JP2016506239A - 新規な細胞株スクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、組換えタンパク質生産のためのスクリーニングに有用な新規の細胞株開発方法を提供する。当該方法は、目的の遺伝子のための発現ベクターに存在する膜アンカー型レポータまたは細胞内レポータを利用し、FACSまたはMACSによる初期細胞選択を容易にする。スイッチング機構を用いて、適切なDNAレコンビナーゼを与えることによって染色体からレポータを欠失させることができ、これにより、選択された細胞を、レポーターの同時発現なしに目的のタンパク質を分泌する生産細胞に変換する。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、2012年11月30日に出願された米国仮出願番号第61/732,156号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に明確に援用される。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書中に援用される。2013年11月27日に作成された上記ASCIIの写しは、34166−00002_SL.txtと称され、サイズは33,232バイトである。
本技術は、細胞株開発およびタンパク質生産に関し、より特定的には、膜アンカー型レポーター(MAR)を発現する細胞を、目的のタンパク質(POI)を培養培地に分泌する生産細胞に変換するスイッチ機構に関する。
背景
組換え治療用タンパク質は、癌から不妊まで多数のヒト疾患を治療するために広く使用されている。組換え治療用タンパク質には、さまざまな血液凝固因子、インシュリン、成長ホルモン、酵素、Fc融合タンパク質、モノクローナル抗体および他のタンパク質が含まれる(Scott C, Bioprocess Int. 10(6): S72-S78, 2012)。多くの組換え治療用タンパク質は、正確なフォールディングおよびグリコシル化を含む翻訳後修飾の必要性から、哺乳類の宿主細胞を用いて製造される。中でも、治療用抗体は、タンパク質治療剤のうち最も大きな部門のひとつであり、2011年には、およそ30個の認可された抗体治療剤についておよそ500億ドルの世界市場となっている。
主要な治療用抗体は、次の4種類、すなわち、キメラ抗体、ヒト化抗体、さまざまな提示系により選択される合成ヒト抗体ライブラリからの完全ヒト抗体、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニック動物からの完全ヒト抗体に属する抗体発見プログラムに由来する(Chames P. et al, Br J Pharmacol.157(2): 220-233, 2009)。ヒト定常領域および非ヒト可変領域を含むキメラ抗体は、人体に免疫原性リスクを呈し、その結果、治療用途的に見て、ヒト化抗体または完全ヒト抗体には受け入れられていない。ヒト化抗体は、抗原相互作用に不可欠な90〜95%のヒト残基および5〜10%の非ヒト残基を含むが、完全ヒト抗体は、100%のヒト残基を含む。ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、いずれもさまざまな疾患を治療するための治療用途において、大きな成功を収めている。
治療用抗体の開発には、抗体発見、工学、生産細胞株開発、製造工程開発、および臨床研究を含めて10〜15年かかることが多い。これらの作業の中でも、抗体発見には6〜18カ月かかり、生産細胞株開発にはさらに6〜10カ月かかる可能性がある。現在の抗体発見方法論における最大の問題のひとつは、一般的に全長IgGである最終抗体生成物の形式を利用していないことである。選択される抗体は、典型的にはマウス抗体であるか、または、scFvもしくはFabなどのヒト抗体のフラグメントであり、これらは、生産細胞株開発の前に最終IgG形式に再編成される必要がある。再編成は、下流工程開発において、活性の損失、低発現レベル、凝集、不溶性、および/または不安定性を含む予期せぬ問題を招くことがある。したがって、さらなる抗体工学および最適化が必要となり、その結果、貴重な時間の損失およびコストの増加が生じてしまう可能性がある。
細胞株開発は、抗体を含むすべての治療用タンパク質のための生産細胞株を得るための工程の、非常に重要な部分である。生産細胞株は、生産性が高く、安定であり、かつ、生物活性、タンパク質配列均一性、グリコシル化特性、電荷変異体、酸化、脱アミノ、および低レベルの凝集を含む、正確な生成物品質属性を有する必要がある。CHO細胞は、治療用タンパク質の生産のために最も一般的な哺乳類細胞である。生物学的治療剤を生産するために、NS0またはSP2/0細胞などの他の哺乳類細胞も使用されている(Jayapal KR, et al., Chemical Engineering Progress, 103: 40-47,2007; Li F, et al., MAbs. 2(5): 466-477, 2010)。従来の細胞株開発は、選択マーカとしてジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)またはグルタミン合成酵素(GS)を組込むことによって遺伝子増幅系を利用する。典型的には、96ウェル組織培養プレートでの限界希釈クローニングによって、細胞株開発プログラムにおいて1000個ものクローンがスクリーニングされる。生産性の高い細胞株を得るためには、たとえば、DHFR系においてメトトレキサート(MTX)を用いて、またはGS系においてメチオニンスルホキシミン(MSX)を用いて、安定なトランスフェクション後に淘汰圧を加えることによって遺伝子増幅が必要となる。ほとんどの場合、生産性は、工程の非常に後期の段階までの唯一の選択基準であることが多く、この後期段階では、一握りのクローンのみが大規模製造に重要な他の品質属性について評価される。その結果、プロジェクトリスクの増加および下流開発に関して複雑な課題が生じてしまう。
組換え型タンパク質生産細胞株としての使用のための目的の細胞集団を選択する工程は、細胞表面分子または細胞内レポーター分子の発現を伴い得る。GFPなどの細胞内レポーターの高レベルの発現は、細胞毒性があることが分かっている(Liu HS, et al., Biochem Biophys Res Commun, 260: 712-717, 1999; Wallace LM, et al., Molecular Therapy Nucleic Acids. 2, e86, 2013)が、レポーターの細胞毒性は、細胞表面提示によって最小限となる。
提示技術は、抗体などのタンパク質の高スループットスクリーニングのために開発されている。抗体提示系は、抗体フラグメントをスクリーニングし、選択し、特徴付けるための適用に成功している。これらの系は、典型的には、ファージ提示、大腸菌提示または酵母提示に依拠している。各提示系にはその強みおよび弱みがあるが、一般的に、これらの系は、翻訳後修飾機能を欠くか、または哺乳類細胞と異なる翻訳後修飾機能を示し、全長IgGの代わりに小さな抗体フラグメントを提示する傾向がある。そのため、単離される抗体フラグメントの生物活性の特徴づけおよびさらなる開発には、適切なフォールディングおよび翻訳後処理のために、全免疫グロブリンへの変換および哺乳類細胞における発現が必要となることが多い。このような変換工程は、初期のスクリーニングで選択されたものと異なる結合特徴を有する抗体を生成する場合がある。
