CN108085252B

CN108085252B - 电穿孔方法与设备

Info

Publication number: CN108085252B
Application number: CN201711466033.5A
Authority: CN
Inventors: 陈剑
Original assignee: Individual
Current assignee: Taizhou Sairui TREK Biological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2033-02-20
Also published as: KR101965282B1; KR20190035962A; EP2958985A4; CA2901759A1; WO2014127510A1; KR102036623B1; CN108085252A; CN105143436A; CN105143436B; CA2901759C; EP2958985B1; KR20150118189A; JP2016506751A; EP3882333A1; EP2958985A1; JP6181209B2

Abstract

本发明公开了电穿孔方法与设备。根据一种实施方式，生物细胞电穿孔装置包括：样品容器，具有用于容纳细胞的绝缘室体，所述样品容器具有第一电极和第二电极以提供电连接以实现电穿孔；以及第一导电介质层，含有具有溶质离子的溶液，所述第一导电介质层一端与所述第一电极接触，另一端形成界面，其中，所述第一导电介质层隔开细胞与所述第一电极的接触，所述第一导电介质层通过所述溶质离子将电脉冲传导至细胞样品。

Description

电穿孔方法与设备

本申请是申请号为201380073426.3，申请日为2013年2月20日，发明名称为“电穿孔方法与设备”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明主要是与细胞电刺激相关的方法与设备，特别是细胞电穿孔的方法与设备。

背景技术

电穿孔是广泛使用的以电刺激来暂时性产生细胞膜穿孔的让细胞膜具有通透性的方法。电穿孔的应用包括把DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、siRNA(小干涉RNA)、多肽、蛋白质、抗体、药物或者其他物质传送到多种细胞，比如哺乳动物细胞、植物细胞、酵母、其他真核细胞、细菌、其他微生物和人类细胞。电刺激也可以用于细胞融合来获得杂种瘤细胞或者其他融合细胞。细胞电融合可以看做是一种特殊的细胞电穿孔。

一般在电穿孔过程中，细胞悬浮在一种有利于细胞存活的缓冲液或者介质中。细菌的电穿孔一般使用低电导率的液体，比如水，来降低瞬间大电流产生的热量。细胞悬浮液接着加进一个具有两个平电极的矩形电极杯中来放电。例如位于加州赫苦斯的伯乐(Bio-Rad)公司生产了Gene Pulser系列产品来进行电极杯中的细胞电穿孔。传统上细胞电穿孔需要很高的电场强度。

电穿孔过程通常对细胞具有毒性。首先，当电场强度太高的时候细胞膜可能会被不可逆地破坏。其次，当电场作用产生的细胞膜穿孔可以允许目标物质进入细胞的时候，这些穿孔可能也会允许细胞内部物质外流或者外部其他物质的不受控内流导致对细胞活性的负面影响。第三，电流产生的热量可能破坏细胞。最后，电极附近电化学反应产生的毒性物质比如自由基、气体和金属离子可能会破坏细胞。

细胞性状的不同，也就是细胞差异性是成功取得高效率、低细胞毒性的电穿孔结果的最大障碍。细胞大小是一个已知的细胞差异性因素。大细胞的电穿孔相对比较容易。在一个具有不同大小细胞的混合液中，当较大细胞在某个电压下得到有效电穿孔时，这个电压往往不足以将较小细胞有效电穿孔。在提高电场强度使较小细胞有效电穿孔时，较大细胞通常被过高电压不可逆地损伤以致不能存活。其他因素比如细胞膜成分的区别或者细胞成熟状态的区别也可能增加细胞差异性。

虽然以前有改善电穿孔效率的多种努力，细胞差异性这个关键问题一直没有得到解决。电穿孔的效率、细胞存活率与经济性有待提高。本文所公开的设备和方法旨在解决一个或者多个前述的问题。

发明内容

本发明公开了一种生物细胞电穿孔装置。所述装置包括：样品容器，具有用于容纳细胞的绝缘室体，所述样品容器具有第一电极和第二电极以提供电连接以实现电穿孔；以及第一导电介质层，含有具有溶质离子的溶液，所述第一导电介质层一端与所述第一电极接触，另一端形成界面，其中，所述第一导电介质层隔开细胞与所述第一电极的接触，所述第一导电介质层通过所述溶质离子将电脉冲传导至细胞样品。

本发明还公开了一种生物细胞电穿孔方法。所述方法包括：

提供用于电穿孔的样品容器，所述样品容器具有：用于容纳细胞的绝缘室体，提供电连接以实现电穿孔的第一电极和第二电极，以及含有具有溶质离子的溶液的第一导电介质层，所述第一导电介质层一端与所述第一电极接触，另一端形成界面；

利用所述第一导电介质层隔开细胞与所述第一电极的接触；

利用预设电脉冲对所述细胞单层中的细胞进行处理，所述电脉冲通过第一导电介质层中的所述溶质离子传导至细胞样品。

本发明公开的其他实施方式可以通过说明书、权利要求书与附图使本领域的技术人员了解。

附图说明

图1A示出了与所披露实施例相一致的细胞电穿孔示例性设备；

图1B示出了与所披露实施例相一致的在样品容器中形成的示例性细胞单层；

图1C示出了与所披露实施例相一致的在样品容器中形成的示例性细胞单层；

图2A示出了球形绝缘细胞的阻挡和分流作用对电流的影响；

图2B示出了细胞电穿孔的有效表面；

图3示出了细胞体积大小对于细胞电穿孔的有效表面的影响；

图4示出了在所指示电流方向下的三种代表性细胞相邻位置；

图5示出了流过细胞单层的电流的分布；

图6示出了使用类似细胞的人造绝缘颗粒增加细胞总数量；

图7示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图8示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图9A示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图9B示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图10示出了与所披露实施例相一致的利用离心技术制造出一个紧密的细胞单层或多个细胞单层用于电穿孔或者细胞电融合；

图11A示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图11B示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图12A示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图12B示出了与所披露实施例相一致的样品容器；

图13示出了与所披露实施例相一致的电穿孔示例性流程；

图14A示出了与所披露实施例相一致的示例性设备；

图14B示出了与所披露实施例相一致的下层介质在电穿孔中的应用；

图15示出了示例的毛细管辅助进行的电穿孔。

具体实施方式

现参照附图将本发明的示例性实施例给出详细的说明。各图中将尽可能使用相同附图标记来表示相同或相似的组成部分。

图1A示出了与所披露实施例相一致的示例性电穿孔装置100。所述装置100包括一个样品容器10。样品容器10包括绝缘室体14、第一电极15a和第二电极15b。样品容器10内，在下层介质12的表面上和上层介质13的下面形成一个界面。一个跨越电流场的细胞单层11可以形成在所述界面上。在本发明中使用的细胞单层是指单个、紧密填充的细胞层。因此一个细胞单层有时也称为一个紧密细胞单层或者一个紧密单层。装置100还包括一个脉冲发生器18。样品容器10可以放入脉冲发生器18中，电脉冲从第一电极15a和第二电极15b释放。图1B示出了细胞单层11在绝缘室体14内的截面图。如图1B所示，细胞单层11占据了绝缘室体14的横截面。

装置100可以用细胞电穿孔模型分析中的一些概念来实现。图2A示出了半径为R的球形细胞在原本均一的电流或者电场中。对于一个典型的用来传送DNA、RNA、蛋白质到细胞的电穿孔，电击在介质或者在盐水缓冲液中进行。与细胞外溶液和细胞内部细胞浆相比，以磷脂双分子层为基础的细胞膜有非常低的电导性，因此大部分电流绕过细胞内部。因此细胞类似于一个绝缘体。

细胞膜的绝缘功能可以保护细胞内部以免在电穿孔时暴露在短时间强电场下。如图2A所示，球形绝缘体细胞对电流的阻挡和分流能使原本均一的电场变成绕细胞鼓胀的电场。

细胞膜上某个位置的点可以通过其半径与总电流方向之间的夹角θ来指定。导电介质中带负电荷的分子例如DNA、RNA和蛋白质运动方向与电流方向相反。

对于一个置于原本均一电流场的半径为R的细胞，在细胞膜上半径夹角为θ的指定位置上的跨膜电势能够大致通过以下方程建模计算：

V_θ＝1.5·E₀·R·cosθ (I)

