CN105073154B - 化学梯度 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本文中描述了提供化学梯度的装置。在一些实施方式中，本文中描述的装置包含具有第一端和第二端的管道、布置在所述管道中并从第一端向第二端延伸的一个或多个微通道，和盘卷在至少一个微通道的外部周围的纤维，其中所述纤维包含活性剂，所述活性剂可操作地扩散到所述微通道的内部。

Description

化学梯度
相关申请的交互参考
本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求2013年2月19日提交的序号为61/766,366的美国临时专利申请的优先权，所述临时专利申请在此以其全部内容引为参考。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明根据国立卫生研究院/国立神经系统紊乱和中风研究所(NationalInstitutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke)(NIH/NINDS)授予的许可1R21NS072955-01A1，由政府支持完成。
技术领域
本发明涉及用于形成化学梯度的装置和方法，以及包含化学梯度的组合物，并特别涉及用于药物投送和其他生物医学应用的化学梯度。
背景技术
在损伤发展和之后的期间，神经细胞响应生物分子的梯度迁移并朝着适当的靶细胞和器官伸长它们的轴突，所述生物分子或是通过附着于所述细胞或细胞外基质(ECM)、或是通过分泌到细胞外液中而引导轴突再生(趋化性)。在一些情况下，趋化性的可溶分子由特殊的细胞分泌，并从释放位点通过扩散和对流形成梯度。对这种梯度的细胞响应可受到所述生物分子的性质、和ECM(其可包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)的物理特性例如基质孔度和硬度的影响。在发展中的周围神经系统(PNS)中，神经营养因子(NTF)例如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)的梯度由远端靶细胞和直接轴突伸长和脊髓腹侧运动神经元(VMN)的靶识别、以及背根神经节(DRG)中的感觉神经元来建立。在成人PNS中，感觉神经元的传出分支在损伤后自发地恢复皮肤和肌肉靶标的神经支配，但传入轴突不能进入成人脊髓的有害环境，除非受到诱发的NGF表达的诱使。此外，通过表达再建立NTF梯度的适当的基因表达，可显著减少在再生期间由损伤的VMN和DGR神经元产生的导向误差。
不幸的是，在神经修复中生成化学梯度例如NTF梯度和使用化学梯度仍然是极度富有挑战性的。例如，一些现有技术未能提供目标分子信号的持续释放和/或缺乏ECM支持。其他技术缺乏提供通常在体内存在的非瞬时和/或生理相关性化学梯度的能力。另外，以前一些用于生成化学梯度的方法只适用于体外短期研究和/或存在与注射病毒载体有关的风险。因此，需要改进的提供化学梯度的装置和方法。
发明内容
本公开涉及通过建立高度可调的化学梯度例如NTF或NGF梯度而可用于组织修复的方法、装置和组合物，所述化学梯度设计成通过充有ECM的多腔(multiluminal)或多通道水凝胶来引导轴突生长。为此，本公开涉及锚定于水凝胶微通道壁的新的盘卷聚合结构，所述结构用于建立渗透所述腔胶原蛋白的高度和可预测调节的可控和持续NTF释放梯度，其还稳定扩散因子的梯度并提供用于轴突伸长的容许和可预测地调节和控制/可控的生长底物。确定数学模型来描述在这种复杂基质中的NTF扩散和确定随时间的腔NTF浓度，利用DRG体外神经生长试验提供沿着所述三维NGF梯度的趋化性神经再生证据。这种方法被认为在受引导的组织修复上证明有用，以及其他用途。
本公开的方面涉及装置，其包含至少一个管道，所述管道具有第一端和第二端与布置在所述管道中并从第一端向第二端延伸的一个或多个微通道。纤维盘卷在至少一个微通道的外部周围，其中所述纤维包含活性剂，所述活性剂可操作地扩散到所述微通道的内部。在另一个方面，所述管道包含导管例如Micro-Renathane植入管。
在又一个方面，所述微通道布置在所述管道中的基质材料内。此外，所述基质材料可包括琼脂糖凝胶、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、胶原蛋白、聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚醚-聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚砜(PS)、聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO)、聚烯烃例如聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)，或一种或多种前述项的组合。
在又一个方面，所述基质材料包含琼脂糖凝胶，所述琼脂糖凝胶基于琼脂糖凝胶的总重量，包含约1.5重量％和2.5重量％之间的琼脂糖。此外，多个微通道优选布置在所述管道中，和多个纤维盘卷在多个微通道的外部周围。
在又一个方面，所述多个纤维各自盘卷在不同的微通道外部周围，并且至少两个所述盘卷纤维包含不同的活性剂、不同量的活性剂、和/或不同的节距(pitch)。
在又一个方面，所述纤维包含聚合材料或由其形成，所述聚合材料例如乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯或其组合。纤维也可包含其他材料或由其形成。另外，在另一个方面，所述聚合物是生物降解型。
在又一种变化形式中，所述纤维以各向同性构造和/或各向异性构造盘卷在微通道的外部周围。
在另一个方面，所述活性剂包含药物和/或生长因子。
本公开的方面还涉及形成化学梯度的方法，所述方法包括在生物室中布置本文中描述的任何装置。其他方面考虑了所述生物室包含神经管道。优选地，所述活性剂梯度包括药物梯度和/或生长因子梯度。
本公开的方面也涉及包含盘卷聚合材料的组合物，所述聚合材料包含活性剂，当所述聚合材料布置在生物室中时，所述活性剂可操作地从所述聚合材料中扩散出来。在另一个方面，所述聚合材料优选包括乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、或其组合。在又一个方面，所述聚合材料是生物降解型的。在又一个方面，所述活性剂包含药物和/或生长因子。在又一个方面，所述生物室包括神经管道。
本公开的其他变化形式还涉及组合物，和包含组合物的装置，所述组合物包含含有第一浓度的活性剂的第一凝胶和含有第二浓度的活性剂的第二凝胶，其中所述第一凝胶和第二凝胶间隔排列以提供所述活性剂的浓度梯度。
在另一个方面，所述组合物包含含有第三浓度的活性剂的第三凝胶，所述第一凝胶、第二凝胶和第三凝胶间隔排列、或取向，以提供包含所述活性剂浓度梯度的梯度区。在又一个方面，所述梯度区包含线性浓度梯度。此外，所述第一、第二和第三凝胶被排列成提供多个线性浓度梯度，或所述第一、第二和第三凝胶间隔排列或取向以在所述梯度区之外还提供非梯度区。
在另一种变化形式中，本公开涉及上面描述的组合物，其中所述第一凝胶和/或第二凝胶包含琼脂糖凝胶、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、或其组合和所述活性剂包含药物或生长因子。
此外，本公开涉及装置，其包含管道和布置在所述管道中的任何前述组合物。
另外，本公开涉及形成化学或活性剂浓度梯度的方法，所述方法包括在生物室、例如神经管道中布置任何前述装置并且其中所述化学或活性剂浓度梯度包括药物梯度或生长因子梯度。
此外，本公开涉及形成化学或活性剂梯度的方法，所述方法包括在生物室、例如神经管道中布置任何前述组合物并且其中所述化学或活性剂浓度梯度包括药物梯度或生长因子梯度。