選択工程が、生産性以外の品質属性に基づく急速細胞株選択を容易にする、細胞株(抗体生産細胞株など)を生産する組換え型タンパク質の選択のための改善された工程に対する必要性がある。本発明は、組換え型タンパク質生産のための細胞株のスクリーニングおよび選択のための改善された組成物および方法を提供する。
発明の概要
本開示のさらなる特徴および利点は、以下の説明に記載され、その一部が説明から明らかになる、または、本明細書中に開示される原則の実施により習得可能となるであろう。本開示の特徴および利点は、本明細書中に設けられる開示および例により実現および入手可能となるであろう。本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の説明および添付の請求項からより十分に明確になる、または、本明細書中に記載される原則の実施により習得可能となるであろう。
本発明は、POIの最適な発現を与える細胞のサブ集団の選択後、レポーター(たとえば、細胞表面レポーターまたは細胞内レポーター)の発現をオフし得るスイッチ機構に関する。レポーターは、GFPであるか、または、FACS、MACS、もしくはレポ−ターを検出するのに有効な任意の他の分析法により検出可能な任意の他の分子であり得る。レポーターの発現は、レポーターがPOI発現の代理となるようにPOIの発現に機能的に連結される。上述のスイッチ機構は、表面細胞膜アンカー型レポーター(MAR)または細胞内レポーターを提示する細胞を、POIを分泌する生産細胞に変換させるために使用されてもよい。一連の分子設計が開示され、これらには、目的の遺伝子(GOI)のための発現ベクターに挿入された、部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するMARの配列が組込まれる。レポーターカセットは、プロモーターと、GOIまたはGOIの下流との間に、内部リボソーム進入部位(IRES)または別のプロモーターに続いて存在し得る。いずれの場合においても、レポーター発現がまず可能となり、FACSまたはMACSによる細胞選択が容易になり、次いで、レポーター発現は、レポーターの同時発現なしにPOIを生産するように細胞を切換えるために、細胞に適切な部位特異的DNAレコンビナーゼを一過性発現させるまたは直接提供することよって除去される。
代替的には、レポーターカセットは、GOIのイントロン配列の中間に存在して、選択的スプライシングを引起し、レポーターの発現を招き得る。適切な部位特異的DNAレコンビナーゼタンパク質の一過性発現または直接の提供後、レポーターカセットは、イントロンから欠失され、レポーターの同時発現なしにPOIの最適な発現および分泌が可能となる。
本開示の上記および他の利点および特徴がどのように得られるかを説明するために、上に簡潔に説明した原則を、添付の図面に図示される特定の実施形態を参照して、より詳細に説明する。これらの図面は、本開示の例示的な実施形態を図示するに過ぎず、したがって、その範囲を限定するとしてみなされるべきではないことを理解されつつ、添付の図面を用いて、本明細書中の原則をさらに具体的かつ詳細に記載し、説明する。
図1A〜Cは、発現ベクターを含む例示的なMARカセットおよびMARを欠失させるスイッチ機構の概略図である。Aでは、MARがGOIの前に存在する。Bでは、MARがGOIの後に、IRESまたは別のプロモーターに続いて存在する。Cでは、MARがGOIのイントロンの中間に存在する。 図2a)〜f)は、モデルGOIの例示的な分子構造の概略図である。a)1つのイントロンおよび2つのエクソンを有する野生型ゲノム配列である。b)膜結合ドメイン(MAD)に融合したエクソン2である。c)部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するエクソン2−MADのイントロンへの挿入である。d)DRRSが隣接するMADのイントロンへの挿入である。e)部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するエクソン2−MADのエクソン2の下流への挿入である。f)DRRSが隣接するMADのエクソン2の下流への挿入である。 図2Cの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。 図2Dの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。 図2Eの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。 図2Fの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。 図2Cの分子設計の適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。 図2Dの分子設計の適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。 図2Eの分子設計の適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。 図2Fの分子設計の適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。 図5a)〜f)は、例示的な抗体重鎖ゲノム配列の概略図である。a)4つのエクソン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3)と3つのイントロン(イントロン1〜3)を含む野生型重鎖定常領域である。b)MADに融合した重鎖である。c)LoxP配列が隣接するCH3−MADのイントロン3への挿入である。d)LoxP配列が隣接するMADのイントロン3への挿入である。e)LoxP配列が隣接するCH3−MADのCH3の下流への挿入である。f)LoxP配列が隣接するMADのCH3の下流への挿入である。c)〜f)では、CH2前の領域が存在するが、図示しない。 図5Cの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。CH2前の領域は図示しない。 図5Dの分子設計の2つの選択的RNAスプライシングイベントの概略図である。CH2前の領域は図示しない。 図5Cの分子設計のCreレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。CH2前の領域は図示しない。 図5Dの分子設計のCreレコンビナーゼの存在下でのDNA組換えの概略図である。CH2前の領域は図示しない。 抗体細胞株開発工程のフローチャートである。 抗体ライブラリスクリーニング工程のフローチャートである。 抗体重鎖発現ベクターのプラスミドマップである。 抗体軽鎖発現ベクターのプラスミドマップである。 抗体重鎖および軽鎖発現ベクターのプラスミドマップである。 