JP2016506926A

JP2016506926A - タンパク質組合せ基盤のｆｖライブラリー及びこれの製造方法

Info

Publication number: JP2016506926A
Application number: JP2015555104A
Authority: JP
Inventors: ビョンドーソン，; ジースンユン，; ソンイリー，; ヘインキム，; ヒョジュンチョイ，; ジョンリプチョイ，
Original assignee: スクリプスコリアアンティボディーインスティテュート
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2016-03-07
Anticipated expiration: 2034-01-24
Also published as: EP2949789A1; RU2015135521A; AU2014210475A1; NZ710422A; EP2949789A4; ES2887398T3; EP2949789B1; HK1215722A1; KR20150115747A; US20160025740A1; CA2898197C; CN104995341A; BR112015017560A2; US10309969B2; CN104995341B; US20190376979A1; MX2015009340A; ZA201505317B; CA2898197A1; JP6368322B2

Abstract

本発明はタンパク質組合せ基盤のＦＶライブラリーの製造方法、前記製造されたＦＶライブラリーを利用した目的抗体のスクリーニング方法、前記スクリーニング方法によってスクリーニングされたＦＶ抗体及び前記ＦＶライブラリーの製造方法によって製造されたＦＶライブラリーに関する。本発明のＦＶライブラリーは、タンパク質組合せ基盤で製造されて個別的機能検査が可能であると共に、目的する抗原がなくても所望のＦＶ抗体を選別できるだけでなく、既存のＤＮＡ基盤のライブラリーよりタンパク質精製回数が画期的に減って費用及び時間を節減できる。

Description

本発明は、タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの製造方法、前記製造されたＦ_Ｖライブラリーを利用した目的抗体のスクリーニング方法、前記スクリーニング方法によってスクリーニングされたＦ_Ｖ抗体及び前記Ｆ_Ｖライブラリーの製造方法によって製造されたＦ_Ｖライブラリーに関する。

抗体は、免疫系内の白血球のＢ細胞（Ｂリンパ球）で抗原の刺激によって作られるタンパク質であって、抗原に会うと、細胞にある受容体を介して抗原を認識して受容体を介して結合する。このような抗体は、疾病を治療するためのタンパク質新薬の候補物質と考えられて、目的とする機能的な抗体を探すために種々の抗体ライブラリーを製造して、これからスクリーニングする。このような抗体ライブラリーは、遺伝子組換え技術を利用するもので、ヒト体内に存在するＢ細胞で抗体タンパク質をコードする遺伝子を抽出して、抗体遺伝子ライブラリーを製作して、このライブラリーから所望の抗原結合特異性を持った抗体を選別する。抗体ライブラリー技術は、ヒト抗体など抗体の製作に一大革新をもたらした。抗体免疫反応の最も著しい特徴は、外部からどのような種類、あるいは形の抗原が体内に侵入しても、その抗原が体内の成分と同じでない外来物質であれば、その抗原と特異的に結合する抗体が一週間以内に作られるということである。抗体はＢリンパ球によって作られて、一つのＢリンパ球はただ一種類の抗体だけを生産する。実際に、人体には数多くのＢリンパ球があって、各Ｂリンパ球は、自己だけの独特の抗原結合特異性を持った抗体を細胞膜に発現しているが、一般に約１０^８種類程度の抗原結合多様性が人体内に存在すると知られている。抗原が侵入する場合には、この抗原と特異的に結合する抗体を発現しているＢリンパ球だけが速く増殖をしながら抗体を多量生産して、結果的に血清内にこの特定抗体の濃度が急激に上昇して、侵入した抗原の迅速な除去機能を行うことになる。従って、人体内には数億種の抗体多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）が存在して、このような抗体の多様性を抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）と表現する。従って、人体から十分な数のＢリンパ球を採血で取得した後、この細胞からｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）方法で抗体重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを得ると、比較的簡単な方法で人体内の抗体レパートリーを遺伝子形態で試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）に確保することができる。抗体ライブラリー技術の核心は、このようなヒト抗体遺伝子レパートリーをタンパク質で発現する（あるいはディスプレーと表現）と同時に、その抗体タンパク質をコードする遺伝子がある媒体を介して連結される、いわゆる遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｌｉｎｋａｇｅ）であり、これを介して抗体ライブラリーから特定抗原と結合する抗体を選別して同時にその特定抗体をコードする遺伝子を取得する。この時完ぺきな形態の免疫は不要であり、抗原結合機能を持った抗体のＦａｂ形態で発現するか、あるいは重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ）が約１５アミノ酸の短いペプチド連結子（ｌｉｎｋｅｒ）に連結されたｓｃＦ_Ｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）と命名された抗体断片で発現する。この時このような抗体の遺伝型−表現型連結（ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｌｉｎｋａｇｅ）に用いられる媒体をどのような媒体の表面に発現させるのかによって、ファージディスプレー、リボソームデスプレイ、酵母ディスプレーなどで区別されて、抗原を投与するなどの免疫反応の誘導せず所望の抗原結合性の抗体を得ることができる。しかし、抗体ライブラリー製作及び抗体選別に多くのノウハウが必要で、高親和度の抗体を得るのが容易でないため、抗体選別後親和度成熟など抗体最適化過程を行う場合が多く、特に１次選別時、毒性などの問題から直ちに哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌ）で機能分析を行うことができない短所などがある。治療抗体の場合には、単に抗原との結合でなく実際の治療機能がある抗体を選別しなければならないので、このような短所は、治療用抗体開発に障壁となってきた。

抗体ライブラリーの中で現在最も多く用いられているのは、ファージディスプレー抗体ライブラリーであり、実際に現在商業化されているリューマチ関節炎治療剤であるヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ、ａｎｔＩ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａヒトモノクローナル抗体）がファージディスプレー技術によって製造された治療用抗体である。理想的な抗体ライブラリーは、巨大な抗体多様性を含んでいて、所望の抗原結合特異性を持った高親和度の抗体クローンをいつでも獲得できるライブラリーである。このためには、約１０^１０乃至１０^１１程度の抗体多様性を持ったライブラリーを製作しなければならないが、抗体遺伝子クローニング作業を介して、このような大きさのライブラリーを製作するのはかなり難しく、まさにこの点がファージディスプレー抗体ライブラリー製作の最も難しい難題といえる。また、ファージ自体が毒性として作用して、すくに機能分析を行うことができない短所がある。リボソームデスプレイの最も大きい長所は、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅシステムデあるため、理論的に１０^１３の大きさのライブラリー製作が可能なほど巨大な大きさのライブラリーを簡単に作ることができて、高親和度抗体（ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙａｎｔｉｂｏｄｙ）の獲得に有利で（一般に抗体ライブラリーの大きさが大きいほどライブラリー内に高親和度の抗体が含まれている可能性が高い）、ＰＣＲ増幅過程があるのでｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを利用できて、分子進化（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を人為的に誘導するための突然変異の導入が非常に容易であるが、これも毒性問題及び種々の実験上の問題点によって、実際の場合ｎａｉｖｅ祈願の抗体ライブラリーの製作には、ファージディスプレー技術を主に使っている。酵母ディスプレー技術の場合、組換えベクターをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株に挿入する過程と酵母細胞の大きい大きさによって１０^９以上の多様性を持った抗体ライブラリーを作るのに多くの技術的制限があり、従って選別過程での長所を活用してすでに確保されている抗原−特異的抗体の突然変異ライブラリーを製作して、これから高親和度の抗体を選別するのに主に用いる。

