CN110872559A - 一种流式电转染装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，固定第一电极的支架，固定第二电极的支架，其特征在于，所述管体两端开口的管口处设置凹槽，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架分别设置于凹槽中，所述第一电极和第二电极的形状与所述管体中部横截面的形状相同，所述管体与第一电极和第二电极组成腔体，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架设置间隙，液体通过间隙进入和/或流出腔体。本发明的流式电转染装置必须在液体充满腔体的时候，才能够形成电转染，保证细胞进行电转染的时间相同，提高电转染效率的同时提高细胞处理量。

Description

一种流式电转染装置

技术领域

本发明涉及电转染领域，涉及一种流式电转染装置，特别是涉及一种流体浸满装置后才能进行电转染的方法。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电转染(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。当细胞膜发生电转染时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：

将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，美国专利US6773669。

在现有技术中公开的电转染设备及方法大部分不适用于处理大量的样品，也不适用于连续处理样品。也就是说，现有技术中得到的电转染室均是“静态”工作的，即：在电转染室处理完一批样品以后，需要对电转染室进行清洗、重新加入细胞等处理，才能继续下一批样品处理。在公开的技术中，电转染常常是在一次性单室样品管中进行的，其用于电转染的最大容量通常小于1毫升。在需要处理大量样品的场合中，这种技术冗长乏味，劳动强度大。研究人员在此基础上，发明了多个电转染腔并联的形式，这种技术有其优点，但却不能根本解决难以实现快速处理大量样品的困难。

本发明所要解决的技术问题是细胞液处理体积偏小的技术问题，提供了一种流式电转染装置；同时还解决了流式电转染装置难以控制处理细胞的时间相同的技术问题。

发明内容

为了达到上述目的，本发明所提供的流式电转染装置的技术方案概述如下：

本发明提供的流式电穿孔装置，所述装置包括绝缘管体，管体内部具有用于容纳目标液体样本的腔体，管体的下端设有与腔体相连通的第一电极，正下方为进液口；管体的上端设有与腔体相连通的第二电极，正上方为出液口；所述第一电极或第二电极的直径与管体内径等大；电极四周有环形间隙装置，液体样本可以绕过电极流动；电极由支架固定在管体两端。

本发明提供的流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，固定第一电极的支架，固定第二电极的支架，其特征在于，所述管体两端开口的管口处设置凹槽，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架分别设置于凹槽中，所述第一电极和第二电极的形状与所述管体中部横截面的形状相同，所述管体与第一电极和第二电极组成腔体，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架设置间隙，液体通过间隙进入和/或流出腔体。所述间歇的形状优选环形、圆形、方形等；所述支架的形状优选环形、圆形、方形等。

优选，所述管体中部横截面的形状为圆形、正方形、长方形、三角形或其它规则的多边形等，所述其它规则的多边形可以是五边形、六边形、八边形等；

优选，所述第一电极和第二电极分别通过电连接线与外部脉冲电源形成电气连接。电连接线穿过管体上设置的开孔通往管体外，电连接线与管体开孔之间由密封胶密封。所述电连接线分别固定在第一电极和第二电极背对腔体的一侧。

优选，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架分别设置卡扣，第一电极能够通过卡扣固定在固定第一电极的支架中，第二电极能够通过卡扣固定在固定第二电极的支架中。

优选，所述第一电极和第二电极的尺寸不大于所述管体中部横截面的尺寸。

优选，所述管体两端开口的管口处的横截面的尺寸不小于所述管体中部横截面的尺寸。

优选，所述装置还包括与管体连接的导管，所述导管与管体密封连接。所述密封连接采用注塑或超声焊接的方式将导管与管体连接成为一个整体。

优选，所述管体两端开口的管口处设置凹槽的外侧设置液体缓冲区域。所述液体缓冲区域可以通过与管体连接的导管的直径逐渐增加的方式实现。

优选，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架与凹槽通过螺纹方式固定、卡扣方式固定或者胶黏方式固定连接。

优选，所述装置还包括泵，包括蠕动泵，气泵等。

本发明技术方案带来的有益效果：本发明提供一种结构新颖的流式电转染装置，使电转染处理量提高数十至数百倍，满足电转染大量细胞的需求。本发明的流式电转染装置必须在液体充满腔体的时候，才能够形成电转染，保证细胞进行电转染的时间相同。本发明的流式电转染装置相比本领域常规使用的非流式电极杯处理细胞，能够在维持高电转染效率的同时提高细胞处理量。

附图说明

图1本发明的流式电转染装置整体结构示意图；

图2本发明的流式电转染装置中固定第一电极的支架；

图3本发明的流式电转染装置中第一电极的形状；

附图注释：1-管体，2-第一电极，3-第二电极，4-腔体，5-固定第一电极的支架，6-固定第二电极的支架，7-管体进液口，8-管体出液口，9-第一电极导线，10-第二电极导线。

