KR102250348B1 - 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다.

Description

정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 시스템 및 방법{SYSTEM AND METHOD FOR MODELING BRAIN DYNAMICS IN NORMAL AND DISEASED STATES}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 “정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하는 것”이라는 명칭으로 2013년 1월 31일에 출원된 미국 가특허출원번호 61/759,363에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용 전부는 모든 점에 있어서 참조로 본 문서에 결합된다.
연방 자금 지원을 받은 연구 또는 개발에 관한 설명
본 발명은 미국 국립보건원이 수여한 승인 번호 EB008738에 근거한 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 뇌 역동성을 모델링하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는, 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하는 것에 관한 것이다.
관련 기술에 대한 설명
일반적으로, 정상 및 신경학상으로 병이든 상태의 두뇌 네트워크 함수 역동성은 알려져 있지 않다. 본원발명은 관련된 두뇌 네트워크 함수 역동성의 고정밀 지식을 갖는 질환모델을 생성하고, 수량적 설계를 가능하게 하는 두뇌 네트워크 함수 역동성을 효율적으로 조사하고 치료 옵션을 평가하기 위해 설계된 새로운 기법을 제공하다. 이러한 접근 방식을 이용한 치료법이 특별한 두뇌 역동성을 변화시키는 것을 직접적으로 겨냥하여 설계 및 평가될 수 있다. 예를 들면, 이러한 접근 방식은 의약의 발달, 신경세포의 자극, 초점 수술, 세포 및 유전자 치료에 도움이 될 수 있다.
신경학적 질병을 연구하기 위한 종래 동물 모델들은 기계적 손상, 약물 투여, 전기자극 및 유전적 개변을 이용하여 생성된다. 이후, 동물 모델들은 행동적 분석, 전기기록, 해부학상의 평가 및 생체 외 면역조직화학에 의해 특징된다. 본원 발명의 접근법은 이로우며 종래 모델링의 다양한 단점을 극복한다.
제안된 발명은 정밀한 세포 형 특이 두뇌기능을 근거로 신경 장애를 생성, 규정하고 카테고리로 나누기 위한 독특한 최초 기회를 만들어 낸다. 더욱이, 치료제가 효능을 평가하기 위해 투여된 동안에 신경장애는 정밀하게 종으로 모니터 될 수 있다. 평가에 덧붙여, 본 발명은 병이든 뇌 기능을 변경하기 위한 치료법의 적극적인 설계를 가능하게 한다.
광유적학적 자극 및 기능적 자기 공명 영상 판독은 정확한 기원과 대응 두뇌 망 역동성을 갖는 동물 모델을 생성하기 위한 방안들을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 발작 및 기타 병이든 상태와 관련된 모델들이 생성될 수 있다.
제안된 발명의 다양한 양태가 인간 치료 발전을 유도하기 위한 사전 임상방법으로서 사용될 수 있다.
본원발명의 다양한 양태는 정확한 기원 및 관련 네트워크, 알츠하이머 질병 네트워크, 파킨슨 병 중독 네트워크, 최소한의 의식이 있는 환자 관련된 DBS 대상 네트워크 및 기타 정상 및 질병 상태를 갖는 발작 모델을 연구하고 확인하기 위해 사용되어 오고 있다.
본원발명의 다양한 양태는 두뇌 질병을 갖는 모델을 생성하는 단계 및 광유전학적 자극 및 기능적 자기공명영상(fMRI) 이미지를 근거로 모델을 분류하는 단계를 포함하는 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 방법은 광감응성 자극 중에 상기 분류를 근거로 뇌파(EEG) 측정을 해석하기 위한 추가 측정을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
추가 측정은 뇌파를 이용하여 수행될 수 있다.
질병 상태의 모델은 발작 모델일 수 있다.
질병 상태의 모델은 발작 동물모델일 수 있다.
발작은 등쪽 CA1 자극, 중간 CA1 자극, 배쪽 CA1 자극 또는 서브이큘럼 자극 중 최소한 하나에 의해 발생될 수 있다.
본 방법은 신경자극 및 약물 설계를 위한 발작 동물 모델을 이용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원발명의 다양한 양태는 정상 및 질병 상태의 두뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 세포형 특이성을 갖는 광유전적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 통하여 행동의 미주신경자극(VNS) 메커니즘을 식별하는 단계, 별개 발작 유형을 생성하고 그 발작 유형을 식별하기 위해 각각의 발작 유형에 대한 VNS의 효능을 평가하는 단계, 각 발작 유형에 관한 고유 뇌파(EEG) 서명들을 식별하고, 뇌파(EEG) 및 발작 동기화된 ofMRI로 환자의 뇌파(EEG) 서명을 식별하는 단계를 포함한다.
본 방법은 행동의 VNS 메커니즘을 확인하기 위해 VNS-동기화된 ofMRI를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원발명의 다양한 양태는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하는 방법을 제공하며, 본 방법은 뇌 질환 상태의 모델을 생성하는 단계와 광유전적 자극과 기능적 자기공명영상(fMRI) 이미지를 근거로 모델을 분류하는 단계를 포함한다.
본 발명은 광감응성 자극중에 분류를 근거로 뇌파(EEG) 측정을 해석하기 위한 추가 측정을 수행하는 것을 더 포함할 수 있다.
추가 측정은 뇌파(EEG)를 이용하여 수행될 수 있다.
질병 상태의 모델은 발작 모델일 수 있다.
질병 상태의 모델은 발작 동물 모델일 수 있다.
발작은 등쪽 CA1 자극, 중간 CA1 자극, 배쪽 CA1 자극 또는 서브이큘럼 자극 중 최소한 하나에 의해 발생될 수 있다.
본 방법은 신경자극 및 약물 설계를 위한 발작 동물 모델을 이용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원발명의 다양한 양태는 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 세포형 특이성을 갖는 광유전적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 통하여 행동의 미주신경자극(VNS) 메커니즘을 식별하는 단계, 별개 발작 유형을 생성하고 그 발작 유형을 식별하기 위해 각각의 발작 유형에 대한 VNS의 효능을 평가하는 단계, 각 발작 유형에 관한 고유 뇌파(EEG) 서명들을 식별하고, 뇌파(EEG) 및 발작 동기화된 ofMRI로 환자의 뇌파(EEG) 서명을 식별하는 단계를 포함한다.
본 방법은 미주신경자극(VNS), 뇌심부자극(DBS) 및 감응성신경자극(RNS)중 하나일 수 있는 신경자극을 더 포함할 수 있다.
본 방법은 행동의 신경자극 메커니즘을 확인하기 위해 신경자극 동기화된 ofMRI를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
신경자극은 미주신경자극(VNS), 뇌심부자극(DBS) 및 감응성신경자극(RNS)중 하나일 수 있다.
본원 발명의 다양한 양태는 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하는 방법을 제공하며, 본 발명은 후내측, 내측, 복내측 및/혹은 외측 CA1부위의 피라미드 신경세포를 광유전적으로 자극하는 단계, 광유전적 기능적 자기공명영상(ofMRI)을 가지고 연결된 뇌 네트워크를 통하여 발작을 모니터링하는 단계, 및 ofMRI 활성 위치에서 로컬 필드 전위 및 단일 단위 기록을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 통로의 억제 개재 신경 또는 섬유에 대한 직접적인 자극을 발생시키지 않으면서 달성될 수 있다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 단기적 활성을 발생시키기 위해 20Hz이하의 주파수 자극을 활용하여 수행될 수 있다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 단기적 활성을 발생시키기 위해 6-10Hz의 주파수 자극을 활용하여 수행될 수 있다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 20Hz 이상의 주파수 자극으로 수행될 수 있다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 장기적 활성을 발생시키기 위해 20-60Hz의 주파수 자극을 활용하여 수행될 수 있다.
상기 광유전적으로 자극하는 단계는 40Hz 광 자극으로 수행될 수 있다.
본 방법은 피라미드 뉴런을 자극하거나 억제하기 위해 AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 또는 AAV5-CamKIIa-NpHR-mCherry 중 최소한 하나를 투입하는 단계 및 뉴런을 광유전적으로 초래하기 위해 청색 및 노란빛 중 최소한 하나를 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
청색 빛은 초당 1, 10, 60 또는 100 주기로 전달될 수 있다.
청색 빛은 뇌를 스캐닝하면서 총 6분 동안 매분 20초 동안 초당 1, 10, 60 또는 100 주기로로 전달될 수 있다.
본원 발명의 방법 및 장치는 본 문서에 결합된 첨부 도면과 본원 발명의 몇몇 원리들을 설명하기 위해 함께 사용되는 다음의 구제적인 설명으로부터 분명히 나타나거나, 좀 더 자세히 기재되어 있는 기타 특징 및 장점들을 갖는다.
도 1a 및 도 1b는 등쪽 CA1의 흥분성 뉴런으로부터 발생되는 발작을 도시하고 있다. 전위 기록이기의 발작은 행동적 출력을 갖지 않는다. 발작은 전두 피질로 전파되지 않으며, 전방 시상을 사용하지 않는다.
도 2a 및 도 2b는 배쪽 CA1의 흥분성 뉴런으로부터 발생되는 발작을 도시하고 있다. 전위 기록이기의 발작은 장대성 행동적 발작을 갖는다. 발작은 전두 피질로 전파되지 않으며 전방 시상을 사용하지 않는다.
도 3a는 도 2의 동일한 발작 유형에 관여하지 않는 전방 시상(AV)를 도시하고 있으며, 도 3b는 서브리큘럼의 흥분성 뉴런으로부터 유래하는 관측되는 명확한 관여를 도시하고 있다.
도 4a 및 4b는 VNS 동기화된 fMRI를 도시하고 있다.
도 5, 도 5b, 도 5c 도 5d, 도 5e, 도 5f 및 도 5g는 피라미드 등쪽 CA1 세포 드라이브의 강력한 BOLD 및 EEG 반응의 광유전적 세타 주파수 여기를 도시하고 있다. 도 5a는 관상 슬라이스(1 … 20)의 변환된 세포(삼각형), 빛 및 위치를 도시하고 있다. 도 5b는 등쪽 CA1의 ChR2-EYFP 발현의 형광(좌측) 및 공초점(우측) 이미지를 도시하고 있다. 화살표는 EYFP 발현을 보여주는 세포를 가리킨다. 도 5c는 기준 전극은, 브레그마의 오른쪽으로 3.0 mm 전방 및 2.0 mm에 배치되고, 기록 전극은 등쪽 CA1 상부 대뇌피질의 상부에 배치되는, 두개골 EEG 및 광 자극 위치를 도시하고 있다. 도 5d는 감지하기 힘든 얼굴 및 몸 동작의 상세 보기로 행동을 기록하기 위해 주문 설계된 3개의 카메라를 구비한 다이아몬드 형태의 챔버를 도시하고 있다. 도 5e는 6Hz 광 자극과 협력하여 유발된 EEG 스파이크를 도시하고 있다. 도 5f는 대부분 외측 등쪽 해마 형성체(HF), 동측 시상(T), 동측성 팽대후부 피질(RSC)(P<0.001; 삼각형의 하부 팁: 광 자극 부위)에서 관찰되는 BOLD 활성화를 도시하고 있다. fMRI 데이터 세트는 5개의 동물들에 대한 6개의 독립적인 실험으로부터 평균화 된다. 각각의 개별적인 실험은 6개의 fMRI 스캔으로 구성된다. 도 5g는 왼쪽으로 각각의 청색 빛 자극에 대응하여 나타나는 750ms 주기 해상도 슬라이딩 윈도 재건된 ofMRI 혈류 역학적 반응(모든 활성 복셀에 걸쳐서 평균화됨)을 도시하고 있으며, 오른쪽으로는 자극이 중지된 이후에 중대한 쇠퇴를 갖는 광 자극내의 BOLD 신호 피크를 나타내는 하나의 획기적인 흔적을 도시하고 있다.
도 6, 도 6b 및 도 6c는 외측 점증과 함께 진화하는 전위 기록적 발작을 발행시키는 피라미드 등쪽 CA1 세포의 감마 주파수 여기를 도시하고 있다. 도 6a는 등쪽 CA1이 40Hz 광 자극을 받을 때 나타나는 진화하는 EEG 발작 패턴을 도시하고 있다. 유발된 스파이크는 더 높은 전압 폴리스파이크-서파로 변환된다. 발작성 활성은 자극을 더 오래 지속시킨다. 도 6b는, 등쪽 CA1의 6Hz 자극과 비교되는, 40Hz 자극이 외측 등쪽 해마 형성체, 양쪽 시상, 외측 동측성 팽대후부 피질, 및 격막(P<0.001; 삼각형 하부팁: 광 자극 부위)에서 더 광대한 BOLD 활성화를 발생시키는 것을 도시하고 있다. 도 6c는, 왼쪽으로, 40Hz 등쪽 CA1 자극이 청색 광 자극으로 동기화되는 장기적인 BOLD HRF를 일으키는 것을 도시하고 있으며, 오른쪽으로는, 하나의 획기적인 HRF가 발작성 활성이 40Hz 빛 자극을 오래 지속시키는 EEG 결과와 일치되는 ofMRI에서의 지속 활성화를 나타내는 것을 도시하고 있다.
도 7, 도 7b, 도 7c 및 도 7d는 양호한 BOLD 및 EEG 반응을 제공하는 피라미드 복부 CA1의 세타 주파수 여기를 도시하고 있다. 도 7a는 ofMRI 관상 슬라이스(1… 20)의 형질도입세포(삼각형), 빛 및 위치를 도시하고 있다. 도 7b는 복측 CA1에서의 ChR2-EYFP 발현의 형광(좌측) 및 공초점(우측) 이미지를 도시하고 있다. 화살표들은 EYFP 발현을 나타내는 세포들을 가리킨다. 도 7c는 6Hz 복부해마 자극이 자극과 동시에 유발된 EEG 스파이크 웨이브를 초래하는 것을 도시하고 있다. 도 7d는, BOLD 신호가 대측성 해마 형성체보다 더 외측, 대측성 시상보다 더 외측, 양쪽 외측 중격핵과 동측성 팽대후부 피질(P<0.001; 삼각형의 하부팁: 광 자극 부위)에서 관찰되는 것을 도시하고 있다. ofMRI 데이터 세트는 4개의 동물에 대한 6개의 독립적인 실험으로부터 평균화된다. 각각의 개별적인 실험은 6개의 fMRI 스캔으로 구성된다.
도 8 및 도 8b는 광범위한 BOLD 신호와 함께 EEG 및 행동 발작을 발생시키는 피라미드 복측 CA1세포의 감마 주파수 여기를 도시하고 있다. 도 8a는 20s, 40Hz 자극이 자극을 더 오래 지속시키는 진화하는 EEG 발작 패턴을 일으키는 것을 도시하고 있다. 머리 털기, 얼굴 찡그리기, 간헐적 경련성 발작 및 달리기-점프를 포함한 행동들이 다른 설치류 대상들에서 양호하게 나타난다. 도 8b는, 6Hz자극과 비교되는, 광범위한 BOLD 활성화가 다른 영역에서 다음과 같이 관찰되는 것을 도시하고 있다: 복부 해마 형성체, 시상 및 중격 영역은 좀 더 지속되는 반응을 나타내고, 등쪽 해마 및 대상피질은 더 짧은 지속 반응을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 흥분성 뉴런에서 특이적 발현을 보이는 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP의 면역 조직학적 특징을 도시하고 있다. AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP: 흥분성 마커 CaMKIIa, 억제 마커 GABA, 및 핵 마커 DAPI를 위한 스테이닝. ChR2-eYFP(좌측), CaMKIIa 및 GABA(중간), DAPI +오버레이(우측)가 나타난다. CaMKII, GABA 및 DAPI를 구비한 eYFP의 오버레이는 eYFP를 동시에 발현하는 GABA 양성 세포(도 9b)가 아닌 CaMKIla 양성 세포(도 9a의 흰색 화살표)를 나타낸다. eYFP를 발현하는 98%의 세포들이 CaMKII에 대해 양성이었다(1745/1786개의 세포들, n=5마리 동물). 0.5 mm3의 옵신 발현 CA1 영역에서 카운트되는 모든 CaMKII세포들의 51%(1786/3479개의 세포들, n=5 마리 동물)가 eYFP 양성이었다.
도 10a 및 도 10b는 등쪽 해마 CA1 및 해부상으로 연결된 영역에서 발현되는 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP를 보여주는 형광 및 공초점 영상을 도시하고 있다. 도 10a는 등쪽 해마 CA1, 대측성 CA1, 운동 피질, 해마 핌브리아, 중격핵 및 시상의 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP 발현을 보여주는 형광영상이다. 도 10b는 바이러스 투입 부위(등쪽 해마 CA1 영역, 상부 열 좌측 패널) 근처에 위치하는 세포체에서 발현되고 이러한 세포체로부터 돌출된 축삭 섬유에 걸쳐서 발현되는 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP를 보여주는 공초점 영상이다. 대측성 등쪽 해마 CA1 영역과 운동 피질층 VI의 세포체의 작은 일부만이 eYFP(<2%)를 발현하는 투입 부위 근처에서 관찰된다. 그렇지만, 이러한 영역들의 어떤 것도 자극 부위로 직접적으로 돌출하지 않기 때문에, 이러한 위치에서의 세포체 갖는 뉴런으로부터 ChR2의 어떠한 섬유 발현도 기대되지 않으며, 그러므로, 이것은 CA1의 세포체를 갖는 뉴런만을 직접적으로 자극하는 목표를 저해하지 않는다. eYFP발현은 해마, 중격핵 및 시상의 핌브리아의 축색돌기로 제한된다.
도 11a 및 도 11b는 등쪽 및 복부 해마 자극의 EEG 및 행동을 도시하고 있다. 도11a: 등쪽 해마에서의 6Hz 및 10Hz 자극은 자극을 더 지속시키지 않는 유발된 스파이크를 생성하였다. 반면, 20, 40 및 60Hz에서의 자극은 6개의 실험(10일 실험, 두 마리 동물)에서 진화하는 해마 발작성 전위 기록적 이벤트 및 정상적인 행동을 생성하였다. 원 내부의 숫자들은 자극 주파수를 가리킨다. 도 11b: 복부 해마에서의 6Hz 자극은 자극과 하나의 진화하는 발작 동안에 3가지 에피소드의 스파이크 웨이브를 생성한다. 6Hz 복측 실험은 각각 하나씩 정상적인 행동과 연관성이 있으며, 두 개는 머리 흔들기, 하나는 간헐적 경련성 발작과 연관성이 있다. 반면, 10, 20, 40, 60Hz에서의 자극은 머리 흔들기, 얼굴 찡그리기, 간헐적 경련성 발작 또는 달리기-점프 발작(21일 실험과 3마리 동물)을 포함하는 완전히 진화하는 발작성 패턴 및 발작 행동들을 항상 일으킨다. 발작 패턴의 복제 가능성이 각 실험이 개시된 이후에 5, 10, 및 15분에서 3번의 20초 연속 빛 자극을 전달함으로써 평가되었다. EEG 및 행동 패턴이 3번의 연속적인 자극의 각각에서 유사했다(가장 장기적인 전위 기록적 발작만이 대개 첫 번째로 데이터 요약을 위해 순위 평가되었다.) 제1 발작을 위한 EEG 변화의 지속기간은 80.8±4.1초 이었고, 제2발작은 40.9±4.3초 이었으며, 제3발작은 66.0±6.9초 이었다. 제1발작은 두 번째(p=0.00002, 두 개의 테일드의 쌍으로 된 t-테스트) 테스트를 수행했던 것보다는 더 긴 지속기간을 갖지만 세 번째(p=0.21) 테스트보다는 길지 않은 지속기간을 가졌다. 등쪽 해마 발작의 평균 지속기간은 복측 발작(p=0.08)의 평균 지속기간인 86.9±4.0초에 비해 64.7±2.2초 이었다. ofMRI가 O2(35%), N2O(63.5%) 및 아이소플루레인(~1.2-1.5%)으로 마취된 쥐에서 기록되었기 때문에, 추가적인 영상-EEG가 동일한 혼합물을 흡입한 3마리 동물에 대한 30일 실험에서 분석되었다. 6, 10, 20, 40 및 60Hz에서의 빛 자극은 깨어있는 쥐에서 EEG 이벤트로부터 패턴과 지속기간 동안에 구별하기 어려운 전위 기록적인 진화하는 발작을 일으키면서, 빛 자극 전 기초선 EEG들은 마취로부터 기대되는 바와 같은 파열 억제를 모두 나타내었다.
도 12a 및 도12b는 복부 해마 CA1과 연결 영역에서 발현되는 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP를 보여주는 형광 및 공초점 영상을 도시하고 있다. 도 12a: 형광영상은 복부해마 CA1, 대측성 CA1, 치상회, 체감각 피질, 해마 및 시상의 핌브리아에서 발현되는 AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP를 보여준다. 도 12b: AAV5-CaMKII::hChR2-eYFP는 주사 부위 발현된 eYFP((<1%) 근처의 체감각 피질 층 VI의 소수 세포체를 제외한 바이러스 투입(복부 해마 CA1, 상부 열 좌측 패널)근처에 위치하는 세포체와 이러한 세포체로부터 돌출된 축삭 섬유에 걸쳐서 발현된다. 그렇지만, 체감각 피질 뉴런은 자극 부위로 직접적으로 돌출되지 않으며, 우리는 체감각 피질의 세포체를 갖는 뉴런으로부터 ChR2의 어떠한 섬유 발현도 기대하지 않으며, 그러므로 이것은 CA1의 세포체를 갖는 뉴런만을 직접적으로 자극하기 위한 목표를 저해하지 않는다. eYFP 발현은 대측성 CA1, 치상회, 해마 및 시상의 핌브리아의 축색돌기로 제한된다.
도13은 ANT 자극이 발작을 감소시키는 것을 도시하고 있다. 110명의 ANT에서 양 방향으로 이식된 전극을 가졌고 환자가 한달 동안 회복되었다. 이후 3개월 동안, 환자들은 그들의 치료 그룹을 알지 못한 상태에서 5V(원형, 실선) 또는 0V(정사각형, 점선)에서 자극에 임의로 추출되었다. 상당히 더 적은 발작(p<0.04)이 5V 활성 자극을 받은 그룹에서 발생되었다.
도 14, 도 14b, 도 14c, 도14d 및 도14e는 규정된 설치류 피질성 세포 드라이브 양성 BOLD에서 광학적으로 구동되는 국소 여기를 나타내는 ofMIR를 도시하고 있다. 도 14a는 개략적인 형질도입 세포(삼각형) 및 캐뉼러 이식 및 자극 부위에서 M1에 나타나는 청색 빛 전달을 나타낸다. 관상 영상 슬라이스는 “1..9”로서 표시된다. 도 14b는 M1(좌측)의 ChR2-EYFP 발현의 공초점 이미지를 나타낸다; 더 높은 배율이 형질도입 뉴런 세포체 및 공정(우측)을 나타낸다. 도 14c는 473nm 광 자극 동안에 세포외 광센서 장치 기록을 나타낸다. 도 14d에서, BOLD 활성화는 광 자극 부위(화살촉: 투입/자극 부위) 근처에서 관찰된다. 관상 슬라이스는 연속적이며 0.5mm 두께를 갖는다. 도 14e는 광 자극(좌측)의 6가지 연속적인 기간 동안의 ofMRI 혈류 동태학적 반응을 나타내며; 자극 패러다임은 매 60s(청색 막대기들)마다 반복되는 20s의 20 Hz/15 ms 473 nm 빛 자극이었고; 혈류 동태학적 반응이 운동 피질에서 일관성 계수>0.35를 갖는 모든 복셀에 걸쳐서 평균화 되었으며; 모든 자극 기간(우측)의 평균인 기초 선은 평균 선-자극 신호 크기에 해당한다.
