CN111575181A - 一种可加压的流式电穿孔装置 - Google Patents

Abstract

本发明的可加压的流式电极管装置根据压水井的原理，提供了一种通过可移动的活塞实现自动进液并加压，抑制电穿孔过程中细胞液中气泡的产生，并有效清除积累附着在电极及管体上的死细胞等糊状物的电转染装置。

Description

一种可加压的流式电穿孔装置

技术领域

本发明涉及电穿孔领域，涉及一种可加压的流式电穿孔装置，更具体而言，本发明涉及一种通过活塞加压的方式抑制电穿孔过程产生气泡的流式电穿孔装置。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以通过微孔进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜上微孔消失，细胞膜重新成为选择性通透屏障。

与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的移动，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过微孔进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，美国专利US6773669。

中国专利CN201010242144公开了一种流式电转染装置及系统，该系统包括：流式电转染装置，其中包括：基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖；注射泵，由管道连接到所述流式电转染装置中顶盖的入口及出口控制流体的流速；电压源，由电连接件连接电极设定并产生脉冲电压。流式电转染系统利用流体通道以及相连接的注射泵来实现各种悬浮液在流体通道中的连续流动，从而使细胞被电转染的过程能够持续进行，实现快速处理大量样品。

中国专利CN201610806987公开了用于细胞的电转染的一次性用品，其包括：在所述一次性用品的内部的流体隔室；第一流体端口，其用于向所述流体隔室提供细胞悬液；以及第二流体端口，其用于将包括待被电转染到所述细胞中的至少一种化合物的流体递送至所述流体隔室；设置在所述流体隔室中的第一电极和第二电极；至少一个出口端口，其递送来自所述流体隔室的所述流体，其中所述第一流体端口和所述第二流体端口与混合通道流体连通，所述混合通道与所述流体隔室流体连通。

但是上述公开的流式电转染装置在实际电转染过程中均会产生大量气泡，产生的气泡附着在电极板上影响电场均匀性，从而导致电转染效果不稳定。发明人已经做出了一些努力，利用对电转染的液体进行加压，以克服电转染时气泡的产生，例如CN2018104939356公开了一种间歇式流式电转染装置；CN2018110783561公开了一种间歇式流式电转染装置；CN2018109939121公开了一种流式电转染装置；虽然上述专利已经取得了一定的技术效果，但是，上述专利并不对本发明产生影响。

同时发明人还发现电转染过程中，管壁上会残留糊状物，影响电场强度以及电场的均匀度，发明人经过检索发现，在流式电转染领域仍需解决电转染过程产生气泡和除去产生的糊状物的技术问题。

发明内容

本发明是针对上述现有技术存在的技术问题，根据压水井的原理，提供了一种通过可移动的活塞自动进液并加压的方式，抑制电穿孔过程中细胞液中气泡的产生，并有效除去残留在管体上的糊状物的电穿孔装置。

本发明的另一目的是提高电穿孔装置的稳定性，提高电穿孔的效率。

为了达到上述目的，本发明所提供的电穿孔装置的技术方案概述如下：

一种电穿孔装置，包括管体，第一电极，第二电极，活塞，垫片，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述管体的一端设置密封端，所述管体的另一端设置能够沿所述管体相对移动的活塞，所述活塞包括塞头和连杆，所述塞头与垫片设置固定连接，所述垫片和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进和/或出口和至少一个液体进和/或出口阀门，所述液体进和/或出口位于所述管体的密封端，所述液体进和/或出口阀门位于所述管体液体进和/或出口处。

优选，所述塞头的截面面积小于所述腔体的截面面积，进一步优选所述塞头的截面直径或边长小于所述腔体的截面直径或边长；所述塞头截面的轮廓形状与所述腔体截面的轮廓形状相同。所述塞头的材料选择硬质固体材料，所述硬质固体材料选自陶瓷、塑料等绝缘材料。

优选，所述垫片的截面面积不小于所述腔体的截面面积，进一步优选所述垫片的截面面积与所述腔体的截面面积相同，所述垫片截面的轮廓形状与所述腔体截面的轮廓形状相同。进一步优选所述垫片的截面直径或边长不小于所述腔体的截面直径或边长，进一步优选所述垫片的截面直径或边长等于所述腔体的截面直径或边长。所述垫片材料选择柔性软体材料，所述柔性软体材料为可变形不透液体的绝缘材料，选自橡胶、硅胶、塑料等。所述垫片的厚度不小于所述腔体截面面积与所述塞头截面面积的差值，进一步优选所述垫片的厚度等于所述腔体截面面积与所述塞头截面面积的差值。进一步优选所述垫片的厚度不小于所述腔体截面直径或边长与所述塞头截面直径或边长的差值，进一步优选所述垫片的厚度等于所述腔体截面直径或边长与所述塞头截面直径或边长的差值。

优选，所述塞头与垫片设置固定连接，所述固定连接是指通过化学试剂(比如粘合剂)方式连接，或所述塞头与所述垫片通过物理固定方式连接。

优选，所述第一电极和第二电极的长度小于管体的长度，所述第一电极和第二电极的一端与所述管体的密封端平齐。

优选，所述活塞设置工作位置，所述工作位置为第一电极和第二电极远离所述管体密封端的另一端，即腔体中待处理液体样品的高度与第一电极和第二电极的上端平齐时的位置。

优选，当所述液体进和/或出口阀门关闭时，所述垫片和管体的内部形成密闭式腔体。

优选，所述装置还包括使所述活塞能够沿所述管体相对移动的推拉装置，所述推拉装置与所述连杆连接；所述推拉装置包括但不限于液压杆、气压杆、螺旋推拉装置、电磁力推拉装置、人力推拉装置等。

优选，所述装置还包括导管，所述导管与液体进和/或出口密封连接。

本发明技术方案带来的有益效果：

本发明的电穿孔装置能够连续处理大量液体样品，并且能够有效的将管体残留的糊状物清除，提高电穿孔效率；

本发明的电穿孔装置在电穿孔过程中对液体加压，抑制气泡产生，减小因气泡附着导致的电场强度不均匀性，提高电穿孔装置的稳定性，从而提高电穿孔效率。

本发明的电穿孔装置将压水井的原理移植过来，结构设计新颖，能够自动进液，具有开创性。

附图说明

图1本发明电穿孔装置整体结构示例图；

图2本发明电穿孔装置液体进入腔体的示意图；

图3本发明电穿孔装置液体完全进入腔体后进行加压电穿孔的示意图；

图4本发明电穿孔装置除去电穿孔完成后的液体的示意图；

附图注释：1-阀门，2-管体密封端，3-垫片，4-塞头，5-连杆，6-第一电极，7-第二电极，8-腔体，9-管体。

实施方式

实施例一

整体结构设计(一)

本发明提供的电穿孔装置如图1所示，包括管体(9)，其中管体(9)的一端开口，另一端设置管体密封端(2)；装置还包括第一电极(6)和第二电极(7)，所述第一电极(6)和第二电极(7)的长度小于管体(9)的长度，所述第一电极(6)和第二电极(7)的一端与所述管体密封端(2)平齐；所述管体密封端(2)设置阀门(1)，用于控制液体的进出；装置还包括垫片(3)、塞头(4)和连杆(5)，所述塞头(4)与垫片(3)通过粘合剂固定连接，所述垫片(3)和管体(9)的内部具有容纳液体样本的腔体(8)，所述塞头(4)的截面直径或边长小于所述腔体(8)的截面直径或边长；所述塞头(4)截面的轮廓形状与所述腔体(8)截面的轮廓形状相同，所述塞头(4)的材料选择陶瓷；所述垫片(3)的截面直径或边长与所述腔体(8)的截面直径或边长相同，所述垫片(3)截面的轮廓形状与所述腔体(8)截面的轮廓形状相同。所述垫片材料选择橡胶。所述垫片(3)的厚度等于所述腔体(8)截面直径或边长与所述塞头(4)截面直径或边长的差值；所述连杆(5)能够上下移动塞头(4)和垫片(3)，当所述垫片(3)在随连杆(5)上下移动时，垫片(3)与腔体(8)的外壁摩擦产生与运动方向相反的形变，当垫片(3)因运动而向塞头(4)形变时，垫片(3)可填充塞头(4)和腔体(8)之间的缝隙从而使得腔体(8)形成密封的状态。

实施例二

装置的使用方法(二)

本发明提供的电穿孔装置对使用方法如图2-4所示，首先，样品进样。打开阀门(1)，推动连杆(5)使塞头(4)和垫片(3)于管体密封端(2)；通过移液枪向塞头(4)和垫片(3)上方添加待处理液体样品；关闭阀门(1)，拉动连杆(5)使塞头(4)和垫片(3)向远离管体密封端(2)的工作位置移动，此时腔体(8)内气压小于外界气压，垫片(3)向腔体(8)一侧发生变形，如图2所示，塞头(4)和垫片(3)上方添加的待处理液体样品受气压影响从垫片(3)和管壁的缝隙中进入腔体(8)。