附图说明
图1A-B示出了包含微通道的管道的透视图。
图1C示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的透视图。
图2示出了根据本文中描述的一种实施方式，引导神经细胞进入装置的混合神经群体的示意性透视图。
图3示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的示意性透视图。
图4A-E示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的各种组件的照片。
图5A示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的示意性透视图。
图5B-D示出了由图5A的装置提供的化学梯度的显微镜图像。
图6示出了与图5B-D的化学梯度对应的平均细胞突长度。
图7A示出了根据本文中描述的一种实施方式的化学梯度的示意性透视图。
图7B-C示出了包含多个微通道的管道的透视图。
图7D示出了根据本文中描述的一种实施方式，包含多个微通道的装置的透视图。
图7E示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的透视图，和所述装置对应的密度测定图谱。
图7Fi-iii示出了根据本文中描述的一种实施方式的装置的制造方法。
图7G-I是图7E中显示的形态的显微镜图像。
图8A示出了根据本文中描述的方法的一些实施方式形成的化学梯度的一系列显微镜图像。
图8B示出了图8A的化学梯度曲线。
图9A-C示出了根据本文中描述的一种实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞的显微镜图像。
图10A-I示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞的显微镜图像。
图10J示出了对应于图10Α-Ι的图形。
图10K示出了对应于图10A-J的校准曲线。
图11示出了根据本文中描述的化学梯度的一些实施方式，分子的释放轮廓线图形。
图12示出了根据本文中描述的化学梯度的一些实施方式，分子的释放轮廓线图形。
图13A-D示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞的显微镜图像。
图13E-F示出了图13A-D对应的图形。
图14A-B示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞的显微镜图像。
图14C示出了图14A-B对应的图形。
图15A-B示出了根据本文中描述的一些实施方式，安置在化学梯度中的神经细胞的显微镜图像。
图15C-D示出了图15A-B对应的图形。
图16示出了根据本文中描述的方法的一种实施方式，轴突生长的转向角比率的图形。
图17示出了根据本文中描述的一种实施方式的组合物的示意性透视图。
图18示出了根据本文中描述的一种实施方式的组合物的扫描电子显微镜(SEM)图像。
具体实施方式
通过参考以下详细说明、实施例和图，可以更容易地了解本文中描述的方面。然而，本文中描述的要素、装置和方法不限于在详细描述、实施例和图中介绍的具体实施方式。应该认识到，所公开的实施方式仅仅说明本发明的原理。许多的修改和改编在不背离本发明的精神和范围下，对本领域技术人员将是容易地显而易见的。
另外，本文中公开的全部范围要理解为包括在其中包含的任何和全部子范围。例如，“1.0至10.0”的陈述范围应该考虑包括以最小值1.0或更大开始并以最大值10.0或更小结束的任何和全部子范围，例如1.0至5.3，或4.7至10.0，或3.6至7.9。
本文中公开的所有范围还被认为包括所述范围的端点，除非明确地另有说明。例如，“5和10之间”的范围通常应该认为包括端点5和10。
另外，当词组“高达”结合量或数量使用时，要理解所述量至少是可检测的量或数量。例如，存在量“高达”规定量的材料可以从可检测量起并高达和包括所述规定量。
如在下文进一步描述，本公开涉及可用于形成化学梯度、包括在生物环境内形成化学梯度的方法、装置和组合物。另外，这种化学梯度可用于组织修复和/或药物投送。例如，在一些情况下，可通过建立高度可调的神经生长因子(NGF)梯度，所述梯度被设计成引导轴突生长穿过本文中描述的装置的微通道、例如充有细胞外基质(ECM)材料的水凝胶微通道，来实现组织修复。
因此，本公开的方面涉及可用于提供持续的化学梯度、包括在生物环境中提供持续化学梯度的装置、方法和组合物。在一种变化形式中，纳入了已知量活性剂、例如生长因子的纤维以预定和预选的取向盘卷，优选在管道中微通道的壁、或外周长周围。以这种方式，可以向被引入微通道的组织可控地提供预定浓度的所述活性成分。在一些实施方式中，可以通过沿着所述微通道的长度有意改变存在于给定区域中的纤维节距或卷数，从而沿着所述微通道的长度可预测地改变所投送的活性剂浓度。以这种方式，可以建立沿着微通道长度的浓度梯度。例如，当在所述盘卷纤维中提供活性剂例如生长因子(GF)时，这种盘卷纤维可以在一个或多个微通道或腔周围或内部盘卷，以在所述微通道或腔中提供一种或多种限定的GF梯度。因此，公开了方法、装置和组合物来生成预定、预选和可预测地控制的化学梯度。这样的化学梯度本文中也可以称为“可编程”梯度。在一些实施方式中，所述梯度通过本文中描述的纤维的节距或圈数实现。
在一些实施方式中，本文中描述的装置包含具有第一端和第二端的管道、布置在所述管道中并从第一端向第二端延伸的一个或多个微通道，和在至少一个微通道的外部周围盘卷的纤维，其中所述纤维包含活性剂，所述活性剂可操作地扩散到所述微通道的内部。所述装置的管道可具有任何尺寸、形状和结构，并由不会与本发明的目的不相容的任何材料形成。例如，在一些实施方式中，所述管道由聚合材料例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、或聚烯烃例如聚乙烯或聚丙烯等等形成。此外，在一些情况下，所述管道具有基本上管形或圆柱形的形状。在一些实施方式中，这种管形或圆柱形的管道具有的内径在约100μm和约50mm之间，约100μm和约10mm之间，约1mm和约10mm之间，约1mm和约5mm之间，或约200μm和约500μm之间。在一些情况下，所述管道具有的直径大于约50mm或小于约100μm。另外，在一些情况下，本文中描述的管道具有的长度在约1mm和约200mm之间，约5mm和约100mm之间，约10mm和约30mm之间，或约50mm和约150mm之间。
另外，本文中描述的管道可包含不会与本发明的目的不相容的任何材料或由其形成。例如，在一些实施方式中，所述管道由聚合材料形成，所述聚合材料例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚己内酯、聚乳酸(PLA)、胶原蛋白、聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚醚聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚砜(PS)、聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO)、聚烯烃例如聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)，或一种或多种前述项的组合。在一些情况下，所述管道包含一段植入管或导管，例如Micro-Renathane植入管。也可以使用其他材料。
