KR102036623B1 - 전기천공 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

생물학적 세포의 전기천공용 장치가 제공한다. 장치는 세포를 수용하기 위한 절연체 챔버를 가진 샘플 용기를 포함한다. 샘플 용기는 전기천공을 위한 전기 연결을 제공하기 위해 제 1 전극 및 제 2 전극을 가진다. 절연체 챔버는 적어도 하나의 세포 단층을 포함하도록 구성된다. 장치는 또한 세포의 전기천공을 위한 소정의 펄스를 발생시킬 수 있는 펄스 발생기를 포함한다.

Description

전기천공 방법 및 장치{Methods and Devices for Electroporation}
본 발명은 일반적으로 세포의 전기 자극 방법 및 장치에 관한 것으로, 특히 세포의 전기천공 방법 및 장치에 관한 것이다.
전기천공은 전기 자극으로 막 구멍의 일시적 생성에 의한 세포막의 투과처리를 위한 널리 사용된 방법이다. 전기천공의 응용분야는 포유류 세포, 식물 세포, 효모, 다른 진핵세포, 박테리아, 다른 미생물 및 사람 환자로부터의 세포와 같은 다양한 세포에 DNA, RNA, siRNA, 펩타이드, 단백질, 항체, 약물 또는 다른 물질의 전달을 포함한다. 전기 자극은 또한 하이브리도마 또는 다른 융합 세포의 생산에서 세포 융합을 위해 사용될 수 있다. 전기 세포 융합은 특수한 형태의 전기천공으로 생각될 수 있다.
전형적인 전기천공 동안, 세포는 세포 생존에 유리한 버퍼 또는 배지에 현탁된다. 박테리아 세포 전기천공 동안, 물과 같은 낮은 컨덕턴스 배지가 일시적 고전류에 의한 열 생산을 감소시키는데 주로 사용된다. 그런 후에 세포 현탁액은 전기 방전을 위한 2개의 평면 전극이 삽입된 직사각형 큐벳에 놓인다. 예를 들어, 바이오-라드(Bio-Rad)(Hercules, CA)는 큐벳에서 세포를 전기천공하기 위해 생성물의 유전자 펄스 라인을 만든다. 전통적으로, 전기천공은 고 자기장 강도를 필요로 한다.
전기천공 공정은 주로 세포에 유독하다. 첫째, 전기장 강도가 너무 높을 때, 세포막은 비가역적으로 손상될 수 있다. 둘째, 전기적으로 유도된 막 구멍은 표적 물질이 세포에 들어가게 하는 반면, 구멍은 또한 세포 생존능력에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 세포 내용물의 유출 및 다른 의도하지 않은 물질의 유입을 가능하게 할 수 있다. 셋째, 전류에 의해 생성된 열은 세포를 손상시킬 수 있다. 마지막으로, 유리 라디칼, 기체 및 전극 근처 금속 이온과 같은 전기화학적으로 발생된 독성 물질은 세포에 유해하다.
세포 특성의 변이, 즉 전기천공 동안 세포의 이종성은 낮은 세포 독성을 가진 고효율 전기천공을 얻는데 가장 큰 장애물로 남아있다. 이종성에 기여하는 하나의 공지된 인자는 세포 크기이다. 더 큰 세포는 전기천공되기 더 쉬운 경향이 있다. 다른 크기를 가진 세포의 혼합물의 경우, 더 큰 세포가 특정 전압하에서 효율적으로 전기천공될 때, 전압은 주로 더 작은 세포를 효율적으로 전기천공하는데 충분하지 않다. 더 작은 세포가 효율적으로 천공되는 전기장 강도에서, 전압이 주로 더 큰 세포가 생존하기에는 너무 높기 때문에 더 큰 세포는 주로 비가역적으로 손상된다. 다른 세포막 조성물 또는 세포 성숙과 같은 다른 인자가 또한 세포의 이종성에 기여할 수 있다.
세포 전기천공의 효율을 개선하는 여러 시도에도 불구하고, 세포 이종성의 중요한 문제는 해결되지 않고 남아있다. 전기천공 방법의 효율, 세포 생존가능성 및 비용 효율이 더욱 개선될 수 있다. 개시된 장치 및 방법은 상기한 하나 이상의 문제 및 다른 문제를 해결하는데 집중한다.
본 발명의 한 양태는 생물학적 세포의 전기천공용 장치를 제공한다. 장치는 세포를 수용하기 위한 절연체 챔버를 가진 샘플 용기를 포함한다. 샘플 용기는 전기천공을 위한 전기 연결을 제공하기 위해 제 1 전극 및 제 2 전극을 가진다. 절연체 챔버는 적어도 하나의 세포 단층을 포함하도록 구성된다. 장치는 또한 세포의 전기천공을 위한 소정의 펄스를 발생시킬 수 있는 펄스 발생기를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 생물학적 세포의 전기천공 장치를 제공한다. 장치는 전기천공을 위해 생물학적 세포의 샘플을 고정하기 위한 샘플 용기를 포함한다. 용기는 세포를 고정하기 위해 용기의 바디를 형성하는 절연체 챔버를 포함한다. 절연체 챔버는 복수의 면을 가진다. 용기는 또한 전기 펄스 발생기로부터 전기 펄스를 수신하도록 제 1 전극과 제 2 전극을 포함하여 세포를 전기천공한다. 절연체 챔버 및 전극은 생물학적 세포의 샘플을 샘플 용기 내에 밀봉할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 생물학적 세포의 전기천공 방법을 제공한다. 방법은 다음 단계를 포함한다. 세포는 샘플 용기의 절연체 챔버에 적어도 하나의 세포 단층을 형성하도록 배열된다. 샘플 용기는 전기천공을 위한 전기 연결을 제공하도록 제 1 전극과 제 2 전극을 가진다. 세포 단층에 있는 세포는 펄스 발생기에 의해 발생된 소정의 전기 펄스로 처리된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면을 고려하여 당업자가 이해할 수 있다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a는 개시된 실시태양과 일치하는 생물학적 세포의 예시적 전기천공 장치를 예시한다.
도 1b는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기에 형성된 예시적 세포 단층을 예시한다.
도 1c는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기에 형성된 예시적 세포 단층을 예시한다.
도 2a는 구형 절연체 전지에 의한 전류 흐름에 대한 차단 및 전환 효과를 예시한다.
도 2b는 세포에 대한 전기천공을 위한 효과적인 표면을 예시한다.
도 3은 효과적인 전기천공 표면에 대한 세포 크기의 효과를 예시한다.
도 4는 전기 회로의 표시된 방향을 가진 3개의 대표적 이웃 세포 위치를 예시한다.
도 5는 세포 단층을 통해 흐르는 전류의 분포를 예시한다.
도 6은 전체 세포 숫자를 증가시키는데 세포-모방 인공 절연체 입자의 사용을 예시한다.
도 7은 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 8은 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 9a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 9b는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 10은 개시된 실시태양과 일치하는 전기천공 또는 전기 세포 융합을 위한 세포의 조밀한 세포 단층 또는 여러 단층을 제조하는데 원심분리의 예시적 사용을 예시한다.
도 11a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 11b는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 12a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 12b는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다.
도 13은 개시된 실시태양과 일치하는 전기천공의 예시적 방법을 예시한다.
도 14a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 장치를 예시한다.
도 14b는 개시된 실시태양과 일치하는 전기천공을 위한 예시적 하부 배지층의 예시적 사용을 예시한다.
도 15는 예시적 모세관 지원 전기천공을 예시한다.
첨부된 도면에 예시되는 본 발명의 예시적 실시태양을 더욱 상세하게 참조할 것이다. 가능한 곳마다, 동일한 도면부호가 도면 전체에서 사용되어 동일한 부품 또는 유사한 부품을 언급할 것이다.
도 1a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 전기천공 장치(100)를 예시한다. 장치(100)는 샘플 용기(10)를 포함한다. 샘플 용기(10)는 절연체 챔버(14), 제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)을 포함한다. 샘플 용기(10) 내에, 계면이 하부 배지층(12)의 표면상에 및 상부 배지층(13)의 아래에 형성된다. 전기장을 가로지르는 세포 단층(11)이 계면 상에 형성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 세포 단층은 단일의 조밀하게 채워진 세포층을 의미한다. 세포 단층은 따라서 때때로 조밀한 세포 단층 또는 조밀한 단층으로 불린다. 장치(100)는 또한 펄스 발생기(18)를 포함한다. 샘플 용기(10)는 제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)을 통해 전기 펄스를 전달하는 펄스 발생기(18)에 놓일 수 있다. 도 1b는 절연체 챔버(14) 내의 세포 단층(11)의 단면도를 제공한다. 도 1b에 도시된 대로, 단층(11)은 절연체 챔버(14)의 단면적을 차지한다.
장치(100)는 세포 전기천공을 모델링하기 위한 특정 개념을 사용하여 구현될 수 있다. 도 2a는 최초에 균일한 전류 흐름 또는 전기장에 대한 반지름 R을 가진 구형 세포의 효과를 예시한다. 세포에 대한 DNA, RNA 또는 단백질의 전달과 같은 전형적인 전기천공의 경우, 전기 충격은 배지 또는 다른 식염수 버퍼 용액에서 일어난다. 세포외 용액 및 세포내 세포 혈장과 비교하여, 지질-이중층 기반의 세포막은 훨씬 낮은 전기 전도도를 가지며 전류의 대부분은 세포의 내부를 우회한다. 따라서 세포는 절연 물체와 유사하다.
세포막의 절연체 효과는 세포 내부를 전기천공 동안 강한 전기장의 단시간 노출로부터 보호한다. 도 2a에 도시된 대로, 절연체-유사 구형 세포에 의한 전류의 방해 및 우회는 균일한 전기장을 세포 주위에서 부풀어 오른 것으로 변화시킨다.
세포막 상의 국소 지점은 일반적인 전류의 방향으로부터 이의 반지름 각(θ)으로 지정될 수 있다. 전도성 배지에서 DNA, RNA 및 단백질과 같은 음으로 하전된 분자는 전류의 방향과 반대 방향으로 이동한다.
최초로 균일한 전기장에 놓인 R의 반경을 가진 단일 세포의 경우, 반지름 각(θ)을 가진 막 상의 소정의 점에서 막투과 전위는 대략 다음 식으로 모델로 만들 수 있다
Vθ = 1.5·E0·R·cosθ, (I),
E0는 최초 균일한 전기장의 전기장 강도이다. 전체 전기장의 방향에 대해 두 국소 지점에서 θ이 0° 또는 180°와 동일할 때, cosθ는 1 또는 -1과 동일하며 막투과 전위 값은 최고이다. 전류의 상류 국소 지점(θ=180°)이 아닌 전류의 하류 국소 지점(θ=0°)에서, DNA, RNA 및 단백질과 같은 음으로 하전된 분자는 최고 전위하에서 막을 통과한다. 반대로, 막투과 전위는 θ가 90°과 동일한 세포막 상의 지점에서 영인 반면, 전류는 이런 막 지점 바로 바깥에서 최강이다.
막투과 전위는 θ가 0°일 때 최대이고 θ가 90°일 때 0 전위까지 감소한다. 국소 막 지점에서 더 큰 막투과 전위는 분자를 수송하는 더 큰 힘을 생산한다. 물질을 전달하기 위해서, 최소 막투과 전위 Vmin이 필요로 할 수 있다. θ 또는 θmax의 최대값은 막투과 전위가 Vmin이 되는 경우 0°내지 90°에 도달할 수 있다. 한편, 더 작은 θ를 가진 세포 지점 상에서 막투과 전위는 세포를 비가역적으로 손상시킬 수 있는 전위보다 높을 수 없다. θmax는 최대 유효 전기천공 표면을 정의한다.
