍＫＩＩα発現興奮性ニューロンにおいてのみＣｈＲ２を生産した一方で、ＥＹＦＰを使用して、検証のためＣｈＲ２発現を共局在化させた。スプラーグドーリーラット（１１週齢を超える、２５０〜３５０ｇ）を被検体として使用して、動物畜産および実験操作は、国立衛生研究所およびＵＣＬＡ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）からのガイドラインに厳密に従った。ラットは、誘導チャンバー中で５％イソフルランにより麻酔をかけて、手術中にノーズコーンを用いて２〜３％で維持した。動物を定位フレームおよび加熱パッド上へ固定した後、人工涙液を目に垂らして、手術中の乾燥を防いだ。疼痛緩和のため、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。頭部を剪毛して、７０％エタノールおよびベタジンで消毒して、感染の可能性を最低限に抑えた。正中切開後、定位フレームにマウントした歯科用ドリルを使用して、小さな開頭術を行った。２つのタイプの手術を行った：Ｉ）背側ＣＡ１（＋１．２ｍｍ ＭＬ右半球、−４．３ｍｍ ＡＰ、−３．６ｍｍ ＤＶで注射）におけるウイルス注射（ラット１匹当たり注射１回、２μｌ／部位）およびカニューレ（３．４ｍｍ突出）移植、ＩＩ）腹側ＣＡ１（＋５．２ｍｍ ＭＬ右半球、−５．８ｍｍ ＡＰ、−４．６ｍｍ ＤＶで注射）におけるウイルス注射（ラット１匹当たり注射１回、２μｌ／部位）およびカニューレ（４．４ｍｍ突出）移植。ＭＲＩおよび免疫組織化学により、ウイルス発現および刺激位置の精度を検証した。誤ったプローブ位置を有する動物は排除した。濃縮ウイルスを、１０μｌシリンジおよび３４ゲージ金属針（World Precision Instruments Inc.）を使用して、マイクロシリンジポンプ制御器により駆動される流速１５０ｎｌ／分で送達した。シリンジ針を適所に１０分間残した後、ゆっくりと引き抜いた。ベースから所望のＤＶ座標へ伸長する光ファイバーを伴う特注設計した光ファイバーカニューレを、頭蓋骨上に取り付けて、凝固するまで（１０分）メタボンド（Parkell Inc.）の一層を使用して固定した。５−０ナイロン皮膚縫合を行うことで、切開を縫合して閉じて、麻酔から回復するまで（通常、約１５分）動物を加熱パッド上に保持した。術後の不快感を最低限に抑えるために、ブプレノフィンを一日二度、術後４８時間、皮下注射した。

ｏｆＭＲＩ実験
[00109] ｆＭＲＩスキャニングは、ＵＬＣＡにあるＡｈｍａｎｓｏｎ−Ｌｏｖｅｌａｃｅ Ｂｒａｉｎ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒにおいて、７Ｔ Ｂｒｏｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ小動物専用ＭＲＩシステムで実施した。動物に初めに、５％イソフルランを有する誘導チャンバー中で麻酔をかけて、挿管した後、特注のＭＲＩ適合性クレードル上へ配置させて、耳および歯を固定した。外径３９ｍｍ内径２５ｍｍの特注設計した送信／受信単一ループ表面コイルを、頭蓋骨上の関心対象の領域にわたって中央に置いた。コア径６２．５μｍの光ファイバーを、青色レーザー供給源（４７３ｎｍ）へ接続して、光ファイバーカニューレと連結させた。ｆＭＲＩスキャニング中、動物は、換気装置（Harvard Apparatus、モデル６８３小動物換気装置）を使用して浅麻酔下で人工的に換気（４５〜５５ストローク／分）して、Ｏ_２（３５％）、Ｎ_２Ｏ（６３．５％）およびイソフルラン（１．５％）の混合物で気化器を較正しながら、磁石のアイソセンターへ配置させた。呼気ＣＯ_２を３〜４％に保って、加熱気流を使用して、体温を３６〜３８℃で維持した。Ｔ２荷重高分解能解剖学的画像をｆＭＲＩスキャニング前に獲得して、脳損傷およびプローブ配置に関してチェックした。グラジエントリコールエコー（ＧＥＲ）ＢＯＬＤ法を使用して、種々の光学刺激パラメーターを受けてｆＭＲＩ画像を獲得した。１回６０秒サイクルの刺激は、３０％デューティサイクルによる所望の周波数での光学刺激２０秒、および光学刺激なし４０秒を含んでおり、実験１回当たり６回のサイクルを可能にした。刺激は、６、１０、２０、４０および６０Ｈｚの周波数で実施した。光ファイバー出力をおよそ２．５ｍＷに設定し、これは、対照実験では任意の加熱関連人工産物を誘導しなかった。

画像獲得および再構築。
[00110] グラジエント−エコー（ＧＲＥ）−ＢＯＬＤ配列を獲得に使用した。パルス配列は、面内視野（ＦＯＶ）３５×３５ｍｍ^２、空間分解能０．５×０．５×０．５ｍｍ^３、および反復時間毎（７５０ｍｓ）に画像をアップデートすることができるスライドウィンドウ再構築を有するように設計した。ＧＲＥ−ＢＯＬＤ ｆＭＲＩは、二次元であり、マルチスライスであり、４つのインターリーブスパイラル読み取りを伴うグラジエントエコー配列であるように設計した；反復時間（ＴＲ）７５０ｍｓおよびエコー時間（ＴＥ）１２ｍｓは、１１．５ｍｍのスライス方向容量を網羅する２３個のスライスを生じる。この特異的な設計により、オプトジェネティック制御中に脳の大容量マッピングが可能となった。特注設計したＧＰＵベースの平行再構築および動き補正の完了時に、周波数ドメイン解析が実施され、コヒーレンス値が算出された。特注のアルゴリズムおよびソフトウェア（MRVista）を使用して、コヒーレンス値閾値０．３５を受けて、活性化マップを獲得した。デジタル標準ラット脳アトラスを使用して、移植したカニューレの位置を確認して、特異的脳領域へ活性化ボクセルを局在化させた。

ｏｆＭＲＩデータ解析。
[00111] ｏｆＭＲＩ ＧＲＥ ＢＯＬＤスパイラルｋスペースサンプルをまず、２次元（２Ｄ）グリッディング再構築法により再構築させた。背側および腹側ＣＡ１実験の両方に関して、最終的なｆＭＲＩ画像は、６匹の動物における８回の独立した実験（それぞれが６回のスキャンを含有する）から平均化される。精密な平均化に関して、画像は全て、誤整列が存在しないように登録した。第１の工程として、他の画像が登録するのに必要とされる移行および回転が最小限に保持されるように、正中位置を有する画像を選択した。次に、選択した実験データの３Ｄ時間枠の１つを抽出して、登録用に実験間画像変換行列計算用の鋳型として使用した。特注開発されたＭａｔｌａｂツールをまず使用して、登録されるべき各実験の選択３Ｄ画像を、選択した鋳型画像へ変換することができる６自由度行列を決定した。続いて、別の特注のＧＰＵベースの平行動き補正ツールを使用して、実験間登録に関して実際の変換を行い、続いて各実験の時系列および６つの反復スキャン内で動きに関して補正した。全ての画像を整列させた後に、それらを平均化して、最終的なｆＭＲＩ４Ｄ画像をもたらした。次に、周波数ドメイン解析によりデータセットを解析した。

ＥＥＧ電極移植
[00112] ｏｆＭＲＩ研究の完了後、動物に、ＥＥＧ電極移植に関するさらなる手術を施した。動物は、誘導チャンバー中で５％イソフルランにより麻酔をかけて、手術中にノーズコーンを用いて２〜３％で維持した。動物を定位フレームおよび加熱パッド上へ固定して、人工涙液を垂らして、手術中の乾燥を防ぎ、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。ラットの頭部を剪毛した。７０％エタノールおよびベタジンを消毒薬として裸の頭皮へ適用した。滅菌メスを用いて正中切開を行い、頭蓋骨上の再生した膜を滅菌綿棒で除去した。２つのステンレス製のねじ（０−８０、直径１．５ｍｍ、Plastics One Inc.）をおよそ２．０ｃｍの絶縁線（３０ゲージ、Ｒ３０Ｙ０１００、Wire Wrapping Wire, O.K. Industries）に取り付けて、前頭大脳皮質上で頭蓋骨へ付けた。一方の電極を、参照用にブレグマの前方およそ３．０ｍｍおよび右に２．０ｍｍに配置させ、他方の電極を、海馬ＥＧＧ記録用に、Ｉ）背側ＣＡ１またはＩＩ）腹側ＣＡ１上の大脳皮質の縁に、各動物における光ファイバー移植位置に対して尾側およそ１．５ｍｍで配置させた。電極を頭蓋骨に取り付けた後、それらを凝固するまでメタボンド（Parkell Inc.）の一層を使用して固定して、およそ１０分を要した。５−０ナイロン皮膚縫合を行うことで、切開を閉じた。およそ１５分で麻酔から回復するまで、動物を加熱パッド上に保持した。疼痛を最低限に抑えるために、ブプレノフィンを１２時間毎に、術後４８時間、皮下注射した。動物を一週間、不快感または感染に関して厳密に観察して、それらの水の中にはトリメトプリム−スルファメトキサゾール抗生物質（４８ｍｇ／１００ｍｌ）を供給した。

ビデオ−ＥＥＧ記録
[00113] 各端に、および上部上にカメラ取り付けたダイヤモンド形状の箱に、ラットを順化させた。この形状により、箱内のカマー（comer）をより鈍角にさせ、動物を正面から可視化するのを助長する。注意散漫となるものはケージに配置させなかった。動物には、試行の間、食物および水を与えた。ＥＥＧ記録は、ベースラインの５分間、続いて各試行が２０分間続くように、５、１０および１５分での２０または４０秒のオプトジェネティック光刺激（間での４：２０の刺激なし）を実施した。チャネル１つ当たり毎秒１０００ポイントでサンプリングする市販のデジタルＥＥＧシステムを使用して、ＥＥＧを記録した。刺激周波数の種々のパラメーターは、無作為の試行順序で試験した。５つの試行（６、１０、２０、４０および偽）を含有する試験を、各動物について三度繰り返した。偽実験は、レーザーの力を、脳中で２桁分、光を減衰させるレベルに低減させて、したがって任意の影響を無視し得るものにしたが、動物および研究者らに目に見える鮮やかな青色閃光を生み出すことが依然として可能であった。ＥＥＧ記録中に、３つのビデオカメラは全て、動物の行動を記録した。ｏｆＭＲＩは、Ｏ_２（およそ３５％）、Ｎ_２Ｏ（およそ６３．５％）およびイソフルラン（１．５％）の吸入で麻酔をかけたラットで記録されたため、ビデオ−ＥＥＧもまた、この混合物を吸入している３匹の動物における実験で解析した。

[00114] 各ビデオ−ＥＥＧクリップは、処理に対して目隠しされた観察者により、１つの最良カテゴリーへ分類した：正常、スパイク、スパイク波または進行性電子記録発作。各ＥＥＧに対して対を成すビデオクリッピングは、発作に関する修飾ラシーヌスケールに従って分類した：１＝口および顔面の動き、２＝頭部頷き、３＝前肢クローヌス、４＝立ち上がり、および５＝立ち上がりおよび転倒（体位制御の損失を伴う完全間代性運動発作）、ならびに追加のカテゴリーである激しい震えに関するＷＤＳおよび疾走−跳躍発作に関するＲ。カテゴリー３、４および５は場合によっては、「間代性発作」のスーパーカテゴリーへ組み合わせられた。各セッションで生み出された３つのうちの最もエレクトログラフ的に長期にわたる発作を、ほとんどの場合スコア付けするのに最初に使用した。

オプシン発現検証
[00115] ビデオ−ＥＥＧ記録の完了時に、ラットをノックダウン箱中でイソフルラン（Sigma）により深く麻酔をかけて、０．１Ｍ ＰＢＳおよびＰＢＳ中の氷冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に潅流させた。脳を抽出して、４％ＰＦＡ中に４℃で一晩固定した。脳を４℃で、ＰＢＳ中の１０％、２０％、続いて３０％ショ糖で平衡化した。冠状切片（５０μｍ）を凍結用ミクロトーム（ＨＭ ４３０ スライディングミクロトーム、Thermo Scientific Inc.）上で調製した。連続した切片（５００μｍ間隔で）を顕微鏡スライドガラス上にマウントして、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＥＬ６０００）を用いてオプシン発現を検査した。

