JP2016509028A - 化学勾配 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C.第119条(e)に規定する、2013年2月19日に出願された米国仮特許出願第61/766,366号に基づく優先権を主張し、この仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
連邦政府による助成金を受けた研究についての記載
技術分野
本明細書に記載される態様は、下記の詳細な説明、実施例、および図面を参照することによってより容易に理解され得る。本明細書に記載される構成要素、装置、および方法は、しかし、詳細な説明、実施例、および図面に示される特定の実施形態に限定されない。開示された実施形態は、単に本発明の一例にすぎないことが認識されるべきである。多数の修正および改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者にとって容易に明白であろう。
単一のマイクロチャネルを備える装置
1つの変形形態では、化学勾配をもたらし、その中を通って軸索が成長するであろうマイクロチャネル内に、特定の成長因子を局所送達することができる、埋め込み型装置が作製される。この変形形態と比較するため、図1Aは、導管10内の管腔またはマイクロチャネル11を図示する。マイクロチャネル11は、活性物質(示されない)を含み、少なくとも一時的な望ましい化学ポテンシャルの領域を提供する。しかし、マイクロチャネル長にわたる活性物質濃度を、図1Aの構造を用いて制御することは難しい。この変形形態のための更なる比較例として、図1Bは、導管10内の埋め込まれた微粒子13を含むマイクロチャネル12を示す。微粒子13は、薬物または成長因子などの活性物質(図示されない)を含浸し、生分解性であり得る。微粒子13は、予測可能に長期にわたって、事前に選択されたか、または制御されたプログラム可能な方法で活性物質を、分解または別の方法で放出することができる。従って、図1Bの構造は、長期にわたってマイクロチャネル12内にある濃度の活性物質を供給し得る。しかし、このモデルは濃度勾配を持たない。一方、図1Cは、本開示の装置の実施形態を示す。コイル状繊維16は活性物質を含浸し、マイクロチャネル14を取り囲む。マイクロチャネル14は、ヒドロゲル導管10内に埋め込まれる。マイクロチャネル14の長さに沿った繊維のコイル16の配置は、マイクロチャネル14中に放出される活性物質の制御可能な勾配を作り出す。濃度、ひいては制御可能な勾配は、らせん状の巻き数、ピッチ数、もしくは巻きの間の横方向距離、繊維のサイズもしくは厚さ、および/または、チャネルの長さを変化させることによって予測可能に調整され得る。従って、図1Cの装置は、マイクロチャネル内に持続的な化学勾配を生じさせることによって長期的な活性物質送達を可能にする。化学勾配は、長期にわたる拡散によるコイル状繊維からマイクロチャネル内への活性物質の放出によってもたらされる。コイル状繊維からの活性物質放出の時間プロファイルは、繊維内の活性物質の濃度、活性物質の大きさおよび/または化学組成、繊維材料の化学組成および/または微細構造、ならびに導管内に配置されるマトリックス材料の化学組成および/または微細構造のうちの1つ以上に基づいて制御され得る。更に、マイクロチャネル周囲の繊維の巻き数は、いくつかの実施形態では、化学勾配の望ましい傾斜度をもたらすようにプログラムされ得る。「プログラムされる」という用語は、本明細書における言及目的では、望ましい結果をもたらすように制御され得る、制御可能な、任意の事前に選択され、あらかじめ決められた繊維のコイルの位置付けを意味することが理解される。化学勾配の「傾斜度」は、本明細書における言及目的では、所定の方向でマイクロチャネルの長さに対する、所定の活性物質または他の化学種の濃度のグラフの傾きを含む。
複数のマイクロチャネルを備える装置
