JP2016506751A - 電気穿孔方法、及び、電気穿孔装置 - Google Patents
電気穿孔方法、及び、電気穿孔装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016506751A JP2016506751A JP2015557314A JP2015557314A JP2016506751A JP 2016506751 A JP2016506751 A JP 2016506751A JP 2015557314 A JP2015557314 A JP 2015557314A JP 2015557314 A JP2015557314 A JP 2015557314A JP 2016506751 A JP2016506751 A JP 2016506751A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electroporation
- cells
- cell
- electrode
- container
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 title claims abstract description 209
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 claims abstract description 77
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 81
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 16
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 371
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 99
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 51
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 41
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 29
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 19
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 11
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 9
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 7
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 2
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000010891 electric arc Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012811 non-conductive material Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004713 Cyclic olefin copolymer Substances 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000009429 electrical wiring Methods 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012945 sealing adhesive Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011135 tin Substances 0.000 description 1
- XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N tin dioxide Chemical compound O=[Sn]=O XOLBLPGZBRYERU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001887 tin oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/10—Apparatus for enzymology or microbiology rotatably mounted
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
電気穿孔の応用として、様々な細胞、例えば哺乳類細胞、植物細胞、酵母、他の真核細胞、バクテリア、他の微生物細胞及びヒト患者からの細胞にDNA、RNA、siRNA、ペプチド、蛋白質、抗体、ドラッグ、又は他の物質を導入することがある。
さらに、電気的刺激はハイブリドーマ、或いは他の融合細胞の製造における細胞融合に用いられる。
電気的細胞融合は電気穿孔の特殊な形式と見なすことができる。
例えば、Bio−Rad社(Hercules、CA)のGene Pulserシリーズでは、キュベット中の細胞が電気穿孔される構成としている。従来の電気穿孔では高電界強度が必要とされる。
まず第一に、電界強度が高すぎると、細胞膜は不可逆的にダメージを受ける可能性がある。
第二に、電気的に誘発される膜細孔は、対象物質が細胞に導入される際に、細孔からの細胞内含量の流出と、細胞の生存性に悪影響を与える他の意図しない物質の流入を許容する可能性がある。
第三に、電流により発生した熱は、細胞に害を及ぼす可能性がある。
最後に、電気化学的に生成された有害因子、例えば、電極の近くにある遊離基、ガス及び金属イオンは細胞に有害である。
不均一性に影響する要因の一つとして知られるものは細胞のサイズである。より大きい細胞はより簡単に電気穿孔される。異なるサイズの細胞混合物では、大細胞はある電圧の下で効率的に電気穿孔される一方、その電圧は、小細胞を効率的に電気穿孔するには、十分ではない場合が多い。小細胞が効率的に電気穿孔される電界強度では、その電圧が大細胞の生存にとって高すぎるため、通常、大細胞は不可逆的なダメージを受ける。また、細胞膜の異なる組成、又は細胞の成熟状態といった他の要素は、細胞の不均一性に影響を与えてしまう。
上記装置は、細胞を収容する絶縁性チャンバを有するサンプル容器を有する。サンプル容器は、電気穿孔用の電気的接続を提供する第一電極、及び第二電極を有する。絶縁性チャンバは、少なくとも一つの細胞単層を含むように構成される。当該装置はまた、細胞の電気穿孔に必要なパルスを生成するパルス発生器を有する。
その方法は以下のステップを含む。
サンプル容器の絶縁性チャンバに、少なくとも一つの細胞単層を形成するために、細胞を配置する。
サンプル容器には、電気穿孔用の電気的接続を提供する第一電極、及び第二電極がある。
パルス発生器により生成される所定の電気パルスで、細胞単層の細胞の電気穿孔をする。
図1Bは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器中の細胞単層の形成を示す図である。
図1Cは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器中の細胞単層の形成を示す図である。
図2Aは、球状の絶縁体細胞による電流フローの遮断及び分流の効果を示す図である。
図2Bは、細胞における電気穿孔の有効表面を示す図である。
図3は、有効な電気穿孔の表面における細胞のサイズの効果を示す図である。
図4は、示された電流方向における三つの代表的な細胞の隣接している位置を示す図である。
図5は、細胞単層を通って流れる電流の分布を示す図である。
図6は、模擬細胞の人工の絶縁性粒子を使用し、総細胞数を増やすことを示す図である。
図7は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図8は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図9Aは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図9Bは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図10は、本発明の実施例に対応する電気穿孔、又は電気細胞融合に用いるため、例示的な遠心分離法を使用し、緻密な細胞単層、又は複数の細胞単層を造る、ことを示す図である。
図11Aは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図11Bは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図12Aは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図12Bは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図13は、本発明の実施例に対応する例示的な電気穿孔のプロセスを示す図である。