类似地，本文中描述的管道的微通道可具有不会与本发明的目的不相容的任何大小与形状。例如，在一些情况下，基本上管形或圆柱形的微通道具有的直径在约100nm和约2000μm之间，约100nm和约50μm之间，约100nm和约1μm之间，约500nm和约10μm之间，约500nm和约5μm之间，或约500nm和约1μm之间。在一些实施方式中，所述微通道具有的平均直径在约100μm和约2000μm之间，约100μm和约1000μm之间，或约300μm和约800μm之间。在一些情况下，所述微通道具有的平均直径小于约100μm或大于约2000μm。另外，所述微通道可具有高达所述装置的管道长度的约99％、高达约95％、高达约90％或高达约80％的长度。
另外，在一些实施方式中，本文中描述的装置的微通道布置在所述管道中布置的基质材料内。可以使用不会与本发明的目的不相容的任何基质材料。例如，在一些情况下，基质材料包含水凝胶，例如生物降解型水凝胶。为了本文中参考的目的，“生物降解型”材料包括可在生物环境内分解、并可以提供无毒分解产物的材料。在一些情况下，本文中描述的可生物降解材料包含一个或多个酯键。在一些情况下，本文中描述的装置的基质材料包含琼脂糖凝胶。可以使用不会与本发明的目的不相容的任何琼脂糖凝胶。例如，在一些情况下，所述基质材料包含琼脂糖凝胶，所述琼脂糖凝胶基于琼脂糖凝胶的总重量，包含约0.5和约5重量％之间的琼脂糖、约1和约4重量％之间的琼脂糖、或约1.5和约2.5重量％之间的琼脂糖。适合用于本文中描述的装置的一些实施方式中的其它非限制性基质材料的例子包括乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、胶原蛋白、聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚醚-聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚砜(PS)、聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物(PEO-PPO)、聚烯烃例如聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)，或一种或多种前述项的组合。其他基质材料也可以单独或组合使用。
此外，不会与本发明的目的不相容的任何纤维都可以盘卷在本文中描述的微通道外部周围。为了本文中参考的目的，“纤维”包括任何伸长的结构，例如股或细丝。本文中描述的纤维可具有不会与本发明的目的不相容的任何直径。例如，在一些实施方式中，本文中描述的纤维具有的直径(在以本文中描述的方式盘卷或盘卷之前)在约100nm和约100μm之间，约500nm和约50μm之间，约1μm和约50μm之间，或约10μm和约50μm之间。另外，在一些实施方式中，盘卷的纤维包括外径在约10μm和约1000μm之间、约50μm和约500μm之间、或约100μm和约500μm之间的卷、环或圈。
关于所述纤维相对于微通道的优选取向，要理解所述纤维以其优选的盘卷状态优选占据由所述微通道的外周长限定的区域，或是与所述外周长相邻另行取向。以这种方式，在本文中使用时，术语“微通道的外部”是指所述盘卷纤维借此与微通道一致定位、或环绕所述微通道的任何取向。
另外，在一些变化形式中，本文中描述的装置的纤维包含聚合物例如生物降解型聚合物或由其形成。在一些情况下，纤维包含聚乙交酯、聚丙交酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚对二氧六环酮、藻酸盐、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯或其组合，或由其形成。此外，如下文进一步描述，本文中描述的装置的纤维可以用不会与本发明的目的不相容的任何方式盘卷在所述装置的微通道外部周围。例如，在一些情况下，所述纤维以各向同性构造盘卷在所述微通道外部周围。为了本文中参考的目的，“各向同性”构造包括具有均等或基本上均等节距的构造。为了本文中参考的目的，纤维的“节距”包括每长度的纤维盘卷周围的微通道的纤维的环或卷数。为了本文中参考的目的，“均等的”节距包括沿着微通道长度没有变化的节距。为了本文中参考的目的，“基本上”均等的节距包括沿着微通道长度的变化小于约10％、小于约5％、或小于约1％的节距。或者，本文中描述的纤维以各向异性构造盘卷在所述微通道的外部周围，也是可能的。为了本文中参考的目的，“各向异性”构造包括非各向同性构造，例如在下文进一步描述的非各向同性构造。此外，在一些变化形式中，本文中描述的纤维不阻断或阻塞本文中描述的装置的微通道。
本文中描述的纤维的活性剂可包括不与本发明的目的不相容的一种或多种活性剂。为了本文中参考的目的，“活性剂”包括可以以本文中描述的方式提供化学梯度的化学物种。例如，在一些情况下，活性剂包括药物、肽、蛋白、生长抑制因子、或生长促进因子例如神经生长因子(NGF)。因此，在一些实施方式中，由本文中描述的装置提供的化学梯度包括药物浓度梯度或生长因子浓度梯度。可以使用不会与本发明的目的不相容的任何药物。活性剂也可包括其他需要的分子信号或标志物。另外，在一些实施方式中，所述活性剂是生物活性的和/或未变性的。
此外，如下文进一步描述，本文中描述的装置的的一些实施方式包含布置在管道中的多个微通道。所述微通道可具有相同或不同的大小、形状和/或结构。另外，在包含多个微通道的一些情况下，多个纤维可盘卷在所述多个微通道中一个或多个的外部周围。在一些情况下，所述多个纤维各自盘卷在不同的微通道外部周围，并且至少两个所述盘卷纤维包含相同或不同的活性剂、相同或不同量的活性剂、和/或相同或不同的节距和/或尺寸。
在另一个方面，本文中描述了组合物，其在一些实施方式中与一些其他组合物相比较，可提供一个或多个优点。例如，在一些实施方式中，本文中描述的组合物提供了也由本文中描述的装置提供的一个或多个优点。此外，在一些情况下，本文中描述的组合物可附加或代替本文中描述的装置用于形成化学梯度。
在一些实施方式中，本文中描述的组合物包含盘卷的聚合材料，所述聚合材料包含活性剂，当所述聚合材料布置在生物室中时，所述活性剂可操作地从所述聚合材料中扩散出来。在一些情况下，所述盘卷的聚合材料可具有与本文中描述的装置的纤维相同的结构。例如，在一些情况下，本文中描述的组合物的盘卷聚合材料是生物降解型。在一些实施方式中，所述聚合材料包括乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、或其组合。另外，在一些情况下，所述活性剂包含药物或生长因子。还有，本文中描述的组合物的生物室可包括不会与本发明的目的不相容的任何生物室。例如，在一些情况下，所述生物室包含活生物的部分。另外，在一些实施方式中，所述生物室包含神经管道。也可以使用其他生物室，如本文中进一步的描述。
在其他变化形式中，本文中描述的组合物不一定包括盘卷组分，例如本文中描述的盘卷纤维或聚合材料。例如，在一些情况下，本文中描述的组合物包含含有第一浓度的活性剂的第一梯度材料或基质和包含第二浓度的所述活性剂的第二梯度材料或基质，其中所述第一基质和第二基质间隔排列以提供所述活性剂的浓度梯度。所述活性剂可包括本文中描述的任何活性剂，例如药物或生长因子。此外，在一些变化形式中，本文中描述的组合物还包含含有第三浓度的所述活性剂的第三梯度材料或基质，并且所述第一基质、第二基质和第三基质间隔排列、或取向，以提供包含所述活性剂浓度梯度的梯度区。在一些情况下，所述梯度区可包含线性浓度梯度。另外，在一些实施方式中，排列本文中描述的组合物的第一、第二和第三基质以提供多个浓度梯度，包括多个线性浓度梯度。此外，在一些情况下，可排列所述第一、第二和第三基质，以在本文中描述的梯度区之外还提供非梯度区。本文中描述的组合物的梯度材料或基质可包含不会与本发明的目的不相容的任何材料或由其形成。例如，在一些情况下，基质是包含聚合材料、包括生物降解型聚合材料或由其形成的凝胶。在一些实施方式中，凝胶包括水凝胶。在一些情况下，凝胶包含琼脂糖凝胶、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯或其组合，或由其形成。其他凝胶或非凝胶材料也可以用作基质以建立目标梯度。