本明細書に記載される装置は、いくつかの実施形態では、複数のマイクロチャネルを備える。このような装置は、間隙を超えて軸索の成長を促進するために使用され得る。軸索が間隙を超えて成長しなければならない場合、しばしば、特定のモダリティー(modalities)または種類の軸索を、異なるコンパートメントまたは空間領域内に分離する必要がある。このような分離は、感覚枝および運動枝の修復、ならびに/または閉回路の末梢神経インターフェイスの発達のために有用であり得る。更に、このような分離は、本明細書に記載される装置の複数のマイクロチャネルの周囲に本明細書に記載される複数の繊維を配置することによって実現でき、それらの繊維は、異なるマイクロチャネルに送達される成長因子の量および/もしくは種類が異なり、ならびに/または、異なるマイクロチャネル内にもたらされる化学勾配の傾斜度が異なる。このようにして、神経の混合集団に由来する特定の種類の軸索は、特定のマイクロチャネル内に誘引され、それによって最終的に特定の軸索型に適した標的に誘導され得る。更に、この過程は、混合集団中の複数の異なる軸索型のために実施され得る。
化学勾配を形成する方法
実施例1の図1Cの装置の一般構造を有する装置を使用して、以下のように、本明細書に記載される1つの実施形態の化学勾配を形成した。最初に、ポリ(DL-乳酸-co-グリコール酸)共重合体(PLGA)コイル状繊維を作製した。生分解性PLGA(85:15)共重合体(0.84固有粘度(i.v.)、135,000重量平均分子量(MW))を、湿式紡糸工程を用いて繊維にした。簡潔には、20 wt.% PLGA溶液をジクロロメタン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)に完全に溶解させた。この溶液をガラス製注射筒(気密性、Hamilton, Reno, NY)に充填し、イソプロパノールで満たした直径1.5-cmのチューブに注入することによって、繊維を形成した。あらかじめ洗浄したマイラー基板を回収用の糸巻きとして使用した。考えられる多くの紡糸パラメーターとともに、紡糸液注入速度および繊維回収速度を、それぞれ1.8 mL/hおよび8.5 m/minに制御することによって、直径30μmの繊維を得た。加えて、必要であれば、活性物質(例えば成長因子など)の生物活性を保護するために、ポリエチレングリコール(PEG)を紡糸用調合に加えた。コイル状繊維を形成するために、繊維をガラス棒に巻き付け(しばしば、形成繊維とも呼ばれる)、一晩乾燥させることによって残っているジクロロメタンを蒸発させた。形成後、繊維をチタン繊維(直径=250μm)の周囲にコイル状に巻き、使用前は4℃で保存した。
化学勾配を形成する方法
乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)コイルからの成長因子放出は、有限要素解析を用いて解かれる多媒体モデルの2つの配置(等方性および異方性)においてモデル化された。モデルは、COMSOL Multiphysicsにおいて、2.4 GHz Intel(登録商標)Core(商標)2 Quad プロセッサー搭載コンピューターを用いて実行され、250μmの直径および1cmの長さを有する円筒内に配置される250μmの直径および1μmの厚さを有するリングに定義された。第一の配置(等方性)は、20個のリングの均一な分布で構成された。第二の配置(異方性)は、互いに異なる間隔でリングの配置を有する3つの区画の配置で構成された。区画は、250、500、および1000μmを有する区画で構成された。充填されたPLGAコイルからの放出プロファイルは、分解性ポリマーからの放出のためのKorsmeyer-Peppas式の修正版を用いてモデル化された。コイルの初期条件は、1μgの均一な投与量として与えられた。28日間、シミュレーションを行った。
化学勾配を形成する方法
管腔内NGF-コラーゲン勾配プロトコール
コラーゲン充填多管腔神経ガイド(nerve guides)における分子勾配の作製によって持続的な成長因子放出を実現する方法は、図7A〜Gおよび図8A〜Bに示されるように、本明細書に記載される。これを実現するために、チタンロッドにコイル状に巻かれたNGF放出繊維を、透過性多管腔マトリックス(TMM)成型装置に作られた開口部に挿入した。TMMは、それを通してチタンロッドが挿入される向かい合った末端の穴を有する四角形のプラスチックオープンフレームで構成される。その後、1.5%アガロースを金属ロッド上に加え、NGF放出ポリマーコイルをアガロース中に効率的に埋め込んだ。