293F細胞へのリツキサン発現ベクターのトランスフェクション後2日目の培養培地におけるリツキサンレベルを示す図である。 293F細胞へのリツキサン発現ベクターのトランスフェクション後2日目の細胞表面リツキサン発現を示すFACSグラフである。 Cre発現ベクターの一過性トランスフェクション(「Cre後」)によって膜アンカー型抗体発現がオフに切換えられたことを示す図である。 細胞の組換えCreによる処置(「Cre後」)によって膜アンカー型抗体発現がオフに切換えられたことを示す図である。 選択的スプライシングを介して膜アンカー型ヒュミラおよび分泌型ヒュミラの両方を発現するCHOS細胞株の細胞表面抗体を示す図である。 膜抗体発現は、選択的スプライシングを介して膜アンカー型ヒュミラおよび分泌型ヒュミラの両方を発現する細胞における分泌型抗体レベルと強い相関関係にあることを示す図である。 膜繋ぎ止めをオフに切換えた後のヒュミラ発現細胞株の表面抗体の欠如を示す図である。 膜アンカー型ヒュミラを発現するCHOS細胞株が、ビオチン化TNHαおよびストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートとの結合後に陽染したことを示す図である。
発明の詳細な説明
本明細書では、目的のタンパク質(POI)を培養培地に分泌する生産細胞の選択の改善のための組成物、方法および系が提供される。
本発明は、本明細書に記載される特定の組成物、装置、方法論、系、キットまたは病状に限定されず、当然ながら、これらはさまざまであり得る。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためでなく、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
本発明は、膜アンカー型レポーター(MAR)または細胞内レポーターを発現する細胞を、たとえば、抗体または任意の他のタンパク質などの目的のタンパク質(POI)を培養培地に分泌する生産細胞に変換するために使用され得るスイッチ機構に関する。MARは、膜アンカー型POI、膜アンカー型GFP、または、蛍光活性化細胞選別(FACS)もしくは磁気活性化細胞選別(MACS)などの高スループット方法論、もしくはレポーター分子の発現を検出するのに有効な任意の他の分析法を用いて検出または選択可能な任意の他の膜結合型分子を含む、任意の分子であり得る。本方法は、レポーター分子を検出することによってFACSまたはMACSなどの方法論を用いて所望の細胞の初期スクリーニングまたは選択を可能にし、続いて、細胞が、生産目的のレポーター分子の同時発現なしにPOIを分泌するように、細胞を形質転換させる分子スイッチを適用する。
本開示のさまざまな実施形態を以下に詳細に記載する。特定の実施形態を記載するが、これは例示目的に過ぎないことが理解されるべきである。当業者であれば、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく他の構成を使用してもよいことを認識されるであろう。
定義
本明細書および添付の請求項で使用する単数形は、文脈において別段の明記がない限り、複数形の記載を含むことに留意されるべきである。
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語は、概して、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同様の意味を有する。
本明細書で記載する刊行物は、本出願の出願日以前の開示についてのみ示される。本明細書中のどの記載も、本発明が、先行発明によって当該開示に先行する権利を有さないことの記述として解釈されるべきではない。
本明細書で使用する「膜アンカー型レポーター」または「MAR」という用語は、膜結合ドメイン(MAD)に融合した任意の膜分子または非膜分子に関して使用する。
本明細書で使用する「膜結合ドメイン」または「MAD」という用語は、膜に結合したタンパク質ドメインに関して使用し、当該タンパク質ドメインは、GPIアンカーシグナル配列(GASS)、膜貫通ドメイン、または、細胞膜もしくは、たとえばAb、GFPなどの膜タンパク質に結合する任意の分子であり得る。発明の一局面では、宿主細胞は、POIに融合した細胞表面膜アンカー型レポーターの発現を特徴とし、当該レポーターの発現は、FACS、MACSまたはPOIの細胞表面発現を検出可能な任意の技術により検出される。POIに融合した細胞表面膜アンカー型レポーターの発現は、図3A〜図3D、図6Aおよび図6Bに示されるようなDNA構築物のトランスフェクション後に検出される。
本明細書で使用する「目的のタンパク質」または「POI」という用語は、本発明の方法を用いて選択され得る所望の特徴を有するタンパク質に関して使用する。「目的のタンパク質」(POI)には、全長タンパク質、ポリペプチド、およびこれらのフラグメント、ペプチドが含まれ、これらはすべて選択される宿主細胞で発現可能である。例示的なPOIは、抗体、酵素、サイトカイン、接着分子、受容体、誘導体、および、本明細書に記載する方法を用いて発現可能な任意の他のポリペプチドである。本発明の別の局面では、目的のタンパク質は、分泌型ポリペプチドとして培養培地から回収される。一般的に、目的のタンパク質は、培養培地中に、少なくとも100mg/L、少なくとも150mg/L、少なくとも200mg/L、少なくとも300mg/L、少なくとも500mg/L、少なくとも、または少なくとも1000mg/Lのレベル、たとえば、100〜150mg/L、150〜200mg/L、200〜250mg/L、250〜300mg/L、300〜500mg/L、または500〜1000mg/Lのレベルで生産される。一部の場合には、たとえば酵素などのPOIは、低濃度で生物的に活性であり得る。このような場合、培養培地中100mg/L未満のレベルでの生産で、商業用生産要件が満たされる。一般に、宿主細胞が発現するタンパク質をどのように精製するかを当業者に教示する方法は、当該技術分野で周知である。
本明細書で使用する「目的の遺伝子」または「GOI」という用語は、「目的のタンパク質」(POI)をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列に関して使用する。選択される配列は、全長または切断型遺伝子、融合またはタグ付け遺伝子であり、cDNA、ゲノムDNA、またはDNAフラグメント、好ましくはcDNAであり得る。選択される配列は、天然配列、すなわち、自然発生形態であることもでき、または、変異されるもしくはその他の方法によって所望に修飾されることもできる。