另外，如本文中描述，组合物可布置在管道中来提供装置。因此，在另一个方面，本文中描述了装置，其中所述装置包含管道与布置在所述管道中的本文中描述的组合物。
在又一个方面，本文中描述了形成化学梯度的方法，在一些变化形式中，其与一些其他方法相比，可以提供一个或多个优点。例如，在一些情况下，本文中描述的方法可以以模块化和/或可调的方式提供化学梯度。还有，在一些情况下，本文中描述的方法可提供在体内表现出持续、非瞬时化学梯度的化学梯度。在一些变化形式中，本文中描述的形成化学梯度的方法包括在生物室中布置本文中描述的装置和/或组合物。在一些情况下，所述化学梯度包括活性剂浓度梯度，例如药物梯度或生长因子梯度。此外，在一些情况下，所述生物室包括神经管。另外，本文中描述的任何装置和/或组合物可以用于本文描述的方法。
本文中描述的一些实施方式在下面的非限制性实施例中进一步说明。
实施例1
包含单个微通道的装置
在一种变化形式中，制作植入式装置，其提供化学梯度并使得能够在微通道内定位投送特定的生长因子，轴突将穿过所述微通道生长。出于对这种变化形式的比较目的，图1A示出了在导管10内的腔或微通道11。微通道11包含活性剂(未显示)以提供期望的化学势的至少一个瞬时区。然而，在所述微通道长度上的活性剂浓度难以利用图1A的结构来控制。作为这种变化形式的另一个比较例，图1B显示了在导管11内的微通道12，其包含包埋的微粒13。微粒13用活性剂(未显示)例如药物或生长因子浸渍并且可以是生物降解型的。微粒13可随时间以预选或受控的、可编程的方式可预测地降解或以其他方式释放所述活性剂。因此，图1B的结构可在一段时间中在微通道12内提供活性剂浓度。然而，这种模型缺乏浓度梯度。相形之下，图1C显示了根据本公开的装置的实施方式。盘卷纤维16用活性剂浸渍并围绕微通道14。微通道14包埋在水凝胶管道10内。沿着微通道14的长度布置纤维16的盘卷生成了释放到微通道14中的活性剂的可控梯度。所述浓度、和进而的可控梯度，可通过改变螺旋圈数、节距、或圈之间的横向距离、所述纤维的尺寸或厚度、和/或通道的长度来可预测地调节。因此，图1C的装置通过在微通道中产生持续的化学梯度，容许长期投送活性剂。所述化学梯度通过从所述盘卷纤维释放活性剂并通过随时间扩散进入微通道而提供。从盘卷纤维释放活性剂的时间轮廓可根据下面的一项或多项来控制：纤维内的活性剂浓度，活性剂的尺寸和/或化学组成，纤维材料的化学组成和/或显微结构，和布置在所述管道中的任何基质材料的化学组成和/或微结构。另外，在一些实施方式中，在所述微通道周围的纤维圈数，可被编程以提供期望的化学梯度陡度。为了本文中参考的目的，术语“编程”要理解为是指所述纤维盘卷的任何预选和预定取向可以被控制并且是可控的，以提供期望的结果。为了本文中参考的目的，化学梯度的“陡度”包括给定的活性剂或其他化学物种相对于微通道长度在给定的方向中的浓度曲线的斜率。
实施例2
包含多个微通道的装置
在一些实施方式中，本文中描述的装置包含多个微通道。这样的装置可用于刺激轴突跨过间隙生长。当轴突必须跨过间隙生长时，经常需要将特定形态或类型的轴突分离到不同的室或空间区域中。这样的分离可用于感觉和运动分支的修复和/或闭路外周神经接口的发育。此外，可通过将多个本文中描述的纤维布置在本文中描述的装置的多个微通道周围来实现这样的分离，其中所述纤维在传递给不同微通道的生长因子的量和/或类型上不同和/或在所述不同的微通道内提供的化学梯度的陡度上不同。以这种方式，可诱使来自混合神经群体的特定类型的轴突进入特定的微通道并从而最终引导到所述特定轴突类型的适当靶标。另外，可对所述混合群体中的多个不同的轴突类型进行这种方法。
图2显示了在多腔管道中应用几个盘卷纤维、优选具有不同梯度来引导轴突和具有不同形态的其他细胞类型的示意图。这允许在提供每种细胞类型的最佳浓度梯度时将不同细胞类型指导到所述管道。形态特异性轴突引导是建立所述梯度的一种预期应用。更具体地说，图2是示意图，显示了来自混合神经群体的几个轴突20被引导到多腔管道22中，所述多腔管道具有位于各自的微通道24b、25b、26b、27b的盘卷纤维24a、25a、26a、27a，并且每个微通道任选能具有不同的形态。在这种变化形式中，每个腔或微通道被螺旋缠绕的纤维包围，所述纤维含有已知诱使特定类型的神经元(神经细胞)生长的特异性分子信令(例如神经营养蛋白或多效蛋白)。所述分子信令的释放在所述盘卷纤维内部的微通道中生成梯度。所述梯度可通过在上文进一步描述的纤维体系结构而控制(例如，通过选择螺旋圈的总数、相邻的圈之间的横向距离、和/或圈的节距)。
为了证实多种生长因子的协同效应，测试从单一的神经营养性或多营养性因子中萌发的感觉神经元的生长。这种试验测定了由这些化学刺激引起的生长的基线。图3是示意图，显示了应用多个盘卷纤维在多通道管道中提供不同的梯度来引导轴突和其他类型的细胞。如图3中所示，管道30包括第一微通道32，所述微通道具有绕所述微通道壁的长度取向的两个盘卷纤维33、34。类似地，第二微通道36具有绕第二微通道壁的长度取向的两个盘卷纤维37、38。这种结构容许将不同的细胞类型引导到不同的微通道，其中每个微通道可具有具体活性剂与对所述不同细胞类型的预期效果相对应的期望、预选和最佳浓度梯度。例如，可各自选择不同微通道的不同化学梯度，以促进不同类型轴突的生长。要理解，任何数量的活性剂和任何数量的纤维可以围绕微通道以达到目标化学梯度的任何方式布置。
实施例3
形成化学梯度的方法
具有实施例1中图1C装置的一般结构的装置用于根据本文中描述的一种实施方式如下形成化学梯度。首先，制作聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)盘卷纤维。所述生物降解型PLGA(85:15)共聚物(0.84本征粘度(i.v.)，135,000重均分子量(MW))利用湿纺丝工艺被做成纤维。简单说，20重量％PLGA溶液完全溶解在二氯甲烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中。这种溶液装入玻璃注射器(气密性，Hamilton，Reno，NY)并注射到充有异丙醇的1.5-cm直径管中，以形成纤维。预洗过的聚酯薄膜基材用作收集卷轴。在许多可能的纺丝参数下，所述纺丝溶液注射速率和纤维收集速度分别控制在1.8mL/h和8.5m/min，以获得30μm直径纤维。另外，如有必要，向所述纺丝制剂添加聚乙二醇(PEG)以保存活性剂(例如生长因子)的生物活性。为了形成盘卷纤维，所述纤维缠绕在玻璃棒周围(有时也称为形成纤维)并干燥过夜，从而让任何残留的二氯甲烷蒸发。形成之后，所述纤维在使用之前盘卷在钛纤维(直径＝250μm)周围并在4℃储存。
为了形成包含活性剂(或对照物种)的纤维，所述盘卷纤维放置于所述活性剂的溶液中过夜。例如，下列溶液用于形成包含活性剂(或对照物种)的PLGA纤维：(1)神经生长剂NGF(5μg/mL，Invitrogen，Carlsbad，CA)；(2)对照物种牛血清白蛋白(BSA，20mg/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)；和(3)荧光物种花青染料-3(Cy3，5μg/mL，JacksonImmunoResearch Lab，West Grove，PA)。
负载Cy3的PLGA盘卷纤维利用光学显微术和荧光显微术成像，以证明所述盘卷提供了化学梯度并且倾向于保持它们的结构，甚至在去除所述制造金属后。图4A-F显示了相同的纤维在低和高浓度区域中的放大(显微镜)图像，证实了负载了荧光染料(Cy3)的纤维的圈数和发出荧光有显著差异。图4A显示了围绕制造纤维(未显示)的缠绕卷40的图像。图4B显示了可放置在神经管道中的盘卷PLGA纤维42。图4C-F是在图4B中显示的方框44、46中的区域的较高放大倍数图像。图4D中的Cy3-PLGA盘卷纤维47从高密度区成像，其中“高密度”是指比较高的节距(方框44)。Cy3-PLGA盘卷纤维48从低密度区(方框46)成像。