方程中E₀代表原本均一电场中的电场强度。在总电流方向指定的两个顶点上θ为0°或者180°，cosθ等于1或者-1，跨膜电势值最高。在电流方向下游的顶点(θ＝0°)而不是电流方向上游位置的顶点(θ＝180°)，带负电荷的分子例如DNA、RNA和蛋白质在最大电势下穿过细胞膜。相反，在θ等于90°的细胞膜上该点的跨膜电势为0，尽管在细胞膜这些点外的电流最强。

当θ为0°跨膜电势最大，当θ为90°时跨膜电势减少至0。细胞膜某点上跨膜电势越大可以产生更大的分子传输动力。为了传送某个物质，需要一个最小的跨膜电势V_min。θ在0°到90°范围内有一个最大值θ_max，此处跨膜电势为V_min。同时，细胞上θ值更小的点上的跨膜电势不能超过可能对细胞造成不可逆损害的跨膜电势值。θ_max确定了最大有效电转表面。

图2B示出了在球形细胞上的有效电转表面(以阴影表示)。本发明中的有效电转表面或者细胞电转的有效面是指具有足够的跨膜电势可以允许外源性物质例如DNA、RNA或者蛋白质进入细胞内部的部分细胞表面。利用细胞电穿孔将大分子例如DNA、RNA或者蛋白质引进细胞内，细胞只有在特定跨膜电势下才能存活。在图2B中，V_max代表了最大可承受跨膜电势值，大于该值时细胞会受到不可逆的损害。V_min代表了可以进行有效电穿孔的最小可渗透跨膜电势值，小于该值外源物质将无法进入细胞内。V_max和V_min的值是由细胞膜的特性决定的。不管传送目标物质的种类，V_max值都一样，而V_min与传送目标物质的分子特性例如大小与带电量有关。传送较大的分子时的V_min可能较大。V_max和V_min之间的窗口是电穿孔中跨膜电势的有效范围，此范围可能比较小，尤其是在传送较大分子时。

如图2B所示，只有在细胞顶点位置可以达到跨膜电势最高值V_max。阴影所示的有效电转表面的外边界的跨膜电势值为V_min，其半径夹角为θ_max。对于带负电荷的分子例如DNA、RNA和蛋白质，他们的有效电转表面位于电流方向下游。

在顶点上，θ＝0°因而cosθ＝1，

推导出V_max＝1.5·E₀·R

在θ_max处，跨膜电势减少至V_min：

V_min＝1.5·E₀·R·cosθ_max＝V_max·cosθ_max

因此θ_max的值可以通过以下公式确定：

cosθ_max＝V_min/V_max

通过这个模型分析，细胞顶点的分子传输速度最高。某点传输速度随着θ值的增加而减小，到θ_max处减少至0。

当把不同半径的细胞放置于均一电场中，每个细胞有各自不同的跨膜电势分布图。V_min和V_max的绝对值受一些特定因素的变化的影响。例如，使用不同的电脉冲波形例如指数衰减波或者方波，V_min和V_max的值可能会不同。尽管如此，V_min/V_max的比值可能对这些类型的变化比较不敏感。

图3示出了细胞大小对细胞电穿孔的有效表面的影响。细胞膜本质上是分布着膜蛋白且包括一些通道的磷脂双分子层。同种类型的细胞具有类似的细胞膜组成，尽管细胞大小在某种程度上不同。因此，对于同一细胞的不同位置或者相同类型但是大小不同的细胞，可以认为其细胞膜电学特性例如V_min和V_max是相同的。甚至对于一些不同类型的细胞，很多哺乳动物细胞可能具有相似的细胞膜电学特性，包括V_min和V_max，因为细胞膜本质上是分布着不同蛋白质的磷脂双分子层。

如图3所示，对三种独立的游离细胞进行了分析，包括左边较大的半径为“R”的细胞、中间半径为“r”的中等大小的细胞和右边较小的细胞。三个细胞中心排成一条直线以便用圆形表示细胞实体或者跨膜电势分布图。通过调整电场强度使左边大细胞在顶点上达到V_max，在顶点的V_max和外边界V_min之间用阴影表示电穿孔有效表面。当大细胞获得最优电穿孔时：

V_max＝1.5·E₀·R

推导出

E₀＝V_max/(1.5·R)

中等大小的细胞(半径r<R)在顶点上的跨膜电势较低。在顶点上的跨膜电势V_top可以推导得出

V_top＝1.5·E₀·r＝V_max·r/R

中等大小细胞的跨膜电势大于V_min的有效表面可以通过其外沿角度θ_r来确定，满足的公式是

V_min＝1.5·E₀·r·cosθ_r＝V_top·cosθ_r＝(V_max·r/R)·cosθ

推导出

cosθ_r＝(V_min/V_max)·(R/r)

中等大小的细胞的有效电转表面积比大细胞小，在顶点的V_top和外边界V_min之间用阴影表示。当r/R＝V_min/V_max时，cosθ_r为1，有效表面减少至0。因此细胞获得有效电穿孔的最小半径是

r_min＝(V_min/V_max)·R

右边半径小于r_min的小细胞上的任意一点都不会达到V_min，不存在有效电转表面。

因此细胞体积大小是电穿孔的重要影响因素。较大的细胞不仅在顶点上有更高的跨膜电势并且有更大的有效电转表面。当使用更高的电场使得较小细胞的跨膜电势达到V_max时，较大细胞可能无法存活。细胞大小不同这个难以避免的因素可以导致电穿孔中一部分细胞差异性。比如，细胞群体中95％的细胞其半径变化为大约20％并呈正态高斯分布，V_min/V_max(也就是r_min/R)约等于90％，只有半径差异为10％的细胞可以进行有效电穿孔。根据高斯分布，当群体内的中等大小细胞被电穿孔时，此时可以达到理论上的最高效率大约为67.3％。在传输更大的分子，其V_min/V_max(例如,r_min/R)大约为95％时，理论上最高电穿孔效率为37.6％。

细胞体积大小的问题也会延伸至不同种类的细胞。因为许多种类的哺乳动物细胞拥有近似的V_min和V_max，体积较小的细胞需要更高的电流场使其达到V_min，与此同时伴随着更高电流带来的毒性例如高温、自由基、气体和金属离子可能在有效电穿孔前对细胞产生不可逆的破坏。细胞体积大小不能被轻易改变，所以一个可以适用于不同体积大小细胞的电穿孔技术会很有意义，但是目前还没有这样的技术。

以上对独立的理想细胞进行的跨膜电势分析对于理解细胞电穿孔打下了基础。在电穿孔时，经常希望能够使用大量的数量级为10⁶至10⁷的细胞数量。这些细胞又被置于一个体积小的容器中，主要是因为两点：i)可以使需要传输的目标物质达到高浓度，ii)更小的样品体积需要较少的能量，因此脉冲发生器的制造更加容易。

在一个典型的电穿孔中，约10⁷的细胞悬浮在0.2ml介质中，每个细胞平均约占据20,000μm³的介质体积。每个细胞约占据边长为27μm的立方体的空间，尺度比一般哺乳动物细胞大得不多。所以一般在电穿孔时，细胞之间的距离与大多数哺乳动物细胞的直径比较相似，也就是细胞之间的距离可能很近。

方程(I)只有在一个单独的游离细胞置于原本均一的电场中是有效的。当少量细胞被置于原本均一的电场中并且细胞之间的距离远大于细胞直径时，方程(I)大致也可以应用。当细胞被拥挤在一起进行电穿孔时，每个细胞周围的电场被细胞自身和周围细胞所改变。虽然细胞膜内在特性V_min和V_max仍然一样，方程(I)不再能用于计算指定位置上的跨膜电势。所以，电场分布图变得复杂和难以预测。细胞随机位置不同是构成细胞电穿孔效率差异性的另一层原因，即使细胞体积大小完全相同也是这样。

因此，为了对电场有更好的了解以帮助设计更优化的电穿孔和电融合方法，这里提出了对复杂电场的一种分析。

图4示出了相同大小细胞的三种代表性排列方式。第一种类型是不受周围细胞影响的游离细胞(F)。第二种和第三种排列方式代表了两种相邻细胞排列的特殊方式。第一种特殊排列方式中，两个或多个细胞沿着总电流方向紧密地纵向排列。这种排列方式用S1,S2和S3三个细胞来表示。第二种特殊排列方式中，细胞横向紧密排列在与总电流方向基本垂直的横截平面上。这种排列方式用E1,E2和E3三个细胞来表示。虽然很难推出这些细胞上的跨膜电势的准确方程式，相关的定性分析足以帮助提出改进电穿孔的方法。