도 2b는 구형 세포 상에(어두운 지역으로 나타낸) 유효 전기천공 표면을 예시한다. 본 발명에서 사용된 유효 전기천공 표면 또는 전기천공을 위한 유효 표면은 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 외인성 물질이 세포에 들어가게 하는데 충분한 막투과 전위를 가진 세포 표면의 일부를 의미한다. DNA, RNA 또는 단백질과 같은 더 큰 분자를 세포에 주입하는 전기천공에서, 세포는 단지 특정 막투과 전위하에서 생존할 수 있다. 도 2b에서, Vmax는 최대로 허용가능한 가역적 막투과 전위를 나타내며, 이 이상에서 세포는 비가역적으로 손상될 수 있다. Vmin은 효과적인 전기천공을 가능하게 하는 최소로 흡수가능한 막투과 전위를 나타내며, 이 이하에서 외인성 물질은 세포에 들어갈 수 없다. Vmax 및 Vmin 모두는 막 특성에 의해 측정된다. Vmax는 전달될 표적 물질의 종류와 상관없이 동일 수 있는 반면 Vmin은 크기 및 전하와 같은 표적 분자 특성과 관련이 있다. 더 큰 분자는 아마도 전달을 위해 더 큰 Vmin을 가질 것이다. 세포를 전기천공하는 막투과 전위의 유효 범위인 Vmax 및 Vmin 사이의 창은 특히 더 큰 분자를 전달하기에 작을 수 있다.
도 2b에 도시된 대로, 세포의 국소 지점만 Vmax, 최고 막투과 전위에 도달할 수 있다. 어두워진 유효 전기천공 표면의 외부 경계는 Vmin의 막투과 전위 및 θmax의 반지름 각을 가진다. DNA, RNA 및 단백질과 같은 음으로 하전된 분자의 경우, 유효 전기천공 표면은 전류의 하류에 위치된다.
국소 지점에서,
θ = 0°및 cosθ = 1,
Vmax = 1.5·E0·R를 제공한다.
막투과 전위가 Vmin까지 감소하는 θmax에서,
Vmin = 1.5·E0·R·cosθmax = Vmax·cosθmax.
따라서 θmax는 다음을 만족시킴으로써 측정된다
cosθmax = Vmin/Vmax.
이런 모델링에 따라, 국소 지점은 최고 속도의 유효 분자 수송을 가진다. 국소 수송 속도는 θmax에서 0이 될 때까지 θ의 증가와 함께 감소한다.
다른 반지름의 개별 세포가 균일한 전기장에 놓일 때, 각 세포는 다른 막투과 전위 프로파일을 가진다. Vmin 및 Vmax의 절대값은 상황에 따라 특정 변화에 영향을 받는다. 예를 들어, 지수 붕괴파 또는 정사각형파와 같은 다른 전기 펄스 모양이 사용될 때, Vmin 및 Vmax 값은 다를 수 있다. 그러나, Vmin/Vmax의 비는 아마도 이런 형태의 변형에 대해 민감하지 않다.
도 3은 어떻게 세포 크기가 유효 전기천공 표면에 영향을 미치는 지를 예시한다. 세포막은 필수적으로 일부 채널을 포함하는 막 단백질로 점선을 그은 지질 이중층이다. 동일한 형태의 세포는 비록 세포가 어느 정도까지 변하지만 유사한 막 조성물을 가진다. 따라서, Vmax 및 Vmin와 같은 막의 전기적 특성은 세포의 다른 국소 지점 상에서 그리고 동일한 형태이나 다른 크기인 세포에 대해 동일한 것으로 고려될 수 있다. 다른 세포 형태의 경우, 여러 포유류 세포는 아마도 Vmax 및 Vmin를 포함하는 유사한 막 전기 특성을 공유하는데 이는 막은 필수적으로 다른 단백질로 유사하게 점선을 그은 지질 이중층이기 때문이다.
도 3에 도시된 대로, 3개의 개별 유리 세포, 반지름 "R"을 가진 왼쪽의 큰 세포, 반지름 "r"을 가진 중앙의 중간 세포 및 오른쪽의 가장 작은 세포가 분석된다. 3개의 세포 중앙은 원이 물리적 세포 또는 막투과 전위 프로파일을 나타내도록 정렬된다. 전기장 강도는 큰 세포가 국소 지점에서 Vmax에 도달하도록 설정되며, 유효 전기천공 표면은 Vmax를 가진 국소 지점과 Vmin을 가진 외부 경계 사이에서 어둡게 된다. 큰 세포가 최적 전기천공을 얻을 때,
Vmax=1.5·E0·R은
E0=Vmax/(1.5·R)을 제공한다.
중간 세포(반지름 r<R)는 국소 지점에서 더 낮은 막투과 전위를 가질 것이다. 국소 지점에서 막투과 전위 Vtop는 다음으로 제공된다.
Vtop=1.5·E0·r=Vmax·r/R.
Vmin보다 큰 막투과 전위를 가진 중간 세포에 대한 유효 표면은
Vmin=1.5·E0·r·cosθr=Vtop·cosθr=(Vmax·r/R)·cosθr을 만족하는 아웃바운드 각 θr에 의해 정의되어
cosθr=(Vmin/Vmax)·(R/r)를 제공한다.
중간 세포 상의 유효 전기천공 표면은 큰 세포의 유효 전기천공 표면보다 더 작으며 Vtop을 가진 국소 지점과 Vmin을 가진 외부 경계 사이에서 어둡게 된다. r/R=Vmin/Vmax일 때, cosθr는 1이 되고 유효 표면은 0으로 감소한다. 따라서 유효 전기천공을 얻기 위한 세포의 최소 반지름은
rmin=(Vmin/Vmax)·R이다.
rmin미만의 반지름을 가진 오른쪽에 나타낸 작은 세포는 Vmin에 도달하는 어떠한 점도 갖지 않을 수 있고 유효 전기천공 표면이 없다.
따라서, 세포 크기는 전기천공에서 중요한 인자이다. 더 큰 세포는 국소 지점에 더 높은 막투과 전위를 가질 뿐만 아니라 더 큰 유효 면적을 가진다. 더 높은 전기장이 가해져서 더 작은 세포의 막투과 전위가 Vmax에 도달할 수 있을 때, 더 큰 세포는 생존할 수 없을 것이다. 세포 크기의 차이는 피할 수 없으며 전기천공에서 세포 특성의 일부 이종성의 원인이 된다. 예를 들어, 세포 집단의 95%가 정상(가우시안) 분포를 가진 약 20%의 반지름 변화를 가지며, Vmin/Vmax(즉, rmin/R)은 약 90%이며, 약 10%의 반지름 변화의 범위 내의 세포들만 효과적으로 천공될 수 있다. 가우시안 분포를 기초로, 중간크기 세포가 전기천공될 때 최고 이론적 전기천공 효율은 약 67.3%이다. 더 큰 분자의 경우, Vmin/Vmax(즉, rmin/R)은 약 95%이며, 최고 이론적 전기천공 효율은 약 37.6%가 된다.
세포 크기 문제는 또한 다른 세포 형태로 확장된다. 여러 형태의 포유류 세포는 유사한 Vmin 및 Vmax를 가질 것이기 때문에, 더 작은 크기의 세포 형태는 Vmin에 도달하는데 훨씬 더 높은 전기장 세기를 필요로 하며 주로 열, 자유 라디칼, 기체 및 금속 이온과 같은 높은 전류와 관련된 독성이 세포가 효과적으로 천공되기 전에 세포를 비가역적으로 손상시킬 수 있다. 세포 크기는 쉽게 변할 수 없어서, 세포 크기의 변화성을 고려하는 전기천공 방법이 바람직하나 현재는 사용할 수 없다.
개별 이상적 세포의 막투과 전위의 상기 분석은 세포 전기천공을 이해하기 위한 기초를 규정한다. 전기천공에서, 약 106 내지 107의 큰 세포 숫자를 사용하는 것이 주로 바람직하다. 세포는 또한 주로 두 가지 이유: i) 높은 농도의 표적 물질을 전달되게 하도록, ii) 더 작은 샘플 부피는 더 적은 에너지를 필요로 하며 따라서 펄스 발생기는 제조하기 더 쉽다는 이유 때문에 작은 부피로 밀집된다.
0.2ml 배지에 현탁된 천만 세포에 의한 통상적인 전기천공에서, 각 세포는 20,000 입방 마이크론(㎛3)의 평균 배지 공간을 차지한다. 각 세포는 통상적인 포유류 세포의 지름보다 훨씬 더 크기 않은 약 27㎛의 측면 길이를 가진 입방체와 동일한 공간을 차지한다. 따라서 통상적인 전기천공에서, 세포들 사이의 평균 거리는 대부분의 포유류 세포의 세포 지름에 필적할 수 있는데, 즉 세포들은 서로 매우 가까울 수 있다.
식(I)은 단일 유리 세포가 균일한 전기장에 놓일 때에만 유효하다. 식(I)은 적은 수의 세포들이 이들 사이에 세포 지름을 훨씬 초과하는 거리로 균일한 전기장에 놓일 때 대략 적용될 수 있다. 세포가 밀집되는 전기천공에서, 각 세포를 둘러싸는 전기장은 이런 세포 자체 및 근처의 다른 세포에 의해 모양이 만들어진다. 고유 막 특성 Vmin 및 Vmax가 여전히 동일한 반면, 식(I)은 소정의 지점에서 막투과 전위를 계산하기 위해 더 이상 적용될 수 없다. 그 결과, 전기장의 프로파일은 매우 복잡하고 예측할 수 없다. 세포의 무작위 위치선정은 세포가 크기가 완벽하게 동일한 경우에도 세포의 전기천공 효율에 또 다른 층의 이종성을 구성한다.
따라서, 복잡한 전기장의 분석은 전기장을 더욱 잘 이해하고 전기천공 및 전기 세포 융합의 개선 방법의 설계를 촉진하기 위해 제공된다.
도 4는 동일한 크기의 세포들에 의한 대표적 세포 위치선정의 세 형태를 예시한다. 첫 번째 형태는 이웃 세포에 영향을 받지 않은 유리 세포(F)이다. 두 번째 및 세 번째 형태는 이웃 세포를 위치 선정하는 2개의 특수한 방식을 나타낸다. 첫 번째 특수한 위치선정에서, 둘 이상의 세포는 일반적인 전류 흐름의 방향을 따라 세로방향 방식으로 가깝게 정렬된다. 이런 위치선정은 세포 S1, S2 및 S3에 의해 나타내어진다. 두 번째 특수한 위치선정에서, 세포들은 일반적인 전류 흐름의 방향에 실질적으로 직각인 단평면 상에 가로방향으로 가깝게 정렬된다. 이런 위치선정은 세포 E1, E2 및 E3에 의해 나타내어진다. 이런 세포들 상에서 막투과 전위의 정확한 식을 유추하는 것은 더욱 복잡한 반면, 전기천공의 개선된 방법을 개발하기 위한 적절하게 충분한 방식으로 정량 분석이 실행될 수 있다.
도 4에 도시된 대로, S1, S2 및 S3는 가깝게 정렬되며 전류의 흐름을 유리 세포 F 이상으로 현저하게 차단하고 전환시키지 않는다. 따라서, 단지 S1 및 S3가 세포 F의 막투과 전위 프로파일과 유사한 국소 표면상의 막투과 전위 프로파일을 가진다. 또한, 전류의 S1 세포 하류의 단지 국소 표면(도 4에서 어두운 영역)이 음으로 하전된 분자의 전기천공에 효과적일 수 있다. S3 세포는 전류의 방향이 역전되는 경우 음으로 하전된 분자의 전기천공을 위한 S1 세포와 같을 수 있다. S2 세포는 S1 및 S3 세포로부터의 차단 효과 때문에 더 낮은 막투과 전위를 가질 것이다. 다음 세포가 전기천공되는 것을 차단하는 선두 세포의 효과는 세로방향 차단 효과로 정의된다. 세로방향 차단 효과는 세포들 사이의 거리가 증가하거나 정렬이 엄격한 세로방향 배향으로부터 벗어날 때 덜 두드러지게 된다. 따라서 세로방향 정렬은 여러 차단 세포를 위한 전기천공의 효율을 증가시킴으로써 전기천공의 바람직하지 않은 이종성의 수준을 시작한다.