[00116] 免疫組織化学に関して、浮遊性切片を、２％の標準的なロバ血清、１％ウシ血清アルブミンおよび０．２％トリトンＸ−１００で３０分間加工処理して、マウスモノクローナルＣａＭキナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα、１：４００、Abcam、ケンブリッジ、ＭＡ）、マウスモノクローナル汎ニューロンマーカーＮｅｕＮ（１：２００、EMD Millipore、テメキュラ、ＣＡ）、ウサギポリクローナルパルブアルブミン（１：１０００、Millipore、ビルリカ、ＭＡ）、ウサギポリクローナルガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ、１：１０Ｋ、Calbiochem、サンディエゴ、ＣＡ）およびウサギポリクローナルグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、１：４００、Millipore、ビルリカ、ＭＡ）に対する一次抗体に、４℃で４８時間曝露させた。次に、切片をＰＢＳで洗浄して、室温で２時間、二次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合ＡｆｆｉｍｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（ともに１：１０００、Jackson Laboratories、ウエストグローブ、ＰＡ）とともにインキュベートした。二重または三重免疫蛍光を、レーザー共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ ６５００）で評価した。

実施例Ｃ
てんかんに関する神経刺激の変換
１．課題、革新および影響評価：
[00117] 深部脳刺激（ＤＢＳ）は、パーキンソン病、振戦、うつ病、疼痛、てんかんおよび多くの他のものを含む脳障害に関して潜在的に有用な新たな治療法である。しかしながら、ＤＢＳメカニズムの初歩的な理解が有効性を制限する。ＤＢＳは、局所組織を阻害または励起させて、ネットワーク同期性を崩壊させて、通路の線維を活性化させて、不確かな遠隔作用を発生させることができる。最良の標的は必ずしも既知ではないが、使用される標的は、刺激に対するそれらの応答では不均一である。臨床試験における刺激パラメーターは、大部分が推量である。新たな技術であるオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）は、これらの制限を克服する立場にある。ｏｆＭＲＩは、神経学的状態に関与する特異的脳ネットワークを表示することができ、脳の全３Ｄ空間におけるニューロン活動を可視化することができる。オプトジェネティクスは、光の制御可能かつ反復可能なパルスにより、特異的ニューロン集団を励起または阻害させることができる。ｏｆＭＲＩを使用して、脳刺激のメカニズムを精査することが可能であり、得られた洞察を、電気脳刺激に対する合理的アプローチを設計するのに用いる。例としててんかんを使用して、海馬から伝播する発作の制御可能なモデルを開発して、伝播ネットワークを通じてこれらの発作を追跡または阻害し、オプトジェネティックマッピングにより発見される小領域およびパラメーターへ電気刺激を仕立ててもよい。

２．論理的根拠：
[00118] てんかん用のＤＢＳは、治療的ＤＢＳの見込みおよび制限の実例として解することができる。投薬抵抗性てんかんに関する脳刺激の２つの近年の多施設無作為対照試験（１つは本出願人により導かれる）は、統計学的に有意な有益性を示したが、ほんの約４０％の発作の中央値の低減を有したに過ぎなかった（図１３）。視床前核（ＡＮＴ）は、ほとんどの発作が由来する刺激の前面および近心側頭領域に影響を与えるその能力のため、試行の１つにおいて刺激の標的として使用された。有益性の度合いは、刺激のパラメーターに非常に依存した。例えば、１人の患者は、５Ｖの刺激が６分サイクルで活性化されるたびに、発作が誘発されたが、続いて４Ｖの刺激による発作では、実質的な低減が見られた。刺激の最良のパラメーターが既知である場合に、どれくらいより多くの有益性が実現されたのであろうか？最良の電圧（または電流）、刺激周波数、パルス幅、両極性対参照刺激、連続的、間欠的または応答性刺激とは何であろうか？最も重要なことには、最良の標的とは何であろうか？ターゲッティングは、電極を配置させるための全般的な領域だけではなく、通路の線維の活性化を伴って、または伴わずに、特異的細胞集団を刺激するための努力を包含する。例えば視床下核の刺激は、皮質−視床下線維の逆行性活性化により発作を阻害するとされてきた。ＡＮＴＳの電気刺激は、局所ニューロンだけでなく、乳頭体視床束（mammillothalamic tract）、セロトニン作動性、コリン作動性およびグルタミン酸作動性の通路の線維もまた活性化する。

[00119] オプトジェネティクスは、電気的刺激よりもはるかに高い特異性で脳回路を調節することができる新規技術である。特異的細胞集団は、隣接する通路の線維に対してごくわずかな影響で選択的に励起または阻害させることができる。ｏｆＭＲＩは、オプトジェネティック制御をｆＭＲＩ読み出しと組み合わせることにより、特異的細胞集団のオプトジェネティック刺激により活性化される下流構造を強調させることができる。特異性のかかる度合いは、将来の臨床試験の設計において大いに役立つ。例えば、近心側頭または外側側頭発作病巣に対して近心前面補足運動領域発作病巣に影響を与えるように、電気刺激はどこで起きるべきであるか？数百ヘルツ（Ｈｚ）での非常に高周波数刺激は、低周波数刺激よりもてんかんに関与する回路を良好に阻害するのであろうか？刺激の有害な二相励起−阻害効果を最低限に抑えることはできるのか？ｏｆＭＲＩマッピングの特異性は、これらの難解な問題を明確にするこれまでに得られなかった機会を提供する。てんかんを治療するために実際のオプトジェネティック技術を使用するのは、今後数年であり得る。探索ツールとしてのオプトジェネティクスの精度および有効性は、どのようにして電気刺激が適用されるかどうかを変換し得る。

３．アプローチ：
[00120] 本発明の各種態様は、下記の通りに概説され得る。

[00121] オプトジェネティクス発作モデル開発：オプトジェネティック刺激により生産される海馬発作のモデルを開発および検証して、精密な解剖学的始点、起源の細胞型および発作オンセット時間を有するモデルを提供する。このことは、てんかんのための神経刺激療法の系統的な研究および最適化を容易にする。

[00122] 細胞型特異的神経刺激による発作の阻害：特異的細胞型の制御を可能にするオプトジェネティック刺激を使用して、発作を阻害する（行動強度を防止するか、短くするか、または改善する）ことが最良に可能である最適な刺激標的およびパラメーターを同定する。本発明者らの研究は、以下の背景セクションで論述するように、海馬発作の伝播経路を研究することにより開始する。オプトジェネティック阻害性および崩壊的刺激技法を使用して、発作を阻害し得るこの経路に沿って、重要な構造を決定し得る。

[00123] 電気刺激への転換：このセクションでは、最初の２つの目的から学び取れる教訓を使用して、電気刺激療法の最適化を加速させる。ラットＡＮＴにおける種々の電気刺激パラメーターにより生産される代謝解剖学は、現在の臨床的変動のより良好な理解を得るために研究され得る。電気刺激のパラメーターは、目的２で同定される首尾よいオプトジェネティック刺激により生産されるものに最も似ている脳活性化パターンを生産するように設定され得る。このことは、その刺激の、オプトジェネティック発作モデルおよびＧＡＢＡアンタゴニスト、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）により作製される従来の全身性発作モデルを阻害する能力により評価される。目的１の時間的に正確な海馬オプトジェネティック発作モデルを使用して、抗発作効果がどのようにして、ＡＮＴへの電気刺激後に持ちこたえるかを決定し得る。これらの実験は、てんかんのためのＤＢＳの臨床的役割を変革するための道を開き得る。

背景
[00124] オプトジェネティクスは、単一構成要素の微生物光活性化膜コンダクタンス制御因子が、細胞型特異的プロモーターを使用して特異的に標的とされる細胞型および回路要素へ導入されて、ｉｎ ｖｉｖｏでミリ秒スケールの標的活動調節を可能にする革命的な神経調節技術である。チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）は、４７０ｎｍの青色光への曝露後にＮａ＋イオンが細胞に入るのを可能にする一価陽イオンチャネルであるのに対して、ハロロドプシン（ＮｐＨＲ）は、５８０ｎｍの黄色光による照射時に活性化するクロライドポンプである。これらの２つのタンパク質の最適活性化波長が１００ｎｍ以上離れているため、それらは、活動電位発火（firing）を開始するために、または無傷組織において神経活動を抑止するために独立して制御することができ、一緒にニューロン同期性を調節し得る。両方のタンパク質が、ミリ秒のスケールで迅速な時間的キネティクスを有し、ＣｈＲ２を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで信頼性ある一連の高周波数活動電位を駆動させて、ＮｐＨＲを使用して一連の高周波数スパイク内で単一活動電位を抑止することが可能である。これまでは、神経科学における最大の課題の１つは、脳の種々の回路要素を選択的に制御して、その機能を理解することの難しさであった。オプトジェネティクスは、遺伝的に標的とされる回路要素のｉｎ ｖｉｖｏ制御を可能にすることにより、各回路要素の系統的寄与の研究を可能にする。

[00125] ｏｆＭＲＩ技術（図１４〜図１６）は、オプトジェネティック制御を高磁場ｆＭＲＩと組み合わせることにより、脳回路要素の正確な制御および脳に対して生じる因果的効果の可視化を可能にする。ｏｆＭＲＩを使用した本発明者らの初期研究では、脳回路要素が、それらの遺伝的同一性、細胞体の位置および軸索突出標的に基づいて、首尾よく制御およびモニタリングされた。ラットのＭ１皮質における細胞体を有する興奮性ニューロンの選択的励起は、局所皮質（図１４）、線条体を含む遠位野、および視床（図１５）における頑強な活動測定をもたらした。同様に、神経活動は、従来のＧＲＥ−ＢＯＬＤ ｆＭＲＩ技法と比較して、通過帯域ｂＳＳＦＰ ｆＭＲＩ技法（次のパラグラフで記載する）を使用して、線条体および視床において脳全体にわたって、より正確にマッピングされることが実証された（図１５）。ｆＭＲＩシグナルの時間的動態はまた、高い時間的分解能を有する電気生理学的測定と強力な相関関係を有することがわかり、ｆＭＲＩ血行動態応答が、時間的な神経活動パターンを正確に反映することを示した。また、視床前部および後部において興奮性ニューロンを標的とすることは、各領域のネットワーク結合性に関する既存の文献と一致した頑強な局所および長期活動を実証した。さらに、Ｍ１皮質から突出している軸索線維の選択的励起は、遺伝的同一性のほかに、配線パターンを使用して、脳を選択的に標的として、モニタリングすることができることを示した（図１６）。これらの見解は、ｏｆＭＲＩが、機能的回路解析ならびに機能障害性回路網の包括的な表現型決定に適した有力なツールを規定することを実証する。

[00126] 通過帯域ｂ−ＳＳＦＰ ｆＭＲＩは、各励起反復間隔（Ｔ_Ｒ）中に完全に平衡化される勾配パルスと組み合わせた迅速なラジオ周波数励起パルスを利用する新規ｆＭＲＩ法である。その短い読み出し時間およびＴ_Ｒに起因して、ｂ−ＳＳＦＰは、完全脳、高分解能機能的画像法に適した歪みを含まない３Ｄ画像法を提供する（図１６）。従来のｆＭＲＩが、深部脳構造を含む全脳を研究するための非侵襲的手順を提供する非常に首尾よい技法である一方で、それは、その現在の形態で神経機能の精密な評価に対してかなりの制限を有する。より大きな空間的歪みに起因して、脳の大部分を画像化することはできない。空間的分解能はまた、最先端の神経科学に必要な情報を提供するための有意な改善を必要とする。通過帯域ｂ−ＳＳＦＰ ｆＭＲＩは、歪みを含まない３Ｄ等方性分解能画像を得る方法を提供することにより、ある特定の重要な問題に関してｆＭＲＩの収穫を大いに高める。

[00127] 近心側頭領域からの発作拡散の解剖学：以下の目的１では、近心および外側海馬において正確に発生する発作により活性化される脳領域が可視化され得る。いわゆるパペッツの回路が活性化され得る。図１７は、近心側頭領域に由来する発作に関するパペッツの回路を介した主な（しかし、それのみではない）伝播経路を表す。近心側頭領域に由来する複雑な部分的および二次性全身性発作は、てんかんを伴う成体の間で最も蔓延している難治性発作を含む。領域ＣＡ１からの海馬流出は、海馬采および脳弓に集まる（図１７における＃３）。脳弓は、視床下部後部における乳頭体の内側（＃５）および外側（＃６）領域への入力を提供する。外側乳頭核が、ＡＮＴの両方の前背側核部分に両側で突出する一方で、内側乳頭核は、前腹側および前内側部分へ同側のみで突出する。乳頭体視床束（ＭＴＴ）を切断することにより、ＰＴＺ誘導性発作に関する閾値が増加し得る。逆に、ラットおよび患者において乳頭体を電気的に刺激することにより、発作が阻害される。さらに、脳弓は、視床前核（ＡＮＴ、＃８）へ直接的に、後交連分岐を送る。

[00128] ＡＮＴの前腹側（ＡＶ）亜群は、この群の核における一次核であり、ＡＮＴの前内側または前背側核に関して具体的に言及されない限りは、動物文献は通常、前腹側（ＡＶ）視床という用語をデフォルトとする。ＡＮＴは、てんかんのための電気刺激の標的として大規模対照臨床試験で有効であると証明された唯一の特異的脳領域として、特殊な意義を保持する。海馬流出はまた、ＭＴＴ（＃７）を介してＡＴＴへ流れる。ＡＶへの他の重要な入力は、視床網様体から生じ、小〜中サイズのシナプス、帯状回皮質および脳幹で終結する。