図14Aは、本発明の実施例に対応する例示的な装置を示す図である。
図14Bは、本発明の実施例に対応する電気穿孔のために、例示的な下側媒質層の使用を示す図である。
図15は、例示的な細管補助の電気穿孔を示す図である。
図1Bは、絶縁性チャンバ14にある細胞単層11の断面図を示す。図1Bに示されるように、単層11は、絶縁性チャンバ14の断面エリアを占めている。
細胞にDNA、RNA、又は蛋白質を導入するといった典型的な電気穿孔では、媒質、又は他の緩衝塩溶液の中で電撃が行われる。
細胞外の溶液や細胞内の細胞質と比較すると、脂質二重層ベースの細胞膜はかなり低い電導度を有し、電流の大部分が細胞の内部をバイパスする。従って、細胞は絶縁物体に似たものとなる。
図2Aに示されるように、絶縁体に似た球状細胞による電流の遮断と分流により、もともと均一な電場が細胞の周囲が隆起する電場に変えられる。
Vθ=1.5・Eo・R・cosθ (I)
ここで、Eoはもともと均一な電場の電界強度である。
全体的な電界の方向に対する二つの局所点のθが0°、又は180°に等しい時に、cosθは1、又は−1に等しく、経膜電位値は最も高くなる。
電流の上流(θ=180°)ではなく、電流の下流(θ=0°)の局所点において、DNA、RNA、蛋白質などの陰性荷電分子は、最大電位下で細胞膜を通過する。反対に、θが90°に等しいときは、細胞膜点の外の電流は最も強いが、細胞膜の点における経膜電位はゼロとなる。
物質を導入するためには、最小量の経膜電位Vminが必要である。
θの最大値、又はθmaxは、0°と90°の間で到達でき、そこで、経膜電位がVminになる。
同時に、θがより小さい細胞膜上の経膜電位は、細胞に不可逆的なダメージをもたらす電位を超えることができない。θmaxは、最も効果の高い電気穿孔表面を定義する。
本発明において使用される有効電気穿孔表面、又は細胞の電気穿孔のための有効表面は、十分な経膜電位を有し、DNA、RNA、蛋白質などの外部の物質を細胞に導入する細胞表面の部分のことをいう。
DNA、RNA、蛋白質などの大分子を細胞に導入する電気穿孔において、細胞は特定の経膜電位よりも低い場合にのみ生存可能である。
Vminは有効な電気穿孔が可能となる最小の透過可能な経膜電位を表し、それを下回ると、外部の物質は細胞に導入されることができない。
VmaxとVminの値は細胞膜の特性により決定される。
Vmaxは、導入する対象物質の種類を問わず同じである。一方、Vminはサイズや電荷など対象物質の分子の特性に関係する。
大分子を導入する時のVminは大きくなる。
VmaxとVminの間の範囲は、細胞を電気穿孔する経膜電位の有効範囲であり、特に大分子を導入する時には、その範囲は小さくなる。
影がつけられた有効電気穿孔表面の外縁部にVminの経膜電位が存在し、その半径角度はθmaxである。DNA、RNA、蛋白質などの陰性荷電分子については、有効電気穿孔表面は電流の下流側に配置される。
θ=0° 及び cosθ=1 である局所点において、
Vmax=1.5・Eo・R
が付与される。
θmaxにおいては、経膜電位がVminまで減少し、
Vmin=1.5・Eo・R・cosθmax=Vmax・cosθmax
となる。
従って、θmaxは以下の公式により確定できる。
cosθmax=Vmin/Vmax
VminとVmaxの絶対値は状況に応じたある変化に従う。
例えば、指数関数的な減衰波や方形波などの異なる電気パルス形状が使用される場合、VminとVmaxの値は異なることになる。
しかし、Vmin/Vmaxの比率は、これらのタイプの変化と同じように敏感とはならない。
細胞膜は、本質的に膜蛋白が分布しており、いくつかのチャンネルを有する脂質二重層である。
細胞のサイズがある程度異なっても、同じタイプの細胞は、同様の膜構成を有する。
従って、同一の細胞の異なる位置、或いは、同じタイプの異なるサイズの細胞においては、その膜電気特性、例えば、VmaxやVminなどは、同じであると考えられる。細胞のタイプが異なるものでさえも、多くの哺乳動物細胞は、VmaxとVminを含む同様の膜電気特性を有するといえる。細胞膜は、本質的には、異なる蛋白質が同じように分布された脂質二重層であるからである。
円形により物理細胞や経膜電位プロファイルを表すために、三つの細胞の中心は一直線上に配置される。
電界強度は、大細胞が局所点においてVmaxに達するように設定され、Vmaxである局所点とVminである外縁部の間における有効電気穿孔表面に影がつけられる。
大細胞が最適な電気穿孔を得られる際には、
Vmax=1.5・Eo・R
となり、
Eo=Vmax/(1.5・R)
となる。
中細胞(半径r<R)での局所点における経膜電位はより低くなる。
局所点における経膜電位Vtopは以下のように示される。
Vtop=1.5・Eo・r=Vmax・r/R
Vmin=1.5・Eo・r・cosθr=Vtop・cosθr=(Vmax・r/R)・cosθr
これにより、以下のようになる。
cosθr=(Vmin/Vmax)・(R/r)
中細胞上の有効電気穿孔表面は大細胞の有効電気穿孔表面より小さく、Vtopである局所点とVminである外縁部の間に影がつけられる。
r/R=Vmin/Vmaxである時に、cosθrは1になり、有効表面はゼロまで減少する。
従って、有効な電気穿孔を得るための最小半径は、以下となる。
rmin=(Vmin/Vmax)・R
大細胞は局所点における経膜電位が高いだけではなく、有効表面も大きくなる。
小細胞の経膜電位をVmaxに到達させるために高い電流場が適用されると、大細胞は生存することができなくなる。
細胞のサイズが相違することは避けられず、電気穿孔中の細胞特性は不均一であると考えられる。例えば、細胞群の95%は、正規分布(ガウス分布)分布により約20%の半径偏差があり、Vmin/Vmax(即ち、rmin/R)が約90%であれば、半径偏差が約10%である範囲内の細胞だけが有効に電気穿孔される。ガウス分布に基づいて、中細胞が電気穿孔される時に、理論上の最も高い電気穿孔効率は約67.3%に達する。大細胞については、Vmin/Vmax(例えば、rmin/R)が約95%であり、理論上の最も高い電気穿孔効率は約37.6%になる。
多くのタイプの哺乳動物細胞には同様のVminとVmaxがあるため、小さなサイズの細胞がVminに到達するには、より高い電流場強度を必要とし、高電流になるにつれて有害物がもたらされる。例えば、熱、遊離基、ガス及び金属イオンは、細胞に対して有効的な電気穿孔がなされる前に、不可逆的にダメージを与えることがある。
細胞のサイズは容易に変えることができないため、細胞のサイズのバラつきに適応する電気穿孔の方法が望まれるが、現在では利用可能ではない。
電気穿孔においては、106〜107のオーダーで多数の細胞を使用することが望ましい場合がしばしばある。
また、細胞が体積の小さい容器の中に置かれる二つの主な理由は以下である。
i)高濃度の対象物質の輸送を実現すること。
ii)より小さなサンプル体積はより少ないエネルギーを必要とするため、パルス発生器の製造が容易であること。
各細胞は、側面の長さが約27μmの立方体と等しいスペースを占有し、典型的な哺乳動物細胞の直径よりは大きくない。従って、典型的な電気穿孔においては、細胞間の平均距離はほとんどの哺乳動物細胞の細胞直径と同等である。即ち、細胞は互いに非常に接近している。
計算式(I)は、少数の細胞が均一な電場に置かれ、細胞間の距離が細胞直径よりもはるかに大きい場合に適用できる。細胞が密集しているときの電気穿孔では、各細胞を取り囲む電場は、この細胞自体と接近する他の細胞により変化する。細胞膜内の固有の特性であるVminとVmaxが同じ場合でも、所定点における経膜電位を計算するためには、計算式(I)はもはや適用できないものとなる。このため、電場プロファイルは複雑となり、予測が困難となる。
細胞のサイズが完全に等しい場合でも、細胞がランダムに配置されると、細胞の電気穿孔効率が不均一な別の層を構成することになる。
一番目のタイプは、周囲の細胞の影響を受けない遊離細胞(F)である。二番目と三番目のタイプは、隣接する細胞の位置を決める二つの特別な方法を表す。
一番目の特別な配置では、一般的な電流流動の方向に沿って、二つ或いは多数の細胞が密接に縦方向に並ぶ。このボジショニングは細胞S1、S2及びS3により表される。
二番目の特別な配置では、細胞は密接に、一般的な電流流動の方向に対して、略垂直な断面において横に配置される。この配置は細胞E1、E2及びE3により表される。
これらの細胞上における経膜電位の正確な計算式を導出するのはより困難であるが、電気穿孔の改良方法を開発するためには、関連する定性的な分析がなされる。
もし電流の方向が逆の場合には、S3細胞もS1細胞のように、有効に陰性荷電分子の電気穿孔をすることができる。S1とS3の細胞のシールド効果により、S2細胞はより低い経膜電位を有することになる。
前側に配置される細胞による、後ろ側の細胞を電気穿孔の取得からシールドする効果は、縦方向のシールド効果と定義される。
細胞間の距離が大きくなる、又は、配列が厳密な縦方向から逸脱すると、縦方向のシールド効果は顕著ではなくなる。
縦方向の配列は、多数の細胞をシールドし、電気穿孔効率を低下させため、電気穿孔において望まれないバラつきのレベルに至ることになる。