しかし、このような抗体ライブラリーは、全ての抗体が個別的に分離保管する形態でなく、全ての抗体が混ざっている形態である。このような抗体ライブラリーが持つ限界は、目標物質抗原に対する抗体を選別する時機能（活性）による選別が現実的に不可能であり、ただ抗原との結合に基づいた抗体選別だけが可能な短所がある。この過程で得られた初期抗体候補は、次の段階で機能の有無を調べて実質的に機能を持つ抗体を選別する。このような選別段階で多くの場合、初期抗体選別段階で結合だけうまくできて機能がない抗体が得られるようになる。従って、このような選別方法の限界を克服できる新しい方法が求められる。即ち、最初から機能による抗体を選別する方法が求められている。しかし、既存のライブラリーは、種々の抗体が共に混ざっている状態で、一度に機能による各々の抗体選別が不可能である。従って、低分子化合物ライブラリーのように全ての抗体を個別的に精製して保管する方法が可能である場合、機能による選別が可能となる。しかし、抗体はタンパク質であるため、発現及び精製過程が必要で、これを介して十万個または百万個の各々異なる抗体のライブラリーを構築するのは現実的に不可能である。即ち、既存の方法は、ライブラリー多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１，０００，０００と仮定すれば１，０００，０００個のタンパク質精製が必要で、多様性が増加するほど必要なタンパク質精製回数が急激に増える短所がある。これは既存のライブラリー技術は、ベクター内でＤＮＡ水準でＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを組み合わせてライブラリーを製造する技術（ＵＳ８，１７８，３２０）、ＤＮＡ水準で抗体重鎖及び軽鎖ライブラリーを製造する技術（ＵＳ７，８５８，５５９）等多様なライブラリー製造技術があるが、いずれもＤＮＡ水準での組合せで各々満足するｄｉｖｅｒｓｉｔｙのライブラリーを製造するためには、その数だけのタンパク質の精製が必要で、増え過ぎた個数によってライブラリーで製造された抗体を直ぐに機能分析をすることができないので、その数を減らすために抗原との結合を介して選別して機能を分析できる個数を減らす追加ｓｔｅｐが必要で、このような選別中本当に重要な抗体を脱落する重大な短所があった。特に、既存のライブラリー製造方法は、ＤＮＡ水準での組合せでＦ_Ｖを発現しなければならないので、多様性だけのタンパク質精製が必要であって、個別的に分離した抗体ライブラリーを放棄した状態であった。
このような背景下、本発明者等は、抗体が機能的に選別することができるように個別的に分離しているライブラリーを開発するために鋭意努力した結果、既存のＤＮＡ水準で組み合わせるライブラリー製造技術とは異なりライブラリーをタンパク質水準で製造することに着目した、Ｖ_ＨとＶ_Ｌのタンパク質水準での組合せを介してタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを製造する可能性があることを確認して本発明を完成した。

米国特許第８，１７８，３２０号明細書米国特許第７，８５８，５５９明細書

本発明の一つの目的は、タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーの製造方法を提供することである。

本発明の他の一つの目的は、前記タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの製造方法によって製造されたＦ_Ｖライブラリーを利用して、目的抗体をスクリーニングする方法を提供することである。

本発明のさらに他の一つの目的は、前記スクリーニングする方法によってスクリーニングされた目的Ｆ_Ｖ抗体を提供することである。

本発明のさらに他の一つの目的は、前記タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの製造方法によって製造されたＦ_Ｖライブラリーを提供することである。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、ンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー及びこれの製造方法を提供する。

具体的に、本発明は、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質が結合したＦ_Ｖを含むタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを提供する。

また、本発明は、（ａ）重鎖可変領域（ｈｅａｖｙＣ−Ｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｈ）ドメインタンパク質及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｌ）ドメインタンパク質を製造する工程；及び（ｂ）前記（ａ）工程で製造されたＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質を結合する工程を含む、タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーの製造方法を提供する。

本発明の標的−ＬＰＥＴＧ−多様な長さのリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ及びＨｉｓタグの融合タンパク質の模式図を簡単に示した図である。（Ａ）は、７個のアミノ酸からなるリンカー、（Ｂ）は１８個のアミノ酸からなるリンカー、（Ｃ）は２０個のアミノ酸からなるリンカーである。本発明のタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの対結合模式図を示した図である。（Ａ）は野生型結合、（Ｂ）は二硫化結合、（Ｃ）はｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合を示した図である。簡単なタンパク質精製過程の模式図を示した図である。精製されたＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ突然変異のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。ＦｌａｇタグがないＶ_Ｈドメインタンパク質であるＶ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ、Ｎ−末端にＦｌａｇタグがあるＦｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ、Ｎ−末端及びＣ−末端にＦｌａｇタグがあるＦｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇタンパク質の発現がＦｌａｇ存在によって増加することを示した図である。ｓｏｒｔａｓｅ融合の有無、Ｆｌａｇ融合の有無による組換えタンパク質の発現及び精製収率を比較して示した図である。Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対結合のＥＬＩＳＡ実験方法の模式図である。Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対結合のＥＬＩＳＡ実験結果を示した図である。Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ及びＦｌａｇ−Ｖ_Ｌ対結合のＥＬＩＳＡ結果を示した図である。システイン突然変異が導入されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ対結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ及びＦｌａｇ−Ｖ_Ｌ対結合がＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ対結合が増加させることを示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦ_ＶのＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示した図である。Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ及び組み立てられたＦ_Ｖ野生型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。Ｖ_Ｌ−Ｑ１００Ｃ−Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ、及び組み立てられたＦ_ＶのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ、及び組み立てられたＦ_ＶのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。ＢＴ−４７４細胞増殖に対する結合４Ｄ５Ｆ_Ｖ抗体の効果をＣＣＫ８ａｓｓａｙ（Ｄｏｊｊｉｎｄｏ）を介して確認した結果を示した図である。ＢＴ−４７４細胞で４Ｄ５ＩｇＧ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン及び結合Ｆ_Ｖ抗体のＨｅｒ２発現細胞表面への結合プロフィールをＦＡＣＳを介してモニタリングした結果を示した図である。ＣＤＲデザインのためのＶ_ＨＣＤＲ３及びＶ_ＬＣＤＲ３の選択を示した図である。Ｖ_ＨＣＤＲ及びＶ_ＬＣＤＲ多様性を導入するための、高頻度の有無を分析を示した図である。本発明の一実施例に係る多様性を持つライブラリーをデザインした結果を示した図である。５Ｖ_Ｈｓと５Ｖ_Ｌｓの組合せで構築された２５Ｆ_ＶｓをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した結果を示した図である。４Ｄ５Ｖ_Ｈと５個の合成Ｖ_Ｌｓによって製造された結合Ｆ_ＶをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した結果を示した図である。ライブラリースクリーニング過程を示した図である。アルファアッセイを介して個別Ｆ_Ｖと１０個の混合抗原の相互結合をスクリーニングした結果を示した図である。混合された抗原に結合するＦ_Ｖと個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングした結果を示した図である。ＣＳＦ１Ｒに主に結合するＦ_Ｖのアルファアッセイの結果を示した図である。アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をＥＬＩＳＡで確認した結果を示した図である。アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をウエスタンブロットを介して確認した結果を示した図である。ｃ−ＭＥＴに結合するＦ_Ｖのアルファアッセイの結果を示した図である。アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をＥＬＩＳＡで確認した結果を示した図である。アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をウエスタンブロットで確認した結果を示した図である。

本発明の用語「Ｆ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー」とは、多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を持つ各々の複数のＦ_Ｖが集まっているＦ_Ｖの総集合体を意味する。本発明の用語「Ｆ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、抗体のＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇ）領域の一部分で重鎖可変領域（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔＣ−Ｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｌ）からなる部分で、最小抗体断片を意味する。本発明の目的上、前記Ｆ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーは、タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーであってもよい。