도 15는 ofMRI 회로 맵, 즉 종래 BOLD 및 통과대역 bSSFP-fMRI을 도시하고 있다. 예상되는 바와 같이, M1에 CaMKIIa::ChR2-EYFP의 투입은 운동 피질, 선조체 및 시상에서, 즉, 제1투입 부위 및 발현되는 뉴런의 축색돌기가 돌출(좌측)되는 부위에서 옵신 발현을 일으킨다. 종래BOLD fMRI 활성 맵이 적절한 해부상의 아틀라스 영상들 위에 겹쳐 놓여있다. 통과대역 bSSFP-fMRI 활성 맵이 회로 레벨 활성을 좀 더 완전히 촬영하고 있는 적절한 해부상의 아틀라스 영상들 위에 겹쳐 놓여있다.
도 16, 도 16b, 도 16c 및 도 16d는 ofMRI 중에 위치, 유전적 정체성, 배선으로 정의되는 세포 억제를 도시하고 있다. 도 16a는 MV5-CaMKIIa::ChR2-EYFP의 M1 투입과 시상의 광 자극을 나타낸다. 도 16c에 나타난 관상 슬라이스는 "1..6" 및 "7..12"로서 표시된다. 도 16c는 피질성 패턴(좌측) 및 피질-시상 돌기에서의 발현을 확인하는 ChR2 발현 패턴을 나타낸다. 도 16c는 시상(상부) 및 피질(하부)에서 획득되는 BOLD ofMRI 데이터를 나타낸다. 도 16d는 시상에서 피질-시상 섬유의 광 자극에 의해 유발된 피질성(회색) 및 시상(검정색) BOLD 신호를 위한 ofMRI-HRF를 나타낸다. 양쪽의 ofMRI-HRFs는 도 13의 피질내 결과들과의 비교하면 완만하게 경사진다.
도 17은 해마 발작 전파와 관련된 파페츠 회로를 도시하고 있다. 내측(1) 및 외측(2) 해마가 도시되지 않은 기타 중에서 뇌궁(3)의 유출을 모으고 있다. 뇌궁(3)은 시상(8)의 전방 핵의 복측 핵에 존재하는 직접적인 뇌궁 연결(4) 시냅스 및 시상하부의 유두체와 이어져 있다. 유두체는 내측(5) 및 외측(6) 핵 그룹을 갖는다. 유두체들은 MTT(7)를 통하여 ANT(8)로 돌출되며, 팽대 피질(9)을 향하여 교대로 돌출된다. 치대 번들(10)은 서브이큘럼 및 해마 쪽으로 루프 백을 완성한다.
도 18a 및 도18b는 ANT(AV)에 대한 작동성 및 콜린성 돌기를 도시하고 있다. 도 18a는 작동성 터미널 스테이닝이 복측 시상에서 현저하다는 것을 나타내고 있다. 도 18b는 콜린성 마커가 특히 복측 시상의 후측 부분에 밀집한다는 것을 나타낸다.
도 19는 바이쿠쿨린을 해마에 주입함으로써 생성되는 쥐의 좌측 해마에서의 초점 발작을 도시하고 있다. 스파이크-웨이브가 해마 전극에서 볼 수 있다.
도 20, 도 20b, 도 20c, 도 20d, 도 20e 및 도 20f는 주파수 종속적인 세포형 특이 활성을 불러일으키는 해마에서의 피라미드 뉴런 자극의 ofMRI를 도시하고 있다. 도 20a는 내측 CA1 피라미드 뉴런의 20s 및 10Hz 자극은 입쪽 및 꼬리의 측두엽 영역의 점증을 주사 부위로 끄집어 낸다. 도 20b는 유도된 활성의 향상된 입쪽, 꼬리 및 외측 전파를 산출하는 20Hz 자극을 나타낸다. 도 20c에서 활성 복셀의 수는 10Hz를 나타내며, 도 20d는 20Hz가 활성 해부상의 영역을 위해 계획되는 것을 나타낸다. 20Hz 자극은 더 큰 활성화 볼륨 및 단계를 일으킨다. 서브이큘럼은 특히 큰 위상 차를 갖는다. 도 20e는 6, 10, 20, 40, 60Hz의 자극 주파수를 위해 계획된 서브이큘럼의 ofMRI-HRF를 나타낸다. 20Hz 자극이상은 자극 오프셋 이후 ~20초 동안 일관된 반응을 제공한다. 도 20f는 20Hz 자극의 5, 10, 20초 동안 서브이큘럼의ofMRI-HRF를 나타낸다. 자극 지속기간과는 상관 없이, 모든 자극이 자극 오프셋 이후에 ~20s 동안 일관된 반응을 제공한다.
도 21, 도 21b, 도 21c, 도 21d, 도 21e 및 도 21f는 LFP 및 단일 유닛 기록이 ofMRI 결과와 일치하는 주파수 의존성을 나타낸다는 것을 도시하고 있다. 도 21a는 광 자극 동안에 LFP 증가를 초래하는 내측 CA1 피라미드 뉴런의 20s, 10Hz 자극을 나타내고 있다. 반면, 도 21b는 자극 오프셋 이후에 지속되는 일련의 LFP를 제공하는 20Hz 자극을 나타낸다. 도 21c는 자극 동안에 스파이크 률의 증가를 나타내는 10Hz 자극 동안의 단일 유닛 기록을 나타낸다. 도 21d는 자극 오프셋 이후 일련의 뉴런 스파이크를 일으키는 20Hz 및 60Hz 자극을 나타낸다. 도 2f 즉 흥미롭게도 40Hz 자극으로 CA1에서의 반대쪽 기록이 자극 오프셋 이후에 유지되는 자극에 대한 억제를 갖는 세포를 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 외측 CA1의 피라미드 뉴런 자극이 파페츠 회로를 모으는 것을 도시하고 있다. 도 22a는 다른 회로 요소뿐만 아니라 측두엽의 점증을 파페츠 회로로 유도하는 외측 CA1 피라미드 뉴런의 20s 및 60Hz 자극을 나타낸다. 도 22b는 계획된 각 영역에서 활성 복셀의 수를 도시하고 있다. 위상은 내측 CA1 자극에 비하여 더 많은 다양성을 보여주고 있다.
도 23a 및 23b는PTZ 모델의 발작에서 ANT의 전기 자극을 도시하고 있다. 도 23a: ANT의 100Hz 자극이 피질성 발작 활성을 중지시킨다. 도 23b: ANT 자극이 간헐적 경련성 발작을 생성하기 위해 필요한 PTZ의 양을 증가시키는 것으로 나타난다.
도 24a 및 24b는 압축 감지 통과대역 b-SSFP fMRI를 도시하고 있다. 도 24a: 종래에 수집 및 재구성되는 통과대역 b-SSFP fMRI를 도시하고 있다. 도 24b: 압축 감지 재구성된 통과대역 b-SSFP fMRI로 적절하게 추출되지 않은 고해상도 수집은 동일한 수집 시간으로 6배 더 작은 복셀을 달성한다.
도 25는 예시적인 연구 연대표를 도시하고 있다.
도 26a, 도 26b, 도 26c, 도 26d, 도 26e, 도 26f, 도 26 g, 도 26h, 도 26i 및 도 26j 는 ofMRI의 정확한 시공간적인 측정 능력을 보여주는 ofMRI 활성 부위에서의 전기생리학적인 기록을 도시하고 있다. 도 26a는 6, 10, 20, 40, 60Hz에서 등쪽-내측 CA1 파라미드 뉴런의 20s 자극을 갖는 서브이큘럼의 ofMRI-HRF를 나타낸다. 20Hz 이상의 자극은 자극 오프셋 이루 ~ 20s 동안에 일련의 반응을 제공한다. 도 26b는 20 Hz 자극의 5, 10, 20s 동안 서브이큘럼의 ofMRI-HRF를 나타낸다. 자극 지속기간과는 상관없이 ~ 20s 동안 일련의 반응이 자극 오프셋 이후 관찰된다. 도 26c 및 26d는 6 및 10Hz 자극이 광 자극 동안에 LFP 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. 반면, 도 26e 및 도 26f는 20 및 40Hz 자극이 자극 오프셋 이후에 지속되는 LFP를 제공한다는 것을 나타낸다. 도 26g는 자극 중에 스파이크 비율 증가를 보여주는 10Hz 자극 중 단일 유닛 기록을 도시하고 있다. 도 26h는 40Hz 자극이, 도 26i는 60Hz 자극이 자극 후 지속되는 뉴런 스파이크를 일으키는 것을 나타내고 있다. 도 26i는 40Hz 자극을 갖는 CA1에서의 반대쪽 기록이 자극 오프셋 후 지속되는 자극에 대한 억제를 갖는 세포를 나타낸다는 것을 도시하고 있다. 이러한 발견들은 측두 뉴런 활성을 나타내는 ofMRI-HRF 신호의 정확성을 입증한다.
도 27은 등 내측 CA1의 광 유전적 자극 동안에 EEG 및 행동을 도시하고 있다. 상위 4개의 트레이스는 형질 전환된 해마의 광 유전 빛 자극 전, 중과 이후에 간략하게 연속적인 EEG를 보여준다. 빛 자극은 검은 색 화살표로 표시된 "빛 개시"시간에 적용되고 40 초 동안 지속되었다. 전체트레이스는 뇌파 기록의 80s를 보여준다. 하부 이미지는 발작 동안 비디오의 화면을 보여준다.
도 28a 및 28c는 발작 모델 #1을 도시하고 있다. 등 내측 CA1의 피라미드 뉴런의 고주파 자극은 해마를 통해 한정된 뉴런 활성 전파를 갖는 발작을 일으킨다. 도 28a는 내측 CA1 피라미드 뉴런의 20s 및 40Hz 자극이 입쪽 및 꼬리 양 측두엽 점증을 주사 부위(청색 별, +2.0 mm, -4.8 mm, -3.5 mm)로 유도하는 것을 보여주고 있다. 상부 좌측 코너: Paxino 아틀라스 슬라이스 번호. 도 28b는 활성 해부 영역(5 마리 동물들)을 위해 계획되었던 활성 복셀의 수를 나타낸다. 행동 테스트는 A의 변질된 라신 스케일 및 3 EEG 스코어를 나타낸다.
도 29a 및 도 29b는 발작 모델 #2를 도시하고 있다. 배 외측 CA1의 피라미드 뉴런의 고주파 자극은 파페츠 고전회로를 통해 뉴런 활성 전파를 갖는 발작을 일으킨다. 도 29a는 배 외측 CA1 피라미드 뉴런의 20s, 40Hz 자극이 파페츠 고전 회로의 뚜렷한 점증을 이끌어내는 것을 나타낸다 (주사 부위): 청색 별, +5.4 mm, -6.6 mm, -4.2 mm). 도 29b는 활성 해부 영역(5마리 동물)을 위해 계획되었던 활성 복셀의 수를 나타낸다. 행동은 변질된 라신 스케일 5를 나타낸다.
도 30a, 도 30b, 도 30c, 및 도 30d는 해마에서 영양 결핍의 신경계 및 아미로이드 플라크 형성체, 콜린성 뉴런 길이, 볼륨 감소 및 기저 전뇌에서의 분지, 해마에서 LTP의 감소, 대상 인식 부족을 보여주는 AD의 유전자 도입 마우스 모델을 도시하고 있으며, 이것은 모두 신약 후보 LM11A-31의 투입에 의해 중대하게 구조된다. 도 30a 는 표시된 바와 같이 비히클 또는 LM11A-3이 제공된 APPL/S 마우스의 해마에서 영양결핍의 뉴런(좌측) 및 아미로이드 플라크(우측)을 위한 티오플라빈 S 스테이닝을 위한 APP 면역표시의 현미경 사진이다. 기준자 = 25㎛. 도 30b는 콜린 아세틸전달효소-면역 염색 기저 전뇌 영역의 현미경 사진이다. LM11A-31를 갖는 APPL/S 마우스의 치료는 콜린성 신경돌기의 증가된 길이, 볼륨 및 분지와 관련되었다. 도 30c 는 LM11A-31가 APP/PS1 마우스: APP/PS1-비히클 대 wt-비히클, p = 0.003; APP/PS1-비히클 대 APP/PS1-LM11A-31, p = 0.02; wt-비히클 대 wt-LM11A-31, NS 에서 LTP를 정상화하는 것을 나타낸다. 도 30d는 LM11A-31 가 APPL/S 마우스에서 물체 인식 부족을 예방하는 것을 나타낸다. 통계적 중요성은 ANOVA 및 사후 학생-뉴먼-쿨스 테스트를 이용하여 결정되었다.
도 31a는 마우스 뇌 콜린성 시스템을 도시하고 있다. 기초 전뇌의 MSDBB가 해마로 해부상으로 돌출되는 것으로 알려져 있다. 본원 발명에 따라서, 콜린성 뉴런은 AD에서 해마와 관련된 중대한 기억 상실 때문에 MSDBB에서 자극되었다.
도 32a, 도 32b 및 도 32c는 기저 전뇌에서 콜린성 뉴런 특이 자극을 갖는 ofMRI가 해마를 포함한 세계적인 네트워크 점증을 보여주는 것을 도시하고 있다. 도 32a는 선택적으로 자극의 대상이 되었던 기저 전뇌 MSDBB에서의 콜린성 뉴런을 도시하고 있다. 도32b는 도32c의 영상 슬라이스 2 근처의 캐뉼러 이식 위치를 보여주고 있는 해부 MRI 영상이다. 도 32c는 해마를 포함한 대면적 점증으로 이어지는 MSDBB의 콜린성 뉴런의 감마(40Hz) 주파수 자극이다. 활성영역은 M2(보충적 운동피질), Cg(대상 피질), 중격핵, VHC(복부 해마 commissure), HF(해마 형성체), 및 RSC(팽대 피질)을 포함한다. 그레이 스케일은 위상, 즉 활성 지속기간, 피크 타이밍을 나타낸다. 흰색은 삼각형을 자극위치로 도치시키고 있다.
도 33은 치상회의 과립세포로 출력을 도시하고 있다. 분자층의 과립세포 덴드라이트는 엔토리날 피질성 피라미드 세포로부터 자극적 입력을 접수한다. 게다가, 기저 전뇌 핵으로부터 봉합 및 콜린성 입력으로부터의 세로토닌 입력은 과립 세포의 신경을 통하게 한다. 콜린성 또는 세로토닌 뉴런(녹색 축색 돌기로 표시)에서 ChR2를 선택적으로 발현하는 형질 전환 동물을 사용하고, 광자극 섬유를 치상회(청색 빛)에 배치하여, 치상회로 특이적으로 돌출되는 콜린성 또는 세로토닌 뉴런이 선택적으로 활성화될 것이다.
도 34a 및 도 34b는 ofMRI 동안에 위치, 유전적 정체성 및 배선에 의해 정의된 세포 억제를 도시하고 있다. 도 34a는 AAV5-CaMKIIα:：ChR2-EYFP의 M1 투입 및 해마의 광 자극을 도시하고 있다. 관상면 슬라이스는 “1..6” 및 “7..12”로서 표시된다. 도 34b는 시상(상부)과 피질(하부)에서 획득된 BOLD ofMRI를 도시하고 있다. 이러한 연구는 ChR2를 발현하는 축색돌기 섬유들의 자극을 갖는 ofMRI가 양호한 신호를 끌어내는 것을 증명해준다.
도 35b는 도 35c의 영상 슬라이스 2 근처의 캐뉼러 이식 위치를 나타내는 해부 MRI 영상을 도시하고 있다. 도 35c는 기저 전뇌의 콜린성 뉴런의 감마(40Hz) 주파수 자극이 해마를 포함한 광역 네트워크 점증으로 이어진다는 것을 도시하고 있다. 활성 영역은 M2(보충적 운동피질), Cg(대상피질), 중격 핵, VHC (복부 해마 commissure), DG(치상회)를 포함한 HF(해마 형성체) 및 RSC(팽대 피질)을 포함한다. 색은 위상, 즉 활성의 지속기간, 피크 타이밍을 나타낸다. 흰색은 삼각형을 자극 위치로 도치시켰다.
예들이 첨부도면에 도시되고 아래 설명된 본원 발명(들)의 다양한 실시예들이 구체적으로 설명될 것이다. 본 발명(들)은 예시적인 실시 예들과 함께 설명될 것이며, 본 설명이 이러한 예시적인 실시 예들로 발명(들)을 한정하지 않는 것으로 이해될 것이다. 반면에, 본 발명(들)은 예시적인 실시 예들뿐만 아니라 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 발명의 정신 및 범위 이내에 포함될 수 있는 다양한 대안, 수정, 균등물 및 기타 실시예들을 포함한다.
본원 발명의 다양한 양태는 다양한 암시를 갖는다.
첫 번째로, 간질병의 분야의 관점에서, 본원 발명은 어떤 치료법이 설계될 수 있는지에 대한 기본적인 변화을 나타내고 있다.
예를 들면, Medtronics은 간질병에 대한 뇌심부자극(DBS) 치료법을 위한 임상 시험에 200 $200 MM을 소비하였다. 이러한 치료법은 FDA에 의해 불충분한 것으로 간주되는 ~40 % 효능 때문에 미국에서 승인되지 않았다.
전방 시상의 자극이 해마로부터 유래하는 발작을 역방향으로 억제하기 위한 전위를 갖는다는 증거를 근거로, 이러한 시험에서 자극을 위한 대상 및 파라미터가 경험적으로 선택되었다. 이것은 또한 많은 간질 환자의 치료에 효능을 초래할 수 있는 것을 나타내고 있지만, 대다수의 환자에게 효과가 없었다.
중요한 건, 아래 실시예 A 및 실시예 B에 요약된 접근 방식은 이러한 다양한 효능에 대한 직접적인 설명을 제공한다. 예를 들면, 본원 발명에 따른 모델링은, 해마로부터 발생되는 많은 유형의 발작들이 발작 네트워크의 일부로서 전방 시상을 사용하지 않는다는 것을, 보여주고 있다. 그러므로, 전방 시상 자극은 이러한 경로를 포함하는 발작을 중지시킬 가능성은 적다. 그렇지만, 해마와 관련하여 발생된 발작의 대체 부분집합은 전파 통로로서 전방 시상을 활용한다. 그러므로, 이러한 발작은 전방 시상 자극 치료법에 반응할 것이다. 만약 본원 발명에 따라서 착수된 우리의 연구를 통해서 현재 이용할 수 있는 그와 같은 증거를 임상 시험에 종사한 메드트로닉(Medtronics)이 이용할 수 있었더라면, 좀 더 효과적인 대상과 환자 개체군 선택이 가능했었을 것이며, 절실히 필요로 하는 환자에게 좀 더 효과적인 치료법의 좀 더 빠른 전달을 가능하게 하면서 비용에 있어서 수억 대를 절감할 수 있었을 것이다.
이리하여, 매우 정밀한 발작을 발생시키고 그 네트워크 관여를 추적하기 위한 능력이 본원 발명에 따른 치료법의 설계에 대한 기본적인 변화를 가능하게 할 극단적으로 영향력 있는 접근 방식이다. 게다가, 본원 발명에 따른 치료 대상을 식별하기 위한 MRI 접근 방식은 간질병뿐만 아니라 파킨슨 우울증, 알츠하이머 강박 장애 및 고통을 포함한 많은 기타 신경질병에 대한 일반적인 충격을 잠재적으로 가질 것이다.
두번째, 기능적 뇌 영상 관점으로부터, 본원 발명은 자극 파라미터의 간단한 변경이 뇌 네트워크의 뚜렷한 공간적 점증을 일으키는 뇌의 역학적 특성을 촬영하기 위한 기능적 뇌 영상의 역량에 대한 최조 시범에 해당한다. 본원 발명의 다양한 양태는 세타 대 감마 주파수 자극을 증명하는 것을 제공한다.
본원 발명의 다양한 양태는 자극 주파수가 어떻게 공간적 네트워크 요소에 점증을 변경하고, 기능적 자기 공명 영상(fMRI) 혈류 반응 함수(HRF)로 촬영될 수 있는 각 위치의 상이한 시간 역동성을 초래하는지를 제공한다. 진화하는 발작으로부터의 HRF는 지속적인 반응을 명확하게 나타낸다.
본원 발명의 다양한 양태는 복합 연접부에 걸친 전체 뇌에서 네트워크 반응을 추적하는 ofMRI 기술의 역량을 처음으로 증명하는 것을 제공한다. 예를 들면, 도 4 는 해마로부터 직접적인 돌기를 명확하게 갖지 않은 전두 피질 영역에서의 네트워크 연동 상태를 나타내고 있다. 조심스럽게 선택된 대상과 결합 된 본원 발명에 따른 고 품질 영상과 자극의 정확한 특성이 처음으로 이러한 역량에 대한 명확한 입증을 가능하게 하였다.
세번째로, 미주신경자극(VNS)를 위한 신경자극 치료 효과의 직접적인 시각화 분야의 관점으로부터, 본원 발명의 광 유전적 기능적 자기공명영상(ofMRI)은 어떠한 신경자극 치료법이 치료 효는을 위해 설계 및 평가될 수 있는 지에 대한 본질적인 변화를 제공한다. 상기 주목된 바와 같이, 메드트로닉(Medtronics)은 미국에서 승인되지 않았던 치료법에 $200 MM를 소비하였다.
본원 발명에 따른 MRI실험은 이러한 다양한 효능에 대한 직접적인 설명을 제공한다. 해마로부터 발생되는 많은 종류의 발작은 발작 네트워크의 일부로서 전방 시상을 사용하지 않는다. 그러므로, 전방 시상 자극이 이러한 통로를 포함하는 발작을 중지시킬 가능성은 낮다. 예를 들면, 도 1 및 도 2는 전방 시상을 사용하지 않는 해마로부터 유래하는 발작을 도시하고 있다. 그렇지만, 본원 발명에 따른 모델링은, 해마와 관련하여 발생되는 발작의 대체 부분집합이 그 전파 통보(도 3 참조)로서 전방 시상을 활용하는 것을, 보여주고 있다. 그러므로, 이러한 발작들은 전방시상 자극요법에 반응했을 것이다. 본 설명에서 요약된 우리 연구를 통하여 현재 이용할 수 있는 이러한 증거를 임상 시험에 종사한 Medtronics가 이용할 수 있었더라면, 좀 더 효과적인 대상과 환자 개체군 선택이 가능했었을 것이며, 절실히 필요로 하는 환자에게 좀 더 효과적인 치료법의 좀 더 빠른 전달을 가능하게 하면서 비용에 있어서 수억 대를 절감할 수 있었을 것이다.
이러한 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명에 따라서 매우 정밀한 발작을 발생시키고 그 네트워크 관여를 추적하기 위한 능력은 치료법의 설계에 대한 기본적인 변화를 가능하게 할 극단적으로 영향력 있는 접근 방식에 해당한다. 유사하게는, 이러한 접근 방식은 정확하게 치료적인 자극 충격을 추적할 수 있다. 치료 대상을 식별하고 충격을 평가하기 위한 본원 발명에 따른 MRI 접근 방식은 간질병뿐만 아니라 우울증, 알츠하이머 및 파킨슨 강박 장애 및 고통을 포함한 많은 기타 신경질병에 대한 일반적인 충격을 가질 수 있다.
신경 치료법 발전을 위한 이러한 고 충격 잠재력 때문에, 본원 발명에 따른 이러한 접근 방식은 실패한 시험으로 인한 수억 대를 제거하고 최적의 치료 목표로 우리를 빠르게 인도하기 위한 잠재력을 가지고 있다. 게다가, 본원 발명에 따른 이러한 접근 방식은 환자 그룹을 분류하기 위한 EEG 서명과 함께 이러한 결과를 발견할 수 있으며, 이ㄹ하여 각 환자를 위한 치료를 최적화할 수 있다.
VNS를 위한 행동의 근원적인 메커니즘을 이해하기 하고, 효과적인 결과로 대상 개체군을 식별하기 위해서, 본원 발명의 다양한 양태가 다음과 같은 단계를 제공한다:
세포 형 특이성을 갖는 설치류 동물에 대한 광유전학적 fMRI를 통해 행위의 VNS 메커니즘을 식별하는 단계.