その結果、超大型の単一細胞を形成するかのように、E1、E2及びE3の経膜電位は細胞Fの経膜電位より高くなる。横に配置される細胞は経膜電位計算式(I)にもはや従うものではない。
細胞の平面の近くでは、電流の総量が少ないため、このような細胞の局所点付近の経膜電位は、遊離の単一細胞の経膜電位よりも減ることになる。
定性的には、有効表面の形状は若干不規則になるが、各E1、E2及びE3細胞は、F細胞と比較して、Vmax点とVmin点の間において電気穿孔の効果が強化されるため、より大きな有効電気穿孔表面を有することになる。
横に配置される細胞が互いの電気穿孔の実施容易性を高める効果は、横方向の増強効果と定義される。
細胞間の距離が増える、又は、細胞が断面位置から逸脱すると、横方向の増強効果は顕著ではなくなる。
まとめると、上述した電流方向において、これらの細胞の電気穿孔の実施容易性は、以下のように並べることができる。
E2,E1,E3>S1,F>S2,S3
縦方向のシールド効果と、横方向の増強効果と、及び、縦方向のシールド効果と横方向の増強効果の組み合わせ相互作用である。
主に縦ではなく、また主に横ではない位置において隣接する細胞の間には、組み合わせ相互作用があり、これらの相互作用はより小さなシールド効果と増強効果を有する。
定性的な分析により、高効率な電気穿孔を実現するためには、縦方向のシールドは望まれないことが明らかになった。
しかし、細胞懸濁液中においては縦方向のシールド効果は回避し難い。
電流方向を変更することにより、縦配列の細胞の両側の局所表面における電気穿孔の効率を向上させることが可能となる。
横方向の増強効果は、電気穿孔に有益であり、特に、Vminに達する破壊的に高い電界強度を要求するタイプである小サイズの細胞型にとって有用である。
また、ギルドメタル、表面改良合金、又は、導電性材料で被覆、混合されたゴム又はプラスチックなどの非導電性材料により作ることができる。
第一電極15aと第二電極15bは、インジウム‐すず酸化物、アルミニウム添加酸化亜鉛、及びアンチモン添加酸化錫などの材料を使用し、細胞の顕微鏡観察のために、透明に作られる。
第一電極と第二電極は、異なる材料や、異なる形状で作ることができる。
両電極15a,15bの間の距離は、液体の取り扱いを容易にするために、1mmより大きく、対象物質に過剰に消費されて導入されるのを避けるために、50mmより小さくすることが好ましい。1つの実施例において、両電極15a,15bの間の距離は、簡単な取り扱い及び反応剤の保存のために、1mm〜30mmの範囲とされる。電極板15a,15bの形状および寸法は、容器10の形状および寸法により決定され得る。電極15a,15bを製造するためには、通常、金又は白金のような貴金属を使用する必要がない。
しかし、電極15a,15bを製造するためには、コストが問題とならない時や、あるいは、容器が再使用の必要がある時に、金及び白金のような貴重な不活性の金属を使用することができる。
発生器18は、指数関数的な減衰波、方形波、又は矩形波、高周波、波形の結合などの一つ、又はいくつかの異なるパルスフォームを生成することができる。
電気穿孔のパルスフォームは細胞型、容器のタイプ、及び/又は他のデータに基づいて、予め決定されることができる。
その結果、パルス発生器18は、電気穿孔のために、所定のパルスフォームを供給するようにプログラムされることができる。本開示において、一つのパルス、又は一つのパルスフォームとは、単一のパルス、又は、多数のパルスやパルスフォームにより構成された結合パルスのことをいう。
通常、上側媒質やバッファ層13は、細胞懸濁液、或いは他のあらゆる適切な媒質、又はバッファを作成するのに用いられる媒質、又はバッファにて構成される。
上側媒質層13に使用される媒質やバッファは、任意の適切な媒質やバッファであってもよく、例えば、MEM,DMEM,IMDM,RPMI,Hanks’,PBS及びリンガー液などである。
下側媒質やバッファ層12は、高濃度の溶液にて構成され、例えば、糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびフィコールを含む溶液とすることができる。
下側媒質層12に使用される媒質やバッファは、上側媒質層13に使用される媒質やバッファと同じ、又は同じではない任意の適切な媒質やバッファであってもよく、例えば、MEM,DMEM,IMDM,RPMI,Hanks’,PBS及びリンガー液などである。
また、下側媒質層12は半固体ゲルにより形成されることができる。例えば、寒天、又はアガロースベースのゲル、シリコンゲル、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲン又はゼラチンゲル、マトリゲル、ヒアルロン酸ゲル、アルギン酸ゲル、ポリエチレングリコールゲル、メチルセルロース、又は他の変性セルロースベースのゲル、アクリラートゲル、ポリグリコールゲル及びプロピレングリコールゲルである。
固体マトリクスは多孔性であり、望ましくは親水性とし、下側媒質層12の導電性が維持される。
固体マトリクスは、シリコン、樹脂類、グラスファイバー、ポリメタクリレート、シリケイト、変性セルロース、ポリビニル、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド及び共重合体などの材料により作ることができる。
下側媒質層12を形成するある材料は、液体と半固体の間、又は、半固体と固体の間、又は、液体と固体の間の物理状態となる。
このような下側媒質層12の物理状態は、安定的なインタフェースが上側媒質層13と下側媒質層12の間に形成され、維持される限り、電気穿孔に影響を及ぼさない。導入される対象分子は上側媒質層13、又は、下側媒質層12、或いは両方にあってもよい。
しかし、ある実施例において、細胞が存在するための少なくとも一つの媒質インタフェースがある限り、二つ以上の導電性媒質層を使用することができる。
異なる断面積のサンプル容器を用いて異なるサイズのインタフェースを形成することができ、これにより、異なる数の細胞に対応することができる。
図1Cに示されるように、細胞単層11は電極15b上に直接形成される。
単層11を形成するために、媒質やバッファの細胞の数が適切な細胞懸濁液が、サンプル容器中に放置される。
細胞は、単層11を形成するために、自然な重力、又は遠心分離法で電極15bに沈降する。このことは、必要とされる電界強度が低い時、及び/又は、細胞が有害物を許容できる場合には、適切なものとなる。
また、媒質、又はバッファ中の塩類は、媒質層12,13を導電させる。
バクテリアなどの非常に小さな原核細胞の電気穿孔には、時に水が低導電性媒質として使用され、極めて高い電界強度を許容する。
このような場合、導入される荷電分子は、水をベースとする媒質について、液体ベースの細胞膜よりもさらに導電性を与えることができ、特に細胞膜と比較すると、水をベースとする媒質は大まかにいって導電性があると考えられる。
影が付された部分は、特定の電流方向における陰性荷電分子の有効電気穿孔表面を表す。
隙間の幅はおよそ、有効電気穿孔表面の下の電流パスの平均幅として定義され得る。
単層11の抵抗は、約5つの細胞の媒質深度(20%の逆数が5である)であり、それに、これは通常の電極間距離と比べて小さいので、電気抵抗の全体的な増加は少なくなる。
これは、従来の同様の容器での電気穿孔と比較すると、必要な電圧が約20%であり、また、必要なパワーは約4%(20%×20%)だけになることを意味する。
この簡易計算によれば、同様の電気穿孔を達成するためには、細胞単層が懸濁液中の細胞よりも、かなり低い電気エネルギーを必要とすることが示される。
単層11について使用される合理的な最小の緻密度は、横方向の増強効果を利用するために約50%とすることができる。
層の緻密度が増加するのに従って、横方向の増強効果はより顕著になり、有利になる。
特定の重力や遠心力では、単層内にそれ以上の細胞を含ませることができなくなったときに、完全な緻密度に達することになる。
緻密度が完全となった状況は、細胞の間のトータルの空間は小さくなるが、完全になくなるわけではない。
細胞が緻密に配置される場合では、細胞は可塑性を有するため、円形や球状には見えない。
単層の完全な緻密度を簡易に検査する際には、細胞の小部分が互いの上部に重なり、多少の望まれない縦方向のシールド効果を発揮するため、電気穿孔の効率は僅かに低下することになる。
有効表面の経膜電位は、遊離の単一細胞のように、局所点から急に落下することがない。
従来の懸濁液中の電気穿孔では、細胞は、経膜電位及び有効な輸送表面積の両方が不均一であった。
しかし、多様なサイズの細胞は、緻密な単層では、同様の経膜電位を有することになる。
これは、単層の両側付近での全電流が小さく、電位が単層のすぐ外側における電位が実質的に等しいためである。
単層11中の小細胞は、より小さな有効な輸送表面のみを有することになるが、大細胞と比較すると、ほとんど等しい経膜電位を有することになる。
例えば、細胞直径の10%のバラつきは、従来の電気穿孔では、物質の導入において10倍よりも大きなバラつきが生じることになる。
これに対し、緻密な細胞単層の電気穿孔では、物質の導入におけるバラつきは、約10%だけとなる。
細胞を電極15a,15bから物理的に離れることは、電気化学的に有害な物質が細胞に導入されるのを避けるために非常に有効な方法であるため、導電性媒質層12,13の間にインタフェースを使用することは有効である。
導電性媒質やバッファは、溶質イオンで導電することができ、これは自由電子で導電する典型的な電極とはまったく異なる。
