JP2016509854A - たばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを低減するための方法 - Google Patents

Abstract

本書にはたばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKの量を低減する方法が説明されており、その方法は、（a）少なくとも基質結合型NNKを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、（c）液体または蒸気の存在下で、たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約110度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から基質結合型NNKの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）工程（c）に次いで、たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、（e）工程（b）および（d）で得られる基質結合型NNKのレベルを随意に比較する工程と、（f）たばこ材料から少なくとも基質結合型NNKが除去されたたばこ材料を特定する工程とを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、たばこ材料中の、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン（NNK）を含めた、一つ以上の種類のタバコ特異的ニトロソアミンの量を低減するための方法に関連する。前記方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料を含むたばこ製品についても説明している。

たばこ製品の製造および加工中には、製造プロセス（ステミング、熟成、混合、切断、乾燥、冷却、スクリーニング、成形および包装を含む）中に生じるたばこの茎、くず葉、およびたばこダストなどの副産物が生じ、これらを再生利用してそれらの有用なたばこ内容物を再生することができる。例えば、製造プロセスから出るたばこの茎およびたばこの微粉は、たばこ製品の製造に直接使用するには不適切である。茎および微粉は原料投資のうちかなりの量を占めるために、これらの茎および微粉をさらに再構成たばこシートなどの製品に変化させて、その後、容認できる加工済みたばこ葉との混合物中で比較的大きな量を利用可能にするプロセスが開発されてきた。再構成たばこは、スラリーまたはキャストシートのプロセスで製造できるが、このプロセスではドロドロにしたたばこの茎およびたばこ葉のその他の部分のパルプはすりつぶされて、異なる添加物を含むこともある溶液と混合される。結果として生じるたばこスラリーがこの後、スプレーされて薄い膜を形成し、乾燥され、圧延され、細片に角切りにされて、これがフィラーに追加される。

ニトロソアミンは、たばこ、食品および化粧品など、数多くの消費者製品に見られる有機化合物である。ニトロソアミンは、この部類の化合物の一部では実験動物で発がん性が示されてきたため、強い学術的関心を引いてきた。空気乾燥および熱風送管乾燥処理済みのたばこは、無煙たばこ、紙巻たばこの主流煙および副流煙に含まれていることのある、タバコ特異的ニトロソアミンを含むことが報告されている。たばこ中では、4種のニトロソアミンがかなりの量で生成される。これらは、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン（NNK）、N-ニトロソノルニコチン（NNN）、N-ニトロソアナタビン（NAT）、およびN-ニトロソアナバシン（NAB）である。成長中の植物体または新鮮な刻みたばこ（未乾燥たばこ）中にタバコ特異的ニトロソアミンが有意な量で存在するとは考えられていないが、乾燥処理プロセス中に形成されることがある。未乾燥葉の乾燥処理プロセス中のタバコ特異的ニトロソアミンの形成に加えて、タバコ特異的ニトロソアミンは、再構成たばこを準備するために使用されるプロセスなど、水溶性のたばこスラリーを準備するのに使用されるプロセス中に形成されることもある。

タバコ特異的ニトロソアミンを減少させる試みにおいて、放射線処理、化学的処理および抽出を含めた、植物体または収穫済みのたばこの葉の様々な処理が提案されてきた。タバコ特異的ニトロソアミンを低減するためのその他の方法が、MacKown et al.（1988）J. Agric. Food Chem. 36、1031-1035によって提案されてきた。これらの方法には、再構成たばこシートの製造時に、滅菌、微生物阻害剤、pHを増やすための塩基類、またはタバコ特異的ニトロソアミンの蓄積を減らすためのアスコルビン酸を使用した処理が関与する。WO2012160133号では、特にニトロソアミンのレベルが高い原因が亜硝酸レベルの増加であるときに、そのpH値を増やすことにより、たばこホモジネート中のタバコ特異的ニトロソアミンのレベルを下げるためのプロセスが説明されている。

たばこ中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンのレベルを低減させる試みにおける一つの問題は、空気乾燥したたばこ（NNKを含む）中の一部のニトロソアミンが基質結合型の形態で存在することである。例えば、バーレー種のベースウェブ（すなわち、水抽出したバーレー種繊維）の煙は、元のたばこの煙に見られるNNKの70%を含み、一方でNNNおよびNATのレベルは95%以上低減される（Haut, S. A., Lambert, E. A., 1988, The Determination of TSNA in Fillers from the Crossed Soluble/Baseweb Study. Legacy Tobacco Documents Library）。基質結合型NNKは、水洗いしたバーレー種フィラーから0.1N KOH溶液を用いて抽出できる。このアルカリ処理はまた煙中のNNKレベルも低下させる（Keene, C.K., 1992, The Effect of Base Digestion on TSNA in Extractables-Depleted Fillers. Legacy Tobacco Documents）。ただし、処理によって毒物学的に関連性のある化合物がたばこに導入されることがあり、たばこの質が著しく低下する。基質結合型の形態は、pH中性の水溶性の抽出方法を使用して簡単には溶解できない。

タバコ特異的ニトロソアミン、特に、たばこの処理時に形成され、かつ基質結合型の形態であるタバコ特異的ニトロソアミン（NNKを含む）を低減するための効果的かつ費用効果の高い方法に対する必要性が依然として残る。

本発明は、少なくとも部分的には、たばこおよびたばこ由来の材料を100℃より高い温度に加熱することで、タバコ特異的ニトロソアミン（基質結合型タバコ特異的ニトロソアミンを含み、適切には基質結合型NNK）が放出されうるという、驚くべき発見に基づくものである。一般的に、加熱工程は水または蒸気などの液体の存在下で実施される。一定の実施形態で、水のみ、例えば蒸気の形態の加熱水が使用される。放出される基質結合型タバコ特異的ニトロソアミン（基質結合型NNKを含む）は洗浄によって簡単に除去することができ、これが結果的に、タバコ特異的ニトロソアミンの含量、濃度または量が未処理の出発物質よりも少ないたばこ材料となりうる。これはまた、エアロゾル（煙を含む）中のタバコ特異的ニトロソアミン濃度が未処理の出発物質よりも低くなるたばこ材料にもつながりうる。従って、加熱によって放出される同一の基質結合型NNKも喫煙中にエアロゾルに転換される。有利なことに、この方法は数多くの種類の異なるたばこ材料、また特に高いタバコ特異的ニトロソアミン値を持つたばこ材料に適用できる。特に、本方法は、ある一定のたばこプロセスで使用される茎または繊維を含む、たばこ特異性の高いニトロソアミンの低値の物質に適用できる。水または有機溶剤を100℃より低い温度で使用するその他の方法とは対照的に、提案されているプロセスは、たばこの不溶性の高分子基質に結合されたタバコ特異的ニトロソアミンを除去できる。また、本方法は、一定の実施形態で何ら添加物を使用することなく達成できること、またそれによって何ら追加的な毒物学的に関連性のある化合物がたばこに導入されないことが有利である。本開示の一つの一般的物体は、喫煙またはその他の手段での消費が意図されたたばこ中のニトロソアミン（NNKを含む）の含量を実質的に除去、低下または減少させる。別の一般的物体は、紙巻たばこ、葉巻たばこ、噛みたばこ、嗅ぎたばこおよびゴムおよびトローチ剤を含むたばこを含めた、たばこ製品による発がんの潜在性を減少させる。さらに別の一般的物体は、たばこ製品中のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKを含む）の量を実質的に除去、低減または減少させる。別の一般的物体は、完全に乾燥処理されたたばこ中のタバコ特異的ニトロソアミンの含量を減少させる。別の一般的物体は、エアロゾル（煙を含む）中のタバコ特異的ニトロソアミンの含量を減少させる。本開示のなおも別の物体は、実質的に少なめの量のタバコ特異的ニトロソアミンを含むヒトの消費に適したたばこ製品を提供することによって、たばこを喫煙、消費またはその他何らかの形で摂取するヒト中での一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKを含む）およびその代謝産物の含量を減少させ、それによりこうした製品による発がんの潜在性を低下させる。

第一の態様で、たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKの量を低減する方法が提供されているが、この方法は、（a）少なくとも基質結合型NNKを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、（c）液体または蒸気の存在下で、たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度または摂氏約110度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から基質結合型NNKの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）工程（c）に次いで、たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、（e）工程（b）および（d）で得られる基質結合型NNKのレベルを随意に比較する工程と、（f）たばこ材料から少なくとも基質結合型NNKが放出または除去されたたばこ材料を特定する工程とを含む。

一つの実施形態で、本方法は、工程（c）の前にたばこ材料を第一の水溶液または溶媒で洗浄する工程と、工程（c）の後でたばこ材料を第二の水溶液または溶媒を洗浄する工程といったさらなる工程を含む。

一つの実施形態で、工程（a）で供給されたたばこ材料は工程（c）の前に第一の水溶液または溶媒と接触する。

一つの実施形態で、基質結合型NNKは、第二の水溶液または溶媒を用いた1回以上の洗浄によって試料から除去される。

一つの実施形態で、第一および／または第二の水溶液または溶媒は、同一であるかまたは異なる。

一つの実施形態で、方法は、工程（a）と（b）の間に、たばこ材料を第一の水溶液または溶媒と組み合わせるといったさらなる工程を含みうる。これによって混合物が形成できる。

一つの実施形態で、工程（a）で加熱されるたばこ材料は水溶液または溶媒と接触する。例えば、たばこ材料は湿らせたかまたは湿ったものとしうる。例えば、たばこ材料は、少なくとも5%（w/v）の水性混合液（水溶液または懸濁液など）の形態としうる。

一つの実施形態で、工程（b）はたばこ材料を含む水性混合液の加熱を含む。一つの実施形態で、NNKの少なくとも一部は当初、たばこ材料中で不溶性たばこ基質に結合されており、加熱工程（b）でNNKの少なくとも一部が不溶性たばこ基質から放出される。

一つの実施形態で、方法はさらに、（c）放出されたNNKの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程を含む。一つの実施形態で、NNKは、第二の水溶液または溶媒を用いた1回以上の洗浄によって試料から放出される。

一つの実施形態で、工程（a）で供給されたたばこ材料は使用前に第一の水溶液または溶媒と接触する。

一つの実施形態で、水溶液は溶剤である。

一つの実施形態で、たばこ材料は、たばこ葉および／またはたばこの茎および/またはたばこダストおよび／またはたばこ葉プライムラミナ片、またはそのうち2つ以上の組み合わせで構成される群から選択される。

一つの実施形態で、たばこ材料は水または水から生成された蒸気の存在下で加熱される。

別の実施形態で、たばこ材料は水、蒸気または水と蒸気の両方の存在下で加熱される。

別の実施形態で、たばこ材料は加圧された水および／または蒸気の存在下で加熱される。模範的な圧力レベルは、約1〜少なくとも約40 psi、約5〜少なくとも約40 psiおよび10〜少なくとも約40 psiである。

別の実施形態で、たばこ材料は加圧飽和蒸気を用いて加熱される。

別の実施形態で、たばこ材料は過熱蒸気を用いて加熱される。

さらなる態様において、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料が提供されている。

さらなる態様において、不溶性たばこ基質中に約2400ng/g未満のNNKと、少なくとも約1000 ng/gの遊離型NNKを含む（処理済みまたは加工済み）たばこ材料が提供されている。

さらなる態様において、基質結合型NNKの量または濃度が、未処理または加工前のたばこ材料と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%だけ低い（処理済みまたは加工済み）たばこ材料が提供されている。

さらなる態様において、エアロゾル中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量または濃度を低減するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（b）によるたばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む。得られたエアロゾルは、少なくとも工程（b）を経ていない対照たばこ材料からのエアロゾルと比較して低いレベルのNNKを持つことが適切である。

さらなる態様において、エアロゾル中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量または濃度を低減するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（b）によるたばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む。得られたエアロゾルは、少なくとも工程（b）を経ていない対照たばこ材料からのエアロゾルと比較して低いレベルのNNKを持つことが適切である。

さらなる態様において、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるエアロゾルが提供されている。

さらなる態様において、再構成たばこを製造するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）工程（b）によるたばこ材料を水溶液または溶媒で洗浄して、たばこ材料からタバコ特異的ニトロソアミンを放出させる工程と、（d）工程（c）で得られたたばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、（d）随意に再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

さらなる態様において、再構成たばこを製造するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ繊維を水溶性材料から分離することにより、前記たばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、（c）分離した繊維を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏100度まで加熱して、分離した繊維の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）繊維を水溶液または溶媒で洗浄する工程と、（e）繊維および水溶性材料を再び組み合わせて再構成たばこシートを形成する工程と、および（f）随意に再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

さらなる態様において、再構成たばこを製造するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）たばこ材料を一つ以上のシートに成形する工程と、（e）キャストシートを乾燥させる工程と、（f）随意にシートをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

さらなる態様において、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができる再構成たばこが提供されている。

さらなる態様において、たばこカットフィラーとして使用するためのたばこを準備するための方法が提供されているが、その方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料（たばこの茎など）を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）たばこ材料を圧延して切断する工程とを含む。

さらなる態様において、圧延したたばこの茎を含むカットフィラーを製造する方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこの茎を供給する工程と、（b）液体または蒸気の存在下でたばこの茎を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度まで加熱して、たばこの茎の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこの茎から除去する工程と、（d）処理済みの茎を少なくとも一つの種類のたばこラミナ、エクスパンデッドたばこ［膨化たばこ（expanded tobacco）］または再構成たばこと混合する工程と、（e）カットフィラーを製造する工程とを含む。

さらなる態様において、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができる、たばこカットフィラーが提供されている。

さらなる態様において、たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKの量を低減する方法が提供されているが、この方法は、（a）少なくとも基質結合型NNKを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を第一の水溶液または溶媒で洗浄する工程と、（c）液体または蒸気の存在下でたばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度または摂氏約110度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から基質結合型NNKの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）工程（c）からのたばこ材料を第二の水溶液で洗浄する工程と、（e）少なくとも基質結合型NNKをたばこ材料から除去または放出させる工程とを含む。上記のそれぞれの実施形態は、本発明のそれぞれの態様の実施形態として開示されている。一つまたはそれ以上の実施形態の組み合わせが意図されている。

図1は、選択したたばこ試料中の遊離型および基質結合型NNKの濃度を示す。 図2は、本開示の実施形態の一つによる水洗いしたバーレー種の茎からのオートクレーブ処理によるNNKの放出を示す。 図3は、本開示の実施形態の一つによる3R4Fフィラーからのオートクレーブ処理によるNNKの放出を示す。 図4は、本開示の実施形態の一つによるバーレー種の茎内の遊離型および結合型NNKのオートクレーブ処理および洗浄に対する効果を示す。 図5は、グラスウールおよび試験対象のたばこ材料で充填させたパスツールピペットの先端にある熱電対を使用して決定した高温で、洗浄したバーレー種の茎または洗浄−オートクレーブ処理−洗浄したバーレー種の茎からのNNK、NNNおよびニコチンの放出を示す。

［定義］
本明細書の範囲内で使用される技術的な用語および表現には一般に、植物体および分子生物学の関連分野でそれらに共通して適用される意味が与えられる。以下の用語の定義はどれも、本明細書の全内容に適用される。「含む、備える（comprising）」という語は、それ以外の要素または工程を除外するものではなく、また不定冠詞「a」もしくは「an」は、複数であることを除外するものではない。ある一つの工程が、請求の範囲に列挙された複数の特徴の機能を実現することもある。属性または値に関連した「実質的に」、「約」、「およそ」およびこれに類する用語はまた、特に、それぞれ厳密な意味でその属性を、または厳密な意味でその値を定義付ける。所定の数値または範囲の文脈での「約」という用語は、所定の値または範囲の20%以内、10%以内、または5%以内である値または範囲を意味する。

「減少させる」、「減少させた」、「抑制する」または「抑制された」という用語は本明細書で使用されるとき、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または最大100%までの量の低減を含む。

「少なくとも一部」という用語は本明細書で使用されるとき、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の量を含む。

「たばこ材料」という用語は、たばこ植物体の任意の部分または異なる植物体の混合物を意味し、これには、たばこ葉くず、未加工のたばこくず葉、たばこの茎、たばこの処理中に生成されたたばこダスト、およびたばこ葉プライムラミナ片およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。たばこ材料は、加工済みのたばこの部分または断片の形態、本質的に天然のラミナまたは茎の形態の乾燥・熟成させたたばこ、たばこ抽出物または上記の混合物を持ちうるが、これには例えば、抽出したたばこパルプと粒状化して乾燥・熟成した天然たばこラミナを組み合わせた混合物がある。たばこ材料は、固体の形態、液体の形態、半流動性の形態、またはこれに類するものとしうる。たばこ材料は、均質化が施されたたばこホモジネートの形態とし、これには切断および粉砕が含まれるが、これに限定されない。たばこホモジネートは、均質化が施された植物体全体から、または植物の成分（茎および葉の混合物など）の混合物から準備しうる。たばこ材料は、たばこスラリーの形態としうるが、これには、たばこ材料の懸濁液、または水溶液または溶媒中のたばこホモジネートが含まれる。スラリーは、水溶液または溶媒中に5%（w/v）、10%（w/v）、15%（w/v）、20%（w/v）または25%（w/v）またはそれ以上のたばこを混合した物としうる。

「たばこ製品」という用語は、喫煙物品または喫煙に適した物品、および無煙たばこ製品を含む。

「遊離型ニトロソアミン」という用語、またはその文法的な変形は、本明細書で使用されるとき、たばこの抽出物中で計算されたニトロソアミン濃度を意味する。

「総ニトロソアミン」という用語、またはその文法的な変形は、本明細書で使用されるとき、抽出混合物に本明細書に記載した方法（例えば、約130℃まで約4時間の加熱によるなど）を施した後で計算されたニトロソアミン濃度を意味する。

「結合型ニトロソアミン」または「基質結合型ニトロソアミン」という用語、またはその文法的な変形は、本明細書で使用されるとき、「総ニトロソアミン」濃度と「遊離型ニトロソアミン」濃度の差を表す。

［詳細な説明］
本発明は、ヒトによる消費が意図される収穫済みたばこの処理に適用される。一般的に、本方法は、タバコ特異的ニトロソアミン（NNKを含む）を含む、いかなる形態のたばこ材料にも適用できる。タバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部が不溶性たばこ基質に結合していることが適切である。NNKの少なくとも一部が不溶性たばこ基質に結合していることが適切である。遊離型ニトロソアミンおよび不溶性たばこ基質に結合しているニトロソアミンを測定する方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。簡単に言えば、たばこ試料のアリコートが抽出され、それに含まれるニトロソアミン含量が超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量（UPLC-MS/MS）を用いて分析される。一般に、定量化しているニトロソアミンに対応する一つ以上の標準が、そのたばこ試料のアリコートに組み込まれる。抽出物から計算した試料の濃度は、試料中の「遊離型NNK」濃度に対応する。抽出混合物を本明細書に記載した方法（例えば、約130℃まで約4 時間加熱することによる）に従い処理した後、ニトロソアミン濃度を再びUPLC-MS/MSで測定する。これらの値から、試料中の「総NNK」濃度を計算できる。「結合型NNK」濃度は、「総NNK」濃度と「遊離型NNK」濃度の差である。数多くの研究が、たばこについて、特にタバコ特異的ニトロソアミンに関連して実施されてきた。収穫されたばかりのたばこの葉は「未乾燥たばこ」といい、公知の発がん性物質は含まれていないと考えられるが、未乾燥たばこはヒトによる消費には適していない。未乾燥たばこを乾燥処理するプロセスは、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バージニア・フルー（ブライト）種たばこは一般に熱風送管乾燥処理がなされ、バーレー種およびある種のダーク・ストレインは通常は空気乾燥処理がなされる。たばこの熱風送管乾燥処理は一般に5〜7日の期間にわたり行われ、空気乾燥処理は1〜2カ月にわたり行われる。数多くの主要な化学変化および生化学変化は、乾燥処理プロセス中に始まり、葉の乾燥の初期段階を通して継続される。たばこの黄色から褐色への転換は一般に、ニトロソアミンの形成および著しい蓄積をもたらし、微生物の含量が増加する。タバコ特異的ニトロソアミンが形成される正確なメカニズムは明らかではないが、乾燥処理プロセス中の亜硝酸塩の生成において微生物による硝酸塩レダクターゼが関与する微生物活性によって促進されると考えられている。

一つの実施形態によれば、本発明は、たばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンのレベル、量または濃度を低減するための方法を提供する。別の実施形態によれば、本発明はたばこ材料中の少なくともNNKのレベル、量または濃度を低減するための方法を提供する。一つの実施形態によれば、本発明は、不溶性の基質に結合されたたばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKなど）のレベル、量または濃度を低減するための方法を提供する。

一態様において、たばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量を低減するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）随意にたばこ材料を第一の水溶液または溶媒と組み合わせる（例えば、混合する）工程と、（c）液体または蒸気の存在下で、たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度または摂氏約101度よりも高い温度に加熱して、タバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料の不溶性たばこ基質から放出させる工程を含む。一つの実施形態で、工程（c）で加熱されるたばこ材料は、湿らせたものかまたは湿ったものである。例えば、たばこ材料は少なくとも5%（w/v）の混合液の形態としうる。一つの実施形態で、工程（c）は工程（b）からのたばこ材料を含む混合液の加熱を含む。放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を、1回以上の洗浄工程によりたばこ材料から放出しうる。本方法は、たばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの総量を低減できる。上述の通り、タバコ特異的ニトロソアミンは、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン（NNK）、N-ニトロソノルニコチン（NNN）、N-ニトロソアナタビン（NAT）、およびN-ニトロソアナバシン（NAB）を含む。本方法は、たばこ材料中の少なくともNNKの総量を低減できる。本方法は、たばこ材料中の不溶性の基質に結合された一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの総量を低減できる。本方法は、たばこ材料中の不溶性の基質に結合された少なくともNNKの総量を低減できる。

一つの実施形態で、たばこ材料は再構成たばこ（再構成たばこ（葉）シートなど）の準備に使用できる。これらのシートは、再生利用したたばこ微粉、たばこの茎および「クラスたばこ」（たばこの加工の任意の段階で収集される一般的に大きさが30メッシュ未満のたばこ粒子）から製造できる紙様の材料である。再構成たばこは、たばこ副産物中の溶解可能な化学物質を抽出し、抽出から残ったたばこ繊維を紙に加工し、濃縮された形態の抽出材料を紙上に再塗布することにより製造できる。

こうして、一態様において、再構成たばこを製造するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（c）で得られたたばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、（e）随意に再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

さらなる態様において、再構成たばこを製造するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）随意にたばこ材料を第一の水溶液または溶媒と組み合わせる工程と、（c）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（e）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（f）たばこ材料を一つ以上のシートに成形する工程と、（g）キャストシートを乾燥させる工程と、（h）随意にシートをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

一つの実施形態で、たばこ材料は、乾燥処理したたばこ材料を含むか、またはそれにより構成されるか、または実質的にそれにより構成される。たばこの葉、特に未乾燥たばこの葉を乾燥処理するプロセスは、当業者に公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるが、これに限定はされない。たばこ材料を乾燥処理するプロセスは、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バージニア・フルー（ブライト）種たばこは一般に熱風送管乾燥処理がなされ、バーレー種およびある種のダーク・ストレインは通常は空気乾燥処理がなされ、パイプたばこ、噛みたばこ、および嗅ぎたばこは普通は火力乾燥処理がなされる。任意の種類のたばこからのたばこ材料を使用しうるが、ある一定の種類のたばこが好ましい。特に好ましいたばこ材料は、熱風送管乾燥、トルコ種、バーレー種、バージニア種、メリーランド種、オリエンタル種、またはそのうち任意の2つ以上の組み合わせから構成される群から選択される。たばこ材料の形状は制限されない。均質化したたばこ材料の形態でもよい。挽いたたばこ材料の形態でもよい。細かく挽いたたばこ材料の形態でもよい。細かく挽いたたばこ材料は一般に、約30〜600ミクロンの微粒子サイズを持つ。細かく挽いたたばこ材料は、たばこ製品の製造で公知の任意のプロセスから、これらのプロセスの偶発的な副産物として得られることも、または研磨技術（衝撃粉砕およびローラー粉砕を含む）など、さらなるサイズの低減プロセスによって得られることもある。たばこホモジネート（乾燥処理済みたばこホモジネートなどであるが、これに限定されない）は、当該技術分野において公知の各種方法を使用してたばこ材料から準備しうるが、例えば、たばこは、細断、粉砕、粒状化、微粒化、または粉末化された形態としうる。たばこは、平均微粒子サイズがいわゆる「細刻み」たばこ製品に使用される、細断されたたばこの部分または断片のそれよりも小さい部分または断片の形態で採用しうる。たばこが非常に細かく分割されたたばこ微粒子または断片に形成される場合には、約18 Tylerメッシュ、約20 Tylerメッシュ、約50 Tylerメッシュ、約60 Tylerメッシュ、約100 Tylerメッシュ、または約200 Tylerメッシュまたはそれ以上のスクリーンを通過するサイズとしうる。希望に応じて、異なるサイズのたばこホモジネートを混ぜ合わせうる。たばこホモジネートは、粉砕、ミリング、またはこれに類する装置や技術を使用して、粉末タイプの形態に粉砕または微粉砕されることが適切である。ハンマミル、カッターヘッド、空気制御ミル、またはこれに類するものなどの装置を使用する粉砕またはミリング中は、たばこは比較的乾燥した形態であることが適している。例えば、たばこの部分または断片は、その含水量が約15重量パーセント未満〜約5重量パーセント未満であるときに粉砕またはミリングしうる。たばこ材料は、たばこの葉の部分（ラミナおよび茎、またはたばこの茎、たばこの葉およびたばこダストなど）を用いて形成しうる。

使用の前に、たばこ材料は、随意に前洗いをしたり、または第一の水溶液または溶媒と接触させたりすることができる。一定の実施形態で、第一の水溶液は水を含む無毒性水溶液である。一定の実施形態で、第一の水溶液は水のみである。一定の実施形態で、第一の水溶液は、緩衝液または緩衝液を含む無毒性水溶液である。緩衝液が使用される場合には、一般的に、少なくとも約pH 5.0、pH 6.0またはpH 7.0またはそれ以上など、望ましいpHとされる。第一の水溶液または溶媒は、たばこ材料と組み合わせたとき、または混合したとき、例えば、5%（w/v）、10%（w/v）、15%（w/v）、20%（w/v）、25%（w/v）、30%（w/v）、35%（w/v）、40%（w/v）または45%（w/v）またはそれ以上の混合物としうる。一定の実施形態で、たばこ材料と水溶液または溶媒の比が1:5または1:10の混合物が使用される。一定の実施形態で、前洗いの工程は、少なくとも約5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、60分、90分、120分、150分または180分またはそれ以上の間、およそ室温で実施される。一定の実施形態で、前洗いの工程は、およそ室温で、または摂氏約20度、摂氏約30度、摂氏約40度、摂氏約50度、摂氏約60度、摂氏約80度、または摂氏約90度またはそれより高い温度など、室温よりも高い温度または低い温度で実施される。一定の実施形態で、前洗いの工程は、物理的撹拌、および／または高い温度および／または厳しい物理的撹拌など、より厳密性の高い洗浄条件の存在下で実施できる。より厳密性の高い洗浄条件は、総タバコ特異的ニトロソアミン含量をさらに減少させうると考えらえる。

たばこ材料は、水溶液または溶媒と組み合わせて混合物を形成できる。水溶液または溶媒は、前洗いまたは接触の工程で使用される第一の水溶液または溶媒と同一でも異なるものでもよい。たばこ材料は、たばこスラリーまたは乾燥処理したたばこスラリーを形成するために使用できる。たばこスラリーは、たばこ材料（ホモジネートまたは粉砕たばこ材料を含む）を水溶液または溶媒と混合することにより準備できる。水溶液または溶媒がいかなる追加的な毒物学的に関連がある粉砕性化合物をたばこに導入しないことは本発明の利点ではあるが、水溶液または溶媒の正確な種類または性質に制限はない。こうして、水溶液または溶媒は一般的に、処理プロセスで使用される濃度で人の健康に対して毒性はないものとなる。一定の実施形態で、水溶液は水を含む無毒性水溶液である。一定の実施形態で、水溶液は緩衝液または緩衝液を含む無毒性水溶液である。緩衝液が使用される場合には、少なくともpH 6.0またはpH 7.0またはそれ以上などが望ましいpHとされる。水溶液または溶媒は、たばこ材料と組み合わせたとき、例えば、5%（w/v）、10%（w/v）、15%（w/v）、20%（w/v）、25%（w/v）、30%（w/v）、35%（w/v）、40%（w/v）または45%（w/v）またはそれ以上の混合物としうる。

本方法のさらなる工程で、たばこ材料は、少なくとも約10秒、20秒、30秒、40秒、50秒または1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、11分、12分、13分、14分、15分、16分、17分、18分、19分、20分、25分、30分、40分、45分、50分、60分または2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、または8時間またはそれ以上の間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、NNKの少なくとも一部を不溶性たばこ基質からたばこ材料に放出させることができる。一般的に、加熱工程は、摂氏約100度よりも高い温度で蒸気となり、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させることができる液体の存在下で実施される。加熱されるたばこ材料は加熱前に湿らせるかまたは湿っていることが適切である。例えば、たばこ材料は少なくとも5%（w/v）の混合液の形態としうる。たばこ材料は、本明細書で説明した混合物の形態であること、およびこの混合物は、少なくとも約10秒、20秒、30秒、40秒、50秒または1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、11分、12分、13分、14分、15分、16分、17分、18分、19分、20分、25分、30分、40分、45分、50分、60分または2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、または8時間またはそれより長い時間またはそれ以上の間、本明細書で説明した摂氏約100度よりも高い温度または本明細書で説明した摂氏約200度よりも高い温度に加熱して、NNKの少なくとも一部を不溶性たばこ基質からたばこ材料に放出させることが適切である。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約10秒、20秒、30秒、40秒、50秒または1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、11分、12分、13分、14分、15分、16分、17分、18分、19分、20分、25分、30分、40分、45分、50分、60分または2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、または8時間またはそれ以上の間、摂氏約100度よりも高い温度まで加熱して、一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKなど）の少なくとも一部を、不溶性たばこ基質からたばこ材料に放出させることができる。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約1分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約5分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約10分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約45分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約60分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約90分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約120分間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱される。

たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約101度、102度、103度、104度、105度、106度、107度、108度、109度または110度以上としうる。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約115度、120度、125度、130度、135度、140度、145度、150度、155度、160度、165度、170度、175度、180度、185度、190度、195度または200度以上としうる。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、ある温度範囲内としうる。一例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約101〜200度、摂氏約101〜190度、摂氏約101〜180度、摂氏約101〜170度、摂氏約101〜160度、摂氏約101〜150度、摂氏約101〜140度、摂氏約101〜130度、摂氏約101〜120度、または摂氏約101〜110度、摂氏約101〜120度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜200度、摂氏約120〜200度、摂氏約130〜200度、摂氏約140〜200度、摂氏約150〜200度、摂氏約160〜200度、摂氏約170〜200度、摂氏約180〜200度または摂氏約190〜200度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜190度、摂氏約120〜190度、摂氏約130〜190度、摂氏約140〜190度、摂氏約150〜190度、摂氏約160〜190度、摂氏約170〜190度、または摂氏約180〜190度または摂氏約190〜200度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜180度、摂氏約120〜180度、摂氏約130〜180度、摂氏約140〜180度、摂氏約150〜180度、摂氏約160〜180度、または摂氏約170〜180度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜170度、摂氏約120〜170度、摂氏約130〜170度、摂氏約140〜170度、摂氏約150〜170度、または摂氏約160〜170度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜160度、摂氏約120〜160度、摂氏約130〜160度、摂氏約140〜160度、または摂氏約150〜160度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜150度、摂氏約120〜150度、摂氏約130〜150度、または摂氏約140〜150度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜140度、摂氏約120〜140度、または摂氏約130〜140度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約110〜130度、摂氏約110〜120度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約101〜140度、摂氏約105〜140度、摂氏約110〜140度、摂氏約115〜140度、摂氏約120〜140度、摂氏約125〜140度、摂氏約130〜140度または摂氏約135〜140度の範囲内としうる。さらなる例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約101〜130度、摂氏約105〜130度、摂氏約110〜130度、摂氏約115〜130度、摂氏約120〜130度、または摂氏約125〜130度の範囲内としうる。

一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約1分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約5分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約10分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約15分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約60分間、少なくとも摂氏約110度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏約120度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20分間、少なくとも摂氏約120度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30分間、少なくとも摂氏約120度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約60分間、少なくとも摂氏約120度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏約130度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20分間、少なくとも摂氏約130度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30分間、少なくとも摂氏約130度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約60分間、少なくとも摂氏約130度の温度に加熱される。

一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度以上としうる。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、ある温度範囲内としうる。一例として、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約200〜300度、摂氏約200〜290度、摂氏約200〜280度、摂氏約200〜270度、摂氏約200〜260度、摂氏約200〜250度の範囲内としうる。

一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20秒間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約40秒間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約1分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約5分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約10分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約15分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約20分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約30分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。一定の実施形態で、たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は、少なくとも約60分間、少なくとも摂氏約200度、210度、220度、230度、240度、250度、260度、270度、280度、290度または300度の温度に加熱される。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物が加熱される温度は、摂氏約200〜300度、摂氏約200〜290度、摂氏約200〜280度、摂氏約200〜270度、摂氏約200〜260度、摂氏約200〜250度、摂氏約200〜240度、摂氏約200〜230度、摂氏約200〜220度、または摂氏約200〜210度の範囲内としうる。

たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は一般的に、本開示の方法において、水および／または蒸気の存在下で加熱される。たばこ材料、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料またはたばこ材料を含む混合物は一般的に、本開示の方法において、水のみ、および／または蒸気のみの存在下で加熱されうる。蒸気のみが使用される場合には、たばこ材料は、湿らせたかまたは湿ったたばこ材料の形態、または混合物の形態であることが望ましい。加熱工程は、液体の沸点を上昇させることができる加圧状態で行うことができる。一つの実施形態で、加熱工程は、たばこ材料を蒸気（加圧蒸気を含む）にさらす条件下で実施される。別の実施形態で、たばこ材料は、封じ込められた容積または容器内で加圧蒸気にさらされる。模範的圧力レベルについては、本明細書で考察されている。加圧飽和蒸気を使用できる。飽和蒸気は同一の圧力で加熱した水と平衡を保つ蒸気である。加圧飽和蒸気はオートクレーブ内で作り出して使用することができる。当業者であればよく理解できる通り、オートクレーブはシールされた筐体内で圧力を利用して温度を上昇させることで機能する。水は乾燥空気よりも効率良く熱を伝達するため、熱の透過を助けるために水が導入される。一般的に、温度はある一定期間にわたり摂氏約121度以上に上昇させる必要がある。圧力の上昇は、その引火点（蒸発点）を超えて蒸気の温度が上昇するのを助ける。過熱蒸気の形態での蒸気も使用しうる。過熱蒸気は、温度測定がなされる絶対圧で、その気化（沸騰）点よりも高い温度の蒸気である。過熱蒸気の使用は、過熱蒸気乾燥機を使用することで達成できる。

加熱および自由選択の圧力工程に続き、たばこ材料は、随意に後洗いの工程で第二の水溶液または溶媒で洗浄することができる。第二の水溶液または溶媒は、前洗いの工程で使用される第一の水溶液または溶媒と同一でも異なるものでもよく、および／または加熱／圧力工程で使用される液体と同一でも異なるものでもよい。一定の実施形態で、第二の水溶液は水を含む無毒性水溶液である。一定の実施形態で、第二の水溶液は緩衝液または緩衝液を含む無毒性水溶液である。緩衝液が使用される場合には、少なくともpH 6.0またはpH 7.0またはそれ以上などが望ましいpHとされる。第二の水溶液または溶媒は、たばこ材料と組み合わせたとき、例えば、5%（w/v）、10%（w/v）、15%（w/v）、20%（w/v）、25%（w/v）、30%（w/v）、35%（w/v）、40%（w/v）または45%（w/v）またはそれ以上の混合物としうる。一定の実施形態で、たばこ材料と水溶液または溶媒の比が1:5または1:10の混合物が使用される。一定の実施形態で、後洗いの工程は、少なくとも約5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分、60分、90分、120分、150分または180分またはそれ以上の間、室温で実施される。一定の実施形態で、後洗いの工程は、およそ室温で、またはさらには高い温度で、例えば摂氏約20度、摂氏約30度、摂氏約40度、摂氏約50度、摂氏約60度、摂氏約80度、または摂氏約90度またはそれより高い温度などで実施される。一定の実施形態で、後洗いの工程は、物理的撹拌、および／またはより厳密性の高い洗浄条件の存在下で実施できる。より厳密性の高い洗浄条件（より高い温度および／または激しい物理的撹拌など）は、総タバコ特異的ニトロソアミン含量をさらに減少させうると考えらえる。

さらなる随意的な工程で、本明細書に記載した方法を使用して得られるか、または得ることができる加工済みまたは処理済みたばこ材料が乾燥される。たばこ材料を乾燥させるための適切な条件は、当該技術分野において公知であり、例えば、摂氏約50度の温度で約17時間がある。

このプロセスのいかなる段階でも、タバコ特異的ニトロソアミン含量（少なくともNNK含量など）を測定できる。一つの実施形態で、一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンは、プロセスの開始時および／またはプロセスの終了時に測定できる。別の実施形態で、一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンは、プロセスの終了時に、タバコ特異的ニトロソアミン含量が要求量または要求濃度で存在することをチェックするために測定される。別の実施形態で、一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンは、加熱工程の前およびその後に測定される。こうして、本明細書に記載した方法は、本明細書で説明した一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを測定する別の随意的な工程を含みうる。方法は、遊離型および／または結合型の形態である一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを測定する工程を含みうる。一つの実施形態で、少なくともNNKのレベルまたは量が測定される。これらの化合物のレベルは、たばこ材料中、たばこ供給原料中、またはたばこホモジネート中、およびこれに類するもので測定しうる。これらの一つ以上の化合物のレベルは、本明細書に記載した方法を使用した処理の後で測定しうる。これらの一つ以上の化合物のレベルは、本明細書に記載した方法を使用した処理の前に、本明細書に記載した方法を使用した処理中に、または本明細書に記載した方法を使用した処理の終了時に測定しうる。これらの化合物のレベルは、本明細書に記載した方法を使用した処理中に断続的にも測定しうる。レベルは、例えば、本明細書に記載した方法を施していない対照たばこ材料と比較することもできる。こうして、測定工程は、随意にたばこ中のニトロソアミンのレベルを比較するための比較工程を伴い得る。タバコ特異的ニトロソアミンを測定するために、当該技術分野において公知である各種の方法を使用しうるが、これには、超高性能液体クロマトグラフィーを含む液体クロマトグラフィー法、および当該技術分野において広く知られているタンデム型質量分析を含む質量分析法などがある。一つの実施形態で、超高性能液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（UPLC-MS/MS）が使用される。

さらなる態様において、たばこ材料中の不溶性たばこ基質に結合した一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量を低減するための方法が提供されているが、この方法は、（a）不溶性たばこ基質に結合した一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）随意にたばこ材料を第一の水溶液または溶媒と組み合わせる工程と、（c）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程とを含む。一つの実施形態で、工程（c）で加熱されるたばこ材料は、加熱前に湿らせたものか、または湿ったものである。例えば、たばこ材料は少なくとも5%（w/v）の混合液の形態としうる。一つの実施形態で、工程（c）は工程（b）からのたばこ材料を含む水溶液または溶媒の加熱を含む。別の態様において、たばこ材料中の不溶性たばこ基質に結合したNNKの量を低減するための方法が提供されているが、この方法は、（a）不溶性たばこ基質に結合されたNNKを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）随意にたばこ材料を第一の水溶液または溶媒と組み合わせる工程と、（c）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程とを含む。一つの実施形態で、工程（c）で加熱されるたばこ材料は、加熱前に湿らせたものか、または湿ったものである。例えば、たばこ材料は少なくとも5%（w/v）の混合液の形態としうる。一つの実施形態で、工程（c）は工程（b）からのたばこ材料を含む混合液の加熱を含む。

一定の実施形態で、タバコ特異的ニトロソアミン（例えばNNK）放出の最大レートは、たばこ材料の加熱から30〜60分以内に発生する。一定の実施形態で、少なくともおよそ10,000 ng/gのNNKがたばこ材料の加熱の約30〜60分以内に放出されるか、または少なくとも約13,000 ng/gのNNKがたばこ材料の加熱の約30〜60分以内に放出される。一定の実施形態で、放出レートは、より高い温度で増大する。例えば、およそ10,000 ng/gのNNKが摂氏130度でたばこ材料の加熱の約30〜60分以内に放出されうるが、一方で約13,000 ng/gのNNKが摂氏140度でたばこ材料の加熱の約30〜60分以内に放出されうる。NNK放出の量は、摂氏約130度で約4時間以上にわたり継続し、摂氏約140度で約8時間以上にわたり継続しうる。

温度に依存する総NNKの減少、すなわち、遊離型および結合型のNNKの減少を観察できる。例えば、摂氏約110度で約1時間後、たばこ材料中の総NNK含量は約3400 ng/gでありうる。摂氏120度で約1時間後、総NNK含量は約2900 ng/gでありうる。摂氏130度で約1時間後、総NNK含量は約2600 ng/gでありうる。

温度に依存する基質結合型NNKの減少を観察できる。摂氏110度で約1時間後、基質結合型NNK含量は約2480 ng/gでありうる。摂氏120度で約1時間後、基質結合型NNK含量は約1520 ng/gでありうる。摂氏130度で約1時間後、基質結合型NNK含量は約810 ng/gでありうる。

たばこ材料は、風味剤、有機および無機のフィラー（例えば、穀物、加工済み穀物、ポン菓子、マルトデキストリン、ブドウ糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ラクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、微粒セルロース、およびこれに類するもの）、結合剤（例えば、ポビドン、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびその他の変性セルロース型の結合剤、ナトリウムアルギン酸塩、キサンタンゴム、デンプン系の結合剤、アラビアゴム、レシチン、およびこれに類するもの）、着色剤（例えば、染料および顔料で、カラメル色素および二酸化チタン、およびこれに類するものを含む）、湿潤剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、およびこれに類するもの）、口腔ケア添加物、防腐剤（例えば、ソルビン酸カリウム、およびこれに類するもの）、シロップ（例えば、ハチミツ、異性化糖、およびこれに類する風味剤として使用されるもの）、および崩壊助剤（例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グリコール酸デンプンナトリウム、アルファ化コーンスターチ、およびこれに類するもの）といった成分のうち一つ以上およびその組み合わせを含むがこれに限定されない添加物を含みうる。こうした添加物は、当業者に公知であり、当該技術分野において公知の量および形態で提示されうる。

特定のいかなる理論にも束縛されることなく、乾燥処理時のその形成に加えて、タバコ特異的ニトロソアミンは、たばこの加工中に形成されると理解される。従って、本明細書に記載した方法は、高いタバコ特異的ニトロソアミンレベルが蓄積されうる乾燥処理済みたばこまたはたばこスラリーから準備されるたばこ製品を含む、たばこ製品中で生成される一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKなど）のレベル、量または濃度を低減させるのに特に効果的でありうる。本明細書で考察した通り、本明細書に記載した方法は、再構成たばこの準備に特に適しうる。

さらなる態様において、不溶性たばこ基質中に約2400 ng/g未満のNNKと、少なくとも約900 ng/gの遊離型NNKを含む（加工済みまたは処理済み）たばこ材料が提供されている。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約2480 ng/g未満のNNKと、少なくとも約930 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約2481 ng/g未満のNNKと、少なくとも約934 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約1550 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1300 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約1520 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1390 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約1520 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1397 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約810 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1800 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約809 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1850 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の約809 ng/g未満のNNKと、少なくとも約1859〜1860 ng/gの遊離型NNKを含む。

一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の2500 ng/g〜800 ng/gのNNKと、約900 ng/g〜1900 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の2480 ng/g〜810 ng/gのNNKと、約930 ng/g〜1860 ng/gの遊離型NNKを含む。一定の実施形態で、（加工済みまたは処理済み）たばこ材料は、不溶性たばこ基質中の2481 ng/g〜809 ng/gのNNKと、約934 ng/g〜1859 ng/gの遊離型NNKを含む。

本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料は、各種の消費者製品（たばこ製品など）に組み入れうる。また、本明細書には、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料から形成されるたばこ製品が記載されている。また、本開示にはこうしたたばこ製品を製造するための方法が含まれている。たばこ製品には、不燃性の製品、加熱式の製品、およびエアロゾル発生製品を含む、喫煙物品または喫煙に適した物品および無煙たばこ製品が含まれるが、これに限定されない。喫煙物品または喫煙に適した物品の非限定的な例には、紙巻たばこ、シガリロ、葉巻たばこおよびパイプたばこが含まれる。無煙たばこ製品の非限定的な例には、噛みたばこ、嗅ぎたばこ、およびエアロゾル発生製品で使用するための基質が含まれる。無煙のたばこ製品は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーの他、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分への蒸着、それへの混合、それによる包囲、または別の方法でのそれとの組み合わせを含めた、任意の形態のたばこを含みうる。無煙たばこ製品の液体含量は、装置内に含めるか、またはある形態内（ビーズなど）に閉じ込めて、水溶性ラッパーとの相互作用を排除できる。ラッパーは、部分的または完全にたばこを組み込む組成物に閉じ込めるか、またはたばこの複数のタブ、ビーズ、または薄片をまとめて保持するための接着剤として機能させる小袋の形状としうる。ラッパーを構成するための模範的材料には、HPMC、CMC、ペクチン、アルギン酸塩、プルラン、およびその他の商業的に実現可能な食用の膜形成ポリマーを含む膜組成物が含まれる。その他の包装材料には、ゼラチン、HPMC、デンプン／カラゲナン、またはその他の商業的に入手可能な材料から製造される予め形成されたカプセルが含まれうる。こうした包装材料には、成分としてのたばこが含まれうる。口腔内で崩壊されないラッパーは、織物もしくは不織布で、塗工紙もしくは非塗工紙で、または有孔フィルムもしくはそれ以外の多孔性プラスチックフィルムで構成しうる。ラッパーは風味剤または着色剤を組み込みうる。無煙製品は、小さなパッケージを垂直形状／充填／シール包装機によって形成できるブリスター包装などの方法を含め、商業包装の技術分野で当業者に公知の任意の方法を用いてラッパーと一緒に組み立てうる。

一つの態様は、たばこ材料からエアロゾルを生成するための方法に関連するが、この方法は、（a）本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む。別の態様は、エアロゾル中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミン（NNKなど）の量または濃度を低減するための方法に関連する。一般的に、エアロゾルは煙の形態となる。本方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（c）からのたばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む。本明細書に記載した方法により得られるか、または得ることができるエアロゾルも提供されている。得られたエアロゾルは、少なくとも工程（b）を経ていない対照たばこ材料からのエアロゾルと比較して低いレベルのNNKを持つことが適切である。本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料は、再構成たばこに形成しうる。再構成たばこは一般的に、様々な方法で形成することができる。例えば、一つの実施形態で、バンドキャスティングを利用して、再構成たばこを形成することができる。バンドキャスティングでは一般に、細かく分割したたばこの部分のスラリーと、鋼製の帯上に被膜してから乾燥させる結合剤とが採用される。乾燥後、シートは天然のたばこ片と混合されるか、または細断されて、紙巻たばこフィラーとしてなど、各種のたばこ製品で使用される。再構成たばこを製造するためのプロセスのいくつかの例が、US 3,353,541号、US 3,420,241号、US 3,386,449号、US 3,760,815号およびUS 4,674,519号に記載されている。再構成たばこは製紙プロセスによって形成することもできる。このプロセスによって再構成たばこを形成するためのプロセスのいくつかの例が、US 3,428,053号、US 3,415,253号、US 3,561,451号、US 3,467,109号、US 3,483,874号、US 3,860,012号、US 3,847,164号、US 4,182,349号、US 5,715,844号、US 5,724,998号およびUS 5,765,570号に記載されている。例えば、製紙の技法を使用した再構成たばこの形成には、たばこと水との混合、そこからの溶解可能な成分の抽出、溶解可能な成分の濃縮、たばこの精製、ウェブの形成、濃縮した溶解可能成分の再適用、乾燥、およびスレッシングといった工程が関与しうる。様々な成分（風味または着色の処理）をウェブに適用できる。こうして、さらなる態様によれば、再構成たばこを準備するための方法が提供されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱する工程と、（c）工程（b）から得られたたばこ材料を再構成たばこに製造する工程とを含む。再構成たばこは、バンドキャスティングプロセスまたは製紙プロセスによって準備されることが適切である。たばこ材料は、随意に加熱工程の前および／または後に洗浄することができる。

別の実施形態によれば、本明細書に記載した方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料は、たばこシート（再構成たばこシートなど）に形成しうる。この実施形態によれば、方法は、（a）本明細書に記載した方法に従って（処理済みまたは加工済み）たばこ材料（たばこホモジネートなど）を得る工程と、（b）たばこホモジネートのスラリーを準備する工程と、（c）たばこホモジネートのスラリーを成形する工程と、（d）たばこホモジネートのスラリーを乾燥させて、再構成たばこシートを形成する工程とを含む。

別の実施形態によれば、方法は、（a）本明細書に記載した方法に従って（処理済みまたは加工済み）たばこ材料（たばこホモジネートなど）を得て、たばこスラリーを準備する工程と、（b）たばこホモジネートのスラリーを成形する工程と、（c）たばこホモジネートのスラリーを乾燥させて、たばこシートを形成する工程とを含む。

たばこホモジネートのスラリーを成形する工程は、当該技術分野において公知である任意の成形プロセスまたは製紙プロセスを使用して実施しうる。一例として、成形プロセスについては、US 5,724,998号およびUS 5,584,306号に説明があり、製紙プロセスについては、US 4,341,228号、US 5,584,306号およびUS 6,216,706号に説明がある。成形プロセスには一般に、連続的なステンレス鋼ベルト上にスラリーを成形する工程、キャストスラリーを乾燥させて再構成たばこシートを形成する工程、そのシートを除去する工程が関与する。製紙プロセスには一般に、望ましいシートに形成するために、ヘッドボックスから水溶性スラリーをワイヤースクリーン上に成形する工程が関与する。水溶性スラリーは、溶解可能な部分と繊維性の部分に分離しうる。水が繊維性の部分から排出され、そのようにして形成されるシートがその後で処理・乾燥される。

たばこスラリーは一つ以上の結合剤（ゴムおよびペクチンなど）をさらに含みうる。上述の通り、再構成たばこシートを準備するために使用されるたばこスラリーは、木材セルロース繊維、エアロゾル形成剤、糖類、および芳香成分および結合剤のうち一つ以上の成分、およびそれらの組み合わせを含む一般的添加物をさら含むが、これに限定されない。上記の添加物は当業者に公知であり、当該技術分野において公知の量および形態でこれらの水溶性スラリーの形態で存在しうる。

準備が整うと、本明細書で説明した再構成たばこシートは、未加工の葉たばこを切るのと同様な方法で切って、紙巻たばこおよびその他のたばこ製品に適したたばこフィラーを製造しうる。本明細書で説明した再構成たばこシートは、メカニカルフィンガーでさらに破壊または剥離させて、天然のたばこラミナ片と類似したサイズの断片にしたり、または一辺が約50〜100 mmのダイヤモンド形の断片に切断したりすることもできる。本明細書で説明した再構成たばこシートの断片はさらに、火力乾燥たばこ、バーレー種たばこ、メリーランド種たばこ、オリエンタル種たばこ、希少たばこ、特殊たばこ、エクスパンデッドたばこ、およびこれに類するものなど、その他のたばこと混合しうる。特定の紙巻たばこブランドの製造に使用されるたばこブレンド内の各種のたばこの正確な量は、ブランドによって異なる。例えば、Tobacco Encyclopaedia、Voges（Ed.）p. 44-45（1984）、およびBrowne、The Design of Cigarettes、3rd Ed.、p.43（1990）、およびTobacco Production, Chemistry and Technology、Davis et al.（Eds.）p. 346（1999）を参照。次に、ブレンド全体をカットフィラーに裂いて、たばこ製品に組み込みうる。従って、タバコ特異的ニトロソアミン（NNKなど）の量が低減されたたばこ（例えば、再構成たばこシート）を含むたばこ製品を製造するための方法が提供されている。

本明細書の開示に従い得られるか、または得ることができるたばこ材料は、たばこカットフィラーで、およびカットフィラーのたばこロッドから形成される喫煙物品でも使用できる。慣習的に、喫煙物品用のカットフィラーたばこ製品は、主に、スレッシングプロセス中に葉の幹部分から分離されるたばこ葉の薄片部分から形成される。薄片を除去し分離した後に残る幹部分の多くは使用されない。商業的に使用可能なたばこ材料の量を増やすために、一部のたばこの茎を薄片とともにカットフィラーに戻して加えることができる。カットフィラーで使用するためのたばこの茎の味覚および燃焼特性を改善するために、まず茎に一つ以上の処理手順を施すことがよくあるが、これには本明細書で説明した手順が含まれうる。圧延工程を、本開示の方法が施されたたばこの茎に対して実施できる。茎は望ましい厚み（平均厚み約0.6 mm〜0.8 mmなど）に圧延できる。その後の加工および貯蔵工程時に、茎は最終厚み約0.8 mm〜約1.0 mmに膨張することがある。圧延後、茎は乾燥されて、たばこ製造工場に運搬され、そこで切断されてたばこカットフィラーに加えられる。一部の場合に、圧延工程は、別の方法としてカットフィラー用のオンライン製造プロセスの一部として組み込むこともできる。一般に、茎の構造に対する損傷を阻止するために、圧延前のたばこの茎の含水量は約28%〜約34%のオーブン揮発分である。必要に応じて、たばこの茎は、含水量をこのレベルに増やすために圧延前に調整できる。たばこの茎を調整するための公知のプロセスには、茎を水、蒸気または水と蒸気の混合物に接触させることが関与する。圧延工程がオンラインで組み込まれ、かつ乾燥させた茎が使用される方法では、調整の工程は一般に長く時間がかかり、圧延前に長時間にわたり茎を水に浸す工程が必要となることがある。たばこの茎は、一工程の圧延プロセスを使用して圧延して、茎の厚みを望ましい平均厚みに減少させることができる。圧延後、茎は切り取って、幅0.1 mm〜0.2 mmに切断できる。切断した圧延済みの茎はその後で、随意に公知の茎伸張テクニックを使用して膨張させた後で乾燥される。茎が予め圧延・乾燥されている場合、一般に、たばこの茎の含水量を増やして28%〜34%のオーブン揮発分に戻すために、切断前に茎を調整する必要が出てくる。これによって、切断中の茎の損傷や破損を制限するために、たばこの茎の柔軟性が増大する。最後に、切断した圧延済みの茎は、切断した圧延済みたばこの茎の少なくとも5重量パーセントを持つカットフィラーを形成するために、たばこカットラミナおよび任意の追加的なたばこ材料と組み合わされる。こうして、さらなる態様において、たばこカットフィラーとして使用するためのたばこを準備するための方法が提供されているが、その方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（c）によるたばこ材料を水溶液または溶媒で洗浄して、たばこ材料からタバコ特異的ニトロソアミンを放出させる工程と、（e）たばこ材料を圧延して切断する工程とを含む。また、たばこカットフィラーで使用するために、たばこ材料（たばこの茎など）を処理する方法も説明されているが、この方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（c）によるたばこ材料を水溶液または溶媒で洗浄して、たばこ材料からタバコ特異的ニトロソアミンを放出させる工程と、（e）たばこ材料を圧延する工程と、（f）たばこ材料を切断する工程と、（g）随意に切断した圧延済みの茎を乾燥する工程とを含む。圧延済みたばこの茎をたばこラミナと組み合わせて、その工程が組み合せたたばこの茎およびラミナについて実施されるようにできる。切断工程は、圧延済みの茎を切断幅約0.3 mm〜1.3 mmに切断する工程を含みうる。本方法は、たばこ葉から茎を除去する工程、平均長さ約15 mm〜80 mmに茎を切断する工程、茎を厚み0.1 mm〜0.5 mmに圧延する工程を含みうる。圧延したたばこの茎を含むカットフィラーを製造する方法も提供されているが、その方法は、本明細書に記載した方法を使用してたばこの茎を処理する工程と、処理済みの茎を少なくとも一つの種類のたばこラミナ、エクスパンデッドたばこまたは再構成たばこと混合してカットフィラーを製造する工程とを含む。

この方法によって得られるか、または得ることができるたばこカットフィラーは少なくとも60重量パーセントのたばこラミナ、および好ましくは少なくとも80重量パーセントのたばこラミナを含むことができ、そのたばこラミナは平均切断幅0.8 mm〜1.1 mmを持ち、適切には平均切断幅約0.9 mmを持ち、および平均厚み約0.2 mmを持つ。たばこカットフィラーは、最大95重量パーセントのたばこラミナを含むことができ、そのたばこラミナは平均切断幅約0.8 mm〜1.1 mmを持ち、より適切には平均切断幅約0.9 mmを持ち、平均厚み約0.2 mmを持つ。従って、カットフィラー中のたばこラミナの粒子は、たばこの茎の粒子と類似した寸法である。そのため、たばこの茎は、高い包含レートであってもたばこラミナと視覚的に違いはない。さらに、たばこの茎およびラミナの混合は、有利なことに、茎が著しく沈下することなく輸送および効果的な加工がなされる。切断した圧延済みたばこの茎の平均切断幅は約0.1 mm以内であることが適切であり、カットフィラー中のたばこラミナの平均厚みが約0.05 mm以内であることがより適切である。カットフィラーは、様々な喫煙物品に組み込みうる。例えば、カットフィラーは、フィルター紙巻たばこ、シガリロまたは葉巻など、燃焼性喫煙物品のたばこロッドに使用しうる。別の方法として、カットフィラーは、蒸留式の喫煙物品、または電気加熱式の喫煙システムにおいて、たばこにエアロゾル発生基質を提供するために使用しうる。別の方法として、カットフィラーは、手巻き製品、またはルースたばこ製品（例えば、パイプで使用するための製品）として使用しうる。

たばこ材料は、天然のたばこ植物体、突然変異たばこ植物体、非天然たばこ植物体または遺伝子組み換えたばこ植物体に由来したものとしうる。

たばこ材料は、植物体に由来するかまたは由来しうるものが考えられるが、これにはタバコ属、タバコ属の様々な種（N. rusticaおよびN. tabacumを含む）の植物体が含まれる。たばこ材料は、熱気送管乾燥種またはブライト種、バーレー種、ダーク種およびオリエンタル／トルコ種として公知のタバコ属の種の品種に由来しうる。一部の実施形態において、たばこ材料は、バーレー種、バージニア種、熱気送管乾燥種、空気乾燥種、火力乾燥種、オリエンタル種、またはダーク種たばこ植物体に由来する。一部の実施形態において、たばこ材料は、例えば、以下の品種のうち一つ以上に由来する： N. tabacum AA 37-1、N. tabacum B 13P、N.tabacum Xanthi（Mitchell-Mor）、N.tabacum KT D#3 Hybrid 107、N.tabacum Bel-W3、N.tabacum 79-615、N.tabacum Samsun Holmes NN、N.tabacum BU21 × N.tabacum Hoja Paradoの交配F4世代、系統97、N.tabacum KTRDC#2 Hybrid 49、N.tabacum KTRDC#4 Hybrid 1 10、N.tabacum Burley 21、N.tabacum PM016、N.tabacum KTRDC#5 KY 160 SI、N.tabacum KTRDC#7 FCA、N.tabacum KTRDC#6 TN 86 SI、N.tabacum PM021、N.tabacum K 149、N.tabacum K 326、N.tabacum K 346、N.tabacum K 358、N.tabacum K 394、N.tabacum K 399、N.tabacum K 730、N.tabacum KY 10、N.tabacum KY 14、N.tabacum KY 160、N.tabacum KY 17、N.tabacum KY 8959、N.tabacum KY 9、N.tabacum KY 907、N.tabacum MD 609、N.tabacum McNair 373、N.tabacum NC 2000、N.tabacum PG 01、N.tabacum PG 04、N.tabacum P01、N.tabacum P02、N.tabacum P03、N.tabacum RG 11、N.tabacum RG 17、N.tabacum RG 8、N.tabacum Speight G-28、N.tabacum TN 86、N.tabacum TN 90、N.tabacum VA 509、N.tabacum AS44、N.tabacum Banket A1、N.tabacum Basma Drama B84/31、N.tabacum Basma I Zichna ZP4/B、N.tabacum Basma Xanthi BX 2A、N.tabacum Batek、N.tabacum Besuki Jember、N.tabacum C104、N.tabacum Coker 319、N.tabacum Coker 347、N.tabacum Criollo Misionero、N.tabacum PM092、N.tabacum Delcrest、N.tabacum Djebel 81、N.tabacum DVH 405、N.tabacum Galpao Comum、N.tabacum HB04P、N.tabacum Hicks Broadleaf、N.tabacum Kabakulak Elassona、N.tabacum PM102、N.tabacum Kutsage E1、N.tabacum KY 14xL8、N.tabacum KY 171、N.tabacum LA BU 21、N.tabacum McNair 944、N.tabacum NC 2326、N.tabacum NC 71、N.tabacum NC 297、N.tabacum NC 3、N.tabacum PVH 03、N.tabacum PVH 09、N.tabacum PVH 19、N.tabacum PVH 2110、N.tabacum Red Russian、N.tabacum Samsun、N.tabacum Saplak、N.tabacum Simmaba、N.tabacum Talgar 28、N.tabacum PM132、N.tabacum Wislica、N.tabacum Yayaldag、N.tabacum NC 4、N.tabacum TR Madole、N.tabacum Prilep HC-72、N.tabacum Prilep P23、N.tabacum Prilep PB 156/1、N.tabacum Prilep P12-2/1、N.tabacum Yaka JK-48、N.tabacum Yaka JB 125/3、N.tabacum TI-1068、N.tabacum KDH-960、N.tabacum TI-1070、N.tabacum TW136、N.tabacum PM204、N.tabacum PM205、N.tabacum Basma、N.tabacum TKF 4028、N.tabacum L8、N.tabacum TKF 2002、N.tabacum TN90、N.tabacum GR141、N.tabacum Basma xanthi、N.tabacum GR149、N.tabacum GR153、およびN. tabacum Petit Havana。

本開示のさらなる態様は下記の項に記載する。

1．たばこ材料中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量を低減するための方法であって、その方法は、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程とを含む。

2．タバコ特異的ニトロソアミンが、NNKを含むか、それによって構成されるか、または実質的にそれによって構成される、項1に記載の方法。

3．工程（a）で供給されたたばこ材料が工程（b）の前に第一の水溶液または溶媒と接触する、項1または項2に記載の方法。

4．第二の水溶液または溶媒を用いた1回以上の洗浄によって、タバコ特異的ニトロソアミンが試料から除去される、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。

5．第一および／または第二の水溶液または溶媒が同一であるかまたは異なる、項3または項4に記載の方法。

6．たばこ材料が、たばこ葉および／またはたばこの茎および／またはたばこダストおよび／またはたばこ葉プライムラミナ片またはそのうち2つ以上の組み合わせから構成される群から選択される、項1〜5のいずれか1項に記載の方法。

7．たばこ材料が水または水から生成された蒸気の存在下で加熱される、項1〜6のいずれか1項に記載の方法。

8．たばこ材料が工程（b）において、加圧蒸気および／または過熱蒸気の存在下で加熱される、項1〜7のいずれか1項に記載の方法。

9．項1〜8のいずれか1項の方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料。

10．不溶性たばこ基質中の約2400ng/g未満のNNKと、少なくとも約900 ng/gの遊離型NNKとを含むたばこ材料。

11．エアロゾル中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量または濃度を低減するための方法であって、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質から一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）工程（b）によるたばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む。

12．再構成たばこを製造するための方法であって、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱する工程と、（c）工程（b）によるたばこ材料を水溶液または溶媒で洗浄して、たばこ材料からタバコ特異的ニトロソアミンを放出させる工程と、（d）工程（c）で得られたたばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、（e）随意に再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

13．再構成たばこを製造するための方法であって、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、（b）たばこ繊維を水溶性材料から分離することにより、前記たばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、（c）分離した繊維を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏100度まで加熱して、分離した繊維の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（d）繊維を水溶液または溶媒で洗浄する工程と、（e）繊維および水溶性材料を再び組み合わせて再構成たばこシートを形成する工程と、および（f）随意に再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む。

14. たばこカットフィラーとして使用するためのたばこを準備するための方法であって、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料（たばこの茎など）を供給する工程と、（b）たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、たばこ材料の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこ材料から除去する工程と、（d）たばこ材料を圧延して切断する工程とを含む。

15. 圧延したたばこの茎を含むカットフィラーを製造する方法であって、（a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこの茎を供給する工程と、（b）液体または蒸気の存在下でたばこの茎を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度まで加熱して、たばこの茎の不溶性たばこ基質からタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、（c）放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部をたばこの茎から除去する工程と、（d）処理済みの茎を少なくとも一つの種類のたばこラミナ、エクスパンデッドたばこまたは再構成たばこと混合する工程と、（e）カットフィラーを製造する工程とを含む。

以下の例は、例証として提供するものであり、制限するためのものではない。別途に指示のない限り、本発明は、分子生物学および植物生物学の従来的な技法および方法を採用する。

たばこ中の遊離型および結合型のNNKの分析方法
たばこ試料のアリコート（例えば、約750 mg）を、約30 mLのトリス-HCl 緩衝液（50 mM； pH 7.4）を用いて、およそ室温で約1時間振盪させることで抽出する。内部標準液（100 ng/mL NNK-d₄）を加える。抽出物の試料（0.4 mL）を0.2 μMフィルターを使用して濾過し、超高性能液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（UPLC-MS/MS）を使用してNNK含量を分析する。これらの抽出物濃度から計算した試料の濃度は、試料中の「遊離型NNK」濃度に対応する。抽出混合物の処理（例えば、約130℃まで約4時間加熱することによる）および抽出物のアリコートの濾過を行った後、UPLC-MS/MSによりNNK濃度を再び測定する。これらの値から、試料中の「総NNK」濃度を計算できる。「結合型NNK」濃度は、「総NNK」濃度と「遊離型NNK」濃度の差である。

「総NNK」抽出の別の方法は、濃縮HClによる抽出混合物の酸性化（例えば、3 mLの37% HClを加えて30 mLにする）および80℃で48時間の培養を含む。酸性抽出物はろ過の前に中和され、NaOH溶液（6N、40 μL）および水酸化マグネシウム懸濁液（10%； 40 μL）を320 μLの抽出液に加えてUPLC分析をする。

UPLC分析
使用するカラムは、Waters Acquity BEH C18、1.7 μm、2.1 × 50 mmである。使用する溶出剤は、（A）アンモニウム重炭酸塩（10mM；アンモニアを用いてpH 9.8に調整）＋2%（v/v）アセトニトリル;（B）アセトニトリルである。使用する勾配は、0分 - 5% B、0.5分 - 5% B、3.3分 - 18.3% Bである。使用する流量は0.5 mL/分である。使用するカラム温度は50℃である。

MS/MS法
この分析は、Waters TQ分光計上で以下のMRM遷移を使用して実施される： NNK： 208.2 → 122.2；ドウェル時間100 ms；NNK-d4： 212.2 → 126.2；ドウェル時間100 ms； 毛細管電圧： 0.6 kV；コーン電圧： 25 V；衝突エネルギー： 11 eV；ソース温度： 120℃；脱溶媒温度： 400℃；脱溶媒ガス流： 800 L/h。

たばこ試料中の遊離型および基質結合型のNNKの分析
1N HClを用いた抽出（80℃で2日間）によって基質結合型NNKが放出された所見を使用し、上述のUPLC-MS/MSを用いて、たばこ試料中の遊離型および基質結合型NNKを分析する。この方法を適用することにより、バーレー種の葉、バーレー種の茎および再構成たばこ中の大部分のNNKが、基質結合型の形態で存在することが判明している。

図1に示す通り、この分析で最も高い総NNK含量は、再構成たばこおよびバーレー種の茎で見つかった。総遊離型NNK含量および総結合型NNKは、再構成たばこおよびバーレー種の茎で最も高かった。

水洗いしたバーレー種の茎からの基質結合型NNKの放出
上述の基質結合型NNKの酸性（またはアルカリ性）の放出は一般的に、たばこの物理的完全性に対するその影響のため、ヒトへの使用が意図されるたばこ材料からのNNK除去に使用できない。従って、その他の方法が必要である。

水洗いしたバーレー種の茎を、実験用オートクレーブ内で水中で130℃または140℃に加熱する。これにより、4時間以内に有意な量の基質結合型NNKが放出される。図2で分かる通り、バーレー種の茎でのNNK放出の最大レートは最初の30〜60分以内に発生しており、摂氏130度でおよそ10,000 ng/gが放出され、摂氏140度で約13,000 ng/gが放出されている。NNK放出の量は、摂氏130度で最長約4時間、摂氏140度で最長約8時間にわたり継続した。

水中で110℃〜130℃の温度で抽出された3R4F実験用紙巻たばこからのフィラーについて、同じ全体的な効果が観察された。NNK放出レートの明確な温度依存症が観察された。図3で分かる通り、NNKの放出の急速なレートは、最初の60分以内で発生し、摂氏110度、摂氏120度および摂氏130度のそれぞれで約1,400 ng/g、1,700 ng/gおよび2,000 ng/gが放出された。約60分後、放出のレートは減少したが、NNKの継続的な放出は約200分後にもなお観察された。

バーレー種の茎からの基質結合型NNKの除去
たばこ材料からの基質結合型NNKの除去について、タバコ特異的ニトロソアミンを豊富に含むバーレー種の茎に洗浄／オートクレーブ／洗浄の3工程の手順を適用することにより、本明細書に記載した方法の潜在性を評価する。まず茎をおよそ室温で約2時間、水（100 gの茎に対して1.5 L）で洗浄し、次に湿った茎をオートクレーブ処理し、再び水で約2時間洗浄する。この処理の後、材料を乾燥させて（約50℃で約17時間）、遊離型および基質結合型NNK含量の両方について分析する。結果を表1および図4に示す。

図4に示す通り、温度に依存する総NNK（＝遊離型＋結合型NNK）の減少が観察された。摂氏110度で1時間の方法では総NNK含量は約3415 ng/gであった。摂氏120度で1時間の方法では総NNK含量は約2917 ng/gであった。摂氏130度で1時間の方法では総NNK含量は約2668 ng/gであった。比較すると、未処理の茎の総NNK含量は約3680 ng/gであった。オートクレーブ処理のない方法では、総NNK含量は約5024 ng/gであった。

図4に示す通り、温度に依存する基質結合型NNKの大幅な減少が観察された。摂氏110度で1時間の方法では基質結合型NNK含量は約2481 ng/gであった。摂氏120度で1時間の方法では基質結合型NNK含量は約1520 ng/gであった。摂氏130度で1時間の方法では基質結合型NNK含量は約809 ng/gであった。比較すると、未処理の茎の基質結合型NNK含量は約2715 ng/gであった。オートクレーブ処理のない方法では、基質結合型NNK含量は約4848 ng/gであった。

図4に示す通り、温度に依存する遊離型NNKの大幅な増加が観察された。摂氏110度で1時間の方法では遊離型NNK含量は約934 ng/gであった。摂氏120度で1時間の方法では遊離型NNK含量は約1397 ng/gであった。摂氏130度で1時間の方法では遊離型NNK含量は約1859 ng/gであった。比較すると、未処理の茎の基質結合型含量は約2715 ng/gであった。オートクレーブ処理のない方法では、基質結合型含量は約4848 ng/gであった。

未処理の茎と比較して「オートクレーブ処理なし」の試料中の結合型NNK含量が高いのは、未処理の茎で最大30〜40%の乾燥重量を占める水溶性物質が第一の洗浄工程中に喪失するためと考えられる。オートクレーブ処理した茎中の遊離型NNKの比率が高いのは、最後の洗浄工程が徹底的なものではなく、例えば、水／茎混合物のより激しい物理的撹拌によるなど、改良された洗浄方法を適用することにより、さらなる総NNK含量の低減が達成される可能性があることを示す。

水洗いしたバーレー種の茎を加えた紙巻たばこの煙NNK分析
オートクレーブ処理時に放出される基質結合型NNKが煙NNKに寄与することを示すために、洗浄したバーレー種の茎を20%加えたか、または本明細書に記載した通り処理したオートクレーブ処理・洗浄を施したバーレー種の茎材料を20%含む紙巻たばこの煙を分析した。

洗浄／オートクレーブ処理済みのバーレー種の茎の準備： 細断したバーレー種の茎を毎回1200 mLの水（70℃で1時間）で3回連続して抽出する。毎回の抽出の後、真空ろ過により固体を分離する。3回目の抽出の後、固体を冷凍し凍結乾燥させる。その後、抽出した茎をMeOH/H2Oで4回洗浄（1:1；毎回480mL；毎回の工程後に4000 rpmで10分間遠心分離）、480mLの水で2回洗浄（同一条件）した後、再び凍結乾燥させて、47 gの洗浄したバーレー種の茎（wBS）が得られる。このwBS（20 g）の一部を水中でオートクレーブ処理する（300 mL；130℃で4時間）。次に、混合物を遠心分離し（10分、4000 rpm）、沈殿物を水（300 mL）で3回洗浄し、毎回の洗浄工程の後で遠心分離する。洗浄した材料をフリーズドライすると、10.9 gのオートクレーブ処理・洗浄したバーレー種の茎（aBS）が得られる。

紙巻たばこの準備： バーレー種カットフィラーとwBSまたはaBSの手巻きブレンドにより、紙巻たばこを準備する。圧延の前にたばこを60〜65%RHで1〜2時間調整する。紙巻たばこ1本当たり700 mgのたばこを使用する。3種類の試料のそれぞれについて15本の紙巻たばこを作成する：紙巻たばこA： 100%バーレー種紙巻たばこ、紙巻たばこB： 80%バーレー種＋20% wBS、および紙巻たばこC： 80%バーレー種＋20% aBS。

煙分析： 紙巻たばこをカナダ保健省の喫煙計画を使用して喫煙し、紙巻たばこ1本当たり15回、30秒間隔で吹かし、1回につき55 mLの容積の煙を収集する。3種類の紙巻たばこの煙を、ガラス繊維フィルター（Cambridge pad）上に蓄積させる。紙巻たばこの一種類当たり15本の紙巻たばこの喫煙をする。トリス-HCl緩衝液（30 mL；pH 7.5；内部標準液NNK-d4およびNNN-d4、100 ng/mL）中で振盪させて、パッドを直ちに抽出する。次に、抽出物をNNK、NNNおよびニコチンについて分析する。

wBS中の結合型NNK含量は7082 ng/g、aBS中の結合型NNK含量は1594 ng/g、およびバーレー種カットフィラー中のニコチンレベルは29.2 mg/gである。

20% wBSまたは20% aBSを含まないバーレー種ブレンドで、ニコチンは紙巻たばこ1本当たり5 mg、NNKは紙巻たばこ1本当たり245 ng、およびNNNは紙巻たばこ1本当たり129 ngである。

20% wBSを含むバーレー種ブレンドで、ニコチンは紙巻たばこ1本当たり4 mg、NNKは紙巻たばこ1本当たり701 ng、およびNNNは紙巻たばこ1本当たり118 ngである。

20% aBSを含むバーレー種ブレンドで、ニコチンは紙巻たばこ1本当たり5 mg、NNKは紙巻たばこ1本当たり390 ng、およびNNNは紙巻たばこ1本当たり112 ngである。

洗浄したバーレー種の茎（wBS）を加えた紙巻たばこの煙で、NNKレベルの有意な増大が見られる。さらに、aBSを含む紙巻たばこの煙NNKレベルは、wBSを含む紙巻たばこよりも有意に低い。NNNまたはニコチンについては、有意な減少は観察されていない。これは、オートクレーブ処理によって放出される同一の基質結合型NNKも、喫煙中にエアロゾルに転換されることを示す。興味深いことに、aBSを含む紙巻たばこは、純粋なバーレー種紙巻たばこよりも有意に多い煙NNKを送達する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、これは基質結合型NNKの一部分がオートクレーブによる方法では放出されないことを示す。wBSおよびaBS紙巻たばこの煙NNKと、wBSの結合型NNKの含量（オートクレーブ抽出により測定）の差から、（この特定の紙巻たばこデザインおよび喫煙方法での）結合型NNKの煙の移動量は30%であると計算できる。この移動量はニコチン（26%）の移動量と非常に類似しているため、基質結合型状態からの放出による結合型NNKの煙送達に対する有意な妨げはないことを結論付けることができる。これは、結合されていない予め形成された「遊離型」NNKと同様の方法で、結合型NNKが煙NNKの濃度に寄与することを意味する。

洗浄したバーレー種の茎からのNNKの熱放出
洗浄したバーレー種の茎の粉末の一部を、グラスウールのプラグ間のパスツールピペットの先端に挿入する。こうして、加熱時に気化する一切のNNKがピペットの冷たい方の部分に凝縮し、ガラス表面から抽出できる。

追加的なオートクレーブ処理・洗浄に送られた粉末にした洗浄済みバーレー種の茎または洗浄済みバーレー種の茎のいずれかを、グラスウールのプラグ間のパスツールピペットの先端に配置する。これらの試料をヒートガンのノズルで35秒間加熱する。その後、試料もしくは凝縮物が含まれているピペットの部分を粉砕し、ガラス片、グラスウールおよびたばこ粉末を、トリス-HCl緩衝液中（5ml；50mM；pH7.5；内部標準液：NNK-d4およびNNN-d4 @ 100 ng/mL含む）で室温で1時間振盪させて、まとめて抽出する。抽出物のアリコートをろ過し、LC-MSにより遊離型NNK、NNNおよびニコチンを決定する。残りの抽出混合物をオートクレーブ内で加熱する（130℃で4時間）。総NNKを、オートクレーブ処理した抽出混合物のNNK含量を測定することで決定する。この実験設定で到達した実際の温度を、グラスウールを詰めたパスツールピペットの先端に熱電対を配置することにより測定する。時間依存する温度測定が、20秒後までにT-10℃に達していることを示す。

結果を図5に示す。その遊離型の形態への結合型NNKの放出が、200℃を超える温度で観察される。40秒間にわたる目標温度270℃への加熱は、試料が20秒までに260℃を超えることを意味するが、結合型NNKのほとんど完全な解放につながる。この温度で、NNKの小さな部分（20%まで）が劣化する。オートクレーブ処理および水洗いによって結合型NNKの最大90%が除去される材料は、残留結合型NNK濃度から期待される濃度を超える遊離型NNKの放出または形成がないことを示す。ニコチンおよびNNNの放出の開始はまた200℃から観察されるが、元のバーレー種の茎の細断片（ニコチン：8.2 mg/g、NNN：13 μg/g、遊離型NNK：2.9 μg/g）中の含量と比較した時よりも相当に低い濃度である。観察されたNNK放出温度200〜250℃は、従来型の紙巻たばこと、たばこが外部熱源によって加熱される新しい喫煙装置の両方で、基質結合型NNKが煙NNKに貢献しうることを示唆している。

本明細書で引用または説明した任意の刊行物は、本明細書の出願日より前に開示された関連情報を提供するものである。本明細書に含まれる声明は、そうした開示に先行する権利が発明者にないことを認めると解釈されないものとする。上記の明細書で言及したすべての出版物は、本明細書に参照によって組み込む。発明についての様々な改良や変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者にとって明らかとなる。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、当然のことながら、本発明は主張の通り、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための説明したモードについて、細胞生物学、分子生物学および植物体生物学の分野または関連する分野の当業者にとって明らかである様々な改良は、以下の請求項の範囲内に収まるものであることが意図される。

Claims (14)

1. たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKの量を低減する方法であって、
   （a）少なくとも基質結合型NNKを含むたばこ材料を供給する工程と、
   （b）前記たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、
   （c）液体または蒸気の存在下で、前記たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約110度よりも高い温度に加熱して、前記たばこ材料の不溶性たばこ基質から前記基質結合型NNKの少なくとも一部を放出させる工程と、
   （d）工程（c）に次いで、前記たばこ材料中の少なくとも基質結合型NNKのレベルを随意に測定する工程と、
   （e）工程（b）および（d）で得られる基質結合型NNKのレベルを随意に比較する工程と、
   （f）前記たばこ材料から少なくとも基質結合型NNKが放出されたたばこ材料を特定する工程とを含む方法。
2. 工程（a）で供給された前記たばこ材料が工程（c）の前に第一の水溶液または溶媒と接触する、請求項1に記載の方法。
3. 第二の水溶液または溶媒を用いた1回以上の洗浄によって、前記基質結合型NNKが試料から除去される、請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
4. 前記第一および／または第二の水溶液または溶媒が同一であるか異なる、請求項3または請求項4に記載の方法。
5. 前記たばこ材料が、たばこ葉および／またはたばこの茎および／またはたばこダストおよび／またはたばこ葉プライムラミナ細片またはそのうち2つ以上の組み合わせから構成される群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
6. 前記たばこ材料が水または水から生成された蒸気の存在下で加熱される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
7. 前記たばこ材料が工程（b）で加圧蒸気および／または過熱蒸気の存在下で加熱される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
8. 請求項1〜7のいずれか1項の方法によって得られるか、または得ることができるたばこ材料。
9. 不溶性たばこ基質中の約2400ng/g未満のNNKと、少なくとも約900 ng/gの遊離型NNKとを含むたばこ材料。
10. エアロゾル中の一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの量または濃度を低減するための方法であって、
    （a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、
    （b）前記たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、前記たばこ材料の不溶性たばこ基質から前記一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、
    （c）前記放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を前記たばこ材料から除去する工程と、
    （d）工程（b）による前記たばこ材料を加熱してエアロゾルを生成する工程とを含む、方法。
11. 再構成たばこを製造するための方法であって、
    （a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、
    （b）前記たばこ材料を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱する工程と、
    （c）工程（b）による前記たばこ材料を水溶液または溶媒で洗浄して、前記たばこ材料から前記タバコ特異的ニトロソアミンを放出させる工程と、
    （d）工程（c）で得られた前記たばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、
    （e）随意に前記再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む、方法。
12. 再構成たばこを製造するための方法であって、
    （a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料を供給する工程と、
    （b）たばこ繊維を水溶性材料から分離することにより、前記たばこ材料を再構成たばこに製造する工程と、
    （c）前記分離した繊維を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、少なくとも摂氏100度まで加熱して、前記分離した繊維の不溶性たばこ基質から前記タバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、
    （d）前記繊維を水溶液または溶媒で洗浄する工程と、
    （e）前記繊維および水溶性材料を再び組み合わせて再構成たばこシートを形成する工程と、
    （f）随意に前記再構成たばこをたばこ製品に組み込む工程とを含む、方法。
13. たばこカットフィラーとして使用するためのたばこを準備するための方法であって、
    （a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこ材料（たばこの茎など）を供給する工程と、
    （b）前記たばこ材料を液体または蒸気の存在下で少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度に加熱して、前記たばこ材料の不溶性たばこ基質から前記タバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、
    （c）前記放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を前記たばこ材料から除去する工程と、
    （d）前記たばこ材料を圧延して切断する工程とを含む、方法。
14. 圧延したたばこの茎を含むカットフィラーを製造する方法であって、
    （a）一つ以上のタバコ特異的ニトロソアミンを含むたばこの茎を供給する工程と、
    （b）液体または蒸気の存在下で前記たばこの茎を少なくとも約30秒間、摂氏約100度よりも高い温度まで加熱して、前記たばこの茎の不溶性たばこ基質から前記タバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を放出させる工程と、
    （c）前記放出されたタバコ特異的ニトロソアミンの少なくとも一部を前記たばこの茎から除去する工程と、
    （d）前記処理済みの茎を少なくとも一つの種類のたばこラミナ、エクスパンデッドたばこまたは再構成たばこと混合する工程と、
    （e）カットフィラーを製造する工程とを含む、方法。