대조적인 발작 유형을 발생시키고, 그러한 유형의 발작을 식별하기 위해 VNS가 각 발작 유형에 효과적인지 각 유형에 대한 VNS의 효능을 평가하고, 독특한 EEG 서명을 확인하는 단계.
EEG 및 발작 동기화된 MRI를 통하여 환자의 EEG 서명을 식별하고, 행동의 VNS 메커니즘을 확인하기 위해 VNS 동기화된 fMRI를 수행하는 단계.
VNS-동기화된fMRI의 실행가능성이 MRI로 VNS 장치의 호환성을 예상보다 일찍 입증하는 것을 보여주고 있다(도 4 참조). 비록 정보가 행동의 근본적인 메커니즘을 충분히 이해하기에 충분히 자세하지 않을 수 도 있겠지만, 통합된 동물ofMRI, EEG 및 인간fMRI를 활용한 통합 접근법을 통한 본원 발명의 다양한 양태는 대상 선정 및 환자 선정 과정의 상황을 완전히 변환시킬 완전히 상세한 행동 메커니즘을 제공하는 것을 목표로 한다.
실시예 A ­ 광유전적 fMRI 로 정확한 기원의 발작 네트워크를 밝혀낸다.
간질병은 전세계의 26명의 사람 당 한명에게 영향을 끼치는 높은 유병률의 손상 신경장애로서, 대략 1/3이 현존하는 치료법에 과민증이 있거나 면역성이 있다. 더욱이, 간질병의 이질적 병리생리학과 발작 개시 및 전파와 관련된 직접적인 뉴런 경로를 관찰하지 못하는 현재 불능은 더욱 효과적인 치료의 개발을 위한 특별한 도전을 제기하고 있다. 본원 발명의 광 유전적 기능 자기공명영상(ofMRI) 방법을 활용함으로써, 발작이 세포 종류, 위치, 일시적인 소정 패턴 및 개시 시간을 포함한 기원에 대한 정확한 지식으로 처음으로 발작이 발생되면서, 연관된 뇌 하류 전파 네트워크가 확인된다. 테마 주파수로 등쪽 해마에서의 CaMKIIa-발현 뉴런의 특이 자극은 대부분 해마 형성체로 제한되는 단기 지속기간의 혈류 역학적 반응을 초래한다. 더 높은 감마 주파수에서의 자극은 중격을 포함하는 뇌의 광영역에서의 자극을 오래 지속시키는 더 긴 지속기간의 혈륙 역학적 반응을 생성한다. 데타 자극의 비디오 전자뇌파검사(EEG) 모니터링은 유발된 EEG 반응을 나타내고, 감마 자극은 장기 지속기간의 혈류 역학적 반응에 해당하는 전위기록적 발작을 유도한다. 그렇지만, 행동 발작은 등쪽 해마를 자극하는 것으로부터 유도되지 않는다. 반면에, 복부 해마에서의 CaMKIIa-발현 뉴런의 감마 주파수 자극은 행동 발작에 수반되는 전위기록적 발작을 일으킨다. 해당하는 ofMRI­식별된 발작 네트워크는 전두 피질성 영역의 개입을 보여주고 있다. 중요한건, 이러한 관찰은 복합 연접부에 걸쳐 전체 뇌 역학 네트워크 함수를 드러나기 위한 ofMRI의 역량을 도시하고 있다. 임상 간질병은 좀더 복잡한 과정를 나타낼 수 있으며, 정확한 기원의 반복적 발작 전파 경로의 직접적인 시각화는 발작에 포함되는 네트워크를 조직적으로 해부하기 위한 전례 없는 기회를 제공할 것이며, 약물치료, 초점 수술 및 뉴런 자극을 목표가 된 치료 전략의 설계를 가능하게 한다.
간질병은 발작을 자연스럽게 재연하기 위한 민감성을 증가시키는 다양한 유전적 획득 원인에 기인한다. 해부학적으로, 이러한 원인은 저조하게 기술되는 하류 뉴런 네트워크 활성과 함께 초점 또는 확산된 손상으로 해석된다. 행동 모니터링, EEG, 구조적 또는 기능적 MRI 및 PET 영상과 같은 종래 간질병 진단 방법은 임상 및 연구 설정에 있어서 결정적인 중요성을 가지지만, 특이 유형의 발작의 기저를 이루고 있는 뇌 네트워크를 독특하게 정의하는 데 있어 한계를 갖는다. 현재, 발작 메커니즘을 연구하기 위해 사용되는 동물 모델은 극심한 또는 만성적인 전기 자극, 초점적으로 적용되거나, 조직적으로 관리되는 화학 경련성, 초점 손상, 또는 유전적으로 근친 교배시킨 동물 등을 포함한다. 이러한 모델은 중심이 되는 통찰력을 제공하고 중요한 치료법의 발달로 이어졌으며, 개념적이고 실질적인 도전이 여전히 남아 있다. 첫 번째, 많은 모델에서, 발작 개시가 저조하게 국부화되며, 경로의 섬유 및 혼합된 흥분-억제 세포 집단을 포함하여 이질적인 해부 집단을 포함하며 저조한 반복성을 갖는 큰 변화성을 유도한다. 두 번째로, 발작은 네트워크 전파를 추적하는 것과 같은 시간 종속 현상에 대한 복잡한 연구에서 예상할 수 없는 시간을 두고 일어난다. 세 번째로, 각각의 발작에 전체 뇌의 기능적 개입을 정확하게 시각화하기 위한 방법없이, 정확한 네트워크 활성을 근거로 발작을 정의하기 어려웠다.
본원 발명의 다양한 양태는 특이적 해부 및 및 세포 타입의 기원의 발작에 의해 작동되는 네트워크를 정밀하게 식별할 수 있는 접근법을 제공한다. 본 접근법은 광 유전적 기능적 자기공명영상(ofMRI)과 앞서 언급된 많은 도전을 해결하는 선구적인 기술을 활용한다. 본원 발명의 다양한 양태는 청색 빛으로 흥분될 수 있도록 CA1의 등쪽 또는 복측 영역에서 해마 피라미드 뉴런을 변경함으로써, 건강하고 간질병이 없는 쥐에 대한 발작을 발생시키고 추적하기 위한 방법을 제공한다. 발작은 밀리초계 시간적 정밀성과, 전체 뇌를 통하여 발작 초점으로부터 하류로 이어서 추종되는 그 전파 패턴으로 야기될 수 있다. 활성화된 네트워크는 기원 부위와 자극 주파수에 의존한다. 각 발작은 EEG의 허위 제어 비교와 영상 기록된 동물 행동에 의해 입증된다.
첫째로, 어른 쥐의 등쪽 해마 CA1 영역에는 아데노연관 바이러스 매개체 AAV5- CaMKIIa::ChR2(H134R)-EYFP가 투입되었다. 이것은 Ca2+/칼모듈린-의존적 단백질 키나제IIa (CaMKIIa)를 발현하되, GABA성 또는 신경교 세포에서가 아닌 해마 피라미드 뉴런에서 특별하게 채널로돕신(ChR2)의 특이 발현을 생성한다. 등쪽 해마 바이러스 주사 부위도 EEG, 행동 및 혈액 산화 레벨 의존성(BOLD) fMRI 연구(도 5a)를 위한 광 자극 부위로서 사용되었다. 형광 (도 5b, 좌측) 및 공초점(도 5b, 우측) 이미지가 ChR2-EYFP(향상된 노란 형광 단백질)의 발현을 입증하기 위해 제공되었다. EEG 및행동 연구가 도 5c에 나타난 프로브 위치와 얼굴 찡그림과 같은 미묘한 동작을 촬영하기 위한 3개의 카메라를 구비하도록 설계된 다이아몬드 형태로 된 행동 챔버(도 5d)를 가지고 수행되었다. EEG 및 행동 연구를 위해, 473 nm 파장 빛이 총 실험 지속기간인 20분을 가지고 5, 10, 15분에서 20초 동안 전달되었다. EEG 및 행동 비디오가 실험중에 계속해서 기록되었다. 비디오-BEG 기록이 앞이 안보이는 채로 쥐와 인간 비디오-EEG에 경험이 있는 위원회 라이선스가 있는 뇌파 전위 기록장치가에 의해 마련되었다.
저 주파수 자극의 충격을 조사하기 위해서, 6Hz에서 청색 473nm 파장의 레이저 펄스가 청색 막대기로 표시되는 때에 등쪽 CA1으로 전달되었으며(도 5e), 각각의 자극과 협력하여 유발된 스파이크만을 일으켰다. 이러한 자극 파라미터와 함께, 정상 행동이 자극 중과 후에 관찰되었다(보충적인 도7a). 관련된 네트워크 함수를 평가하기 위해서, ofMRI 이미지가 바이러스 투입 후 최소한 10일이 걸린 연속적인 0.5mm 관상면 슬라이스로 취득되었다(FIG. If). 5 마리 동물에 관한 6개의 독립적인 실험으로부터 평균화된fMRI 신호가 대부분 외측 등쪽 해마 형성체, 외측 사상, 및 팽대 피질에서 관측되었다. 모든 활성 복셀로부터 평균화된 ofMRI 혈류 역학적 반응 함수(ofMRI-HRF)가 각각의 청색 빛 자극에 응해서 나타났다(도 5g, 좌측). 단일 기간 자취(도 5g, 우측)는 BOLD 신호가 빛 자극의 종료 후에 짧게 자극 및 쇠퇴의 시간내에서 최고조에 이르는 것을 나타내고 있다.
등쪽 CA1에서 40Hz의 청색 473nm 파장 레이저 펄스는 진화하는 EEG 발작 패턴을 생성하며, 유발된 스파이크로 시작하고, 전압을 증가시키며, 폴리스파이크-서파 및 그 후 파른 스파이크로 변환한다(도 6a). 발작성 활성은 빛 자극을 보다 더 오래 지속시킨다. 발작성 EEG 패턴에도 불구하고, 알아볼 수 있는 행동 변화는 전위 기록적 발작을 수반하지 않았다(보충적인 도 7a). 5마리 동물에 관한 6개의 독립적인 실험으로부터 평균화된 등쪽 해마 CA1에서의 40Hz 자극에 대한 BOLD 반응이 도 6b에 나타나 있다. 좀 더 광대한 활성화가 6Hz 자극과 비교되게 관측되며(도 5f), 외측 등쪽 해마 형성체, 외측 시상, 동측성 팽대후부 피질 및 격막을 포함한다. 색 부호화는 붉은 마크로 나타나 있는 좀 더 이른 피크 반응과 노란 또는 녹색의 후 반응과 함께 반응의 위상(타이밍)을 반영한다. 40Hz(도 6c)에 관한 ofMRI-HRF는 동일한 위치에서의 6Hz 자극과 비교되는 중대하게 연장된 BOLD 신호를 나타낸다. 이것은 40Hz 자극을 위한 빛 자극을 좀 더 지속시키는 발잘성 활성을 보여주는 EEG 활성과 잘 상응한다. 이것은 ofMRI-HRF 형태와 근본적인 뉴런 활성간의 상관 관계를 입증한다.
다음 연구에서, 어른 쥐가 복부 해마 CA1 영역에서 투입되었고 캐뉼러 삽입되었다(도 7a). 형광(도 7b, 좌측) 및 공초점(도 7, 우측) 이미지가 ChR2-EYFP의 발현을 입증하기위해 제공된다. 6Hz에서의 청색 레이저 펄스에 의한 자극은 초당 6에서 EEG 스파이크 파를 일으키고, 대부분의 실험에 관한 비디오 기록에 대한 뚜렷한 행동 변화 없이 20초 동안 자극(도 7c)을 지속 시킨다. 복측 해마에서 6Hz 자극을 갖는 4개의 실험에서, EEG가 3개의 실험에서 스파이크 파를 나타내고 있으며, 진화하는 발작은 하나의 실험에서 나타나고 있다. 해당 행동은 하나의 실험에서 정상적이며, 머리 흔들기는 두 개의 실험에서 간헐적 경련성 앞다리와 머리 젖히기는 하나의 실험에서 정상적이다(보충적인 도 7b). 6Hz로 복부해마에서 자극을 받은 4마리 동물에 대한 6일 평균화된 실험으로부터 획득 된 ofMRI는 대측성 해마 형성체보다 더 외측, 대측성 시상보다 더 외측, 양쪽 중격핵과 동측성 팽대후부 피질에서 BOLD 활성화를 나타내고 있다(도 7d).
40Hz에서의 복부 해마 자극은 빛 자극 중 및 이후 진화하는 EEG 발작 패턴(도 8a)를 생성한다. 해당 행동은 얼굴 찡그림, 간헐적 경련성 발작 또는 달리기-점프 발작을 포함한다(보충적인 도 7b). EEG 판독과 일치하는, 4마리 동물에 관한 6개의 평균화된 실험으로부터 획득된 40Hz 복부 해마 자극 BOLD 신호도 광범위하다(도 8b). 외측 활성화가 복측 및 등쪽 해마, 격벽핵, 복측 선조체 및 브로카의 수평 밴드에서 관측된다. 외측 활성화는 전장, 전방 대상 피질, 연전방 영역, 복측 및 회측 궤도 피질, 전방 인슐러 영역 및 편도체 영역을 포함한 입쪽 영역에서 나타난다. 덜 중요하거나 지연된 활성화는 팽대 피질과 체감각 영역에서 발생된다.
본원 발명의 다양한 측면은 광 유전적으로 발생되는 발작의 알려진 기원과 개시 시간에 의해 전체 뇌에 걸친 뇌 네트워크 활성화를 추적하기 위한 가능성을 입증하다. ＂하이퍼­특정＂ 기원을 갖는, 제시된 발작 전개 행동 증상은 세포 형 기원과 자극 파라미터에 의존성을 가지면서 다른 동물 모델과 인간 뇌파계 발작 뇌파에서 나타난 것들과 비교할 만한다. 본 발명에 따라서, 네트 워크 점증의 4개의 뚜렷한 패턴이 세타 및 감마 주파수에서 등쪽 또는 복부 해마 자극으로 나타난다. 등쪽 해마 자극을 갖는 감마 주파수 자극은 세타 주파수 자극과 비교되는 RF 및 BEG-감지 전위 기록적 발작을 일으킨다. 그러나, 등쪽 해마 자극은 뇌의 전방 영역 또는 관리 및 운동 기능에 포함되는 피질성 영역을 활성화 시키지 못한다. ofMRI로 관찰되는 제한된 네트워크 개입은 이러한 동물에서 발작성 행동의 부족과 잘 일치한다. 특히 40Hz에서의 복부 해마 자극은 전방 피질 및 하부 피질 영역을 포괄하는 광범위한 일련의 구조를 회복시킨다. 광범위한 활성화는 완전히 발현된 간헐적 경련성 발작과 일치한다. 복부 해마로부터 유발된 전위 기록적 발작은 행동적으로 조용한 등쪽 해마의 발작과는 대조적으로 항상 운동 발작 행동에서 나타난다. 등쪽 또는 복부 해마 자극과 ofMRI 활성화 패턴도 해마의 이러한 두 지역의 해부학적 연결성에 해당한다. 그러므로, ofMRI에 의한 발작의 네트워크 매핑은 네트워크 구성 요소 및 특이 세포 집단에서 발생하는 발작의 전기 임상 증상의 분석을 가능하게 한다.
ofMRI-시각화된 네트워크는 시각화를 위해 필요한 최소한의 신진 대사 활성화에 대한 신경 혈관 커플링과 불확실성의 불완전한 이해 때문인 발작에 관련된 모든 요소를 나타내는 것으로 간주되어서는 안된다. 그럼에도 불구하고, ofMRI지도와 BEG/행동 기록 사이의 강한 상관 관계는 ofMRI을 이용하여 신경학적 질병 네트워크의 연구에 대한 가장 높은 정의 및 충실도를 나타낸다. 본원 발명에 따라서, EEG 기록은 발작 활성의 간단한 검증을 위한 자극 부위 근처의 단일 채널로 제조되었다. 그렇지만, 다채널 EEG와 결합한 추가 조사는 ofMRI 신호와 EEG 기록을 공간적으로 관련시키는 데 도움이 될 것이다.
정밀하게 전달된 광 유전적 자극과 이후 타임락된 고해상 fMRI fMRI 경로 이미지가 아주 예민한 초점 신경 집단에서 시작하는 발작과 관련된 다른 네트워크 활성화를 드러내고 있다. 발작 중에 활성화되는 네트워크는 매우 재현성이 있으며 EEG 및 행동 관찰과 관련이 있다. 혈류 역학적 반응 함수의 지속기간은 공간 정보를 정확하게 제공할 뿐만 아니라 시간적 신경 활성 패턴을 조사하기 위한 ofMRI 기술 능력을 나타내는 네트워크의 활성화의 시간 지속 기간을 반영한다. 복부 해마와 폴리 시냅시스로 연결되어 있는 것으로 알려진 영역의 점증은 또한 복합 연접주에 걸쳐서 동적 네트워크 활성을 드러내는 ofMRI의 역량을 입증한다. 임상 발작은 혼합된 복합 세포 집단에서 발생하고, 본원 발명에 따른 접근법은 체계적인 분석 및 복합 발작의 성분 분석을 용이하게한다. 수술 병변, 국소 신경 자극 또는 초점 약물 응용과 같은 정확한 해부학적 지식에 의존하는 치료법은 다양한 전기 임상 패턴에 관여하는 특정 뇌 네트워크의 더 명확한 이해로 도움이된다.
방법 요약
광 유전적 fMRI 데이터 수집 및 분석
마취된(-1.0-1.5 %의 이소플루레인) 동물이 473nm의 레이저에 연결되어 자극되었으며, 7T 작은 동물 전용 MRI 스캐너를 사용하여 경사 리콜된 에코 (GRE) BOLD 이미징 시퀀스로 스캔되었다. 수집된 데이터는 각 750ms 마다 재구성되었고, 움직임 보정되었으며, 평균화를 위한 공통된 선택 이미지로 정렬되었다. 평균 데이터 세트는 자극에 대해 동시 발생하는 주파수 성분의 중요도를 계산하는 주파수 도메인 분석에 의해 분석되었다.
EEG 및 행동 연구
ofMRI 연구 후, 각각의 설치류 대상은 두개골 EEG전극을 이식했다. 그런 다음, 동물은 행동을 기록하기 위해 세 개의 카메라를 구비한 다이아몬드 모양의 상자에서 테스트되었다. 모든 실험에서, 피시험자는 데이터 수집을 개시 한 후 5, 10, 15 분에서 20 또는 40 초 동안 베이스 라인 수집으로부터 5 분 후에 자극되었다. EEG 신호가 1kHz의 샘플링 속도로 기록되었다. 6, 10, 20, 40Hz 자극과 함께 다섯 가지 유형의 시험이 수행되었다.
옵신 발현 검증 및 면역 조직 화학
뇌 슬라이스가 특이도, 민감도와 옵신 발현의 공간적 분포를 확인하기 위해 광학 현미경과 면역 조직 화학을 위해 준비되었다. 피시험자의 두뇌 먼저 추출되었으며 하룻밤 4% PFA로 고정되었고 4 ℃의 PBS에서 10 %, 20 %, 30 % 자당에서 균형을 유지시켰다. 관상부(50 ㎛)가 동결 마이크로톰에서 준비되었고, 연속 부분(50 ㎛ 떨어진)은 옵신 발현을 위해 조사되었다. 공초점 형광 이미지는 오일 침지 목표를 이용한 레이저 공초점 현미경에 취득되었다.
실시예 B
다음의 실시예는 도 9 내지 도 12를 참조하여 설명된다.
아데노 관련된 바이러스 생산 및 전달.
pAAV-CaMKIIα­ChR2(H134R)-EYFP 플라스미드는 Mlul 및EcoRI 제한 부위를 사용하여 AAV 백본에 pAAV-CaMKIIa-ChR2(H134R)-EYFP를 복제하여 구성되었다. 지도는 www.optogenetics.org에서 온라인으로 사용할 수 있다. 재조합 AAV 벡터는 AAV5 코트 단백질과 혈청형이 결정되었으며 노스 캐롤라이나 대학의 바이러스 벡터 코어로 포장되었다; 타이터는 2 × 10 입자/mL이었다.
바이러스 및 캐뉼러 배치의 뇌정위적 주입
AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 바이러스 벡터는 Deisseroth 실험실에서 입수되었고, 노스 캐롤라이나 대학의 벡터 코어에서 포장되고 -80 ℃에서 보관되었다. AAV5가 선택되었으며, 그 이유는 그것이 선행성 라벨을 생성하고, 주사 부위에서 세포체와 뉴런을 선택적으로 겨냥하기 때문이다. CamKIIα촉진제는 CamKIIα발현 흥분성 뉴런에서만 ChR2를 생성하기 위해서 사용되었으며, EYFP는 검증을 위해 ChR2 발현을 공동 국소화시키기 위해 사용되었다. 스프래그-다우리 쥐들(11 주 이전, 250-350g)이 피시험자로서 사용되었다; 동물 사육 및 실험 조작은 건강의 국립보건원과 UCLA 기관 동물 관리 및 사용위원회(IACUC)의 지침에 엄격하게 일치되었다. 쥐들은 유도 챔버에서 5 % 이소플레인으로 마취되었고 수술 중 노즈콘으로 2-3%로 유지되었다. 동물을 정위 프레임 및 가열 패드 위에 확보 한 후, 인공 누액이 수술 중 탈수를 방지하기 위해 눈에 도포되었다. 부프레노르핀(0.05㎎/㎏) 이 통증 완화를 위해 피하 주사되었다. 머리는 감염의 가능성을 최소화하기 위해 70 % 에탄올과 베타다인으로 면도 및 세정되었다. 중간 선 절개 후, 작은 뇌절제술이 정위 프레임에 장착된 치과 드릴을 사용하여 수행되었다. 두 가지 유형의 수술이 수행되었다: I) 등쪽CA1(+1.2mm ML 오른쪽 반구, -4.3mm AP, -3.6mm DV에서 주입)에서 바이러스 주사(쥐 당 한 대의 주사, 2 ㎕/부위)과 캐뉼라(3.4mm 돌기) 이식; II) 복부 CA1(+5.2mm ML 오른쪽 반구, -5.8mm AP, -4.6mm DV에서 주사)에서 바이러스 주사(쥐 당 한 대의 주사, 2 ㎕/부위)과 캐뉼라(4.4 mm의 돌기) 이식. MRI 및 면역조직화학은 바이러스 발현과 자극 위치의 정밀도를 검증하였다. 잘못된 프로브 위치를 갖는 동물들은 제거되었다. 농축된 바이러스는 10 ㎕ 주사기 및 마이크로 시린지 펌프 제어기에 의해 구동되는 150nl/분의 유속으로 34 게이지 금속 바늘(세계 정밀 기기 주식회사)을 이용하여 전달되었다. 주사기 바늘은 서서히 배출되기 전에 십분 동안 장소에 방치되었다. 베이스로부터 원하는 DV좌표로 연장되는 광섬유를 갖는 맞춤형 섬유-광 캐뉼러가 두개골에 장착되었으며, 응고(10분) 때까지 메타 본드(Parkell 사)의 한 개의 층을 사용하여 확보되었다. 절개부는 5-0 나일론 피부 봉합을 실행하여 봉합되었으며, 동물들은 마취(일반적으로 약 15 분)에서 회복 될 때까지 가열 패드에 보관되었다. 부프레노르핀이 수술 후 통증을 최소화하기 위해 수술 후 48 시간 동안 하루 2회 피하 주입되었다.
ofMRI 실험
fMRI 스캐닝이 UCLA의 아맨슨-러브레이스 뇌 맵핑 센터의 7T 브로커 바이오스펙 작은 동물 전용 MRI시스템에서 수행되었다. 동물은 처음에 5%의 이소플루레인으로 유도 챔버에서 마취되었고 확보된 귀 및 치아와 함께 맞춤형MRI 호환 크래들에 배치하기 전에 관이 삽입되었다. 39mm 외경과 25mm 내경의 맞춤 설계된 송신/수신 단일 루프 면 코일이 신호 대 잡음비를 최대화하도록 두개골의 관심 영역에 중심으로 배치되었다. 62.5 ㎛ 코어 직경의 광섬유는 청색 레이저 광원(473㎚)에 연결되었고 광섬유 캐뉼러와 결합되었다. fMRI 스캐닝 중에, 동물들은 O2(35%), N2O(63.5 %>) 및 이소플루레인(1.5 %)의 혼합물과 함께 보정된 증발기와 빛 마취하에 호흡기를 사용하여 인위적으로 호흡(하버드 장치 모델 683 작은 동물 인공 호흡기)되면서 자석의 이소 중심에 배치되었다. 호기 CO2가 3-4%로 유지되었고, 체온은 가열된 공기흐름을 이용하여 36 ~ 38 ℃로 유지되었다. T2 강조 고해상도 해부학적 영상은 뇌 손상 및 프로브 위치를 확인하기 위해 fMRI 스캔 이전에 획득되었다. 경사 리콜된 에코(GRE) BOLD 방법이 다른 광 자극 파라미터를 동반하는 fMRI 영상을 획득하는 데 사용되었다. 하나의 60초 사이클의 자극은 광 자극 업이 30% 듀티 사이클과 40초로 원하는 주파숭서 20초 광 자극을 포함하였으며, 실험 당 6개의 사이클을 허용하였다. 자극은 6, 10, 20, 40 및 60Hz의 주파수에서 수행되었다. 광섬유 출력 전력은 대략 2.5 mW으로 설정되었으며, 그것은 제어 실험에서 임의의 가열 관련된 인공물을 유도하지 않았다.