出力電力がより低い時において、異なるパルスフォームを生成することはより簡単である。
あるタイプの基本パルスフォームは指数関数的な減衰波であり、通常、帯電したコンデンサをサンプルに対し放電することにより作られる。
指数関数的な減衰波は、インダクタとサンプルをリンクさせることでより緩慢に形成することができ、初期のピーク電流を減衰させることができる。基本パルスフォームの別のタイプは、方形波や矩形波である。
必要であれば、高周波などの他の波形も容易に生成することができる。
シーケンスにおいて、単一又は複数の波形をサンプルに適用することができる。
交流を用いることは、分子導入において細胞の一側の局所表面にのみ有効ではなく、細胞の両側の局所表面に対して有効となる。
特に、複数細胞単層(ペレット)に詰め込まれる細胞の電気穿孔には、交流パルシングスキームは、図4の説明で説明されるように、縦方向のシールド効果を軽減することができる。
パルス発生器はディジタルやアナログパネルにより制御することができる。
さらに、パルス発生器は、再充電可能バッテリ、又はコンデンサなどのエネルギー貯蔵装置を含むことができる。その結果、ユニットを電力線から取り外すことができ、必要であればコードレスにすることができる。
小サイズの細胞は、従来の電気穿孔では、高い電界強度を要求するため、より有利である。
単層方法は、造血細胞系、リンパ球細胞系、血液由来細胞などの懸濁液で通常成長する細胞への適用について便利である。
付着性細胞は、機械的分散、又はトリプシン処理などの一般的な手段により、支持物質から取り除くことができる。
さらに、付着性細胞は、適切な媒質やバッファに懸濁されて、電気穿孔のための単層を形成することができる。
サンプル容器10中で培養される付着性細胞は、電気穿孔を直接行うことができる。
しかしながら、いくつかの理由によりそのような電気穿孔の品質を制御することは、より困難なものとなる。
第一に、付着性細胞の細胞表面領域の変化は、懸濁細胞よりもかなり大きく、細胞の電気的性質のバラつきが大きいことがある。
第二に、付着性細胞が一律に単層11をカバーすることが困難ということがある。細胞はある空き領域は存在せず、ある密集領域では重なって存在することもある。空き領域に近い細胞には、電気的な有害性が増加しやすい。密集領域では、ある細胞が他の細胞の上に重なるため、電気穿孔効率が低下することになる。
第3に、電気穿孔は、細胞の成長過程ではなく、十分に成長した特定の時点においてにも電気穿孔は実行される、ということである。このため、電気穿孔を実行する時間は制限されている。
第4に、細胞の培養に必要な時間はサンプルのバラつきを増加させるため、結果の再現性の精度がより低下するということである。
図6は、少数の細胞の電気穿孔における人工の絶縁性粒子の使用を示す。
絶縁性粒子16(影で示される)は、実際の細胞17(白丸)と任意に混合される。
混合される細胞単層11は、両導電性媒質層12,13のインタフェース上に形成される。
媒質と細胞は絶縁性チャンバ14内に入れられ、電極15a,15bの間に電気パルスが輸送される。
使用される絶縁性粒子16の数が細胞17の数を大きく超える場合には、細胞17の正確な数は重要ではなくなり、同じ数の絶縁性粒子16を異なる数の細胞17を含むサンプルと一緒に使用することで、実験の操作を容易にすることができる。
サンプル容器20は、固定電極25、封止カバーとして機能する可動電極26、円柱形絶縁性チャンバ21、漏液受溝24を有する。
電極25の直径は、絶縁性チャンバ21の底端の溝の直径より少し大きく、絶縁性チャンバ21の底端に発生する張力により、電極25を密に取り付けることができる。
或いは、容器の底端を封止するために、接着剤又は他の適切な方法により、電極25を絶縁性チャンバ21に固定することができる。
カバー22は、メイン絶縁性チャンバ21のチャンバ壁における頂部の溝にタイトに嵌合され、これにより、電極26はメイン絶縁性チャンバ21の内縁をカバーし、サンプルを封止する。細胞単層11を含む媒質層12,13を空気泡がない状態で確実に封止するために、添加される細胞懸濁液の量を密封容器20の許容量より少し多くすることにより、少量の余剰な液体を存在させ、完全な封止を実現させる。電極カバー26を閉鎖するで押し出される余剰な液体は、メイン絶縁性チャンバ21のチャンバ壁の頂部に蝕刻された漏液受溝24に流出させることができる。電気穿孔後、余剰の液体中の細胞は、電気穿孔されないため廃棄してもよい。
図8は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器30を示す図である。図8に示すように、サンプル容器30は絶縁性チャンバ34、下部電極35、整合金属コネクタ37付きのメッシュ型電極36、封止カバー39を有する。
下側媒質層12、上側媒質層13、及び細胞単層11は、自然な重力、又は人工の遠心力により、形成されることができる。
細胞を自然な重力によりインタフェースに沈殿させることは、簡単で、低コストである。
一方、人工の遠心力は重力より強いため、細胞単層、又は複数細胞単層ペレットをより早く、より緻密に形成することができる。
一つ、又は一つ以上のサンプル容器10は、適切なバランスで一つのローターに設置される。容器20、30、又は40などの他の例示的なサンプル容器も、同様に遠心分離法において使用され得る。
遠心分離機50は、第一金属支持体55、第二金属片56、回転軸線58、電気ブラシ59a,59b、及び適切なローター内配線を有する。
図10に示される破線は、各実験で電気穿孔されるサンプルの数、及び配線の代替的な方法の選択を配慮し、実際の配線における柔軟性を反映するものである。
図10に示される複数のサンプル容器は、ローター中の複数のサンプル容器、或いは移動中のサンプル容器を表す。
電気パルス発生器54は、所定のパルスを生成し、パルスをサンプル容器に輸送する。パルス発生器54は、固定ユニット、又は、ローターとともに回転し、回転中にパルスを生成するローター内の回路で構成することができる。
第二金属片56は、電気的中な接触を作るために、遠心力により上部電極15aに押し付けられる。
金属片55、56とサンプル容器10が接触するところの二つの接点は、回転軸線58上の電気ブラシ59a,59bを介して、グループとして又は、単一のものとして、回転軸線58に配線されることができる。
ローター内回路54が使用される際には、金属片55、56はローター内回路54に配線されることができる。その結果、二つの金属片55及び56は、導体として機能し、電気パルスをサンプル容器10に輸送する。
電気穿孔容器中において媒質インタフェースを回転アームにほぼ垂直な配置させる自動調整スイングバケットローター、又は固定角ローター内において、適切な角度は容易に実現できる。
固定角ローターの回転軸線58は垂直、又は水平のいずれかである。回転軸線58が水平な場合には、媒質インタフェースは、回転アームに実質的に垂直である必要がある。
数センチメートルないしは数デシメートルの代表的な回転半径の場合、ほとんどの真核細胞が細胞単層を形成するために、数百rpm(回転/分)ないしは数千rpmの回転速度で十分である。また、他のrpm数も使用され得る。
バクテリアなどの小原核細胞では、数千rpmの回転速度が必要となる。。
遠心分離に必要な時間は数秒ないし数分である。また、他の時間も使用され得る。
細胞が容器中の媒質インタフェースにおいて側方へ移動しないように、回転の加速を緩やかにすることができる。
媒質インタフェースを垂直に配置する固定角ローターの場合では、懸濁液中の細胞が、細胞分布における不均一性の原因になる片側への沈積を消磁させないように、回転を速やかに開始させる必要がある。
遠心分離機50が使用される場合では、遠心分離後又は遠心分離中に、電気パルスは輸送されることができる。
遠心分離後にパルスを輸送するために、ローター内電気配線がない普通の実験遠心分離機は、ローター内で電気穿孔容器を保持するに、適当なアダプターと共に使用されることができる。
ただし、サンプル容器10は、パルシング前に細胞単層10又はペレットが乱れるのを避けるために、遠心分離機50から非常に慎重に取り出される必要がある。
他方、遠心分離中に電気パルスを輸送する場合は、パルシング条件がより信頼できるという利点がある。
別の法として、サンプルのための最終的な電気パルスは、電気ブラシ59a,59bからのあらゆる信号ノイズを避けるために、ローター内回路54にて生成することができる。
回転軸線58の近くのローター内回路54は、強い遠心力を受けないように構成することができる。
ローター内回路54が使用される場合、電気ブラシ59a,59bは、電気エネルギー及び制御命令を受けるのに使用されるが、これらは最終的なパルス輸送ループに存在しない。
コンタクトレスの電力輸送は、磁気エネルギーの転移を用いて実現でき、この方法は電気ブラシ59a,59bからの信号ノイズを避けるために利用できる。
ローター内回路54が使用される場合には、無線の電波信号は、ローター内のパルシングを制御するために使用することができる。
図11Aに示されるように、下部電極65は、絶縁性チャンバ61に封入される。絶縁金属線67は下部電極65に接続される。開口カバー62により被覆される上部電極66は、メイン絶縁性チャンバ61の上を閉じ、両媒質層12、13及び細胞単層11を封止する。カバー62は接続部材63により、主絶縁性チャンバと連結される。
