CN113951835B - 一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤S1,利用光可切换荧光探针对重建区域内生物组织的细胞进行荧光显微成像,测得荧光值ζ(r)。步骤S2,根据一阶波恩近似,得到荧光值ζ(r)。步骤S3,根据漫射方程,求出格林函数。步骤S4,结合边界条件,利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解,得到某一成像时刻细胞内荧光探针的三维分布。步骤S5,根据计算得到的所有成像时刻细胞内荧光探针的三维分布叠加生成三维荧光定位显微图像。本发明将光学断层重建方法与超高分辨荧光显微技术相结合,通过构建超分辨荧光显微三维重建模型,进行快速三维成像,提高了三维成像的空间分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法。
背景技术
作为近几年发展起来的一门新的荧光显微成像技术,超高分辨荧光显微成像技术(Super-ResolutionFluorescence Microscopy)[例如:随机光学重构显微成像(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)及光敏定位显微成像PALM(Photoactivated Localization Microscopy)],突破了光学衍射极限,能够使侧向空间分辨率提高至20~50nm,即能够在单分子水平(纳米尺度)上对活细胞的胞内细胞器或分子结构进行成像,这将有助于在分子水平上理解生物过程的分子机制以及疾病的分子基础。
随着生物医学的发展,科研人员更希望能够在纳米尺度下观察细胞的三维结构及其空间关系,即进行三维超高分辨成像。然而,目前的荧光显微三维成像,主要是通过改变光路设计的方式来完成。其优点是不需复杂的计算即可完成三维成像。主要缺点如下:首先,在STORM(PALM)成像中,提高成像空间分辨率的关键是从背景信号中有效识别被激活的荧光分子。然而,在STORM(PALM)成像过程中,通常使用宽场照明方式。宽场照明能够激活并激发焦平面以外的荧光染料(蛋白),随着成像深度增加,非焦平面上受激荧光分子所发荧光信号将带来严重的背景干扰。此外,细胞自发荧光等干扰信号也会随之增强,进而降低三维成像的空间分辨率。其次,目前基于STORM(PALM)的三维超分辨成像技术,例如柱面镜象散法以及多焦面法,仅能获取600~800nm深度范围内的三维超分辨图像。为了进行全细胞的三维成像,需要在轴向进行多次扫描成像,从而增加了成像的时间分辨率。因此,现有超高分辨荧光显微成像技术很难在全细胞水平,进行快速、三维成像,这已不能满足生物医学研究日益发展的需求。
发明内容
为解决上述问题,提供一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤S1,利用光可切换荧光探针对重建区域内生物组织的细胞进行荧光显微成像,测得荧光值ζ(r)。步骤S2,根据一阶波恩近似,荧光值ζ(r)的具体表达式为:式中,V是重建区域,格林函数/>为发射谱段光子在细胞内的传播,格林函数/>为激发谱段光子在细胞内的传播。步骤S3,根据漫射方程,求/>和/>步骤S4,结合边界条件,利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解,得到某一成像时刻的细胞内荧光探针的三维分布n。步骤S5,根据所有成像时刻计算得到的n叠加生成三维荧光定位显微图像。
本发明提供的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,还可以具有这样的技术特征,其中,步骤S4包括以下步骤:步骤S4-1,根据有限元方法,将重建区域V离散成小的网格后,得到有限元传播方程,具体表达式为:ζ(r)=W×n,式中,W是一个Ndata×Nvoxels的权重矩阵,是格林函数和格林函数/>在有限元传播中的矩阵,Ndata为所有源-检测点对的总数,Nvoxels为重建区域所有体素的总数。步骤S4-2,基于压缩传感技术,根据稀疏重建方法,构建调制矩阵P,具体表达式为:/>式中,U、Λ和VT是前向矩阵W的奇异值分解后的矩阵,W=UΛVT,I是单位阵,λ为正则参数,T代表转置操作。步骤S4-3,有限元传播方程变换为:ζ(r)#=W#×n,式中,ζ(r)#=Pζ(r)为预调制前向矩阵,W#=PW为预调制测量值。步骤S4-4,利用正交最小二乘法对变换后的有限元传播方程进行求解,得到细胞内荧光探针的三维分布n,具体表达式为:/>式中,||n||0为三维分布n的l0范式。
本发明提供的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,还可以具有这样的技术特征,其中,漫射方程的具体表达式为:式中,Φ(r)表示光子密度分布,r为距离,μa为介质的吸收系数,D(r)为介质的扩散系数,S(r)为光源的空间分布。
本发明提供的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,还可以具有这样的技术特征,其中,边界条件为设定的光传播的空间区域。
发明作用与效果