如图4所示，S1,S2和S3三个细胞紧密排成一条直线，这三个细胞对电流的阻挡和分流作用并没有比游离细胞F明显加强。因此，只有S1和S3细胞顶部表面的跨膜电势与游离细胞F的相近。不仅如此，只有在电流方向下游的S1细胞顶部表面(图4中阴影部分)可以对带有负电荷分子进行有效电穿孔。如果把电流方向反过来，S3细胞也可以像S1细胞一样对带有负电荷分子进行有效电穿孔。因为S1和S3细胞的屏蔽效应，S2细胞的跨膜电势较低。排列在前面的前导细胞对排列在后的细胞的电穿孔屏蔽作用在这里定义为纵向屏蔽效应。纵向屏蔽效应在细胞间距离增加或者当细胞排列偏离严格的纵向方向时变得不那么明显。细胞的纵向排列由于产生很多被屏蔽的细胞从而降低电穿孔效率，因此构成了电穿孔效率不理想的另一层原因。

相反，E1、E2和E3细胞在一起产生对电流更大的阻挡和限制作用。因此，E1、E2和E3细胞的跨膜电势比细胞F更高，正如它们形成一个特大型细胞。这些横向排列的细胞不再遵循跨膜电势公式(I)。因为在细胞平面附近总电流较小，这些细胞顶点附近的跨膜电势从顶点下降比游离细胞更缓慢。以定性的方式来描述，E1、E2和E3每一个细胞都比F细胞有更大的V_max点和V_min点之间有效电穿孔表面从而可以提高电穿孔效果，尽管有效电穿孔表面的形状可能会变得有些不规则。

尽管一个三维等高线图可以将E1、E2和E3细胞的真实有效电穿孔表面更加精确地描绘出来，图4中二维阴影图足以大致示出其更大的有效表面。横向排列的细胞增加了相互的电穿孔可行性这种现象被定义为横向增强效应。横向增强效应在细胞间距离增加或者当细胞偏离横截平面排列时变得不那么明显。总体来说，在所指示电流方向下这些细胞电穿孔可行性排列顺序为：

E2,E1,E3>S1,F>S2,S3

一般在细胞悬浮液中进行的电穿孔，复杂的细胞间的电交互作用按照特性可以主要归类为三种情形：纵向屏蔽、横向增强和前两者的混合作用。混合作用在既不是明显纵向排列也不是明显横向排列的邻近细胞间产生，并且混合作用的屏蔽和增强效益都更弱。定性分析中揭示了纵向屏蔽效应对于实现高效率的电穿孔通常是不合需要的。纵向屏蔽效应的影响在细胞悬浮液中是很难避免的。改变电流方向可以使纵向排列细胞的两个顶端表面都得以呈现来增加电穿孔效率。横向增强效应有利于电穿孔并且尤其对需要破坏性高电场才能达到V_min的小体积细胞有很大帮助。

基于这些认识，期望在电穿孔时可以消除或者减少纵向屏蔽效应带来的不利影响并且使横向增强效应最大化。

回到图1A中，当细胞处于横跨电流场方向的紧密的细胞单层11中时，纵向屏蔽效应在几何上消失，细胞间的横向增强作用增强。

如图1A所示，在样品容器10中绝缘室体14、第一电极15a和第二电极15b封住了上层介质13和下层介质12使得样品不会漏出。样品容器10可以有不同的形状，例如为圆柱形或者非圆柱形。

在样品容器10中使用的绝缘室体14可以由绝缘材料例如塑料、橡胶、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亚胺、聚二甲硅氧烷、环烯烃共聚物、热塑性聚酯弹性体、玻璃、石英和硅制成。绝缘室体14可以由一个或者多个绝缘材料制成使得它变得坚固并且可以与电极紧密配合。

第一电极15a和第二电极15b可以由导电性材料例如铝、铁、钢、镍、钛、锌、铜、锡、银、石墨和合金制成。它们还可以由镀金属材料、表面修饰的金属或者表面涂层或者混合导电性材料的绝缘体例如橡胶或者塑料制成。第一电极15a和第二电极15b可以被设计为透明以便对细胞进行显微镜观察，材料可以使用例如铟锡氧化物、铝掺杂氧化锌和掺锑氧化锡这类物质。第一电极和第二电极可以由不同的材料制成或者被制成不同形状。

电极15a可以为上部电极，电极15b可以为下部电极。两个电极15a和15b之间的距离最好超过1mm以便容易处理液体，同时小于50mm以避免消耗过多需被传送的目标物质。在一个实施例中，两个电极15a和15b之间的距离范围在1mm到30mm之间以便容易处理和节约所传送的物质。电极板15a和15b的形状和大小可以根据样品容器10的形状和大小决定。通常情况下不需要使用贵金属例如金或者铂制造电极15a和15b。但是惰性贵金属例如金和铂可以在不考虑成本因素或者容器需要被重复使用时用来制造电极15a和15b。

脉冲发生器18产生的电脉冲用来进行生物细胞的电穿孔。脉冲发生器18可以产生一个或者多个不同的脉冲波形例如指数衰减波、方波或矩形波、高频波和多种波形组合。电穿孔所需的脉冲波形可以根据细胞种类、容器种类或其他数据进行设置。因此脉冲发生器18可以设定程序来产生预设的脉冲波形进行电穿孔。本发明中，一个脉冲或者一个脉冲波形可以指一个单脉冲或者由多个脉冲或多种脉冲波形组成的组合脉冲。

紧密的细胞单层11可以在电极表面或者两个电极之间的任何地方形成。为了形成一个不直接在电极上的细胞单层11，可以在两个导电介质层12和13之间形成一个界面可以让细胞停留。这个界面又指的是导电介质层的表面。包含一定数量细胞的细胞悬浮液被放置在下层介质12的表面。细胞可以悬浮在用来形成上层介质13的介质或缓冲液或者其他合适的介质或缓冲液来形成细胞悬浮液。这些细胞可以通过自然重力或者人工施加离心力沉降到下层介质12和上层介质13之间的界面上。脉冲发生器18通过第一电极15a和第二电极15b传输特定波形的电脉冲到细胞单层，并且脉冲过程发生在细胞单层形成之后。

在电穿孔过程中，一个稳定的界面需要保持在上层介质13和下层介质12之间。上层介质或缓冲液13一般来源于制造细胞悬浮液的介质或缓冲液，或是其他合适的介质或缓冲液。用于上层介质13的介质或缓冲液可以是任意一种合适的介质或缓冲液例如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks’液、PBS和Ringer’s液。下层介质或缓冲液12可以是一种高密度的溶液例如含有糖、甘油、聚乙二醇和聚蔗糖的溶液。用于下层介质12的介质或缓冲液可以是任意一种合适的介质或缓冲液例如MEM、DMEM、IMDM、RPMI、Hanks’液、PBS和Ringer’s液，这些介质或缓冲液可以与上层介质13使用的相同或者不同。下层介质12还可以由半固体凝胶例如基于琼脂或琼脂糖的凝胶、硅凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、胶原蛋白或明胶、基质胶、透明质酸凝胶、海藻酸钙凝胶、聚乙二醇凝胶、基于甲基纤维素或改性纤维素的凝胶、丙烯酸盐凝胶、聚乙二醇凝胶和丙二醇凝胶形成。

不仅如此，下层介质12可以由浸泡在介质或者缓冲液中的多孔性固体基质组成。这种固体基质是多孔的并且最好具有亲水性以便维持下层介质12的导电性。固体基质可以由硅树脂、树脂、玻璃纤维、聚甲基丙烯酸酯、硅酸盐、改性纤维素、乙烯聚合物、聚赖氨酸、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚丙烯酰胺和共聚合物这些材料构成。形成下层介质12中的某些材料的物理状态可能介于液体和半固体之间，或者半固体和固体之间，或者液体和固体之间。只要一个稳定的界面可以在上层介质13和下层介质12之间形成并且维持，下层介质12的这种物理状态不会影响电穿孔。被传输的目标分子可以在上层介质13中或者在下层介质12中，或者两者都有。

半固体或者固体状态的下层介质12可以在样品容器10中预先形成。例如，在合适的介质如RPMI介质中的琼脂糖凝胶可以形成下层介质12，并且可以在样品容器10中预制。预制一个下层介质，可以使用能被固化或者成为凝胶的液体，或者下层介质可以做成预先设定的尺寸然后再放入样品容器里。

通常，两层介质，上层介质13和下层介质12，就足以在电穿孔时形成一个细胞单层11。但是在某些实施例中，只要能形成至少一个介质界面让细胞停留，也可以使用超过两个导电介质层。可以使用不同横截面积的样品容器来形成不同大小的界面，以适应数量不同的细胞。

图1C示出了与所披露实施例相一致的样品容器。如图1C所示，细胞单层11直接在电极15b上形成。为了形成细胞单层11，合适的介质或缓冲液中含有一定数量细胞的细胞悬浮液可以放入样品容器中。细胞通过自然重力或者离心力沉降在电极15b上形成细胞单层11。当细胞需要电场强度很低和/或细胞可以承受毒性时，这个方法是是适合的。

对大多数真核细胞的电穿孔操作，形成介质12和13的介质或缓冲液通常含有盐份来维持合适的渗透压。介质或缓冲液中的盐分又可以使介质12和13具有导电性。对于很小的原核细胞如细菌的电穿孔操作，有时使用水作为一种低电导介质可以允许使用高电场强度。在这种情况下，被传送的带电分子仍可以使水类介质比脂质类细胞膜更具有导电性，与细胞膜相比水类介质仍然可以大致视为导体。

用来形成细胞单层11的细胞数量取决于单层11所处表面面积和平均细胞占用面积大小。使用的细胞浓度可以经验性地通过观察显微镜下在另一个已知面积的透明容器内的情况决定，也可以通过电阻测量或者测试不同细胞数量的电穿孔效率来决定。缓冲液中的细胞浓度可以由计数装置决定，例如血球计数器或者基于成像或流式的计数器。不同细胞的特性例如平均占用面积和较优电场强度可以储存在数据库中以易于参照。不同界面面积的样品容器可以用来适应不同细胞数目。

两层或两层以上细胞单层可以紧密堆积在介质界面上并且这样得到的细胞沉淀仍可进行电穿孔操作。在这种情况下，除了细胞双层以外，电穿孔可能更加具有差异性，分子传输在不同细胞之间的变化增加。在一个细胞双层中，当使用交流电脉冲方案时，细胞的两个单层仍然可能有较均匀的电穿孔。本发明中提及的一个细胞沉淀是指形成不止一个紧密填充的细胞层的一群细胞。细胞沉淀中的细胞可能形成或不形成可清楚分辨的细胞层。

多层细胞或者细胞沉淀可以方便地应用于需要大量细胞并且分子传输在细胞之间的差异性不是主要问题的试验中。多层细胞电穿孔法可以视为是细胞单层电穿孔法的一种特殊形式或者其延伸方法。对于传统的在细胞悬浮液中的电穿孔，多层细胞电穿孔法仍然在效率、细胞存活能力和成本效率上具有优势。细胞单层的电穿孔方法和装置都可以适用多层细胞或者细胞沉淀。

单层细胞电穿孔法极大程度上减少了所需的总电场强度。图5示出了电流穿过细胞单层11的分布规律。图5中，细胞单层周围的电流三维分布可以由简化的二维图说明。

由于细胞与绝缘体类似，大部分穿过紧密的细胞单层11的电流都会从细胞间的缝隙通过。只有在细胞间缝隙的电流场强度与传统的在悬浮液中的电穿孔所需电流场强度相近。在其他位置，电流由于被扩散使得电流强度变得很低。

仅仅在细胞单层11外部，电流密度或者电场强度被分散到一个很低的水平，因此在细胞顶部表面附近制造了一块扩大的低电场区域(L-F)。在(L-F)区域内电势变化不大，即使细胞大小和细胞间缝隙大小的变化也不影响，只要细胞单层是紧密的并且细胞间缝隙相对较小。阴影区域表示在所示电流方向下带负电荷分子的有效电穿孔表面。

这样对细胞存活是有利的，因为细胞间缝隙空间比较小，而小区域内较强电流的作用可以很快发散出去。细胞间的缝隙可能为不规则的形状，所以缝隙的宽度或者截面积是不均一的。缝隙宽度可以大致按照有效电穿孔表面下方的平均电流通路宽度确定。

例如，当细胞单层11中的细胞占据80％的空间而留下20％的细胞间缝隙时，在同一个容器中使细胞单层产生类似悬浮细胞的跨膜电势时需要的总电流约为细胞悬浮液的所需总电流的20％。整体电阻的增加会比较小，因为细胞单层11的电阻大约相当于5个细胞深度的溶液电阻(20％的倒数为5)，对比通常电极之间的距离是比较小的。也就是说在同一个容器中大约只需要传统电穿孔20％的电压，或者4％的功率(20％×20％)就可以达到要求。这种简化的计算表明细胞单层比悬浮液中的细胞为完成类似的电穿孔需要的电能低。

本发明中使用的用语“紧密”是指细胞所占据单层区域面积的程度。用语“紧密度”是指细胞占据细胞单层区域面积的百分比。细胞单层11较合理的最小可行紧密度大约为50％，以便利用横向增强效应。随着单层紧密度增加，横向增强效应可以变得更加明显和有利。在指定的重力或者离心力下不再有细胞可以放入细胞单层时达到完全紧密性。在完全紧密性下，细胞间缝隙总空间会很小但是可能不会完全消失。当细胞紧密地排列时，因为细胞的一定可塑性它们的形状可能不呈现圆形或者球形。稍微超出完全紧密细胞单层的细胞数量时，电穿孔效率可能会稍微降低，因为一小部分细胞会相互叠起来从而会产生一些不理想的纵向屏蔽效应。

相比悬浮液中单独的游离细胞，紧密的细胞单层11上的每个细胞都有较大的电穿孔有效表面。在有效表面内，跨膜电势从顶点下降不会像游离细胞那么快。悬浮液中进行的传统电穿孔，细胞在跨膜电势和有效传输表面都存在差异性。但是不同尺寸的细胞在一个紧密单层中会有相近的跨膜电势。因为总电流在细胞单层的两面很小，因此细胞单层外部近处的电势基本上是一样的。细胞单层11中较小的细胞只是有效传输表面较小，它们的跨膜电势与较大细胞是几乎相同的。

利用细胞单层电穿孔法，被传输至每个细胞的目标分子的数量存在较少的差异性。例如，直径相差10％的细胞可能在传统电穿孔中传输的物质量相差大于10倍。然而，在紧密细胞单层电穿孔中的物质传输量的差异性可能只有大约为10％。由于在顶端有更平缓的电势分布，细胞单层电穿孔的工作电压范围(按百分比)对于类似电流脉冲方式而言可能比传统电穿孔的工作电压范围更大。

由于单层细胞电穿孔中使用较低电压，很多电流和电极本身产生的细胞毒性可以降低。直接将细胞单层11放置在电极15b上相对简单，可能适合于在特定缓冲液中需要很小电场强度或者细胞可以承受毒性的情况。使用导电介质层12和13之间的界面是有利的，因为物理上使细胞不接近电极15a和15b是一个可以避免对细胞造成电化学毒性的有效方法。导电介质或者缓冲液可以通过溶质离子导电并且不同于一般通过自由电子导电的电极。

并且由于单层细胞电穿孔中使用较低电压，使得基于单层细胞电穿孔法所需的脉冲发生器18相比基于传统电穿孔法所需的脉冲发生器的制造更加容易。当输出功率较低，产生不同的脉冲波形更简单。普通脉冲波形中的一种形式是指数式衰减波，一般由带电的电容器对样品放电形成。指数式衰减波可以通过连接一个电感器到样品上降低初始峰值电流而变得更为平缓。普通脉冲波形中的另一种形式是方波或矩形波。如果需要的话，其他形式的波形例如高频波也可以很容易实现。单一波形或者按序列的多个波形可以被应用在样品上。

当使用按特定序列排列的多个波形时，它们可以为同一个方向(直流电)或者为不同方向(交流电)。使用交流电可能有利于细胞的两个顶部表面而非只有一个表面用于细胞的传输。尤其当电穿孔的细胞处在多层细胞中时，交流电脉冲方式可能减轻图4描述的纵向屏蔽效应。脉冲发生器可以通过数字或模拟方式控制。并且脉冲发生器可以包含能量存储设备例如充电电池或电容器，使得该装置可以脱离电源线并在需要时无需电源线。

单层细胞电穿孔法有利于不同大小的细胞。较小的细胞更为受益，因为它们在传统电穿孔中需要更高的电场强度。单层电穿孔法可以方便地用于一般在悬浮液中成长的细胞例如造血细胞系、淋巴细胞系和血液类细胞。

对于通常生长在支撑物质或结构上的附着性细胞，可以使它们暂时处于悬浮状态用于电穿孔。附着性细胞可以通过一些常见方式例如机械分散和胰蛋白酶处理离开它们的支撑结构。附着性细胞可以在合适的介质或缓冲液中悬浮并且形成细胞单层用于电穿孔。

附着性细胞也可以在样品容器10中两层介质12和13之间的界面上培养。样品容器10中培养的附着性细胞可以直接用于电穿孔。但是，因为下述几种原因这种方式的电穿孔更难控制质量。第一，附着性细胞表面积的变化比悬浮细胞更大而且细胞的电学特性存在更大的差异性。第二，附着性细胞很难均匀地覆盖在单层11上。单层中的空地上可能没有细胞而拥挤的地方可能形成细胞堆积。靠近空地区域的细胞会遭受增强的电流引起的毒性。在拥挤的区域因为一些细胞相互之间叠放而导致电穿孔效率降低。第三，电穿孔只能在细胞长满而又没有过度增长的特定时间内进行。因此，进行电穿孔的时间受到限制。第四，结果的可重复性会更低，因为培养细胞所需较长时间会导致样品差异性。

如果细胞数量比较低，使用类似细胞的人造绝缘颗粒或合适直径的人造细胞增加细胞总数量。图6示出了人造绝缘颗粒在进行较少细胞电穿孔时的应用。绝缘颗粒16(阴影标示)随机地与真实细胞17(空心圆圈)混合。混合的细胞单层11在导电介质12和13的界面上形成。介质和细胞都处于绝缘室体14内并且电脉冲经过电极15a和15b传输。

绝缘颗粒16可以帮助形成一个紧密的单层11并且和真实细胞17一样限制电流。当使用绝缘颗粒16的数量大大超过细胞17的数量时，细胞17的准确数量变得不重要，同一个数量的绝缘颗粒16可以和不同数量的细胞17一起使用，从而简化了实验步骤。

绝缘颗粒16的大小可以与细胞17大小相近。绝缘颗粒16和细胞17的平均细胞直径差异最好在10倍以内。

绝缘颗粒16可以由特定生物特性的物质构成或者被这些物质覆盖使得在电穿孔后可以和细胞17一同保留下来。绝缘颗粒16也可以由磁性特征的物质构成使得它们可以通过磁性法被分离。其他把绝缘颗粒16和细胞17分离开的方法可以基于不同的沉降率或者不同的密度。在某些实施例中，人造绝缘颗粒16可以是其他类型的真实细胞，例如可以在电穿孔后容易分离的细胞，或者经过放射性或药物处理失去细胞活性或停止生长的细胞。

图1A示出了与所披露实施例相一致的作为示例性样品容器10。其他类型的样品容器也可以使用。

图7示出了与所披露实施例相一致的示例性样品容器20。所述样品容器20包括固定电极25、可用作密封盖的可移动电极26、筒式的绝缘室体21和剩余液容纳槽24。

绝缘室体21在底端有一个开口槽用于固定电极25并在绝缘室顶部壁上有另一个开口槽用于容纳可移动电极26。电极25的直径可以稍大于绝缘室体21底部槽的直径使得电极25可以由于绝缘室体21底部产生的张力而紧固安装。或者电极25可以通过胶粘接或者其他方式固定在绝缘室体21上用于密封容器底部。

可移动电极26可以嵌入一开口绝缘盖体22中，所述开口绝缘盖体22可通过柔性连接体23连接至主绝缘室体21。盖体22可以牢固地放入主绝缘室体21壁上的顶部槽内，这样允许电极26盖在主绝缘室体21的内侧边沿上而将样品密封。为了保证密封的介质层12和13以及包含的细胞单层11中没有气泡，加入的细胞悬浮液的体积可以稍微大于密封的容器20的可容纳体积，使得有少量的剩余液体渗出来保证一个完美的密封状态。在闭合电极盖26时，剩余溢出的液体可以流入制作在主绝缘室体21顶部壁上的剩余液容纳槽24中。进行电穿孔后，剩余液体中的细胞可以被丢弃因为它们没有经过电穿孔。

虽然将样品密封在容器内避免产生气泡是良好的做法，在进行单层细胞11或者多层细胞电穿孔时有一些小的气泡是可以接受的。由于介质中总体电场强度很低，电极26附近的气泡对电场的干扰只会对介质界面上细胞附近的电场产生微不足道的影响。对比传统开口式电极杯，密闭容器可能有其优势因为电极附近产生的气泡可以被压缩从而对细胞样品产生较少的干扰。密封容器通常指容器可以将样品没有开口地密封在内并且液体样品不会随着容器向不同的方向旋转而流动。

圆筒形的室体的制造相对比较容易，圆形电极板可以紧固嵌入无须使用任何密封胶。圆筒形容器20可以有某种改变或包含其他特征。虽然容器20内部空间为圆柱状，容器外部可以为其他形状，只要保持容器内部形状不变。圆筒形容器20可以按不同的尺寸制造。在一个实施例中，电极25和26之间的距离可以在1mm至50mm范围内。在另一个实施例中，电极25和26之间的距离可以在1mm至30mm范围内。主绝缘室体21的内径可以在1mm至100mm范围内。

虽然圆筒形容器的制造和使用很方便，用于单层细胞电穿孔的容器20可以使用任何合适的形状，只要细胞能在介质界面或者电极25上形成一个单层。例如，一个矩形的容器或者其他形状的容器是合适的。矩形容器可以使用按扣关闭方式或其他关闭方式。

如图7所示，密封盖体内包括被绝缘盖体22包住的电极26。其他类型的密封盖体也可以使用。例如，一个密封盖体可以是合适形状的且具有按压关闭或者螺纹关闭方式的导电电极26。

绝缘盖体22可以用按扣方式关闭样品容器20。为了保证紧密的密封，可以使用一个锁定结构。其他方式例如螺纹关闭的方式也可以使用。例如螺纹可以被制造在开口的绝缘盖体22和主绝缘室体21上用于形成一个紧密的封闭状态。盖体22可以紧密适配在主绝缘室体21的内侧如图7所示，或者盖体也可以适配在主绝缘室体21的外侧。另外，柔性连接体23也可以在这里使用以方便地盖紧盖体22。

示例性样品容器20的每一个部件上，都可以有标记或者把手以方便操作。绝缘室体21可以由类似制造绝缘室体14的材料制成。电极25和26可以由类似制造电极15a和15b的材料制成。

本发明预期还有一个开放式结构的样品容器。图8示出了与所披露实施例相一致的样品容器30。如图8所示，样品容器30包含一个绝缘室体34、一个底部电极35、一个配有适合的金属连接器37的网型电极36和一个密封盖39。

在图8中，细胞在下层介质12和上层介质13之间的界面上形成细胞单层11或者细胞多层。介质和细胞处于容器30的绝缘室体34中。底部电极35被固定在绝缘室体34的底部槽中。样品容器30可以采取各种合适的形状例如矩形。样品容器可以排列成一个阵列用于处理多个样品。

配有适合的金属连接器37的网型电极36可以插入在绝缘室体34顶部壁上的槽内。网型电极36可以允许细胞自由通过并且它可以浸入上层介质13中对细胞进行电穿孔。网型电极36可以在添加细胞悬浮液之前或之后被插入。另外，网型电极36可以被固定在容器30中或者可拆卸地连接到容器30。网型电极36与容器30外形一样以便适配在容器30中。例如，当容器30是矩形的时候网型电极36也是矩形的。

如果有必要，顶部的密封盖39可以进一步保护开放式结构的容器30。密封盖39可以由塑料制成。细胞可以在移除网型电极36后或者在网型电极36还存在的时候从容器取出。

绝缘室体34可以由类似制造绝缘室体11的材料制成。电极35、36和连接器37可以由类似制造电极15a和15b的材料制成。

本发明预期还有一个配有固定电极和一个单独附加的盖子的样品容器。图9A示出了与所披露实施例相一致的示例性样品容器40。如图9A所示，容器40包含一个绝缘室体44、第一固定电极45a、第二固定电极45b和容器40内部预先形成的半固体状或固态浸润的下层介质12。

绝缘室体44可以由类似制造绝缘室体14的材料制成。电极45a、45b可以由类似制造电极15a和15b的材料制成。

如图9A所示，当容器被竖直放置，也就是介质界面是竖直的时候，细胞悬浮液加满下层介质12和第一电极45a之间的空间。然后容器40立刻转为水平位置，以便介质界面变为水平方向并且细胞沉降至下层介质12和上层介质13之间形成细胞单层11。细胞悬浮液通过液体自然表面张力被限制于开口的容器40内同时细胞可以通过重力而非强大的离心力沉淀下来。

图9B示出了配有可活动绝缘盖的容器40。绝缘盖体48密封住容器40内下层介质12和上层介质13敞开的一边。配有固定电极和可活动绝缘盖体的容器40在使用离心力的时候可能是有帮助的。本发明中，一个可移动盖体可以指一个具有盖子功能的可移动电极或者样品容器绝缘室体的一个可活动部件。

为了将细胞排列成紧密的单层，装有适量细胞数量的细胞悬浮液放置于下层介质12的顶部。细胞通过自然重力或者人工离心力沉降至下层介质12和上层介质13之间的界面。另外，较高密度的下层介质可以加到细胞悬浮液。下层介质12、上层介质13和细胞单层11可以通过自然重力或人工离心力形成。通过自然重力使细胞沉降至界面的方式简单并且成本低。另一方面，由于人工离心力可以比重力更强，一个细胞单层或者多层细胞的细胞沉淀可以更快形成并且可以更紧密。

图10示出了利用离心技术制造一个紧密的细胞单层或者细胞沉淀。配有电极15a、15b和绝缘室体14的示例性样品容器10可以被用来容纳两个介质层12、13和细胞单层11。一个或多个样品容器10可以被放置于一个维持适当平衡的转子上。其他示例性样品容器例如容器20、30或40也可以使用离心方法。

图10示出了与所披露实施例相一致的示例性离心机50。离心机50包括第一金属支撑件55、第二金属件56、旋转轴58、电刷59a和59b和适配的转子内电连接线。图10中虚线代表电连接线可以灵活设置并示出了可选的接线方式，实际的接线方式可以根据转子内每次需被电穿孔的样品数量来确定。图10中多个样品容器可以理解为在转子中的多个样品容器或一个在转动的样品容器。一个电脉冲发生器54可以产生一个设定的脉冲并且将该脉冲传输到样品容器中。脉冲发生器54可以为一个位置固定的装置或者一个随着转子旋转并且在旋转时产生脉冲的转子内电路。

第一金属支撑件55保持容器在转子内并且形成与底部电极15b的电接触。通过离心力使第二金属件56挤压在顶部电极15a上从而形成电接触。金属件55和56与各样品容器10接触的两组接触点可以以组的形式接线至旋转轴58，也可以分别通过旋转轴58上的电刷59a和59b连接至旋转轴58上。当使用转子内电路54时，金属件55和56可以连接至转子内电路54上。因此两个金属件55和56起到用于传输电脉冲至样品容器10的导体的功能。

离心机50可以为摆动斗(水平转子)离心机或者为固定角转子离心机。在离心作用下，介质界面或者细胞单层11与旋转臂或者空心箭头57所示离心力方向垂直。合适的角度在自动调节的摆动斗转子或者在使电穿孔容器内介质界面接近垂直于旋转臂的固定角转子里面可以很容易实现。用于固定角转子的旋转轴58可以为竖直或者水平。当旋转轴58为水平时，介质界面需要垂直于旋转臂。

离心力与旋转半径和角速度的平方是成比例的。对于一般几厘米至几分米的旋转半径，几百转数/分(每分钟旋转数)至几千转数/分的旋转速度足以使大部分真核细胞形成一个细胞单层。其他转数也可以被使用。对于很小的原核细胞如细菌，转速可能需使用几千转数/分。离心分离时间范围从几秒到几分钟。其他离心时间也可以使用。旋转加速的过程可以设置得比较平缓，使容器内细胞不会移动到介质界面一侧。对于介质界面竖直的固定角转子，转动应该立即开始来使悬浮液中细胞不会沉淀到一边导致细胞分布不均匀。

如图10所示，金属件55和56可以连接至旋转轴58上来提供电脉冲进行对细胞单层11上的细胞进行离心过程中的电穿孔。

细胞进入单层11或者多层细胞的细胞沉淀后电脉冲可以进行传输。当使用离心机50时，电脉冲可以在离心的同时或之后进行传输。离心后施以脉冲，普通实验室用不含转子内电线的离心机也可以使用，合适的适配器可以将电穿孔容器保持在转子内。但是样品容器10需要非常小心地从离心机50中取出，以避免在电脉冲前破坏细胞单层11或者细胞沉淀。在另一方面，在离心过程中进行电脉冲可能是更加可靠和有利的。

在传输一个电脉冲后，细胞可以从样品容器10中移出，或者如果用于电穿孔的介质也适合细胞生存的话细胞可以保留在容器10中。一个离心机和一个脉冲发生器可以结合在一个机器中，这样机器可以易于携带并且方便控制。

对于位置固定的脉冲发生器54，炭刷或者电刷59a和59b可以被用来将脉冲发生器的电脉冲传输至离心机转子内的样品中。另外，最后加到样品上的电脉冲也可以由转子内电路54产生从而避免电刷59a和59b产生的信号噪声。转子内电路54可以安装在旋转轴58附近以便其不用承受高离心力。当使用转子内电路54时，电刷59a和59b可以用来接收电能和控制命令，但是它们不在最后的脉冲传输线路内。无触点的电功率传输可以通过使用磁性能量转移的方式实现，这种方式可以避免电刷59a和59b产生的信号噪声。当使用转子内电路54时，可以使用无线电信号控制转子内脉冲。

图11A示出了与所披露实施例相一致的示例性容器60。如图11A所示，底部电极65装在绝缘室体61内。带绝缘的金属线67连接到底部电极65上。被开口的盖体62包围的顶部电极66可以闭合在主绝缘室体61上并且密封住两层介质12、13和细胞单层11。盖体62可以通过连接体63连接在主绝缘室体上。槽64可以做在主绝缘室体中来容纳多余的样品。电脉冲通过电极66和67传输。这种结构可以有利于防止样品在离心过程中泄露。

图11B示出了示例性容器60的一种另外形式。绝缘室体61可以更改为开口的底部并且被放置于增大的底部电极65内，底部电极65既有结构支撑也有电连接的作用。上部电极66装配在绝缘室61内并通过绝缘室体61实现与电极65之间电隔离。容器60的这种另外形式也可以有利于防止样品在离心过程中泄露。

理论上，转子内平面的介质界面会产生少许不均匀的离心力，因为旋转半径有些不同。如果离心时间不是很长的话，这个因素不会造成很大影响。细胞分布基本均匀可以通过使用一个较长的旋转臂长度、使用一个可以减少细胞侧向移动的介质界面和允许细胞在离心之前先沉淀来实现。样品容器中可以配有弯曲的电极。样品容器中一个弯曲的介质界面可能在各点上具有相同旋转半径。配有绕自身轴旋转的全圆柱形介质界面的容器能够理想地在界面所有点上提供相等的旋转半径，并且可以使用任意加速方式而不用考虑细胞侧向移动问题。

图12A示出了与所披露实施例相一致的示例性容器70。容器70采取环形结构配有一个弯曲的绝缘室体和两个环形弯曲的电极来形成内部空间以容纳电穿孔样品细胞。一个细胞单层11可以被放置在电极75和76中间的圆柱形表面。图12A是容器70垂直于它的中心轴的截面视图。当容器70在离心机内沿着它的中心轴旋转时，单层11上的细胞承受相等的向外的离心力。在离心过程中，单层11上的细胞在离心加速完成后形成一个单层并在支撑表面保持稳定。图12B是容器70中把环形切开的剖面。由绝缘室体71和两个电极75、76形成容器70的主体。

细胞单层11可以在离心力下直接放置于外圈电极75的表面。或者，导电介质层12可以被用来防止细胞单层11直接接触电极。细胞在离心前可以首先悬浮在介质13中。离心机例如图10所示配有合适的转子内电连接线的离心机50可以来在离心过程中完成电穿孔操作。电极75、76可以通过转子内电连接线和电刷连接在脉冲发生器上。配有包封的绝缘室体的容器70的环形区段也可以使用。另外，弯曲的电极和/或者弯曲的介质表面可用于容器例如容器10、20、30、40或60。在本发明中，电极或者导电介质层表面可以是平的或者不平的。

另外，本发明可以适用于细胞电融合。当细胞电融合是电穿孔的目标，有两个细胞单层的含有大约两层细胞的双层结构可以用在与用于电穿孔样品容器类似的容器中，例如示例性样品容器10、20、30、40、60或70。每一层包含一种类型的细胞是较好的选择，但是混合两种类型的细胞也是可取的，尽管融合效率可能较低。

细胞双层可以利用沉降速度差异依次或者一起形成，例如一种类型的细胞可以首先沉降然后另一种细胞跟随落下。配有网型电极的容器便于制作不同种类的细胞双层。第一种细胞悬浮液加入容器中到达网型电极的位置，细胞被收集在下层介质表面。然后第二种细胞悬浮液加入容器中并漫过网型电极，使得细胞可以均匀放置在第一个细胞单层顶部。另一种制造两个按序细胞单层的方法是利用两个在不同介质里的细胞悬浮液，该介质可以形成一个界面并且第二种细胞悬浮液可以在第一种细胞悬浮液已经形成细胞单层后加入。

在合适的缓冲液中的细胞双层可以通过合适的电脉冲进行处理用来促进细胞融合。电脉冲的传输可以在离心过程中进行。由于在细胞电融合过程中不用进行目标物质传输，节省试剂并不是实验目的。因此用于细胞融合的样品容器的两个电极之间可以有更大的距离以便更容易地依次形成不同种类的细胞双层。不仅如此，两种类型的细胞单层可以通过重复进行除去离心的介质并加入更多细胞悬浮液的操作从而形成三层或三层以上的细胞交替层的叠层用于细胞电融合。

图13示出了与所披露实施例相一致的示例性细胞单层电穿孔方法200。首先，细胞分散在悬浮液中(202)。对于附着性细胞，它们先脱离附着再分散在悬浮液中。如有需要细胞可以进行清洗。还有，细胞浓度可以通过一种计数方式确定(204)。适当数量的细胞被取用来形成一个细胞单层或者多个细胞单层。之后，将细胞悬浮液的体积调整到适合样品容器(206)。需要被传输的目标物质可以在将细胞悬浮液装入样品容器前加入悬浮液中。然后，细胞悬浮液装入样品容器中(208)。

将细胞悬浮液装入样品容器后，使细胞排列为一个细胞单层(210)。如果细胞单层用重力自然沉淀来形成，样品容器需要放置于水平表面上一段时间。形成一个细胞单层的时间可以靠实验决定。例如细胞单层的形成可以通过显微镜来观察。如果细胞单层通过离心形成，样品容器可以放置于离心机内。形成细胞单层后，细胞用一个电脉冲处理(212)。如果利用离心机形成细胞单层，电脉冲处理的时间可以是离心之后或者在离心过程中。在细胞电脉冲处理后，细胞从样品容器中取出(214)。如果在离心过程中进行电脉冲处理，取出细胞前需停止离心机。对于细胞电融合，可以增加一个制造细胞双层的步骤，并且缓冲液和电脉冲可以不同于一般以传输物质为目的时所用的缓冲液和电脉冲。

本发明也可以适用于在细胞悬浮液中的电穿孔。图14A示出了与实施例相一致的可以用于细胞悬浮液中电穿孔操作的示例性样品容器80。如图14A所示，容器80包含一个筒式绝缘室体81、固定电极85、具有密封盖功能的可移动电极86、开口的绝缘盖体82和一个剩余液容纳槽84。

绝缘室体81的底部有一个开口槽用于固定电极85，位于绝缘室体81壁上的顶部槽用于容纳可移动电极86。电极85的直径可以略微大于绝缘室体81的底部开口槽直径，使得电极85由于绝缘室体81底部产生的张力而紧固在其中。或者电极85可以通过胶粘接或者其他方式固定在绝缘室体81上用于密封容器底部。

可移动电极86可以被嵌入在开口绝缘盖体82中，所述盖体82可通过柔性连接体83连接至主绝缘室体81。盖体82可以牢固地放入主绝缘室体81壁上的顶部槽内，这样允许电极86盖在主绝缘室体81的内侧边沿上而将样品密封。为了密封细胞悬浮液87时比较可靠不产生气泡，加入的细胞悬浮液的体积可以稍微大于密封的容器的可容纳体积，使得有少量的剩余液体渗出来保证一个完美的密封状态。在闭合电极盖86时，剩余溢出的液体可以流入制作在主绝缘室体81顶部壁上的剩余液容纳槽84中。进行电穿孔后，剩余液体中的细胞可以被丢弃因为它们没有经过电穿孔。虽然将样品密封在容器内避免产生气泡是很好的做法，一些小的气泡是可被接受的只要这些小的气泡只占据电极表面很小一部分。

对纵向屏蔽效应和横向增强效应的理解也可以帮助提高悬浮液中细胞的电穿孔效率。对于较大体积的细胞类型，它们需要较低的电场强度来实现有效电穿孔，由于相邻细胞间电场相互作用导致的细胞的差异性可能对电穿孔效率有一些不利影响。但是对于更多常见的较小体积的细胞种类，它们需要较高的电场强度来实现有效电穿孔，由于相邻细胞间电场相互作用导致的细胞的差异性相反可能对细胞电穿孔较为有利。

对于较小的细胞，在悬浮液中增加细胞浓度可以提高横向增强效应。纵向屏蔽效应也可能同时增强。增强的纵向屏蔽效应可能成为提高横向增强效应时可以接受的代价。纵向屏蔽效应可能通过交流电脉冲方案从而减轻。

细胞总体积占细胞悬浮液体积的最佳百分比可能由于细胞种类不同而变化。细胞总体积百分比大约等于或大于5％可能适合于大多数种类的细胞。当细胞数量不够时，可以使用单层细胞电穿孔法中类似使用的人造绝缘颗粒。

对于改进的细胞悬浮液的电穿孔，可以使用示例性样品容器80或者其他用于单层电穿孔法的样品容器。用于细胞悬浮液电穿孔的容器80中电极85和86之间一般有较大距离使得较少的细胞在电极附近从而减少对细胞造成电化学毒性。电极85和86之间的较优距离最好在3mm到100mm之间，进一步优选距离在5mm至50mm之间。

容器80可以为圆柱形状。容器80横截面直径可以大于1mm。在特定实施例中，容器80横截面的直径范围在1mm至20mm。其他范围外的直径也可以使用。容器80的外形也可以是除了圆柱形以外的其他形状。

可移动电极例如容器80中的电极86可以使用在绝缘室体两端，尤其当容器内径很小或者当电极之间距离很远的时候。对于这样一个容器80，可能不方便只用一个可移动电极装载样品。由于靠近电极附近的细胞承受明显的电化学毒性，可以在绝缘室体81上做一些标记用来指示将要丢弃的受损害的细胞。容器80也可以连接到注射式系统使细胞悬浮液样品能够持续流入容器内。

当容器80中的电极85和86距离相对较远时，需要用高电压维持一个相对应的电场强度。表面上需要脉冲发生器传输一个相对高电压看似是缺点可能实际并不是问题。

例如，为了在悬浮液中给人类细胞系电穿孔，从1000μF的电容器释放指数波到4mm间距的电极杯中，该电极杯中的0.2ml样品需要200V电压。如果将同样0.2ml的细胞悬浮液放置于电极间距2cm(电极杯间距的五倍)的更长的容器内，需要1000V电压，但是需要只有40μF(1000μF的1/25)的电容器就够了，因为来自电容器的电能遵循公式：

E＝0.5U²C

其中E代表电能，U代表电压，C代表电容。因此高电压的脉冲发生器实际上也容易制造，因为它需要小得多的电容来储存近似大小的电能。类似地，产生其他高电压的波形也并不困难。