溝64がメイン絶縁性チャンバの中に形成されることができ、あらゆる余剰のサンプルを保持できる。電極66,67の間で電気パルスが輸送される。このような構成は、遠心分離の際にサンプル漏れを防止するのに有効である。
絶縁性チャンバ61は、開放底を有するように変更され、支持構造及び電気コネクタとして機能する拡大された下部電極65に設置される。
上部電極66は、絶縁性チャンバ61に取り付けられ、絶縁性チャンバ61により、電極65と電気的に絶縁される。
容器60のこのような代替形状も、遠心分離中のサンプル漏れを防止するのに有効である。
遠心分離の時間が長大でなければ、これは重要な影響をもたらすことがない。より長い回転アームを用いることや、側方への細胞移動を減少するための媒質インタフェースを用い遠心分離前に休止時間を設けることで、実質的に均一な細胞分布を実現できる。
曲線状電極を有するサンプル容器は作ることができる。
曲線状媒質インタフェースは、全てのポイントにおいて等しい回転半径がある容器中に形成され得る。
自らの軸を中心として回転するフルサークル円柱形媒質インタフェースがある容器は、全てのインタフェースポイントにおいて、理想的に等しい回転半径を提供し、また、側方への細胞移動の問題がなく、あらゆる加速設定を使用することができる。
容器70は、細胞サンプルの電気穿孔のために、内部空間を密封する一つの曲線状絶縁体本体と二つの曲線状電極を有するリング状の形を想定することができる。
両電極75,76の間の円柱形表面に、細胞単層11は配置され得る。
図12Aは、重心軸に垂直な容器70の断面図である。
容器70が自らの重心軸に沿って、遠心分離機で回転する際に、単層11の細胞は、等しく外側への遠心力を受けることができる。
遠心分離の過程において、単層11の細胞は、遠心分離機の加速が終了し、単層が形成された後に、支持表面において安定状態が維持される。
図12Bはリングを切断する断面における容器70の別の図である。絶縁性チャンバ71及び両電極75,76により容器70の本体が形成される。
あるいは、導電性媒質層12は、細胞単層11が直接電極に接触することを防止するために使用できる。
遠心分離前に、細胞は媒質13でまず懸濁されることができる。
図10で説明される遠心分離機50のような適切なローター内配線を有する構造は、遠心分離の際に、電気穿孔を実行するために使用できる。
ローター内配線及び電気ブラシにより、電極75,76はパルス発生器に接続できる。
適切な収納絶縁性チャンバを備える容器70のリングセグメントも、使用することができる。
あるいは、曲線状電極、及び/又は、曲線状媒質表面は、容器10、20、30、40又は60などの容器のために使用され得る。
本発明において、電極の表面、又は、導電性媒質層は平坦であってもよく、平坦ではなくてもよい。
電気細胞融合が電気穿孔の目的である場合、およそ2つの細胞単層を有する二重単層構成は、例示的なサンプル容器10、20、30、40、60又は70などの、電気穿孔のために使用されるサンプル容器と同様のサンプル容器において使用することができる。
望ましくは、各層は一種の細胞を含む。ただし、二種の細胞を混合することも、融合の効率が低が許容され得る。
メッシュ型電極がある容器は、異なる細胞の二つの単層を作るのに便利である。
1番目の細胞懸濁液がメッシュ電極の表面にちょうど至るまで容器に加えられ、細胞は下側媒質インタフェースの表面に集まる。
そして、2番目の細胞懸濁液は、最初の細胞単層の上に均等に配置されるように、メッシュ電極の上に添加される。
2つの単層を順次形成する別方法は、インタフェースを形成できる二つの異なる媒質と、二つの細胞懸濁液を使用し、2番目の細胞懸濁液を一番目の細胞懸濁液が単層を形成した後に加える方法である。
遠心分離の過程において、電気パルスが輸送される。電気細胞融合のでは細胞に導入される対象物質が存在しないため、反応剤を節約することは目的ではない。従って、細胞融合のためのサンプル容器は、異なる細胞の二つの単層を順次に作ることをより簡単にするために、両電極の間により大きい距離を有することができる。
さらに、二種の細胞単層は、遠心分離媒質を取り除く工程を繰り返すこと、及び、より多くの細胞懸濁液を加えることにより、電気細胞融合に三つ、又はそれ以上の細胞層がある細胞層が交互するサンドイッチを形成することができる。
ます細胞が懸濁液に分散される(202)。
付着性細胞については、まず付着したものから離脱させ、懸濁液に分散させる。必要であれば、細胞は洗浄される。
また、細胞濃度は計数法により決定されることができる(204)。
次に、適切な数の細胞が単層、又は複数の単層を形成するために採取される。
次に、細胞懸濁液はサンプル容器に応じて、適切なボリュームに調整される(206)。
導入される対象物質は、サンプル容器に細胞懸濁液を入れる前に、細胞懸濁液に含ませることができる。
次いで、細胞懸濁液はサンプル容器中に入れられる(208)。
細胞単層を重力による自然な沈降により形成する場合には、サンプル容器はある程度の時間水平面に設置する必要がある。
単層を形成するための必要な時間は、経験的に決定され得る。
例えば、単層の生成は顕微鏡により観察することができる。
細胞単層を遠心分離法により形成する場合には、サンプル容器は遠心分離機に設置される。細胞単層の形成後に、細胞は電気パルスにより処理される(212)。
細胞単層の形成に遠心分離機が使用される場合には、電気パルス処理は、遠心分離後又は遠心分離中に実行され得る。
細胞の電気パルス処理後に、細胞はサンプル容器から取り出される(214)。
電気パルス処理が遠心分離中に行われる場合には、細胞の取り出し前に遠心分離機は停止される。
電気細胞融合については、二重の細胞単層を作る工程が追加され、バッファ及び電気パルスは、物質導入の目的に通常使用されるバッファ及び電気パルスと異なるものとしてもよい。
図14Aは、本発明の実施例に対応する例示的な細胞懸濁液の電気穿孔に使用できるサンプル容器80を示す。
図14Aに示すように、容器80は、円柱形絶縁性チャンバ81、固定電極85、封止カバーとしても機能する可動電極86、開口絶縁性カバー82、漏液受溝84を有する。
絶縁性チャンバ81は、底端に電極85を固定する開口溝があり、箱81のチャンバ壁の頂部に、可動電極86を受ける別の開口溝がある。
電極85の直径は、絶縁性チャンバ81の底端にある溝の直径より少し大きいため、絶縁性チャンバ81の底端に発生する多少の張力により、電極85が締め付けられる。
あるいは、容器底端を封止する目的で電極85を絶縁性チャンバ81に固定するために、接着剤又は他の適切な方法で封止してもよい。
カバー82はメイン絶縁性チャンバ81のチャンバ壁における頂部の溝に堅固に嵌合することができ、それにより、電極86は、メイン絶縁性チャンバ81中の内縁をカバーし、サンプルを封止できる。
細胞懸濁液87を空気泡なしに確実に封止するため、完全な密封を確保するための少量の余剰な液体を生じさせるために、添加される細胞懸濁液の量は密封容器の許容量より少し多い。
電極カバー86を閉鎖することにより、押し出された余剰の液体は、メイン絶縁性チャンバ81のチャンバ壁の頂部に蝕刻される漏液受溝84に流出させることができる。電気穿孔後、余剰の液体中の細胞は、電気穿孔されないため廃棄してもよい。
大型細胞については、有効な電気穿孔を実現するために低電界強度が必要とされ、隣接する細胞間の電気的な相互作用により引き起こされる細胞の不均一性は、電気穿孔効率に不利な影響をもたらす。
しかし、より一般的な小サイズの細胞では、有効な電気穿孔について高電界強度を必要とし、隣接する細胞間の電気的な相互作用により引き起こされる細胞の不均一性は、かえって細胞の電気穿孔に非常に有益なものとなる。
十分な細胞がない場合には、細胞単層において説明されたものと同様の人工の絶縁性粒子を使用できる。
細胞懸濁液の電気穿孔のために提供される容器80は、電極85,86の間に一般により長い距離が確保されるため、電極のすぐ近くの細胞はより少なくなり、細胞への電気化学的な有害物を減少させる。電極85,86の間の距離は3mmから100mmまでが好ましく、5mmから50mmまでが更に好ましい。
電極近くの細胞は重大な電気化学的な有害作用を受けるため、絶縁性チャンバ81上に、害された細胞が取り除かれるべきであるといった指標をいくつか表記してもよい。
また、容器80は、容器に細胞懸濁液のサンプルを連続して流入させて連続処理を可能にするサンプル注入システムに接続することもできる。
パルス発生器がより高い電圧を輸送することを要求する外観上の不利は、それほど問題とはならない。
同じ0.2mlの細胞懸濁液が2cmの電極間隔がある長い容器に置かれる場合(キュベット隙間距離の5倍)、必要な電圧は1000ボルトとなるが、コンデンサからの電気エネルギーが以下の方程式に従うため、40μF(1000μFの1/25)のコンデンサだけで足りる。
E=0.5U2C
Eは電気エネルギーであり、Uは電圧であり、Cは容量である。
従って、高圧パルス発生器は、同様の量のエネルギーを蓄積するために、非常に小さなコンデンサで対応できるため、実際に容易に製造できる。
バクテリアなどの非常に小さい細胞は、水などの低導電性液体において、20,000V/cmなどの高電界強度で電気穿孔される必要がある。
従来では、1mm、又は2mmの短い電極間隔があるキュベットの中でバクテリアの電気穿孔は実行されるため、通常、3,000V未満の電圧が必要とされる。
容器80の中において、バクテリアなどの非常に小さい細胞を電気穿孔するためには、超高電圧を必要とする。