[00129] ＡＮＴ出力は、主に脳梁膨大後部皮質に対してであり、これは、帯状回（＃９）の一部であり、ブロードマン野２６、２９および３０を表す。ＡＶはさらに、海馬台、後海馬台、前海馬台、傍海馬台および尾側嗅内皮質に突出する。帯状回皮質は、海馬台および海馬に戻って突出し、パペッツの回路のループを完了させる。以下の目的２では、発作伝播および開発は、パペッツシステムの中間点および小領域（例えば、内側および外側乳頭体、ＡＮＴに対する直接脳弓束、およびＡＮＴにおける細胞体）でオプトジェネティック技法を使用することにより阻害され得る。

[00130] 神経伝達物質系。神経伝達物質系の操作は、電気刺激の治療上の効果を調節するための別の方法である。伝統的な研究は、薬理学的遮断を用いて、薬物またはデバイスの治療作用における神経伝達物質系の役割を解明している。神経伝達物質アンタゴニストは、様々な度合いの特異性を有し、遮断はほとんどの場合、関心対象の系の外側にある効果をもたらす。オプトジェネティック技法は、関心対象の特異的経路において神経伝達物質系の不活性化または励起を可能にする。このアプローチは、標的とされる刺激療法の設計により有用に情報を与える。二次的な有益性は、薬物設計につながり得る。

[00131] ＡＮＴのＡＶ核は、正中縫線由来のセロトニン末端のマーカーで任意の視床核の最も大量に標識されたものである。これまでの研究によれば、ラットのＡＶにおけるセロトニンの上昇は、けいれん薬であるＰＴＺにより生じる発作を阻害する。逆に言うと、ＰＴＺ発作に関して閾値を上げるためのＡＮＴ電気刺激の有益な効果は、セロトニンアンタゴニストであるメチルセルジドにより大規模に阻止される。コリン作動性線維は、メソポンチン被蓋の２つのコリン作動性細胞群、主に背外側被蓋核、およびより少ない程度で脚橋被蓋核からＡＶへと進む。ＡＶへのこれらの上行性コリン作動性求心路は、乳頭体および皮質からの興奮性入力を調節し得る。ＡＶは、視床皮質突出ニューロンの遠位樹状突起を主に神経支配するＡＶに対するグルタミン酸作動性線維を使用して、脳梁肥大後部帯状回皮質による入力−出力ループに関与する。ＡＶにおける軸索末端の約１２％が、ＧＡＢＡマーカーに対して陽性であり、これらの末端は、視床網様体、前脳基底核または脳幹で生じ得る。これらのシナプスは、樹状突起および細胞体上で対称的であり、樹状突起および細胞体上に形成する。ＡＶがＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを含有するかどうかについて議論されるが、いずれも１つの最近の研究では同定されなかった。

[00132] オプトジェネティクスの寄与：てんかんのためのＡＮＴを刺激する際の限られた可変的な成功に関する最も可能性が高い理由の１つは、核の複雑さである。ＡＮＴ解剖学に関する概要背景が示す通り、様々な入力、出力、ＡＮＴの巨大細胞および小細胞部分、多数の神経伝達物質系、同側性および両側性経路は全て、視床前部電気刺激の徴候に影響を与える。オプトジェネティック技法は、刺激に対する治療上の応答の重要な構成要素をばらばらにするのに理想的に適している。そうすることにより、より正確に標的とされる電気刺激を用いて将来の研究が誘導される。例えば、３次元でのＤＢＳ効果の有限要素モデリングは、発火のためのより高い閾値を有する細胞体を用いて、シナプスおよび通路の線維のための電極付近に興奮性効果を実証する。したがって、ＡＮＴにおけるある特定の線維系が、決定的に重要であることがわかった場合、刺激は、それらの系を優先的に活性化するように設計され得る。重要な亜集団の知識はまた、刺激の副作用を最低限に抑えるのを助長し得る。記憶障害は、てんかんのためのＡＮＴ刺激の臨床試験において刺激を受けた患者により報告された。オプトジェネティック研究からの知識により導かれる準備した刺激を用いて、記憶障害に関与されると考えられる細胞質不活性化が回避されてもよい。

[00133] この提唱では、新規ｏｆＭＲＩ技術と刺激および発作モデルとの合併により、電気刺激およびオプトジェネティック刺激による発作制御の考え得るメカニズムを明確にする画期的な機械が提供される。以下の説明は、このプロジェクトが達成すると提唱する３つの特異的な目的に従って、三部に分割される。

[00134] 目的１．発作起源およびオンセット時間の精度を伴って、オプトジェニック的に発作を誘導すること：内側および外側ＣＡ１において阻害性介在ニューロンまたは通路の線維の直接的な刺激を被ることなく、発作は、錐体ニューロンをオプトジェネティック的に刺激することにより発生する。続いて、発作は、ｏｆＭＲＩを用いて、連関した脳ネットワークを通じて追跡される。ｏｆＭＲＩシグナルの神経生理学的基礎は、局所電場電位の測定およびｏｆＭＲＩ活動の位置での単一ユニット記録により研究される。発作モデルはまた、ＥＥＤおよびビデオ記録された動物行動の盲検比較により検証される。化学的または電気的操作により作製される他の従来の発作モデルを上回るこの発作モデルを使用することの利点は、起源の特異的細胞の知識、ならびに光のパルスを用いて、迅速におよび繰り返して発作を発生させる能力に存する。このセクションで試験されるべき３つの仮説は、ａ、海馬における錐体ニューロンのオプトジェネティック刺激が、近心側頭発作の従来のモデルで見られるのに匹敵する発作の開始を導くこと、ｂ、発作が、刺激周波数のパラメーター、および海馬内の刺激の特異的な位置に依存すること、ｃ、選択した細胞集団の活性化により生じるオプトジェネティック的に発生させた海馬発作が、繰り返し可能な規定様式で他の脳構造へ伝播することである。

[00135] 提唱モデル：発作を開始させるには、錐体ニューロンが、内側および外側ＣＡ１でオプトジェネティック的に刺激され、これが、パペッツの回路への海馬の流出と即座に結合される。ＣＡ１は、潜在的に不均一な結合を有する大構造であるため、脳ネットワーク、内側および外側の位置は、比較用に選択される。刺激は、毎秒１、１０、６０、１００パルスで適用させた。本発明者らの予備実験に基づいて、刺激位置および周波数に応じる別個の発作応答が予測される。オプトジェネティクスアプローチを用いて、本発明者らの目標は、発作の無類の正確な可逆的オンセットを得ることである。ｏｆＭＲＩと組み合わせたかかる正確な発作発生は、ｉｎ ｖｉｖｏで無傷の全体的な脳ネットワーク内での発作伝播をモニタリングする画期的な能力を潜在的に可能にすることができる。このことは、本発明者らが発作を特徴付けて、戦略を設計して、それらを阻害するのを助長する。

[00136] 選択的オプトジェネティック刺激：このプロジェクト全体にわたって、錐体ニューロンを特異的に刺激および阻害するために、ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰおよび／またはＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙを注射する。ＡＡＶ５は、それが順行性標識を生成するため、注射の部位で細胞体を有するニューロンを選択的に標的とする。ＣａｍＫＩＩａプロモーターを使用して、錐体ニューロンにおいてのみＣｈＲ２またはＮｐＨＲを生産し、および／またはｍＣｈｅｒｒｙを使用して、検証のためのＣｈＲ２およびＮｐＨＲ発現を共局在化させる。ウイルスの注射のための手術からの回復および光ガイド移植後に、青色および／または黄色光を使用して、ニューロンをオプトジェネティック的に誘発する。セロトニン作動性およびコリン作動性ニューロンの選択的な刺激に関して、ＣｈＲ２を選択的に発現するセロトニン作動性およびコリン作動性ニューロンを有するＴＰＨ２−ＣｈＲ２およびＣｈａＴ−ＣｈＲ２トランスジェニックマウスが使用される。トランスジェニックマウスに対する手術は、青色光刺激を送達するための光ガイドの移植のみを含む。目的１では、本発明者らの目標は、ＣＡ１において錐体ニューロンを刺激することにより、てんかんのモデルを作製することである。しかしながら、同様に、目的２および目的３で種々のタイプのニューロンターゲッティングを容易とするために、ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰが、正常なラットならびにＨＰ２−ＣｈＲ２およびＣｈａｔ−ＣｈＲ２トランスジェニックマウスのＣＡ１において注射される。

[00138] ｏｆＭＲＩ：オプトジェネティクスの正確な時間制御を用いて、刺激を周期的に適用させて、ｏｆＭＲＩスキャンが、生じる脳ネットワーク活動をモニタリングするのを可能にする。青色光は、全脳をスキャンしながら、１分毎に２０秒間、総計６分間、毎秒１、１０、６０、１００サイクルで送達させる。Ａ７−Ｔ−Ｂｒｕｋｅｒ小動物専用ＭＲＩシステムを使用する。動物を、特注設計した定位クレードル内に配置させる一方で、挿管して、光イソフルオラン麻酔（およそ１．３％）で換気させる。画像は、全脳を網羅しながら、０．５ｍｍ等方的分解能で、毎秒１．３４フレームで連続的に獲得される。

[00139] ＥＥＧおよび行動：ｏｆＭＲＩ研究後、発作モデルとしての検証のため、海馬および頭蓋骨表面においてＥＥＧを記録しながら、行動研究を行う。ｏｆＭＲＩ研究が終わった後、動物に、ＥＥＧ電極移植に関するさらなる手術を施す。動物が手術から回復した後、動物は、注意散漫となる刺激を伴わずにダイヤモンド形状の箱に順化させる。形状は、角で切り落とされ、動物を正面から可視化するのを助長する。動物には、試行の間、バナナ片を与える。記録は、ベースラインの５分間、５、１０および１５分での２０秒のオプトジェネティック光刺激（間での４：２０の刺激なし）を実施した。実験は２０分続く。１時間半の休憩間隔で、刺激周波数の種々のパラメーターは同様に、無作為順序で試験される。試験は、各動物について二度繰り返す。刺激中、ビデオは、ＥＥＧ記録とともに記録される。発作モデルは、デジタル的にクリッピングされたＥＥＧセグメントおよびラット行動のビデオを盲検的に比較することにより検証される。共同研究者の従来の方法に従って、既知の発作（休憩、睡眠、活動探索、摂食、匂いを嗅ぐ動作）なし、オプトジェネティック刺激由来の発作およびＧＡＢＡアンタゴニストビククリンメチオダイドのカニューレ注射（０．１ｍＭ、正中縫合の左へ２ｍｍ、ブレグマの後側４ｍｍおよび皮質の表面へ深さ２．５ｍｍで、左海馬へ２μＬ）由来の発作の期間、サンプルを採取する（図１９）。オプトジェネティック刺激、ビククリン注射した動物および介在する非発作期間のＥＥＧのクリッピング（ビデオはなし）（図１９）を、処理群を知らされていない２人の脳波記録者によりスコア付けする。各クリップは、１つの最良のカテゴリーに分類される：０＝標準、１＝異常であるが、てんかん様活動なし、２＝発作間欠期てんかん様活動、３＝発作性てんかん様活動。同じセグメントからのビデオクリップは、ＥＥＧなしで提示され、発作に関するラシーヌスケールに従って分類される：１＝口および顔面の動き、２＝頭部頷き、３＝前肢クローヌス、４＝立ち上がり、５＝立ち上がりおよび転倒、体位制御の損失を伴う完全運動発作。群間の差の有意性は、ノンパラメトリック比例差検定により評価する。

[00140] 局所電場電位（ＬＦＰ）および単一ユニット記録：ＬＦＰおよび単一ユニット記録は、基本的な神経活動を同定するために、活動領域としてｏｆＭＲＩにより同定される部位で行われる。２つのシリコン１６チャネルプローブを有するＰｌｅｘｏｎ３２チャネル記録システムを使用して、刺激しながら多重部位から記録した。重大な記録は、イソフルラン麻酔下で実施される。ＬＦＰおよび単一ユニットは、常に一緒に記録される。これらの記録は、末端手順として行われるため、このことは、ｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動試験後に行われる。