반대로, 세포 E1, E2 및 E3는 전체적으로 전류의 흐름을 차단하고 제한하는데 훨씬 큰 효과를 발휘한다. 그 결과, E1, E2 및 E3는 이들이 더 큰 개별 세포를 형성했을 때와 같이 세포 F의 막투과 전위보다 더 높은 막투과 전위를 가질 것이다. 가로로 정렬된 세포는 막투과 전위 식(I)을 더 이상 따르지 않을 것이다. 세포의 평면 근처에 적은 전체 전류가 있기 때문에, 막투과 전위는 유리 개별 세포의 막투과 전위보다 더욱 점진적으로 국소 지점으로부터 감소할 것이다. 정성적 설명으로, E1, E2 및 E3 세포의 각각은 비록 유효 표면의 모양은 다소 불규칙하게 될 수 있지만, Vmax 및 Vmin의 지점 사이에 전기천공의 강화된 효과 때문에 F 세포보다 더 큰 유효 전기천공 표면을 가질 것이다.
3차원 등고선 지도는 E1, E2 및 E3 상의 실제 유효 전기천공 표면을 더욱 정확하게 기술하는 반면, 도 4에 사용된 2차원 음영은 증가된 유효 표면적을 대략 예시하는데 충분하다. 서로의 전기천공 접근성을 증가시키는 가로방향으로 정렬된 세포의 효과는 가로방향 증가 효과로서 정의된다. 가로방향 증가 효과는 세포들 사이의 거리가 증가하거나 세포가 단평면 위치선정으로부터 벗어날 때 덜 두드러지게 된다. 종합적으로, 이런 세포는 다음과 같이 표시된 전류 방향에서 전기천공 접근성에 대해 평가될 수 있다:
E2, E1, E3 > S1, F > S2, S3
세포 현탁액에서 실행된 통상적인 전기천공에서, 복잡한 세포 대 세포 전기 상호작용은 3가지 주요 항목으로 특징이 묘사될 수 있다: 세로방향 차단, 가로방향 증가 및 세로방향 차단 및 세로방향 증가의 혼성 상호작용. 혼성 상호작용은 주로 세로방향이거나 주로 가로방향이 아닌 위치에서 이웃 세포들 사이에 있으며 이런 상호작용은 더 적은 차단 또는 증가 효과를 가진다. 정성 분석은 세로방향 차단은 높은 효율의 전기천공을 성취하는데 주로 바람직하지 않다는 것을 나타내었다. 세포 현탁액에서 세로방향 차단의 효과는 피하기 어렵다. 전류의 방향을 교대로 바꾸면 전기천공의 증가된 효과를 위한 세로방향 정렬 세포들의 두 국소 표면을 제공할 수 있다. 가로방향 증가 효과는 전기천공에 유익하며 특히 Vmin에 도달하기 위해 유해하게 높은 전기장 세기를 필요로 하는 작은 크기의 다른 세포 형태에 특히 도움이 된다.
이런 이해를 기초로, 전기천공 동안 바람직하지 않은 세로방향 차단 효과를 제거 또는 감소시키고 가로방향 증가 효과를 최대화하는 것이 바람직하다.
도 1a로 되돌아가서, 세포가 전기장을 가로질러 조밀한 단층(11)에 머무를 때, 세로방향 차단 효과는 기하학적으로 제거되고 가로방향 증가 효과는 세포들 사이에서 증가한다.
도 1a에 도시된 대로, 절연체 챔버(14), 제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)은 샘플 용기(10) 내의 상부 배지층(13) 및 하부 배지층(12)을 밀봉하여 샘플이 새지 않을 것이다. 용기(10)는 다른 형태일 수 있다. 예를 들어, 용기(10)는 원통 또는 비-원통일 수 있다.
샘플 용기(10)에 사용된 절연체 챔버(14)는 플라스틱, 고무, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리이미드, 폴리다이메틸실록산, 사이클릭 올레핀 코폴리머, 열가소성 폴리에스터 엘라스토머, 유리, 석영 및 실리콘과 같은 비 전도성 재료로 제조될 수 있다. 절연체 챔버(14)는 하나 이상의 형태의 재료로 제조될 수 있어서 강하고 전극에 단단하게 일치될 수 있다.
제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)은 알루미늄, 철, 강, 니켈, 티타늄, 아연, 구리, 주석, 은, 흑연 및 합금과 같은 전도성 재료로 제조될 수 있다. 이들은 또한 금박 금속, 표면-변형 금속 또는 전도성 재료로 코팅되거나 서로 혼합된 고무 또는 플라스틱과 같은 비 전도성 재료로 제조될 수 있다. 제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)은 인듐-주석 산화물, 알루미늄-도핑 아연 산화물 및 안티몬-도핑 주석 산화물과 같은 재료를 사용하여 세포의 현미경 관찰을 위해 투명하게 만들어질 수 있다. 제 1 전극 및 제 2 전극은 다른 재료로 제조될 수 있거나 다른 모양으로 제조될 수 있다.
전극(15a)은 상부 전극일 수 있고 전극(15b)은 하부 전극일 수 있다. 두 전극(15a 및 15b) 사이의 거리는 액체의 쉬운 처리를 위해 1mm보다 크고 전달될 너무 많은 표적 물질이 소비되는 것을 피하도록 50mm 미만이 바람직하다. 한 실시태양에서, 두 전극(15a 및 15b) 사이의 거리는 시약의 쉬운 처리 및 보존을 위해 1mm 내지 30mm 범위이다. 전극판(15a 및 15b)의 모양과 치수는 용기(10)의 모양과 치수에 따라 결정될 수 있다. 전극(15a 및 15b)을 만들기 위해 금 또는 백금과 같은 귀금속을 사용하는 것은 주로 필수적이지 않다. 그러나, 금과 백금과 같은 귀하고 불활성인 금속은 비용이 문제가 되지 않거나 용기가 재사용할 필요가 있을 때 전극(15a 및 15b)을 제조하는데 사용될 수 있다.
펄스 발생기(18)는 생물학적 세포의 전기천공을 위한 전기 펄스를 발생시킨다. 발생기(18)는 지수 붕괴파, 정사각형파 또는 직사각형파, 고주파수 파 및 여러 파형의 조합과 같은 하나 또는 여러 다른 펄스 형태를 발생시킬 수 있다. 전기천공을 위한 펄스 형태는 세포 형태, 용기의 형태 및/또는 다른 데이터를 기초로 미리 결정될 수 있다. 따라서 펄스 발생기(18)는 전기천공을 위한 소정의 펄스 형태를 전달하도록 프로그램될 수 있다. 본 발명에서, 펄스 또는 펄스 형태는 단일 펄스 또는 여러 펄스 또는 펄스 형태로 구성된 조합 펄스를 의미할 수 있다.
조밀한 세포 단층(11)은 한 전극의 표면상에 또는 두 전극 사이의 어느 곳에 형성될 수 있다. 한 전극 바로 위에 있지 않은 세포 단층(11)을 형성하기 위해서, 세포들이 머무르도록 2개의 전도성 배지층(12 및 13) 사이에 계면이 만들어질 수 있다. 계면은 또한 전도성 배지층의 표면으로 불린다. 적절한 수의 세포를 함유하는 세포 현탁액은 하부 배지층(12)의 표면상에 놓인다. 세포 현탁액은 상부 배지층(13) 또는 다른 적절한 배지 또는 버퍼를 형성하는데 사용된 배지 또는 버퍼에 세포를 현탁함으로써 형성될 수 있다. 세포는 자연 중력 또는 인공 원심력에 의해 하부 배지층(12) 및 상부 배지층(13) 사이의 계면에 정착될 수 있다. 펄스 발생기(18)는 제 1 전극(15a) 및 제 2 전극(15b)을 통해 세포 단층에 특정 형태의 전기 펄스를 전달하며 펄싱은 세포 단층이 형성된 후 일어난다.
안정한 계면은 전기천공 동안 상부 배지층(13) 및 하부 배지층(12) 사이에 유지될 필요가 있다. 상부 배지 또는 버퍼층(13)은 주로 세포 현탁액 또는 임의의 다른 적절한 배지 또는 버퍼를 생성하는데 사용된 배지 또는 버퍼로부터 발생된다. 상부 배지층(13)에 사용된 배지 또는 버퍼는 MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크스(Hanks'), PBS 및 링거 용액과 같은 임의의 적절한 배지 또는 버퍼일 수 있다. 하부 배지 또는 버퍼층(12)은 당, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 피콜(ficoll) 함유 용액과 같은 고밀도 용액일 수 있다. 하부 배지층(12)에 사용된 배지 또는 버퍼는 상부 배지층(13)에 사용된 배지 또는 버퍼와 동일하거나 동일하지 않을 수 있는 MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크스, PBS 및 링거 용액과 같은 임의의 적절한 배지 또는 버퍼일 수 있다. 하부 배지층(12)은 또한 아가 또는 아가로스계 겔, 실리콘 겔, 폴리아크릴아마이드 겔, 콜라겐 또는 젤라틴 겔, 마트리겔, 히알루론산 겔, 알지네이트 겔, 폴리에틸렌 글리콜 겔, 메틸 셀룰로오스 또는 다른 변형 셀룰로오스계 겔, 아크릴레이트 겔, 폴리글리콜 및 프로필렌 글리콜 겔과 같은 반-고체 겔로 형성될 수 있다.
또한, 하부 배지층(12)은 배지 또는 버퍼로 흠뻑 적셔진 다공성 고체 기질로 형성될 수 있다. 고체 기질은 다공성이며 바람직하게는 친수성이어서 하부 배지층(12)의 전도성이 유지된다. 고체 기질은 실리콘, 수지, 유리 섬유, 폴리메타크릴레이트, 실리케이트, 변형 셀룰로오스, 폴리바이닐, 폴리리신, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드 및 코-폴리머와 같은 재료로 제조될 수 있다. 하부 배지층(12)을 형성하는 특정 재료는 액체 및 반고체 또는 반고체 및 고체 또는 액체 및 고체의 물리적 상태 사이에 해당할 수 있다. 하부 배지층(12)의 이런 물리적 상태는 안정한 계면이 형성될 수 있고 상부 배지층(13)과 하부 배지층(12) 사이에 유지될 수 있는 한 전기천공에 영향을 미치지 않을 것이다. 전달될 표적 분자는 상부 배지층(13) 또는 하부 배지층(12) 또는 둘 다에 있을 수 있다.
반고체 또는 고체인 하부 배지층(12)은 샘플 용기(10)에 미리 형성될 수 있다. 예를 들어, RPMI 배지와 같은 적절한 배지에서 아가로스 겔은 하부 배지층(12)을 형성할 수 있고 샘플 용기(10)에서 프리캐스트(precast)될 수 있다. 하부 배지층을 프리캐스트하기 위해서, 단단해지거나 겔이 될 수 있는 액체가 사용될 수 있거나 하부 배지층은 소정의 치수로 제조되어 샘플 용기에 놓일 수 있다.
주로, 두 배지층, 상부 배지층(13) 및 하부 배지층(12)은 전기천공을 위한 세포 단층(11)을 형성하는데 충분할 것이다. 그러나, 특정 실시태양에서, 세포가 머무르는 적어도 하나의 배지 계면이 존재하는 한 둘 이상의 전도성 배지층이 사용될 수 있다. 다른 단면적의 샘플 용기는 다른 수의 세포를 수용하도록 다른 크기를 가진 계면을 형성하도록 제조될 수 있다.
도 1c는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기를 예시한다. 도 1c에 도시된 대로, 세포 단층(11)은 전극(15b) 상에 직접 형성된다. 단층(11)을 형성하기 위해서, 적절한 배지 또는 버퍼에 적절한 수의 세포를 가진 세포 현탁액은 샘플 용기에 적재된다. 세포는 자연 중력하에서 또는 원심분리에 의해 전극(15b)에 정착되어 단층(11)을 형성한다. 이것은 필요한 전기장 세기가 낮고 및/또는 세포가 독성을 견딜 수 있을 때 적절하다.
대부분의 진핵 세포의 전기천공의 경우, 2개의 배지층(12 및 13)을 형성하는 배지 또는 버퍼는 주로 적절한 삼투압을 유지하기 위해 염을 함유한다. 배지 또는 버퍼에서 염은 배지층(12 및 13)을 전도성으로 만든다. 박테리아와 같은 매우 작은 원핵 세포의 전기천공의 경우, 때때로 물이 저 전도성 배지로서 사용되어 매우 높은 전기장 강도를 허용한다. 이 경우에, 전달될 하전된 분자는 수성 배지를 지질성 세포막보다 더욱 전도성으로 만들며 배지는 특히 세포막과 비교하여 전도성인 것으로 여전히 대략적으로 생각될 수 있다.