本発明で使用される超高電圧は、5,000Vより高く、非常に小さい細胞の電気穿孔に通常使用される10,000Vから30,000Vまでの範囲にある電圧のことをいう。
数万ボルトを輸送可能なパルス発生器は、超高電圧の下ではエネルギーを蓄積するのに極めて低い容量が必要とされるため、製造が困難ではない。
パルス発生器は再充電可能バッテリ、又はコンデンサなどのエネルギー貯蔵装置を備えることができ、またコードレスとなって移動がより簡単になる。
従来のキュベットでは、不均一に分布されるイオン性溶質は、小さな電流の漏れ領域を形成し、二つの電極の付近で短絡を生じさせる。
より長い電極間隔を有する密封容器内では、小さな電流の漏れ領域が形成される場合でも、1つの電極と他の電極で短絡が発生しないように電極が離れている。
電極の近くで停滞する小空気泡がある場合でも、1つの電極から他の電極まで到達しないため、電気アークが引き起こされることがない。
従って、より長い密封容器80は、電気アークの生成を抑えるのに有利である。
1mmのキュベットの場合では50μmの距離の誤差が5%となるが、2cmの長容器では0.25%だけとなる。
図14Bに示されるように、下側媒質層88aは電極85上に形成される。細胞懸濁液87は、下側媒質層88aの上に入れられる。細胞懸濁液87中の細胞はペレット89の中に導入されるる。
下側媒質層88aは電極85から細胞を物理的に離れさせる。
特に容器が細胞懸濁液の電気穿孔を意図するものである場合に、他の媒質層88bも上部電極上で使用されるため、細胞懸濁液の両端は電極からの直接照射から保護される。
細胞懸濁液87は直接にこの容器中で電気穿孔されることができ、あるいは、細胞濃度を高めるために、懸濁液中の細胞はペレット89中に導入されることができる。
細胞懸濁液の電気穿孔のための容器80は、電極85,86の間により長い距離を有することになるが、細胞ペレット89の電気穿孔に用いられる容器80は、電極85,86の間の距離をより短くすることができる。
自然な重力、又は遠心分離法により、ペレット89を作ることができる。
遠心分離機が使用される場合、遠心分離後又は遠心分離中に、細胞ペレット89のパルシングを行うことができ、これは、遠心分離機50の単層及び複数単層電気穿孔に説明された方法と同様である。
ペレット89は高効率及び細胞に低有害で電気穿孔することができ、懸濁液中の同じ細胞の電気穿孔に必要な電圧よりも低い。
パルス発生器は、エネルギー貯蔵装置を備えることができ、コードレスの移動に便利である。
パルス発生器、又は単層ベースの電気穿孔において説明されたパルスフォームの変化は、懸濁液やペレット中の細胞の電気穿孔にも適用され得る。
また、人工の絶縁性粒子は、細胞ペレットを作るために実際の細胞と共に使用することができる。
本発明による装置と方法は、他の方法と装置より利点を有する。
例えば、本開示による装置と方法では、細管式電気穿孔と比較して一定の利点がある。
図15に示されるように、20μmの内径がある細管の中で電気穿孔が実施される。
二つの細胞、細胞Aと細胞Bが、細管の中に配置される。
細胞Aは18μmの直径を有し、細胞Bは16μmの直径を有する。
図15に示されるように、細胞Aと細管壁の間の最小距離は1μmであり、細胞Bと細管壁の間の最小距離は2μmである。
細管壁は絶縁体であるため、電流は細胞と細管壁の隙間隙間に制限される。
その全電流は細胞Aと細胞Bの周りの隙間隙間を流れる。
しかし、Bについては、ほんのわずか小さいものの、Bを電気穿孔することは非常に困難である。
交流パルシングスキームによるとしても、細胞Bは細胞Aの経膜電位の約半分となる。その結果、細胞Bは依然として有効に電気穿孔できない。
仮に、Aの直径が19μmになり、且その隙間が0.5μmになると、Aの経膜電位はBの約400%になり、細管における電気穿孔効率において多大な細胞の不均一性をもたらすということが証明される。
小細管の場合には細胞の高い部分が細管壁のすぐ近くに位置付けられるため、内径がより小さい場合に細管はうまく機能する。
緻密な単層ベースの電気穿孔方法は、電気穿孔における細胞の不均一を減少させる。
これに対し、細管式の電気穿孔の方法は、電気穿孔における細胞の不均一性を強め、限界がある。
本発明で説明されるように、懸濁液やペレット中の濃縮細胞自身の横方向の増強効果を主として利用することは、電気穿孔効率及びコスト性の両方に有利である。
容器80の他の構成などのサンプル容器は、直径又は断面領域を制限しない点において、細管と異なる。
所望の直径が使用して、大容量の細胞サンプルを容器80にて処理することができる。
Claims (24)
- 生物細胞の電気穿孔装置であり、
バッファにある細胞サンプルを収容する絶縁性チャンバと、第一電極と、第二電極とを有するサンプル容器であって、
前記絶縁性チャンバと前記電極は前記細胞サンプルを収容するための密封箱を形成し、
前記電極は前記細胞サンプルに電気的接続を提供し、
前記電極の間において、前記細胞サンプルが少なくとも一つの細胞単層を形成することを可能とする、サンプル容器と、
前記サンプル容器中の細胞サンプルの電気穿孔に所定のパルスを生成するパルス発生器と、
を有する、生物細胞の電気穿孔装置。 - 前記細胞単層の緻密度は少なくとも50%である、ことを特徴とする請求項1に記載の電気穿孔装置。
- 記絶縁性チャンバは、さらに前記電極の一つと接触する第一導電性媒質層を含むように構成され、
前記細胞サンプルは、前記第一導電性媒質層の表面に少なくとも一つの前記細胞単層を形成する、
ことを特徴とする請求項1又は請求項2のいずれかに記載の電気穿孔装置。 - 前記第一導電性媒質層は、前記サンプル容器の中に形成される、
ことを特徴とする請求項3に記載の電気穿孔装置。 - 少なくとも一つの前記電極は可動であり、封止カバーとして機能する、
ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 余剰の液体を受け入れるために、
前記絶縁性チャンバは、前記絶縁性チャンバのチャンバ壁に溝を有する、
ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 遠心分離法による前記細胞単層の形成を促進可能にするための遠心分離機をさらに有する、
ことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 前記遠心分離機は、電気穿孔において、所定の電気パルスを前記サンプル容器に輸送するための前記パルス発生器と一体化される、
ことを特徴とする請求項7に記載の電気穿孔装置。 - 細胞数を測定し、電気穿孔のための細胞サンプルに所定数の細胞を含ませるための計数装置をさらに有する、
ことを特徴とする請求項1乃至請求項8のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 生物細胞の電気穿孔装置であって、
電気穿孔に生物細胞のサンプルを収容するためのサンプル容器であって、前記生物細胞を収容するために、容器の本体を形成する絶縁性チャンバを有するサンプル容器と、
前記絶縁性チャンバは複数の側面と、第一電極と、第二電極を有し、
前記第一電極と前記第二電極は、電気パルス発生器から電気パルスを受け、細胞を電気穿孔させるものであり、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極により、前記サンプル容器中の生物細胞のサンプルを封止可能に構成する、電気穿孔装置。 - 前記絶縁性チャンバは、前記第一、第二電極のうちの一つと接触する第一導電性媒質層を有する、
ことを特徴とする請求項10に記載の電気穿孔装置。 - 前記第一、第二電極の少なくとも一つが可動であり、封止の機能を有する、
ことを特徴とする請求項10又は請求項11に記載の電気穿孔装置。 - 前記絶縁性チャンバの一つの側面が可動であり、封止の機能を有する、
ことを特徴とする請求項10又は請求項11に記載の電気穿孔装置。 - 余剰の液体を受け入れるために、前記絶縁性チャンバは、絶縁性チャンバのチャンバ壁に溝を有する、
ことを特徴とする請求項10乃至請求項13のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 前記第一、第二電極を介して、前記サンプル容器にある生物細胞を電気穿孔するための電気パルス発生器をさらに有する、
ことを特徴とする請求項10乃至請求項14のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - 前記電気パルス発生器は、超高電圧パルスを生成するように構成される、
ことを特徴とする請求項15に記載の電気穿孔装置。 - 電気エネルギーを蓄積し、電気穿孔のために、コードレス機能を容易にするエネルギー貯蔵装置をさらに含む、
ことを特徴とする請求項15又は請求項16に記載の電気穿孔装置。 - 電気穿孔されるの細胞と共に使用される人工の絶縁性粒子を有する、
ことを特徴とする請求項10乃至請求項17のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。 - サンプル容器の絶縁性チャンバに少なくとも一つの細胞単層を形成するために細胞を配置するステップであって、
前記サンプル容器は、電気穿孔に電気的接続を提供する第一電極と、第二電極を有するステップと、
所定の電気パルスで前記細胞単層の細胞を処理するステップであって、