实施方式

实施例一

本发明提供的流式电转染装置如图1-3所示，包括绝缘管体(1)，第一电极(2)，第二电极(3)，固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)，管体进液口(7)，管体出液口(8)，绝缘管体(1)两端开口的管壁处设置凹槽，所述凹槽处端面与固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)的环形端面尺寸一致，固定第一电极的支架(5)和固定第二电极的支架(6)分别通过胶黏方式固定于两端凹槽处，管体进液口(7)端面、管体出液口(8)端面与固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)的环形端面尺寸一致，管体进液口(7)、管体出液口(8)分别设置于绝缘管体(1)的两侧，绝缘管体(1)、固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)、管体进液口(7)、管体出液口(8)均选用相同的绝缘材质，各端面连接处通过密封胶密封(或者通过超声焊接实现密封)，第一电极(2)和第二电极(3)分别与固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)固定连接，电极嵌入在固定支架内部卡扣中，第一电极(2)和第二电极(3)分别通过第一电极导线(9)和第二电极导线(10)与外部脉冲电源形成电气连接，第一电极导线(9)和第二电极导线(10)穿过绝缘管体上(1)设置的开孔通往管体(1)外，第一电极导线(9)和第二电极导线(10)与管体(1)开孔之间由密封胶密封。第一电极(2)和第二电极(3)的直径与绝缘管体(1)的内径相同，固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)设置环形间隙，液体通过环形间隙进入管体(1)与第一电极(2)和第二电极(3)组成的腔体(4)。所述绝缘管体(1)、固定第一电极的支架(5)，固定第二电极的支架(6)、管体进液口(7)、管体出液口(8)可以通过模具注塑成型，将第一电极(2)和第二电极(3)分别装配到固定第一电极的支架(5)和固定第二电极的支架(6)内圈的卡扣中，将第一电极导线(9)和第二电极导线(10)穿过管体上的开孔后焊接到第一电极(2)和第二电极(3)表面，使用密封胶封住第一电极导线(9)和第二电极导线(10)与管体开孔的间隙，将装有电极的支架装到绝缘管体(1)的端面处，使用密封胶固定。

实施例二

收集处于对数生长期的293F细胞(人胚胎肾细胞，悬浮型)，转速1000转/分钟，离心5分钟，弃上清，用市场上可以购买的壹达生物EBEL电转缓冲液10毫升重悬细胞，使得细胞的密度为2.0×10⁷个/毫升，加入需要电转染转入细胞的质粒pcDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为40微克/毫升，轻柔混合均匀。

在本发明制备得到的流式电转装置中，通过一套完整的蠕动泵加软管装置将混有293F细胞、质粒pcDNA3.1-GFP的细胞悬液通过进液口端的环形间隙泵入管体，然后通过出液口端的环形间隙流出管体。

配合流式电转染仪器使用，采用如下条件进行电刺激：流速5.5毫升/分钟、电压180伏特、脉冲宽度6毫秒、脉冲次数2次、脉冲间隔1秒，进行电转。电转染结束后，将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入OptiCHO培养基重悬细胞，接种与三角锥形瓶内培养，培养密度2×10⁶/ml,然后置于摇床上培养，摇床转速125转/分钟，培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察转染效率。

实施例三

利用本发明的流式电转染装置与非流式电转染装置，使用293F细胞进行生物测定实验对比，非流式电转染装置为本领域常规使用的电极杯。

实验条件/参数：

表1

表2

实验结果对比

表3

注释：TE：转染效率；V：细胞存活率；MFI：平均荧光强度，表示单位细胞内转入的质粒的量。

实验结果分析

在电极脉宽1毫秒、次数为6次的条件下：本发明的流式电转染装置在180伏特时电转效率约85％，在210伏特时电转效率最高，约97％；而在230V时电转效率约87％。非流式电转染装置：在180伏特时电转效率约72％，之后逐渐升高；至200伏特时最高，电转效率约83％，之后至230伏特间电转效率略有下降，但相差不超过5％，电转效率趋于稳定。

由此可知，相同电转染参数条件下，非流式电转染装置的电转染效率比本发明流式电转染装置的电转染效率相差约5％；且本发明流式电转染装置所得的细胞存活率高于非流式电转染装置，本发明流式电转染装置的阳性细胞平均荧光强度高于非流式电转染装置。本发明流式电转染装置在各项性能指标均优于非流式电转染装置的同时，完成高于非流式电转染装置100倍细胞数量的电转染。

尽管已经用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，固定第一电极的支架，固定第二电极的支架，其特征在于，所述管体两端开口的管口处设置凹槽，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架分别设置于凹槽中，所述第一电极和第二电极的形状与所述管体中部横截面的形状相同，所述管体与第一电极和第二电极组成腔体，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架设置间隙，液体通过间隙进入和/或流出腔体。

2.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述管体中部横截面的形状为圆形、正方形、长方形、三角形或其它规则的多边形等。

3.根据权利要求2所述的流式电转染装置，其特征在于，所述第一电极和第二电极的尺寸不大于所述管体中部横截面的尺寸。

4.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述管体两端开口的管口处的横截面的尺寸不小于所述管体中部横截面的尺寸。

5.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述第一电极和第二电极分别通过电连接线与外部脉冲电源形成电气连接。

6.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架分别设置卡扣，第一电极能够通过卡扣固定在固定第一电极的支架中，第二电极能够通过卡扣固定在固定第二电极的支架中。

7.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述固定第一电极的支架和固定第二电极的支架与凹槽通过螺纹方式固定、卡扣方式固定或者胶黏方式连接。

8.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述装置还包括与管体连接的导管，所述导管与管体密封连接，所述密封连接优选采用注塑或超声焊接的方式。

9.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述管体两端开口的管口处设置凹槽的外侧设置液体缓冲区域。

10.根据权利要求1所述的流式电转染装置，其特征在于，所述间歇的形状优选环形、圆形、方形等；所述支架的形状优选环形、圆形、方形等。

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