[00141] 本発明者らの予備研究では、青色光を使用して、１分間隔で２０秒間を６分間、毎秒６、１０、２０、４０および６０サイクルでニューロンをオプトジェネティック的に誘発した。低頻度（１０Ｈｚ）での内側ＣＡ１における椎体ニューロンの刺激は、活動が、ＣＡ１、歯状回（ＤＧ）、ＣＡ３、海馬台および脳梁膨大後部皮質の部分を含む領域に広がることを示した（図２０ａ）。しかしながら、著しい差は、２０Ｈｚでの刺激の場合に観察された。ここで中隔核およびより大部分のＣＡ１、ＤＧ、ＣＡ３、海馬台および脳梁膨大後部皮質を含むかなり広い野が動員される（図２０ｂ）。空間的活性化パターンのさらなる定量的解析は、各領域に関する活性ボクセルの数をプロットすることにより行われた。バーの色は、活性ボクセルの平均期を示す（図２０ｃ、図２０ｄ）。このことにより、１０Ｈｚに比較して２０Ｈｚの刺激の場合に、活動容量の有意な増加が明らかに実証される。さらに、野は全て、特に海馬台で、より有意に高い相を表示する。周波数依存性相の供給源を研究するために、ｏｆＭＲＩ血行動態応答機能（ＨＲＦ）は、海馬台における一般的に活性なボクセルに関して、６、１０、２０、４０、６０Ｈｚでプロットした（図２０ｅ）。これにより、ＨＲＦにおける非常に明確な動向が示され、ここで２０Ｈｚを超える刺激のみが、刺激オフセット後におよそ２０秒の持続性高振幅を有するＨＲＦをもたらす。およそ２０秒間続くかかる持続性活動はまた、刺激持続期間に依存することがわかり、ここで５、１０、２０秒の刺激は全て、およそ２０秒の持続性ＨＲＦをもたらした（図２０ｆ）。

[00142] ＨＲＦにおけるかかる差はまた、局所電場電位（ＬＦＰ）および単一ユニット記録を使用して基本的な神経活動の精密な反映であると証明された（図２１）。１０Ｈｚの刺激で記録されたＬＦＰは、刺激オフセット後に神経活動の即時の減少を示す（図２１ａ）一方で、２０Ｈｚの刺激は、刺激停止後におよそ２０秒間、持続性ＬＦＰシグナルを示し（図２１ｂ）、ｏｆＭＲＩ−ＨＲＦ観察と一致する（図２１ｅ、図２１ｆ）。単一ユニット記録により、２０Ｈｚを超える速度での刺激が、刺激オフセット後に持続性神経スパイキングをもたらす一方で、低周波数刺激は、刺激中にのみ、スパイキングを付与する類似の動向が明らかとなる（図２１ｃ〜図２１ｅ）。興味深いことに、対側では、光学刺激の結果として阻害されるニューロンもまた観察され得る。さらに、阻害は、高周波数刺激で、刺激オフセット後に続いた（図２１ｆ）。

[00143] これらの結果は、２０Ｈｚを超える刺激が、１０Ｈｚと比較して、発作のより効率的な発生をもたらすことを示唆する。

[00144] 位置依存性をさらに探究するために、外側ＣＡ１を高周波数（６０Ｈｚ）で刺激した。これにより、内側ＣＡ１刺激と比較して、全脳にわたって観察される劇的に異なる活動パターンが生じた。外側ＣＡ１光学刺激は、パペッツの古典的回路を活性化し（図１７）、海馬から、脳弓への、視床下部の乳頭体への、視床前部への、帯状回皮質への、帯状束への、嗅内皮質への、そして海馬へと戻る経路を誘起する（図２１）。

[00145] 外側ＣＡ１における４０秒の刺激による予備行動研究（以下の表）は、非常に低い光パワーでの偽刺激では効果なしを示す一方で、１０Ｈｚでの十分な光パワー刺激は、ラシーヌステージ２の発作を誘導する。２０および４０Ｈｚでの刺激は、ラセーヌステージ５の発作を誘発する。このことは、穏やかな行動またはラセーヌステージ１の行動のみが、全ての周波数（１０、２０、４０Ｈｚ）に関して観察される内側ＣＡ１刺激と明確に対照的である。このことは、内側ＣＡ１刺激により動員される、主として局所海馬領域を示す一方で、パペッツの回路は、外側ＣＡ１刺激により動員されるｏｆＭＲＩの見解と一致する。

[00146] この目的で、１５匹の雄スプラーグ−ドーリーラット、５匹の雄ＴＰＨ２−ＣｈＲ２および５匹の雄ＣｈａＴ−ＣｈＲ２トランスジェニックマウスが使用される。５匹のラットはそれぞれ、内側ＣＡ１および外側ＣＡ１で移植および刺激され、５匹のラットにビククリンメチオダイドを施す。ｏｆＭＲＩはまず、ＣＡ１光ガイド移植を有する１０匹のラットに関して、毎秒１、１０、６０、１００サイクルの刺激周波数で行われる。ＥＥＧおよび行動試験は、モデル検証に関して、ＣＡ１において光ガイドを有する１０匹のラット、およびビククリン注射したラットで行われる。この後、ｏｆＭＲＩマッピングに付された１０匹のラットは、ＬＦＰおよび単一ユニット記録を受けて、ｏｆＭＲＩシグナル変化の神経生理学的相関物を同定する。次に、目的２のセロトニン作動性およびコリン作動性オプトジェネティック実験はマウスにおいてのみ実施され得るため、ＴＰＨ２−ＣｈＲ２およびＣｈａｔ−ＣｈＲ２を使用して、ラットで同定される場合に最適な発作発生パラメーターを有するマウスにおける提唱発作モデルを作製する。マウスモデルは、ｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動を通じてラットモデルと比較して検証される。予備データは、高周波数による外側ＣＡ１刺激が、要求に応じて伝播性発作の発生に関する最良の候補物であることを示唆する。

[00147] 予想される結果：海馬錐体細胞のオプトジェネティック刺激は、特異的パターンの広がりを有する再現可能な、および信頼性の高い発作を生じる。非発作セグメント、従来のけいれん薬（ＢＭＩ）およびオプトジェネティック刺激により生じる発作からのＥＥＧの盲検評価は、オプトジェネティック発作モデルが従来のモデルに非常に匹敵するが、より実験的に制御可能および解釈可能であることを示す。

[00148] 目的２．細胞型特異的神経刺激による発作の阻害。このセクションでは、オプトジェネティック的に誘導される海馬発作を追跡することができ、発作を阻害するための最良なオプトジェネティック位置およびパラメーターが決定され得る。ＮｐＨＲによるオプトジェネティック阻害の効果、ならびにＣｈＲ２による崩壊的励起が探究され得る。崩壊的励起性オプトジェネティック刺激は、それが下流構造を脱同期させて、機能的に阻害することにより、最も電気刺激に近似するため、試験される。ここでの仮説は以下の通りである：ａ、ＮｐＨＲによる神経阻害は、ＮｐＨＲ阻害の領域に依存して種々の度合いの有効性で、新皮質への海馬発作拡散のｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動証拠を阻止する。ｂ．ＣｈＲ２による崩壊的神経励起は、ＣｈＲ２崩壊的励起の領域および刺激の周波数に依存して種々の度合いの有効性で、新皮質への海馬発作拡散のｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動証拠を阻止する。ｃ．ＡＮＴにおけるコリン作動性線維のセロトニン作動性および崩壊性（阻害性）励起の細胞型特異的光誘導励起は、新皮質への海馬発作拡散のｏｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動証拠を阻止する。これが有効であると判明すれば、ＤＢＳと、薬物療法、例えば選択的セロトニン最取込み阻害剤との組合せが考慮され得る。

[00149] 目的２における研究に関して、全ての動物は、青色光刺激に関して光ガイドともに外側ＣＡ１に滴下注入されたＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを有する。研究中の治療上の標的に応じて、全ての動物は、他の位置でさらなる注射および／またはプローブを有する。治療上の刺激のための一側性オプトジェネティック刺激を使用し得るが、残留発作が観察される場合には、両側性刺激が使用され得る。目的２のａおよびｂにおける錐体ニューロンの治療上の阻害および励起に関して、ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰおよびＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙの両方が本発明者らの標的領域へ注射される。本発明者らの注射標的としては、内側および外側乳頭体、脳弓束が由来する海馬（ＡＰ＋５．３、ＤＶ＋７．１、Ｌ±０．７、イヤーバーに対して）が挙げられる。これらの領域へ順行性ウイルスを注射すること、およびＡＶにおいて刺激することにより、特異的な解剖学的起源の流入線維を選択的に阻害または励起することが可能であり得る。ＡＶ刺激によるＡＶにおける注射は、ＡＶにおいて細胞体を有する錐体ニューロンの特異的刺激を可能にする。これらの経路の１つを選択的に不活性化することまたは崩壊的に刺激することが、電気刺激の抗けいれん効果の発生要素を同定するということが仮説である。ＡＶへのセロトニン作動性およびコリン作動性突出の役割を試験するために、セロトニン作動性ニューロンおよびコリン作動性ニューロンにおいて特異的にＣｈＲ２発現を有するトランスジェニックマウスが利用され得る。これまでの研究に基づいて、セロトニン作動性ニューロンが刺激される一方で、コリン作動性ニューロンは、治療上の有効性に関して崩壊的に刺激される（すなわち、機能的に阻害される）。総計６つの治療群に関して、それぞれ５匹の動物が使用される。

[00150] 光刺激は、毎秒１、１０、６０、１００パルスでの黄色光阻害または青色光刺激で試験される（トランスジェニック動物に関しては青色光のみ）。動向が、より高い周波数からの有益性を支持する場合、１００Ｈｚよりも大きい周波数で刺激するのに、代替的なオプシンが使用される。

[00151] オプトジェネティック刺激は、３０秒間：発作の開始前の１０秒、および発作を発生するのに使用される２０秒長の刺激の終結後の１０秒で、２つの時点で各実験において導入される。このことは、発作阻害メカニズムの全般的なマップを得るために、ｏｆＭＲＩスキャン中に１分毎に６分間、繰り返される。さらに、ＥＥＧおよび行動試験を使用して、治療の有効性を等級分けするのに使用される。テンネセンは、海馬培養スライスモデルにおいて、５〜１０秒の阻害性刺激を利用した。ｉｎ ｖｉｖｏでの実験に関して、十分に長い持続期間が選択され得る。

[00152] 予想される結果：海馬で発生する発作は、広がり経路のオプトジェネティック操作により、阻害されるか、防止されるか、短縮されるか、またはその両方である。ＮｐＨＲによる直接的な阻害、およびＣｈＲ２による崩壊的励起が有効である。有益性の度合いは、刺激の特異的位置、ならびにオプトジェネティック刺激の周波数および持続期間に依存する。本発明者らの実験設計は、パペッツの回路に関して背景仮説なしで開始する。回路は潜在的に、発作伝播に関する概念的な過度の単純化であり、これは、海馬で発生する発作の実際の広がりを想像することにより改善され得る。ｏｆＭＲＩデータからのフィードバックを利用して、最適な標的に関する検索を精緻化し得る。本発明の方法は、体細胞の抗発作効果と通路の線維とを識別するためのてんかんの分野における初めてのもののうちの１つであり得る。

[00153] 目的３．電気刺激への転換。このセクションでは、臨床的実施への見解のより有効な転換に関する有益なオプトジェネティック刺激を最良に模倣するように、電気刺激が最適化され得る。３つの仮説は以下の通りである。ａ．様々な振幅および周波数でのＡＮＴの電気刺激は、ｆＭＲＩで撮影して、行動をモニタリングしながら、ＥＥＧは、全脳にわたる電気的刺激効果の特徴的なパターンを明らかにする。ｂ．電気刺激により目的２で同定される最適なオプトジェネテッィク刺激をまねることにより、発作は、オプトジェネティック発作モデルに関して、および全身性ＰＴＺ発作モデルに関して有効に阻害される。ｃ．治療上の電気刺激とオプトジェネティック的に誘導される発作との間の様々な時間間隔は、刺激の長い有益性がどのようにして存続するかどうかを開示する。このことは、臨床上の刺激レジメンの計画を非常に容易とする。

[00154] まず、脳に対する電気刺激の全般的な影響を理解するために、ＭＲ適合性プラチナテフロン絶縁線電極（http://www.plastics1.com）を、５匹の雄スプラーグ−ドーリーラットのＡＮＴにおいて両側で移植し得る。次に、刺激の影響は、様々な周波数および振幅で、ｆＭＲＩにより測定する。双極性刺激のヒト臨床試験パラメーターは、１Ｖ間隔で１〜１０Ｖに関して１４５Ｈｚ、０．１ｍｓの持続期間で始め得る。刺激は、１分間隔で２０秒間を６分間適用させ得る。より初期のＰＥＴ研究は、ＡＮＴにおける両側性電気刺激が、標的領域である視床および海馬でのグルコース取込みを増加させて、帯状回皮質および前頭葉におけるグルコース取込みを減少させたことを示している。このことは、電気刺激の影響がこれらのネットワークに関与することの良好な兆候であるが、より高い空間的分解能および時間精度を用いた研究が、本発明者らの目的に必要である。