이미지 수집 및 재건.
경사 에코(GRE) BOLD 시퀀스가 수집을 위해 사용되었다. 펄스 시퀀스는 35x35mm2 화각(FOV), 0.5x0.5x0.5mm3공간해상도와 매반복시간 (750ms) 마다 이미지를 업데이트 할 수 있는 슬라이딩 윈도우 재건을 갖도록 설계되었다. 경사에코 BOLD fMRI는 네 개의 인터리브 나선형 판독과 2 차원 다중 슬라이스 경사 에코 시퀀스로 설계되었으며; 750ms 반복 시간(TR)과 12ms 에코 시간(TE)은 11.5mm의 슬라이스 방향 볼륨을 커버하는 23개의 슬라이스를 초래한다. 이러한 특이 디자인은 광 유전적 제어 중에 뇌의 대용량 매핑을 허용하였다. 맞춤형 GPU 기반 병렬 재건 및 모션 보정이 완료된 때에, 주파수 영역 분석이 수행되었고, 코히어런스 값이 계산되었다. 활성화 맵은 사용자 정의 기입 알고리즘 및 소프트웨어(MRVista)를 사용하여 0.35 간섭 임계 값에 이어 획득되었다. 디지털 표준 쥐의 뇌 아틀라스가 이식된 캐뉼러의 위치를 확인하고 특정 뇌 영역으로 활성화 복셀을 지역화하는 데에 사용되었다.
ofMRI 데이터 분석.
ofMRI GRE BOLD 나선형 kspace 샘플이 우선 2 차원(2D) 그리딩 재건 방법을 통하여 재구성되었다. 등쪽 및 복부 CA1 실험 모두에 대하여, 최종 fMRI 이미지가 여섯 동물에 대한 여덟개의 독립적인 실험(각각 여섯개의 스캔을 포함)에서 평균화되었다. 정확한 평균화를 위해, 모든 이미지들은 오정렬이 없도록 등록되었다. 첫 단계로, 기타 이미지들을 등록하기 위해 필요한 전환 및 회전이 최소로 유지되도록 중간 위치를 갖는 이미지가 선택되었다. 선택된 실험 데이터의 하나의 3D 타임 프레임이 등록을 위한 중간 실험 이미지 변환 매트릭스 계산을 위한 탬플릿으로서 추출 및 사용되었다. 맞춤 개발된 매트랩 툴이 우선 선택된 탬플릿 이미지로 등록될 각 실험의 선택된 3D 이미지들을 변환할 수 있는 6자유도의 매트릭스를 결정하는 데에 사용되었다. 또 다른 사용자 기록 GPU 기반 병렬 모션 보정 툴은 중간 실험 등록을 위한 실제 변환을 수행하는 데 사용된 후, 각 실험의 시계열과 여섯 반복 스캔 내의 움직임을 보정하기 위해 사용되었다. 모든 이미지들이 정렬 된 후에, 이미지들은 최종의 fMRI 4D 이미지를 생성하기위해 평균화되었다. 이후 데이터 세트가 주파수 도메인 분석에 의해 분석되었다.
EEG 전극 이식
ofMRI 연구 완료 후, 동물들은 EEG 전극 이식을 위한 추가 수술을 받았다. 동물들은 유도 챔버에서 5 % 이소플루레인으로 마취되었고 수술하는 동안 노즈콘으로 2-3%로 유지되었다. 동물들이 정위 프레임 및 가열 패드 상에 고정되었고, 인공 눈물이 수술 중 탈수를 방지하기 위해 적용되었으며, 부프레노르핀(0.05㎎ / ㎏)이 피하 주사되었다. 쥐의 머리가 면도되었다. 에탄올 70 %와 베타딘이 방부제로서 노출된 두피에 적용되었다. 중간 선 절개는 멸균 메스로 수행되었고, 두개골의 재성장 막은 멸균 면 어플리케이터로 제거되었다. 두 개의 스테인레스 스틸 나사(0-80, 1.5mm 직경, 플라스틱 원 인코레이티드사)가 -2.0 cm의 절연 전선(30 게이지, R30Y0100, 와이어 포장 와이어, O.K. 인더스트리사)에 부착되었으며, 전두엽 대뇌 피질을 통해 두개골에 부착되었다. 하나의 전극이 참고로 브레그마의 오른쪽으로 약 3.0mm 전방과 2.0mm에 배치되고, 해마 EEG 기록을 위한 다른 전극은 I) 등쪽 CA1 또는 II) 복부 CA1 상부의 대뇌피질의 가장자리에서 각각의 동물의 광 섬유 이식 위치로 대략 1.5mm 꼬리에 배치되었다. 전극이 두개골에 부착된 이 후에, 이들은 약 10 분을 요구하는 응고 때까지 메타밴드(Parkell 사)의 하나의 층을 사용하여 고정되었다. 절개는 5-0 나일론 피부 봉합을 실행하여 차단되었다. 동물들은 약 15 분에서 마취에서 회복될 때까지 가열 패드에 보관되었다. 부프레노르핀은 수술 후 48 시간 통증을 최소화하기 위해 피하에 12 시간마다 투여되었다. 동물들은 밀접 일주일 동안 불편함이나 감염에 대하여 관찰되었으며 물에 트리메소프림-설파 항생제(48 밀리그램 / 100 ml)가 제공되었다.
비디오- EEG 기록
쥐들은 각각의 말단과 상단에 장착된 카메라를 구비한 다이아몬드 모양의 상자에 적응되었다. 이러한 모양은 상자의 코너에 더 둔하게 만들고, 동물 머리를 시각화하는 데 도움이 된다. 전환자들이 케이지에 배치되지 않았다. 동물들은 실험 사이에 음식과 물을 받았다. EEG 기록은 각 시험이 20 분 동안 지속되도록, 5, 10, 15 분(4:20의 중간에 비자극)에 광 유전적 빛 자극의 20 또는 40 초 후, 초기 5 분 동안 수행되었다. 채널당 초당 1,000 포인트에서 샘플링하는 상업적 디지털 EEG 시스템이 EEG를 기록하는데 사용되었다. 자극 주파수의 다른 파라미터가 무작위 시험의 순서로 테스트되었다. 다섯개의 시험 (6, 10, 20, 40 및 가짜)을 포함하는 테스트들은 각 동물에 대해 3 회 반복되었다. 모의 실험은 뇌에서 두 개 순서의 크기에 의해 광을 감쇠할 수준으로 레이저의 파워를 낮췄으며, 이리하여 영향을 무시할 수 있지만 여전히 동물 및 연구자들에게 보이는 밝은 청색 플래시를 생산할 수 있다. EEG 기록 중에, 모든 3 개의 비디오 카메라는 동물의 행동을 기록했다. ofMRI가 O2(~35%), N2O (~63.5%) 및 이소플루레인(1.5%)의 흡입으로 마취된 취들에서 기록되었기 때문에, 비디어 EEG는 이러한 혼합물을 흡입한 세마리 동물에 대한 실험에서 분석되었다.
각 비디오 뇌파 클립이 치료를 깨닫지 못하는 관찰자에 의해 다음과 같은 하나의 최고 카테고리로 분류되었다: 정상, 스파이크, 스파이크 파 또는 진화하는 전자 기록적 발작. 각각의 EEG와 쌍을 이루는 비디오 클립핑은 다음과 같은 발작에 관한 수정 라신 스케일에 따라서 분류되었다: 1 = 입과 얼굴의 움직임, 2 = 머리를 끄덕임, 3 = 앞다리의 간헐성 경련, 4 = 양육, 5 = 양육 및 하강(자세 제어의 손상을 갖는 전체 간헐적 경련성 운동 발작), 및 여분의 카테고리로 WDS의 머리털리 및 R의 달리기-점프 발작. 카테고리 3, 4 및 5는 때때로 ＂간헐적 경련성 발작＂의 수퍼 카테고리로 통합되었다. 각 세션에서 생성된 가장 전기 기록적으로 지속되는 세 가지 발작이 스코링을 위해 항상 사용되었다.
옵신 발현 검증
비디오 EEG 기록이 완료되면, 쥐들은 녹다운 박스에서 이소플루레인(시그마)로 깊게 마취되었고, PBS에서 0.1M PBS와 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)로 관류시켰다. 뇌가 4 ℃에서 하룻밤 4 % PFA에서 추출 및 고정되었다. 뇌는 4 ℃의 PBS에서 10%, 20% 및 30% 자당에서 균형이 유지되었다. 관상 섹션(50 ㎛)이 냉동 마이크로톰(HM 430 슬라이딩 마이크로톰, 서모 사이언티픽 인코포레이티드 사)에서 제조되었다. 연속 섹션(500 ㎛ 떨어진)이 현미경 슬라이드 상에 장착되었고, 옵신 발현이 라이카 형광 현미경 (라이카 EL6000)으로 관찰되었다.
면역조직화학을 위해, 자유 부동성 섹션이 2% 정상 당나귀 혈청, 1 % 소 혈청 알부민 및 0.2 % 트리톤 X-100으로 30분 동안 처리되었으며, 다음과 같은 것에 대항하는 일차 항체로 4 ℃에서 48 시간 노출되었다: 마우스 단일 클론 CaM-키나아제 Ⅱα(CaMKIIa, 1:400, Abcam, 캠브리지, MA); 마우스 단일 클론 팬 신경 마커 NeuN(1 : 200, EMD 밀리 포어, 테메큘라, 캘리포니아); 토끼 폴리 클론 파브알브민(1:1000, 밀리 포어, 빌레리카, MA); 토끼 폴리 클론 감마 아미노 부티르산(GAB, 1:10,000, 칼바이오켐, 샌디에고, CA); 및 토끼 폴리 클론 섬유성 신경 교세포 산성 단백질(GFAP, 1 : 400, 밀리 포어, 빌레 리카, MA). 섹션이 PBS로 세척되었고, 이차 항체와 함께 실온에서 2 시간 동안 다음과 같이 배양되었다: 알렉사 Fluor®594 공역 AffiniPure 당나귀 항 - 마우스 IgG 및 알렉사 Fluor®647 공역 AffmiPure 당나귀 항-토끼 IgG(모두 1:1000, 잭슨 연구소, 웨스트 그로브, PA). 이중 또는 삼중 면역 형광성이 레이저 공초점 현미경(라이카 CTR 6500)으로 평가되었다.
실시예 C
간질병을 위한 신경자극 변형
도전, 혁신, 영향력 설명:
깊은 뇌 자극(DBS)은 파킨슨 병, 진전, 우울증, 통증, 간질 및 많은 기타의 것들을 포함하여 뇌 질환에 대한 잠재적 가치가 있는 새로운 치료법이다. 그러나, DBS 메커니즘의 기본적인 이해가 효율성을 제한한다. DBS는 국소 조직을 억제 또는 자극할 수 있으며, 네트워크 동시성을 방해할 수 있고, 섬유 경로를 활성화 시킬수 있으며, 불확실한 원격 작업을 생성할 수 있다. 가장 좋은 대상이 반드시 알려져 있지 않더라도, 사용 대상들은 자극에 대한 반응에 있어서 이종이다. 임상 시험에서 자극 파라미터는 대부분이 추측된다. 새로운 기술인 광 유전적 기능적 자기 공명 영상(ofMRI)은 이러한 한계를 극복할 수 있는 위치에 있다. ofMRI는 신경 조건에 관련된 특정 뇌 네트워크를 표시할 수 있으며, 뇌의 전체 3 차원 공간에서의 뉴런 활성을 시각화할 수 있다. 광 유전학은 빛의 제어 및 반복 펄스 통하여 특정 뉴런 집단을 선택적으로 자극 또는 제어할 수 있다. ofMRI는 전기 뇌 자극에 대한 합리적인 접근법을 설계하기 위한 통찰력을 이용하여 뇌 자극 메커니즘을 절개하는데 사용될 수있다. 예를 들어 간질을 사용하여, 발작의 제어 모델이 해마로부터 전파 개발될 수 있으며, 전파 네트워크를 통하여 이러한 발작을 추적 및 억제할 수 있고, 광 유전적 매핑에 의해 발견되는 하위 영역 및 파마미터로 전기 자극을 조정할 수 있다.
근거:
간질병에 대한 DBS는 치료적 DBS의 약속과 한계를 예시로서 간주될 수 있다. 약물에 내성을 갖는 간질병(현재 출원인에 의해 안내되고 있는 것)을 위한 뇌 자극에 대한 두 개의 최근 다기관 무작위, 대조 시험은 통계학적으로 유의한 효과를 보였지만, 발작의 약 40 % 평균 감소(도 13)를 갖는 것으로 나타났다. 시상의 전방 핵(ANT)이, 대분분의 발작이 발생하는 정면 및 중앙 측두부에 영향을 줄 수 있는 그 역량 때문에, 실험 중 하나에서 자극의 대상으로 사용되었다. 이득의 정도는 자극의 파라미터에 매우 의존한다. 한 명의 환자는, 예를 들면, 5V 자극이 6분 주기로 활성화될 때마다 발생되는 발작을 갖지만, 이어서 4 V자극으로 발작의 실질적인 감소가 있었다. 자극의 가장 좋은 파라미터가 알려진다면 많은 이점이 실현될 수 있을 것이다. 최고 전압(또는 전류), 자극 주파수, 펄스 폭, 양극성 대 기준 자극, 연속적, 간헐적 또는 응답 자극은 무엇인가? 가장 중요한건, 가장 좋은 대상이 무엇인가? 이다. 목표는 통로의 섬유의 활성화를 가지고 또는 활성화 없이, 전극을 배치하기 위한 일반 영역뿐만 아니라 특이 세포 집단을 자극하기 위한 노력을 포함하고 있다. 예를 들면, 시상 하부 핵의 자극이 피질성 시상하부 섬유의 역방향성 활성화에 의한 발작을 억제하는 것으로 알려져 있다. ANTS의 전기 자극은 국소 뉴런뿐만 아니라 유두 시상 다발, 경로의 세로토닌성, 콜린성 및 글루타메이트 섬유를 활성화 시킨다. 광유전학은 전기 자극을 줄 수 있는 훨씬 큰 특이성을 갖는 뇌 회로를 조절할 수 신규한 기술이다. 특정 세포 집단은 경로의 인접 섬유에 대한 무시할 효과를 가지면서 선택적으로 자극 또는 억제될 수 있다. ofMRI는 fMRI 판독과 광 유전적컨트롤을 결합하여, 특정 세포 집단의 광 유전적 자극에 의해 활성화 되는 하류 구조를 강조할 수 있습니다. 이러한 정도의 특이성은 향후 임상 시험의 설계에 대단히 도움이 될 것이다. 예를 들어, 보충적인 운동 영역 발작 초점 대 중앙 또는 외측 측두 발작 초점에 영향을 미칠 수 있는 전기 자극이 어디서 발생되어야만 하는 가? 간질병과 관련된 회로를 억제하기위해 수백 헤르츠(Hz)에서 매우 높은 주파수 자극을 수행하는 것이 낮은 주파수 자극을 수행하는 것 보다 좋은 가? 자극의 해로운 이상성 여기-억제 효과가 최조화 될 수 있는가? ofMRI 매핑의 특이성이 이러한 어려운 질문을 명확히하기 위한 이전에 사용될 수 없었던 기회를 제공한다. 미래 몇 년 간질을 치료하는 실제 광 유전 기술이 이용될 수 있을 것이다. 탐색 도구로서 유전학적 정밀도와 효율은 전기 자극이 적용되는 방법을 변환할 수 있다.
접근법:
본원 발명의 다양한 양태가 다음과 같이 요약될 수 있다.
광유전적 발작 모델 개발: 광 유전적 자극에 의해 생성되는 해마 발작의 모델을 개발하고 검증하며, 이것은 정확한 해부학적 출발점와, 세포 유형의 기원, 및 발작 발병 시간과 함께 모델을 제공할 것이다. 이는 간질병에 때한 체계적인 연구와 신경 자극 치료의 최적화를 촉진 할 것이다.
셀 타입의 특정 신경 자극으로 발작 금지: 특정 세포 유형의 제어를 가능하게 하는 광 유전적 자극은 발작을 최적으로 억제(금지, 단축 또는 행동의 강도를 개선하는 것) 할 수 있는 가장 최적의 자극 대상 및 파라미터를 식별하는 데 사용된다. 우리의 검색은 아래의 배경 기술 부분에서 논의된 바와 같이, 해마 발작 전파 경로를 조사하는 것으로 시작될 것이다. 광 유전적 억제 및 번거로운 자극 기술이 발작을 억제할 수 있는 이러한 경로를 따라 핵심 구조를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
전기 자극에 대한 번역: 본 섹션에서, 처음 두 가지 목적에서 배운 교훈은 전기 자극 치료의 최적화를 촉진하는 데 사용될 것이다. 쥐 ANT의 다른 전기적 자극에 의해 생성된 매개 대사 해부학은 현재 임상적 변화의 더 나은 이해를 얻기 위해 조사될 수있다. 전기 자극의 파라미터는 뇌 활성화 패턴을 생성하기 위해 설정될 수 있으며, 하나는 목표 2에서 확인된 성공적인 광 유전적 자극에 의해 생성된다. 이것은 광 유전적 및 GABA 길항제, 펜틸렌테르라졸(PTZ)에 의해 제조된 종래 일반화 된 발작 모델을 억제하는 자극의 능력에 의해 평가될 것이다. 목표 1의 정확한 시간적 해마 광 유전적 발작 모델은 ANT에 대한 전기 자극 이후에 얼마나 오래 항 경련 효과가 견디는 지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실험을 간질병을 위한 DBS 임상 역할을 변환하기 위한 통로를 마련할 수 있다.
배경
광유전학은 단일 성분 미생물의 빛 활성화된 막횡단 도전 조정기가 밀리초 규모의 목표로 하는 체내 활동 조절을 가능하게 하기 위해서 세포 유형 특정 프로모터를 이용하여 특정하게 목표로 한 세포 유형과 회로 요소로 도입되는 획기적인 신경 조절 기술이다. Channelrhodopsin (ChR2)는 세포에 Na+ 이온이 들어가게 하고 이어서 470nm의 청색 빛에의 노출하는 1가 양이온 채널인 반면: halorhopdopsin (NpHR)는 580nm 황색 광으로의 조명시 활성화되는 클로라이드 펌프이다. 이들 두 프로테인의 최적의 활성화 파장은 100nm이상 떨어져 있기 때문에, 이들은 활동 전위 점화를 시작하거나 온전한 조직의 신경 활동을 억제하기 위해 독립적으로 조절되고, 함께 뉴런의 동기성을 조정한다. 두 프로테인은 밀리초의 크기인 빠른 시간적 운동성을 가져서, ChR2를 이용하여 체내 고주파수 동작 전위의 신뢰 가능한 트레인을 구동하고 NpHR를 이용하여 고 주파수 스파이크 트레인 내에서 단일의 동작 전위를 억제하는 것을 가능하게 한다. 유전학은 목표로 하는 회로 요소의 체내 조절을 가능하게 하여 각 회로 소자의 계통적 기여의 연구를 허용한다.
ofMRI 기술(도 14 내지 도 16)은 광유전적 조절을 고 자기 fMRI와 결합하여, 뇌 회로 요소의 정밀한 조절과 뇌에 미치는 결과된 원인적 영향의 가시화를 허용한다. ofMRI를 이용한 우리의 초기 연구에서, 뇌 회로 요소는 이들의 유전적 정체성, 세포체 위치, 및 축색 돌기 목표에 기초하여 성공적으로 조절 및 모니터된다. 쥐의 M1 피질에서의 세포체를 갖는 흥분성 뉴런의 선택적 여기는 국부 피질(도 14), 선조체를 포함하는 말단 영역 및 시상에서의 양호한 활동 측정이 결과된다. 신경 활동은 종래의 GRE-BOLD fMRI 기술(도 15)와 비교하여 통과대역 bSSFP fMRI 기술(다음 단락에서 설명)을 이용하여 선조체와 시상의 뇌 전체에 더욱 정확하게 매핑되는 것이 증명된다. fMRI의 시간적 역학은 높은 시간적 해상도로 전기 생리학적 측정으로 강한 상관 관계를 갖는 것으로 나타나, fMRI 혈류 역학적 응답이 시간적 신경 활동 패턴을 정확하게 반영하는 것을 나타낸다. 전방 및 후방 시상의 목표로 하는 흥분성 뉴런은 또한 각 부위의 네트워크 연결성에 관한 기존의 주제와 일치하는 양호한 국부적 광범위한 활동을 증명해준다. 게다가, M1 피질로부터 돌기한 축색 돌기 섬유의 선택적 여기는 유전적 정체성에 부가하여 배선 패턴이 뇌를 선택적으로 목표로 하고 모니터하는 데에 사용되는 것을 나타낸다(도 16). 이들 연구 결과는 ofMRI가 기능 회로 분석에 적합한 도구뿐만 아니라 기능장애 회로의 광범위한 표현형을 정의하는 것을 입증한다.
통과대역 b-SSFP fMRI는 각 여기 반복 간격 (TR) 동안 완전히 균형잡힌 그래디언트 펄스와 결합된 신속한 무선주파수 여기 펄스를 이용하는 새로운 fMRI 방이다. 그 단축된 판독 시간과 TR로 인해 b-SSFP는 전 뇌에 적합한 왜곡없는 3D 영상, 즉 고 해상도의 기능적 영상을 제공한다(도 16). 종래의 fMRI가 뇌심부 구조를 포함하여 전 뇌를 연구하기 위해 비외과적인 수단을 제공하는 매우 성공적인 기술인 반면, 이것은 현재의 형태로 신경 기능의 정확한 평가를 위해서는 상당한 제한을 갖는다. 큰 공간적 왜곡으로 인해, 뇌의 대부분은 영상화될 수 없다. 공간 해상도는 또한 현재의 예술 신경 과학에 필요한 정보를 제공하기 위해서는 상당한 개선을 필요로 한다. 통과대역 b-SSFP fMRI는 왜곡 없는 3D 등방성 해상도의 영상을 얻기 위한 방법을 제공하여, 특정한 문제에 대해 fMRI의 결과물을 크게 개선할 수 있다.