本明細書で使用する「宿主細胞」または「発現宿主細胞」という用語は、生物活性に必要とされる正確なフォールディングおよびグリコシル化を含む翻訳後修飾を有するPOIを効果的に生産する任意の細胞株を指す。例示的な宿主細胞としては、たとえば、CHOS(Invitrogen社)などのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、Sp2/0、CHO由来突然変異細胞、またはこのような細胞のいずれかの誘導体もしくは子孫が挙げられる。他の哺乳類細胞としては、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、およびげっ歯類の細胞が挙げられ、また、真核細胞も特定のPOIの生産のために適宜本発明の意義の範囲内で使用可能であり、酵母、昆虫、植物および鳥類の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「磁気活性化細胞選別」または「MACS」という用語は、表面抗原(CD分子)に依存するさまざまな細胞集団の分離のための方法に関して使用する。MACSという用語は、Miltenyi Biotec社の登録商標であり、この方法は、MACS技術としてこの会社により販売されている。
本明細書で使用する「DNAレコンビナーゼ認識配列」または「DRRS」という用語は、部位特異的レコンビナーゼの活性によりDNAセグメントの再編成を容易にする配列に関して使用し、部位特異的レコンビナーゼは、短DNA配列を認識して結合し、その結果、DNAバックボーンが切断されることにより、2つのDNA配列が交換された後、DNA鎖が再結合する。
本明細書で使用する「GPIアンカー型シグナル配列」または「GASS」という用語は、翻訳後修飾中にタンパク質のC末端に結合し得る糖脂質に関して使用する。GASSは、炭水化物含有リンカー(イノシトール残基にグリコシドで結合したグルコサミンおよびマンノース)を介して成熟タンパク質のC末端アミノ酸に連結したホスファチジルイノシトール基からなる。疎水性フォスファチジルイノシトール基は、細胞膜にタンパク質を繋ぎ止める。
「生産性」または「特定の生産性」という用語は、規定される時間内に規定される細胞数によって生産される特定のタンパク質(たとえばPOIなど)の量を示す。「生産性」を測る例示的な方法の1つとして、規定される密度で新しい培養培地に細胞を播種することがある。たとえば24、48または72時間などの規定される時間後、細胞培養液のサンプルを採取し、ELISA測定に供して、目的のタンパク質の力価を求める。生産性は、培養培地のmg/Lとして報告され得る。産業製造の文脈では、特定の生産性は、通常、1つの細胞および1日当たりに生産されるピコグラム(「pg/細胞/日」)単位でのタンパク質の量として表される。
「生物活性」という用語は、細胞内またはインビトロでのアッセイにおけるタンパク質の生物学的機能を示し、定量する。
説明
本発明は、GOIの発現ベクターに挿入された、部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接する膜アンカー型レポーター(MAR)または細胞内レポーターの配列が組込まれた一連の分子設計に関する。レポーターカセットは、プロモータとGOIとの間(図1A)、または、GOIの後にIRESもしくは別のプロモーターに続いて(図1B)、または、GOIのイントロンの中間(図1C)に存在し得る。レポーターは、まず発現され、たとえばFACSまたはMACSによる細胞選別が可能となり、次いで、適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの一過性発現または直接の提供によってレポーターが欠失され、細胞を、レポーターの同時発現なしにPOIの分泌に切換える。MARは、FACSまたはMACSなどの高スループット方法論を用いて検出または選択される必要があり、MARは、膜結合ドメイン(MAD)に融合した任意の膜タンパク質または非膜タンパク質であり得、膜結合ドメイン(MAD)は、GPIアンカーシグナル配列(GASS)、または膜貫通ドメイン、または、細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドであり得る。たとえば、MARは、膜アンカー型GFPまたは膜アンカー型POIであり得る。細胞内レポータータンパク質の代わりに膜アンカー型レポータータンパク質を使用することの利点の1つとしては、レポータータンパク質の高濃度の蓄積後に生じるおそれのある細胞毒性を回避することである。配列番号1は、N末端のIL2シグナルペプチドおよびC末端のDAF GASSに融合したGFPのヌクレオチド配列を示す。ここでは、任意のGFP変異体または他の蛍光タンパク質、機能性シグナルペプチドまたは膜結合ドメインを使用することができる。
レポーターを含有する発現ベクターをトランスフェクトした後、CHO細胞などの宿主細胞は、発現ベクターが染色体に組込まれたまま、安定な細胞の選択のための適切な抗生物質の存在下で生育され得る。代替的には、トランスフェクト細胞は、レポーター発現が安定するまで1〜2週間FACSまたはMACSによってレポーター発現について直接選択されることもできる。抗生物質を使用しないことの利点は、細胞のよりよい健康状態および発現カセットの潜在的により低い遺伝子抑制のためである(Kaufman WL, et al., Nucleic Acids Res., 36(17), e111, 2008)。次いで、レポーターの高発現レベルまたは他の性質(安定性、タンパク質配列均一性、適切なグリコシル化特性、適切な電荷変異体、および許容される凝集レベルなど)を有する所望の細胞が、FACSまたはMACSまたは別の分析技術により選択され得る。次に、適切な部位特異的DNAレコンビナーゼを提供することによってレポーターカセットを欠失させて、選択された細胞を、POIを生産する生産細胞に切換えることができる。DNAレコンビナーゼは、発現ベクターによる一過性トランスフェクション、または培養培地へのDNAレコンビナーゼタンパク質の直接的な提供、または任意の他の手段によって細胞に供給され得る。
本発明はさらに、GOIのイントロン配列を修飾するための一連の分子設計を提供する。図2Aは、2つのエクソンおよび1つのイントロンを含むモデル分泌型GOIのゲノム配列を示す。このゲノム配列は、MADに融合していれば細胞表面に繋ぎ止められ、MADは、GASS、または膜貫通ドメイン、または細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドであり得る(図2B)。選択的スプライシング部位を形成するために、DRRSが隣接するMADに融合したGOIエクソン2のDNA配列をイントロンに挿入することができる(図2C)、DRRSが隣接するMADをイントロンに挿入することができる(図2D)、DRRSが隣接するMADに融合したGOIエクソン2のDNA配列をエクソン2の下流に挿入することができる(図2E)、または、DRRSが隣接するMADをエクソン2の下流に挿入することができる(図2F)。
mRNAは、図3Aに示すイントロンのための不変のスプライシングドナーまたは任意の機能性スプライシングドナーと、2つのスプライシング受容体とを含んでもよい。2つのスプライシング受容体は、野生型GOI mRNAにおけるスプライシング受容体または任意の機能性スプライシング受容体と同一であってもよい。この例示的な選択的スプライシングは、受容体1を用いると膜アンカー型POIを、受容体2を用いると分泌型POIを生じ得る(図3A)。分泌型POIのみを望む場合、図4Aに示すように、DRRSを認識する適切な部位特異的DNAレコンビナーゼを細胞で一過性発現させて、DRRS間の配列を欠失させることができる。