[00155] 上記研究からの見解に基づいて、刺激電極を別の組の１０匹のラットに配置させ、刺激強度および周波数を調節して、目的２で同定されるような発作阻害に関する最適なオプトジェネティック刺激により生産されるｆＭＲＩ活性化パターンを最も緊密に模倣する。位置、周波数および強度のこれらのパラメーターに仕立てた電気刺激は、高度の有効性を伴う発作を阻害し得る。これは、１０匹のうち最初の５匹が、視床における電気刺激電極のほかに、外側ＣＡ１において移植されたオプトジェネティック刺激カヌーレを有する目的１からのオプトジェネティック発作モデルにおいてまず試験され得る。共同研究者によりこれまでに用いられたモデル（図２３）であるＧＡＢＡ_ＡアンタゴニストであるＰＴＺの尾静脈への注射により生じる間代および強直発作を使用して、他の５匹のラットに関する全身性発作レベルにおける見解をさらに試験し得る。オプトジェネティック発作モデルに関して、ｆＭＲＩ、ＥＥＧおよび行動試験は、刺激有効性の結果を測定するのに行われる。ｆＭＲＩは、1分毎に６分間、てんかんモデル作製に関して２０秒のオプトジェネティック刺激により行われる一方で、電気刺激は、オプトジェネティック刺激オンセットの１０秒前に３０秒間適用させる。ＰＴＺモデルに関して、生理食塩水中２０ｍｇ／ｍｌとしてのＰＴＺの連続注射は、注入ポンプにより５．５ｍｇ／ｋｇ／分の速度で注入される。てんかん様ＥＥＧ放電は通常、５分で始まり、約１０分で行動間代性発作を、その後すぐに強直発作を伴う。時間的経過は、用量注入速度を調節することにより圧縮または拡張され得る。これまでに、ＰＴＺ注入前に開始される０．１〜２０Ｖ（５〜８００μＡ）、１００μＳの両極性パルスによるＡＮＴの電気刺激は、発作のＥＥＧまたは行動の徴候を発生するのに必要とされるＰＴＺ用量（注入時間）を増加することが知られている。最初の発作に対するより長い注入時間（ＰＴＺのより高い必要用量）は、刺激の抗けいれん作用を表す。この全身性発作モデルに関して、刺激効率は、ＰＴＺ用量により測定される。

[00156] 連続的な電気刺激は、運動障害を治療するのに一般的に用いられるが、間欠性刺激が組織への刺激性が少ないと考えられ、それがバッテリー寿命を保存するので、てんかんを治療するための電気刺激は、1分のオンおよび５分のオフのようなクロックサイクルで伝統的に行われてきた。間隔刺激の合理的決定は、刺激後の治療上の影響の持続期間に依存すべきである。ヒツジにおける海馬ペニシリン誘導性発作の研究は、ＡＮＴ刺激の１０秒後に１〜２分間、スパイク抑止を示した。本発明によれば、ＡＮＴへの電気的刺激後に抗発作効果がどれくらい長く持ちこたえるかを、目的１の光誘発海馬発作モデルを使用することにより研究し得る。ｆＭＲＩ、行動実験およびＥＥＧを用いて、刺激の影響を測定する。特異的発作オンセット時間が、オプトジェネティック刺激で制御される一方で、治療上の電気刺激は、刺激オンセットの１０、５、３、１、０分で1分間開始し得る。ｆＭＲＩ実験に関して、治療上の有効性が目的３ｂにおいて最良に実証された関心対象の３つの領域を選択して、シグナル強度変化に関してモニタリングする。高いＳＮＲを保証するために、８回の測定を平均化する。ＥＥＧおよび行動は、目的１で記載される方法により評価する。

[00157] 予想される結果：ＡＮＴの電気刺激は、電気刺激パラメーターがどのようにして機能的出力を変化させるかを示し得る。この知識により、目的２で同定される最適なオプトジェネティック標的は、電気刺激により有効にまねることが可能であり、有望な治療標的をもたらす。目的１からの時間的に正確な発作モデルからの実験は、刺激間隔に関して最適なタイミングの適正な系統的理解を提供し得る。

[00158] 課題および危険性への直面：考え得るピットフォールおよび期待。上記で概説される斬新な研究計画は、アプローチの新規性に関連付けられる固有の危険性を有する。考え得るピットフォールおよびバックアップ計画は以下に概説される。

[00159] 高分解能、全脳ｏｆＭＲＩ。ＭＲＩは、Ｎｙｑｕｉｓｔサンプリング速度要件および逐次サンプリングに起因して、時間的および空間的分解能において従来制限される。小脳領域からの活動の高分解能空間的描写を容易とするために、圧縮された検出アルゴリズムが開発された。サンプリング下の高分解能獲得軌跡が特注設計されて、検出再構築アルゴリズムを圧縮して、およそ６倍のボクセル容量低減を得た。等方性２００μｍ分解能および毎秒１．３フレームの速度の平面内分解能が、全脳を網羅すると同時に達成される（図２４）。Ｌｅｅ Ｌａｂにおいて開発中のこの前例のない性能は、発作活動の精密な描写をさらに進めて、阻害メカニズムに関する本発明者らの研究を助ける。

[00160] 麻酔および発作。本発明者らの画像法研究は全て、イソフルラン麻酔を用いて行われる。イソフルランは、神経活動を阻害することが知られているが、それにも関わらず、本発明者らの初期研究は、発作活動の良好なｏｆＭＲＩ、行動および細胞ユニットの証拠を示した。しかしながら、発作が、麻酔により過度に抑止される場合、目的１で開始するモデルは、ＥＥＧ活性化および発作活動に対してあまり抑止効果を有さないことが知られているケタミンまたはエンフルオラン麻酔を使用して再度検証され得る。

[00161] 発作モデル。臨床上のてんかんは不均一であり、単一動物モデルは、臨床上のてんかんのサブタイプの１つさえもモデルを完璧にモデリングしない。本発明の各種態様は、３つのモデルを使用することを提唱する：新規で、海馬オプトジェネティック刺激により生じたもの、海馬へビククリンメチオダイド注射した第２の標準的局所発作モデル、および全身性発作の第３の標準的ＰＴＺモデル。本発明の各種態様は、ある特定のタイプの発作を研究し、自発的に再発性する発作を伴うてんかんの全般的な臨床単位は研究しない。これらの単純なモデルで開始することにより、てんかん治療法をより特異的および有効にさせる際にオプトジェネティクスの値が立証されることが、本発明者らの考えである。続いて、教訓は、他のモデルにおいて、最終的には臨床で検証され得る。

[00162] 伝播の付属的経路。パペッツの回路は、海馬の流出路だけでなく、これはまた、海馬交連（葉胃）および嗅内皮質を介して遠心性神経を有し得る。パペッツ経路が阻害される場合でさえ、これらの付属的経路は、発作の広がりを可能にし得ることが可能である。動物およびヒトにおける乳頭体および視床前部の刺激が、発作を低減する（図２３）ことは知られておらず、予備データはパペッツ回路の活性化を示す（図２２）が、ＡＮＴ刺激の不完全な有効性に関する理由として、他の経路を除外することはできない。ｏｆＭＲＩの重要な利点は、パペッツの回路の外側で活性化される脳領域を直接的に観察および同定する能力である。確認される場合には、実験は、観察される経路を包含するように修飾され得る。

[00163] 期待：本発明の各種態様は、まさにてんかんのためだけではなく、各種神経学的および神経外科的疾患のためにも、臨床医が神経刺激に関して臨床試験を設計する方法を変化させ得る。オプトジェネティック技法は、電気刺激技法よりもはるかに局部的であり、細胞型特異的であり、制御可能であるため、本発明のプラットフォームおよび方法論は、刺激の標的およびパラメーターに関する推量の多くを低減し得る。実のある研究室作業が、臨床的応用に先行すべきであり、これは、神経伝達の分野で非常に稀な事例である。本発明者らのプロジェクトは、合理的な基盤で神経刺激に関して治験設計を行うことに対する強力な工程であるはずである。

[00164] ４．変換研究プロジェクトプログラムに関する妥当性：神経刺激は、難治性神経学的疾患のための有用な新たな治療法として出現している重要な領域である。しかしながら、治療努力はこれまでのところ、経験的基礎に基づいており、完全に有効ではない。刺激標的の単純なパラメーター変化またはわずかな変化は、有益な効果を抹消するか、またはさらには症状を悪化させ得る。刺激要素の移植が侵襲性であるため、最大効果が必要とされる。本発明によれば、神経刺激は、新たなプラットフォームを確立することにより変換されて、治療結果に対するそれぞれの神経ネットワーク要素の寄与を系統的に試験し得る。てんかんは、初の実験の場であるが、習得した教訓は、神経刺激により潜在的に改善される多くの他の疾患に適用される。このプロジェクトは、迅速に誘発および終結させることができ、またニューロンの特異的集団から生じるてんかんモデルの初の開発を提供する。内側および外側海馬からの発作により活性化されるネットワークの可視化は、機能的発作解剖学の本発明者らの知識に対して新規に加味するものである。これらの実験は、オプトジェネティック阻害の使用により規定の伝播経路を通じて発作の広がりを中断することの初の実証を提供する。電気刺激がパルス終了後にどれくらい長く発作を阻害するかどうかの研究は、臨床上の刺激の合理的タイミングへの初のガイドの１つを提供する。重要な戦略は、電気刺激に対する有益な応答の極めて重要な構成要素を同定するのにオプトジェネティック技法の精度および再現性を使用することである。いつかは、オプトジェネティック神経調節がそれ自体、有用な臨床上のツールとなり得るが、さしあたって、電気刺激の構成要素を精査するための鋭いメスとして最良に使用される。本発明者らの予備結果は、前途有望であるが、この提唱で概説される目標は、分子生物学および細胞生物学、遺伝学、物理学、工学、神経解剖学および臨床神経学にわたって大望をもっている。これは、高い潜在的影響および高いリスクを有するプロジェクトである。変換研究プログラムは、かかるプロジェクトに資金提供するのに理想的に適しており、それにより科学を臨床により近いものにする。

[00165] ５．例示的なタイムライン。初年度には、目的１で概説されるように、発作のオプトジェネティックモデルが作製され得る。２０匹のラットを使用して、発作のラットモデルを作製し得る。２年目には、同じ実験を、目的１に関する２０匹のトランスジェニックマウスに繰り返し得る。さらに、２年目には、ラットオプトジェネティック発作モデルに関して、パペッツの回路における錐体ニューロンおよびＡＮＴへの入力を阻害することにより発作を阻害する取り組みが開始され得る。３年目には、崩壊的刺激が錐体ニューロンへ適用される。同じ年に、電気刺激がラットのＡＮＴへ適用される実験が行われ得る一方で、電気刺激の影響を評価するために、画像法、行動およびＥＥＧが行われる。４年目には、２年目に開発されたマウスのオプトジェネティック発作モデルが利用され、ここではセロトニン作動性およびコリン作動性集団が、それらの抗発作効果を研究するのに調節される。同年には、電気刺激により最適なオプトジェネティック抗発作効果をまねることが開始し得る。まず、発作のオプトジェネティックモデリングが開始され、続いて同様に、一般的な発作モデルにおける効果を評価し得る。最終年では、刺激持続期間の効果が評価される。

実施例Ｄ
治療に対する、背景を記載するアプローチ。
[00166] てんかんならびに多くの他の神経学的疾患のための薬物開発における重要な課題は、化合物の将来の臨床的有効性および副作用の精密な前臨床予測性である。神経系の複雑さにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの情報、ｅｘ ｖｉｖｏでのデータまたは単純な動物行動モデルにおいて代理を使用して、候補化合物の影響を推論することが極めて困難となっている。疾患メカニズムの正確な先験的知識を用いずに、薬物の有効性を正確に試験するのに使用することができる疾患モデルを作製することは困難である。本発明者らの提唱は、オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）技術を利用して、薬物投与の影響のｉｎ ｖｉｖｏでの完全脳定量化とともに精密な疾患モデル作製を通じてこのプロセスを基本的に変革することを目的とする。ｏｆＭＲＩは、オプトジェネティクスと呼ばれる、細胞型特異的な時間的に正確な刺激方法を、ｆＭＲＩ読み出しと組み合わせる新規技術である。ＰＩにより出版された概念研究の最初の証拠（Nature 2010）は、その遺伝的同一性、細胞体位置、軸索突出標的および時間的シグナル伝達パターンにより特定される細胞型に起因する脳全体にわたる（brain-wide）神経活動を正確に可視化するｏｆＭＲＩ技術の能力を実証した。

[00167] オプトジェネティクスを使用して、ＰＩの研究室は、多様な一連の発作活動が繰り返して、および信頼性高く発生し得ることを示すデータを有する。電気ショックで作製した発作モデルとは異なり、化学的注射、キンドリング、遺伝子株の近親交配または物理的外傷、元の細胞型の正確な知識、発作オンセットの位置および時間が決定され得る。

[00168] さらに、ｏｆＭＲＩ読み出しにより、神経シグナル伝達がどのようにして、ネットワークを通じて伝播して、観察される穏やかな部分的発作または完全二次性全身性強直−間代発作を創出するかの正確な経路が、正確に可視化され得る。非常に限定数の脳の位置でのＥＥＧ記録（侵襲性電極を必要とする深い位置で）、または粗い行動のみを示すラシーヌスケールに頼るのではなく、ｏｆＭＲＩは、全脳の治療上の影響を、生きている行動中の動物で実証し得る。その技術のｉｎ ｖｉｖｏでの性質はまた、疾患の長期にわたる追跡を可能にし、ここで単一の動物を使用して、種々の用量および治療の経過がどのように経時的に動物に影響を与えるかを追跡し得る。このことは、種々の時点で多数の動物を屠殺することに頼り、それにより分散、コストおよび時間を増大させる従来のｅｘ ｖｉｖｏでの技術と対比している。