既存のライブラリーは、抗体の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）の抗体遺伝子レパートリー（ａｎｔｉｂｏｄｙｇｅｎｅｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）を満足するために、ＤＮＡ水準で組合せが行われた。一般に、抗体はＢリンパ球によって作られて、一つのＢリンパ球はただ一種類の抗体だけを生産する。そこで、人体内には数多くのＢリンパ球が存在して、各々のＢリンパ球は、自己だけの独特の抗原結合特異性を持った抗体を細胞膜に発現していて、一般に約１０^８種類程度の抗原結合多様性が人体内に存在すると知られている。従って、人体内には数億種の抗体多様性が存在して、このような抗体多様性であるレパートリーを形成するためには、数億個の組合せのＤＮＡを製造して、これから抗体を形成しなければならない。例えば、１０^８の多様性を持つライブラリーを製造するためには、１００，０００，０００個のＤＮＡを合成して、１００，０００，０００度のタンパク質精製を行ってこそ分離したタンパク質発現抗体ライブラリーを製造するもので、これは現実的に不可能に近い。しかし、本発明のタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの場合には、Ｖ_Ｈドメイン１０，０００個とＶ_Ｌドメイン１０，０００個の発現及び精製、即ち、ただ２０，０００個の発現及び精製を介して分離したＦ_Ｖライブラリーを製造することができる。このような本発明のタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリー製造方法は、本発明者等によって最初に開発された。本発明のタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリー製造方法は、各々分離精製されたＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを細胞内でなく細胞外で結合させて所望のタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを製造できることを特徴とする。

好ましくは、前記Ｆ_Ｖライブラリーは、個別的機能検査が可能であることを特徴とする。

好ましくは、前記個別的機能検査は、目標物質結合に伴う目的に応じて、前−選別工程を行って、さらに好ましくは目標物質結合に伴う前−選別工程を行わなくても良い。

前記で説明したように、既存のライブラリーは、ＤＮＡ基盤のライブラリーであって、各々の抗体をＤＮＡからタンパク質に発現して分離するには、数多くの発現及び精製過程が必要で、各々の抗体が、ライブラリー内に個別的に分離されておらず、各々の抗体が、ライブラリー内に混在して存在する。そこで、タンパク質である抗体の機能検査を行うためには、抗体をタンパク質に精製分離する工程が必要で、これは先に説明したように実質的には不可能で、抗原と同じ目標物質との結合を介して１次選別する工程を介して、目標物質と結合した抗体に対してのみ機能検査を行って２次選別をした。しかし、このような目標物質との結合による選別時には、実際機能をする抗体を逃す危険がある。そこで、本発明のＦ_Ｖライブラリーは、個別的分離が可能で、１次選別、即ち目標物質結合による前−選別工程なしに、個別的機能検査を行って実質的に機能をするＦ_Ｖ抗体を逃さないで製造することができる。

本発明の目的上、前記Ｆ_ＶライブラリーはＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインを含むＦ_Ｖライブラリーであってもよいが、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及び軽鎖可変領域Ｖ_Ｌドメインタンパク質の組合せによって製造されるライブラリー基盤で、抗原結合能力を持つ断片であるＣＨ領域が結合したＦａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆ_Ｖ及びｒＩｇＧを含む、抗体の抗原結合形態及び全体抗体を含んでもよい。また、前記抗体は、組換え一本鎖Ｆ_Ｖ断片（ｓｃＦ_Ｖ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または、両特異性分子、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディを含んでもよい。二価または両特異性分子は、例えば、Kostelnyなど（１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７），ＰａｃｋＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１５７９），Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒなど（１９９３，Ｓｕｐｒａ），Ｇｒｕｂｅｒなど（１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５３６８），Ｚｈｕなど（１９９７，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，６：７８１など），Ｈｕなど（１９９６，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６：３０５５），Ａｄａｍｓなど（１９９３，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５３：４０２６）及びＭｃＣａｒｔｎｅｙなど（１９９５，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，８：３０１）に記載される。前記全体抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を持つ構造で、１個の抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ‘は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ）を持つ点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基が二硫化結合から生成される。

前記（ａ）工程である重鎖可変領域（ｈｅａｖｙＣ−Ｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｈ）ドメインタンパク質及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｌ）ドメインタンパク質を製造する工程は、好ましくはＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質に目的する多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を導入して製造されることができる。多様性導入は、公示の突然変異方法によって実行されることができる。また、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質は、公示の方法によって製造されることができる。前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質からなるＦ_Ｖライブラリーの製造は、ＰＤＢ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）、ＳＣＯＰ（ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎ）といったヒトタンパク質の３次構造を全部含むデータベースを使って配列が選択できて、これに制限されるのではないが公示の多様なヒトまたは、非ヒトタンパク質の配列が知られた多様なデータベスを介してライブラリー製造のためのタンパク質配列を選択することができる。また、Ｋａｂａｔ抗体データベス（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ）とＮＣＢＩデータベス（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｋＨ−Ｇｏｖ）から入手可能な公示された可変部位配列及びＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＰＲＦ／ＳＥＱＤＢ（ｗｗｗ．ｐｒｆ．ｏｒ．ｊｐ）のようなタンパク質データベスからＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を選択してＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列のライブラリーを設計することができる。また、一つ以上の個別提供者等（ｄｏｎｏｒｓ）から増幅されたＶ_Ｈ及びＶ_ＬｍＲＮＡの直接配列決定（ｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によってヒトＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の収集によって、このようなものなどを補充することができる。ドメインの多様な組合せをＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインタンパク質の設計のために考慮してもよい。配列選択においては、Ｔ細胞受容体または他のＩｇ配列を除いて、抗体ドメイン配列だけを公示の方法によって選別してもよい。本発明の一実施例では、ＰＩＳＥＣサーバーでＨＭＭＥＲプログラムを利用して選択した（実施例６）。

前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質は、ヒトまたは非ヒト由来であってもよい。

好ましくは、前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質またはＶ_Ｌドメインタンパク質内のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）に突然変異が導入される。前記ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で選択された１種以上であってもよく、これに制限されないが、１種、２種、または、３種であってもよい。さらに好ましくはＣＤＲ３であってもよいが、目的する抗体の種類によって制限されず突然変異が導入されてもよい。本発明の一実施例では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は固定して、ＣＤＲ３に突然変異を導入して多様性を変化させた（実施例８）。

好ましくは、前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質またはＶ_Ｌドメインタンパク質内のフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に突然変異が導入される。

好ましくは、前記（ａ）工程で製造されたＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質を無作為的に結合する工程である（ｂ）工程のタンパク質結合は、（ｉ）野生型ドメイン間の結合、（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合、（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合、（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合、及び（ｖ）これらの組合せからなる群で選択された結合であってもよい。前記（ｉ）乃至（ｉｖ）は、公示の結合方法を制限することがく含み、その例として（ｉ）乃至（ｉｖ）各々、または１種以上の組合せによって実行されることができる。

好ましくは、前記（ｉ）野生型ドメイン間の結合は、野生型Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質間の公示された対結合によって実行されることができる。本発明の一実施例では、野生型結合（対結合）を確認した（実験例２）。

好ましくは、前記（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合は、公示の方法によってＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質にシステインを導入して、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質各々に導入されたシステイン間に二硫化結合をなして対結合をなすことができる。本発明の一実施例では、二硫化結合（対結合）を確認した（実験例１乃至４）。

好ましくは、前記（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合は、公示されたｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインをＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質に導入して、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合でＶＨドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質間に対結合をなすことができる。このようなｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインは、公示されたデータベスなどから得ることができて、ＫａｔｊａＭ．Ａｒｎｄｔｅｔａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１２、２２１−２２８）が開示した方法を応用して製造することができる。また、ＪｅｎｎｉｆｅｒＲ．ｅｔａｌ．（Ｊ．ＢｉｏｌＣ−Ｈｅｍ．（２００２）２７７，３７２７２−３７２７９）、Ｊ．Ｒ．Ｌｉｔｏｗｓｋｉ（Ｊ．ｐｅｐｔｉｄｅＲｅｓ．（２００１）５８，４７７−４９２）、ＪｅｓｕｓＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．（ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）２１，５１１−５９１）、ＫａｔｊａＭ．Ａｒｎｄｔｅｔａｌ．（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００２）１０，１２３５−１２４８）、ＫａｔｊａＭ．Ａｒｎｄｔｅｔａｌ.（Ｊ．ＢｉｏｌＣ−Ｈｅｍ．（２０００）２９５，６２７−６３９）等に記載された配列などを参照することができるが、一定の規則を持つｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインは、いずれも含まれることで、前記論文の配列に制限されない。本発明の一実施例では、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合による対結合を確認した（実験例１乃至４）。