단층(11)을 형성하는데 사용될 세포의 숫자는 단층(11)이 위치되는 표면의 면적 및 평균 크기 세포가 차지하는 면적에 의해 정해진다. 사용될 세포 농도는 공지된 영역을 가진 다른 투명 용기에서 현미경하에서 단층(11)의 관찰, 전기 저항 측정 또는 다른 세포 숫자에 의한 전기천공 효율의 테스팅에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 버퍼에서 세포의 농도는 혈구계 또는 영상-기반 또는 유속-기반 계수 장치와 같은 계수 장치에 의해 측정될 수 있다. 점유의 평균 면적 및 바람직한 전기장 강도와 같은 다른 세포의 특성은 용이한 참조를 위해 데이터베이스에 저장될 수 있다. 다른 계면 면적의 샘플 용기는 다른 세포 숫자를 수용하도록 제조될 수 있다.
세포의 둘 이상의 단층은 배지 계면 상에 조밀하게 적층될 수 있고 결과로 얻은 세포 펠렛은 여전히 전기천공될 수 있다. 이런 상황에서, 전기천공은 세포들 중에서 분자 수송의 변화가 증가함에 따라 더욱 이질적이게 될 수 있으나 세포 이중층은 예외이다. 세포 이중층에서, 교류 펄싱 계획이 사용될 때 세포의 두 단층은 여전히 매우 균일한 전기천공을 가질 수 있다. 본 발명에서 사용된 펠렛은 하나 이상의 조밀하게 적층된 층을 형성하는 세포의 그룹을 의미한다. 펠렛에 있는 세포는 분간할 수 있는 층을 형성하거나 형성하지 못할 수 있다.
또한 세포 펠릿으로 불리는 세포의 여러 단층은 매우 많은 세포 숫자를 필요로 하고 세포들 사이의 분자 수송의 변화가 큰 문제가 아닌 응용분야에서 편리하게 사용될 수 있다. 전기천공의 여러 단층 방법은 단층 전기천공 방법의 특수 형태 또는 확장으로 생각될 수 있다. 세포 현탁액에 의한 전통적인 전기천공과 비교하여, 전기천공의 여러 단층 방법은 효율, 세포 생존가능성 및 비용 효과에서 여전히 유리하다. 세포 단층에 대해 기술된 방법 및 장치는 다층 또는 펠렛에 있는 세포에 모두 응용가능하다.
단층 전기천공 방법은 필수 전체 전기장 강도를 실질적으로 감소시킨다. 도 5는 세포 단층(11)을 통해 흐르는 전류의 분포를 예시한다. 도 5에서, 세포 단층 주위 전류의 3차원 분포는 단순화된 2차원 표현에 의해 예시된다.
세포는 절연체와 유사하기 때문에, 조밀한 세포 단층(11)을 통과하는 전류의 대부분은 세포들 사이의 갈라진 틈을 통과할 것이다. 세포들 사이의 갈라진 틈 내의 전기장 강도만이 현탁액에서 전통적인 전기천공에 필요한 것과 유사할 것이다. 다른 위치에서, 전류는 매우 낮은 수준으로 확산된다.
단층(11) 바로 외부에, 전류 밀도 또는 전기장 강도는 매우 낮은 수준으로 확산되어서, 세포의 국소 표면 근처에 낮은 전기장(L-F)의 확대된 영역을 형성한다. L-F 영역 내에서, 단층이 조밀하고 갈라진 틈이 상대적으로 작은 한 세포 크기 및 갈라진 틈 크기의 변화와 무관하게 매우 적은 전위 변화가 존재한다. 어두운 영역은 전류의 소정의 방향에서 음으로 하전된 분자에 대한 유효 전기천공 표면을 나타낸다.
이것은 세포 생존에 유익한데 이는 갈라진 틈이 작고 더 강한 전류의 작은 영역의 효과가 빠르게 분산하기 때문이다. 세포들 사이의 갈라진 틈은 불규칙한 형태를 가질 수 있고, 따라서 갈라진 틈의 폭 또는 면적은 균일하지 않을 수 있다. 갈라진 틈의 폭은 유효 전기천공 표면 아래의 전류 통로의 평균 폭으로서 대략 정의될 수 있다.
예를 들어, 단층(11)에서 세포가 공간의 80%를 차지하고 세포들 사이에 전체 갈라진 틈 공간인 약 20%를 남길 때, 전체 전류는 동일한 용기에서 이런 세포들의 현탁액을 위한 유사한 막투과 전위를 생성하는데 필요로 하는 것의 약 20%일 수 있다. 전기 저항의 전체 증가는 적을 수 있는데, 단층(11)의 저항은 배지의 약 5 세포 깊이(20%의 역수는 5이다) 이것은 전극들 사이의 일반적인 거리와 비교하여 작다. 이것은 동일한 용기에서 전통적인 전기천공을 위해 전압의 약 20%로 전환되고 필요한 전력의 단지 약 4%(20%x20%)로 전환된다. 이런 단순화된 계산은 세포 단층은 유사한 전기천공을 성취하기 위해 현탁액에서 세포보다 훨씬 낮은 전기 에너지를 필요로 하다는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 용어 "조밀한"은 세포가 단층 영역을 차지하는 정도를 의미한다. 용어 "조밀함"은 세포에 의해 차지된 세포 단층 영역의 백분율을 의미한다. 단층(11)에 대한 합리적인 최소 실용적 조밀함은 측면 강화 효과의 이점을 이용하기 위해 약 50%일 수 있다. 층 조밀함이 증가함에 따라, 측면 증가 효과는 더욱 현저해지고 유익해진다. 더 이상의 세포가 소정의 중력 또는 원심력에서 단층 속에 일치할 수 없을 때 완전한 조밀함이 성취된다. 완전한 조밀함에서, 세포들 사이의 전체 공간은 작으나 완전히 제거될 수 없었다. 세포들이 조밀하게 배열될 때, 이들은 가소성 때문에 원형 또는 구형을 나타낼 수 없을 것이다. 단층에서 완전한 조밀함을 약간 넘어서면 효율에 작은 감소가 일어날 수 있으며, 이는 세포의 작은 부분은 서로의 상부에 놓일 수 있고 일부 바람직하지 않은 세로방향 차단 효과를 도입할 수 있기 때문이다.
현탁액에서 개별 세포와 비교하여, 조밀한 단층(11)에서 각 세포는 더 큰 유효 표면을 가질 수 있다. 유효 표면 내에서, 막투과 전위는 유리 개별 세포와 같이 가파르게 국소 지점으로부터 떨어지지 않는다. 현탁액에서 전통적인 전기천공에서, 세포는 막투과 전위 및 유효 전달 표면적 모두에서 이종성을 가진다. 그러나, 가변 크기의 세포는 조밀한 단층에서 유사한 막투과 전위를 가질 수 있다. 이것은 단층의 양쪽에서의 전체 전류가 작고 따라서 전위는 단층의 단지 바깥쪽과 실질적으로 동일하기 때문이다. 단층(11)에서 더 작은 세포는 단지 더 작은 유효 전달 표면을 가질 수 있으나, 더 큰 세포와 비교하여 거의 동일한 막투과 전위를 가질 수 있다.
단층 방법으로, 각 세포에 전달된 표적 분자의 양은 훨씬 적게 변할 수 있다. 예를 들어, 10% 세포 지름 차이는 전통적인 전기천공에서 물질 전달에 약 10보다 큰 차이를 일으킬 수 있다. 반대로, 물질 전달의 변화는 조밀한 단층 전기천공에서 약 10%일 수 있다. 국소 표면상에서 더욱 균일한 전위 프로파일 때문에, 작업 전압 범위(백분율)는 전통적인 방법에서 유사한 펄싱 계획과 비교하여 증가된다.
낮은 전력이 단층 전기천공에 사용되기 때문에, 전류 및 전극과 관련된 세포 독성의 대부분이 감소될 수 있다. 전극(15b) 상에 조밀한 단층(11)을 직접 배열하는 것은 상대적으로 단순하고 특정 버퍼에서 매우 작은 전기장 강도를 필요로 하는 세포 또는 독성을 견딜 수 있는 세포에 적합할 수 있다. 전도성 배지층(12 및 13) 사이의 계면을 사용하는 것이 유리할 수 있는데, 이는 전극(15a 및 15b)으로부터 세포를 물리적으로 떨어뜨리는 것은 세포에 대한 전기화학적 독성을 피하는 매우 효과적인 방법이기 때문이다. 전도성 배지 또는 버퍼는 용질 이온에 의해 전기를 전달하며 이는 유리 전자에 의해 통상적으로 전기를 전달하는 전극과 구별된다.
또한 더 낮은 전력이 단층 전기천공에 사용되기 때문에, 전통적인 전기천공 방법을 위한 펄스 생성기를 만드는 것과 비교하여 단층 기반 전기천공 방법을 위한 펄스 생성기(18)를 제조하는 것이 더 쉽다. 출력 전력이 낮을 때, 다른 펄스 형태를 생성하는 것이 더 쉽다. 일반적인 펄스 형태의 한 형식은 샘플에 하전된 커패시터를 방전함으로써 통상적으로 만들어진 지수 붕괴 파이다. 지수 붕괴 파는 인덕터를 샘플에 연결하여 훨씬 가파르게 만들어질 수 있어서 최초 피크 전류는 약해질 수 있다. 다른 형태의 일반적인 펄스 형태는 사각형 파 또는 직사각형 파이다. 고 주파수 파와 같은 다른 파형은 또한 원할 때 쉽게 생성될 수 있다. 한 시퀀스에서 단일 파형 또는 여러 파형이 샘플에 적용될 수 있다.
구체적인 서열의 여러 파형이 사용될 때, 이들은 동일한 방향(직류) 또는 다른 방향(교류)일 수 있다. 교류를 사용하는 것은 단지 하나 대신에 한 세포의 두 국소 표면은 분자 수송에 사용될 수 있다는 점에서 유익할 수 있다. 특히 여러 단층 펠렛에 적층된 세포의 전기천공의 경우, 교류 펄싱 계획은 도 4에 대한 설명에서 설명된 대로 세로방향 차단 효과를 완화할 수 있다. 펄스 발생기는 디지털 또는 아날로그 패널에 의해 제어될 수 있다. 또한, 펄스 발생기는 충전 배터리 또는 커패시터와 같은 에너지 저장 장치를 포함할 수 있어서, 유닛은 전원 라인으로부터 분리될 수 있고 원하는 경우 무선이 될 수 있다.
단층 방법은 다른 크기의 세포에게 유익하다. 더 작은 크기의 세포는 더욱 유리한데 이는 전통적인 전기천공에서 더 높은 전기장 강도에 대한 이들의 필요 때문이다. 단층 방법은 조혈 줄기세포, 림프 줄기 세포 및 혈액 기원의 세포와 같은 현탁액에서 통상적으로 성장되는 세포에 편리하게 적용될 수 있다.
일부 지지 물질 또는 구조상에서 주로 성장하는 점착 세포의 경우, 전기천공을 위해 일시적으로 현탁될 수 있다. 점착 세포는 기계적 분산 및 트립신 처리와 같은 일반적인 수단에 의해 지지 구조로부터 제거될 수 있다. 그런 후에 점착 세포는 적절한 배지 또는 버퍼에 현탁될 수 있고 전기천공을 위한 단층을 형성할 수 있다.
점착 세포는 또한 동일한 용기(10) 내의 두 배지층(12 및 13) 사이의 계면 상에서 배양될 수 있다. 샘플 용기(10) 내의 배양된 점착 세포는 직접 전기천공될 수 있다. 그러나, 여러 이유로 이런 전기천공의 품질을 제어하는 것이 더욱 어렵다. 첫째, 점착 세포의 세포 표면적 변화는 현탁액 세포보다 훨씬 더 크며 세포의 전기 특성은 더욱 가변적이다. 둘째, 점착 세포가 단층(11)을 균일하게 덮는 것이 어렵다. 세포는 일부 빈 지역에서 없을 수 있으며 일부 밀집된 지역에 쌓일 수 있다. 빈 지역에 가까운 세포는 증가된 전기 독성에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 전기천공 효율은 밀집된 지역에서 감소할 수 있는데 이는 일부 세포가 다른 세포의 상부에 있기 때문이다. 셋째, 전기천공은 세포가 포화상태에 이르렀으나 과다성장하지 않을 때 특정 시간 동안에만 실행될 수 있다. 그 결과, 전기천공을 실행하는 시간은 제약된다. 넷째, 결과의 재생성이 더 낮을 수 있는데 이는 세포 배양에 필요한 시간이 샘플들 사이에 변화를 가져오기 때문이다.
세포 숫자가 적은 경우, 적절한 지름을 가진 세포-모방 인공 절연체 입자 또는 인공세포가 전체 세포 숫자를 증가시키는데 사용될 수 있다. 도 6은 세포의 전기천공에서 낮은 숫자로 인공 절연체 입자의 사용을 예시한다. 절연체 입자(16)(어두움) 실제 세포(17)(개방 원)와 무작위로 혼합된다. 혼합 세포 단층(11)은 두 전도성 배지층(12 및 13)의 계면 상에 형성된다. 배지 및 세포는 절연체 챔버(14)에 함유되고 전기 펄스가 전극(15a 및 15b)을 통해 전달된다.
절연층 입자(16)는 실제 세포(17)가 하는 것과 같이 조밀한 단층(11)을 형성하는 것을 도울 수 있고 전류 흐름을 제한할 수 있다. 사용된 절연체 입자(16)의 숫자가 세포 숫자를 많이 초과할 때, 세포(17)의 정확한 숫자는 중요하지 않게 되며 절연체 입자(16)의 동일한 숫자가 세포(17)의 다른 숫자를 함유하는 샘플과 함께 사용될 수 있어서, 절차를 간소화한다.
절연체 입자(16)의 크기는 세포(17)의 크기와 유사할 수 있다. 절연체 입자(16)의 평균 지름과 세포(17)의 평균 지름 사이의 차이가 약 10 이내인 것이 바람직하다.
절연체 입자(16)는 특정한 생물학적 특성을 가진 재료로 제조되거나 코팅될 수 있어서 전기천공 이후 세포(17)와 남겨질 수 있다. 절연체 입자(16)는 또한 자성을 가진 재료로 제조될 수 있어서 자성 방법에 의해 분리될 수 있다. 절연체 입자(16)를 세포(17)로부터 분리하는 다른 방법은 침전 작용의 다른 속도 또는 다른 밀도를 기초로 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 인공 절연체 입자(16)는 전기 천공 이후 쉬운 분리를 허용할 수 있는 세포 및 세포 생존가능성을 잃게 하거나 세포 성장을 정지시키기 위해 방사선 조사 또는 약물 처리될 수 있는 세포와 같은 다른 형태의 실제 세포일 수 있다.
도 1a에 도시된 대로 샘플 용기(10)는 개시된 실시태양과 일치하는 한 예시적 용기이다. 샘플 용기의 다른 형태가 또한 사용될 수 있다.
도 7은 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기(20)를 예시한다. 샘플 용기(20)는 고정 전극(25), 밀봉 덮개로서 작용하는 이동가능한 전극(26), 원통 절연체 챔버(21), 과량-수용 그루브(24)를 포함한다.
챔버(21)는 전극(25)을 고정하기 위한 하부 말단에 개방 그루브 및 이동가능한 전극(26)을 수용하기 위한 챔버 벽의 상부에 다른 개방 그루브를 가진다. 전극(25)의 지름은 절연체 챔버(21)의 하부 말단에 그루브의 지름보다 약간 클 수 있어서 전극(25)은 절연체 챔버(21)의 하부 말단에 생성된 장력에 의해 단단히 죄어진다. 선택적으로, 전극(25)은 접착 또는 임의의 다른 적절한 방법에 의해 용기 하부의 밀봉을 위해 절연체 챔버(21)에 고정될 수 있다.
이동가능한 전극(26)은 유연한 연결장치(23)를 통해 주요 절연 챔버(21)에 연결되는 개방 절연체 덮개(22)에 삽입될 수 있다. 덮개(22)는 주요 절연체 챔버(21)의 벽에 있는 상부 그루브에 단단하게 끼워질 수 있어서, 전극(26)이 주요 절연체 챔버(21)에서 내부 림을 덮고 샘플을 밀봉하게 한다. 공기 방울 없이 세포 단층(11)을 함유하는 배지층(12 및 13)을 견고하게 밀봉하기 위해서, 첨가될 세포 현탁액의 부피는 밀봉된 용기(20) 내의 허용된 부피보다 약간 더 클 수 있어서 적은 과량의 액체가 존재하여 완전한 밀봉을 보장한다. 전극 덮개(26)를 아래로 닫음으로써 밀려나온 과량의 액체가 주요 절연체 챔버(21)의 벽의 상부에 새겨진 과량-수용 그루브(24)로 흐를 수 있다. 전기천공 이후, 과량의 액체에 있는 세포는 전기천공되지 않았기 때문에 버려질 수 있다.
공기 방울이 없는 용기 내부의 샘플을 밀봉하는 것은 좋은 관행인 반면, 단층(11) 또는 여러 단층에서 세포의 전기천공 동안 일부 작은 공기 방울은 실제로는 허용될 수 있다. 배지에서 전체 전기장 강도는 매우 낮기 때문에, 전극(26) 근처의 공기 방울에 의한 전기장의 방해는 배지 계면 상의 세포 근처의 전기장에 단지 미미한 효과를 남길 것이다. 전통적인 개방 큐벳과 비교하여, 밀봉된 용기가 유리할 수 있는데 이는 전극 근처에 생산된 공기 방울이 압축될 수 있어서 세포 샘플에 더 적은 방해를 일으킬 수 있다. 밀봉된 용기는 일반적으로 개방된 측면 없이 샘플을 밀봉할 수 있고 용기가 다른 방향으로 회전될 때 내부의 액체 샘플이 주위로 흐르지 않을 수 있는 용기를 의미한다.
원통 챔버는 상대적으로 제조하기 쉽고 둥근 형태 전극판은 임의의 밀봉 접착제의 사용 없이도 쉽게 끼워질 수 있다. 원통 용기(20)는 변형될 수 있거나 추가 특징을 포함한다. 용기(20)의 내부 공간이 원통인 반면, 용기의 외부는 용기의 내부 형태가 유지되는 한 다른 형태일 수 있다. 원통 용기(20)는 또한 다른 치수로 제조될 수 있다. 한 실시태양에서, 전극들(25 및 26) 사이의 거리는 1mm 내지 50mm일 수 있다. 다른 실시태양에서, 전극들(25 및 26) 사이의 거리는 1mm 내지 30mm일 수 있다. 주요 절연체 챔버(21)의 내부 지름은 1mm 내지 100mm일 수 있다.
원통 용기는 제조하고 사용하기 편리한 반면, 단층 전기천공을 위한 용기(20)는 세포가 배지 계면 또는 전극(25) 상에 단층을 형성할 수 있는 한 임의의 적절한 형태를 사용할 수 있다. 예를 들어, 직사각형 용기 또는 다른 형태를 가진 용기가 적합할 수 있다. 스냅-온 밀폐 장치 또는 다른 밀폐 장치가 직사각형 용기 상에 사용될 수 있다.
도 7에 도시된 대로, 밀봉 덮개는 절연체 덮개(22)에 의해 둘러싸인 전극(26)을 포함한다. 다른 형태의 밀봉 덮개가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 스냅-온 또는 스크루-온 밀폐 장치를 가진 적절한 형태의 전도성 전극(26)일 수 있다.
절연체 덮개(22)는 샘플 용기(20)를 밀폐하도록 스냅 온 될 수 있다. 잠금 구조는 단단한 폐쇄를 보장하도록 사용될 수 있다. 스크루-온 형태 밀폐 장치와 같은 다른 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 스크루 나사산은 단단한 폐쇄를 위한 개방 절연체 덮개(22) 및 주요 절연체 챔버(21)에 만들어질 수 있다. 덮개(22)는 도 7에 도시된 대로 주요 챔버(21)의 내부 림에 단단히 끼워질 수 있거나 외부 림에 의해 주요 챔버(21)에 끼워질 수 있다. 선택적으로, 유연한 연결장치(23)는 또한 덮개(22)의 편리한 폐쇄를 위해 포함될 수 있다.
예시적 샘플 용기(20)의 이런 구성요소의 각각에, 편리한 처리를 위한 표시 또는 핸들일 수 있다. 절연체 챔버(21)는 절연체 챔버(14)를 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다. 전극(25 및 26)은 전극(15a 및 15b)을 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 개방 구조를 가진 샘플 용기를 고려한다. 도 8은 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기(30)를 예시한다. 도 8에 도시된 대로, 샘플 용기(30)는 절연체 챔버(34), 하부 전극(35), 조화되는 금속 커넥터(37)를 가진 메시-형태 전극(36) 및 밀봉 덮개(39)를 포함한다.
도 8에 도시된 대로, 세포는 하부 배지층(12) 및 상부 배지층(13) 사이의 계면 상에 단층(11) 또는 여러 단층을 형성한다. 배지 및 세포는 용기(30)의 절연체 챔버(34)에 함유된다. 하부 전극(35)은 절연체 챔버(34)의 하부 말단에 있는 그루브에 고정된다. 용기(30)는 직사각형과 같은 임의의 적절한 형태를 가질 수 있다. 용기는 여러 샘플의 처리를 위한 어레이로 배열될 수 있다.
조화되는 금속 커넥터(37)를 가진 메시-형태 전극(36)은 절연체 챔버(34)의 벽의 상부에 있는 그루브에 삽입된다. 메시 전극(36)은 세포의 자유로운 통과를 허용할 수 있고 세포의 전기천공을 위한 상부 배지층(13)에 가라앉는다. 메시 전극(36)은 세포 현탁액의 첨가 이전 또는 이후 삽입될 수 있다. 또한, 메시 전극(36)은 용기(30)에 고정될 수 있거나 용기(30)에 제거가능하게 부착될 수 있다. 메시 전극(36)은 용기(30)에 끼워질 수 있도록 용기(30)의 동일한 형태를 가진다. 예를 들어, 메시 전극(36)은 용기(30)가 직사각형일 때 직사각형이다.
개방 구조 용기(30)는 필요한 경우 상부에 밀봉 덮개(39)에 의해 추가로 보호될 수 있다. 밀봉 덮개(39)는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 세포는 메시 전극(36)을 제거한 후 또는 메시 전극(36)의 존재하에서 제거될 수 있다.
절연체 챔버(34)는 절연체 챔버(11)를 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다. 전극(35 및 36) 및 커넥터(37)은 전극(15a 및 15b)을 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 고정된 전극 및 분리된 추가 덮개를 가진 샘플 용기를 고려한다. 도 9a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기(40)를 예시한다. 도 9a에 도시된 대로, 용기(40)는 용기(40) 내에 절연체 챔버(44), 제 1 고정 전극(45a), 제 2 고정 전극(45b) 및 미리-형성된 반-고체 또는 흠뻑 젖은 고체 하부 배지층(12)을 포함한다.
절연체 챔버(44)는 절연체 챔버(14)를 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다. 전극(45a 및 45b)은 전극(15a 및 15b)을 제조하는 재료와 유사한 재료로 제조될 수 있다.
도 9a에 도시된 대로, 세포 현탁액은 용기가 수직으로 놓일 때, 배지 계면이 수직일 때 하부 배지층(12) 및 제 1 전극(45a) 사이의 간격을 채운다. 그런 후에 용기(40)는 즉시 평평해져서 배지 계면은 수평이 되며 세포는 하부 배지층(12)과 상부 배지층(13) 사이의 계면 상에 자리 잡은 단층(11)을 형성한다. 세포 현탁액은 액체의 자연 표면 장력에 의해 양쪽이 개방된 용기(40)에 한정되며 세포는 강한 원심력이 아닌 중력에 의해 가라앉을 수 있다.
도 9b는 이동가능한 절연체 덮개를 가진 용기(40)를 도시한다. 절연체 덮개(48)는 용기(40) 내부의 하부 배지층(12) 및 상부 배지층(13)의 개방 면을 밀봉한다. 고정된 전극 및 이동가능한 절연체 덮개를 가진 용기(40)는 원심력이 가해질 때 유용할 수 있다. 본 발명에서, 이동가능한 덮개는 샘플 용기의 절연체 챔버의 덮개 또는 이동가능한 부분으로서 작용하는 이동가능한 전극을 의미할 수 있다.
세포를 조밀한 단층 속에 배열하기 위해서, 바람직하게는 적절한 숫자의 세포를 함유하는 세포 현탁액이 하부 배지층(12)의 상부에 놓인다. 세포는 자연 중력 또는 인공 원심력하에서 하부 배지층(12)과 상부 배지층(13) 사이의 계면 상에 자리 잡을 수 있다. 선택적으로, 더 높은 밀도를 가진 하부 배지가 세포 현탁액에 첨가될 수 있다. 하부 배지층(12), 상부 배지층(13) 및 세포 단층(11)은 자연 중력 또는 인공 원심력하에서 형성될 수 있다. 세포를 자연 중력에 의해 계면에 침전시키는 것이 간단하고 비용이 적게 든다. 다른 한편으론, 중력보다 큰 인공 원심력에 의해, 세포 단층 또는 여러-단층 펠렛이 더욱 빠르고 더욱 조밀하게 형성될 수 있다.
도 10은 세포의 조밀한 세포 단층 또는 여러 단층을 제조하는데 원심분리의 사용을 예시한다. 두 전극(15a 및 15b) 및 절연체 챔버(14)를 가진 예시적 샘플 용기(10)가 두 배지층(12 및 13) 및 세포 단층(11)을 고정하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 샘플 용기(10)가 적절한 균형으로 하나의 로터에 놓일 수 있다. 용기(20, 30 또는 40)와 같은 다른 예시적 샘플 용기가 또한 원심분리에 사용될 수 있다.
개시된 실시태양과 일치하는 예시적 원심분리기(50)가 도 10에 도시된다. 원심분리기(50)는 제 1 금속 지지체(55), 제 2 금속 조각(56), 회전축(58), 전기 브러쉬(59a 및 59b) 및 적절한 인-로터(in-rotor) 배선을 포함한다. 도 10의 점선은 각 시도에서 전기천공될 샘플의 숫자 및 배선의 다른 방법의 선택사항을 고려하여 실제 배선의 융통성을 나타낸다. 도 10의 여러 샘플 용기는 로터에 있는 여러 샘플 용기 또는 움직이는 한 샘플 용기로 해석될 수 있다. 전기 펄스 발생기(54)는 소정의 펄스를 생산하며 펄스는 샘플 용기에 전달된다. 펄스 발생기(54)는 고정 유닛 또는 로터와 회전하고 움직이는 동안 펄스를 생산하는 인-로터 회로일 수 있다.
제 1 금속 지지체(55)는 용기를 로터에 유지시키며 하부 전극(15b)과 전기 컨택을 만든다. 제 2 금속 조각(56)은 원심력에 의해 상부 전극(15a)으로 압착되어 전기 컨택을 만든다. 금속 조각(55 및 56)이 샘플 용기(10)와 접촉하는 2개의 접점은 회전축(58) 상의 전기 브러쉬(59a 및 59b)를 통해 그룹으로 또는 개별적으로 회전축(58)에 전선으로 연결될 수 있다. 인-로터 회로(54)가 사용될 때, 금속 조각(55 및 56)이 인-로터 회로(54)에 전선으로 연결될 수 있다. 따라서 두 금속 조각(55 및 56)은 전기 펄스를 샘플 용기(10)에 전달하는 도체로서 작용한다.
원심분리기(50)는 스윙-버킷 원심분리기 또는 고정-로터 원심분리기일 수 있다. 원심분리 동안, 배지 계면 또는 세포 단층(10)은 속이 빈 화살표(57)에 의해 표시된 대로 회전 팔 또는 원심력의 방향에 실질적으로 수직이다. 적절한 각도는 회전 팔에 거의 수직인 전기천공 용기에 배지 계면을 위치시키는 자가-조절 스윙-버킷 로터 또는 고정-각도 로터에서 쉽게 성취될 수 있다. 고정-각도 로터를 위한 회전축(58)은 수직 또는 수평일 수 있다. 회전축(58)이 수평일 때, 배지 계면은 회전 팔에 실질적으로 수직일 필요가 있다.
원심력은 회전 반경 및 각속도의 제곱에 비례한다. 수 센티미터 내지 수 데시미터의 전형적인 회전 반경의 경우, 수백 rpm(분당 회전수) 내지 수천 rpm의 회전 속도는 대부분의 진핵 세포가 세포 단층을 형성하는데 충분하다. 다른 rpm 숫자가 또한 사용될 수 있다. 박테리아와 같은 작은 원핵세포의 경우, 수천 rpm의 회전 속도가 필요할 수 있다. 원심분리에 필요한 시간은 초 내지 분일 수 있다. 회전의 가속은 부드럽게 이루어질 수 있어서, 세포는 용기에서 배지 계면 상에서 측면으로 이동하지 않는다. 배지 계면을 수직으로 위치시키는 고정-각도 로터의 경우, 회전이 즉석에서 시작되어서 현탁액에 있는 세포는 한쪽으로 가라앉지 않아서 세포 분산에 불규칙함을 일으킨다.
도 10에 도시된 대로, 금속 조각(55 및 56)은 회전축(58)에 전선이 연결되어 원심분리 동안 세포 단층(11) 상에서 세포들을 전기천공하기 위한 전기 펄스를 제공할 수 있다.
전기 펄스는 세포들이 단층(11) 또는 여러-단층 펠릿 속에 옮겨진 후 전달될 수 있다. 원심분리기(50)가 사용될 때, 전기 펄스는 원심분리 이후 또는 원심분리 동안 전달될 수 있다. 원심분리 뒤에 펄스하기 위해서, 인-로터 전기 배선 없는 일반적인 실험실 원심분리기는 로터에 전기천공 용기를 고정하기 위한 적절한 어댑터와 함께 사용될 수 있다. 그러나, 샘플 용기(10)는 펄싱 이전에 세포 단층(10) 또는 펠렛을 방해하는 것을 피하기 위해 원심분리기(10)로부터 매우 조심스럽게 꺼내질 필요가 있다. 다른 한편으론, 원심분리 동안 전기 펄스의 전달은 펄싱 조건이 더욱 신뢰할 수 있다는 점에서 유리하다.
전기 펄스의 전달 이후, 세포는 샘플 용기(10)로부터 제거될 수 있거나 전기천공을 위한 배지가 세포 유지에 적절한 경우 용기(10)에 남아있을 수 있다. 원심분리기 및 펄스 발생기는 하나의 기계 속에 통합될 수 있어서, 간편한 휴대성과 편리한 제어를 제공한다.
정지 펄스 발생기(54)에 의해, 탄소 브러쉬 또는 전기 브러쉬(59a 및 59b)가 원심분리기 로터에서 펄스 발생기로부터 샘플로 전기 펄스를 전달하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 샘플에 대한 최종 전기 펄스는 인-로터 회로(54)에 의해 생성될 수 있어서 전기 브러쉬(59a 및 59b)로부터 임의의 신호 노이즈를 피할 수 있다. 인-로터 회로(54)는 회전축(58) 근처에 제조될 수 있어서 높은 원심력에 영향을 받지 않는다. 인-로터 회로(54)가 사용될 때, 전기 브러쉬(59a 및 59b)는 전기 에너지와 제어 지시를 받아들이는데 사용될 수 있고 이들은 최종 펄스 전달 루프에 있지 않다. 무접촉 전력 전달은 또한 전기 브러쉬(59a 및 59b)로부터 신호 노이즈를 피하기 위해 자성 에너지 전달을 사용하여 성취될 수 있다. 인-로터 회로(54)가 사용될 때, 무선 라디오 신호가 로터에서 펄싱을 제어하는데 사용될 수 있다.
도 11a는 본 발명과 일치하는 예시적 용기(60)를 예시한다. 도 11a에 도시된 대로, 하부 전극(65)은 절연체 챔버(61)에 둘러싸인다. 절연 금속선(67)은 하부 전극(65)에 연결된다. 개방 덮개(62)에 의해 상자에 넣어진 상부 전극(66)은 주요 절연체 챔버(61) 상에 닫혀져 두 배지층(12 및 13) 및 세포 단층(11)을 밀봉할 수 있다. 덮개(62)는 링커(63)에 의해 주요 챔버에 연결될 수 있다. 그루브(64)는 임의의 과량의 샘플을 수용하도록 주요 절연체 챔버에 만들어질 수 있다. 전기 펄스가 전극(66 및 67)을 통해 전달된다. 이런 구성은 원심분리 동안 샘플 누수를 예방하는데 효과적일 수 있다.
도 11b는 예시적 용기(60)의 한 변형예를 예시한다. 절연체 챔버(61)는 개방된 하부를 갖도록 변형되며 구조 지지체 및 전기 커넥터로서 작용하는 확대된 하부 전극(65) 내에 놓인다. 상부 전극(66)은 절연체 챔버(61)에 끼워지며 절연체 챔버(61)에 의해 전극(65)으로부터 전기적으로 절연된다. 용기(60)의 선택적 구성은 또한 원심분리 동안 샘플 누설을 예방하는데 유용하다.
이론적으로, 로터에서 평평한 배지 계면은 다른 회전 반경 때문에 약간 불규칙한 원심력을 생산한다. 원심분리의 시간이 연장되지 않는 경우 이것은 현저한 인자가 아닐 수 있다. 실질적으로 규칙적인 세포 분포는 긴 회전 암 길이, 측면 세포 이동을 감소시키는 배지 계면 및 원심분리 이전 약간의 정착 시간을 통해 성취될 수 있다. 굽은 전극을 가진 샘플 용기가 제조될 수 있다. 굽은 배지 계면은 모든 지점에서 동일한 회전 반경을 가진 용기를 내에 형성될 수 있다. 자체 축 주위를 회전하는 완전히 원인 원통 배지 계면을 가진 용기는 모든 계면 지점 상에서 동일한 회전 반경을 이상적으로 제공할 수 있고 측면 세포 이동의 문제 없이 임의의 가속 설정을 사용할 수 있다.
도 12a는 본 발명과 일치하는 예시적 용기(70)를 예시한다. 용기(70)는 굽은 절연체 바디 및 세포 샘플의 전기천공을 위한 내부 공간을 둘러싸는 두 굽은 전극을 가진 고리 유사 형태를 가질 수 있다. 세포 단층(11)은 두 전극(75 및 76) 사이의 원통 표면에 배열될 수 있다. 도 12a는 중앙축에 수직인 용기(70)의 단면도이다. 용기(70)가 자체 중앙축을 따라 원심분리기에서 회전할 때, 단층(11)에 있는 세포는 동일한 외부 원심력을 경험할 것이다. 원심분리 동안, 단층(11)에 있는 세포는 원심분리기의 가속이 완료되고 단층이 형성된 후 지지 표면상에서 안정하게 남아있을 것이다. 도 12b는 고리를 절단하여 개방하는 단면에서 용기(70)의 다른 도면이다. 절연체 챔버(71) 및 두 전극(75 및 76)은 용기(70)의 바디를 형성한다.
세포 단층(11)은 외부 전극(75)의 표면상에 원심력하에서 직접 배열될 수 있다. 선택적으로, 전도성 배지층(12)은 세포 단층(11)이 전극과 직접 접촉하는 것을 막는데 사용될 수 있다. 세포는 원심분리 전에 배지(13)에 먼저 현탁될 수 있다. 적절한 인-로터 배선을 가진 도 10에 기술된 원심분리기(50)와 같은 원심분리기가 원심분리 동안 전기천공을 실행하는데 사용될 수 있다. 전극(75 및 76)은 인-로터 배선 및 전기 브러쉬를 통해 펄스 생성기에 연결될 수 있다. 적절한 상자에 들어간 절연체 챔버를 갖춘 용기(70)의 고리 부분이 또한 사용될 수 있다. 선택적으로, 굽은 전극 및/또는 굽은 배지 표면이 용기(10, 20, 30, 40 또는 60)와 같은 용기에 사용될 수 있다. 본 발명에서, 전극 또는 전도성 배지층의 표면은 평평하나 평평하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명은 전기 세포 융합에 사용될 수 있다. 전기 세포 융합이 전기천공의 목적일 때, 대략 두 세포 단층을 가진 이중-단층 구성이 전기천공에 사용된 샘플 용기와 유사한, 예시적 샘플 용기(10, 20, 30, 40, 60 또는 70)와 같은 샘플 용기에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 각 층은 한 형태의 세포를 함유하며, 융합 효과는 낮을 수 있으나 두 형태의 세포를 혼합하는 것도 허용가능하다.
이중-단층은 다른 침전 속도를 이용하여 연속적으로 또는 함께 형성될 수 있는데, 즉, 한 형태의 세포가 먼저 가라앉을 수 있고 다른 것이 그 뒤를 뒤따를 수 있다. 메시-형태 전극을 가진 용기는 다른 세포의 두 단층을 제조하는데 편리할 수 있다. 제 1 세포 현탁액이 메시 전극까지 용기에 첨가될 수 있으며 세포는 하부 배지 계면 상에 수집된다. 그런 후에 제 2 세포 현탁액이 메시 전극 위에 첨가될 수 있어서 제 1 세포 단층의 상부에 고르게 배열될 수 있다. 두 연속 단층을 제조하는 다른 가능한 방식은 계면을 형성할 수 있는 두 다른 배지에 두 세포 현탁액을 사용하는 것이며 제 2 세포 현탁액이 제 1 세포 현탁액이 이미 단층에 있은 후에 첨가될 수 있다.
적절한 버퍼에 있는 이중-단층은 적절한 전기 펄스에 의해 처리되어 세포 융합을 촉진할 수 있다. 전기 펄스의 전달은 원심분리 동안 일어날 수 있다. 전기 세포 융합 동안 세포에 전달될 표적 물질이 없기 때문에, 시약을 줄이는 것은 목표가 아니다. 따라서 세포 융합을 위한 샘플 용기는 두 전극 사이에 더 큰 거리를 가질 수 있어서 다른 세포의 두 단층을 연속적으로 만드는 것이 더 쉽다. 게다가, 세포 단층의 두 형태는 원심분리된 배지를 제거하고 추가 세포 현탁액을 첨가하는 단계를 반복함으로써 전기 세포 융합을 위한 셋 이상의 세포층을 가진 교대하는 세포층의 샌드위치를 형성할 수 있다.
도 13은 개시된 실시태양과 일치하는 전기천공의 예시적 방법(200)을 예시한다. 처음에, 세포는 현탁액(202)에 분산된다. 점착 세포의 경우, 들어 올려지고 현탁액 속으로 분산될 수 있다. 원하는 경우 세포는 세척될 수 있다. 또한, 세포 농도는 계수 방법(204)에 의해 측정될 수 있다. 적절한 수의 세포가 단층 또는 여러 단층에 이용된다. 또한, 세포 현탁액은 샘플 용기(206)에 대한 적절한 부피로 조절된다. 전달될 표적 물질은 세포 현탁액을 샘플 용기에 적재되기 전에 세포 현탁액에 포함될 수 있다. 또한, 세포 현탁액은 샘플 용기(208)에 적재된다.
샘플 용기에 세포 현탁액을 적재한 후, 세포 단층이 배열된다(210). 세포 단층이 중력 매개 자연 침전에 의해 만들어질 경우, 샘플 용기는 소정의 기긴 동안 평평한 표면에 놓일 필요가 있다. 단층을 형성하는데 필요한 시간은 실험적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 단층의 형성은 현미경하에서 관찰될 수 있다. 세포 단층이 원심분리에 의해 만들어질 경우, 샘플 용기는 원심분리기에 놓일 수 있다. 세포 단층의 형성 이후, 세포는 전기 펄스(212)에 의해 처리된다. 전기 펄스 처리는 원심분리기가 세포 단층을 형성하는데 사용되는 경우 원심분리 이후 또는 원심분리 동안 실행될 수 있다. 세포의 전기 펄스 처리 이후, 세포는 샘플 용기(214)로부터 제거된다. 전기 펄스 처리가 원심분리 동안인 경우, 원심분리기는 세포의 제거 이전 정지된다. 전기 세포 융합의 경우, 세포 이중-단층을 제조하는데 추가 단계가 있을 수 있으며 버퍼 및 전기 펄스는 물질 전달을 위해서 통상적으로 사용된 것과 다를 수 있다.
본 발명은 또한 세포 현탁액에서 전기천공에 응용가능할 수 있다. 도 14a는 개시된 실시태양과 일치하는 예시적 샘플 용기(80)를 예시하며, 세포 현탁액의 전기천공에 사용될 수 있다. 도 14a에 도시된 대로, 용기(80)는 원통 절연체 챔버(81), 고정된 전극(85), 밀봉 덮개로서 작용하는 이동가능한 전극(86), 개방 절연체 덮개(82) 및 과량-수용 그루브(84)를 포함한다.
절연체 챔버(81)는 고정된 전극(85)을 위한 하부 말단에 개방된 그루브를 가지며 이동가능한 전극(86)을 수용하도록 챔버(81)의 벽의 상부에 다른 개방된 그루브를 가진다. 전극(85)의 지름은 절연체 챔버(81)의 하부 말단에서 그루브의 지름보다 약간 더 클 수 있어서 전극(85)은 절연체 챔버(81)의 하부 말단에서 생성된 일부 장력에 의해 단단히 조여질 수 있다. 선택적으로 전극(85)은 접착 또는 다른 적절한 방법에 의해 용기 하부의 밀봉을 위해 절연체 챔버(81)에 고정될 수 있다.
이동가능한 전극(86)은 고정가능한 연결장치(83)를 통해 주요 절연체 챔버(81)에 연결된 개방된 절연체 덮개(82)에 삽입된다. 덮개(82)는 주요 절연체 챔버(81)의 벽에 상부 그루브를 단단하게 끼울 수 있어서, 전극(86)이 주요 절연체 챔버(81)에서 내부 림 위에 덮이게 하고 샘플을 밀봉하게 한다. 공기 방울 없이 세포 현탁액(87)을 단단히 고정하기 위해서, 첨가될 세포 현탁액의 부피는 밀봉된 용기 내의 허용된 부피보다 약간 더 클 수 있어서 적은 과량의 액체가 존재하여 완벽한 밀봉을 보장한다. 전극 덮개(86)를 아래로 닫음으로써 밀려나온 과량의 액체는 주요 절연체 챔버(81)의 벽의 상부에 새겨진 과량-수용 그루브(84)로 흐를 수 있다. 전기천공 이후, 과량의 액체에 있는 세포는 전기천공되지 않았기 때문에 버려질 수 있다. 공기 방울이 없는 용기(80) 내부의 세포 현탁액을 밀봉하는 것은 좋은 관행인 반면, 작은 공기 방울이 전극 표면의 작은 부분만을 차지하기 때문에 실제로는 허용될 수 있다.
세로 차폐 효과 및 측면 강화 효과의 이해는 또한 현탁액에서 세포의 전기천공 효율을 개선하는 것을 도울 수 있다. 더 큰 크기의 세포 형태의 경우, 이들은 효과적인 전기천공을 얻기 위해 더 낮은 전기장 강도를 필요로 하며 가까운 세포 대 세포 전기 상호작용에 의해 유발된 세포 이종성은 전기천공 효율에 유익하지 않을 수 있다. 그러나, 효과적인 전기천공을 얻기 위해 더 낮은 전기장 강도를 필요로 하는 더 작은 크기의 더욱 일반적인 세포 형태의 경우, 가까운 세포 대 세포 전기 상호작용에 의해 유발된 세포 이종성은 세포 전기천공에 매우 효과적일 수 있다.
더 작은 세포의 경우, 현탁액에서 세포 농도를 증가시키는 것은 측면 강화 효과를 증가시킬 수 있다. 동시에, 세로 차단 효과 또한 증가될 수 있다. 증가된 세로 차단 효과는 증가된 세포 강화 효과에 대한 가치있는 교환일 수 있다. 세로 차단 효과는 교류 펄싱 계획에 의해 완화될 수 있다.
세포 현탁액에서 전체 세포 부피의 바람직한 백분율은 세포의 다른 형태 사이에서 변할 수 있다. 약 5% 또는 그 이상의 전체 세포 부피 백분율이 여러 세포 형태에 바람직할 수 있다. 충분한 세포가 없을 때, 인공 절연체 입자가 단층 기초 방법에 대해 기술된 것과 유사하게 사용될 수 있다.
세포 현탁액의 개선된 전기천공의 경우, 예시적 샘플 용기(80) 또는 단층 기초 방법에 대해 기술된 것과 유사한 다른 샘플 용기가 사용될 수 있다. 세포 현탁액의 전기천공에 전용인 용기(80)는 전극(85 및 86) 사이에 더 긴 거리를 갖는 경향이 있어서 더 적은 세포가 전극의 가까운 근처 내에 존재하여 세포에 대한 전기화학적 독성을 감소시킨다. 전극(85 및 86) 사이의 거리는 3mm 내지 100mm인 것이 바람직하며 5mm 내지 50mm의 거리가 더욱 바람직하다.
용기(80)는 원통 형태일 수 있다. 용기(80)의 단면의 지름은 1mm보다 클 수 있다. 특정 실시태양에서, 용기(80)의 단면의 지름은 1 내지 20mm 범위일 수 있다. 다른 지름 값이 또한 사용될 수 있다. 용기(80)는 원통 형태 이외의 형태일 수 있다.
용기(80) 속 전극(86)과 같은 이동가능한 전극은, 특히 용기의 내부 지름이 작거나 전극 사이의 거리가 매우 길 때 절연체 챔버의 두 말단 상에 사용될 수 있다. 이런 용기(80)의 경우, 단지 하나의 이동가능한 전극으로 샘플을 적재하는 것은 불편할 수 있다. 전극 근처 세포는 현저한 전기화학적 독성에 영향을 받기 때문에, 버려질 손상된 세포의 지표로서 일부 표시가 절연체 챔버(81)에 만들어질 수 있다. 용기(80)는 또한 샘플 주사 시스템에 연결되어 용기 속으로 흐르는 세포 현탁액 샘플의 연속 처리를 가능하게 할 수 있다.
용기(80)가 전극(85 및 86) 사이에 비교적 긴 거리를 가질 때, 높은 전압이 필적할만한 전기장 강도를 유지하는데 필요할 수 있다. 더 높은 전압을 전달하는데 펄스 발생기를 필요로 하는 표면적 단점은 문제가 적을 수 있다.
예를 들어, 인간 세포주의 현탁액을 전기천공하기 위해서, 200볼트가 4mm-간격 큐벳에 있는 0.2ml 샘플에 필요로 하며 약 1000μF의 커패시터로부터 지수 방출을 가진다. 동일한 0.2ml 세포 현탁액이 2cm 전극 거리(큐벳 간격 거리의 5배)를 가진 더 긴 용기에 놓이는 경우, 필요한 전압은 1000볼트일 수 있으나, 단지 40μF의 커패시터(1000μF의 1/25)가 필요한데 이는 커패시터로부터의 전기 에너지가 다음 방정식을 따르기 때문이다
E = 0.5U2C
여기서 E는 전기 에너지이며, U는 전압이며 C는 커패시턴스이다. 따라서 고전압 펄스 발생기는 실제로 제조하기 쉬운데 이는 유사한 양의 에너지를 저장하기 위해 훨씬 더 적은 커패시터를 필요로 하기 때문이다. 유사하게는, 다른 형태의 더 높은 전압을 발생시키는 것이 어렵지 않을 수 있다.
박테리아와 같은 매우 작은 세포는 물과 같은 저-전도성 액체에서 전기천공될 20,000V/cm와 같은 매우 높은 전기장 강도를 필요로 한다. 전통적으로 박테리아 전기천공은 1mm 또는 2mm의 짧은 전극 거리를 가진 큐벳에서 실행되어 3,000V 미만의 전압이 주로 필요하다. 용기(80) 속 박테리아와 같은 매우 작은 세포를 전기천공하기 위해서, 초 고전압이 필요할 수 있다. 본 발명에 사용된 것과 같은, 초 고전압은 5,000V보다 높으며 주로 매우 작은 세포의 전기천공에 통상적으로 사용된 10,000 내지 30,000V 범위에 있는 전압을 의미한다. 수만 볼트를 전달할 수 있는 펄스 발생기는 제조하기 어렵지 않을 수 있는데, 이는 매우 낮은 커패시턴스는 초 고전압하에서 에너지를 저장할 필요가 있기 때문이다. 펄스 발생기는 재충전 배터리 또는 커패시터와 같은 에너지 저장 장치가 장착되어 무선이 되며 쉬운 이동성을 촉진할 수 있다.