根据本发明的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,首先充分将光学断层重建方法与超高分辨荧光显微技术相结合,建立超分辨荧光显微三维重建模型。从而能够弥补以往3D超分辨成像的不足,可实现快速、三维的全细胞成像。
其次,本发明由于利用了光学断层重建方法,因此可将3D超分辨成像问题转化为3D光学重建问题,具有在不损失成像空间分辨率的前提下,提升成像深度及成像的时间分辨率的优点。
最后,本发明由于利用了单角度光学重建方法,即使用一个角度的光学投影信号进行活细胞的三维重建,具有在不损失空间分辨率的基础上,提高3D超分辨成像重建算法速度的优点。可以广泛应用于动态荧光分子图像的重建过程中。
附图说明
图1是本发明实施例中的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法流程图;
图2是本发明实施例中的利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解的流程示意图;
图3是本发明实施例中的仿真的荧光分子在成像体内的真实分布示意图;
图4是本发明实施例中的利用光学断层重建的荧光分子分布示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,以下结合实施例及附图对本发明的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法作具体阐述。
<实施例>
图1是本发明实施例中的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法流程图。
如图1所示,一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法包括以下步骤:
步骤S1,利用光可切换荧光探针对重建区域内生物组织的细胞进行荧光显微成像,测得荧光值ζ(r)。在光可切换荧光探针的介入下,对细胞进行荧光显微成像,获取不同时刻的荧光图像序列。每帧图像包含多个荧光探针,随机分布在细胞内。
步骤S2,根据一阶波恩近似,荧光值ζ(r)的具体表达式为:
式中,V是重建区域,格林函数为发射谱段光子在细胞内的传播,格林函数为激发谱段光子在细胞内的传播。
步骤S3,根据漫射方程,求出格林函数和格林函数/>
准确描述光在细胞内传播的数学模型是三维荧光显微成像问题的基础。由于成像过程中采集的是在细胞中经历复杂散射过程后出射边界的漫射光子,因此,不同于其他高能射线的断层成像,只考虑准直传播光的贡献,而需根据漫射光传播的特点,建立相应的数学模型。考虑到细胞通常包含多重散射媒质,所以在荧光显微成像中,可使用粒子输运理论建立光传播模型。
具体而言,根据输运理论,光在生物组织中的传播可以通过辐射传输方程(Radiative Transfer Equation,RTE)来描述。然而,直接对辐射传输方程求解计算量较大。为了在实际中更好地进行前向模拟与后向重建,本实施例对辐射传输方程进行简化与近似,生成漫射方程,并以此为基础,完成光传播模型的数学建模。
漫射方程的具体表达式为:
式中,Φ(r)表示光子密度分布,r为距离,μa为介质的吸收系数,D(r)为介质的扩散系数,S(r)为光源的空间分布。
步骤S4,结合边界条件,利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解,得到细胞内荧光探针的三维分布n。其中,边界条件为设定的光传播的空间区域。
有限元方法(FEM)可完成复杂几何形状且各向异质情况的求解问题,并且在引入边界条件方面具有很大便利性。因而,本实施例使用有限元方法对漫射方程进行求解。
在传统的荧光分子断层重建中,通常需要获取样本在全角度的测量值。但在超高分辨荧光成像中,必须基于特定时刻的荧光测量值完成三维重建,致使丧失获取全角度测量信息的时机。但是,测量数据的缺失会致使重建分辨率的下降。此外,在超高分辨成像过程中,如果同一时刻被激活的荧光探针过多,会导致被激活的荧光探针在成像平面发生交叠,从而为后续的重建带来困难,进而影响最终的成像分辨率。为了解决上述问题,本实施例中在重建过程中结合压缩传感技术,以实现在单角度及高激活荧光探针密度的情况下,完成准确的三维重建。
图2是本发明实施例中的利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解的流程示意图。
如图2所示,步骤S4包括以下步骤:
步骤S4-1,根据有限元方法,将重建区域V离散成小的网格后,得到有限元传播方程,具体表达式为:ζ(r)=W×n,式中,W是一个Ndata×Nvoxels的权重矩阵,是格林函数和格林函数/>在有限元传播中的矩阵,Ndata为所有源-检测点对的总数,Nvoxels为重建区域所有体素的总数。
为了进一步提高前向模型W的准确性,在W的构建过程中,对细胞内不同结构,可赋予不同的光学参数(吸收系数和散射系数),从而形成异质前向模型,用以更好的描述光在细胞中的传播。
步骤S4-2,基于压缩传感技术,根据稀疏重建方法,构建调制矩阵P,具体表达式为:
式中,U、Λ和VT是前向矩阵W的奇异值分解后的矩阵,W=UΛVT,I是单位阵,λ为正则参数,T代表转置操作。
步骤S4-3,有限元传播方程变换为:ζ(r)#=W#×n。
在传统的荧光分子断层重建中,通常需要获取样本在全角度(360度范围内)的测量值。但在超高分辨荧光成像中,必须基于特定时刻的荧光测量值完成三维重建,致使丧失获取全角度测量信息的时机。但是,测量数据的缺失会致使重建分辨率的下降。此外,在超高分辨成像过程中,如果同一时刻被激活的荧光探针过多,会导致被激活的荧光探针在成像平面发生交叠,从而为后续的重建带来困难,进而影响最终的成像分辨率。
为了解决上述问题,本实施例在重建过程中结合压缩传感(CS)技术,以实现在单角度及高激活荧光探针密度的情况下,完成准确的三维重建。具体而言,为了提高重建精度,利用预调制矩阵P,得到:
ζ(r)#=W#×n
式中,ζ(r)#=Pζ(r)为预调制前向矩阵,W#=PW为预调制测量值。
步骤S4-4,利用正交最小二乘法对变换后的有限元传播方程进行求解,得到某一成像时刻内细胞内荧光探针的三维分布n,具体表达式为:
式中,||n||0为三维分布n的l0范式。
步骤S5,将所有帧(成像时刻)计算得到的定位结果进行叠加,实现快速、三维超高分辨荧光定位显微成像。
在光可切换荧光探针的介入下,对细胞进行荧光显微成像,获取不同时刻的荧光图像序列。每帧图像包含多个荧光探针,随机分布在细胞内。基于构建的漫射光传播模型,结合稀疏断层重建算法,对实验获取的细胞图像序列进行重建,实现对每帧图像中所包含的荧光探针进行准确地三维定位。将所有帧的定位结果进行叠加,实现快速、三维超高分辨荧光定位显微成像。
图3是本发明实施例中的仿真的荧光分子在成像体内的真实分布示意图;图4是本发明实施例中的利用光学断层重建的荧光分子分布示意图。
如图3及图4所示,重建后的图像结果能够清晰反映荧光分子在成像体内的真实分布。
实施例作用与效果
根据本实施例提供的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法。首先,充分将光学断层重建方法与超高分辨荧光显微技术相结合,建立超分辨荧光显微三维重建模型。从而能够弥补以往3D超分辨成像的不足,可实现快速、三维的全细胞成像。
其次,本实施例利用了光学断层重建方法,因此可将3D超分辨成像问题转化为3D光学重建问题,具有在不损失成像空间分辨率的前提下,提升成像深度及成像的时间分辨率的优点。
最后,本实施例利用了单角度光学重建方法,即使用一个角度的光学投影信号进行活细胞的三维重建,具有在不损失空间分辨率的基础上,提高3D超分辨成像重建算法速度的优点。可以广泛应用于动态荧光分子图像的重建过程中。
上述实施例仅用于举例说明本发明的具体实施方式,而本发明不限于上述实施例的描述范围。
Claims (3)
1.一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1,利用光可切换荧光探针对重建区域内生物组织的细胞进行荧光显微成像,测得荧光值ζ(r);
步骤S2,根据一阶波恩近似,荧光值ζ(r)的具体表达式为:
式中,V是重建区域,格林函数为发射谱段光子在细胞内的传播,格林函数为激发谱段光子在细胞内的传播;
步骤S3,根据漫射方程,求出所述格林函数和所述格林函数/>
步骤S4,结合边界条件,利用有限元方法和稀疏重建方法进行求解,得到某一成像时刻细胞内荧光探针的三维分布n;
步骤S5,根据所有成像时刻计算得到的n叠加生成三维荧光定位显微图像,
其中,所述步骤S4包括以下步骤:
步骤S4-1,根据有限元方法,将所述重建区域V离散成小的网格后,得到有限元传播方程,具体表达式为:
ζ(r)=W×n
式中,W是一个Ndata×Nvoxels的权重矩阵,是格林函数和所述格林函数/>在有限元传播中的矩阵,Ndata为所有源-检测点对的总数,Nvoxels为所述重建区域所有体素的总数;
步骤S4-2,基于压缩传感技术,根据稀疏重建方法,构建调制矩阵P,具体表达式为:
式中,U、Λ和VT是前向矩阵W的奇异值分解后的矩阵,W=UΛVT,I是单位阵,λ为正则参数,T代表转置操作,
步骤S4-3,有限元传播方程变换为:
ζ(r)#=W#×n,
式中,ζ(r)#=Pζ(r)为预调制前向矩阵,W#=PW为预调制测量值;
步骤S4-4,利用正交最小二乘法对变换后的有限元传播方程进行求解,得到所述某一成像时刻细胞内荧光探针的三维分布n,具体表达式为:
式中,||n||0为所述三维分布n的l0范式。
2.根据权利要求1所述的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,其特征在于:
其中,所述漫射方程的具体表达式为:
式中,Φ(r)表示光子密度分布,r为距离,μa为介质的吸收系数,D(r)为介质的扩散系数,S(r)为光源的空间分布。
3.根据权利要求1所述的一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法,其特征在于:
其中,所述边界条件为设定的光传播的空间区域。
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稀疏正则和自适应有限元的荧光分子断层成像;程星;侯榆青;董芳;贺小伟;余景景;;西安电子科技大学学报(第02期);全文 * |
荧光断层成像中圆柱仿体的三维重建;宋小磊;胡刚;姚俊杰;白净;;软件学报(第05期);全文 * |
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