当腔体(8)中待处理液体样品的高度与第一电极(6)和第二电极(7)的上端平齐时，即为活塞工作位置，如图3所示，推动连杆(5)，垫片(3)向塞头(4)一侧发生变形，所述垫片(3)填充塞头(4)和腔体(8)之间的缝隙使得腔体(8)形成密封，同时通过推动连杆(5)给充满液体的腔体(8)加压。

加压的同时进行电穿孔，电穿孔完成后，如图4，打开阀门(1)，推动连杆(5)使塞头(4)和垫片(3)于管体密封端(2)，处理完的液体样品被排出腔体(8)。重复以上操作再次处理样品。

实施例三

生物测定实验

收集处于对数生长期的CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，转速1000转/分离心5分钟，弃上清，用电转染缓冲液重悬细胞，使得细胞的密度为1×10⁷个/毫升，加入需要电转染转入细胞的质粒pCDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为20微克/毫升，轻柔混合均匀。

利用本发明实施例一制备得到的电转染装置进行实验，利用液压杆控制活塞在工作位置和非工作位置移动，配合电转染仪器使用，采用如下条件进行电刺激：电压180伏特，脉冲宽度6毫秒，脉冲次数2次，脉冲间隔1秒。

对比试验为在液体填充腔体至活塞工作位置，未对腔体内液体施加压力，直接进行电转染。

本发明技术方案的试验为在液体填充腔体至活塞工作位置，对腔体内液体施加压力后，进行电转染。

电转染结束后，将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入CD-OptiCHO培养基重悬细胞，接种于三角锥形瓶内培养，培养密度2×10⁶个/毫升，然后将三角锥形瓶置于摇床上培养，摇床转速125转/分钟，培养条件：温度为37摄氏度，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察，并用流式细胞仪检测电转染效率和细胞存活率。

通过对电转染过程的观察，对比试验在电转染过程中会在电极附近产生少量气泡，影响电转染效果；而本发明技术方案的试验在电转染过程中并无气泡产生。

通过对电转染结果对比，对比试验的电转染效率为60％-62％，细胞存活率为81％-86％；本发明技术方案试验的电转染效率为86％-88％，细胞存活率为82％-84％。实验结果表明本发明技术方案试验提供的电转染装置具有更高的电转染效率。

虽然已详细描述本发明，但是在本发明的精神和范围内的修改对于本领域技术人员将是显而易见的。应当理解以上叙述的和/或在所附的权利要求书中的本发明的方面和各种实施方案的部分以及各种特征可进行组合或全部或部分进行互换。如本领域技术人员将意识到的，在前述各种实施方案的描述中，指代另一实施方案的那些实施方案可适当地与其它实施方案组合。此外，本领域普通技术人员将意识到前述描述是仅作为举例，且不意欲限制本发明。

Claims (10)

1.一种电穿孔装置，包括管体，第一电极，第二电极，活塞，垫片，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行置于所述管体的内壁，所述管体的一端设置密封端，所述管体的另一端设置能够沿所述管体相对移动的活塞，所述活塞包括塞头和连杆，所述塞头与垫片设置固定连接，所述垫片和管体的内部具有容纳液体样本的腔体，所述管体设置至少一个液体进和/或出口和至少一个液体进和/或出口阀门，所述液体进和/或出口位于所述管体的密封端，所述液体进和/或出口阀门位于所述管体液体进和/或出口处。

2.根据权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述塞头的截面面积小于所述腔体的截面面积。

3.根据权利要求2所述的电穿孔装置，其特征在于，所述垫片的截面面积不小于所述腔体的截面面积。

4.根据权利要求3所述的电穿孔装置，其特征在于，所述垫片的截面形状与所述腔体的截面形状相同。

5.根据权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述垫片材料选择柔性材料，优选所述柔性材料选自橡胶、硅胶、塑料等。

6.根据权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述塞头材料选择硬质材料，优选所述硬质材料选自陶瓷、塑料等。

7.根据权利要求3所述的电穿孔装置，其特征在于，所述垫片的厚度不小于所述腔体截面直径或边长与所述塞头截面直径或边长的差值。

8.根据权利要求7所述的电穿孔装置，其特征在于，所述垫片的厚度等于所述腔体截面直径或边长与所述塞头截面直径或边长的差值。

9.根据权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，所述第一电极和第二电极的长度小于管体的长度。

10.根据权利要求1所述的电穿孔装置，其特征在于，当所述液体进和/或出口阀门关闭时，所述垫片和管体的内部形成密闭式腔体。

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