所述纤维的制造需要苛刻的化学程序，例如应用有机溶剂(二氯甲烷)。为了证实生长因子(蛋白质)在制造所述盘卷的过程中始终保留，在嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞存在下提供负载NGF的盘卷纤维。PC-12细胞是在神经生长因子(NGF)存在下增殖和分化的细胞系。细胞/ECM悬液利用在下文马上进一步描述的透明多腔基质(TMM)装置，装入所述浇铸装置区域的细胞孔中，并通过生成负压推到所述腔中。接种在所述腔内部的细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定24小时并用俄勒冈绿鬼笔环肽和TO-PRO3碘化物(Invitrogen，Carlsbad，CA)染色以分别显现原样的细胞骨架和核标记。测量在零、低和高浓度区域中所述PC-12细胞突起长度。为了促进染色染料的渗透，所述凝胶放置在细胞培养板中，同时所述溶液利用磁性板和搅拌棒在4℃搅拌过夜。
嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)加入用于浇铸琼脂糖凝胶的新的长方形框架(12.5mmx36mm)中。所述浇铸装置用牙科粘固剂制成并用于引导多个钛纤维(0.25mmx17mm；SmallParts，Logansport，IN)。缠绕了含生长因子的聚合物卷的钛纤维在所述装置的两端处穿过通孔布置。在无菌条件下，所述浇铸装置放在细胞培养皿中的玻璃载片上并施加1.5％超纯琼脂糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液以覆盖所述纤维并使其聚合。PC 12细胞(1xl06ml)悬浮在生长因子减少的基质胶(3.5mg/mL，BD Biosciences，San Jose，CA)中。在从所述固化的凝胶去除钛纤维期间产生的负压，拉动所述PC12细胞/ECM混合物进入所述浇铸的水凝胶微通道的腔内。所述生长因子盘卷纤维在所述腔中完好并接近接触PC12细胞。所述细胞培养物饲以RPMI-1640培养基(Sigma，St.Louis，MO)并在37℃和5％CO2培养箱中保持72小时。
为了显现所述微通道中分化的PC12细胞，所述凝胶在4％多聚甲醛(PFA)中固定并处理，用于免疫荧光。用封闭溶液(0.1％Triton-PBS/1％正常血清)清洗所述凝胶后，所述样品分别用俄勒冈绿鬼笔环肽和TO-PRO3碘化物(Invitrogen，Carlsbad，CA)作为细胞骨架和核标记进行温育。所述染色利用Zeiss共焦显微镜(Zeiss Axioplan2LSM 510META)评价。所述染色利用常规和荧光显微术以及z-协议栈(z-stack)3D图象重构来评价和分析所述多腔水凝胶中的微血管网络。在3种不同的盘卷密度(无，低和高)中PC-12细胞突起长度的定量利用Axiovision LE软件(CarlZeiss，Axiocam，4.7.2版)和Zeiss LSM Image Browser(4.2.0.12版)完成。
所有数据值表示为均值±平均标准误差。数据利用Prism 4软件(GraphPadSoftware Inc.)通过参数student-t检验或通过非参数student-t检验继以Mann Whitney事后评价进行分析。P≤0.05的值被认为有统计学显著性。
图5A-D证明在负载了NGF的微通道中的PC-12细胞的生物活性。图5A是试验设计的示意图。负载了NGF的盘卷纤维52放入神经管道50中。PC-12细胞然后负载在所述通道内部。图5B是显微镜图像，显示了位于所述卷远侧的PC-12细胞(在微通道中的区域相当于图5A中的“方框B”)。这些细胞在接种后24小时没有显示任何突起。图5C是显微镜图像，显示了位于所述卷中部的PC-12细胞(在微通道中的区域相当于图5A中的“方框C”)。这些细胞在24小时中分化并表现出一些突起。图5D是显微镜图像，显示了位于具有最高的盘卷圈数的高密度通道区域中的PC-12细胞(在微通道中的区域相当于图5A中的“方框D”)。24小时后，该区中细胞分化并表现出长突起。在没有NGF负载卷的区域中，所述腔内部的细胞图像外观球形并且没有显示突起。然而，在有负载NGF的盘卷纤维的区域中接种的细胞完全分化并具有长突起。有趣的是，这些突起在有高密度卷的区域中更长。这证实了有更高圈数的区域将释放更多NGF，因此具有较高的生长因子浓度。为了量化所显现的图像，测量了等于或长于细胞体的所有突起的长度。所述数据的定量分析显示，在图5B-D中描绘的三个“方框”区域B-D中细胞突起的长度之间有显著差异(参见图6)。P值等于或小于0.05被认为有显著性。近侧区域(p<0.002；n＝6；71.33+/-12.17μm)和中部(35.66+/-12.69μm)与远侧(1.4+/-1.14μm)相比，突起的平均长度明显较高。
图6图示了在微通道中负载NGF的盘卷纤维中PC12细胞的生物活性。负载NGF的纤维卷放入神经管道中。通过测量在无任何NGF的区域(图5A中“方框B”)、有低密度盘卷圈数的区域(图5A中“方框C”)和有高密度盘卷圈数的区域(图5A中“方框D”)中的细胞突起，确定PC-12细胞的生物活性。细胞在接种后24小时成像并利用ImageJ测量突起长度。如图6中所示，所述卷的远侧负载的PC12细胞(图5A中方框B)在接种后72小时没有显示任何突起。位于所述卷中部(图5A中方框C)的PC12细胞在24小时内分化并具有一些突起。72小时后，位于所述通道具有最多的负载NGF盘卷圈数的高密度区域(图5A中显示的图像中的方框D)中的PC12细胞分化并具有长突起。位于所述卷中部(图5A图像中方框C)的PC12细胞在24小时内分化并具有一些突起。所述不同区域中细胞突起的长度有显著差异(*)p<0.05和(**)p<0.005。
实施例4
形成化学梯度的方法
从乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)卷的生长因子释放利用有限元分析以两种构造(各向同性和各向异性)的多介质模型建模。所述模型利用2.4GHzCoreTM2Quad处理器计算机以COMSOL Multiphysics完成并构成分布在直径250微米和长度1厘米的圆筒内部的直径250微米和厚度1微米的环。所述第一种构造(各向同性)由均等分布的20个环组成。所述第二种构造(各向异性)由排列的3段组成，所述段排列了相互距离不同的环。所述段由250、500和1000微米的段组成。从所述负载的PLGA卷的释放轮廓利用针对从可降解聚合物释放的改良形式的Korsmeyer-Peppas方程建模。所述卷的初始条件取作1微克的均等负荷。所述模拟持续28天的时间段。
在所述数学模型中，所述填充管道被认为具有琼脂糖凝胶的扩散系数。所述通道的直径被认为是250μm。所述数学分析的结果显示，各向同性的盘卷纤维在通道中产生均匀的浓度，所述浓度保持28天。所述管道的两端被认为是开放的。因此，在近端和远端中，由于从所述腔中出去的扩散通量，观察到生长因子浓度降低。然而，所述近端和远端的浓度变化与中部相比是微不足道的(小于所述中部浓度的15％)并且所述管道结构倾向保持所述均匀的浓度。所述盘卷纤维的各向异性构造早在5天时就产生梯度并倾向于长时间保持所述梯度(至少28天)。从所述远端和近端出去的生长因子通量没有影响所述梯度的建立。在整个研究期间(从第5天至28天)，所述梯度的陡度基本上保持相同。注意了所述盘卷纤维的各向同性设计的数学推断。所述各向同性设计中均匀分布的梯度在所述微通道中将保持至少28天。利用Comsol，所述微通道中的预计浓度分布的图像证实了在各向异性构造中持续梯度至少建立了28天。
实施例5
形成化学梯度的方法