발작의 징후가 중간 측두부로부터 퍼진다: 아래 목표 1에서, 내측 및 외측 해마에서 정밀하게 발생된 발작으로 활성된 뇌 부위가 가시화될 수 있다. 소위 파페츠 회로가 활성화된다. 도 17은 중간 측두부에서 시작한 발작에 대해 파페츠의 회로를 통하는 주요전파 경로를 도시한다. 중간 측두부로부터 시작한 복합된 부분 및 이차적으로 발생된 발작은 간질병을 갖는 성인 사이에서 가장 일반적인 난치성 발작을 포함한다. 부분 CA1로부터의 해마 유출은 해마술과 뇌궁에 모인다(도 17에서 #3). 뇌궁은 시상 하부의 내측(#5)과 외측(#6) 부위에의 입력을 제공한다. 외측 유두의 핵은 ANT의 두 등쪽 부분으로 외측으로 돌기하는 반면; 내측 유두의 핵은 복측 및 내측 부분으로 외측으로만 돌기한다. 유두시상다발(MTT)를 절단하는 것은 PTZ 유도 발작의 임계치를 증가시킬 수 있다. 반대로, 쥐와 환자의 유두체를 전기적으로 자극하는 것은 발작을 억제한다. 부가하여, 외궁은 시상의 전방 핵에 직접 반맞교차 분기를 보낸다 (ANT, #8).
ANT의 내측 또는 등쪽 핵을 특히 언급하지 않는 한, ANT의 복측 소집단은 이 핵 집단에서 주요한 핵이고 동물 문학은 대개 용어 복측 (AV) 시상을 선택하지 않는다. ANT는 간질병에 대한 전기 자극의 목표로서 조절된 임상 치료에 효과적이라고 증명된 특정 뇌 부위로서 특별한 중요성을 갖는다. 해마 유출은 또한 MTT(#7)를 통하여 ANT로 흐른다. AV로의 다른 중요한 입력은 망상 시상으로부터 나와, 소형 내지 중형 크기의 시냅스, 대상 피질 및 뇌간에서 끝난다.
ANT 출력은 주로 대상회(#9)의 일부인 팽대 후부 피질로 가고, 브로드만의 영역 26, 29 및 30을 나타낸다. AV는 구차적으로 서브이큘럼, 후서브이큘럼, 전서브이큘럼, 파라서브이큘럼의 격막 부분으로 및 내후각 피질로 돌기한다. 대상 피질은 서브이큘럼 및 해마로 다시 돌기하여, 파페츠 회로 루프를 완성한다. 아래 목표 2에서, 발작 전파와 전개는 웨이스테이션 및 서브부위(예를 들어, 내측 및 외측 유두체, ANT로의 직접적인 뇌궁계, 및 ANT의 세포체)에서의 광유전적 기술을 이용하여 억제될 수 있다.
신경 전송 시스템. 신경 전송 시스템의 조작은 전기 자극의 치료상의 효과를 조정하는 다른 방법이다. 종래의 연구는 약제상의 차단을 이용항 약물이나 장치의 치료상의 작용에서의 신경 전송 시스템의 역할을 설명한다. 신경 전송 대항제는 변하는 정도의 특수성을 가지며 차단은 관심있는 시스템 외부에서 거의 항상 효과를 만들어낸다. 광유전적 기술은 관심있는 특정 경로에서 신경 전송기 시스템의 비활성화 또는 여기를 허용한다. 이 방법은 목표로 하는 자극 치료법의 설계를 더욱 유용하게 알려준다. 이차적인 장점은 약물 설계에 누적된다.
ANT의 AV 핵에는 중간 봉합선으로부터 세로토닌 말단부의 마커를 갖는 시상 핵으로 가장 많이 표시되어 있다. 이전 연구에 따르면, 쥐의 AV에서의 세레토닌의 증가는 경련성 약품, PTZ에 의해 생기는 발작을 억제한다. 반대로, PTZ 발작에 대한 임계치를 증가시키는 ANT 전기 자극의 유익한 효과는 세레토닌 대항제인, 메틸세르지드(methylsergide)에 의해 크게 차단된다. 콜린성 섬유는 두개의 콜린성 세포 그룹의 메소폰틴 피개로부터, 더 적은 면적, 대뇌각교내 피질 핵까지 AV로 이동한다. 이들 AV로 올라가는 콜린성 구심 신경은 유도체와 피질로부터의 흥분성 입력을 조절할 수 있다. AV는 시상 피질 돌기 뉴런의 말단 덴드라이트를 주로 자극하는 AV에 대한 글루타민산 섬유를 이용하여, 팽대 후부 대상 피질을 갖는 입출력 루프에 참여하게 된다. AV의 축색돌기 말단부의 약 12%는 GABA 마커에 대해 양성적이고, 이들 말단부는 망상 시상, 기저 전뇌 또는 뇌간에서 생긴다. 이들 시냅스들은 대칭적이고 덴드라이트와 세포체에 형성된다. AV가 GABA 중간 뉴런을 포함하는지에 대해서는 논란이 있지만, 한 최근 연구에서 어떤 것도 확인된 것은 없다.
광유전학의 기여: 간질병을 위해 ANT를 자극하는 데에 제한되고 가변적인 성공의 한 가능한 이유는 핵이 복잡하는 것이다. 상기 ANT 해부에 대한 개요 배경으로서, 다양한 입력, 출력, ANT의 확대 세포와 소세포 부분, 다양한 신경 전달 시스템, 외측 경로 모두는 전방 시상 전기 자극에 영향을 주게 된다. 광유전학 기술은 자극에 대한 치료 응답의 중요한 요소를 해부하는 데에 이상적으로 적합하다. 이렇게 행하는 것은 더욱 정밀하게 목표로 한 전기 자극으로 미래의 작업에 대한 지침이 될 것이다. 예를 들어, 삼차원으로 DBS 효과의 유한 요소 모델링하게 되면 세포체가 더 높은 발포의 임계치를 가지고, 경로의 시냅스와 섬유에 대해 전극 근처의 여기 효과를 증명하게 된다. 따라서, ANT에서 특정 섬유 시스템이 중요한 것으로 밝혀지면, 자극은 이들 시스템을 우선적으로 활성화도록 설계될 수 있다. 중요한 부분 모집단을 알고 있음이 또한 자극의 부작용을 최소하도록 도와준다. 기억 손상은 간질병에 대한 ANT 자극의 임상 실험에서 자극을 받는 환자에 의해 보고된 바 있다. 광유전적 연구로부터 지침을 받아 자극을 조정하는 것으로, 기억 손상에 관련된다고 믿어지는 체세포 비활성화를 피할 수 있다.
이 제안에서, 자극과 발작 모델의 새로운 ofMRI 기술의 합병은 전기 및 광유전적 자극에 의해 가능한 발작 조정의 메커니즘을 명확히 하는 획기적인 기회를 제공할 것이다. 이하 설명은 이 프로제트가 성취하려고 제안한 세가지 특정한 목표에 따라 세 부분으로 나누어진다.
목표 1. 발작 시작과 발생 시간을 갖는 정밀한 발작을 광유전적으로 유도한다. 발작은 내측 및 외측 CA1에서, 억제 개재 뉴런이나 섬유의 직접적인 자극을 초래하지 않고, 피라미드형 뉴런을 광유전적으로 자극하여 발생될 수 있다. 발작은 다음에 ofMRI로 연결된 뇌 망을 통해 추적될 수 있다. 신경생리학적 기초의 ofMRI 신호는 ofMRI 활동의 위치에서 로컬 필드 포텐셜과 단일 유닛 기록의 측정으로 조사될 것이다. 발작 모델은 또한 EEG 와 비디오 기록된 동물 행동의 맹검 비교로 입중될 것이다. 화학적 또는 전기적 처리로 이루어진 다른 종래의 발작 모델 보다 이 발작 모델을 이용하는 이점은 원래의 특정 세포을 아는 것과, 광 펄스로 발작을 빠르고 반복적으로 발생할 수 있는 능력에 있다. 이 단락에서 테스트되는 세 가설은: a. 해마의 피라미드형 뉴런의 광유전적 자극이 종래의 내측 측두엽 발작 모델에서 보여지는 것과 비교하여 발작의 초기화를 유도할 것이다. b. 발작은 자극 주기의 변수와, 해마내에서의 특정 자극의 위치에 따라 달라질 것이다. c. 선택된 세포군의 활성화에 의해 생긴 광유전적으로 발생된 해마 발작은 반복 가능한 한정된 방식으로 다른 뇌 구조에 전파될 것이다.
제시된 모델: 발작을 시작하기 위해서, 해마의 유출로 피라미드형 뉴런은 파페츠의 회로에 즉각 연결되는, 내측과 외측 CA1에서 광유전적으로 자극될 것이다. CA1이 잠재적으로 이종성 접속의 대형 구조이기 때문에, 내측 및 외측 위치는 비교를 위해 선택될 수 있다. 자극은 초당 1, 10, 60, 100 펄스로 인가될 것이다. 우리의 사전 조사에 기초하면, 자극 위치와 주파수에 따른 개별의 발작 응답이 에상된다. 광유전적 접근으로, 우리의 목표는 전례 없는 정밀하고 가역적인 발작의 시작을 얻을 수 있는 것이다. ofMRI 와 결합된 이런 정밀한 발작의 형성은 체내 온전한 전체 뇌 망 내에서의 발작 전파를 모니터할 수 있는 획기적인 능력을 가능하게 한다.
선택적인 광유전 자극: 이 프로젝트를 통해서, 피라미드형 뉴런을 특정하여 자극하고 억제하기 위해서, AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 및/또는 AAV5-CamKIIa-NpHR-mCherry 가 주입될 수 있다.
AAV5는 전방의 라벨링을 형성하기 때문에, 주입 위치에서 세포체를 갖는 뉴런을 선택적으로 목표로 하게 된다. CamKIIa 프로모터는 피라미드형 뉴런에서만 ChR2 또는 NpHR를 만들도록 이용되는 반면 EYFP 및/또는mCherry는 확인을 위해 ChR2 and NpHR 표시를 함께 국부화하는 데에 이용될 것이다. 바이러스의 주입과 광학 가이드 이식을 위한 수술에서 회복한 이후, 청색 및/또는 황색 빛이 뉴런을 광유전적으로 초래하는 데에 이용될 것이다. 세레노틴성 및 콜린성 뉴런의 선택적 자극을 위해, TPH2-ChR2 및 ChaT-ChR2 유전자 이식 쥐가 이용되고, 세레토닌성 및 콜린성 뉴런은 선택적으로 ChR2를 표시한다. 유전자 이식 쥐에 대한 수술은 청색 빛 자극을 전달하기 위해 빛 가이드 이식만을 포함할 것이다. 목표 1에서, 우리의 목적은 CA1의 피라미드형 뉴런을 자극하여 간질병의 모델을 형성하는 것이다. 그러나, 목표 2와 3에서 목표로 하는 여러 다른 유형의 뉴런을 활성화하기 위해서, AAV5-CamKIIa-ChR2- EYFP가 정상 쥐뿐만 아니라 HP2-ChR2 and Chat-ChR2 유전자 이식된 쥐의 CA1에 주입될 것이다.
ofMRI: 광유전학의 정밀한 측두 조절로, 자극이 주기적으로 인가되어, ofMRI 스캔이 최종의 뇌 망 활동을 모니터할 수 있게 한다. 청색 빛은 전체 뇌를 스캐닝하면서 총 6분 동안 1분 마다 20초 동안 초당 1, 10, 60, 100 사이클로 전달될 것이다. 7-T-Bruker 작은 동물 전용의 MRI 시스템이 이용된다. 동물은 옅은 이소플루란 마취(~1.3%)로 관 삽입되어 통풍되면서 일반적인 디자인의 정위 크래들 내에 위치되게 된다. 영상은 전체 뇌를 덮으면서 0.5mm의 등방 해상도로 초당 1.34 프레임으로 연속하여 얻어진다.
EEG 및 행동: ofMRI 연구 이후, 발작 모델로서의 입증을 위해, 행동 연구가 해마와 두개골 표면에서 EEG를 기록하면서 실행될 것이다. ofMRI 연구가 종료한 후, 동물은 EEG 전극 이식을 위해 추가의 수술을 받게 된다. 동물이 수술에서 회복된 후에, 동물은 집중을 방해하는 자극이 없는 다이아몬드 형태의 박스에 적응시킨다. 이 형상은 코너가 깍여 있어서 동물이 정면을 향하게 하도록 한다. 동물은 실험 사이에 바나나 조각을 받는다. 기록은 베이스라인 5분 동안 행해지고, 5, 10, 및 15분에 광유전 빛 자극의 20초가 이어진다(사이에 4:20은 자극의 기록이 없음). 실험은 20분 지속된다. 1시간의 휴식 간격으로, 여러 변수의 자극 주파수가 또한 랜덤화된 순서로 테스트된다. 테스트는 각 동물에 대해 두번 반복된다. 자극 동안, 비디오가 EEG 기록과 함께 기록된다. 발작 모델은 디지털적으로 클립된 EEG 세그먼트와 쥐의 행동의 비디오를 맹검 비교함으로써 입증된다. 샘플은 공동 조사자의 이전 방법(도 19)에 따라서, 알려지지 않은 발작(휴식, 수면, 활동적인 탐구, 먹이주기, 킁킁거림)의 주기 동안, 광유전적 자극으로부터의 발작 및 GABA 대항제 바이쿠쿨린 메티오다이드 (봉합 중간선의 좌측 2mm에, 브레그마 뒤쪽으로 4mm에, 그리고 피질의 표면에서 2.5mm 깊이로 왼쪽 해마 내로 0.1 mM, 2 ㎕)의 관 주입으로부터의 발작이 취해진다. 광 유전적 자극, 바이쿠쿨린 주입된 동물 및 사이에 비발작 시간을 갖는 클리핑 (비디오 없이)의 EEG(도 19)가 치료 그룹을 알지못하는 두 뇌전도 검사계에 의해 기록된다. 각 클립은 하나의 카테고리로 분류될 것이다: 0=정상, 1=비정상이지만 간질 활동 없음, 2=간질 발작 사이 활동, 3=간질 발작 활동. 동일한 세그먼트로부터의 비디오 클리핑은 EEG 없이 제시되고 발작의 라신(Racine) 스케일에 따라 분류된다: 자세 조절의 손상 없이, 전체 자동 발작으로, 1=입과 안면 운동, 2=머리 끄덕임, 3=앞다리 경련, 4=뒷다리 서기, 5=뒷다리 서기와 쓰러짐. 그룹 간 차이의 중요성은 비변수적인 비례차 테스트로 평가될 것이다.
로컬 필드 전위 (LFP) 및 단일 유닛 기록: LFP 및 단일 유닛 기록은 기본의 신경 활동을 확인하기 위해 ofMRI 에 의해 활동 영역으로 확인된 위치에서 행해지게 된다. 두개의 실리콘 16. 채널 프로브를 갖는 플렉슨 32 채널 기록 시스템이 자극하면서 다수의 위치로부터 기록하는 데에 이용된다. 정밀한 기록이 아이소플루레인 마취하에서 실행된다. LFP 및 단일 유닛이 항상 함께 기록된다. 이들 기록은 마지막 과정으로 행해지기 때문에, 이것은 ofMRI, EEG 및 행동 테스트 이후 행해지게 된다.
우리의 예비 연구에서, 청색 빛은 6분 동안 1분 간격으로 20초 동안 초당 6, 10, 20, 40 및 60 사이클로 뉴런을 광유전적으로 초래하기 위해 이용된다. 저주파수(10Hz)에서 내측 CA1의 피라미드형 뉴런의 자극은 활동이 CA1, 치상회(DG), CA3, 서브이큘럼, 및 팽대 후부 피질의 부분을 포함하는 부위로 퍼지는 것을 나타낸다(도 20a). 그러나, 두드러진 차이는 20Hz에서 자극이 관찰된다. 중격 핵 및 CA1, DG, CA3, 서브이큘럼 및 팽대 후부 피질의 더 넓은 부분을 포함하여, 상당히 넓은 영역이 모아진다. 공간 활성화 패턴의 정량적 분석은 각 부위에 대한 활성 복셀의 개수를 도식화하여 행해진다. 막대의 색상은 활성 복셀의 평균 위상을 나타낸다(도 20c, d). 이것은 10Hz와 비교하여 20Hz 자극에서 활성화된 체적이 상당히 증가했음을 분명히 증명한다. 부가하여, 모든 영역은 특히 서브이큘럼에서, 상당히 큰 위상을 나타낸다. 주파수 의존성 위상의 원인을 연구하기 위해서, ofMRI 혈류 역학적 응답 함수(HRF)가 서브이큘럼에서 공동으로 활성화된 복셀에 대해 6, 10, 20, 40, 60Hz에서 도식화된다(도 20e). 이것은 HRF에서 매우 확실한 경향을 나타내고, 이 때 20Hz이상의 자극만이 자극 시작 이후 약 20초 지속된 높은 진폭을 갖는 HRF에서 결과된다. 약 20초 동안 지속된 활동은 또한 지속 시간과 상관 없다고 판명되었고 5, 10, 20초 자극 모두 20초 지속된 HRF를 초래하였다.
이러한 HRF의 차이는 또한 로컬 필드 전위(LFP)와 단일 단위 기록을 이용하여 근원적인 신경 활동의 정확한 반향인 것이 증명되었다. 10Hz 자극으로 기록된 LFP는 자극 시작 이후 신경 활동의 갑작스런 감소를 나타내는 반면(도 21a) 20Hz 의 자극은 자극 중단 이후 약 20초 동안 지속된 LFP 신호를 나타내고(도 21b), ofMRI-HRF 관찰과 일치한다(도 21e, f). 단일 유닛 기록은 유사한 경향을 나타내고 이때 20Hz 이상의 비율의 자극은 자극 시작 이후 신경 스파이킹이 지속되는 결과를 가져오는 반면, 저주파수 자극은 오직 자극 동안 스파이킹을 제공할 뿐이다(도 21c-e). 흥미롭게도, 대측면에는, 광학 자극의 결과로 억제된 신경이 또한 관찰될 수 있다. 더욱, 이 억제는 고주파수 자극에서 자극이 시작된 이후 유지된다(도 21f)
이들 결과는 20Hz 이상의 자극이 10Hz와 비교하여, 더욱 효과적인 발작의 형성이 결과됨을 말해준다.
위치 의존성을 더욱 조사하기 위해서, 외측 CA1이 고주파수(60Hz) 에서 자극된다. 이것은 내측 CA1 자극과 비교하여 전체 뇌를 거쳐 관찰된 급격하게 다른 활동 패턴이 결과된다. 외측 CA1 광학 자극은 파페츠의 고전적 회로를 활성화하여, 해마로부터, 뇌궁으로, 시상하부의 유두체로, 대상 피질의 전방 시상으로, 치대 번들로, 내후각 피질로, 및 다시 해마로의 경로를 적용한다(도 21).
외측 CA1에서의 49초 자극의 예비 행동 연구는 매우 낮은 빛의 전력에서의 모의 자극으로는 효과가 없는 반면 10Hz에서의 충분한 빛 전력의 자극은 라신 단계 2 발작을 초래함을 나타낸다. 20과 40Hz에서의 자극은 라신 단계 5 발작을 유발한다. 이것은 오직 가벼운 또는 라신 단계 1의 행동이 모든 주파수(10, 20, 40Hz)에 대해 관찰되는 내측 CA1와는 첨예하게 대비된다. 이것은 주로 국부 해마 부위가 내측 CA1 자극으로 채용되는 반면 파페츠의 회로는 외측 CA1 자극으로 채용되는 것을 나타내는 ofMRI 의 결과와 일치하는 것이다.
이 목적을 위해, 15마리의 숫컷 스프래그 다우리 쥐, 5마리의 숫컷 TPH2-ChR2 및 5마리의 숫컷 ChaT-ChR2 유전자 이식 생쥐가 이용된다. 5마리의 쥐 각각은 내측과 외측 CA1에 이식 및 자극되고, 5마리의 쥐는 바이쿠쿨린 메티오다이드 주입을 받게 된다. ofMRI가 먼저 초당 1, 10, 60, 100 사이클의 자극 주파수로 CA1 광학 가이드가 이식된 10마리의 쥐에 대해 실행된다. EEG 및 행동 테스트는 모델 확인을 위해 CA1에 광학 가이드를 가지고 바이쿠쿨린 주입된 10마리의 쥐에서 행해진다. 이후에, ofMRI 매핑이 행해진 10마리의 쥐는 ofMRI 신호 변화의 신경 생리학적 상관 관계를 확인하기 위해 LFP와 단일 유닛 기록을 거치게 된다.
TPH2- ChR2 and Chat-ChR2 생쥐는 목표 2의 세로토닌성 및 콜린성 광유전적 실험이 생쥐에만 행해지기 때문에, 쥐에서 확인된 바와 같은 최적의 발작 형성 변수를 가지는 생쥐에서 제안된 발작 모델을 형성하기 위해 이용될 것이다. 생쥐 모델은 ofMRI, EEG, 및 행동을 통해 쥐 모델과 비교하여 확인된다. 예비 데이터는 고 주파수에서의 외측 CA1 자극이 요구시 발작을 전파하는 가장 좋은 후보인 것을 말해준다
예측되는 결과: 해마 피라미드형 세포의 광유전적 자극은 특정 확산 패턴을 갖는 반복적 및 신뢰적인 발작을 형성하게 된다. 비발작 세그먼트로부터 EEG의 맹검 평가, 종래의 경련성 (BMI) 및 광유전적 자극으로 형성된 발작은 종래의 모델과 꽤 비교할만하지만, 더욱 실험적으로 조절가능하고 해석가능한 광유전적 발작 모델을 나타낸다.
목표 2. 세포 유형 특정 신경자극을 갖는 발작 억제. 이 단락에서, 광유전적으로 유도된 해마 발작이 추적되고 발작을 억제하는데에 최상인 광유전적 위치와 변수가 결정된다. NpHR로의 광유전적 억제의 효과뿐만 아니라 ChR2에 의한 분열성 여기가 조사된다. 분열성 여기의 광유전적 자극은 하류측 구조를 비동기화하고 기능적으로 억제시켜 테스트하게 되는데, 이는 전기적 자극과 가장 근접하게 가깝기 때문이다. 가설은 다음과 같다. a. NpHR에 의한 신경 억제는 NpHR 억제 부위에 따라 다른 정도의 효능으로 ofMRI, EEG, 및 신피질로의 해마 발작 확산의 행동 증거를 차단시킨다. b. ChR2에 의한 분열성 신경 여기는 ChR2 분열성 여기 부위와 자극 주파수에 따라 다른 정도의 효능으로 ofMRI, EEG, 및 신피질에 대한 해마 발작 확산의 행동적 증거를 차단한다. c. 세로토닌성 섬유의 세포 유형 특정 빛 유도된 여기 및 콜린성 섬유의 분열성(억제성) 여기는 ofMRI, EEG, 및 신피질로의 해마 발작 확산의 행동 증거를 차단하게 된다. 이것은 효과적인 DBS인 것을 증명하고, 약물 치료법, 예를 들어 선택적 세로토닌 재흡수 억제자가 고려될 수 있다.