前記所定の電気パルスはパルス発生器により生成されるステップと、
を有する生物細胞の電気穿孔方法。 - 第一導電性媒質層により表面を形成するステップであって、
第一導電性媒質層に前記細胞単層を形成するステップ、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項20に記載の生物細胞の電気穿孔方法。 - 前記細胞の濃度を測定し、前記細胞単層を形成するために使用される所定数の細胞を提供するステップ、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項20又は請求項21に記載の生物細胞の電気穿孔方法。 - 前記細胞は自然な重力により、前記細胞単層に配置される、
ことを特徴とする請求項19乃至請求項21のいずれか一項に記載の生物細胞の電気穿孔方法。 - 前記細胞は遠心分離法により、前記細胞単層に配置される、
ことを特徴とする請求項19乃至請求項21のいずれか一項に記載の生物細胞の電気穿孔方法。 - 前記細胞が遠心分離中に所定の電気パルスで処理される、
ことを特徴とする請求項23に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2013/071696 WO2014127510A1 (en) | 2013-02-20 | 2013-02-20 | Methods and devices for electroporation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016506751A true JP2016506751A (ja) | 2016-03-07 |
JP6181209B2 JP6181209B2 (ja) | 2017-08-16 |
Family
ID=51390470
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015557314A Active JP6181209B2 (ja) | 2013-02-20 | 2013-02-20 | 電気穿孔方法、及び、電気穿孔装置 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2958985B1 (ja) |
JP (1) | JP6181209B2 (ja) |
KR (2) | KR102036623B1 (ja) |
CN (2) | CN108085252B (ja) |
CA (1) | CA2901759C (ja) |
WO (1) | WO2014127510A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107058095B (zh) * | 2017-02-09 | 2020-07-28 | 清华大学 | 手持式电穿孔装置 |
FR3069534B1 (fr) * | 2017-07-28 | 2020-10-16 | Commissariat Energie Atomique | Preparation de nouveaux capteurs et filtres d'aldehydes et/ ou de cetones |
WO2019108957A1 (en) * | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Alxerion Biotech Corp. | Device and system for loaded cellular vesicles and uses thereof |
US20220403365A1 (en) | 2019-12-06 | 2022-12-22 | BioModi Biotech (Suzhou) Co., Ltd. | Composite material and preparation method therefor and application thereof |
CN117980476A (zh) * | 2021-06-04 | 2024-05-03 | 卓普杰尼股份有限公司 | 用于在基于微滴的系统内施加电压的系统和方法 |
CN114214191B (zh) * | 2021-11-01 | 2024-01-05 | 上海盟德生物科技有限公司 | 一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050170510A1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-08-04 | Yong Huang | Device and method for controlled electroporation and molecular delivery into cells and tissue |
US20050282265A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-12-22 | Laura Vozza-Brown | Electroporation apparatus and methods |
JP2006197872A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Tohoku Univ | 電気穿孔法および電気穿孔用キュベット |
JP2007089426A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Transcutaneous Technologies Inc | 遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法 |
US20090053813A1 (en) * | 2007-08-24 | 2009-02-26 | David Mark Evans | Multiplexed electroporation apparatus |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR890003947B1 (ko) * | 1985-12-11 | 1989-10-13 | 가부시기가이샤 시마즈세이사구쇼 | 세포융합장치 |
US6001617A (en) * | 1989-06-07 | 1999-12-14 | Queen's University At Kingston | Electroporation device and method of use |
US5134070A (en) * | 1990-06-04 | 1992-07-28 | Casnig Dael R | Method and device for cell cultivation on electrodes |
US5983131A (en) * | 1995-08-11 | 1999-11-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Apparatus and method for electroporation of tissue |
KR20030039018A (ko) * | 2001-11-09 | 2003-05-17 | 노기문 | 밀폐용기 |
ATE500894T1 (de) * | 2002-01-17 | 2011-03-15 | Univ College Cork Nat Univ Ie | Testvorrichtung und verfahren zum chemischen oder biologischen screening |
US7521224B2 (en) * | 2003-09-30 | 2009-04-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Microelectronic cell electroporation array |
JP4534043B2 (ja) * | 2003-10-08 | 2010-09-01 | 国立大学法人京都大学 | 核酸導入方法 |
WO2006112870A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-10-26 | Excellin Life Sciences, Inc. | Device and method for controlled electroporation and molecular delivery in cells and tissue |
US7687267B2 (en) * | 2006-09-30 | 2010-03-30 | Rational Biotechnology Inc. | High-throughput cell transfection device and methods of using thereof |
WO2008102728A1 (ja) * | 2007-02-19 | 2008-08-28 | Kyoto University | 核酸導入用導電性基板および核酸導入方法 |
WO2008104086A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Queen's University At Kingston | Planar electroporation apparatus and method |