イントロンを操作する別の方法は、DRRSが隣接するMAD配列を直接挿入することである(図2D)。図3Bに示す選択的スプライシングは、エクソン2が欠失された膜アンカー型POIまたは分泌型POIのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的DNAレコンビナーゼが供給されると、DRRS間の配列が欠失され、発現されるPOIがすべて分泌される(図4B)。
イントロンを操作するさらに別の方法は、部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するエクソン−2−MADをエクソン2の下流に挿入することである(図2E)。図3Cに示す選択的スプライシングは、MADに融合したエクソン−1およびエクソン−2を有する膜アンカー型POI、またはエクソン1およびエクソン2を有する分泌型POIのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的DNAレコンビナーゼが供給されると、DRRS間の配列が欠失され、発現されるPOIがすべて分泌される(図4C)。
イントロンを操作するさらなる方法は、DRRSが隣接するMAD配列をエクソン2の下流に挿入することである(図2F)。図3Dに示す選択的スプライシングは、エクソン2が欠失された膜アンカー型POI、またはエクソン1およびエクソン2を有する分泌型POIのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的DNAレコンビナーゼが供給されると、DRRS間の配列が欠失され、発現されるPOIがすべて分泌される(図4D)。
図5〜7は、前述のイントロン修飾設計をどのように適用してヒト免疫グロブリンガンマゲノム配列を操作するかを説明する。野生型ヒト抗体IgG1重鎖定常領域のゲノム構造は、図5Aに示すように4つのエクソンおよび3つのイントロンを含む。DNA配列は、配列番号3に示される。図5Bは、MADに融合することにより作製された膜アンカー型抗体重鎖を示す。膜アンカー型抗体は、重鎖のC末端にGASSまたは膜貫通ドメイン(TM)を融合することによって構築可能であることが報告されている(Zhou C, et al., MAbs, 2:508-518, 2010; Bowers PM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 108(51):20455-20460, 2011; Li. F, et al., Appl Microbiol BiotechnoL, 96(5): 1233-41 2012)。ヒトDAFのGASSは、配列番号4(ヌクレオチド)および配列番号5(アミノ酸)にそれぞれ示される。任意の他のGASSまたはTMまたは細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドも、膜繋ぎ止めのために使用することができる。選択的スプライシング部位を形成するために、DRRSが隣接するCH3−MADのDNA配列をイントロン3(図5C)または他の2つのイントロンに挿入することができる;DRRSが隣接するMADのDNA配列をイントロン3に挿入することができる(図5D);LoxP配列が隣接するCH3−MADのDNA配列をエクソン3の下流に挿入してもよい(図5E);または、LoxP配列が隣接するMADのDNA配列をエクソン3の下流に挿入してもよい(図5F)。
DNAレコンビナーゼCreの一般的に使用される認識配列のひとつは、LoxPであり、この配列は、配列番号8に示される。同様に、他の部位特異的DNAレコンビナーゼの任意の他のLoxP変異体配列または認識配列をここでは使用することができ、たとえば、FRT配列(FLPのためのDRRS)、またはattBもしくはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS(Wang Y, et al., Plant Cell Rep.; 30(3):267-85, 2011)、または任意の他のチロシンレコンビナーゼもしくはセリンレコンビナーゼのための特定のDNA認識配列などを使用することができる。mRNAは、図6Aに示されるように、イントロン3のための不変のスプライシングドナーと、2つの同一のスプライシング受容体とを有してもよい。
この選択的スプライシングは、受容体1を用いると膜アンカー型抗体を、受容体2を用いると分泌型抗体を生じ得る。分泌型抗体のみを望む場合、DNAレコンビナーゼCreを細胞に一過性発現させるまたは培養培地に供給することができ、2つのLoxP部位間の配列が、図7Aに示されるように欠失される。
たとえば、イントロン3を操作して、LoxP部位が隣接するMADのDNA配列を直接挿入すれば(図5D)、図6Bに示される選択的スプライシングは、CH3が欠失された膜アンカー型抗体または分泌型抗体を与えるであろう。DNAレコンビナーゼCreが発現されると、LoxP部位間の配列が欠失され、発現される抗体がすべて分泌される(図7B)。同様に、LoxP部位が隣接するMADを他の2つのイントロンに挿入して、選択的スプライシングを引起すこともできる。
図8Aは、MARカセットおよびスイッチ機構を利用する例示的な細胞株開発工程を図示する。GOIの発現ベクターは、図1に示されるようなMARカセットにより修飾される。当該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を持ち得る。POIが複数のサブユニットを含む場合、それらは同じベクターまたは別個の発現ベクターにクローン化されてもよい。発現ベクターは、所望の細胞にトランスフェクトされる。1〜2週間抗生物質選択有りまたは無しで染色体内に安定に組込んだ後、FACSまたはMACSなどの任意の高スループット細胞選択または増菌方法論により、細胞をMARの高発現について分析し、選択する。あるアプローチでは、選択された細胞に適切なDNAレコンビナーゼのための発現ベクターを一過性トランスフェクトして、部位特異的DNA組換えを引起す。MARカセットの欠失により、POIを生産する細胞が得られる。96ウェルプレートへの単細胞選別または限界希釈クローニング後、培養培地中のPOI発現レベルおよび/または他の所望の生成物品質属性についてクローンをスクリーニングする。選択されたクローンは、増殖され、凍結保存される。
発明の一応用例では、部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接する膜結合ドメイン(MAD)を含むヒト免疫グロブリンガンマ発現ベクターを、CH2配列とCH3配列との間のイントロン領域に挿入することができる。MADは、GPIアンカー型シグナル配列(GASS)または膜貫通ドメインまたは任意の細胞表面タンパク質に結合するペプチドであることができる。選択的スプライシングの結果、発現される抗体の一部が膜アンカー型となることにより、蛍光標識抗原または二次抗体によって容易に検出される。膜アンカー型抗体の高発現レベルを有する細胞のFACSによる選択後、次いで、細胞を、イントロンにおける膜結合の原因となる配列を欠失させるために、適切な部位特異的DNAレコンビナーゼを一過性発現させることによって、培養培地に抗体を分泌する生産細胞に切換えてもよい。スイッチ機構は、時間およびコストを大きく減少しながら細胞株開発に使用することができ、抗体または任意の他の組換え型タンパク質の生産ために使用することができる。