목표 2의 연구를 위해서, 모든 동물은 청색 빛 자극을 위한 광 가이드와 함께 외측 CA1에 심어진 AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 를 갖게 된다. 조사중인 치료 목적에 따라서, 이들은 다른 위치에서 추가의 주입 및/또는 프로브를 갖게 된다. 치료상의 자극을 위한 외측 광유전적 자극이 이용될 수 있지만, 잔류의 발작이 관찰되면, 외측 자극이 이용될 수 있다. 목표 2 a와 b에서 피라미드형 신경의 치료상의 억제와 여기를 위해, AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 및 AAV5-CamKIIa-NpHR-mCherry가 우리의 목표로 하는 부위에 주입될 수 있다. 우리의 주입은 내측 및 외측 유두체, 뇌궁계가 시작하는 해마 (AP +5.3, DV +7.1, L ± 0.7, 귀 바에 상대적)를 포함한다. 이들 부위로 전향 바이러스를 주입하고 AV에서 자극함으로써, 특정 해부상의 기원인 인입 섬유를 선택적으로 억제하거나 여기하는 것이 가능할 수 있다. AV 자극으로 AV에서의 주입은 AV의 세포체로 피라미드형 뉴런의 특정 자극을 가능하게 한다. 가설은 이들 경로들 중 하나를 선택적으로 비활성화거나 분열성 자극하는 것은 전기적 자극의 항경련제 효과의 생성기를 확인할 것이라는 것이다. AV로의 세로토닌성 및 콜린성 돌기의 역할을 테스트하기 위해서, 세로토닌성 뉴런과 콜린성 뉴런에 특정적으로 ChR2 표시를 갖는 유전자 이식된 쥐가 이용된다. 이전의 연구에 기초하면, 세로토닌성 뉴런이 자극된 반면 콜린성 뉴런은 치료의 효능을 위해 분열성 자극되었다(즉, 기능적으로 억제됨). 총 6개의 치료 그룹에 대해, 5마리의 동물 개체가 이용된다.
빛 자극은 초당 1, 10, 60, 100 펄스로 황색 빛 억제 또는 청색 빛 자극으로 테스트된다(유전자 이식 동물에 대해서는 청색 빛만). 더 높은 주파수로 이점을 얻는 추세라면, 다른 옵신이 100Hz 보다 더 높은 주파수에서 자극하도록 이용된다.
광유전적 자극은 발작의 시작 이전에 30초:10초 및 발작을 형성하는 데에 이용된 20초 길이의 자극의 종료 이후 10초 동안 두번의 시점에서 각 실험에 도입된다. 이것은 발작 억제 메커니즘의 종합적인 맵을 얻기 위해서 of MRI 스캔 동안 6분당안 매 1분 마다 반복되게 된다. 부가하여, EEG 및 행동 테스트는 치료의 효능을 등급화하는 데에 이용된다. Tθnesen은 해마 배양 슬라이스 모델에서 5-10초의 억제성 자극을 이용했다. 체내 실험을 위해 충분히 더 긴 지속 시간을 선택할 수 있다.
예측되는 결과: 해마에서 발생된 발작이 확산 경로의 광유전적 조작에 의해 억제되고 ­방지, 단축 또는 둘다 가능하게된다. NpHR에 의한 직접적 억제와 ChR2에 의한 분열성 여기 둘다 효율적이다. 이점의 정도는 자극의 특정 위치뿐만 아니라 광유전적 자극의 주파수와 지속기간에 따라 달라진다. 우리의 실험 설계는 파페츠의 회에 대한 배경적 가설 없이 시작했다. 회로는 발작 전파에 대해 개념적으로 지나치게 단순화한 것으로 이것은 해마에서 형성된 발작의 실질적인 확산을 이미지화하여 개선될 수 있다. ofMRI 데이터로부터의 피드백이 최적의 목표물에 대한 검색을 개선하기 위해 이용될 수 있다. 본원 발명의 방법은 체세포의 항발작 효과와 경로의 섬유를 구분하기 위해서 간질병의 분야에서 최초의 것 중 하나이다.
목표 3. 전기 자극으로의 전환. 이 단락에서, 전기 자극은 이번 연구 결과를 임상 실험으로 효과적으로 전환하기 위해 이로운 광유전적 자극을 잘 모방하도록 최적화될 수 있다. 세 가설은 다음과 같다: a. fMRI, 모니터링중인 행동 및 EEG로 이미지화하면서 여러 진폭과 주파수에서의ANT의 전기적 자극은 전체 뇌에 걸쳐 전기적 자극 효과의 특성적 패턴을 보일 것이다. b. 전기적 자극으로 목표 2에서 확인된 최적의 광유전적 자극을 모방함으로써, 발작은 광유전적 발작 모델과 일반화된 PTZ 발작 모델에 대해 효과적으로 억제될 것이다. c. 치료상의 전기적 자극과 광유전적으로 유도된 발작 사이의 시간격을 변화시키는 것은 자극의 이점이 얼마나 오래 계속되는지를 밝히게 될 것이다. 이것은 임상적 자극 요법의 계획을 매우 용이하게 한다.
먼저, 뇌에 미치는 전기 자극의 종합적인 영향을 이해하기 위해서, MR 호환가능한 플래티넘 테플론 절연선 전극 (http://www.plastics1.com) 이 5마리의 스프래그 다우리 쥐의 ANT에서 외부에서 이식될 수 있다. 다음에, 자극 충격이 주파수와 진폭을 변화시켜 fMRI에 의해 측정된다. 바이폴라 자극의 인간 임상 실험 변수는 1V 간격으로 1-10V 동안 145Hz 0.1ms 지속기간으로 시작한다. 이 자극은 6분 동안 1분 간격으로 20초 동안 인가된다. 이전의 PET 연구는 ANT의 외측 전기 자극이 목표 부위, 시상과 해마에서 혈당 흡수를 증가시켰고, 대상 피질과 전두 피질에서 혈당 흡수를 감소시켰다는 것을 보여준다. 이것은 전기 자극의 충격이 이들 네트워크를 포함한다는 것을 잘 나타내고; 그러나 더 큰 공간 해상도와 시간적 정밀도를 갖는 연구가 우리의 목표에 필요하다.
상기 연구로부터의 결과에 기초하여, 자극 전극은 다른 세트의 10마리의 쥐에 놓이고, 자극 강도와 주파수는 목표 2에서 확인된 발작 억제를 위한 최적의 광유전적 자극에 의해 발생된 fMRI 활성화 패턴을 가장 근접하게 모방하도록 조정된다. 위치 주파수 및 강도의 변수들로 조정된 전기 자극은 높은 정도의 효능으로 발작을 억제할 수 있다. 이것은 목표 1로부터 광유전적 발작 모델에서 먼저 실험되는데 여기에서는 10마리의 쥐 중 처음 5마리가 시상에의 전기 자극 전극에 부가하여 외측 CA1에 이식된 광유전적 자극관을 갖는다. 공동 조사자에 의해 이미 이용된 모델인, 꼬리 혈관으로GABAA 억제제, PTZ을 주입하여 형성된 간헐적 경련성 및 긴장성 발작이 다른 5마리의 쥐에 대해 일반화된 발작 모델의 연구결과를 더 테스트하도록 이용될 수 있다. 광유전적 발작 모델에 대해, fMRI, EEG, 및 행동 테스트가 자극 효과의 결과를 측정하기 위해 행해진다. fMRI는 전기 자극이 30초 동안 광유전적 자극 시작 이전에 10초 인가되는 동안 6분 동안 매 1분 마다 간질병 모델 발생을 위해 20초 광유전적 자극이 실행된다. PTZ 모델에 대해, 식염수에 PTZ를 20 mg/ml로 연속적으로 주입하게 되면 주입 펌프에 의해 5.5 mg/kg/min의 속도로 주입된다. 발작성 EEG 방전은 대개 5분부터 시작하여, 행동적인 간헐적 경련성 발작이 약 10분에, 긴장성 발작이 그 후 바로 나타난다. 시간 경과는 투여량 투입 비율을 조정하여 단축 또는 늘릴 수 있다. 이전에, PTZ 투입 이전에 시작된 0.1-20 V (5-800 ㎂}, 100 ㎲ 바이폴라 펄스로의 ANT의 전기 자극은 EEG 또는 발작의 행동 징후를 발생하는 데에 필요한 PTZ 투여량 (투입 시간)을 증가시킨 것으로 나타났다.
연속되는 전기 자극은 운동 장애를 치료하는 데에 이용되지만, 간질병을 치료하는 전기 자극은 보통 1분 온하고 5분 오프하는 것과 같은 주기로 행해지는데, 이는 간헐적 자극이 조직을 덜 자극시키고 배터리 수명을 지키기 때문이다. 간격을 두는 자극의 합리적인 판정은 자극 이후 치료상의 효과의 지속기간에 따라 달라진다. 양의 해마 페리실린 유도 발작의 연구는 ANT 자극 10초 이후 1-2분 동안 스파이크 억제를 보여줬다. 본원 발명에 따르면, ANT에 대한 전기 자극 이후에 항발작 효과가 얼마나 오래 지속되는지는 목표 1의 빛으로 초래한 해마 발작 모델을 이용하여 조사될 수 있다. fMRI, 행동 테스팅 및 EEG가 자극의 영향을 측정하는 데에 이용될 수 있다. 특정 발작 시작 시간은 광유전적 자극으로 조절되지만, 치료상의 전기 자극은 1분 동안 자극 시작 이전 10, 5, 3, 1, 0분에 시작할 수 있다. fMRI 실험을 위해, 치료상의 효능이 목표 3b에서 잘 증명되는 3 부위가 신호 강도 변경을 위해 선택되어 모니터된다. 높은 SNR을 확실히 하기 위해서, 8개의 측정을 평균한다. EEG 및 행동은 목표 1에서 기술된 방법으로 평가된다.
예측되는 결과: ANT의 전기 자극은 전기 자극 변수가 기능적 출력을 어떻게 변경하는지를 보여준다. 이런 지식으로, 목표 2에서 확인된 최적의 광유전적 목표는 유망한 치료 목표로 이어지는 전기 자극으로 효율적으로 모방된다. 목표 1의 일시적으로 정밀한 발작 모델로부터의 실험은 자극 간격 동안 최적의 타이밍의 적당한 계통적 이해를 제공한다.
도전과 위험에 직면하여: 잠재적인 위험과 예상들: 위에서 서술된 변형된 조사 계획은 접근방법의 신규성과 관련하여 위험이 내재되어 있다. 잠재적인 위험과 지원 계획이 아래 서술된다.
고해상도의, 전체 뇌 ofMRI. MRI는 통상적으로 나이퀴스트 샘플링 속도 조건과 일련의 샘플링으로 인해 시공간적 해상도에 있어 제한적이다. 작은 뇌 부위로부터 고해상도의 공간적 활동의 묘사를 원할하게 하기 위해서, 압축된 감지 알고리즘이 개발되었다. 샘플링중인, 고해상도의 획득 궤도는 주문 설계되고 압축된 감지 복원 알고리즘으로, 거의 6번의 복셀 체적 감소를 성취한다. 등방성 200 ㎛ 해상도와 초속 1.3프레임의 면내 해상도가 전 뇌를 포괄하여 성취된다. 리의 실험실에서 개발중인 이 전례 없는 능력은 발작 활동의 정밀한 묘사를 더욱 개선하고 억제 메커니즘을 위한 우리의 연구를 도와준다.
마취 및 발작. 우리의 영상 연구 모두는 아이소플루레인 마취제로 실행된 것이다. 아이소플루레인은 신경 활동을 억제하는 것으로 알려져 있지만, 그럼에도 우리의 초기 연구는 양호한 ofMRI, 행동 및 발작 활동의 신경 단위 증거를 보여줬다. 그러나, 발작이 마취로 과하게 억제되면, 목표 1에서 시작한 모델은 EEG 활성화 및 발작 활동을 덜 억제한다고 알려진, 케타민 또는 엔플루레인 마취제를 이용하여 재확인될 수 있다.
발작 모델. 간질병은 이질성이 있으며, 어떠한 단일의 동물 모델도 임상 간질병의 아류형들 중 하나를 완전히 모델화하지 못한다. 본원 발명의 다양한 양태는 세 모델을 이용하여 제시한다: 하나는 해마 광유전적 자극으로 형성된 것, 두번째 표준 발작 모델은 비큐큘린 메티오다이드가 해마에 주입된 것, 세번째 표준 PTZ 모델은 일반적인 발작이다. 본원 발명의 다양한 양태는 자발적으로 반복되는 발작에서, 광범위한 임상적 본질의 간질병이 아니고, 특정 유형의 발작을 연구한 것이다. 이런 간단한 모델로 시작하는 것이 간질병 치료를 더욱 특정적이고 효율적으로 만들 때 광유전학의 가치를 기록하게 된다는 것이 우리의 믿음이다. 교훈은 다른 모델로 갑자기 머리맡에서 입증될 수도 있다.
보조 전파 경로. 파페츠의 회로는 해마의 유일한 유출 트랙트가 아니고, 이는 또한 해마 맞교차 (뇌금) 및 내후각 피질을 통해 원심성 섬유를 갖는다. 동물의 유두체와 전방 시상의 자극은 발작을 줄일 수 있다는(도 23) 것은 알려져 있지 않고 예비 데이터는 파페츠 회로의 활성화를 나타내지만(도 22), 이것은 ANT 자극의 불완전한 효능에 대한 이유로 다른 경로가 배제될 수 없다. ofMRI의 중요한 장점은 파페츠의 회로 밖에서 활성화된 뇌 부위를 직접 관찰하고 확인하는 능력이다. 확인되었다면, 실험은 관찰된 경로를 포함하도록 수정될 수 있다.
예측: 본원 발명의 다양한 양태는 간질병에 대한 것이 아니고, 다양한 신경학적 및 신경외과적 질병에 대해, 임상의가 신경 자극을 위한 임상 치료를 설계하는 방법을 변경시킬 수 있다. 본원 발명의 플랫폼과 방법은 자극의 목표와 변수에 대한 추측의 많은 부분을 감소시키는데, 광유전적 기술이 전기 자극 기술 보다 더 국지적으로 세포 유형 특정 및 조절 가능하기 때문이다. 견고한 실험 작업이 임상 적용에 선행해야한다: 이것은 신경 자극 분야에는 너무나도 적다는 게 사실이다. 우리의 프로젝트는 합리적인 것에 기초를 두고 신경 자극을 위한 치료 설계를 향하여 강한 조치를 취하는 것이다.
4. 전환 연구 프로젝트 프로그램의 적합성: 신경 자극은 난치성 신경학적 질병의 유용한 새 치료법으로 나타나고 있는 중요 분야이다. 그러나, 이제까지 치료의 노력은 경험에 기초하였고, 완전히 효율적이지 못했다. 간단한 변수 변경이나 자극 목표물의 경미한 변경은 효과를 경감시키거나 징후를 더욱 악화시켰다. 자극하는 사람의 이식이 외과적이기 때문에, 최대의 효능이 필요하다. 본 발명에 따르면, 신경자극은 치료 성과 결과에 대한 각 신경 망 요소들의 기여를 계통적으로 테스트하는 새로운 플랫폼을 설치하여 전환될 수 있다간질병은 첫 테스팅의 기초가 되었지만, 배운 교훈은 신경 자극에 의해 잠재적으로 개선된 많은 다른 질병에 적용될 것이다. 이 프로젝트는 신속하게 처리 및 종료될 수 있고 특정 신경 집단에서 일어나는 간질병 모델의 개발을 제공한다. 내측 및 외측 해마로부터의 발작으로 활성화된 망의 가시화가 기능적 발작 구조에 대한 지식에 새로이 추가된다. 이들 실험은 광유전적 억제를 이용하여 정의된 전파 경로를 통해 발작 확산을 차단하는 것의 증명을 제공한다. 전기적 자극이 펄스 종료 이후 발작을 얼마나 오래 억제하는지에 대한 연구는 제1 가이드 중 하나를 임상 자극의 합리적인 타이밍에 제공하게 된다. 주요 전략은 전기 자극에 대한 응답의 중대한 요소를 확인하는 광유전적 기술의 정밀성과 반복 가능성을 제공한다. 언젠가, 광유전적 신경 조정술은 그 자체가 유용한 임상 도구가 될 수 있지만, 현재로는 전기 자극의 성분을 해부하기 위해 예리한 메스로서 잘 이용된다. 우리의 예비의 결과는 유망하고, 여전히 이 제시에서 서술된 목표는 분자 및 세포 생물학, 유전학, 물리학, 공학, 신경 분리 및 임상 신경학에 걸쳐서 야심적이다. 이것은 잠재적인 충격이 크고 위험도가 높은 프로젝트이다. 전환성 연구 프로그램은 이 프로젝트에 자금을 대고, 이로써 과학을 머리맡에 더 가깝게 하는 데에 이상적으로 적합한 것이다.
5. 예시의 타임라인: 첫 해에, 광유전적 발작 모델이 목표 1에서 서술된 바와 같이 발생된다. 20마리의 쥐가 발작 모델을 형성하기 위해 이용된다. 두해째에, 동일한 실험이 목표 1을 위해 20마리의 유전자 이식된 쥐에 반복된다. 부가하여, 두해째에, 쥐 광유전적 발작 모델을 위해 파페츠의 회로에서 피라미드형 뉴런을 그리고 ANT에의 입력을 억제시켜 발작을 억제하기 시작한다. 셋째 해에, 분열성 자극이 피라미드형 뉴런에 적용된다. 동일한 해에, 영상, 행동 및 EEG가 전기 자극의 충격을 평가하기 위해 행해지는 동안 전기 자극이 쥐의 ANT에 적용되는 실험이 행해진다. 네해째에, 두해째에 개발된 생쥐의 광유전적 발작 모델이 이용되고 여기에서는 세로토닌성 및 콜린성 신경 집단이 항발작 효과를 연구하기 위해 조절된다. 동일한 해에, 전기 자극으로 최적의 광유전적 항발작 효과가 시작될 수 있다. 먼저 광유전적 발작 모델이 시작한 다음에, 또한 일반적 발작 모델의 효과를 평가한다. 마지막 해에, 자극 지속 시간 효과가 평가된다.
실시예 D
치료 접근법을 설명하는 배경.
간질병뿐만 아니라 많은 다른 신경학적 질병에 대한 약품 개발의 중요한 도전은 이 화합물의 장래의 임상적 효능과 부작용의 정밀한 잠복 예측 가능성이다. 신경학 계통의 복잡성은 체외 정보, 생체외 데이터 또는 간단한 동물 행동 모델에서 대용을 이용하여 후보 화합물의 충격을 추론하는 것을 매우 어렵게 만든다
질병 기구의 정밀한 선험적 지식 없이, 약물 효능을 정밀하게 테스트하는 데에 이용될 수 있는 질병 모델을 형성하기 어렵다. 우리의 제안은 광유전적 기능 자기 공명 촬영 장치(ofMRI) 기술을 이용하여 약물 운영 충격의 체내 전체 뇌 정량화와 함께 정밀한 질병 모델 발생을 통해 이 과정을 기본적으로 변환하는 것이다. ofMRI는 fMRI 판독에 의한 광유전학으로 불리는 세포 유형 특정적인 시간적으로 정밀한 자극법과 결합한 새로운 기술이다. PI(Nature 2010)에 의해 발간된 개념 연구의 첫번째 증명은 그 유전적 독자성, 세포체 위치, 축색돌기 목표 및 시간적 신호 패턴에 의해 특정된 세포 유형으로 결과된 뇌 광역의 신경 활동을 정확하게 가시화하는 ofMRI 기술의 능력을 입증했다.
광 유전학을 이용하여, PI의 실험실은 발작 활동의 넓은 어레이가 반복적으로 신뢰 가능하게 형성될 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 갖는다. 전기 쇼크, 화학적 투입, 킨들링(kindling), 유전자 변형의 교배, 또는 물리적 트라우마로 발생된 발작 모델과 달리, 원래의 세포 유형, 위치 및 발작 시작 시간에 대한 정확한 지식을 결정할 수 있다.
더욱, ofMRI 판독을 통해, 관찰된 가벼운 부분 발작이나 전체 이차적으로 발생된 간헐적 경련성 발작을 형성하기 위해 신경 시그널링이 망을 통해 어떻게 전파하는지 정확한 경로가 정밀하게 가시화될 수 있다. 매우 제한된 개수의 뇌 위치에서의 EEG 기록 또는 거친 행동만을 나타내는 라신 스케일에 의존하지 않고, ofMRI는 살아있는 행동하는 동물의 전체 뇌에 미치는 치료의 영향을 증명할 수 있다. 채내 기술의 특성은 질병의 종방향 추적을 가능하게 하고 여기에서 단일의 동물이 시간 경과에 따라 다른 투여량과 치료 경과가 어떻게 동물에게 영향을 미치는지를 추적하는 데에 이용될 수 있다. 이것은 다른 시점에서 다수의 동물을 희생시켜, 변동성, 비용 및 시간을 증가시키게 하는 종래의 탈체 기술과 대비된다.
전례 없는 정밀도로 발작 네트워크를 형성하고 가시화하는 ofMRI 의 능력으로, 정량적 대항 약물 스크리닝을 위한 플랫폼이 설계될 수 있다. 정밀하게 형성된 발작 동안 네트워크를 관찰하면서, 우리는 비교적 잘 알려진 분명한 효능과 부작용 프로파일을 갖는 몇 개의 상용 약물을 투여할 것이다. 우리는 이들 알려진 약물에 의해 ofMRI 에 기초한 발작 억제 관찰을 증명하는 것을 목표로 한다. 억제는 완전히 또는 부분적으로 효과적이며 우리는 살아있는 동물의 뇌에서 활동이 감소하거나 증가하는 위치를 직접 관찰할 수 있게 된다. 장차의 작업에서, 우리는 뇌의 특정 영역의 활성화 및 비활성화의 패턴을 강조하여 약물의 신경학적 부작용을 예측하는 ofMRI의 능력을 더욱 조사할 것이다. 광유전적으로 발생된 발작 모델에서 일단 ofMRI이 이들 세 개의 알려진 AED에 대해 인증되면, 우리는 시스템을 추정되는 새로운 AED에 대한 스크린으로 개발하기 위한 더 좋은 위치에 있을 것이다.
과정.
세개의 상용 항간질작용 약품(AED): phenytoin (PHT), lorazepam, and levetiracetam (LEV)가 이용될 수 있다. 이들은 이들의 별개의 잠복기의 대항 효과 및 개별의 약물 작용 기구를 위해 선택된다. 부가하여, 이들은 최대의 전기쇼크(MES), 침투성 펜틸렌테트라졸(PTZ) 및 편도 자극과 같은 일반적인 간질병 모델의 여러 효능 프로파일을 보여준다. PHT는 Na+ 채널의 불응기, 로라제팜 GABA 효능, 및 LEV 새로운 시냅스 전 A2 프로테인에 영향을 미친다. 로라제팜은 모든 세개의 종래의 모델에서 효능을 보이는 반면, LEV는 편도 자극에서만 효능을 보여준다. 임상적으로, PHT는 부분적이고 일반화된 간헐적 경련성 발작에서 효능을 보이지만, LEV는 부분적인 간헐적 경련성 및 비경련성 일반화된 발작에 대한 효능을 보인다. 여러 약물은 여러 동물 모델에 대해 효능의 차이를 보이지만, 임상적 효능은 동물 모델 연구에 의해 반드시 예측될 필요가 있지는 않다. 더욱, MES와 PTZ 모델만이 이용된다면, LEV는 결코 병원으로 가져갈 가능성을 만들지 않는다. 따라서, 병원으로의 예측성을 제공할 수 있는 목표의 간질병 환자 그룹을 나타내는 적당한 동물 모델을 이용하는 것이 크게 중요하다. 이를 위해, 우리는 동물 모델이 제공하는 발작에 대한 정확한 이해뿐만 아니라 약물이 동물 모델의 무엇에 영향을 미치는지에 대한 포괄적인 판독을 가질 필요가 있다.
동물 모델 및 이들의 발작은 종래에 본 스크류(bone screw)를 통해 기록된 행동과 EGG의 비디오에 의해 평가 및 카테고리화된다. 평가 동안, 미리 정해진 패턴에 기초하여 발작의 등급을 매긴 번호가 형성된다. 예를 들어, 비디오 클리핑은 발작에 대해 수정된 라신 스케일에 따라 분류된다: 자세 조절의 손상 없이 전체 자동 발작으로, 0=정상, A=활동 억제, 1=입과 안면 운동, 2=머리 끄덕임, 3=앞다리 경련, 4=뒷다리 서기, S=뒷다리 서기와 쓰러짐. EGG는 최상의 한 카테고리로 분류된다: 0=정상, 1=비정상이지만 간질 활동 없음, 2=발작성 간질 (스파이크) 활동, 3=발작성 간질 (EGG 발작이나 스파이크 웨이브) 활동.