腔内NGF-胶原蛋白梯度方案
本文中描述的方法通过在胶原蛋白填充的多腔神经导向装置中产生分子梯度，实现了持续的生长因子释放，如图7A-G和图8A-B中所示。为了达到这个目的，盘卷在钛棒上的NGF释放纤维被插入在透明多腔基质(TMM)浇铸装置中制成的开口中。所述TMM由正方形塑料开放框架组成，所述框架在两端处有插入所述钛棒的孔。随后在所述金属棒上添加1.5％琼脂糖，将所述NGF释放型聚合卷有效包埋在琼脂糖中。
神经导向装置(NG)在管壁中结合了NTF梯度(图7A)或使用NTF-洗脱型微粒(7C)。然而，当前的多腔NG设计缺乏梯度NTF释放。本研究利用盘卷的聚合纤维锚定到具有腔胶原蛋白的水凝胶微通道的壁上来解决这种局限(图7D)。图7E是盘卷在金属棒上的负载了Cy3IgG的PLGA纤维的照片。荧光成像和密度测定法说明了所生成的梯度。图7F是透明多腔基质(TMM)浇铸装置的示意图，显示了纤维卷部署。在琼脂糖聚合后从所述TMM除去所述金属棒将所述卷锚定在微通道的壁上，同时用胶原蛋白填充所述腔(图7Fi-iii)。在图7G中，共焦图像显示了在所述TMM中部署的聚合卷(红色)与胶原蛋白填料(绿色)。比例尺＝100μm。
更具体地说，如图7A中所示，胶原蛋白管道70a包含以梯度提供的NGF。图7B显示了管道70b，其包含含有NGF的多腔或微通道72b。图7C显示了管道70c，其包含含有NGF微粒74的多腔或微通道72c。在这种变化形式中，微通道72c各自包含基本上均等的NGF浓度。图7D显示了包含多腔或微通道72d的管道70d，所述多腔或微通道含有负载NGF的盘卷纤维76，建立梯度。
根据TMM方法，胶原蛋白77然后添加到所述TMM的“负载”孔中(图7Fi)。在去除所述纤维成型金属(钛)棒78后，NGF释放纤维卷保留在所生成的浇铸在琼脂糖79中的微通道的壁上，并且通过它们的去除而产生的负压基本上同时地用胶原蛋白77填充这种微通道的腔空间(参见图9Fii-iii)。这种方法设计用于将包裹在所述聚合纤维中的分子例如Cy3-IgG、BSA或NGF随时间持续释放到胶原蛋白填充的微通道中，提供容许的和趋化性的神经生长调节。图7G是显微照片，显示了除去金属棒的卷76。图7H和7I是盘卷纤维76的显微照相，胶原蛋白77被引入所述盘卷纤维76的圆周内并填充它。
从盘卷聚合纤维的生长因子释放
两种纤维源用来制造30um盘卷纤维：乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA85:15；135KD)和ELUTETM生物降解型聚二氧六环酮。PLGA纤维通过湿纺丝法制作。简单说，在二氯甲烷(DCM；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中制备20％PLGA溶液，利用注射泵(1.8mL/hr)分配到循环异丙醇凝固浴上，在旋转卷轴上收集所生成的纤维(8.5m/min)。干燥的PLGA盘卷纤维与NGF(10μg/mL；Invitrogen，Carlsbad，CA)、BSA(20mg/mL；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或花青染料-3(Cy3；5μg/mL；Jackson ImmunoResearch Lab，Inc.，West Grove，PA)一起温育过夜。大多数研究使用ELUTETM生物降解型聚二氧六环酮纤维，由TissueGen Inc，Dallas，TX定制制作以包裹NGF并将它在金属钛棒(0.25mmx17mm；SmallParts，Logansport，IN)上或是相等(均等的)或是在3.33mm纵向区域上以15、25和40圈差异隔开地盘卷80次(10-100ng/mL梯度)。纤维在室温干燥并储存在-20℃直到使用。
导电聚合物聚吡咯负载红色染料。如图8A所示，经电刺激后，所述染料在120分钟的时间中从所述纤维释放并建立梯度。图8B显示了SI和SII区域的定量，证实了梯度形成。
PC12细胞培养
具有含BSA或NGF的盘卷PLGA纤维的金属棒部署在如上所述的TMM浇铸装置中。在无菌条件下，所述浇铸装置放在细胞培养皿中的玻璃载片上并使用1.5％超纯琼脂糖覆盖所述纤维。聚合后，悬浮在调聚的(atelomeric)鸡胶原蛋白(85％I型，15％II类型；Millipore)中的嗜铬细胞瘤细胞(PC12；1x106/mL)通过所述产生的负压负载在浇铸的250μm OD水凝胶微通道上。所述TMM细胞培养物在补充有10％HS、5％FBS和1％青/链霉素的RPMI-1640培养基(Hyclone SH30027.02)中培养72小时并保持在37℃和5％CO2下。研究结束时，所述细胞培养物用PBS彻底清洗并染色。PC12细胞的单独的常规培养物在正常培养皿中以1x106的铺板密度培养并暴露于10-100ng/mL NGF范围以确定它们的生物响应(参见图9A-C)。利用PC12作为生物传感器，测量对不同NGF浓度的神经突响应。利用线性回归确定方程式，以基于PC12神经突长度计算在TMM微通道中的NGF的腔浓度。所述PC12细胞显示出响应变化的NGF水平。如图9A-C中所示，随着NGF浓度水平增加，分化细胞的神经突长度增加(如共焦图像中指示)。图9A显示了10ng/mL的NGF浓度。图9B显示了20ng/mL的NGF浓度。图9C显示了50ng/mL的NGF浓度(比例尺＝l00μm)。
生长因子扩散模型
生长因子从PLGA卷的释放利用有限元分析、考虑多介质环境(即有腔胶原蛋白的琼脂糖微通道)以均等和梯度构造二者建模。蛋白质释放动力学通过利用将制造商提供的释放数据拟合成幂律方程来估算。所述幂律方程具有几何(K＝0.37)、时间(t＝0-28d)和释放机制(n＝0.25；(Mt＝M∞Kn)，其中M是释放的药物量和M∞是药物总量)。从PLGA卷的释放动力学利用体积侵蚀模型(bulk-eroding model)、考虑初始突释接着经由互连孔扩散来估算。Carman-Kozeny模型用于考虑在固定体积(Ω)中随时间(δt)的分子浓度(Φ)变化，估算在水、1.5％琼脂糖和0.3％胶原蛋白中的分子扩散(D)。从所述聚合纤维释放了通过下式垂直于表面(S)积分的扩散通量向量(J＝D▽Φ)：δΦ/δt)▽Φ＝∑J*n▽S。所述模型在Multiphysics Modeling and Engineering模拟软件(COMSOL 4.0)中实行，考虑外管(T)为具有3mm OD、1.5mm ID和10mm长度的实体圆柱体、和琼脂糖微通道。针对最大元尺寸180-1000μm、元尺寸、1.5生长速率和0.6的曲率分辨率的边界，所使用的网格模块包括四面体、三角形和六面体网格体积元。所述模型利用发表的精确解验证，并结合体外得到的释放动力学数据。
在TMM微通道中的DRG外植生长
从正常小鼠分离新生(P0-4)DRG细胞并放在含有均等或梯度NGF卷的TMM微通道的一端。所述DRG培养物在Neurobasal A培养基(Sigma，St.Louis，MO)中培养并在37℃和5％CO2下保持7天，然后通过浸泡将它们固定在4％PFA中。然后，清洗所述培养物并染色。
免疫染色
TMM凝胶在PBS中彻底清洗。所述PC12细胞然后与俄勒冈绿鬼笔环肽反应以标记细胞骨架。为了免疫标记DRG轴突生长，所述组织在4％驴血清中温育1小时，然后用小鼠抗-β微管蛋白III抗体(1:400；Sigma Aldrich)在4℃温育过夜。所述组织然后与Cy2-偶联的驴抗小鼠IgG(1:400；Sigma Aldrich)一起温育并清洗。在Zeiss共焦显微镜(Zeiss Axioplan2LSM 510MET A)上的长工作距离水浸物镜用来直接评价在所述水凝胶微通道内的细胞染色和轴突生长。
图像分析和定量