[00169] 無類の精度で発作ネットワークを発生および可視化するｏｆＭＲＩの能力で、定量的抗けいれん薬スクリーニング用のプラットフォームが確立され得る。正確に発生する発作中のネットワーク関与を観察すると同時に、本発明者らは、比較的周知の別個の有効性および副作用プロフィールを有する幾つかの市販薬を投与する。本発明者らは、これらの既知の薬物により発作阻害のｏｆＭＲＩベースの観察を実証することを目的とする。阻害は、完全にまたは部分的に有効であってもよく、本発明者らは、生きている動物の脳における活動の減少または増加の位置を直接的に観察することが可能である。将来の研究では、本発明者らは、脳のある特定野の活性化および不活性化（例えば、運動失調に関するマーカーとしての小脳不活性化）のパターンを強調することにより、薬物の神経学的副作用を予測するｏｆＭＲＩの能力をさらに研究する。オプトジェネティック的に発生する発作モデルにおけるｏｆＭＲＩが、ひとたびこれらの３つの既知のＡＥＤに関して検証されると、本発明者らは、推定上の新たなＡＥＤに関するスクリーンとしてシステムを開発するのに良好な位置にいるだろう。

手順。
[00170] ３つの市販の抗てんかん薬（ＡＥＤ）：フェニトイン（ＰＨＴ）、ロラゼパムおよびレベチラセタム（ＬＥＶ）が使用され得る。それらは、それらの別個の前臨床抗けいれん効果および別個の薬物作用機序に関して選択した。さらに、それらは、最大電気ショック（ＭＥＳ）、全身性ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）および扁桃体キンダリングのような共通てんかんモデルにおける有効性の種々のプロフィールを示す。ＰＨＴは、Ｎａ＋チャネルの不応期に影響を及ぼし、ロラゼパムは、ＧＡＢＡ作動性効率に影響を及ぼし、ＬＥＶは、新規シナプス前Ａ２タンパク質に影響を及ぼす。ロラゼパムは、３つの従来モデル全てにおいて有効性を示すのに対して、ＬＥＶは、扁桃体キンダリングにおいてのみ有効性を示した。臨床上、ＰＨＴおよびロラゼパムは、部分的および全身性強直−間代発作における有効性を示す一方で、ＬＥＶは、部分的な強直−間代および非けいれん性全身性発作に関して有効性を示す。種々の薬物は、種々の動物モデルに関する有効性における明らかな差を示すが、臨床的有効性は、動物モデル研究により必ずしも予測されるわけではない。さらに、ＭＥＳおよびＰＴＺモデルのみが使用される場合、ＬＥＶは、病院に到達しない可能性が高い。したがって、病因へ予測性を提供し得る標的てんかん患者群を表す適正な動物モデルを利用することが、非常に重要である。このため、本発明者らは、動物モデルが提供する発作の精密な理解、ならびに薬物が動物モデルにおいて影響を与える包括的読み出しを有する必要がある。

[00171] 動物モデルおよびそれらの発作は、骨スクリューを介して記録される行動のビデオおよびＥＥＧにより、従来通りに評価および等級分けされる。評価中、予め規定されるパターンに基づく発作を類別する数が作製される。例えば、ビデオクリッピングは、発作に関して修飾ラシーヌスケール（Fisher博士）に従って分類される：０＝標準、Ａ＝活動の停止、１＝口および顔面の動き、２＝頭部頷き、３＝前肢クローヌス、４＝立ち上がり、Ｓ＝立ち上がりおよび転倒、体位制御の損失を伴う完全運動発作。ＥＥＧは、１つの最良のカテゴリーに分類される：０＝標準、１＝異常であるが、てんかん様活動なし、２＝発作間欠期てんかん様（スパイク）活動、３＝発作性てんかん様（ＥＥＧ発作またはスパイク波）活動。

[00172] しかしながら、かかる分類は多くの場合、発作を完全に特徴付けるには十分ではない。それは、線形スケールで発作の重篤性を示すが、例えばどのようにして種々の脳領域が関与されるかを解明せず、別個の発作メカニズムおよび治療オプションに関連付けられる微妙な差を潜在的に見逃す。発作がどこでどのように始まり、それらがどこに伝播するかは、治療を設計する際に重要な問題となり、特にてんかんにおける大量の不均一性を考慮する。したがって、発作起源の正確な知識を有するモデルを有すると、発作伝播を追跡する能力は、どのようにしてＡＥＤが開発されるかを変革する。

[00173] この目的で、ＰＩの研究室は、別個の発作が、元の細胞型、位置および時間的発火率のようなパラメーターにおける微妙な変化により発生し得ることをすでに示している。オプトジェネティック的に発生する発作モデルは、繰り返し可能であり、かつ正確な時間的オンセットの特徴を示す。幾つか異なるオプトジェネティック的に発生する発作のうち、２つを、図２８、図２９に示されるように提唱研究に用いる。これらは、ラット（スプラーグ−ドーリー、雄、２５０〜３５０ｇ）海馬においてＡＡＶウイルスを注射した後に、背内側ＣＡ１における、および腹内側ＣＡ１における錐体ニューロンの４０Ｈｚの光刺激を包含する。ラットにおける背内側ＣＡ１領域は、ヒトにおける後側ＣＡ１の類似体であり、腹内側ＣＡ１領域は、前側ＣＡ１に相当する。オプトジェネティクスを用いると、時間的発火頻度の正確な制御が可能である。ＰＩの研究室におけるｏｆＭＲＩ研究は、錐体ニューロンの海馬刺激に関して、より高度な発作が、２０Ｈｚを上回るより高い周波数刺激で、より長い持続活動（図２６）およびより大きな野の動員を伴って発生することを示す。したがって、この最初の研究に関して、刺激位置における解剖学的差を有する２つのより高い周波数刺激モデルが選択された。図２７は、背内側ＣＡ１への青色光により誘発される発作中のＥＥＧおよび行動の例を示す。予備研究は、これらのモデルに相当する発作中の種々の行動パターンを示している：主に、４０Ｈｚの背内側刺激による活動停止、および腹内側海馬の４０Ｈｚの刺激による立ち上がり、転倒および激しい震え。

[00174] ｏｆＭＲＩ研究を通じて、発作は、正確に発生させることができるだけでなく、関与する脳野および時間的動態の精密な知識によりマッピングおよび規定することもできる。ｏｆＭＲＩ血行動態応答機能（ＨＲＦ）（図２６ａ、図２６ｂ）および相当するＬＦＰ（図２６ｃ〜図２６ｆ）および単一ユニット記録（図２６ｇ〜図２６ｊ）は、適正な時空的動態を提供する際のｏｆＭＲＩ技術の精度を実証する。ＬＦＰおよび単一ユニット記録が、ｏｆＭＲＩにより活動領域として同定される位置で行われた場合、オプトジェネティック刺激により駆動される神経活動は、明らかに測定することができる。特に、それは、低周波数刺激により発生する短期持続活動（図２６a、６〜１０Ｈｚトレース、図２６ｃ、図２６ｇ）およびより高い周波数刺激により発生する長期持続活動（図２６ａ、２０〜６０Ｈｚトレース、図２６ｂ、図２６ｄ〜図２６ｆ、図２６ｈ〜図２６ｊ）の精密な区別を示す。ｏｆＭＲＩ空間活動マップおよびＨＲＦにより、全脳にわたる活動の持続期間およびパターンを正確に決定することができる。このレベルの精度は、通常のｆＭＲＩでは観察されていない。微妙な差を慎重に探す必要があり、依然として必ずしも発作の性質を定量的に規定しない相当するラシーヌスケールおよびＥＥＧ記録に対比して、神経活動の全ての関与する脳領域および時間的動態を描写する全脳画像により、発作を定量的に規定することは明白である。この提唱に使用される２つのモデル（図２８、図２９）は、２つの発作の異なる性質を明らかに描写している。

[00175] 背内側野から腹内側野へ、ＣＡ１内での刺激を移動させることにより、回路動員において著しい変化が示される。帯状および前辺縁、下辺縁構造は、パペッツの古典的回路の一部である。腹内側ＣＡ１刺激により発生する発作は、この回路を通じて伝播する（図２９）一方で、背内側発作は伝播せず、ＣＡ１、海馬台および脳梁膨大後部皮質を含む野において、より大きくてより長い持続活動を動員する（図２８）。両方の野に由来する発作は、ラシーヌレベル５の発作を発生し得るが、脳活動の非常に異なる基本的なパターンを伴う。種々の活性化および伝播パターンは、ｏｆＭＲＩを用いずには同定することができなかったが、但し、場合によっては多重深部電極記録を用いると可能であり、依然として脳領域サンプリング問題を伴う。

[00176] これまでに研究された背内側および腹内側オプトジェネティック海馬刺激のモデルを、ｏｆＭＲＩを使用して薬物有効性を可視化するために、ＰＨＴ、ロラゼパムおよびＬＥＶの投与後に使用してもよい。薬物の有効性はまず、ビデオおよびＥＥＧを含む従来の試験により評価される。続いて、ｏｆＭＲＩ研究を行い、薬物がどのようにして脳ネットワークに影響を与えるかの詳細を可視化させる。薬物をｏｆＭＲＩスキャン中に注射する。目標は、２つの異なる発作モデルおよび３つの異なる薬物に関与する活動の減少または増加の野を具体的に指摘することである。脳野活動が薬物により低減されるという観点から、２つの発作の異なる性質により、３つの薬物の異なる有効性が明らかになると本発明者らは仮定する。従来のビデオおよびＥＥＧ試験を、ｏｆＭＲＩベースの結果と比較することにより、薬物有効性およびそのメカニズムの観点でｏｆＭＲＩが提供することができる情報の感度および豊富度が実証される。発作を定義するために図２８、図２９に見られるように全脳ネットワークを可視化することと、ラシーヌおよびＥＥＧスケールに基づく発作分類とを比較した場合の差についても同様であろう。決行／中止の決定は、本発明者らが、各脳野に関して薬物投与前および後の差を定量的に区別することができるかどうかに基づいて成される。本発明者らの最終的な目標は、各発作モデルに対する各薬物の別個の影響を可視化することである一方で、この実験に関して選択される薬物およびモデルの組合せが、類似の効果を示すことが可能である。しかしながら、本発明者らが６つの事例のいずれかで、脳野依存的活動変化を示し得る限り、ｏｆＭＲＩを使用して新規ＡＥＤに関する系統的な検索を開始することができる十分な証拠となるであろう。図２８、図２９における２つの発作モデルは、ＣＡ１内の種々の発作オンセット位置により作製された。例えば細胞型特異性を有する小さな視床核を刺激する多くの他の発作は、ＰＩの研究室で開発されている。これらのモデルにおいて薬物の影響を区別する際の提唱される研究の成功により、脳活動の目視検査が別個の発作モデルを規定すること、ならびに薬物の影響を定量的に規定することが可能となる。

[00177] 潜在的なピットフォールおよび期待。本発明者らはまず、ＰＨＴ、ロラゼパムおよびＬＥＶそれぞれに関してＥＤ５０の半分を投与する。十分高い用量で、全ての脳野の完全な不活性化が観察されることは可能である。この場合、被試験薬物が影響を与える脳野に関するより具体的な情報を得ることは困難である。したがって、本発明者らは、用量を初期用量の半分に調節する。薬物のいずれかが、別個の脳野において識別可能な増加／減少を表示する場合に、本発明者らは、これを決行とみなす。薬物注射の前および後の差が、発作モデルまたは薬物のいずれでも観察することができない場合、本発明者らは、ＡＥＤ投与量を、ＥＤ５０またはこの用量の倍数へ増加する。依然として識別可能な差が存在しない場合、中止とみなされる。しかしながら、本発明者らがｏｆＭＲＩで検出することができる詳細なレベル、およびこれらの薬物が、他の動物モデルにおいて有効性を示した臨床的に認可された薬物であるという事実を考慮して、本発明者らが、中止の結果を得る可能性は非常に低い。

[00178] 重要な段階：３つの薬物のｏｆＭＲＩ実験を即座に開始して、最初の１年以内で終了させ、ＡＥＤを包括的に評価する技術の能力を検証する。本発明者らは、このデータ、ならびに最初の年における達成の本発明者らの重要な段階として契約を作成する本発明者らの企業開発の取り組みを提供する。成功した場合、２年目中に、本発明者らは、製薬会社からの新規化合物を試験することにより、収益の発生を開始する。２年目の終わりに、本発明者らは、完全に機能的な企業体となっていることを望む。