好ましくは、前記（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合は公示されたタンパク質間相互作用による結合は、制限されずに含まれるか、その例としてＪＵＮドメイン及びＦＯＳドメインのようなロイシン−ジッパーのようなタンパク質結合を利用することができる。また、非共有相互作用、操作されたＣＨドメイン、操作された相互結合面など公示の多様な相互作用を含んでもよい。

好ましくは、前記（ｂ）工程の結合は、無作為的な対結合または目的する対結合によるものであってもよい。

好ましくは、前記タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリー製造方法は、（ｃ）結合したＦ_Ｖを各々指定されたＩＤ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）番号が付与された個別区画に静置する工程をさらに含む。前記結合したＦ_Ｖは、無作為的な対結合または目的する対結合によるものであってもよい。目的する対結合の場合、各々の情報を知っているＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが重複しい一程の規則でライブラリーを製造することを含んでもよい。好ましくは、このように目的する対結合の場合、既知のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの対結合を行って、前記結合したＦ_Ｖを分離して、これを区別して各々指定されたＩＤ番号が付与された個別区画に静置して、各々指定されたＩＤ番号が付与された個別区画のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの情報をＩＤ番号で確認することができる。

本発明のＦ_Ｖライブラリーは、個別的分離が可能であるため、個別区画に静置されたライブラリーを製造することができる。プレート、テストチューブ、ａｒｒａｙなど公示の多様な装置に指定されたＩＤ番号が付与された個別区画を持つことができるが、これに制限されない。また、前記区画内には、緩衝溶液、タンパク質安定化剤などがさらに含まれてもよい。

もう一つの様態として、本発明は、（ａ）前記Ｆ_Ｖライブラリー製造方法で製造されたタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを準備する工程；及び（ｂ）前記Ｆ_Ｖライブラリーを使って目的する特性、特徴または活性に対して、個別的機能検査する工程を含む、目的するＦ_Ｖ抗体をスクリーニングする方法を提供する。

Ｆ_Ｖライブラリー製造方法は前記で説明したとおりである。

好ましくは、前記目的する特性、特徴または活性は、細胞の増殖、分化または細胞死でってもよい。また、目的する特性、特徴または活性が、タンパク質−タンパク質凝集、タンパク質安定性の向上、増加したタンパク質可溶性、グリコシル化部位の導入、接合部位の導入、免疫原性の減少、タンパク質発現の向上、抗原親和性における増加、抗原親和性における減少、結合親和性における変化、免疫原性における変化、または、特異性の向上などであってもよいが、スクリーニングする者の自己の意志目的に応じてその特性、特徴または活性が選択されて、これに制限されない。

好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦ_Ｖ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程をさらに含んでもよい。

好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦ_Ｖ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程；及び（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦ_Ｖ抗体の組合せの前にＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質を確認する工程をさらに含んでもよい。

このように確認した区画のＦ_Ｖ抗体の組合せの前に、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインを確認して、前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインが組合された目的するＦ_Ｖ抗体だけを増幅することができる。

好ましくは、前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦ_Ｖ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程；及び（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦ_Ｖ抗体を分離してＤＮＡ配列を確認する工程をさらに含んでもよい。

このように確認した区画のＦ_Ｖ抗体を分離して、ＤＮＡ配列を確認して、前記目的するＦ_Ｖ抗体だけを増幅することができる。
もう一つの様態として、本発明は、前記スクリーニング方法によってスクリーニングされた目的Ｆ_Ｖ抗体を提供する。

もう一つの様態として、本発明は、前記タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーの製造方法によって製造されたタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを提供する。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：発現ベクターの製造
１−１：ＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（Ｖ_Ｌ）製造
本発明の実施例１で使われたＰＣＲ条件は下記のとおりである。
ＰＣＲ混合物は、３１．５ｕｌの蒸溜水、１０ｕｌの５ＸＰｒｉｍｅＳＴＡＲｂｕｆｆｅｒ、５ｕｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、１ｕｌのフォワードプライマー（１００μＭ）、１ｕｌのリバースプライマー（１００μＭ）、１ｕｌの鋳型（１００ｎｇ／ｕｌ）、０．５ｕｌのＰｒｉｍｅＳＴＡＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／ｕｌ）で構成した。ＰＣＲ条件は、９８℃で１０秒、６８℃で１分を３０サイクル行って、産物を４℃に保管した。

各鋳型は、ＢＡＰ、ｓｏｒｔａｓｅ、標的配列を合成して使った。

具体的に使われたプライマーは下記のとおりである。

先ず、プライマー１_ｓｆｉ(5'−ccgt ggcccaggcggcc GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC−3':配列番号1)または、プライマー１(5'−ATGT CATATG GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC−3':配列番号2)、及びプライマー２(5'−CTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT−3':配列番号3)を利用してＢＡＰ（ｂｉｏｔｉｎａｃｃｅｐｔｏｒｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー３(5'−ATC GAG TGG CAC GAA ATG CAG GCT AAG CCG CAG ATT CCG−3':配列番号4)及びプライマー４(5'−GCCGGTCTCGGGAAGCTTCTTGACCTCGGTAGCGACAAA−3':配列番号5)を利用して、ＳｒｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１６２６８７）の６０乃至２０６回目アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー５(5'−CAG TAA GCT TCC CGA GAC CGG CGAT ATC CAG ATG ACT CAG AGC−3':配列番号6)、プライマー６(5'−ACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT−3':配列番号7)及び鋳型標的（ＶＬ）を利用してＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードする２次ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

その後、前記三つのＰＣＲ産物を共に混合した後、プライマー１_ｓｆｉまたはプライマー１及びプライマー７(5'−taat ggccggcctggcc GC GGC CGC TTAAAGATCTTCTTCACTAATTAACTT−3':配列番号8)を使って、ＳｒｔＡｃ−ＬＰＥＴＧ及び標的（ｔａｒｇｅｔ）をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩｓｉｔｅがある融合タンパク質であるＢＡＰ−ＳｒｔＡ−ｋＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、ｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションして、ＳｆｉＩで切断した後、融合タンパク質であるＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔを発現するベクターであるｐＣｏｍ３ｘでライゲーションした。

１−２：Ｔａｒｇｅｔ（Ｖ_Ｌ）−ｋＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０製造
プライマー８(5'−ATGT CATATG GAC ATT CAG ATG ACA CAG AGT−3':配列番号12)及びプライマー９(5'−ggaaccaccgccggtctcgggaagAAGATCTTCTTCACTAATTAAC−3':配列番号13)を利用して、ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）(GGSSRSS:配列番号9)が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー８及びプライマー１０(5'−GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GGA TGA GCC GGT CTC GGG AAG AAG AT−3':配列番号14)及び前記ＰＣＲ産物であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）を利用してｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）(SSGGGGSGGGGGGSSRSS:配列番号10)が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー１１(5'−gag acc ggc ggt ggt tcc tct aga tct tcc cag gct aag ccg cag att−3':配列番号15)及びプライマー１２(5'−taat GC GGC CGC tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC−3':配列番号16)を利用してｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー１３(5'−gtggttcctctagatcttcc TCG AAG GTC GCG GGA TAT ATT−3':配列番号17)及びプライマー１４(5'−taat ggccggcctggcc tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC−3':配列番号18)を利用してｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