所望の特徴を有するタンパク質の高スループットスクリーニングのために、ライブラリ提示技術が開発されている。WO2010/022961は、宿主細胞の集合から所望されるレベルの対象とするポリペプチドを発現する真核宿主細胞を生成または選択する方法を開示しており、当該方法は、免疫グロブリン膜貫通アンカーを含む融合ポリペプチドを、当該融合ポリペプチドが宿主細胞の表面上に提示されるように使用することによる。
Bowers PM, et al.(Proc Natl Acad Sci U S A. 108(51):20455-60, 2011)は、ヒト抗体を単離するための方法を開示しており、当該方法は、高結合親和性を有する良好に発現されたヒトIgM抗体のFACSによる最初の選択に基づくライブラリスクリーニング方法を使用し、その後、インビトロでの活性化誘導シチジン脱アミノ酵素(AID)により誘導されるインビトロ体細胞突然変異(SHM)と、同じライブラリスクリーニング方法を使用した高親和性抗体の選択とを行う。
DuBridge et al.の米国特許第7,947,495号は、二重提示ベクター組成物および方法を開示しており、これらは、スプライス部位およびレコンビナーゼ認識部位に基づく免疫グロブリンの分泌型形態および膜結合型形態の発現を提供し、単一の宿主細胞における膜結合型免疫グロブリンおよび同じ免疫グロブリンの分泌型形態のための転写の同時発現を可能にしている。
Beerli, R., et al.(PNAS , vol. 105 (38), 14336-14341, 2008)は、完全ヒトmAbsの急速単離のための技術を記載しており、これは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来の抗原特異的B細胞を単離し、シンドビスウイルス発現系を用いた哺乳類細胞表面提示によってスクリーニングされた組換え型抗原特異的単鎖Fv(scFv)ライブラリーを生成し、その後、一回の選択後に、完全ヒト高親和性抗体を単離することによるものである。Zhou et al.(mAbs 2:5, 508-518; 2010)は、哺乳類細胞の表面上での全長機能性抗体の提示に基づいて抗体フラグメントをスクリーニングし、選択し、特徴付けるために使用される別の提示系を開示しており、これは、非常に高い抗原結合親和性を有する抗体の選択のための高スループットFACSスクリーニングと合わされたレコンビナーゼ介在性のDNA組込みに依拠している。
Akamatsu et al.の米国特許第8,163,546号は、「除去可能なテザー提示ベクター」または「膜貫通提示ベクター」の使用に依拠する哺乳類細胞系免疫グロブリンライブラリーを開示しており、当該ライブラリーは、親和性ベースのスクリーニングのための細胞膜結合型免疫グロブリンの発現および分泌型免疫グロブリンの発現のために使用することができる。これらの「除去可能なテザー提示ベクター」においては、細胞表面テザードメインをコードするポリヌクレオチドに第1および第2の制限酵素部位が隣接する。
本明細書に開示される発明は、所望の特徴を有するPOIを選択するための改善されたライブラリーおよびスクリーニング方法を提供する。
図8Bは、選択的スプライシングおよびスイッチ機構を利用する例示的な抗体ライブラリースクリーニング工程を示す。一つの例示的なアプローチでは、VH配列のライブラリーを、図5Cまたは図5Dに示すような修飾イントロン3を有する発現ベクターにクローン化することができる。軽鎖配列のライブラリーは、同じ発現ベクターまたは別個のベクターにクローン化されてもよい。抗体ライブラリーベクターの発現により、膜アンカー型抗体の発現ライブラリーが得られる。CHO細胞または他の発現宿主細胞へのトランスフェクション後、抗原結合抗体を発現する細胞をFACSまたはMACSにより選別または選択してもよい。異なるストリンジェントな条件下で複数回の選別または選択を行い、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体の生産細胞を単離してもよい。抗体配列は、PCRまたはRT−PCRにより選択された細胞から得ることができる。選択された細胞は、適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの発現によってMAD配列を欠失させることにより、生産細胞に変換されてもよい。同様の設計を、抗体または任意の他のタンパク質の任意の工学されたライブラリーに適用してもよい。実施例8を参照のこと。
重鎖ゲノム配列の3番目のイントロンにLoxP部位を含む発現ベクターからのリツキサンの発現
リツキサン重鎖可変配列(VH)を遺伝子合成し、制限部位Xba IとNhe Iとの間のヒトIgG1重鎖定常領域ゲノム配列を含む哺乳類発現ベクターにクローン化し、ベクターLB0−Hを作成した。シグナルペプチドを含むリツキサンVH配列は、配列番号9に示される。抗体重鎖の発現は、EF1αプロモータの制御下であった。当該ベクターは、安定な細胞選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子と、大腸菌増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを持っている。プラスミドマップを図9Aに示す。
リツキサン軽鎖cDNAを遺伝子合成し、制限部位Xba IとBamH Iとの間の別個の哺乳類発現ベクターにクローン化し、ベクターLB0−Kを作成した。当該軽鎖の配列は、配列番号11に示される。抗体軽鎖の発現は、EF1αプロモータの制御下であった。当該ベクターは、安定な細胞選択のためのネオマイシン耐性遺伝子と、大腸菌増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを持っている。プラスミドマップを図9Bに示す。
LoxP部位をLB0−Hにおけるリツキサンガンマゲノム配列の3番目のイントロンの中間にブリッジPCRにより挿入し、LB1を作成した。重鎖定常領域の配列は、配列番号13に示される。
リツキサンを発現させるために、293F細胞(Invitrogen社)にLB0−KとともにLB0−HまたはLB1を同時トランスフェクトした。トランスフェクション条件は、Freestyle Maxトランスフェクション試薬(Invitrogen社)およびGFP発現ベクターで最適化した。30μgのDNAおよび37.5μlのFreestyle Maxを用いて、30mlの細胞(1×10細胞/ml)にトランスフェクトした。翌日、細胞を典型的には3回希釈し、さらに1日培養した後、GFP発現のためのフローサイトメトリー分析に供した。これらの条件下での293F細胞についてのトランスフェクション効率は、〜80%であると求められた。リツキサン発現を評価するために、培地中の抗体レベルを希釈ELISAにより求めた。希釈ELISAでは、リツキサンをヤギ抗ヒトIgG Fc(100ng/ウェル、Bethyl社)により捕獲し、ヤギ抗ヒトカッパ抗体HRPコンジュゲート(1:10,000希釈、Bethyl社)により検出した。