サンプルサイズおよび統計学的解析計画。
[00179] 本発明者らは、同じ動物に対して繰り返される実験を実施して、各薬物の少なくとも５倍の半減期を実験用の種々の薬物間で通過することが可能である（例えば、１週を上回る）。本発明者らはまた、発作閾値を評価して、経時的に著しい「キンドリング」効果を除外する。同じ動物に対して実験を繰り返す能力は、薬物実験用のモデルの将来の魅力を大いに高める。ｏｆＭＲＩ研究を行って、信頼性を考慮する本発明者らの経験、およびｉｎ ｖｉｖｏで正確な再現性に起因して同じ動物において連続実験を実施する能力、非侵襲的画像能力から、本発明者らは、１群当たりたった５匹の動物を必要とする。２つのモデルを用いる場合、このことは、総計１０匹の動物につながり、消耗を前提としない。１０匹の動物を使用して、まず、発作伝播のｏｆＭＲＩが、図２８、図２９に見られるようにマップに精密に示す。次に、同じ動物において、薬物を投与する。図２８、図２９に示されるように脳領域全てを分割して、また薬物注射前および後の間の差の統計学的有意性に注目して、本発明者らは、薬物がどのようにして、各脳領域に影響を及ぼすかを解析する。さらに、２つのモデルに関する薬物有効性の差は、全体的な活動容量がどれくらい変化したか、ならびにどの脳領域の活動が変化したかに関する具体的な特徴により評価する。概要すると、注射前および後の２つのモデルおよび３つの薬物は、２つのモデルに関して注射前に関する２つのデータセット、２つの発作モデルにおける３つの薬物の注射後に関する６つのデータセットを付与する。８つの事例が、総計１０匹の動物における局所データの統計学的比較を通じて比較される。本発明者らはまた、同じ動物において３度、同じ実験条件の繰り返し実験を行い、統計学的パワーを増す。このことは、３回の繰り返しで総計５匹を付与し、たった１０匹の動物を用いた場合のシナリオ１回（６つの事例）当たり１５回の試行をもたらす。本発明者らは、薬物治療の有意性対分散の他の重要な原因を評価するために、局所活性化の連続的な可変性マーキング容量に対して、反復測定統計学によりＡＮＯＶＡを使用してデータを解析する。本発明者らはまた、薬物投与の前および後に活性化される領域対活性化されない領域のノンパラメトリック尺度に対するカイ二乗検定（または５よりも小さなビンサイズに関する比例差検定）を実施する。

[00180] この方法論の結果は、潜在的な新たなＡＥＤの薬物および用量を評価する新たな方法（またはデバイス）である。本発明者らは、脳システム活性化／不活性化のある特定のプロフィールに連関させて、特定の発作型に関する有効性、および最終的には神経学的副作用も予測することを目的とする。

実施例Ｅ
[00181] 深部脳刺激（ＤＢＳ）、応答性神経刺激（ＲＮＳ）、迷走神経刺激（ＶＮＳ）を含む神経刺激方法は、パーキンソン病、振戦、うつ病、強迫性障害、疼痛およびてんかんを包含する広範囲の脳障害に関する前途有望な新たな治療法である。しかしながら、神経刺激メカニズムの初歩的な理解は、その有効性を制限する。認可される多くの治療法および臨床試験中の多くの治療法が、有意な有効性を実証する一方で、基本的な作用機序が何であるのかが不明確である。したがって、現在利用される刺激パラメーターおよび位置は、相当量の推量を包含し、不均一な結果および限られた有効性をもたらす。神経刺激メカニズムを系統的に理解するためのプラットフォームを開発することが、パラダイムシフト能力を有する一方で、かかるプロセスは、脳の極端な複雑さによりこれまでのところ妨げられている。メカニズムをはっきりさせるために、今までに満足することができなかった主な必要条件が存在する。第１に、脳は、ただ１つのニューロンでさえも集積回路を形成して、脳の大きな野にわたって結合を行うため、データが全脳にわたって情報を運搬することは極めて重要である。第２に、時間的動態の細かな詳細を得るために、本発明者らは、高い時間的精度を有する個々の細胞型特異性ネットワーク要素を利用可能にする必要がある。第３に、ネットワーク動態が、行動と相関され得るように、ｉｎ ｖｉｖｏで情報を得ることが極めて重要である。

[00182] この提唱では、本発明者らは、以前に利用可能ではなかった重要な洞察および技術的開発に基づいて、本発明者らの試みを発揮することを目的とする。オプトジェネティックｆＭＲＩ（ｏｆＭＲＩ）技術を使用して、オプトジェネティック制御を高磁場ｆＭＲＩ読み出しと組み合わせて、本発明者らは、細胞型および時間的精度で脳回路要素を正確に制御することが可能であると同時に、ｉｎ ｖｉｖｏで全脳にわたって相当する応答を可視化させる。機能を試験するために動物を屠殺するがなく、同じ個々の動物を、長期にわたって繰り返して試験することができ、平行して、および順次、機能的応答に関して追跡することができる。この提唱では、本発明者らは、神経刺激デバイスの系統的設計を可能にし得るプラットフォーム技術へとｏｆＭＲＩを開発することが目的である。特有の構想を有するｏｆＭＲＩ技術の本来の発明者およびリーダーとして、本発明者らは、近年、重要な技術的進歩を成している。それらは、高い分解能の、歪みを含まない、覚醒している、ハイスループット双方向ｏｆＭＲＩの開発を含む。さらに、治療法開発を助長するための神経学的疾患メカニズムを理解することに対する第１の工程として、本発明者らは、正確な起源を有する十分規定された発作ネットワーク経路が、首尾よく可視化され得ることを示している。これらの初期研究は、現在の臨床試験における可変性有効性の供給源に対する重要な洞察力をすでに本発明者らに付与している。提唱される研究は、成功時に、神経学的疾患メカニズムの本発明者らの理解において画期的な影響を有し、神経刺激戦略を系統的に設計および試験する能力と組み合わせた臨床上の結果の正確な予測は、新たな治療法の開発を加速させる。

[00183] 提唱されるプロジェクトは、本発明者らの力強くて革新的で、大規模な構想に基づいて、多重分野からの新規技術を集積する根本的に新たなアプローチを取る。この課題の手ごわい性質に起因して、それは、ＮＩＨ Ｒ０１またはＲ２１メカニズムにより資金提供される伝統的な仮説駆動型研究に適切なプロジェクトではない。このプロジェクトが強い必要性を同定するという本発明者の構想に基づくものであり、また本発明者がこれまでに有する主な達成がこのプロジェクトを成功させるのに非常に見込みがあると示すことが、この提唱を、特有の、かつＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋ財団法人研究プログラムに完璧に適するものにする。

実施例Ｆ
[00184] アルツハイマー病（ＡＤ）ならびに多くの他の神経学的疾患のための薬物開発における重要な課題は、化合物の将来の臨床的有効性および副作用の精密な前臨床予測性である。神経系の複雑さにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの情報、ｅｘ ｖｉｖｏでのデータまたは単純な動物行動モデルにおいて代理を使用して、候補化合物の影響を推論することが極めて困難となっている。本発明者らの提唱は、オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）技術を利用して、同じ動物において経時的に長期にわたって、薬物投与の影響のｉｎ ｖｉｖｏでの完全脳定量化とともに精密な疾患モデルの特徴付けを通じてこのプロセスを基本的に変革することを目的とする。ｏｆＭＲＩは、オプトジェネティクスと呼ばれる、細胞型特異的な時間的に正確な刺激方法を、ｆＭＲＩ読み出しと組み合わせる新規技術である。ＰＩにより発表された概念研究の最初の証拠（Nature 2010）は、その遺伝的同一性、細胞体位置、軸索突出標的および時間的シグナル伝達パターンにより特定される細胞型に起因する脳全体にわたる神経活動を正確に可視化するｏｆＭＲＩ技術の能力を実証した。

[00185] 高い空間的分解能を達成して、スキャニングを覚醒させるためのｏｆＭＲＩ技術におけるさらなる開発により、ＰＩの研究室は、コリン作動性ニューロンに特異的に関連付けられる全脳ネットワーク応答を特徴付ける能力を示す予備データを有する。規定の時間的パターンを有する前脳基底核におけるコリン作動性ニューロンの選択的刺激は、海馬領域を含む幅広い神経活動を惹起することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏで長期にわたって追跡する能力とともに、ネットワーク活動のかかる直接的な機能的可視化を使用して、疾患が進行するにつれ、種々の用量および治療の経過がどのように経時的に個々の動物に影響を与えるかをモニタリングすることができる。このことは、種々の時点で多数の動物を屠殺することに頼り、それが分散、コストおよび時間を増大させ、その上機能の代理マーカーしか得られない従来のｅｘ ｖｉｖｏ技術と対照的である。さらに、単離された受動的生理学的記録ではなく、特異的経路に対する応答を誘起させる付加能力により、シグナル伝達を指数関数的により頑強なものする。

[00186] 無類の精度でＡＤと関連付けられる重要なネットワークを可視化するｏｆＭＲＩの能力を示す本発明者らの予備見解により、本発明者らは、それを定量的薬物設計に関するプラットフォームとして確立する。ＡＤに関与する重要な神経回路要素と関連付けられるネットワーク関与を観察する能力により、本発明者らは、良好な電気生理学的、行動的および解剖学的有効性をすでに示している候補薬物を投与する。本発明者らは、治療上の効果のｏｆＭＲＩベースの観察を実証することを目的とする。ＡＤの特色の反転は、完全にまたは部分的に有効であり得、本発明者らは、疾患の進行および薬物療法中の生きている動物の脳における変化の位置を直接的に観察することが可能である。さらに、副作用は、問題となる疾患とは無関係の脳の野における薬物投与の結果として、活動の増加または減少により示される。

実施例Ｇ
[00187] この提唱は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連付けられる全脳動的ネットワーク変化の可視化を通じて、薬物候補物の将来の臨床的有効性および副作用の予測性を提供するための技術および関連方法論を導入する。

[00188] 本発明者らのアプローチは、オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）と呼ばれるＰＩにより近年開発された技術を利用する（図１４）。オプトジェネティクスは単一構成要素の微生物光活性化膜貫通コンダクタンス制御因子を、細胞型特異的プロモーターを使用して特異的細胞へ導入して、ｉｎ ｖｉｖｏでミリ秒スケールの標的活動調節を可能にする。特に、チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）は、青色光への曝露時に高い時間的精度で励起されるべきＣｈＲ２を発現するニューロンを誘発する。ｏｆＭＲＩ技術は、オプトジェネティック制御を高磁場ｆＭＲＩと組み合わせる。初期研究では、正確な細胞型ベースのｆＭＲＩ応答が、高い時間的精度で脳全体にわたって測定され得ることが示された。本発明者らは、ＡＤに関連付けられるネットワーク機能障害の直接的で、長期にわたり、そして系統的な評価を可能にするためのｏｆＭＲＩを開発することを提唱し、続いてこれは、ＡＤ薬のための定量的スクリーニングおよびｉｎ ｖｉｖｏでの生理学的フィードバックに使用される。

[00189] 本発明の各種態様は、以下を目的とする：

[00190] 目的１．標準的なマウスにおけるコリン作動性ニューロンネットワークの評価。進行性コリン作動性前脳基底核（ＣＢＦ）ニューロン分解によるアセチルコリンの低下は、ＡＤの重要な特色の１つである（図３０ｂ）。これまでのところ、これらの特徴は、小スケールおよびｅｘ ｖｉｖｏでの死後研究で局所的に観察および定量化されており（図３０ｂ）、このことが、系全体における疾患によるその機能的役割および変化を完全に理解することを困難にしている。ｏｆＭＲＩを使用して、本発明者らは、コリン作動性ニューロンに関連付けられるネットワークを直接的に可視化する。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでの脳ネットワーク全体におけるコリン作動性ニューロンの役割の定量的可視化が、長期にわたって行われる同じマウスにおけるそれらの標準的な機能、ならびにＡＤと関連付けられる時間的変化を規定する際の重要な洞察を提供すると想定する。この目的で、本発明者らは、標準的な機能の研究から始める。

[00191] コリン作動性ニューロンの選択的刺激に関して、２つの戦略を使用することができる。ＣｈＲ２を選択的に発現するコリン作動性ニューロンを有するＣｈａＴ−ＣｂＲ２トランスジェニックマウス、および（ＤＩＯ）ＣｈＲ２−ＥＹＦＰウイルスと組み合わせたＣｈａｔ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス。ＣｈａＴ−ＣｈＲ２トランスジェニックマウスに関して、標的部位で青色光刺激を送達するのに、光ガイドを外科的に移植する必要がある。Ｃｈａｔ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスに関して、コリン作動性ニューロンにおいてＣｈＲ２を発現するためには、光移植ガイドの移植に加えて、手術が、ウイルス注射を包含する必要がある。この目的で、本発明者らは、ＭＩＴでＧｕｏｐｉｎｇ Ｆｅｎｇ博士から最近入手したＣｈａＴ−ＣｈＲ２マウスを利用する。しかしながら、予備研究は、Ｃｒｅ依存性ＡＡＶウイルス注射を伴うＣｈａｔ−Ｃｒｅマウスを使用して行われた。ＣｈａＴ−ＣｈＲ２マウスは、コリン作動性ニューロンにおけるＣｈＲ２のより安定な発現を可能にし、ウイルス発現は通常、実験前におよそ１カ月のリードタイムを要するため、実験時間を短縮する。