CN102124102B (zh) * | 2008-07-18 | 2013-12-18 | 麦克赛特股份有限公司 | 优化电穿孔的方法 |
CN101693874B (zh) * | 2009-09-30 | 2012-04-18 | 重庆大学 | 一种基于微小室阵列结构的细胞电融合芯片装置 |
CN101928666B (zh) * | 2010-07-30 | 2013-04-03 | 北京大学 | 一种流式电穿孔装置及系统 |
US9382510B2 (en) * | 2011-08-25 | 2016-07-05 | Jian Chen | Methods and devices for electroporation |
-
2013
- 2013-02-20 WO PCT/CN2013/071696 patent/WO2014127510A1/en active Application Filing
- 2013-02-20 EP EP13875553.3A patent/EP2958985B1/en active Active
- 2013-02-20 KR KR1020197008852A patent/KR102036623B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-20 KR KR1020157025363A patent/KR101965282B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-20 JP JP2015557314A patent/JP6181209B2/ja active Active
- 2013-02-20 CN CN201711466033.5A patent/CN108085252B/zh active Active
- 2013-02-20 CA CA2901759A patent/CA2901759C/en active Active
- 2013-02-20 CN CN201380073426.3A patent/CN105143436B/zh active Active
- 2013-02-20 EP EP21161374.0A patent/EP3882333A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050170510A1 (en) * | 2003-12-08 | 2005-08-04 | Yong Huang | Device and method for controlled electroporation and molecular delivery into cells and tissue |
US20050282265A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-12-22 | Laura Vozza-Brown | Electroporation apparatus and methods |
JP2006197872A (ja) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Tohoku Univ | 電気穿孔法および電気穿孔用キュベット |
JP2007089426A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Transcutaneous Technologies Inc | 遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法 |
US20090053813A1 (en) * | 2007-08-24 | 2009-02-26 | David Mark Evans | Multiplexed electroporation apparatus |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2958985A1 (en) | 2015-12-30 |
CN105143436B (zh) | 2018-01-23 |
JP6181209B2 (ja) | 2017-08-16 |
WO2014127510A1 (en) | 2014-08-28 |
CN108085252B (zh) | 2021-10-19 |
CN105143436A (zh) | 2015-12-09 |
KR20150118189A (ko) | 2015-10-21 |
EP2958985A4 (en) | 2016-08-17 |
KR101965282B1 (ko) | 2019-04-03 |
KR102036623B1 (ko) | 2019-11-26 |
KR20190035962A (ko) | 2019-04-03 |
CA2901759C (en) | 2021-01-12 |
CA2901759A1 (en) | 2014-08-28 |
CN108085252A (zh) | 2018-05-29 |
EP2958985B1 (en) | 2021-03-31 |
EP3882333A1 (en) | 2021-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11959061B2 (en) | Methods and devices for electroporation | |
JP6181209B2 (ja) | 電気穿孔方法、及び、電気穿孔装置 | |
Pavlin et al. | Effect of cell electroporation on the conductivity of a cell suspension | |
US20210324367A1 (en) | Method and device for uniformly treating adherent cells | |
US20160298074A1 (en) | Flow electroporation device | |
WO2006112870A1 (en) | Device and method for controlled electroporation and molecular delivery in cells and tissue | |
AU2003227006B8 (en) | Container with at least one electrode | |
CN211079184U (zh) | 一种结合了超声和电流脉冲的转染装置 | |
CN217173753U (zh) | 一种利用六孔板环式转染装置 | |
WO2013167185A1 (en) | Electrode assembly for generating electric field pulses to perform electroporation to a biological sample | |
Sowers | Permeability alteration by transmembrane electric fields: electroporation | |
CN210176871U (zh) | 电穿孔芯片及电穿孔系统 | |
CN110734855A (zh) | 一种电击管 | |
CN110734857A (zh) | 一种电击管 | |
CN110734856A (zh) | 一种电击管 | |
CN110885752A (zh) | 一种间歇式流式电转染装置 | |
Lambie | Making Single-cell Electroporation with Microelectrodes Predictable and Reproducible. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151029 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160216 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160812 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160823 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161122 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20161227 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170426 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20170519 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170622 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170719 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6181209 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |