CN110885752A - 一种间歇式流式电转染装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，第一活塞，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述管体的一端密封，所述第一活塞位于所述管体的开口处，所述第一活塞和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体液体进出口处，控制液体进出口的打开和关闭，所述第一活塞能够沿所述管体相对移动。本发明公开的流式电转染装置能够提高电转染装置的稳定性，提高电转染效率。

Description

一种间歇式流式电转染装置

技术领域

本发明涉及电转染领域，涉及一种间歇式流式电转染装置，更具体而言，本发明涉及一种通过活塞移动加压的方式抑制电转染产生气泡的间歇式流式电转染装置。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以通过微孔进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜上微孔消失，细胞膜重新成为选择性通透屏障。

与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的移动，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过微孔进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：

将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，美国专利US6773669。

中国专利CN201010242144公开了一种流式电转染装置及系统，该系统包括：流式电转染装置，其中包括：基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖；注射泵，由管道连接到所述流式电转染装置中顶盖的入口及出口控制流体的流速；电压源，由电连接件连接电极设定并产生脉冲电压。流式电转染系统利用流体通道以及相连接的注射泵来实现各种悬浮液在流体通道中的连续流动，从而使细胞被电转染的过程能够持续进行，实现快速处理大量样品。

中国专利CN201610806987公开了用于细胞的电转染的一次性用品，其包括：在所述一次性用品的内部的流体隔室；第一流体端口，其用于向所述流体隔室提供细胞悬液；以及第二流体端口，其用于将包括待被电转染到所述细胞中的至少一种化合物的流体递送至所述流体隔室；设置在所述流体隔室中的第一电极和第二电极；至少一个出口端口，其递送来自所述流体隔室的所述流体，其中所述第一流体端口和所述第二流体端口与混合通道流体连通，所述混合通道与所述流体隔室流体连通。

但是上述公开的流式电转染装置在实际电转染过程中均会产生大量气泡，产生的气泡附着在电极板上影响电场均匀性，从而导致电转染效果不稳定。发明人经过检索发现，在流式电转染领域还没有解决电转染过程产生气泡的技术问题。

发明内容

本发明是针对上述现有的技术存在的技术问题，提供了一种通过可移动的活塞加压的方式，抑制电转染过程中产生气泡的间歇式流式电转染装置。本发明的另一目的是提高电转染装置的稳定性，提高电转染的效率。

为了达到上述目的，本发明所提供的间歇式流式电转染装置的技术方案概述如下：一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，第一活塞，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述管体的一端密封，所述第一活塞位于所述管体的另一端开口处，所述第一活塞和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体液体进出口处，控制液体进出口的打开和关闭，所述第一活塞能够沿所述管体相对移动。

本发明所述提供的另一技术方案概述如下：一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，第一活塞，第二活塞，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述第一活塞和第二活塞分别位于所述管体两端的开口处，所述第一活塞、第二活塞和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体液体进出口处，控制进出口的打开和关闭，所述第一活塞和/或第二活塞能够沿所述管体相对移动。

优选，所述管体设置通气管，通气管设置通气阀门，进一步优选所述通气管与管体连接处设置通气阀门，所述通气管位于所述第一活塞和第二活塞之间，或者所述通气管位于所述第一活塞和管体的密封端之间，所述通气管的末端设置空气过滤装置；

优选，所述管体设置至少两个液体进出口，所述液体进出口既可以是液体进口，也可以是液体出口，相应的设置至少两个液体进出阀门；所述液体进出阀门既可以是液体进样单向阀，也可以是液体出样单向阀；进一步优选所述管体设置至少一个液体进口和一个液体出口，至少一个液体进样单向阀和一个液体出样单向阀；

优选，所述第一活塞和第二活塞的横截面与所述管体内部的横截面相同或接近，进一步优选所述管体内部的横截面的形状为方形，也可以设置成圆形或其它的形状；

优选，所述第一活塞和第二活塞与管体接触处设置密封装置，所述密封装置优选密封垫圈、密封胶条或其它具有密封性能的装置等；

优选，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述第一活塞和管体或第一活塞、第二活塞和管体的内部形成密闭式腔体；

优选，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述第一活塞和/或第二活塞相对管体移动后，所述密闭式腔体内部的压力值为1.0-2.5Mpa；进一步优选所述腔体内部的压力值为1.1-2.0Mpa；进一步优选所述腔体内部的压力值为1.2-1.5Mpa；

优选，所述装置还包括导管若干，分为进液管和出液管，导管与管体密封设置；

优选，所述装置还包括泵，用于使液体流出或流入腔体，或者用于排出或充入腔体内的气体，泵的种类包括但不限于蠕动泵，气泵，液泵，注射泵等；

优选，所述装置还包括使所述第一活塞和/或第二活塞能够沿所述管体相对移动的加压装置，所述加压装置的种类包括但不限于气囊、液压杆、气压杆、螺旋加压装置、电磁力加压装置等；

优选，所述第一活塞和/或第二活塞设置工作位置和非工作位置，所述活塞从非工作位置移动到工作位置，能够为腔体内部提供压力；进一步优选所述液体进出口位于所述第一活塞和第二活塞之间；进一步优选所述液体进出口位于所述第一活塞和管体的密封端之间。进一步优选所述液体进出口位于所述第一活塞和/或第二活塞设置的工作位置和非工作位置之间。

本发明所述装置的制备方法：首先制备管体，选择能够加热后固化的塑料作为管体的材料，利用制备管体的模具制备管体，在管体上分别设置液体进样口和液体出样口在管体内壁的相对两侧平行设置两片相同形状、大小的电极。在管体的两端开口处分别设置一个相对于管体端面平行的活塞，在活塞与管体接触处采用密封胶条密封，在活塞不接触腔体的一侧与加压装置连接。或者将管体的一端封端，在管体的另一端开口处设置一个相对于管体端面平行的活塞，在活塞与管体接触处采用密封胶条密封，在活塞不接触腔体的一侧与加压装置连接。

本发明技术方案带来的有益效果：

本发明的间歇式流式电转染装置能够处理大量液体样品。

本发明的间歇式流式电转染装置在电转染过程中对液体加压，抑制气泡产生，减小因气泡附着导致的电转染效率波动，提高电转染装置的稳定性。

本发明的间歇式流式电转染装置结构设计新颖，具有开创性。

附图说明

图1本发明间歇式流式电转染装置示例图；图2本发明间歇式流式电转染装置示例图；

附图注释：1-第一电极，2-第二电极，3-管体，4-进液管，5-出液管，6-加压装置，7-第一活塞，8-第二活塞，9-管体封端，10-进样单向阀，11-出样单向阀，12-通气管，13-通气阀门。

实施方式

实施例一

整体结构设计(一)

本发明提供的间歇式流式电转染装置如图1所示，将管体(3)的一端管口设置成管体封端(9)，所述第一电极(1)和第二电极(2)分别平行设置于管体(3)的内壁，所述第一活塞(7)设置于所述管体(3)的另一端管口处，所述第一活塞(7)与加压装置(6)固定连接，加压装置(6)能够将第一活塞(7)从非工作位置移动到工作位置，所述加压装置优选液压杆，使腔体内部承载的液体承受一定的压力。所述管体(3)设置通气管(12)，所述通气管(12)与管体(3)连接处设置通气阀门(13)。在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第一活塞(7)从工作位置移动到非工作位置。重复上述操作进行间歇式流式电转染。

实施例二

整体结构设计(二)

本发明提供的间歇式流式电转染装置如图2所示，所述管体(3)的两端管口设置第一活塞(7)和第二活塞(8)，所述第一电极(1)和第二电极(2)平行设置于管体的内壁，所述第一活塞(7)和第二活塞(8)设置工作位置和非工作位置，所述第一活塞和第二活塞分别与加压装置(6)固定连接，加压装置(6)优选液压杆，加压装置(6)能够将第一活塞(7)和第二活塞(8)分别从非工作位置移动到工作位置，使腔体内部的液体承受一定的压力。在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第一活塞(7)和第二活塞(8)分别从工作位置移动到非工作位置。重复上述操作进行间歇式流式电转染。

实施例三

液体间歇式进液方式和加压方式

进液时，进样单向阀(10)打开，出样单向阀(11)关闭，打开通气阀门(13)，用气泵通过通气管(12)抽出与管体(3)等体积的气体，目标液体样本从进液管(4)进入腔体内部；或者不使用气泵通过通气管(12)抽出与管体(3)等体积的气体，利用蠕动泵将目标液体样本从进液管(4)压入腔体内部；腔体充满后，关闭进样单向阀(10)和通气阀门(13)。通过加压装置(6)对第一活塞(7)和/或第二活塞(8)施加特定的压力，使其从非工作位置移动到工作位置，完成对液体的加压，液体的电转染在加压状态进行。电转染完成后，打开出样单向阀(11)与通气阀门(13)，用气泵通过通气管(12)向管体充入与腔体等体积的气体，目标液体样本从出液管(5)排出；或者不使用气泵通过通气管(12)向腔体充入与管体等体积的气体，借助重力将目标液体样本从出液管(5)排出；目标液体样本完全排出后，出样单向阀(11)关闭，进样单向阀(10)打开，并重复以上进液的动作。

实施例四

生物测定实验

收集处于对数生长期的CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，转速1000转/分离心5分钟，弃上清，用电转染缓冲液重悬细胞，使得细胞的密度为1×10⁷个/毫升，加入需要电转染转入细胞的质粒pCDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为20微克/毫升，轻柔混合均匀。

利用本发明实施例一制备得到的电转染装置进行实验，通过一套完整的蠕动泵加导管装置将混合有细胞、质粒的悬液运送到电转染装置的腔体中，利用液压杆控制第一活塞在工作位置和非工作位置移动，配合电转染仪器使用，采用如下条件进行电刺激：电压180伏特，脉冲宽度6毫秒，脉冲次数2次，脉冲间隔1秒。

对比试验为未对腔体内液体施加压力，将第一活塞保持在非工作位置，在液体填充满腔体后，直接进行电转染；

本发明技术方案的试验为对腔体内液体施加压力，在液体填充满腔体后，通过液压杆将第一活塞从非工作位置移动到工作位置，对液体进行加压，进行电转染。

电转染结束后，将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入CD-OptiCHO培养基重悬细胞，接种于三角锥形瓶内培养，培养密度2×10⁶个/ml，然后将三角锥形瓶置于摇床上培养，摇床转速125转/分钟，培养条件：温度为37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察，并用流式细胞仪检测电转染效率和细胞存活率。

通过对电转染过程的观察，对比试验在电转染过程中会在电极附近产生少量气泡，影响电转染效果；而本发明技术方案的试验在电转染过程中并无气泡产生。

通过对电转染结果对比，对比试验的电转染效率为60％-63％，细胞存活率为72％-79％；本发明技术方案试验的电转染效率为86％-89％，细胞存活率为80％-82％。实验结果表明本发明技术方案试验提供的电转染装置具有更高的电转染效率和细胞存活率。

虽然已详细描述本发明，但是在本发明的精神和范围内的修改对于本领域技术人员将是显而易见的。应当理解以上叙述的和/或在所附的权利要求书中的本发明的方面和各种实施方案的部分以及各种特征可进行组合或全部或部分进行互换。如本领域技术人员将意识到的，在前述各种实施方案的描述中，指代另一实施方案的那些实施方案可适当地与其它实施方案组合。此外，本领域普通技术人员将意识到前述描述是仅作为举例，且不意欲限制本发明。

Claims (10)

1.一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，第一活塞，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述管体的一端密封，所述第一活塞位于所述管体的另一端开口处，所述第一活塞和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体液体进出口处，控制液体进出口的打开和关闭，所述第一活塞能够沿所述管体相对移动。

2.一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，第一活塞，第二活塞，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述第一活塞和第二活塞分别位于所述管体两端的开口处，所述第一活塞、第二活塞和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体液体进出口处，控制进出口的打开和关闭，所述第一活塞和/或第二活塞能够沿所述管体相对移动。

3.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述管体设置至少两个液体进出口。

4.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述第一活塞和/或第二活塞设置工作位置和非工作位置。

5.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述管体设置通气管，通气管设置通气阀门。

6.根据权利要求5所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述通气管与管体连接处设置通气阀门。

7.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述第一活塞和第二活塞与管体接触处设置密封装置，所述密封装置优选密封垫圈、密封胶条或其它具有密封性能的装置等。

8.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述第一活塞和管体或第一活塞、第二活塞和管体的内部形成密闭式腔体。

9.根据权利要求7所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述第一活塞和/或第二活塞沿所述管体相对移动后，所述密闭式腔体内部的压力值为1.0-2.50Mpa，优选压力值为1.1-2.0Mpa。

10.根据权利要求1或2所述的间歇式流式电转染装置，其特征在于，所述装置还包括使所述第一活塞和/或第二活塞能够沿所述管体相对移动的加压装置。优选所述加压装置包括但不限于气囊、液压杆、气压杆、螺旋加压装置、电磁力加压装置等。

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