더 긴 전극 거리를 가진 밀봉가능한 용기(80)는 전기 아크를 효과적으로 예방할 수 있다. 전통적인 큐벳에서, 불규칙하게 분포된 이온성 용질이 근처 두 전극을 단락하는 전류에 대한 작은 누설 영역을 형성할 수 있다. 더 긴 전극 거리를 가진 밀봉된 용기에서, 작은 누설 영역이 형성될 때에도, 한 전극으로부터 다른 전극으로 연장되어 단락을 일으키는 것은 훨씬 덜 일어날 수 있다. 전극 근처에 갇힌 작은 공기 방울이 존재할 때, 이것이 한 전극으로부터 다른 전극으로 연장되지 않기 때문에 아크를 일으키지 않을 것이다. 따라서, 더 긴 밀봉 용기(80)는 전기 아크의 형성을 억제하는데 유리할 수 있다.
더 긴 용기(80)의 다른 이점은 높은 정밀도로 용기(80)를 제조하는 것이 쉽다는 것이다. 50㎛ 거리 에러는 1mm 큐벳에 대해 5%이나, 2cm 길이 용기에 대해 단지 0.25%이다.
도 14b는 개시된 실시태양과 일치하는 세포 현탁액의 전기천공을 위한 용기(80)에서 하부 배지층(88a)의 예시적 사용을 예시한다. 도 14b에 도시된 대로, 하부 배지층(88a)은 전극(85) 상에 형성된다. 세포 현탁액(87)은 하부 배지층(88a)상에 적재된다. 세포 현탁액(87)은 펠렛(89) 속에 옮겨질 수 있다.
하부 배지층(88a)은 도 1a의 하부 배지층(12)과 같은 전기천공의 단층 방법에 사용된 것과 유사하다. 하부 배지층(88a)은 세포를 전극(85)과 물리적으로 떨어뜨린다. 다른 배지층(88b)은, 특히 용기가 세포 현탁액의 전기천공을 위한 것일 때, 상부 전극 상에 사용될 수 있어서, 세로 현탁액의 두 말단은 전극에 대한 직접 노출로부터 보호된다. 세포 현탁액(87)은 이런 용기에서 직접 전기천공될 수 있거나 현탁액에 있는 세포는 펠렛(89)에 옮겨져서 세포 농도를 증가시킬 수 있다. 세포 현탁액의 전기천공을 위한 용기(80)가 전극(85 및 86) 사이에 더 긴 거리를 갖는 반면, 세포 펠릿(89)의 전기천공에 전용인 용기(80)는 전극(85 및 86) 사이에 더 짧은 거리를 가질 수 있다. 펠렛(89)은 자연 중력 또는 원심분리에 의해 제조될 수 있다. 원심분리가 사용되는 경우, 세포 펠릿(89)의 펄싱은 원심분리기(50)에서 단층 및 여러-단층 전기천공에 대해 기술된 방법과 유사하게, 원심분리 이후 또는 원심분리 동안 일어날 수 있다. 펠렛(89)은 현탁액에서 동일한 세포의 전기천공에 필요한 것보다 더 낮은 전압에서 높은 효율과 세포와 대한 낮은 독성으로 전기천공될 수 있다. 펄스 발생기는 에너지 저장 장치가 장착되어 무선 이동성을 촉진할 수 있다. 단층 기반 전기천공에 대해 기술된 펄스 발생기 또는 펄스 형태의 변화는 또한 현탁액 또는 펠렛 속 세포의 전기천공에 적용할 수 있다. 인공 절연체 입자는 또한 세포 펠렛을 제조하는데 실제 세포와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 전기천공에서 높은 효율과 낮은 독성을 성취할 수 있는 전기천공 장치 및 방법을 개시한다. 본 발명에 따른 장치 및 방법은 다른 방법과 장치에 비해 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 장치 및 방법은 모세관 전기천공에 비해 특정한 이점을 가진다.
도 15는 예시적 모세관 지원 전기천공을 예시한다. 도 15에 도시된 대로, 전기천공은 20㎛의 내부 지름을 가진 모세관에서 실행된다. 두 세포, 세포 A 및 세포 B는 모세관 내에 위치한다. 세포 A는 18㎛을 가지며 세포 B는 16㎛의 지름을 가진다.
도 15에 도시된 대로, 세포 A와 모세관 벽 사이의 최저 거리는 1㎛이며 세포 B와 모세관 벽 사이의 최저 거리는 2㎛이다. 모세관 벽은 절연체라서 전류가 세포와 모세관 벽 사이의 간격에 한정된다. 동일한 전체 전류가 세포 A 및 세포 B 주위의 간격을 통해 흐른다.
세포 B 주위의 간격의 단면적이 세포 A 주위의 간격의 단면적의 약 2배이기 때문에, 세포 B 주위의 간격에서 전기장 강도는 A 주위의 간격에서 전기장 강도의 단지 약 절반이다. 따라서, A의 지름이 B의 지름보다 약 1/8(12.5%)이지만 간격 면적 이상의 세포 A의 막투과 전위는 세포 B의 막투과 전위의 약 2배(200%)이다. 모세관에서, 세포 A는 모세관 벽에 의한 측면 강화 효과로 이득을 얻는다. 그러나, B는 단지 약간 더 작기 때문에, B가 전기천공되는 것이 매우 어렵다. 교류 펄싱 계획에 의해서도, 세포 B는 A의 막투과 전위의 약 절반일 수 있다. 그 결과, 세포 B는 여전히 효과적으로 전기천공될 수 없다. A의 지름이 19㎛가 되고 이의 간격이 0.5㎛가 되는 경우, A의 막투과 전위는 B의 약 400%가 될 수 있어서, 모세관은 전기천공 효율에 상당량의 세포 이종성을 가져올 수 있다는 것을 암시한다.
따라서 모세관은 모세관 벽에 의한 측면 강화 효과를 사용함으로써 효과가 있다. 내부지름이 더 작을 때 효과가 있는데 이는 세포의 더 많은 부분이 더 작은 모세관의 모세관 벽의 가까운 근처 내에 위치되기 때문이다. 조밀한 단층 기초 전기천공 방법은 전기천공에서 세포 이종성을 감소시킨다. 비교에 의해, 전기천공의 모세관 방법은 전기천공에서 세포 이동성을 확대하며 이는 본질적으로 제한된다. 본 발명에 기술된 대로 현탁액 또는 펠렛에서 농축된 세포 자체에 의한 측면 강화 효과를 주로 이용하는 것은 전기천공 효율 및 비용 효과 모두에서 유리할 수 있다. 용기(80)의 변형과 같은 샘플 용기는 지름 또는 단면적이 제한되지 않기 때문에 모세관과 다르다. 용기(80)는 원하는 지름이 사용될 때 큰 부피 세포 샘플의 처리를 허용한다.
다양한 실시태양 및 첨부된 도면이 도시되고 기술된 반면, 이들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 이해된다.

Claims (15)

  1. 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치로서,
    상기 장치는
    세포를 수용하기 위한 절연체 챔버를 가진 샘플 용기로서, 샘플 용기는 전기천공을 위한 전기 연결을 제공하는 제 1 전극 및 제 2 전극을 가지는 것인 샘플 용기; 및
    용질 이온을 가지는 수용액을 함유하는 제 1 전도성 배지층으로서, 제 1 전도성 배지층은 제 1 전극과 접촉하는 한 말단 및 계면을 형성하는 다른 말단을 가지는 것인 제 1 전도성 배지층
    을 포함하고,
    제 1 전도성 배지층은 제 1 전극과 접촉하는 것으로부터 세포를 분리하고, 제 1 전도성 배지층은 세포로 용질 이온을 통하여 전기 펄스를 전도하고,
    절연체 챔버는 세포를 고정하기 위한 용기의 바디를 형성하고,
    절연체 챔버는 적어도 하나의 세포 단층을 함유하도록 구성되고,
    절연체 챔버, 제 1 전극 및 제 2 전극은 샘플 용기 내에서 제 1 전도성 배지층을 밀봉하고,
    제 1 전극 및 제 2 전극 중 적어도 하나는 이동가능한 전극이고, 전기 펄스 동안 제 1 전극 및 제 2 전극 사이에 및 절연체 챔버 내에서 세포 함유 샘플을 한정하는 밀봉 덮개로 역할하는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    절연체 챔버는 과량의 액체를 수용하기 위한 절연체 챔버 벽의 제 1 말단 상에 그루브를 가지는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    제 1 전도성 배지층은 다공성 기질에 캐스트되는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    원심분리에 의해 세포 사이에서 현탁된 세포로 적어도 하나의 세포 단층의 형성을 지원하도록 구성된 원심분리기를 더 포함하는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    회전 동안 전기천공을 위해 샘플 용기로 전기 펄스를 전달하도록 구성된 펄스 발생기를 더 포함하는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    펄스 발생기는 무선 기능을 위한 재충전 배터리를 가지는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치
  8. 제 6 항에 있어서,
    전기 펄스를 발생하기 위한 펄스 발생기는 원심분리기에 통합되는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    제 1 전도성 배지층의 계면 상에 세포로 적어도 하나의 세포 단층을 형성하기 위해 복수의 인공 절연체 입자를 더 포함하는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  10. 제 4 항에 있어서,
    다공성 기질은 아가, 아가로스계 겔, 실리콘 겔, 폴리아크릴아마이드 겔, 콜라겐, 젤라틴 겔, 마트리겔, 히알루론산 겔, 알지네이트 겔, 폴리에틸렌 글리콜 겔, 메틸 셀룰로오스, 변형 셀룰로오스계 겔, 아크릴레이트 겔, 폴리글리콜 겔, 프로필렌 글리콜 겔, 실리콘, 수지, 유리 섬유, 폴리메타크릴레이트, 실리케이트, 변형 셀룰로오스, 폴리바이닐, 폴리리신, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드 및 코-폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 생물학적 세포의 전기천공을 위한 장치.
  11. 생물학적 세포를 전기천공하는 방법으로,
    상기 방법은
    전기천공을 위한 샘플 용기를 제공하는 단계로서, 샘플 용기는 세포를 함유하기 위한 절연체 챔버를 가지고, 제 1 전극 및 제 2 전극은 전기천공을 위한 전기 연결을 제공하고, 제 1 전도성 배지층은 용질 이온을 가지는 수용액을 함유하고, 제 1 전도성 배지층은 제 1 전극과 접촉하는 한 말단 및 계면을 형성하는 다른 말단을 가지고, 여기서 절연체 챔버는 세포를 고정하기 위한 용기의 바디를 형성하고, 절연체 챔버는 적어도 하나의 세포 단층을 함유하도록 구성되고, 절연체 챔버, 제 1 전극 및 제 2 전극은 샘플 용기 내에서 제 1 전도성 배지층을 밀봉하는 것인 단계;
    제 1 전극과 접촉하는 것으로부터 세포를, 제 1 전도성 배지층에 의해, 분리하는 단계;
    사전결정된 전기 펄스로 세포를 처리하는 단계로서, 사전결정된 전기 펄스는 제 1 전도성 배지층에서 용질 이온을 통하여 세포로 전도되는 것인 단계
    를 포함하는 생물학적 세포를 전기천공하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    스냅-온 또는 스크루-온 폐쇄 메커니즘을 통하여 단단한 폐쇄에 의해 샘플 용기에서 세포 샘플을 밀봉하는 단계를 더 포함하는 생물학적 세포를 전기천공하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    세포는 자연 중력에 의해 제 1 전도성 배지층의 계면 상에서 적어도 하나의 세포 단층으로 배열되는 것인 생물학적 세포를 전기천공하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    원심분리에 의해 제 1 전도성 배지층의 계면 상에서 적어도 하나의 세포 단층으로 세포를 배열하는 단계를 더 포함하는 것인 생물학적 세포를 전기천공하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    원심분리 동안 사전결정된 전기 펄스로 세포를 처리하는 단계를 더 포함하는 생물학적 세포를 전기천공하는 방법.
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