그러나, 이런 분류는 발작을 완전히 특성화하는 데에 충분하지 않다. 이것은 발작의 심각성을 선형적으로 나타내지만 예를 들어, 여러 뇌 부위가 어떻게 연루되는지를 설명하지 못해, 분명한 발작 기구 및 치료 옵션과 관련된 미묘한 차이를 잠재적으로 손실하게 된다. 발작이 어디에서 어떻게 기원했는지 이들이 어디로 전파하는지가 치료법을 설계할 때, 특히 간질병의 이질성의 양을 고려할 때 중요한 문제가 된다. 발작의 기원을 정확하게 아는 모델을 갖게 되면, 발작 전파를 추적하는 능력이 AED가 전개되는 방법을 전환시킬 것이다.
이를 위해, PI의 실험실은 개별적인 발작은 원래의 세포 유형, 위치 및 시간적 점화 속도와 같은 변수의 미묘한 변화로 형성될 수 있음을 이미 나타낸 바 있다. 광유전적으로 발생된 발작 모델은 반복 가능하고 정밀한 시간적 시작 특성을 보여준다. 몇 개의 다른 광유전적 발생된 발작 중에서, 두개가 도 28, 도 29에서 나타낸 바와 같이, 제시된 연구에 이용될 수 있다. 이들은 쥐(스프래그 다우리, 숫컷, 250-350g)에 AAV 바이러스를 투입한 후 등쪽 내측 CA1 및 복측 내측 CA1에 피라미드형 뉴런의 40Hz 빛 자극을 포함한다. 쥐의 등쪽 내측 CA1 부위는 인간의 후방 CA1의 아날로그이고 복측 외측 CA1 부위는 전방 CA1에 대응한다. 광유전학으로, 정밀한 시간적 점화 주파수의 조절이 가능하다. PI의 실험실에서의 ofMRI 연구는 피라미드형 뉴런의 해마 자극을 위해, 높은 등급의 발작이 더 오래 지속되는 활동과(도 26) 20Hz 이상의 고 주파수 자극으로 더 넓은 영역의 점증으로 형성되는 것을 보여준다. 따라서, 이 첫 연구를 위해, 자극 위치의 해부학상 차이를 갖는 두개의 고 주파수 자극 모델이 선택되었다. 도 27은 등쪽 내측 CA1에 대해 청색 빛으로 초래된 발작 동안의 EEG 및 행동의 일 예를 나타낸다. 사전 작업은 이들 모델에 대응하는 발작 동안 다른 행동 패턴을 나타낸다: 40Hz 등쪽 내측 자극에는 주로 활동 억제를 그리고 복측 외측 해마의 40Hz 자극에는 뒷다리 서기, 쓰러짐 및 머리 털기.
ofMRI 연구를 통해, 발작은 정밀하게 형성되는 것만이 아니라 관계되는 뇌 영역을 정확히 아는 것과 일시적 역학으로 매핑되고 정의될 수도 있다. ofMRI 혈류 역학적 응답 함수(HRF)(eh 26a, b) 및 대응하는 LFP(도 26c-f) 및 단일유닛 기록(도 26g-j)은 적당한 시공간적 역학을 제공할 때 ofMRI 기술의 정밀도를 증명해준다. LFP 및 단일 유닛 기록이 ofMRI 로 활성화된 부위로 확인된 위치에서 이루어지면, 광유전적 자극으로 구동된 신경 활동이 명확하게 측정된다. 특히, 이것은 저주파수 자극을 통해 형성된 짧게 지속되는 활동(도 26a 6-10Hz 트레이스, c, g) 및 고 주파수 자극을 통해 형성된 오래 지속되는 활동 (도 26a 20-60Hz 트레이스, b, d-f, h-j)을 정밀하게 분별화해준다. ofMRI 공간적 활동 맵과 HRF로, 우리는 전 뇌에 걸친 활동의 지속 시간과 활동 패턴을 정확하게 결정할 수 있다. 이런 수준의 정밀도는 보통의 ofMRI로는 결코 관찰되지 않는다. 여전히 발작의 특성을 정량적으로 반드시 정의할 필요가 없는, 미묘한 차이를 주의깊게 찾아야만 하는 대응 라신 스케일 및 EEG 기록과는 반대로, 관계된 모든 뇌 부위를 묘사하는 전체 뇌 이미지와 신경 활동의 시간적 역학은 발작을 정량적으로 정의하는 것을 중요하지 않게 만든다. 이 제안에 대해 이용되는 두 모델(도 28, 도 29)는 두 발작의 다른 특성을 확실하게 묘사한다.
CA1 내에서의 자극을 등쪽 내측으로부터 복측 외측 영역으로 이동시키면 회로 점증적인 변화를 보여준다. 대상 및 변연전, 변연계 구조는 종래의 파페츠의 회로의 일부이다. 복측 외측 CA1 자극으로 발생된 발작은 이 회로를 통해 전파하는 반면, 등쪽 내측 발작은 CA1, 서브이큘럼 및 후내량 팽대 피질을 포함하는 영역에서 더 크고 더 오래 지속되는 활동을 전파하지 않고 모은다. 두 영역으로부터 시작된 발작은 라신 레벨 5의 발작을 형성하지만, 뇌 활성화의 다른 기초적인 패턴은 다르다. 다른 활성화 및 전파 패턴은 가능하게는 다수의 심도 전극 없다면, ofMRI 없이 식별될 수 없고, 이들은 여전히 뇌 부위 샘플링 문제를 수반하게 된다.
이미 연구된 등쪽 내측 및 복측 외측 광유전적 해마 자극의 모델은 ofMRI를 이용한 약물 효능을 가시화하기 위해서, PHT, 로라제팜 및 LEV의 투여 이후에 사용된다. 약물의 효능은 비디오와 EEG를 포함하는 종래의 테스트에 의해 먼저 평가된다. 다음에, ofMRI 연구는 약물이 뇌 망에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 세부사항을 가시화하기 위해 행해진다. 약물은 ofMRI 스캔 동안 투입된다. 목표는 두 다른 발작 모델과 세 다른 약물에 연루되는 활동 감소 또는 증가된 영역을 특정하게 찾아내는 것이다. 우리는 두 발작의 다른 특성이 어느 뇌 영역 활동이 약물로 감소되었는지에 관해서 세 약물로 다른 효능을 나타낸다고 가정한다. 종래의 비디오와 EEG 테스트는 ofMRI 가 약물 효능과 그 기구 면에서 제공할 수 있는 정보의 감도와 풍부성을 증명하기 위해 ofMRI에 기반한 결과와 비교된다. 이것은 발작을 정의하기 위해 도 28 및 도 29에서와 같이 전체 뇌 망을 가시화한 것과 비교하여 라신에 기초한 발작 분류와 EGG 스케일 간의 차이와 유사하다.. 계속이냐 중지냐의 판정은 우리가 각 뇌 영역에 대한 약물 조사 이전과 이후 사이의 차이를 정량적으로 확인할 수 있는지의 여부에 기초하여 행해진다. 우리의 궁극적인 목표는 각 발작 모델에 대한 각 약물의 개별적인 영향을 가시화하는 것이지만, 이 실험에 대해 선택된 약물과 모델의 조합은 유사한 효과를 나타내는 것이 가능하다. 그러나, 우리는 6가지 경우 중 어느 경우에서나 뇌 영역 의존성 활동의 변화를 나타낼 수 있는 한, ofMRI를 이용하여 새로운 AED에 대한 계통적 조사를 시작할 수 있다는 충분한 증거가 된다. 도 28, 도 29의 두 발작 모델은 CA1 내의 여러 발작 시작 위치에서 발생된다. 많은 다른 발작, 예를 들어 세포 유형 특수함을 갖는 작은 시상 핵을 자극하는 것이 PI의 실험실에서 개발되었다. 이들 모델에서 약물 영향을 확인함에 있어 제안된 연구의 성공은 뇌 활동의 외관 검사로 개별의 발작 모델을 정의할 뿐만 아니라 약물 영향을 정량적으로 정의할 수 있게 한다.
잠재적인 위험과 예측들. 우리는 PHT, 로라제팜 및 LEV 각각에 대해 ED50의 절반을 먼저 투여한다. 충분히 많은 투여량으로, 모든 뇌 영역의 완전한 비활성화가 관찰되는 것이 가능하다. 이 경우, 테스트중인 약물이 어느 뇌 영역에 영향을 미치는지에 대한 더 특정적인 정보를 얻기기 어렵다. 따라서, 우리는 초기 투여량의 절반으로 양을 조정한다. 인식 가능한 약물 디스플레이가 별개의 뇌 영역에서 증가/감소하면, 우리는 이것을 계속으로 생각한다. 약물 투여 이전과 이후의 차이가 발작 모델이나 약물 중 어디에서도 관찰되지 않으면, 우리는 AED 투여양을 ED50으로 또는 이 투여양의 배로 증가시킨다. 인식 가능한 차이가 없으면, 중지로 간주한다. 그러나, 우리는 ofMRI로 검출할 수 있는 상세한 수준과, 이들 약물이 다른 동물 모델에서 효능을 나타낸 임상적으로 승인된 약물이라는 사실이 주어지면, 우리는 중지 결과를 얻게 될 가능성은 아주 없다.
이정표: 3개의 약물의 OfMRI 테스팅은 즉시 시작하고 첫 해 내에 종료하여, AED를 포괄적으로 평가하는 기술의 능력을 입증하게 될 것이다. 우리는 이 데이터뿐만 아니라, 첫 해에 성취 이정표로서 계약을 발생하는 사업상 개발 노력을 제공하게 된다. 성공적이라면, 두해째 동안, 우리는 제약 회사로부터 새로운 화합물을 테스팅하여 수입이 발생하기 시작할 것이다.
샘플크기와 통계적 분석 계획.
우리는 동일한 동물에 대해 반복되는 테스트를 실행하여, 테스팅하는 각 약물의 적어도 5 반감기가 다른 약물 사이에 경과하게 한다(예를 들어, 일주일 이상). 우리는 또한 시간이 경과하면서 상당한 “킨들링” 노력을 배제하도록 발작 임계치를 평가한다. 동일한 동물에 대한 테스팅을 반복하는 능력은 약물 테스팅을 위한 모델의 장래의 주목성을 크게 개선한다.
OfMRI 연구를 행하는 우리의 경험으로, 그리고 신뢰성, 체내 정밀한 반복 가능성으로 인해 동일한 동물에서 순차적인 실험을 실행하는 능력, 비외과적인 영상 능력을 고려하면, 우리는 그룹 당 오직 5마리의 동물만을 필요로 한다. 두 모델로 하면 이것은 낭비 없음을 가정할 때 총 10마리의 동물이 결과된다. 10마리의 동물을 이용하면, 먼저 발작 전파의 OfMRI가 도 28, 도 29에서와 같이 매핑된다. 동일한 동물에, 약물이 투여된다. 도 28, 도 29에서 나타낸 바와 같이 모든 뇌 부위를 세그먼트화하고, 약물 투입 이전과 이후 사이의 차이의 통계적 중요성을 보면, 우리는 약물이 각 뇌 부위에 어떻게 영향을 미치는지를 분석하게 된다. 더욱, 두 모델에 대한 약물 효능의 차이는 전체 활성화된 체적이 얼마나 변화했는지 뿐만 아니라 어느 뇌 부위가 변화를 활성화했는지에 대한 특성에 의해 평가되게 된다. 요약하면, 두 모델과 세 약물, 사전 및 사후 투입은 두 모델에 대한 사전 투입시 2 데이터세트를, 두 발작 모델에서 세 약물의 사후 투입시 6 데이터세트를 제공한다. 8가지 겨우는 총 10마리의 동물에서 부위별 데이터의 통계적 비교를 통해 비교된다. 우리는 또한 동일한 동물에서 동일한 실험 조건의 반복된 테스팅을 3회 실행한다. 이것은 3 반복된 총 5마리의 동물을 제공하여, 오직 10마리의 동물로 시나리오당(6경우) 15번의 시도가 결과된다. 우리는 약물 처리의 중요성 대 다른 중요한 변동의 원인을 평가하기 위해서, 부위별 활성화의 체적을 마킹하는 연속되는 변수에 대한 반복된 측정 통계로 ANOVA를 이용하여 데이터를 분석한다. 우리는 또한 약물 투여 이전과 이후에 활성화된 부위 대 비활성화된 부위의 비변수적 측정에 대해 Chi Square 테스트 (또는 5보다 더 작은 단위 크기에 대해 비례적 차이 테스트)를 실행하게 된다.
이 방법의 결과는 잠재적인 새로운 AED의 약물과 투여량을 평가하는 새로운 방법이다. 우리는 특정 발작 유형에 대한 효능 및 또한 신경학적 부작용을 예측하기 위해 뇌 시스템의 특정 프로파일에 연결하는 것을 목표로 한다.
실시예 E
뇌심부 자극(DBS), 반응성 신경 자극(RNS), 미주 신경 자극(VNS)를 포함하는 신경 자극 방법이 파킨슨 병, 떨림, 우울증, 강박 장애, 통증, 및 간질병을 포함하는 광범위한 뇌질환의 새로운 치료책으로 유망하다. 그러나, 신경 자극 기구에 대한 기본적인 이해가 그 효능을 제한시킨다. 많은 치료책이 인증되고 임상 치료중에 상당한 효능을 증명했지만, 근본적인 동작의 기구가 무엇인지는 명확하지 않다. 따라서, 현재 이용되는 자극 변수와 위치는 상당한 양의 추측을 낳았고, 이종성 결과와 제한된 효능이 결과되었다. 신경 자극 기구를 계통적으로 이해하기 위한 플랫폼을 개발하는 것이 패러다임 전환의 가능성을 가지지만, 이런 과정은 뇌의 지나친 복잡성에 의해 이제까지 방해받아왔다. 이 기구를 분석하기 위해, 이제까지 만족할 수 없었던 주요한 필요 조건이 있다. 먼저, 뇌는 단일의 뉴런이 뇌의 넓은 영역에 걸쳐 접속을 하는 집적 회로를 형성하기 때문에, 데이터가 전체 뇌를 통해 정보를 이송한다는 것은 매우 중요하다. 둘째, 시간적 역학의 세부사항을 얻기 위해서, 우리는 높은 시간적 정밀도로 별개의 세포 유형 특정 네트워크에의 접속을 필요로 한다. 셋째, 네트워크 역학이 행동과 상호관련될 수 있도록 체내 정보를 얻는 것이 중요하다.
이 제안에서, 우리는 이전에는 유효하지 않았던 주요한 이해와 기술적인 발전에 근거하여 시도하는 것이 목표이다. 광유전적 fMRI(ofMRI)를 이용하여, 고 자기장 fMRI 판독과 광유전적 조절을 결합하여, 우리는 체내 전체 뇌를 통해 대응하는 응답을 가시화하면서 세포유형과 시간적 정밀도를 갖는 뇌 회로 소자를 정밀하게 조절할 수 있다. 기능을 테스트하는 데에 동물을 희생할 필요 없이, 동일한 개별적 동물이 반복적으로 종방향으로 테스트될 수 있고, 병렬로 직렬로의 기능적 응답을 위해 추적될 수 있다. 이 제안에서, 우리는 ofMRI를 신경 자극 장치의 계통적 설계를 가능하게 할 수 있는 플랫폼 기술로 개발하는 것이 목표이다. 고유의 비전으로 ofMRI 기술의 원 발명자와 선구자로서, 우리는 최근에 중요한 기술적 발전을 이루었다. 이들은 고해상도, 왜곡없음, 어웨이크, 고출력 상호작용적 ofMRI의 개발을 포함한다. 부가하여, 치료법상의 개발을 돕기 위해 신경학적 질병 기구를 이해하는 제1의 단계로서, 우리는 정밀한 기원을 갖는 정교한 발작 네트워크가 성공적으로 가시화될 수 있음을 보여준다. 이들 초기 연구는 이미 현재 임상적 시도에서 가변적인 효능의 원인에 대한 간파를 제공하고 있다. 성공시 이 제안된 연구는 신경학적 질병 기구의 이해에 획기적인 영향을 주게 될 것이고 신경 자극 전략을 계통적으로 디자인하고 테스트하는 능력과 결합된 임상적 결과의 정확한 예측은 새로운 치료법의 개발을 가속화할 것이다.
제안된 프로젝트는 나의 무모하고 혁신적인 대규모의 비전에 기초한 다수의 학문으로부터 새로운 기술을 통합하는 철저히 새로운 방법을 취한다. 이 작업의 특성으로 인해, NIH R01 or R21 기구에 의해 모아진 종래의 가설에 근거한 연구에 적합한 프로젝트는 아니다. 이 제안을 고유하게 하고W.M. Keck 기초 연구 프로그램에 완전히 적합하게 하는 것은 압도적인 필요성을 확인한 나의 비전에 근거한 것이고, 내가 지금까지 유지한 주요한 성취는 이 프로젝트를 성공으로 만드는 데에 크게 약속해주었다.
실시예 F
알츠하이머 질병(AD)뿐만 아니라 많은 다른 신경학적 질병에 대한 약물 개발의 주요한 도전은 화합물의 장차 임상적 효능과 부작용의 정확한 잠복성 예측이다. 신경학 계통의 복잡성은 체외 정보, 탈체 데이터 또는 단순한 동물의 행동 모델의 대용을 이용하여 후보 화합물의 영향을 추론하는 것을 어렵게 만든다. 우리의 제안은 광유전적 기능 자기 공명 영상 (ofMRI) 기술을 이용하여 동일한 동물에서 시간경과에 따라 종방향으로 약물 투여 영향의 체내 전체 뇌 정량화에 함께 정밀한 질별 모델 특성을 통해 이 과정을 기본적으로 변형하는 것을 목표로 한다. ofMRI는 fMRI 판독하는 광유전학으로 불리는 세포 유형에 특정적인, 시간적으로 정밀한 자극 방법과 결합한 새로운 기술이다. PI에 의해 발간된 개념 연구(Nature 2010)의 첫번째 증명은 그 유전적 독자성, 세포체 위치, 축색 기 목표 및 시간적 신호 패턴에 의해 특정된 세포 유형으로 결과된 뇌 광역의 신경 활동을 정확하게 가시화하는 ofMRI 기술의 능력을 입증했다.
고 공간 해상도와 어웨이크 스캐닝을 성취하는 ofMRI 기술의 개발로, PI의 실험실은 콜린성 뉴런과 특정하게 연관된 전체 뇌 네트워크 응답을 특성화하는 능력을 나타내는 예비 데이터를 갖는다. 정의된 시간적 패턴을 갖는 기부 전뇌의 콜린성 뉴런의 선택적 자극은 해마 부위를 포함하여 넓은 신경 활동을 끌어내는 것으로 타났다. 체내 종방향으로 추적하는 능력으로 네트워크 활동의 이런 직접적 기능적 가시화는 얼마나 다른 투여량과 치료 과정이 질병 진행시 시간 경과에 따라 각 개별의 동물에 영향을 미치는지를 모니터하는 데에 이용될 수 있다. 이것은 여러 시점에서 다수의 동물을 희생하는 것에 좌우하는 종래의 탈체 기술과 대비하는 것으로, 이는 함수의 대용 마커를 오직 얻으면서 변수, 비용 및 시간을 늘린다. 부가하여, 수동적인 생리적 기록 보다는 특정 경로에 대한 응답을 일으키는 능력은 시그널링을 기하급수적으로 더욱 양호하게 만든다.
전례없던 정밀도로 AD와 관련된 중요한 네트워크를 가시화하는 ofMRI의 능력을 보여주는 우리의 예비 연구 결과로, 우리는 이를 정량적인 약물 설계를 위한 플랫폼으로 만들것이다. AD에 연루된 주요한 신경 회로 소자와 연관된 네트워크를 관찰하는 능력으로, 우리는 양호한 전기 생리학적, 행동 및 해부상의 효능을 이미 나타낸 후보 약물을 투여할 것이다. 우리는 ofMRI 기본하는 치료상 효과의 관찰을 증명하는 것을 목표로 한다. AD 특성의 반전은 완전히 또는 부분적으로 효과적일 수 있고 우리는 질병의 진행과 약물 치료 동안 살아있는 동물의 뇌의 변화 위치를 직접 관찰할 수 있게 된다. 부가하여, 부작용은 문제시되는 질병에 관련되지 않은 뇌의 영역에서의 약물 투여의 결과 활동의 증가나 감소로 나타나게 된다.
실시예 G
이 제안은 알츠하이머 질병(AD)와 관련된 전체 뇌 동적 네트워크 변화의 가시화를 통해 약물 후보의 장차 임상적 효능과 부작용의 예측성을 제공하는 기술과 관련 방법을 제공한다.
우리의 방법은 광유전적 기능적 자기 공명 영상(ofMRI)으로 불리는 PI에 의해 최근에 개발된 기술을 이용한다(도 14). 광유전학은 단일 요소의 미생물 광 활성화된 막 횡단 도전 조정기를 밀리초 규모의 목표로 하는 체내 활동 변조를 가능하게 하기 위해 세포 유형에 특징적인 프로모터를 이용하여 특정 세포로 유도한다. Channelrhodopsin(ChR2)는 특히 ChR2를 표시하는 뉴런이 청색 광에의 노출시 높은 시간적 정밀도로 여기되게 한다ofMRI 기술은 광유전적 조절을 고 자기장 fMRI와 결합한 것이다. 초기 연구에서는, 정밀한 세포 유형에 근거한 fMRI 응답이 높은 시간적 정밀도로 뇌 전체에 걸쳐 측정될 수 있었다고 나타났다. 우리는 AD와 관련된 네트워크 기능 장애의 직접적, 종방향 계통적 평가를 가능하게 하기 위해 ofMRI의 개발을 제안하고, 이것은 AD 약물에 대해 정량적 스크리닝 및 체내 생이적 피드백에 이용되게 된다.
본원 발명의 다양한 양태는 다음을 목표로 한다:
목표 1: 정상의 생쥐의 콜린성 뉴런의 네트워크 기능을 평가한다. 진행성 콜린성 기저 전뇌(CBF) 신경 저하에 따른 아세틸콜린의 감소는 AD의 주요 특성 중 하나이다(도 30b). 이제까지, 이들 특성들은 작은 크기로 탈체 사후 연구로 국부적으로 관찰 및 정량화되었는데(도 30b), 이는 그 기능적 역할과 전체 시스템의 질병의 변화를 완전히 이해하는 것을 어렵게 만든다. ofMRI를 이용하여, 우리는 콜린성 뉴런과 연관된 네트워크 기능을 직접 가시화한다. 우리는 체내 전체 뇌 네트워크에서 콜린성 뉴런의 역할의 정량적 가시화가 이들의 정상 기능뿐만 아니라 종방향으로 따르는 동일한 생쥐의 AD와 연관된 시간적 변화를 정의하는 데에 있어 주요한 통찰을 제공한다는 것을 생각한다. 이 목표에서, 정상 기능을 조사하는 것을 시작한다.
콜린성 뉴런의 선택적 자극을 위해 두 전략이 이용된다. 콜린성 뉴런을 갖는 ChaT-CbR2 유전자 이식된 생쥐는 ChR2 및 Chat-Cre 유전자 이식된 생쥐를 (DIO) ChR2-EYFP 바이러스와 결합하여 선택적으로 표현한다. ChaT-ChR2 유전자 이식 생쥐에 대해, 광학 가이드는 목표 위치에서 청색 광 자극을 전달하도록 외과적으로 이식될 필요가 있다. Chat-Cre 유전자 이식 쥐에 대해, 수술은 광학적 이식 가이드의 이식에 부가하여, 콜린성 뉴런에 ChR2를 표시하기 위해서 바이러스성 주입을 포함할 필요가 있다. 이 목표를 위해, 우리는 MIT에서Guoping Feng박사로부터 최근에 얻은 ChaT-ChR2 생쥐를 이용한다. 그러나, 예비 연구는 Cre 의존성 AAV 바이러스 주입한 Chat-Cre 생쥐를 이용하여 행해졌다. Chat-Cre 생쥐는 바이러스성 표시가 실험 이전 보통 약 1달 선행 시간을 필요로 하기 때문에 콜린성 뉴런에 ChR2의 더욱 안정된 표시를 가능하게 하고 실험 시간을 단축하게 된다. 우리는 해마에 돌기한 것으로 알려진, 브로카의 의학적 중격 대각 선조(MSDBB)를 목표로 하는 광학 가이드를 6마리의 ChaT-CbR2 생쥐에게 외과적으로 이식한다. 이 영역은 기억 손상과 관련하여 AD에 연루된, 해마 영역에의 돌기를 갖는 중요한 해부상의 위치로 선택된다(도 31). 다음에, 수술에서 회복하는 3-4일 후에, ofMRI 의 비외과적인 체내 특성을 이용하여, 태어나서 3, 6, 9개월에 반복적으로 생쥐를 스캔한다. 청색 빛은 매 1분 마다 20초 동안 세타 및 감마 주파수 대역에서 광학적으로 자극하는 데에 이용된다. 이것은 통계학적인 중요성을 위해 6회 반복된다. 세타 및 감마 자극 주파수는 세타 및 감마 대역에서 AD 환자에 대해 변경된 세타 리듬에 기초하여 선택된다. ofMRI 실험 바로 이전에, 새로운 물체 인식 테스트가 또한 목표 2를 위한 조절 실험으로서 행해진다. ofMRI 및 행동 테스트가 완료된 후에, 로컬 필드 전위 및 스파이킹 활동의 체내 전기 생리학적 측정이 ofMRI 신호원을 확인하기 위해 ofMRI 활성 영역에서 실행된다. 다음에, 뇌는 이영양 신경돌기, 아밀로이드 플라크(amyloid plaques) 및 콜린성 신경 돌기에 대해 현미경 사진화된다. ChaT-Cre 생쥐를 이용하는 사전 연구에서, MSDBB에서 콜린성 뉴런은 광학 섬유 이식에 부가하여 종속 이전 바이러스성 주입을 이용하여 목표로 한다. 세타 및 감마 주파수에서 콜린성 뉴런의 자극으로, 우리는 감마 주파수에서 해마를 포함하는 광범위한 활동을 발견했다(도 32). 반대로, 세타 주파수 자극은 더 작은 영역과 관련됨을 나타낸다.
예측되는 결과: MSDBB에서 세타 및 감마 주파수에서 콜린성 뉴런의 선택적 자극으로부터 결과된 ofMRI 공간적 활동 맵 및 혈류 역학적 응답 함수(HRF) 는 AD에서 잠재적으로 변경된 주요한 통신 파트너를 나타낼 것이다. 행동 실험은 기억 손상의 어떠한 사인도 나타내지 않는다고 예측되고 우리는 현미경 사진에서는 어떠한 이상도 보지 않을 것으로 예측한다. 우리는 또한 ofMRI 및 행동 데이터가 3, 6, 9 개월에 걸쳐 일치한다고 예측하는데, 이것은 우리가 중요하다고 예측하지 않은 정상적인 노화로 인한 변경을 반영할 뿐이다.
목표 2: AD의 유전자 조작 생쥐 모델을 이용하여 AD에 대한 바이오 마커로 콜린성 자극에 대한 ofMRI 응답을 설정한다. 잘 특성화된 AD의 생쥐 모델, APPL/S는 정상 생쥐와 비교하여 ofMRI 응답의 차이를 연구하는 데에 이용된다. APPL/S 생쥐는 Thy1 프로모터 중인 인간의 아밀로이드 전조체 프로테인(APP)를 나타내고 AD에 대해 잘 설정된 동물 모델이다. Masliaha 실험실에서 개발된 이 동물 모델은 MTA 중에 우리에게 제공되고 이들은ChaT-ChR2 생쥐와 교배 번식된다.
우리는 목표 1에서와 같이 MSDBB를 목표로 하는 광학 가이드를 6마리의 ChaT-ChR2, APPL/S 이중 유전자 조작 생쥐에 외과적으로 이식한다. 다음에, 수술에서 회복하는 3-4일 후에, 우리는 생후 3, 6, 9 개월에 반복적으로 생쥐를 스캔한다. 자극 변수는 목표 1에서의 실험과 일치한다.
예측되는 결과: MSDBB에서 콜린성 뉴런의 자극으로부터 결과된 ofMRI 응답은 목표 1에서 측정된 바와 같이 정상 생쥐와 비교하여 AD의 동물 모델에서 변경된다. 콜린성 주파수 의존성 응답을 측정하는 ofMRI 증명된 능력으로(도 32), 진행중인 기능적 악화는 3, 6, 9개월에 측정될 때 여러 질병 상태에 걸쳐 양호한 감도로 수집되었다. 차이는 결과된 신경 활동의 타이밍을 반영하는 HRF의 활성화 체적 크기와 피크 시간에 대한 통계적 테스트를 통해 정량화된다. 새로운 물체 인식 테스트는 ofMRI 응답 변경과 상호 관련되는 진행중인 메모리 손실을 나타낸다. 행동 테스트는 도한 도 30d에서와 같이 목표 1에서 정상 쥐와의 차이에 대해 통계적으로 분석된다. 현미경 사진은 이영양 신경 돌기, 아밀로이드 플라크, 콜린성 신경 돌기의 길이, 체적 및 브랜칭의 감소의 점진적인 축척을 나타낸다.
목표 3. 유망한 약물 후보를 테스트하는 플랫폼으로 ofMRI 를 개발한다. AD에 유망한 약물 부호인, LM11A-31 (FIG. 30)는 치료 결과를 예상하고 평가하는 ofMRI의 능력을 테스트하는 데에 이용된다. p75 뉴트로핀 수용체(p75NTR)는 AD에 관한 다수의 기구와 관련된 소수의 특정 수용체 중 하나이고 그 기능을 변조하는 것은 중요한 치료 전략을 구성한다. 이전의 체외 연구는 저분자 p75NTR 리간드인, LM11A-31가 다수의 아밀로이드-P- 유도된 신경병성 기구를 방지한다는 것을 증명해준다. Longo 실험실에서의 최근의 연구는 APPL/S 유전자 이식 AD 생쥐 모델의 뉴런 기능 장애와 변질에 미치는 LM11A-31의 영향을 증명한다. 경구 투여 이후, LM11A-31는 혈액 뇌 장벽을 거치고 체외 신경 보호를 제공하기 위해 알려진 혈액 농도에 도달하는 것으로 알려졌다. LM11A-31은 AD 모델 생쥐로부터 얻은 해마 슬라이스제(도 32c)의 시냅틱 손상을 역전시키고 새로운 물제 인식(도 32d)와 Y-maze 성능의 결함을 방지한다. 더욱, LM11A-31는 아밀로이드 수준에 영향을 주지 않고, 기저 전뇌 및 해마(도 32a, b)에서의 콜린성 신경성 이영양을 방지한다. 이들 연구 결과는 p7SNTR가 AD에 대해 중요한 치료상의 목표로 작용하고, LM11A-31 또는 그 유도체는 신경병성 질병의 잠재적으로 적용한 어떤 화합물을 대표한다는 것을 보여준다. LM11A-31는 Longo 실험실에서 개발되었고 네트워크 기능의 변화를 가시화하여 약물의 효능을 정량적으로 기술하는 ofMRI의 능력을 테스트하기 위해 이 목표에 대해 이용될 것이다.
LM11A-31는 2개월에서 시작하여, 경구 공급으로 50mg/kg의 투여량으로 6마리의 ChaT-ChR2, APP s 이중 유전자 조작 생쥐에게 연속적으로 투여된다. 다음에, 우리는 이들에게 목표 2에서와 같이 광학 가이드를 외과적으로 이식한다. 수술후 회복 3-4일 후에, 우리는 생후 3, 6, 9개월에 반복하여 생쥐를 스캔한다. 자극 변수는 목표 1 및 2의 실험과 일치한다. ofMRI 실험 바로 이전에, 새로운 물체 인식 테스트가 메모리 손실의 변경을 특성화하기 위해 행해진다. ofMRI 및 행동 테스트가 완료된 후에, 목표 1과 일치하는 체내 전기 생리학적 측정이 행해진다. 다음에, 뇌는 이영양 신경돌기, 아밀로이드 플라크(amyloid plaques) 및 콜린성 신경 돌기에 대해 현미경 사진화된다
예측되는 결과: 치료는 목표 1과 비교하여 목표 2에서 보여지는 ofMRI 응답의 변경을 역전시킨다. 예를 들어, 편도체의 활동 증가와 같은 의도치 않은 변경이 분노 증가와 같은 부작용을 나타낼 수 있다. 종방향 모니터링 능력은 중요한 치료상의 시점 및 행동 결과에 관한 주요 기능적 요소를 설명해 준다. 이것은 다음에 더욱 개선된 약물 후보와 투여량 타이밍에 대한 디자인 피드백으로 작용하게 된다. 이런 과정은 AD 치료의 설계와 평가를 크게 가속화한다.
본원 발명의 특정 예시의 실시예에 대한 상기 설명은 설명과 기술의 목적을 위해 제시되었다. 이들은 빠뜨림없이 완전하다거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하고자 하는 것도 아니고, 상기 개시에 비추어서 많은 수정과 변형이 가능한 것은 명백하다. 예시의 실시예는 본 발명의 특정한 원리 및 이들의 실재적인 적용을 설명하기 위해 선택 및 서술되어, 당업자라면 본원 발명의 각종 예시의 실시예뿐만 아니라 이들의 대체예와 변형예를 실행하고 이용하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 영역은 여기에 첨부된 청구범위와 이들의 등가물에 의해 정의되는 것으로 한다.

Claims (21)

  1. 하나 이상의 첫번째 객체의 별개의 뇌 영역에서 광 발생부에 의해 뉴런의 광유전적 자극에 의한 다수의 별개 발작 유형을 생성하는 단계;
    각각의 다수의 별개의 발작 유형에 대하여 EEG 장비에 의해 별개의 뇌파(EEG) 서명 및 fMRI 장비에 의해 별개의 기능적 자기 공명 영상(fMRI)을 수득하는 단계;
    상기 별개의 뇌파 서명 및 별개의 기능적 자기 공명 영상에 기반하여 다수의 별개 모델을 생성하는 단계;
    두번째 객체에서 EEG 장비 및 fMRI 장비에 의해 첫번째 발작 이미지를 수득하는 단계; 및
    상기 다수의 별개 모델에 대한 상기 첫번째 발작 이미지의 비교를 통해 두번째 객체에서 발작 유형을 확인하는 단계;를 포함하며,
    상기 다수의 별개 모델을 생성하는 단계에서, 상기 다수의 별개 모델 각각은 다수의 별개 발작 유형에 대응하며, 다수의 별개 모델 각각은 별개 발작 유형의 발현 동안에 별개 뇌 활성화된 네트워크를 식별하는,
    정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 객체에서 발작을 생성하기 위해 광 생성부에 의해 피라미드 뉴런을 광유전적으로 자극하는 단계;
    다수의 발작 활성 위치를 그리기 위해 화상부에 의해 광 유전적 기능적 자기 공명 영상(ofMRI)을 사용하여 객체의 뇌 네트워크를 통해 발작 활성을 모니터링하는 단계;
    객체 뇌의 질병 상태 모델을 생성하기 위해 측정부에 의해 다수의 발작 활성 위치에서 국소장전위를 측정하는 단계; 및
    상기 발작에 대한 근원적인 뉴런 활성을 결정하기 위해 분류부에 의해 광 유전적 자극과 기능적 자기 공명 영상(fMRI)를 기초로 상기 질병 상태 모델을 분류하는 단계;를 포함하는 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 질병 상태 모델의 추가 조치를 취하는 단계를 더 포함하는 정상 및 질병 상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 추가 조치는 뇌파(EEG)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 질병 상태의 모델은 발작 모델인 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 질병 상태의 모델은 발작 동물 모델인 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 발작은 등쪽 CA1 자극, 중간 CA1 자극, 복부 CA1 자극 또는 서브이큘럼 자극 중 최소한 하나의 자극으로부터 발생되는 것을 특징으로하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  11. 제9항에 있어서, 신경 자극과 약물 디자인을 위한 발작의 동물 모델을 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  12. 객체에서 발작을 생성하기 위해 광 생성부에 의해 피라미드 뉴런을 광 유전적으로 자극하는 단계;
    다수의 발작 활성 위치를 그리기 위해 화상부에 의해 광 유전적 기능적 자기 공명 영상(ofMRI)으로 연결된 뇌 네트워크를 통하여 발작을 모니터링 하는 단계; 및
    다수의 발작 활성 위치에서 측정부에 의해 국소장 전위 를 측정하는 단계;를 포함하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 경로의 억제 중간 뉴런 또는 섬유의 직접적인 자극을 발생하지 않으면서 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 20Hz 이하의 주파수 자극을 활용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 6-10Hz의 주파수 자극을 활용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 20Hz의 주파수 자극에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 20-60Hz의 주파수 자극을 활용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 광 유전적으로 자극하는 단계는 40Hz 빛 자극으로 수행되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  19. 제12항에 있어서, 피라미드 뉴런을 자극하거나 억제하기 위해서 AAV5-CamKIIa-ChR2-EYFP 또는 AAV5-CamKIIa-NpHR-mCherry 중의 최소한 하나를 투입하는 단계; 및
    뉴런을 광 유전적으로 일으키기 위해 청색 및 노란색 빛 중 최소한 하나를 적용하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 청색 빛은 초당 1, 10, 60 또는 100 주기로 전달되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 청색 빛은 총 6분동안 매분 20초 동안 초당 1, 10, 60, 또는 100주기로 전달되는 것을 특징으로 하는 정상 및 질병상태에서 뇌 역동성을 모델링하기 위한 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230024667A (ko) 2021-08-12 2023-02-21 연세대학교 산학협력단 딥러닝 모델의 동적 뇌 연결성 추출을 통한 4D fMRI 자폐증 예측 및 조기 진단 방법 및 장치

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10029089B2 (en) 2010-10-15 2018-07-24 Research Foundation For The State University Of New York, The Compositions and methods for enhancing the biological response to chemical agents and physical stimuli
US10478639B2 (en) * 2011-09-09 2019-11-19 The Regents Of The University Of California In vivo visualization and control of patholigical changes in neural circuits
US20140343399A1 (en) * 2013-05-20 2014-11-20 Stefan Posse Seed-Based Connectivity Analysis in Functional MRI
WO2016090239A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Rush University Medical Center Electrode placement and treatment system and method of use thereof
KR20180090876A (ko) * 2015-12-09 2018-08-13 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 기능적 뇌 회로 분석법
JP6618154B2 (ja) * 2016-01-19 2019-12-11 国立大学法人大阪大学 てんかん発作判定装置およびてんかん発作検知装置
EP3235427A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-25 CodeBox Computerdienste GmbH Method and system for estimating a location of an epileptogenic zone of a mammalian brain
WO2018089806A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 The Johns Hopkins University Identifying the epileptogenic zone from nonseizure recordings using network fragility theory
RU2652898C1 (ru) * 2016-12-19 2018-05-03 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ исследования мозговой активности по данным фмрт
US10624588B2 (en) 2017-01-16 2020-04-21 General Electric Company System and method for predicting an excitation pattern of a deep brain stimulation
US10390766B2 (en) 2017-01-16 2019-08-27 General Electric Company System and method for predicting an excitation pattern of a deep brain stimulation
WO2019006199A1 (en) * 2017-06-28 2019-01-03 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs IRMF RECONSTRUCTION OF SPECIFIC BRAIN STATUS IMAGES FROM SLOW ANATOMICAL MRI IMAGE DATA
US11241575B1 (en) * 2017-09-05 2022-02-08 Kelly C.R. Bijanki Anxiolysis without sedation: awake craniotomy facilitated by continuous direct stimulation of cingulum bundle
US11723579B2 (en) 2017-09-19 2023-08-15 Neuroenhancement Lab, LLC Method and apparatus for neuroenhancement
WO2019064412A1 (ja) * 2017-09-28 2019-04-04 特定非営利活動法人ニューロクリアティブ研究会 行動解析装置、行動解析プログラム、行動解析システム
CN107669244B (zh) * 2017-10-27 2018-11-13 中国人民解放军国防科技大学 基于EEG-fMRI的癫痫异常放电位点定位系统
CA3082082A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Lvis Corporation Efficacy and/or therapeutic parameter recommendation using individual patient data and therapeutic brain network maps
US11717686B2 (en) 2017-12-04 2023-08-08 Neuroenhancement Lab, LLC Method and apparatus for neuroenhancement to facilitate learning and performance
US11273283B2 (en) 2017-12-31 2022-03-15 Neuroenhancement Lab, LLC Method and apparatus for neuroenhancement to enhance emotional response
US11364361B2 (en) 2018-04-20 2022-06-21 Neuroenhancement Lab, LLC System and method for inducing sleep by transplanting mental states
KR102170756B1 (ko) * 2018-08-01 2020-10-27 가톨릭대학교 산학협력단 이중 머신 러닝 모델을 이용한 데이터 분류 방법 및 장치
EP3849410A4 (en) 2018-09-14 2022-11-02 Neuroenhancement Lab, LLC SLEEP ENHANCEMENT SYSTEM AND METHOD
CN109364846B (zh) * 2018-10-16 2021-03-23 中子康(武汉)医药科技有限公司 电刺激增加生物分子量子能量共性技术的应用
CN109528197B (zh) * 2018-11-20 2022-07-08 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于脑功能图谱进行精神疾病的个体化预测方法和系统
KR102307479B1 (ko) * 2019-02-12 2021-09-30 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 신경전달물질 기반의 뇌 지도 작성 방법 및 뇌 지도를 이용하는 용도
US20220113288A1 (en) * 2019-02-12 2022-04-14 Neurovis Inc. Neurotransmitter-based brain mapping method and use of brain map
CN109965870B (zh) * 2019-02-27 2022-04-19 杭州诺为医疗技术有限公司 一种自动检测和刺激治疗癫痫的方法
US11786694B2 (en) 2019-05-24 2023-10-17 NeuroLight, Inc. Device, method, and app for facilitating sleep
KR20210015082A (ko) 2019-07-31 2021-02-10 강지애 통증 가시화 기기
KR20220070267A (ko) * 2019-09-25 2022-05-30 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 안와전두 피질에 대한 시상 입력은 gaba 및 불확대에 의해 매개된 광범한 뇌, 주파수-의존적 억제를 유도한다
CN114981818A (zh) * 2019-10-01 2022-08-30 小利兰·斯坦福大学董事会 联合动态因果建模和生物物理学建模以实现多尺度脑网络功能建模
WO2021067334A1 (en) * 2019-10-03 2021-04-08 Nsv, Inc. Automated process for controlling in vivo examination of the cervix and collecting image data related thereto
KR102502880B1 (ko) 2019-10-11 2023-02-23 연세대학교 산학협력단 베이지안 최대엔트로피모델 추정 및 뇌 기능 동적 특성 평가 방법
IL293445A (en) * 2019-12-06 2022-07-01 Univ Leland Stanford Junior Simulating single hippocampal seizures and the long-term effect of repeated seizures
CN113543015A (zh) * 2020-04-13 2021-10-22 华为技术有限公司 一种通信方法、装置及系统
CN112640847B (zh) * 2020-12-30 2022-12-13 重庆医科大学附属第一医院 一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法
CN113100780B (zh) * 2021-03-04 2022-07-26 北京大学 同步脑电-功能磁共振数据的自动化处理方法
CN113558635B (zh) * 2021-06-07 2023-09-19 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种神经性耳聋病人脑功能网络演化的评估方法
KR102475529B1 (ko) 2021-06-10 2022-12-08 경북대학교 산학협력단 복수의 자기공명영상 패러미터를 측정하는 자기공명영상 장치 및 그 동작 방법
CN113768519B (zh) * 2021-09-16 2023-12-26 天津大学 基于深度学习和静息态脑电数据分析病人意识水平的方法
US11694806B2 (en) * 2021-11-19 2023-07-04 Omniscient Neurotechnology Pty Limited Systems and methods for grouping brain parcellation data
CN113951835B (zh) * 2021-12-01 2024-02-13 复旦大学 一种基于光学断层重建策略的三维荧光显微成像方法
CN114246587A (zh) * 2021-12-22 2022-03-29 成都市第四人民医院 一种抑郁症研究检测方法
CN116487038B (zh) * 2023-06-25 2023-08-18 四川大学华西医院 轻度认知障碍向阿尔茨海默发展的预测系统和存储介质

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090088680A1 (en) * 2005-07-22 2009-04-02 Alexander Aravanis Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells
US20120165904A1 (en) * 2010-11-22 2012-06-28 Jin Hyung Lee Optogenetic magnetic resonance imaging

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040092809A1 (en) * 2002-07-26 2004-05-13 Neurion Inc. Methods for measurement and analysis of brain activity
WO2005117693A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Children's Medical Center Corporation Patient-specific seizure onset detection system
US20110307030A1 (en) * 2005-03-24 2011-12-15 Michael Sasha John Methods for Evaluating and Selecting Electrode Sites of a Brain Network to Treat Brain Disorders
US20090093403A1 (en) * 2007-03-01 2009-04-09 Feng Zhang Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells
EP2124734A2 (en) * 2007-01-25 2009-12-02 NeuroVista Corporation Methods and systems for measuring a subject's susceptibility to a seizure
MX2010005929A (es) * 2007-12-04 2010-06-15 Ge Healthcare Ltd Analisis de imagen.
US8337404B2 (en) * 2010-10-01 2012-12-25 Flint Hills Scientific, Llc Detecting, quantifying, and/or classifying seizures using multimodal data
JP5084554B2 (ja) 2008-02-27 2012-11-28 キヤノン株式会社 画像形成装置
ES2608498T3 (es) 2008-04-23 2017-04-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Sistemas, métodos y composiciones para la estimulación óptica de células diana
CA2724483C (en) * 2008-05-16 2018-01-02 Arbor Vita Corporation Psd-95 inhibitor for the treatment of epilepsy
EP2141506B1 (en) 2008-07-01 2019-04-03 The Regents of The University of California Identifying fiber tracts using magnetic resonance imaging (MRI)
US8666478B2 (en) * 2009-10-08 2014-03-04 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Method for determining locations of implanted electrodes with medical images
JP5866332B2 (ja) * 2010-03-17 2016-02-17 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 感光性イオンを通過させる分子
US9814885B2 (en) * 2010-04-27 2017-11-14 Medtronic, Inc. Stimulation electrode selection
US10568307B2 (en) * 2010-11-05 2020-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same
US9833144B2 (en) * 2011-01-07 2017-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Probes, methods of making probes, and methods of use
EP2720611B1 (en) * 2011-06-20 2016-04-20 The Regents of The University of California Neuron recording system

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090088680A1 (en) * 2005-07-22 2009-04-02 Alexander Aravanis Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells
US20120165904A1 (en) * 2010-11-22 2012-06-28 Jin Hyung Lee Optogenetic magnetic resonance imaging

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문, Tracing activity across the whole brain neural network with optogenetic functional magnetic resonance imaging , Frontiers in Neuroinformatics, vol. 5, (2011.01.01.)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230024667A (ko) 2021-08-12 2023-02-21 연세대학교 산학협력단 딥러닝 모델의 동적 뇌 연결성 추출을 통한 4D fMRI 자폐증 예측 및 조기 진단 방법 및 장치

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WO2014121146A1 (en) 2014-08-07
CN111297360A (zh) 2020-06-19

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