[00192] 本発明者らはまず、海馬へ突出することが知られている内側中隔ブローカ対角帯（ＭＳＤＢＢ）を標的とする光ガイドを６匹のＣｈａｔ−ＣｂＲ２マウスに手術で移植する。この野は、記憶喪失に関連してＡＤに関わる海馬野への突出を有するその重要な解剖学的位置に関して選択した（図３１）。続いて、ｏｆＭＲＩの非侵襲的なｉｎ ｖｉｖｏでの性質を活用して、本発明者らは、誕生から３、６、９カ月でマウスを繰り返しスキャンする。青色光を使用して、シータおよびガンマ周波数バンドで、１分毎に２０秒間、光学的に刺激する。統計学的有意性のために、これを６回繰り返す。シータおよびガンマ周波数の刺激は、シータおよびガンマバンドにおけるＡＤ患者に関する変更されたシータ律動に基づいて選択した。ｏｆＭＲＩ実験の直前に、新規物体認識試験もまた、目的２に関する対照実験として行われる。ｏｆＭＲＩおよび行動試験が完了した後、局所電場電位およびスパイキング活動のｉｎ ｖｉｖｏでの電気生理学的測定は、ｏｆＭＲＩ活動領域で実施されて、ｏｆＭＲＩシグナルの供給源を確認する。続いて、脳を灌流させて、変性神経突起、アミロイド斑およびコリン作動性神経突起に関して顕微鏡写真撮影を行う。

[00193] ＣｈａＴ−Ｃｒｅマウスを使用する本発明者らの予備研究では、光ファイバー移植に加えて、ｅｒｅ依存性ウイルス注射を使用して、ＭＳＤＢＢにおけるコリン作動性ニューロンを標的とした。シータおよびガンマ周波数でのコリン作動性ニューロンの刺激により、本発明者らは、ガンマ周波数では海馬を含む幅広い活動を見出した（図３２）。対比して、シータ周波数刺激は、はるかに小さな野の関与を示した。

[00194] 予想される結果：ＭＳＤＢＢにおけるシータおよびガンマ周波数でのコリン作動性ニューロンの選択的刺激に起因するｏｆＭＲＩ空間的活動マップおよび血行動態応答機能（ＨＲＦ）により、ＡＤで潜在的に変更される重要な伝達パートナーが明らかとなる。行動実験は、記憶障害の徴候を示さないと予想され、本発明者らは、顕微鏡写真において異常性が見られないと予想する。本発明者らは、ｏｆＭＲＩおよび行動データが３、６、９カ月齢にわたって大部分が一致すると予想し、これは、本発明者らが有意ではないと予想する正常な老化に起因して、変化を反映するに過ぎない。

[00195] 目的２．ＡＤのトランスジェニックマウスモデルを使用したＡＤに関するバイオマーカーとしてのコリン作動性刺激に対するｏｆＭＲＩ応答の確立。ＡＤの十分に特徴付けられたマウスモデルであるＡＰＰＬ／Ｓを使用して、正常なマウスと比較して、ｏｆＭＲＩ応答における差を研究する。ＡＰＰＬ／Ｓマウスは、Ｔｈｙ１プロモーター下でヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）を発現し、ＡＤに関する十分に確立された動物モデルである。Ｍａｓｌｉａｈａ研究室で開発されたこの動物モデルが、ＭＴＡ下で本発明者らに供給され、それらを繁殖させて、ＣｈａＴ−ＣｈＲ２マウスと交雑させる。

[00196] 本発明者らは、目的１と同様に、内側中隔ブローカ対角帯（ＭＳＤＢＢ）を標的とする光ガイドを６匹のＣｈａＴ−ＣｈＲ２，ＡＰＰＬ／Ｓ二重トランスジェニックマウスに手術で移植する。続いて、手術からの回復の３〜４日後に、本発明者らは、誕生から３、６、９カ月でマウスを繰り返しスキャンする。刺激パラメーターは、目的１における実験に適合させる。ｏｆＭＲＩ実験の直前に、新規物体認識試験を行って、記憶障害を特徴付ける。ｏｆＭＲＩおよび行動試験が完了した後、目的１を適合させるｉｎ ｖｉｖｏでの電気生理学的測定も行われる。続いて、脳を再び灌流させて、変性神経突起、アミロイド斑およびコリン作動性神経突起に関して顕微鏡写真撮影を行う。

[00197] 予想される結果：ＭＳＤＢＢにおけるコリン作動性ニューロンの刺激に起因するｏｆＭＲＩ応答は、目的１で測定されたように、正常なマウスと比較してＡＤの動物モデルでは変化する。コリン作動性周波数依存性応答を測定するためのｏｆＭＲＩにより証明された能力を用いて（図３２）、進行性機能的変性は、３、６、９カ月齢で測定される場合に、種々の疾患状態にわたって良好な感度で捕捉される。差は、結果として生じる神経活動のタイミングを反映するＨＲＦの活動容量サイズおよびピーク時間に関する統計学的検定により定量化される。新規物体認識試験は、ｏｆＭＲＩ応答変化と相関する進行性記憶障害を示す。行動試験もまた、図３０ｄに見られるように目的１における正常なマウスとの差に関して統計学的に解析される。顕微鏡写真は、変性神経突起、アミロイド斑の進行性集積、ならびにコリン作動性神経突起の長さ、容量および分岐の低減を示す。

[00198] 目的３．前途有望な薬物候補物を試験するためのプラットフォームとしてのｏｆＭＲＩの開発。ＡＤに関する前途有望な薬物候補物であるＬＭ１１Ａ−３１（図３０）を使用して、治療結果を予測および評価するｏｆＭＲＩの能力を試験する。ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）は、ＡＤに関連する多重メカニズムに関連付けられる数個の特異的受容体の１つであり、その機能を調節することは、重要な治療戦略となり得る。これまでのｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究は、小分子ｐ７５ＮＴＲリガンドであるＬＭ１１Ａ−３１が多数のアミロイドＰ誘導性神経変性メカニズムを防止することを実証した。Ｌｏｎｇｏの研究室における最近の研究もまた、ＡＰＰＬ／ＳトランスジェニックＡＤマウスモデルにおける神経機能障害および変性に対するＬＭ１１Ａ−３１の効果を実証した。経口投与後、ＬＭ１１Ａ−３１は、血液脳関門を通過して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経保護を提供することが知られている脳内濃度に達することがわかった。ＬＭ１１Ａ−３１は、ＡＤモデルマウスに由来する海馬スライス調製物におけるシナプス障害（図３２ｃ）を反転させて、新規物体認識における障害（図３２ｄ）およびＹ迷路行動を防止した。さらに、ＬＭ１１Ａ−３１は、アミロイドレベルに影響を及ぼすことなく、前脳基底核および海馬（図３２ａ、ｂ）においてコリン作動性神経突起ジストロフィーを防止した。これらの見解により、ｐ７ＳＮＴＲがＡＤにとって重要な治療上の標的として機能を果たし得ること、およびＬＭ１１Ａ−３１またはその誘導体が、神経変性疾患において潜在用途を有する化合物種を表すことが示される。ＬＭ１１Ａ−３１は、Ｌｏｎｇｏの研究室で開発され、ネットワーク機能変化を可視化することにより薬物の有効性について定量的に記載するｏｆＭＲＩの能力を試験するためにこの目的で使用される。

[00199] ＬＭ１１Ａ−３１は、２カ月齢で開始して、経口経管栄養を介して５０ｍｇ／ｋｇ容量で６匹のＣｈａＴ−ＣｈＲ２，ＡＰＰｓ二重トランスジェニックマウスへ連続投与される。次に、本発明者らは、目的２で見られるように、それらに光ガイドを手術で移植する。続いて、手術からの回復の３〜４日後に、本発明者らは、誕生から３、６、９カ月でマウスを繰り返しスキャンする。刺激パラメーターは、目的１および２における実験に適合させる。ｏｆＭＲＩ実験の直前に、新規物体認識試験を行って、記憶障害における変化を特徴付ける。ｏｆＭＲＩおよび行動試験が完了した後、目的１を適合させるｉｎ ｖｉｖｏでの電気生理学的測定も行われる。続いて、脳を再び灌流させて、変性神経突起、アミロイド斑、およびコリン作動性ニューロンおよび突起に関して顕微鏡写真撮影を行う。

[00200] 予想される結果：治療は、目的１に比較して、目的２で見られるｏｆＭＲＩ応答における変化を反転させる。例えば扁桃体における活動増加のような任意の意図的ではない変化は、不安の増大のような副作用を表し得る。長期にわたるモニタリング能力は、重大な治療時点、および行動の結果に関連する重要な機能的要素を解明する。このことは、順次、さらに改善された薬物候補物および用量のタイミングに関する設計フィードバックとして機能を果たす。かかるプロセスは、ＡＤ治療の設計および評価を大いに加速する。

[00201] 本発明の特定の例示的な実施形態の上述の説明は、説明および描写の目的で提示した。それらは、包括的であると意図されず、あるいは開示される正確な形態に本発明を限定すると意図されず、上記教示を鑑みて、多くの変更および変化が考え得ることが明らかである。本発明のある特定の原理およびそれらの実用的応用を説明するために、それにより当業者が本発明の各種例示的な実施形態、ならびにそれらの様々な代替物および変更体を作製および利用するのを可能にするために、例示的な実施形態が選択および記載された。本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲およびそれらの等価物により規定されると意図される。

Claims (21)

1. 正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法であって、
   細胞型特異性を用いたオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）により、神経刺激の作用機序を同定する工程と、
   別個の発作型を発生させ、いずれの発作型か同定するために各発作型に関して神経刺激の有効性を評価して、各発作型に関する特有の脳波（ＥＥＧ）の形跡を同定する工程と、
   ＥＥＧおよび発作と同期されたｏｆＭＲＩにより、患者におけるＥＥＧの形跡を同定する工程と
   を含む方法。
2. 前記神経刺激が、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、深部脳刺激（ＤＢＳ）および応答性神経刺激（ＲＮＳ）のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
3. 神経刺激の作用機序を確認するために、神経刺激と同期されたｏｆＭＲＩを行う工程
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記神経刺激が、迷走神経刺激（ＶＮＳ）、深部脳刺激（ＤＢＳ）および応答性神経刺激（ＲＮＳ）のうちの１つである、請求項３に記載の方法。
5. 正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法であって、
   脳における罹患状態モデルを創出する工程と、
   オプトジェネティック刺激および機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）画像に基づいて前記モデルを分類する工程と
   を含む方法。
6. 光応答性刺激中の分類に基づいて脳波（ＥＥＧ）測定を解釈するために、さらなる測定を行う工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記さらなる測定が、ＥＥＧを使用して行われる、請求項６に記載の方法。
8. 前記罹患状態モデルが、発作のモデルである、請求項５に記載の方法。
9. 前記罹患状態モデルが、発作の動物モデルである、請求項５に記載の方法。
10. 前記発作が、背側ＣＡ１刺激、中間ＣＡ１刺激、腹側ＣＡ１刺激または海馬台刺激の少なくとも１つから発生する、請求項９に記載の方法。
11. 神経刺激および薬物設計に関して前記発作の前記動物モデルを使用する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
12. 正常状態および罹患状態での脳動態をモデリングする方法であって、
    背内側、内側、腹内側および／または外側ＣＡ１領域において、錐体ニューロンをオプトジェネティック的に刺激する工程と、
    オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ｏｆＭＲＩ）を用いて、連関した脳ネットワークを通じて発作をモニタリングする工程と、
    ｏｆＭＲＩ活動の位置での局所電場電位および単一ユニット記録を測定する工程と
    を含む方法。
13. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、阻害性介在ニューロンまたは通路の線維の直接的な刺激を起こすことなく遂行される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、短期持続活動を発生するように２０Ｈｚ未満の周波数刺激を利用して遂行される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、短期持続活動を発生するように６〜１０Ｈｚの周波数刺激を利用して遂行される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、２０Ｈｚを超える周波数刺激を用いて遂行される、請求項１２に記載の方法。
17. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、長期持続活動を発生するように２０〜６０Ｈｚの周波数刺激を利用して遂行される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記オプトジェネティック的に刺激する工程が、４０Ｈｚの光刺激を用いて遂行される、請求項１７に記載の方法。
19. 錐体ニューロンを刺激または阻害するために、ＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰまたはＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩａ−ＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙの少なくとも１つを注射する工程と、
    前記ニューロンをオプトジェネティック的に誘発するために、青色および黄色光の少なくとも１つを適用する工程と
    をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
20. 青色光が、毎秒１、１０、６０または１００サイクルで送達される、請求項１９に記載の方法。
21. 青色光が、前記脳をスキャンしながら、毎秒１、１０、６０または１００サイクルで、毎分２０秒間で、総計６分間送達される、請求項２０に記載の方法。