プライマー１５(5'−GGT TCC TCT AGA TCT TCC GGA AGC cag gct aag ccg cag att−3':配列番号19)及びプライマー１４を利用してｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）(SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS:配列番号11)が連結されたｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

最後に、ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ａ）をプライマー８、プライマー１２及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（７ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲで増幅した。

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ｂ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲで増幅した。

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０（図１Ｃ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（１８ａ．ａ．）及びｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲで増幅した。

結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０を発現するベクターであるｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）でライゲーションした。

融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ｋＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０は標的及びｋＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩｓｉｔｅがある。その後、発現のために、すべての遺伝作製物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ｐＥＴ２３ａ−ｋＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（２０ａ．ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ１０にライゲーションした。

実施例２：水溶性発現確認
全ての発現実験は、Ｅ.ｃｏｌｉＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）を利用して行った。１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び０.５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むｄＹＴ培地（３０ｍｌ）に単一バクテリアコロニーを接種して、３７℃で夜中培養した。ｄＹＴｍｅｄｉｕｍ（１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、５０ｍＭＫ_２ＨＰＯ_４）０．３ｌに前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）を接種して３７℃で培養した（バッフル付１ｌフラスコ（１ｌｆｌａｓｋｗｉｔｈｂａｆｆｌｅｓ、２００ｒｐｍ）。ＯＤ_６００値が０．６である時ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるべく添加して発現を誘導した。培養を１８時間１８℃で維持した。細胞を遠心分離で収集して（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、３０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭＮａＣｌで懸濁して、超音波（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）で破砕した。粗抽出を遠心分離して（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、上澄み液を０．２ｍｍフィルターでろ過して、下記の実施例３のＮｉＦＦクロマトグラフィーに直接適用した。

実施例３：Ｎｉ−ＮＴＡ精製
溶解物の上澄み液を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ（ＧＥ）コラムにロードして、２０倍コラム体積のバッファーＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、及び５ｍＭＢＭＥ）で洗浄後、５倍コラム体積のバッファーＢ（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）で洗浄した。洗浄後、タンパク質−結合レジンのａｌｉｑｕｏｔｅを切断バッファー（５ｍＭＣａＣｌ_２及び５ｍＭｔｒｉ−Ｇｌｙを含むバッファーＢ）で平衡化させた後、２５℃で１時間反応させた。

タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析して、タンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した。タンパク質の収率は、計算された計算値を持つＵＶ分析（＠２８０ｎｍ）で定量した。

実施例４：Ｖ _Ｈ及びＶ _Ｌドメイン抗体の対結合
Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬのＦ_Ｖヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）へのドメイン結合反応を同じ体積のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを混合して行った。対結合条件（ｐａｉｒｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）バッファー内に１００μｇ／ｍｌのＶ_Ｈ及び１００μｇ／ｍｌのＶ_Ｌタンパク質を混合して１時間室温で反応させた。

本発明のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインの結合方法は、野生型間の結合、二硫化結合による結合、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる結合であり、各結合方法に対する模式図を図２に示した。

組み立てられたＦ_Ｖ（ａｓｓｅｍｂｌｅｄＦ_Ｖ）をＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィーで分析して、タンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した。また、二硫化結合で組み立てられたＦ_ＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＥＬＩＳＡで分析した。

マイクロプレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を一夜中ｃａｒｂｏｎａｔｅ／ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅバッファー（ｐＨ９．６）内の３００ｎｇの抗原（Ｅｒｂｂ２）及び捕獲抗体で４℃で一夜中コーティングした。ＰＢＳ−Ｔ０．０５％で洗浄後、プレートを３％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｅｄｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ−Ｔで１時間３７℃でブロッキングした。組み立てられたＦ_Ｖ（１〜０．５μｇ）を添加して、１時間３７℃で反応させた。プレートを洗浄して、３％スキムミルク（ｓｋｉｍｍｅｄｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ−Ｔ内のｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ＨＡまたはｍｙｃ抗体を１：２５００希釈して反応させた。プレートを１時間３７℃で反応させて、洗浄後ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ気質溶液で発色させた。前記反応を２ＮＨ_２ＳＯ_４で停止して、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。

実施例５：ＨＰＬＣ分析
ダイオードアレイ検出器を持つＡｇｌｉｅｎｔ１２６０シリーズＨＰＬＣシステムでサイズ排除ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。コラム（７．８０Ｘ３００ｍｍＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ２０００）はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘから購入した。５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１００ｍＭＫＣｌ（ｐＨ６．５）を移動相として使った。

実施例６：抗体配列の収集
ＰＤＢｅｎｔｒｙ１Ｑ９Ｒ内の抗体構造の可変ドメイン領域（ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｒｅｇｉｏｎ）を利用して、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴでＰＤＢ（本発明者等のＰＩＳＣＥＳＷｅｂｓｉｔｅ上で利用可能な非−リダンダンシー配列ファイルｐｄｂａａｎｒ）の全ての配列データを検索した。３５％同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）以上及びＥ−ｖａｌｕｅが１．０×１０^−２０より良い配列だけ維持して、抗体ドメインのみ残した（例えば、Ｔ細胞受容体及び他のＩｇ配列を除く）。結果的に重鎖及び軽鎖配列をＰＩＳＣＥＳサーバーを利用して９０％同一性で選んで集めた。重鎖配列及び軽鎖配列のｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔを個別的にＣＬＵＳＴＡＬＷで決めて、マニュアルとおり選んで集めて、編集した。前記ａｌｉｇｎｍｅｎｔは、その後、ＨＭＭＥＲプログラムを利用して、重鎖−特異的及び軽鎖−特異的ｈｉｄｄｅｎＭａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）を作るのに使った。ＨＭＭプロファイルは位置−特異的挿入確率を含むタンパク質ファミリーのｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔの統計的モデルである。これは可変ドメイン配列内によく決定された位置にあって、長さが様々なＣＤＲの位置を決めるのに適合するようにさせる。前記ＨＭＭは、本発明者等のＰＩＳＣＥＳサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｄｕｎｂｒａｃｋ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／ＰＩＳＣＥＳ−Ｐｈｐ）で利用可能なｐｄｂａａ（リダンダンシー（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を含む、ＰＤＢ内の全てのタンパク質配列のセット）を検索するのに使った。ＨＭＭＥＲスコアのｃｕｔｏｆｆ値及びＥ−ｖａｌｕｅはｐｄｂａａタンパク質配列を検索する時、単に抗体の重鎖及び軽鎖配列スコアがｃｕｔｏｆｆが良いように選択した。両ＨＭＭによって探した配列をさらに高いスコア及びさらに低いＥ−ｖａｌｕｅである一つに割り当てた。κ及びλ軽鎖スコアは、軽鎖ＨＭＭのｃｕｔｏｆｆより良い。このようなＨＭＭプロファイル（一つは重鎖及び一つはλ軽鎖である）は、各ＣＤＲの前後に特異的な保存フレームワーク（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｍｅｗｏｒｋ）の位置を確認するのに使った。

実施例７：ＣＤＲ分析
再配列された抗体Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の整列した収集は、ＣＤＲの長さ及び組成の分析に使った。各ａｌｉｇｎｍｅｎｔ内のＣＤＲは、ＣＤＲの長さに応じてグループで分類した。個別的なグループは、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ.（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８８３）に記載された規則に従って、標準構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で分類した。全ての分析はエクセルを利用して行った。

実施例８：タンパク質組合せによる効果的なＦ _Ｖ抗体形成及び活性検証
広く知られたＨＥＲＣＥＰＴＩＮをモデルとして、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌタンパク質を利用して様々な変移体を導入して、タンパク質組合せによる効率的なＦ_Ｖ抗体形成及び活性検証を確認した。

実験例１：融合タンパク質の自己切断による簡単精製確認
前記実施例１乃至３の方法によって簡単に融合タンパク質で標的タンパク質であるＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインを分離する可能性があることを確認した。

具体的に、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌ−ＨＡ−Ｆｌａｇ−ＬＰＥＴＧＬ−Ｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｒｔＡ−Ｈｉｓ１０の場合、下記のような配列を使った。

Flag(DYKD:配列番号20),V_H(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS:配列番号21),Linker(SLEGTGGTSGSTSGTGGSSRSSST:配列番号22),HA(YPYDVPDYAK:配列番号23)を使って、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌは下記の表１に記載された配列を使った。

具体的に、Ｖ_Ｌ−ｌｉｎｋｅｒ−ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌ−ｍｙｃ−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ.ａ．）−ＳｒｔＡ−Ｈｉｓ１０の場合、下記のような配列を使った。

V_L(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK:配列番号32),linker(ALEGTGSSTGSSTGPGGSSRSSST:配列番号33)、myc(EQKLISEEDLKLPET:配列番号34)を使って、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌは、下記の表２に記載された配列を使った。

システイン突然変異を導入した、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ（Ｈ−Ｇ４４ＣまたはＨ−Ｑ１０５Ｃ）−ＨＡ−Ｆｌａｇ−ＬＰＥＴＧ−Ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｔｒＡＨ−Ｉｓ１０の配列は、下記の表３に記載したＶ_Ｈ以外には前記と同じ配列を使った。

システイン突然変異を導入した、Ｖ_Ｌ（Ｌ−Ａ４３ＣまたはＬ−Ｑ１００Ｃ）−ＭＹＣ−ＬＰＥＴＧ−ｌｉｎｋｅｒ（７、１８、２０ａ．ａ．）−ＳｔｒＡ−Ｈｉｓ１０の配列は、下記の表４に記載したＶ_Ｌ以外には前記と同じ配列を使った。

このような簡単精製方法は図３に簡単に模式化した。
図３の方法によって精製されたＶ_Ｌ及びＶ_ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４に示した。また、図５にＦｌａｇタグによる精製収率を示した。このような結果を図６にまとめた。

前記図４に記載された配列は、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉＨ−Ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から配列情報を収得した。図３と４の配列は、ヘテロダイマー形成のために、４Ｄ５（HERCEPTIN(R)）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のｉｎｔｅｒｆａｃｅにシステインを導入して任意に突然変異を行った。

その結果、前記非−融合システム（ｎｏｎ−ｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）でのＶ_Ｌの精製収率は１０ｍｇ／ｌで、Ｖ_Ｈは０．２ｍｇ／ｌであった。これに対して、精製方法の単純化のために本発明者等が考案したＳｏｒｔａｓｅ融合方法による結果、精製収率が概略３〜６．５倍が増加したことを確認した（図６）。また、Ｆｌａｇタグを付けた場合に、発現率が約２〜５５倍増加したことを確認した（図６）。

実験例２：ＥＬＩＳＡ分析を介したタンパク質水準でＶ _Ｈ −Ｖ _Ｌ対結合確認
前記実施例４の方法でＶ_Ｈ及びＶ_ＬのＦ_Ｖ対結合をＥＬＩＳＡで確認した。このようなＥＬＩＳＡ方法の簡単な模式図を図７に示した。

具体的にＶ_Ｈ−ＨＡｔａｇ及びＶ_Ｌ−ｍｙｃｔａｇでデザインして、１対の野生型結合（ｗｔ）、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１６対の結合をＥＬＩＳＡ方法で分析した。Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対結合のＥＬＩＳＡ結果を図８に示した。その結果、抗原と共に対結合時、全部対結合が似た水準で観察されることが確認された。抗原なしでａｎｔｉ−ＨＡ−ｐａｉｒｓ−ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰで進めた時、野生型はシグナルがなく、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合中Ｖ_ＨｗｉｎｚｉｐＡ１／Ｖ_ＬｗｉｎｚｉｐＢ２はシグナルが低く、Ｖ_ＨｗｉｎｚｉｐＡ２／Ｖ_ＬｗｉｎｚｉｐＢ２はシグナルがなかった。二硫化結合による４対の結合中にはＶ_ＨＧ４４Ｃ/Ｖ_ＬＱ１００Ｃでだけシグナルを確認した（図８、左側棒：ａｎｔｉ−ＨＡ/Ｆ_Ｖ／ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰ、右側棒：Ｅｒｂｂ２／Ｆ_Ｖ／ａｎｔｉ−ｍｙＣ−ＨＲＰ表示）。

また、ＦｌａｇでタグされたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌをデザインして、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる８対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１２対の結合をＥＬＩＳＡ方法で分析した。その結果、抗原と共に対結合時、全部対結合が似た水準で観察されることが確認された。抗原なしでａｎｔｉ−ＨＡ−ｐａｉｒｓ−ａｎｔｉ−ｍｙＣＨＲＰで進めた時、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる８対の結合中Ｖ_ＨｗｉｎｚｉｐＡ１／Ｖ_ＬｗｉｎｚｉｐＢ１とＶ_ＨＩＡＡＬＥ３／Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３のシグナルが高く、二硫化結合による４対の結合中には他の分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど）では対結合が観察されたが、低い親和度でＥＬＩＳＡでシグナルがなかった（図９）。

前記のような結果は、本発明のタンパク質Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが無作為的に対結合を介して多様な多様性を付与するＦ_Ｖライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものとなる。

実験例３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介したタンパク質水準でＶ _Ｈ −Ｖ _Ｌ対結合確認
前記実施例４の方法でＶ_Ｈ及びＶ_ＬのＦ_Ｖ対結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈにシステインを導入する突然変異を介して形成された二硫化結合によるＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対結合を図１０に示した。その結果、Ｖ_Ｌ−Ｑ１００Ｃ／Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ、Ｖ_Ｌ−Ａ４３Ｃ／Ｖ_Ｈ−Ｑ１００Ｃ、及びＶ_Ｌ−Ａ４３Ｃ／Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃが二硫化結合による対結合でヘテロダイマーを形成することを確認した（図１０）。

また、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈにシステインを導入する突然変異を介して形成された二硫化結合中、各々Ｆｌａｇタグを付けた、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌの二硫化結合によるＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対結合を図１１に示した。その結果、Ｖ_Ｌｋ１−Ｑ１００Ｃ／Ｆ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ−Ｆ、Ｖ_Ｌｋ１−Ｑ１００Ｃ／Ｆ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ、及びＶ_Ｌｋ１−Ｑ１００Ｃ／Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃが二硫化結合による対結合でヘテロダイマーを形成して、生産率が増加するのを確認した（図１１）。

前記のような結果は、本発明のタンパク質Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが無作為的に対結合を介して多様な多様性を付与するＦ_Ｖライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものである。

実験例４：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を介したタンパク質水準でＶ _Ｈ −Ｖ _Ｌ対結合確認
前記実施例４及び５の方法でＶ_Ｈ及びＶ_ＬのＦ_Ｖ対結合をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）で確認した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである：

コラム:7.80×300mm BioSep-SEC-s2000
移動相：ＰＢＳ、ＰＨ７．４
コラムflow rate:0.5ｍｌ/min
コラム温度:25℃
UV吸光度検出器:280nm,210nm
注入体積（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅ）：１００ｕｌ

Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦ_Ｖのサイズ排除クロマトグラフィー結果を図１２に示した。

具体的に、ＦｌａｇでタグされたＶ_Ｈ−ＨＡｔａｇ及びＶ_Ｌ−ｍｙｃｔａｇでデザインして、１対の野生型結合（ｗｔ）、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌによる１１対の結合、二硫化結合による４対の結合の計１６対の結合をサイズ排除クロマトグラフィー方法で分析した。Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３−Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦ_Ｖ結合のサイズ排除クロマトグラフィー結果を図１２に示した。その結果、分子量が大きい順で組み立てられたＦＶ、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ、Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３の順に検出されることを確認した。

野生型を含んでＶ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及び組み立てられたＦ_Ｖ結合以外の結果では、Ｖ_ＨあるいはＶ_Ｌが検出されなく、組み立てられたＦ_ＶはＶ_ＨあるいはＶ_Ｌに比較して分子量のサイズ移動を見せて、計算される初期時間に検出されることを確認した。これは、抗体の特徴として知られている高い疏水性によりＶ_ＨあるいはＶ_Ｌ単一ドメイン抗体は、サイズ排除クロマトグラフィー分析が困難で、多くの組み立てられたＦ_Ｖは、各単一ドメイン抗体の表面に露出した疏水性が高い残基が組み立てられたＦ_Ｖによって隠されながら親水性に変わって検出となった。

前記のような結果は、本発明のタンパク質Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが対結合を介して多様な多様性を付与するＦ_Ｖライブラリーを製造する可能性があることを裏付けるものである。

実験例５：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を介したＶ _Ｈ −Ｖ _Ｌ対結合分子量分析
前記実施例４及び５の方法でＶ_Ｈ及びＶ_ＬのＦ_Ｖ対結合の分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで分析した。

Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ及びＦ_Ｖｗｔの分析結果を図１３に、Ｖ_Ｌ−Ｑ１００Ｃ、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ及びＦ_Ｖの分析結果を図１４に、Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ及びＦ_Ｖの分析結果を図１５に示した。

その結果ｗｔに対して各々Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈの分子量を正確に確認できて、結合したＦ_Ｖの分子量は確認されなかった（図１３）。Ｖ_Ｌ−Ｑ１００Ｃ（１３．６ｋＤａ）、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−Ｇ４４Ｃ−Ｆｌａｇ（１６．２ｋＤａ）、Ｆ_Ｖ（２９．８ｋＤａ）の分子量を確認して結合を確認することができた（図１４）。Ｖ_Ｌ−ＩＡＡＬＫ３（１８．６ｋＤａ）、Ｆｌａｇ−Ｖ_Ｈ−ＩＡＡＬＥ３−Ｆｌａｇ（２１．２ｋＤａ）、Ｆ_Ｖ（３９．８ｋＤａ）の分子量が確認して結合を確認することができた（図１５）。

実験例６：細胞水準で組み立てられたＦ _Ｖの活性検証
ＢＴ−４７４細胞増殖に対する結合４Ｄ５Ｆ_Ｖ抗体の効果をＣＣＫ８アッセイの（Ｄｏｊｊｉｎｄｏ）を介して確認して、その結果を図１６に示した。図１６を参照すると、ヒト乳癌細胞ＢＴ−４７４は、細胞表面でＨＥＲ−２を過発現して、結合した４Ｄ５Ｆ_Ｖによって４Ｄ５ＩｇＧ抗体によって減少したのと似た程度でＢＴ−４７４の成長が減少したことを確認することができる。

間接免疫蛍光体ラベリング後に４Ｄ５ＩｇＧとＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ｆｃを順に使って、ＦＡＣＳを介して、細胞表面でＨｅｒ２発現水準を確認した。Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン及び結合Ｆ_Ｖ抗体のＢＴ−４７４細胞に対する結合は、１ｕｇａｎｔｉ−ｃ−Ｍｙｃａｎｔｉｂｏｄｙで細胞を１時間ラベリングして、ＦＡＣＳ前Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙで２次ラベリングして確認した。

ＢＴ−４７４細胞で４Ｄ５ＩｇＧ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン及び結合Ｆ_Ｖ抗体のＨｅｒ２発現細胞表面への結合プロフィールをＦＡＣＳを介してモニタリングして、その結果を図１７に示した。市販中の４Ｄ５ＩｇＧ（ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ）で分析した結果、ＢＴ−４７４細胞でＨＥＲ−２の過発現が確認された。

実験例７：ライブラリーデザイン
Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌタンパク質の対結合によって製造された機能的組合せタンパク質ライブラリーを既知の抗原−抗体結合体でデザインした。自然免疫レパートリー（ｎａｔｕｒａｌｉｍｍｕｎｅｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）は、高い特異性及び親和度を持つ任意の抗原を根本的に認識する抗体を生成することができる。抗原認識は、抗原と接触する広い表面に存在する６個のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）により媒介される。ＣＤＲ配列は、超可変的（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）であるが、機能的ＣＤＲの全体組成が特定アミノ酸タイプに対し友好的な偏見を持つようにさせる。本発明者等のライブラリーは、分子認識を媒介するのに特に適合した機能的グループの小さいサブセットに機能的多様性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を制限した。本発明者などのライブラリーは信頼できるフォールディング及び高発現収率を与える選択されたフレームワーク各々のｋｅｙ抗体内の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３に抗原−抗体複合体形成に重要な高頻度配列を導入して製造した。全てのＣＤＲの長さは、収集された抗体から高頻度で固定した。ＣＤＲ１及び２の組成は、収集された抗体中最も多い残基でデザインした。本発明者等のライブラリーは、Ｖ_Ｈ（１００）及びＶ_Ｌ（１００）の対結合によって１０^４抗体の組合せわせた複雑性（ｃｏｍｂｉｎｅｄｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）を持っている。ヒトｇｅｒｍｌｉｎｅのＶ_Ｈ３、Ｖ_Ｌｋ３及びＶ_Ｌｋ１切片は、非常に高い頻度で再配列された抗体内で確認されて、よく発現して、対をなす。

本発明者等は、Ｖ_{Ｈ３−６６}及びＶ_Ｌｋ１フレームウィーク内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ＤＮＡ配列を合成して、抗原−抗体複合体形成に重要な高頻度配列を利用して、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３に多様性を導入した。

前記実施例６乃至８の方法でライブラリーデザインを行った。フレームワークとしてＶ_{Ｈ３−６６}及びＶ_ＬＫ３を使った。ヘテロダイマーの多くは、ＨＶ３、ＨＶ１、ＨＶ４とＫＶ３及びＫＶ１である。

ＣＤＲは高頻度で出てくるＣＤＲの長さを固定した。具体的に、ＣＤＲＨ１は長さを１０、ＣＤＲＨ２は１０、ＣＤＲＨ３は１１、ＣＤＲＬ１は１１、ＣＤＲＬ２は７、ＣＤＲＬ３は９個のアミノ酸で固定した。高頻度で出てくるＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３の代表的な内容を図１８に示した。

実験例８：ライブラリー構築
多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）デザインは、ＣＤＲ１及び２は最も高頻度の残基で固定して、ＣＤＲ３は高頻度の残基でデザインした。その例を図１９に示した。Ｖ_Ｈドメイン１００個及びＶ_Ｌドメイン１００個を組み合わせて、１００×１００=１００００個の多様性を持つライブラリーをデザインした。その結果は図２０に表示したとおりである。タンパク質組合せによって構築された１０，０００Ｆ_Ｖｓ中５Ｖ_Ｈｓと５Ｖ_Ｌｓの組合せで構築された２５Ｆ_ＶｓをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認して、その結果を図２１に示した。

４Ｄ５Ｖ_Ｈと５個の合成Ｖ_Ｌｓに対する組合せをＦＡＣＳとＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認して、その結果を図２２に示した。４Ｄ５Ｖ_Ｈと５個の合成Ｖ_Ｌｓによって製造された結合Ｆ_ＶをＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した。しかし、ＢＴ−４７４細胞には結合していないことを確認した。

実験例９：ライブラリースクリーニング
ライブラリースクリーニングのために、Ｆｃがコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されたＣＴＬＡ４、４１ＢＢ、ＴＲＡＬＲ１、ｃＭＥＴ、ＴＲＡＬＩＲ２、ＣＤ４０、Ｆｒｉｚｚｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ７、ＣＤ３０、ＩＬ−１７Ｒ、ＣＳＦ１−Ｒを含む１０個の抗原を選定して、１次スクリーニングで１０個の混合された抗原と個別Ｆ_Ｖとの相互結合をアルファアッセイ（ａｌｐｈａａｓｓａｙ、ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＰｒｏｘｉｍｉｔｙＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓＡｓｓａｙ）で確認して、選別された抗体に対する個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングした。ライブラリースクリーニング過程を図２３に図示した。

アルファアッセイはドナービーズ（ｄｏｎｏｒｂｅａｄ）とアクセプタービーズ（ａｃｃｅｐｔｏｒｂｅａｄ）のビーズ基盤近接性アッセイ（ｂｅａｄｂａｓｅｄｐｒｏｘｉｍｉｔｙａｓｓａｙ）で、ビオチン化された抗原は、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコーティングされたビーズでキャプチャーできて、ｍｙｃ−ｔａｇがあるＦ_Ｖはａｎｔｉ−ｍｙｃがコンジュゲーションされたアクセプタービーズに結合することができる。ドナービーズとアクセプタービーズは、抗原−Ｆ_Ｖ相互結合によって近接性を持つことになる。ドナービーズは一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ）放出の結果で６８０ｎｍで励起され、一重項酸素によって増幅された蛍光シグナルがアクセプタービーズで発光されて、アルファシグナルを検出することになる。

アルファアッセイを介して個別Ｆ_Ｖと１０個の混合抗原の相互結合をスクリーニングした結果を図２４に示した。図２４を参照すると、Ｙ軸は、アルファシグナルを、Ｘ軸は、スクリーニングした１００００個のＦ_Ｖを示した。ｈｉｇｈシグナルからｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに近いｌｏｗシグナルまで種々の抗体がスクリーニングされたことを確認することができる。

混合された抗原に結合するＦ_Ｖと個別抗原の相互結合を２次的にスクリーニングして、その結果を図２５に示した。ＣＳＦ１Ｒ、ＭＥＴ、ＣＤ３０、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せる抗体を探すことができ、種々の抗原の組合せに多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を持つ抗体を確認することができた。

ＣＳＦ１Ｒに主に結合するＦ_Ｖのアルファアッセイの結果を図２６に示した。図２６を介して、アルファシグナルの差を見せる種々の抗体を確認することができる。

アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をＥＬＩＳＡで同時に確認して、その結果を図２７に示した。確認したＦ_Ｖｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。Ｆ_Ｖ#７１９７と#７１９５等一部は多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せた。

アルファアッセイの結果、ＣＳＦ１Ｒと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をウエスタンブロットで確認して、その結果を図２８に示した。Ｆ_Ｖｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。

ｃ−ＭＥＴに結合するＦ_Ｖのアルファアッセイの結果を図２９に示した。図２９を介してアルファシグナルの差を見せる種々の抗体を確認した。

アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をＥＬＩＳＡで同時に確認して、その結果を図３０に示した。確認したＦ_Ｖｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を確認した。Ｆ_Ｖ#７２４と#６９００等一部は多重特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を見せた。

アルファアッセイの結果、ｃ−ＭＥＴと主に結合するＦ_Ｖに対する相互結合をウエスタンブロットで確認して、その結果を図３１に示した。図３１を参照すると、Ｆ_Ｖｓが概してＣＳＦ１Ｒとｃ−ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）に同時に結合する結果を示すことを確認した。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

本発明は、今まで存在しなかった新しいＦ_Ｖライブラリー製造のプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）で、特に既存のＤＮＡ水準でライブラリーの組合せではなくＶ_ＨとＶ_Ｌのタンパク質水準での組合せを介して精製及びスクリーニングにかかる時間及び費用を大幅に減少できる新規なン抗体製造のプラットホームを提供できる技術である。このような技術的特徴によって、実質的に機能をする治療抗体を既存の時間及び費用を画期的に削減させて選別できるだけでなく、目標物質に制限されることなく、阻害剤、調節剤などを開発することができる。

また、既存ライブラリーが持つ毒性問題がないので、機能分析が直ぐできて、様々な目的に応じた抗体を選別することができて、細胞増殖、分化、細胞死などに関与する機能に伴う抗体を選別したり、正常及び異常（目的疾病、現象、状態）細胞または個体間において抗体を利用した区分が可能になる。即ち、抗体医薬品の生産に適用できて、その他に様々な疾病の診断、幹細胞分化能の確認及び分化促進、疾病のメカニズム研究、抗体スクリーニング、阻害剤と調節剤の同時開発可能、各種状態（分化及び未分化、疾病群と正常群）に対して抗体ｍａｐｐｉｎｇ（ｆｉｎｇｅｒ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ）可能性などの多様な分野に適用可能になる。

本発明は、走光性を利用して改良された単細胞生物体を微細流体システムを利用して効果的に選別できるもので、細胞単位で容易なモニタリングが可能で、収集した結果の統計的分析を含んだ様々な分析を介して、変化した光反応性及び/または光敏感性を持つ突然変異菌株を容易にまたは高速で選別できて、走光性及び光転換効率の相関解明、光転換効率が向上した改良された単細胞生物体選別に有用に活用できる。

Claims

（ａ）重鎖可変領域（ｈｅａｖｙＣ−Ｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｈ）ドメインタンパク質及び軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ；Ｖ_Ｌ）ドメインタンパク質を製造する工程；及び（ｂ）前記（ａ）工程で製造されたＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質を結合する工程を含む、タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリーの製造方法。
前記（ｂ）工程で、Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質は、無作為的な対結合または目的する対結合によって結合されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記Ｆ_Ｖライブラリーは、個別的機能検査が可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記個別的機能検査は、目標物質結合に伴う前−選別工程を行わないことを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記（ａ）工程のＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質は、目的する多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を導入したことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質は、ヒトまたは非ヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質またはＶ_Ｌドメインタンパク質内のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）またはフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に突然変異が導入されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ＣＤＲは、ＣＤＲ３であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
（ｂ）工程のタンパク質結合は、（ｉ）野生型ドメイン間の結合、（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合、（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合、（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合、及び（ｖ）これらの組合せからなる群で選択された結合であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記タンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリー製造方法は、（ｃ）結合したＦ_Ｖを各々指定されたＩＤ（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）番号が付与された個別区画に静置する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（ａ）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって製造されたタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリーを準備する工程；及び（ｂ）前記Ｆ_Ｖライブラリーを使って目的する特性、特徴または活性に対して、個別的機能検査する工程を含む、目的するＦ_Ｖ抗体をスクリーニングする方法。
前記目的する特性、特徴または活性は、細胞の増殖、分化または細胞死であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記スクリーニングする方法は、（ｃ）目的するＦ_Ｖ抗体が静置された区画のＩＤ番号を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記スクリーニングする方法は、（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦ_Ｖ抗体の組合せの前にＶ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
前記スクリーニングする方法は、（ｄ）確認したＩＤ番号の区画のＦ_Ｖ抗体を分離してＤＮＡ配列を確認する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法によってスクリーニングされた目的Ｆ_Ｖ抗体。
Ｖ_Ｈドメインタンパク質及びＶ_Ｌドメインタンパク質が結合したＦ_Ｖを含むタンパク質組合せ基盤のＦ_Ｖライブラリー。
前記タンパク質結合は、（ｉ）野生型ドメイン間の結合、（ｉｉ）システイン導入による二硫化結合、（ｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメイン融合によるｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ結合、（ｉｖ）タンパク質間相互作用による結合、及び（ｖ）これらの組合せからなる群で選択されたいずれか一種の結合であることを特徴とする請求項１７に記載のＦ_Ｖライブラリー。
前記Ｖ_Ｈドメインタンパク質またはＶ_Ｌドメインタンパク質内のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）またはフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に突然変異が導入されたことを特徴とする請求項１７に記載のＦ_Ｖライブラリー。
前記Ｆ_Ｖは、指定されたＩＤ番号が付与された個別区画に静置されることを特徴とする請求項１７に記載のＦ_Ｖライブラリー。
前記ライブラリーは、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって製造されることを特徴とする請求項１７に記載のＦ_Ｖライブラリー。