在微通道内部与不同的NGF卷数对应的低浓度(SI)和高浓度(SII)区域(图10A-K)评价分化PC12细胞的神经突长度。神经突长度从细胞体到神经突的远端测量。只有神经突长于细胞直径的细胞被考虑利用Axiovision LE软件(CarlZeiss，Axiocam，4.7.2版)、Zeiss LSM Image Browser(4.2.0.1版)进行定量。所述DRG的轴突长度在20X放大倍数下从z-协议栈定量(20个图像，每个在308μm的切片厚度)。对于在该段没有卷和中(1-8)或高(9-15)卷数的段，利用Axiovision LE软件(CarlZeiss，Axiocam，4.7.2版)和Zeiss LSM ImageBrowser(4.2.0.1版)从DRG的边缘到生长锥末端测量轴突长度。轴突的转向角利用Image J测量。所述转向角的定量以所有存在的轴突与转向的轴突数的比率计算。所有试验每个双份进行3-6次。
统计分析
所有数据值表示为均值±平均标准误差。所述PC12数据通过参数student t-检验继以Mann Whitney事后评价进行分析。从所述DRG试验得到的数据利用Prism 4软件(GraphPad Software Inc.)通过ANOVA继以Newman-Keuls多重比较进行评价。P≤0.05的值被认为有统计学显著性。
结果
在3D NGF微梯度中的PC12分化
为了确定所述聚合卷是否可用于建立神经生长因子的生物活性梯度，测试了PC12细胞在所述TMM微通道腔中分化的能力，在所述微通道上BSA或NGF洗脱卷锚定于水凝胶壁。接种后三天，在BSA对照中只观察到圆形的未分化细胞(参见图10A-C)。相反，用NGF卷培养的那些显示出通过从PC12细胞体延伸的神经突指示的几种神经分化程度。观察到神经突延伸与布置在通道中的卷数成正比。卷数低的那些(I段；SI)显示了圆形未分化细胞和一些有神经突的细胞的混合群体(图10D-F)，但在卷数较高的区域中的那些(II段；SII)大多数是分化的细胞，有明显更长的神经元样延伸(图10G-I)。为了证实这种观察，估算在这两个区域中分化PC12细胞的神经突长度，其揭示与SI区域(55.76±12.53μm；p<0.005)相比，SII区中分化PC12细胞的数量明显更大(87±14.6μm)。这两者又明显不同于在BSA-释放卷中所观察的(9.31±1.94μm；p<0.0001)。参见图10J和10K。
培养在胶原蛋白填充的琼脂糖微通道中的PC12细胞的DIC和荧光图像，所述微通道中BSA(图10A-C；对照)或NGF(图10D-I)释放纤维盘卷在壁上。在CTR组中PC12保持未分化(箭头)，但在那些释放NGF中延伸(箭号)，并且当与卷数较低的区域(SI)相比时，在较高卷数的区域(SII)中更丰富。图10J显示了分化PC12的神经突长度的定量。图10K显示了PC12细胞暴露于变化的NGF水平下的神经突长度的校准曲线。叠加线性回归显示NGF浓度值与微通道中低(SI)和高(SII)纤维卷数相对应。*＝p<0.0001，与CTR相比；+＝p<0.005，与SI相比(n＝6)。
这些观测表明，所述聚合卷能将生物活性NGF释放到腔胶原蛋白基质中，形成可建立低(SI)和高(SII)浓度区域的梯度。通过定量在24小时内从放在TMM琼脂糖微通道中的洗脱型ELISA BSA-释放卷的SI和SII卷区释放的蛋白质，支持了这种观念，证实了与SII中相比，SI区域中的浓度差低50％(参见图11)。SI和SII微通道区域原位中生物活性NGF的浓度然后通过利用PC12作为生物传感器直接评价，因为已知它们的分化与NGF浓度成线性比例。测定暴露于NGF10-100ng/mL浓度范围的PC12的神经突长度。进一步确定了这些细胞延伸了从5至120μm的长度，与NGF浓度线性关联(R＝0.96；参见图10K)。然后使用从PC12生长校准曲线估算的线性回归方程确定腔内NGF(NGF＝[(PC12神经突长度+1.91)/(17.06)])。利用这个公式确定了在TMM微通道的低(SI)和中(SII)卷绕区观察到的生长分别对应于40和83ng/mL NGF；其与观察的蛋白质释放差接近一致。从所述TMM微通道的BSA释放定量显示，24小时后40％的包裹的BSA从II段释放，相比之下在SI中释放了20％。
蛋白质微梯度扩散的建模
接下来，设计计算机模型以预测在所述TMM微通道的腔胶原蛋白填料上NGF扩散动力学。在COMSOL中实现了计算机模拟模型，其结合了尺寸与NGF相似的蛋白质从聚合物纤维到微通道腔的扩散系数值，所述聚合物纤维和微通道腔二者均在琼脂糖和胶原蛋白中，根据TMM凝胶的实际物理尺寸在10mm纵向距离上。估算经过1、5和7天在微通道体积(0.7μl)中的NGF浓度，并比较在它们的壁表面上具有均等(U)和梯度(G)卷分布模式的那些。因为蛋白质通过腔0.1％胶原蛋白的扩散系数(7.6-12m2/秒)比通过1.5％琼脂糖微通道结构(2.31-14m2/秒)的更快，扩散主要通过胶原蛋白轴发生。根据所述模型，在7天时，在U卷构造中的聚合纤维沿着所述微通道形成大约7ng/mL的均匀浓度，所述浓度在接近近端和远端开口处稀释。相反，G卷构造朝着有较高卷数的末端产生范围从0.02-12.42ng/mL的线性梯度，并且也在所述末端附近稀释。除了预期的浓度差之外，所述模型预测的随时间变化在所述两种构造之间也表现出显著性。所述U构造随时间保持稳定，在所述通道末端的稀释区逐渐增大。
然而，卷的G部署导致梯度随时间从较高浓度向较低浓度延伸。尽管在微通道末端的稀释效应，但所述G构造中梯度的陡度在模拟期间似乎没有显著变化，在平均30度陡度下提供了0.02-12ng/mL梯度(参见图12)。
所述卷的均等分布导致在1-7天中NGF跨微通道的均匀扩散，在末端有一些稀释。盘卷纤维的差异部署产生10-100ng/mL NGF浓度梯度，陡度角为22度，所述浓度梯度随时间增加和扩大以覆盖所述微通道的大部分体积。如图12所示，当沿着纵轴比较所述均等和梯度浓度时，加重了这种差异。
总之，所述结果证实了在所述琼脂糖微通道壁上更高的盘卷纤维数能在腔胶原蛋白基质中建立生物活性生长因子的线性分子梯度，所述分子梯度然后可用于趋化性地引导轴突生长。
通过3D梯度生长因子投送提高和指导神经生长
证实了装饰水凝胶微通道壁的所述聚合卷可产生持续的生长因子梯度后，通过评价从放置在TMM凝胶一端的新生DRG延伸的轴突纤维数量，来检验NGF洗脱卷对体外神经再生的效应(图13A-F)。没有卷的凝胶(图13B)与有均等的7圈和14圈NGF包裹卷的凝胶比较。轴突生长的程度在有NGF卷的凝胶中比阴性对照定性上更好，尽管轴突数的增加没有达到统计学差异。然而，轴突长度的定量在NGF卷更密组(1321±51.71μm；9-15卷圈数)比没有生长因子组(651.2±40.40μm)和低密度卷组(808.18±55.57μm；<8圈；图3E-F)显著地增加(p<0.005；n＝4)。为了证实NGF梯度对感觉神经元再生的有益效应，单独的DRG组暴露于均等或梯度条件，其中NGF浓度保持在18ng/mL不变
图13A，显示了TMM凝胶的差示强度对比(DIC)图像，显示了充有胶原蛋白并在腔的一端放置DRG外植体后的一个浇铸微通道。所述PDO纤维卷锚定到琼脂糖中和微通道壁上，充空气供显像。针对显现β-微管蛋白进行免疫标记(绿色)的DRG轴突生长的共焦图像显示了以下TMM凝胶：没有卷(参见图13B)；小于9圈NGF负载纤维(参见图13C)；和9-15圈NGF洗脱卷(参见图13D)。显示了下面二者的定量：轴突数量(参见图13E)；和DRG的轴突长度(参见图13F)。轴突长度利用Zeiss LSM Image Browser(4.2.0.12版)测量。所述不同区域中细胞突起的长度有显著差异(*<0.001)。