非常小的细胞比如细菌需要一个很高的电场例如20000V/cm在低导电液体例如水中进行电穿孔。传统上细菌电穿孔一般在电极间距为1mm或者2mm的电极杯中完成，需要的电压小于3000V。为了对较小的细胞例如细菌在容器80中进行电穿孔，需要使用超高电压。在本发明中使用的超高电压是指大于5000V，并且可能达到在10000V至30000V之间，通常用于很小细胞的电穿孔。一个可以产生数以万伏计电压的脉冲发生器可能并不难制造，因为超高电压下需要容量非常小的电容器来储存电能。脉冲发生器可以装备上电能储存装置例如充电电池或者一个储能电容器使其成为无线设备方便移动。

电极间距较远的可密封容器80可以有效防止电弧。在传统电极杯中，不规则分布的离子溶液可能形成一小块渗漏区域使两个电极附近造成短路。在电极间距离较远的密封容器中，即使形成一小块渗漏区域，也远不可能从一个电极延伸至另一个电极从而引起短路。甚至当一些小气泡停留在电极附近，也不会引起电弧，因为它们不会从一个电极延伸至另一个电极。因此，较长的容器80有利于抑制电弧的产生。

长度较长的容器80的另一个优势是制作精密度高。对于一个1mm的电极杯，50μm距离的误差为5％，但是对于一个2cm长容器误差只有0.25％。

图14B示出了与所披露实施例相一致的容器80中下层介质88a在细胞悬浮液电穿孔中的应用。如图14B所示，下层介质88a在电极85上形成。细胞悬浮液87装载在下层介质88a上。细胞悬浮液87中的细胞可以形成细胞沉淀89。

下层介质88a与用于单层细胞电穿孔法的介质类似，例如图1A中下层介质12。下层介质88a物理上使细胞离开电极85。另一个介质层88b也可用在上部电极，尤其当容器准备用于细胞悬浮液电穿孔时，使得两端细胞悬浮液避免直接接触到电极。细胞悬浮液87可以在该容器中直接进行电穿孔，或者悬浮液中的细胞可以形成细胞沉淀89来增加细胞浓度。虽然用于细胞悬浮液电穿孔的容器80中电极85和86间距一般较长，专门用于对细胞沉淀89进行电穿孔的容器80中电极85和86间距可以较短。细胞沉淀89可以通过自然重力或者通过离心力作用形成。如果使用离心机，细胞沉淀89的电穿孔可以在离心结束后或者离心过程中进行，与所描述的离心机50中单层和多层电穿孔法类似。细胞沉淀89可以在比相同细胞悬浮液电穿孔所需电压更低情况下进行效率较高并且毒性较低的电穿孔。脉冲发生器可以配置一个电能储备装置使其无线并且方便移动。基于单层细胞电穿孔所描述的脉冲发生器或者脉冲形式的变化也可用于细胞悬浮液或者细胞沉淀的电穿孔。人造绝缘颗粒也可与真正的细胞一起用于形成细胞沉淀。

本发明提供的电穿孔的设备和方法可以用来在电穿孔时达到高效率并且低毒性的效果。根据本发明提供的电穿孔的设备和方法比其他设备和方法更有优势。例如，本发明提供的电穿孔的设备和方法比毛细管电穿孔具有一定的优势。

图15示出了示例性毛细管辅助进行的电穿孔。如图15所示，电穿孔在内径20μm的毛细管中进行。两个细胞，细胞A和细胞B位于毛细管内。细胞A直径为18μm，细胞B直径为16μm。

如图15所示，细胞A和毛细管壁的最小距离为1m，细胞B与毛细管壁的最小距离为2μm。毛细管壁为绝缘体因此电流主要被限制在细胞和毛细管壁之间的缝隙中。相同的总电流穿过细胞A和细胞B周围的缝隙。

因为细胞B周围缝隙的横截面积大约为细胞A周围缝隙横截面积的两倍，细胞B周围缝隙的电流强度只有细胞A周围缝隙电流强度的一半。因此，细胞A在缝隙外的区域的跨膜电势大约为细胞B跨膜电势的两倍(200％)，尽管细胞A的直径只超过细胞B的直径约1/8(12.5％)。在毛细管中，细胞A受益于毛细管壁产生的横向增强效应。但是，对于细胞B很难进行电穿孔，尽管B只是稍微小一点。即使使用交流电脉冲方式时，细胞B跨膜电势还是只有A的一半。所以，细胞B不能进行有效电穿孔。如果A直径变为19μm使其与毛细管壁缝隙变为0.5μm，A的跨膜电势可能为B的400％，说明毛细管可以在电穿孔效率中引起非常显著的细胞差异性。

因此毛细管在电穿孔中的作用是通过毛细管壁的横向增强作用实现的。当内径较小其效果更好，因为对于较小的毛细管更高比例的细胞位于毛细管壁附近。紧密细胞单层电穿孔法在电穿孔时减少了细胞差异性。相比之下，毛细管电穿孔法在电穿孔时增大了细胞差异性，因此毛细管电穿孔法有其内在的局限性。本发明中主要利用的悬浮液或者细胞沉淀中较密细胞自身的横向增强效应来进行电穿孔的方法可以在电穿孔效率和成本上都具有优势。样品容器例如容器80的各种形式不同于毛细管，容器80的直径或者横截面并没有被限制。容器80只要使用所需的直径就可以容许处理大容量细胞样品。

本发明的各种实施例与相关的附图在这里进行了展示和说明，这些描述的目的并非限制本发明的范围。

Claims

1.一种生物细胞电穿孔装置，其特征在于，包括：

样品容器，具有用于容纳细胞的绝缘室体，所述样品容器具有第一电极和第二电极以提供电连接以实现电穿孔；以及

第一导电介质层，含有具有溶质离子的溶液，所述第一导电介质层一端与所述第一电极接触，另一端形成界面，

其中，所述第一导电介质层用于隔开细胞与所述第一电极的接触，所述第一导电介质层用于通过所述溶质离子将电脉冲传导至细胞样品以进行电穿孔或者电融合，以及

所述第一导电介质层的所述界面上用于形成至少一个细胞单层，

所述第一导电介质层为上层介质层或下层介质层。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一电极和第二电极中的至少一个是可移动电极且用作密封盖，以在电穿孔过程中将细胞样品限制在绝缘室体内且位于第一电极和第二电极之间。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述绝缘室体的壁的一端具有容纳槽以容纳多余的液体。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括预先制作好的多孔性固体基质，其中，所述下层介质层制作在所述多孔性固体基质中。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括有助于把细胞样品中的悬浮细胞形成为至少一个细胞单层的离心机。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，还包括在旋转过程中给样品容器提供用于电穿孔的电脉冲的脉冲发生器。

7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述脉冲发生器具有充电电池以实现无线功能。

8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述脉冲发生器与所述离心机合为一体。

9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括多个人工绝缘颗粒，用于与细胞一起在所述第一导电介质层的所述界面上形成至少一个细胞单层。

10.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述多孔性固体基质为硅树脂、树脂、玻璃纤维、聚甲基丙烯酸酯、硅酸盐、改性纤维素、乙烯聚合物、聚赖氨酸、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚丙烯酰胺或其共聚合物。

11.根据权利要求4所述的装置，所述下层介质层的形成材料选自基于琼脂或琼脂糖的凝胶、硅凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、胶原蛋白或明胶、基质胶、透明质酸凝胶、海藻酸钙凝胶、聚乙二醇凝胶、基于甲基纤维素或改性纤维素的凝胶、丙烯酸盐凝胶和丙二醇凝胶。

12.一种生物细胞电穿孔的方法，其特征在于，包括：

利用所述第一导电介质层隔开细胞与所述第一电极的接触；

利用预设电脉冲对所述细胞单层中的细胞进行处理，所述电脉冲通过所述第一导电介质层中的所述溶质离子传导至细胞样品以进行电穿孔或者电融合，

其中，在所述第一导电介质层的所述界面上形成至少一个细胞单层，所述第一导电介质层为上层介质层或下层介质层。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括：

用密封盖将细胞样品密封在所述样品容器中。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括：

由细胞在自然重力作用下在所述第一导电介质层的界面上形成至少一个细胞单层。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括：

利用离心作用使细胞在所述第一导电介质层的界面上形成至少一个细胞单层。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括：

在离心过程中采用预设电脉冲对所述细胞进行处理。