ヒトIgG抗体(2μg/mlのIgG、シグマ社)をIgG定量のための基準として使用した。発現レベルを図10Aに示す。LB1トランスフェクト細胞は、野生型対照LB0−Hと同等の量の抗体を生産し、これは、CH2とCH3との間のイントロンの中間に挿入されたLoxP配列が抗体発現レベルに影響しなかったことを示唆している。両方のトランスフェクト細胞における重鎖定常領域をRT−PCRにより増幅して、配列決定した。RNAスプライシングは、ガンマ鎖イントロンの内部にLoxP部位があってもなくても同一であることが分かった。
細胞表面上に繋ぎ止められたリツキサンの発現
DAF GPIアンカーシグナル配列(配列番号4)またはPDGFR TMドメイン配列(配列番号6)と、それに続くLoxPおよびイントロン3配列とに融合したヒトIgG1 CH3配列を合成し、LB1中の3番目のイントロンに挿入し、図5Cに示すように、ベクターLB3またはLB4をそれぞれ作成した。LB3およびLB4の重鎖定常領域の配列は、配列番号14および配列番号15にそれぞれ示される。LB0−K中の軽鎖発現カセットは、制限酵素EcoR VおよびAsc Iにより消化された。次いで、2625bpのDNAフラグメントをEcoR VおよびAsc I間のLB4にクローン化し、リツキサン発現ベクターLB37を作成した。プラスミドマップを図9Cに示す。リツキサン発現を評価するために、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、293F細胞に、軽鎖ベクターLB0−Kとともに、重鎖ベクターLB3、またはLB4を同時トランスフェクトした。
培地中の抗体力価を希釈ELISAにより求めた。希釈ELISAでは、リツキサンをヤギ抗ヒトIgG Fc(100ng/ウェル、Bethyl社)により捕獲し、ヤギ抗ヒトカッパ抗体HRPコンジュゲート(1:10,000希釈、Bethyl社)により検出した。ヒトIgG抗体(2μg/mlのIgG、シグマ社)をIgG定量のための基準として使用した。発現レベルを図10Aに示す。修飾イントロンを採用したベクターは、細胞密度が典型的には約1×10細胞/mlである2日後の培養培地中で4〜10μg/mlの範囲のリツキサンの頑強な発現を示す。LB1トランスフェクト細胞は、野生型対照LB0−Hと同等の量の抗体を生産し、これは、CH2とCH3との間のイントロンの中間に挿入されたLoxP配列が抗体発現レベルに影響しなかったことを示唆している。LB3は、LB4よりも2〜3倍多くの抗体を培地に分泌し、これは、GPI連結型膜繋ぎ止めが100%ではないことと一致している。この結果は、3つの独立した実験で再現された。
トランスフェクト293F細胞もヤギ抗ヒトFc抗体FITCコンジュゲート(1:1,000希釈、Bethyl社)で標識し、フローサイトメトリー分析に供した。野生型CH3エクソンベクター(LB0−H、図10B.a)またはLoxP修飾CH3エクソンベクター(LB1、図10B.b)をトランスフェクトした293F細胞は、細胞表面抗体発現を示さなかったが、選択的スプライシングされたCH3−GASSベクター(LB3、図10B.c)またはCH3−TMベクター(LB4、図10B.d)をトランスフェクトした293F細胞は、細胞の20〜30%で細胞表面抗体を示した(表1)。
細胞表面上に繋ぎ止められたCH3欠失リツキサンの発現
DAF GPIアンカーシグナル配列またはPDGFR TMドメイン配列ならびにそれに続くLoxPおよびイントロン3配列を合成し、LB1の3番目のイントロンに挿入し、図Dに示されるように、ベクターLB9またはLB10をそれぞれ作成した。LB9およびLB10の重鎖定常領域の配列は、配列番号16および配列番号17にそれぞれ示される。
Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、293F細胞に、LB0−Kとともに、LB9またはLB10を同時トランスフェクトした。2日後、培地中の抗体レベルを実施例1に記載したのと同様にELISAによりアッセイした。LB9トランスフェクト細胞は、LB10トランスフェクト細胞よりも多い抗体を媒体に分泌し(図10A)、これは、実施例2に記載した結果と一致していた。トランスフェクト293F細胞もヤギ抗ヒトFc抗体FITCコンジュゲート(1:1,000希釈、Bethyl社)で標識し、フローサイトメトリー分析に供した。選択的スプライシングされたベクターLB3(図10B.e)またはLB4(図10B.f)がトランスフェクトされた293F細胞は、細胞の8〜20%で抗体の細胞表面発現を示した(表1)。
リツキサン重鎖の上流での膜アンカー型GFPの発現
コザック共通配列を持つ膜アンカー型GFP(配列番号1)に2つのLoxP部位を隣接させ、これをベクターLB0−HにおけるEF1αプロモータとリツキサンガンマ配列との間に挿入し、図1Aに記載したように、ベクターLB11を作成した。2つのLoxP部位間の配列をLB11において欠失させ、1つのLoxP部位のみを残してベクターLB11−LoxPを作成した。Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、293F細胞に、LB0−Kとともに、LB0−H、LB11、またはLB11−LoxPを同時トランスフェクトした。2日後、抗体レベルを実施例1に記載したのと同様にELISAによりアッセイした。LB11トランスフェクト細胞は、LB0−Hトランスフェクト細胞に対して10%未満しか生産せず(図10A)、これは、リツキサン重鎖遺伝子の上流におけるGFPカセットの存在が、リツキサンの発現を大きく減少させたことを示唆している。GFPカセットの除去後、LB11−LoxPは、LB0−Hと同等レベルでリツキサンを生産した(図10A)。LB11トランスフェクト細胞におけるGFPの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
リツキサン重鎖の下流での膜アンカー型GFPの発現
IRES配列(配列番号18)をコザック共通配列を持つ膜アンカー型GFP(配列番号1)に融合させた。次いで、LoxP部位をN末端およびC末端の両方に付加した。全配列を、リツキサンガンマ終始コドンの下流でベクターLB0−HにおけるポリAシグナルの前に挿入し、図1Bに記載するように、ベクターLB14を作成した。293F細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いてLB14およびLB0−Kを同時トランスフェクトした。2日後、媒体中の抗体レベルを実施例1に記載したようにELISAによりアッセイし、これを図10Aに示す。LB11トランスフェクト細胞におけるGFPの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
Creを提供することによる膜アンカー型抗体のオフ切換え
Cre発現ベクターLB30を構築した。Cre cDNAは、ヒトコドン最適化され、核局在化のためにN末端においてMPKKKRK(配列番号19)のペプチドと融合させた。Creの発現は、ヒトEF1αプロモータによって進められた。