为了证实NGF梯度对感觉神经元再生的有益效应，单独的DRG组暴露于均等(U)或梯度(G)条件，其中NGF浓度保持在18ng/mL。与均等浓度组(U)(图14A)相比，排列了卷以建立梯度(G)的那些显示了更强健的轴突再生(图14B)。轴突长度的定量证实了，通过补充梯度NGF的圆柱形、胶原蛋白填充途径的神经元生长(1694±100.1；n＝3)与含有均等生长因子浓度的那些(1045±81.33，n＝5；参见图14C)相比有明显的生长优势(p<0.05)。在均等或梯度NGF条件下，同时保持相同的浓度，在针对β-微管蛋白染色(绿色)的DRG的微通道中观察的轴突长度的直接比较显示，朝着NGF浓度渐增生长的神经元轴突长度显著增加。*p<0.001，n＝3-5。比例尺＝100μm。
朝NGF梯度的强健的轴突趋化性
除了梯度NGF在DRG轴突伸长中的生长促进效应之外，还注意到在所述均等组中神经突伸长朝向在微通道壁上的所述卷。确实，观察到在那些组中的轴突在它们生长通过胶原蛋白时沿着向上和向下的轨迹(图15A)。在鲜明的对照中，朝着远端建立NGF梯度的组显示出强健的线性生长，轴突在它们伸长时无视所述卷(图15B)。生长角度的定量支持了这种观念，因为在均等组中的那些显示出范围从+60至-60°(图15C)的宽方向性生长。相反，存在梯度NGF的那些显示更有方向性的生长角度，范围从+30至-30°(图15D)。
培养β-微管蛋白标记的DRG轴突并使其生长通过均等分布的卷。所述轴突生长向着所述NGF负载卷取向。参见图15A和C。然而，如图15B和15D中所示，通过梯度分布，所述轴突生长倾向于在通道的中间生长。
轴突生长的转向角比率显示尖锐的锐角。所述转向角的定量以所有存在的轴突与转向的轴突数的比率确定。当比较均等和梯度分布时，所述转向比率有显著差异(*p<0.005)。为了进一步证实这种观察，分别测量转向角比率和确定急转向的轴突数在均等组中与朝着NGF梯度生长的那些相比明显更大(0.5368±0.06321，n＝4；0.1909±0.03772，n＝3；p<0.005)。图16显示了暴露于均等(U)或梯度(G)NGF条件的DRG的比较性观察的转向角比率。总之，该数据显示，通过利用盘卷聚合纤维的梯度将生长因子释放到腔胶原蛋白中，可获得强趋化性生长环境。
另外，靶细胞分泌生长因子，形成分子梯度，充当在轴突伸长和目标识别期间发育和成熟损伤神经元的趋化性引导信令。在主动引导期间，轴突感知吸引和排斥分子的梯度，它们使用所述梯度用于定向它们的生长。
根据本公开，并且如上所述，设计可再现的体内方法，用于将蛋白质负载纤维、优选聚合纤维锚定到多腔水凝胶管道、例如神经管道的壁中。本文中公开的装置、方法和组合物提供了腔内梯度，但对再生中的轴突没有任何阻碍。另外，通过改变每个区域中卷的圈数来提供适当的梯度陡度，本设计是高度可调的。
活体中的细胞响应多种梯度的刺激而迁移、分化和增殖。所述梯度本质上可以是物理或化学的。物理梯度包括，例如，物理性质例如表面拓扑结构、硬度和材料孔隙度的逐渐变化。例如，在骨中，孔度由外至内降低。这种现象允许机械性质变化以及所述梯度特征允许细胞迁移和分化。化学梯度，尤其是生物分子的那些梯度，在所有细胞过程中也是很重要的。例如，细胞迁移不仅取决于绝对浓度，而且取决于梯度的斜率。还已经注意到，当梯度与均等表面比较时，所述迁移细胞的速度快得多。因子例如bFGF已经在水凝胶上以梯度取向固定化，以研究这种梯度对主动脉平滑肌细胞的效应。已知这些细胞以梯度渐增的方向对齐和迁移。理论分析已经用于预测细胞在均等和梯度底物上的迁移速度。这样的模型预测了速度和梯度之间的关系是双相性依赖的。
根据一种变化形式，本公开的模型允许评价系统性能并了解影响剂量和梯度释放的机制。尽管对再建立梯度的所有努力，但这些现代技术的大部分适合平表面，忽视三维基质更接近模拟体内情况。本公开的变化形式提供了在3D中建立梯度的方法和可以结合多种梯度信令，并可以基于细胞类型可预测地、选择性地和可控地调整。
根据本公开，已经建立了NGF的生物活性浓度梯度。所述NGF梯度可以通过在选定的区域上改变盘卷纤维的圈数进行控制。更具体地说，PC12通过以类似于在可溶性NGF中所见的方式延伸神经突来响应NGF浓度。另外，DRG生长和取向也受到梯度存在的影响。本文中描述的梯度方法允许包裹任何蛋白质以靶向目标细胞。本公开考虑了所公开的装置、方法和组合物关于在周围神经系统中长缺口修复或损伤脊髓中轴突引导方面的用途。
本文中公开的可重复和可编程的梯度形成方法具有向目标部位持续传递更多生物活性剂的能力，例如为引导轴突生长的目的而进入神经再生部位。所述梯度浓度可由生物纤维的圈数(即节距)来控制，所述生物纤维是传导性或非传导性的，含有所述活性剂。本文中公开的方法、装置和组合物也可以结合到可植入装置中，以时控或质控方式通过扩散或电刺激来释放生物活性剂。
因此，本文中公开的所述活性剂(例如化学制品或生物物质等)的受控梯度，可以应用于引诱和引导神经再生，例如人造耳蜗电极，其中物质例如脑源性生长因子(BDNF)的受控投送可以有益于将神经元引向电极并保存细胞存活力。还可以进行其中浓度梯度对生物效应至关重要的药剂的药物投送。这种方法是可重复的并且建立的梯度可以是可预测地获得的。
更具体地说，在一些变化形式中，堆叠或以其他方式排列多种或序列的梯度材料或基质，例如凝胶等，来提供梯度。所述梯度材料包含不同浓度的治疗剂，并因此可提供治疗梯度。所述梯度材料可具有治疗或不与本发明的目的不相容的其他性质(例如物理性质)的任何组合，并可用于模拟和/或再造各种各样的自然环境，包括生物环境。另外，可以使用任何数量的凝胶。图17显示了管道1700，其包含三个梯度材料段1702、1704和1706，各自具有不同浓度的治疗剂，并排列以形成梯度。然而，利用其他数量的梯度材料，例如两、四、五或六种梯度材料，也是可能的。在一些情况下，可以使用多于六种梯度材料。如图17中所示，梯度材料段1702具有最高浓度；段1704浓度较低；和段1706浓度最小。
另外，也考虑了利用软的生物相容组分形成梯度的方法。这些方法可以用各种方式修改以达到各种目的。另外，如本文中描述，通过包含用于形成梯度的各种微粒载体，可以实现包裹各种因子。所考虑的变化形式包括结合/悬浮在凝胶(例如水凝胶等)中以提供治疗梯度的微粒。图18示出了根据一种变化形式的组合物的扫描电子显微镜(SEM)图像，其中显示微粒1802悬浮在载体基质1802、例如凝胶例如水凝胶中。
此外，在一些变化形式中，可以以一定的取向排列多个梯度材料或基质，例如包含活性剂例如治疗剂的凝胶，并且每种材料优选包含浓度变化的一种活性剂、多种活性剂、或浓度变化的多种活性剂，以提供预选、预定和可预测的梯度区和如果需要的话，非梯度区。
在实现本发明的各种目的上，已经描述了本发明的各种实施方式。应该认识到，这些实施方式仅仅说明本发明的原理。其许多的修改和改编在不背离本发明的精神和范围下，对本领域技术人员将是容易地显而易见的。

Claims (9)

1.组合物，其包含：
盘卷的聚合材料，所述聚合材料包含活性剂，当所述聚合材料布置在生物室中时，所述活性剂可操作地从所述聚合材料中扩散出来，其中所述组合物在所述生物室内沿着所述盘卷的聚合材料的纵轴产生所述活性剂的梯度。
2.权利要求1的组合物，其中所述聚合材料是生物降解型的。
3.权利要求1的组合物，其中所述聚合材料包括乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己内酯、聚对二氧六环酮或其组合。
4.权利要求1的组合物，其中所述盘卷的聚合材料具有不均等的节距。
5.权利要求1的组合物，其中所述盘卷的聚合材料具有在10μm和100μm之间的纤维直径。
6.权利要求1的组合物，其中所述盘卷的聚合材料具有在50μm和1000μm之间的外径。
7.权利要求1的组合物，其中所述活性剂的浓度在所述盘卷的聚合材料内变化。
8.权利要求7的组合物，其中所述盘卷的聚合材料包含在第一区域处于第一浓度以及在第二区域处于第二浓度的所述活性剂。
9.权利要求8的组合物，其中所述盘卷的聚合材料包含在第三区域处于第三浓度的所述活性剂。
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