2つの繊維源を用いて、30μmのコイル状繊維を作製した。すなわち、乳酸グリコール酸共重合体(PLGA 85:15; 135KD)およびELUTE(商標)生分解性ポリジオキサノンである。PLGA繊維は湿式紡糸によって作製された。簡潔には、20%PLGA溶液をジクロロメタン(DCM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で調製し、循環しているイソプロパノール凝固浴槽にシリンジポンプ(1.8 mL/hr)を用いて供給し、同時に結果として生じる繊維を回転している糸巻き(8.5 m/min)に回収した。乾燥したPLGAコイル繊維を、NGF(10μg /mL; Invitrogen, Carlsbad, CA)、BSA(20 mg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)またはシアニン色素-3(Cy3; 5μg/mL; Jackson ImmunoResearch Lab, Inc., West Grove, PA)とともに一晩インキュベートした。ほとんどの試験は、TissueGen Inc, Dallas, TXによって特注生産されたELUTE(商標)生分解性ポリジオキサノン繊維を使用することによってNGFを封入し、それをチタン金属ロッド(0.25 mm×17 mm; SmallParts, Logansport, IN)に80回、等間隔(均一)、または縦軸方向の3.33 mmの領域に15、25、および40巻きの異なる間隔(10〜100 ng/mL勾配)のいずれかでコイル状に巻いた。繊維を室温で乾燥させ、使用するまで-20℃で保存した。
BSAまたはNGFのいずれかを含有するコイル状PLGA繊維と一体となった金属ロッドを、上述のようにTMM成型装置に配置した。滅菌状態のもとで、成型装置を、細胞培養皿中のスライドガラス上に置き、1.5%超高純度アガロースを用いて繊維を覆った。重合後、無テロメアのニワトリコラーゲン(atelomeric chicken collagen)(85%I型、15%II型; Millipore)に懸濁した褐色細胞腫細胞(PC-12;1×106 / mL)を、成型された250μm ODヒドロゲルマイクロチャネルに、発生する陰圧によって充填した。TMM細胞培養物を、10%HS、5%FBS、および1%pen/strepが追加されたRPMI-1640培地(Hyclone SH30027.02)中で72時間培養し、37℃および5%CO2で維持した。試験の終わりに、細胞培養物をPBSで十分に洗浄し、染色した。別の通常のPC12細胞培養物を、1×106 / mLの播種密度で標準的な培養皿で培養し、10〜100 ng/mL のNGF範囲に曝露してそれらの生物学的応答を測定した(図9A〜C)。PC12をバイオセンサーとして用いて、異なるNGF濃度に対する神経突起の応答を測定した。線形回帰を用いることによって方程式を定義し、PC12神経突起長に基づくTMMマイクロチャネル内のNGFの管腔濃度を計算した。PC12細胞は、様々なレベルのNGFに応答することを示した。図9A〜Cに示されるように、分化した細胞の神経突起長は、(共焦点画像に示されるように)NGF濃度のレベルが増加するにつれて増加する。図9Aは、10 ng/mLのNGF濃度を示す。図9Bは、20 ng/mLのNGF濃度を示す。図9Cは、50 ng/mLのNGF濃度を示す(スケールバー=100μm)。
均一配置と勾配配置との両方において、多媒体環境(すなわち、管腔コラーゲンを含むアガロースマイクロチャネル)を考慮し、有限要素解析を用いて、PLGAコイルからの成長因子放出をモデル化した。タンパク質放出速度は、べき乗方程式に、製造業者によって提供されるフィッティング放出データを用いることによって推定された。ジオメトリ(geometry)(K=0.37)、時間(t=0-28 d)、および放出機構(n=0.25;(Mt = M∞Kn)、式中、Mは放出される薬物の量であり、M∞は薬物の総量である)を有するべき乗方程式。PLGAコイルからの放出速度は、初期バーストに続く相互接続した細孔を介した拡散を考慮して、バルク浸食モデルを用いて推定された。Carman-Kozenyモデルを用いることによって、一定体積(Ω)での分子濃度(Φ)経時的変化(δt)を考慮した、水、1.5%アガロース、および0.3%コラーゲン中での分子拡散(D)を推定した。ポリマー繊維から放出される下記の式:δΦ/ δ t)∇Φ = Σ J*n∇Sによって表面(S)と垂直に統合される拡散流ベクトル(J=D∇Φ)。Multiphysics Modeling and Engineering Simulation Software(COMSOL 4.0)において、外部管(T)を3 mm OD、1.5 mm IDおよび10 mmの長さ、ならびにアガロースマイクロチャネルを有する固体円柱と見なして、モデルを実行した。使用されるメッシングモジュールには、180〜1000μmの最大エレメントサイズ、エレメントサイズ、1.5成長率および0.6の曲率解像度を有する境界について、四面体、三角形、および六面体メッシュボリュームエレメントが含まれた。モデルは、公開された厳密解を用いて検証され、in vitroで得られた放出速度データを統合した。
新生児(P0-4)DRG細胞を正常なマウスから分離し、均一または勾配NGFコイルのいずれかを有するTMMマイクロチャネルの一端に置いた。DRG培養物をNeurobasal A培地(Sigma, St. Louis, MO)中で培養し、浸漬によって4%PFA中でそれらを固定する前に37℃および5%CO2で7日間維持した。その後、培養物を洗浄、染色した。
免疫染色
TMMゲルをPBSで十分に洗浄した。その後、PC12細胞をOregon Green Phalloidinと反応させて、細胞骨格を標識した。DRG軸索成長の免疫標識のために、組織を4%ロバ血清中で1時間インキュベートし、その後マウス抗βチューブリンIII抗体(1:400; Sigma Aldrich)とともに一晩4℃でインキュベートした。その後、組織をCy2コンジュゲートロバ抗マウスIgG(1:400; Sigma Aldrich)とともにインキュベートし、洗浄した。Zeiss共焦点顕微鏡(Zeiss Axioplan 2 LSM 510 META)において長作動距離水浸対物レンズを使用することによって、直接ヒドロゲルマイクロチャネル内で細胞染色および軸索成長を評価した。
異なるNGFコイルの巻き数に対応する低濃度(SI)および高濃度(SII)領域(図10A〜K)のマイクロチャネル内部で、分化したPC12細胞の神経突起長を評価した。細胞体から神経突起の遠位端までの神経突起長を測定した。細胞直径より長い神経突起を有する細胞のみを、Axiovision LEソフトウェア(CarlZeiss, Axiocam, version 4.7.2)、Zeiss LSM Image Browser(version 4.2.0.1)を用いて、定量化について検討する。DRGの軸索長を、20×倍率でz-スタック(各308μmスライス厚で20画像)から定量化した。DRGの端から成長円錐末端までの軸索長を、Axiovision LEソフトウェア(CarlZeiss, Axiocam, version 4.7.2)およびZeiss LSM Image Browser(version 4.2.0.1)を用いて、コイルのない区画およびその区画内に中間のコイル数(1〜8)または高いコイル数(9〜15)を有する区画について測定した。Image Jを用いて、軸索の転向角を測定した。存在するすべての軸索の、転向した軸索の数に対する比率として、転向角の定量化を計算した。すべての実験を二連でそれぞれ3〜6回行った。
すべてのデータ値を、平均値±平均値の標準誤差として表した。PC12データは、パラメトリックなスチューデントのt検定と、その後のMann Whitneyポストホック評価によって解析された。DRG実験から得られたデータは、Prism 4 ソフトウェア(GraphPad Software Inc.)を用いて、ANOVAとその後のNewman-Keulsの多重比較によって評価された。p≦0.05を有する値を、統計的に有意であると見なした。
結果
3D NGF微小勾配中でのPC12の分化
ポリマーコイルが神経成長因子の生物学的に活性のある勾配を構築するために使用され得るかどうかを決定するために、BSAまたはNGF溶出コイルがヒドロゲル壁に固定されたTMMマイクロチャネルの管腔内で分化するPC12細胞の能力を試験した。播種3日後、BSA対照では、丸い未分化の細胞のみが観察された(図10A〜C)。一方、NGFコイルとともに培養された細胞は、PC12細胞体から伸長する神経突起によって示されるように、様々な程度の神経分化を示した。神経突起伸長は、チャネル内に置かれたコイルの巻き数に比例することが観察された。コイルの巻き数の少ないもの(区画I;SI)は、丸い未分化の細胞と神経突起を有する細胞の混合集団を示したが(図10D〜F)、コイルの巻き数のより多い領域のもの(区画II;SII)は、大部分が、明らかにより長いニューロン様の伸長を有する分化した細胞であった(図10G〜I)。この観察を確認するために、両方の領域において分化したPC12細胞の神経突起長を評価したところ、SI領域での細胞(55.76±12.53μm;p<0.005)と比較して、SII領域では有意により多数の分化したPC12細胞(87±14.6μm)を示した。これらの両方は、同様に、BSA放出コイルにおいて観察される細胞(9.31±1.94μm;p<0.0001)とは有意に異なっていた。図10Jおよび10Kを参照。
次に、コンピューターモデルを設計することによって、TMMマイクロチャネルの管腔コラーゲン充填剤におけるNGF拡散動態を予測した。TMMゲルの実際の物理的な大きさに従った10 mmの縦方向距離にわたり、アガロースとコラーゲンとの両方において、ポリマー繊維からマイクロチャネル管腔へのNGFと同様のサイズのタンパク質の拡散係数値を組み込んだCOMSOLにおけるコンピューターシミュレーションモデルが実行された。1、5および7日間にわたるマイクロチャネル容積(0.7 μl)中のNGF濃度が推定され、それらの壁表面に均一(U)および勾配(G)コイル分布パターンを有するものを比較した。管腔の0.1%コラーゲンを通るタンパク質拡散係数(7.6-12 m2/sec)は、1.5%アガロースマイクロチャネル構造を通る拡散係数(2.31-14 m2/sec)より速いため、拡散は主にコラーゲン軸を通じて起こる。モデルによると、7日間で、Uコイル配置のポリマー繊維は、マイクロチャネルに沿って約7 ng/mLの均一な濃度を形成し、近位および遠位の開口部付近から希釈される。一方、Gコイル配置は、より多くのコイルの巻き数を有する末端に向かって0.02〜12.42 ng/mLの直線勾配をもたらし、また末端付近から希釈される。予想された濃度の差に加えて、モデルは、2つの配置の間で有意と思われる経時的な変化を予測した。U配置は、チャネルの末端に次第により大きな希釈領域を伴い、長期にわたって安定を保つ。
ヒドロゲルマイクロチャネルの壁に施されたポリマーコイルが持続的な成長因子勾配を生じ得ることを確認した後、NGF溶出コイルのin vitroでの神経再生に対する効果を、TMMゲルの一端に置かれた新生児DRGから伸長した軸索繊維の数を評価することによって試験した(図13A〜F)。コイルを含まないゲル(図13B)を、均一な7巻きおよび14巻きのNGF封入コイルを含むゲルと比較した。軸索数の増加は統計学的差異には達しなかったが、軸索成長の程度は、陰性対照と比較して、NGFコイルを有するゲルにおいて質的により良好であった。しかし、軸索長の定量化は、成長因子なし(651.2±40.40μm)および低密度コイル群(808.18±55.57μm;<8巻き;図13E〜F)の両方と比較して、より高密度のNGFコイル群(1321±51.71μm;9〜15コイル巻き数)において有意に増加した(p<0.005;n=4)。感覚ニューロン再生に対するNGF勾配の有益な効果を確認するために、別のDRG群を、NGF濃度が18 ng/mLで一定に保たれる均一条件または勾配条件のいずれかに曝露した。
DRG軸索伸長における勾配NGFの成長促進効果に加えて、均一群における神経突起伸長はマイクロチャネルの壁上のコイルに向かって誘導されたことに注目した。実際、それらの群の軸索は、それらがコラーゲンを通って成長する際、上向きおよび下向きの軌道をたどることが観察された(図15A)。全く対照的に、NGF勾配が遠位端に向かって構築された群は、それらが伸長する際、軸索はコイルを無視して、確固とした直線状の成長を示した(図15B)。成長角度の定量化は、均一群の軸索が+60から−60°の幅広い方向性の成長を示し、この見解を支持した(図15C)。反対に、NGFの勾配を与えられた軸索は、より方向性のある成長角度を示し、+30から−30°であった(図15D)。
Claims (20)
- 第一末端および第二末端を有する導管と;
導管内に配置され第一末端から第二末端方向に延びる1つ以上のマイクロチャネルと;
少なくとも1つのマイクロチャネルの外部の周囲にコイル状に巻かれた繊維
とを備え、
前記繊維が、マイクロチャネルの内部に拡散することができる活性物質を含有する、装置。 - 前記導管が移植チューブを含む、請求項1に記載の装置。
- 前記マイクロチャネルが、導管内に配置されるマトリックス材料内に配置される、請求項1に記載の装置。
- 前記マトリックス材料が、アガロースゲル、乳酸グリコール酸共重合体、ポリ乳酸、カプロラクトン、またはその組合せを含む、請求項3に記載の装置。
- 前記マトリックス材料が、1.5%〜2.5%のアガロースを含有するアガロースゲルを含む、請求項3に記載の装置。
- 複数のマイクロチャネルが導管内に配置される、請求項1に記載の装置。
- 複数の繊維が、複数のマイクロチャネルの外部の周囲にコイル状に巻かれる、請求項6に記載の装置。
- 複数の繊維が、異なるマイクロチャネルの外部の周囲にそれぞれコイル状に巻かれる、請求項7に記載の装置。
- 少なくとも2つのコイル状繊維が、異なる活性物質、異なる量の活性物質、および/または異なるピッチを有する、請求項8に記載の装置。
- 前記繊維が、生分解性ポリマーを含む、請求項1に記載の装置。
- 前記繊維が、ポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド-co-ラクチド)、ポリ(ジオキサノン)、カプロラクトン、アルギナート、またはその組合せから形成される、請求項1に記載の装置。
- 前記マトリックス材料がアガロースゲルを含み、前記繊維がポリ(グリコリド)、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド-co-ラクチド)、ポリ(p-ジオキサノン)、カプロラクトン、アルギナート、またはその組合せから形成されるコイルを含む、請求項3に記載の装置。
- 前記繊維が、等方性の配置で、マイクロチャネル外部の周囲にコイル状に巻かれる、請求項1に記載の装置。
- 前記繊維が、異方性の配置で、マイクロチャネル外部の周囲にコイル状に巻かれる、請求項1に記載の装置。
- 前記活性物質が、薬物、ペプチド、タンパク質、成長抑制因子、または成長促進因子を含む、請求項1に記載の装置。
- ポリマー材料が生体コンパートメント内に配置された際、ポリマー材料から拡散することができる活性物質を含有するコイル状のポリマー材料を含む組成物。
- 前記生体コンパートメントが神経導管を含む、請求項16に記載の組成物。
- 装置を生体コンパートメント内に配置することを含む、化学勾配を形成する方法であって、
前記装置が、
第一末端および第二末端を有する導管と;
導管内に配置され第一末端から第二末端方向に延びる1つ以上のマイクロチャネルと;
少なくとも1つのマイクロチャネルの外部の周囲にコイル状に巻かれた繊維
とを備え、
前記繊維が、マイクロチャネルの内部に拡散することができる活性物質を含有する、方法。 - 前記生体コンパートメントが神経導管を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記化学勾配が薬物勾配または成長因子勾配を含む、請求項18に記載の方法。
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