293F細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、制限酵素Asc Iで線状化されたLB37をトランスフェクトし、1μg/mlのピューロマイシンおよび400μg/mlのG418の存在下で培養した。およそ2週間の選択後、安定なプールにCre発現ベクターLB30を一過性トランスフェクトした。さらに1週間の培養後、細胞をヤギ抗ヒトFc抗体FITCコンジュゲート(1:1,000希釈、Bethyl社)で標識し、フローサイトメトリー分析に供して、細胞表面リツキサン発現を評価した。細胞の大部分が、Creトランスフェクション後、図11Aに示すように(「Cre後」)、膜アンカー型抗体を失っていた。
膜アンカー型抗体のオフ切換えもまた、細胞培養液に組換え型Creを提供することによって達成された。上記の安定なプールからクローン化された膜アンカー型抗体を発現する細胞株を、核局在化のためのTAT−NLS(Excellgen社)と融合させた1μMの組換え型Creで2時間処理した。さらに1週間の培養後、上記と同様に、細胞を細胞表面抗体発現について評価した。細胞の大部分が、図11Bに示すように(「Cre後」)、膜アンカー型抗体を失っていた。
高生産性ヒュミラ生産細胞株のスクリーニング
ヒュミラ軽鎖(配列番号20)の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Xba IとBsiW Iとの間のLB0−Kにクローン化し、ベクターLB42を作成した。ヒュミラ重鎖(配列番号22)の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Xba lとNhe Iとの間のLB4にクローン化し、ベクターLB25を作成した。LB42における軽鎖発現カセットは、制限酵素EcoR VおよびAsc Iにより消化された。次いで、2641bpのDNAフラグメントをEcoR VおよびAsc I間のLB25にクローン化し、ヒュミラ発現ベクターLB29を作成した。
CHOS細胞(Invitrogen社)をFreestyle CHO培地(Invitrogen社)で培養した。1×10CHOS細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、制限酵素Asc Iで線状化されたLB29をトランスフェクトし、次いで、10μg/mlのピューロマイシンで2週間選択した。1×10の安定な細胞をヤギ抗ヒトFc抗体FITCコンジュゲート(1:1,000希釈、Bethyl社)で標識し、FACS選別に供した。細胞表面抗体のうち最も高い発現を有した細胞の0.01%を5つの96ウェルプレートに選別した。2〜3週間後、およそ100個のコロニーが生育した。培養培地を、実施例1に記載したように、ELISAによってヒュミラの発現についてスクリーニングした。24個の最も高発現なクローンを採集し、増殖し、凍結保存した。異なる抗体発現レベルを有する6つのクローンを細胞表面抗体評価のために採集した。これらをヤギ抗ヒトFc抗体FITCコンジュゲート(1:1,000希釈、Bethyl社)で標識し、フローサイトメトリー分析に供して、膜アンカー型抗体発現を確認した(図12A)。これらをまた、30mlの振とう培養に供した。7日間の栄養補給なしの回分培養後、実施例1に記載したように、ELISAによって培養培地における抗体生産を評価した。より高い膜抗体発現は、増加した分泌型抗体生産と強く相関付けられることが分かった(図12B)。さらに、最も高い細胞表面抗体の発現を有する線状化LB29をトランスフェクトした安定細胞の0.01%もプールに選別した。1週間の培養後、選択したプールに、Neonトランスフェクション系(Invitrogen社)により、実施例6に記載したCre発現ベクターを一過性トランスフェクトした。さらに一週間の培養後、細胞を限界希釈によって10個の96ウェルプレートにクローン化した。2〜3週間後、およそ200個のコロニーが生育した。培養培地を、実施例1に記載したように、ELISAによってヒュミラの発現についてスクリーニングした。培地中で最も高いレベルの抗体を有する24個のクローンを採集し、24ウェルプレートに増殖した。3日間の培養後、培養培地をヒュミラの発現について再度スクリーニングした。培地中で最も高いレベルの抗体を有する12個のクローンを採集し、増殖し、凍結保存した。細胞は、膜アンカー型抗体を有さないことが確認された(図13A)。30mlの振とう培養での7日間の栄養補給なしの回分培養後、培養培地における抗体生産を評価した。培地中最も高い抗体のレべルを有する5つのクローンの抗体収率を表2に示す。
抗体ライブラリーのモデルスクリーニング
実施例7で選択され、#27と称する1つの細胞株は、膜アンカー型ヒュミラを発現する。細胞株#27からの細胞を1μg/mlのビオチン化ヒトTNFα(ACRO Biosystems社)で30分間処理した。PBSで1回洗浄した後、細胞をストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲート(VectorLabs社)で30分間標識した。PBSで2回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析に共し、細胞表面ヒュミラ上でのTNFαの陽性の結合を示した(図14)。細胞株#27を、リツキサン発現ベクターLB37をトランスフェクトしたCHOS細胞の安定なプールに1:1000の比で添加した。ビオチン化TNFαおよびその後にストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートと結合後、細胞をFACS選別に供した。1000個の陽性細胞をプールに選別した。2週間培養後、FACS陽性細胞における抗体配列をRT−PCRにより増幅し、ヒュミラ抗体配列であることを確認した。

Claims (50)

  1. (a)プロモータと、(b)目的の遺伝子(GOI)と、(c)DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するレポーター遺伝子とを含む、DNA構築物。
  2. 前記DRRSは、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択される、請求項1に記載のDNA構築物。
  3. 前記レポーター遺伝子の上流にIRESをさらに含む、請求項1または3に記載のDNA構築物。
  4. 前記レポーター遺伝子は、膜アンカー型レポーター(MAR)分子をコードし、前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意の分子である、請求項1から3のいずれか1項に記載のDNA構築物。
  5. 前記MARは、膜アンカー型GFP、および目的の膜アンカー型タンパク質からなる群から選択される、請求項4に記載のDNA構築物。
  6. 前記レポーター遺伝子は、細胞内レポーター分子をコードする、請求項1から5のいずれか1項に記載のDNA構築物。
  7. 前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項1から6のいずれか1項に記載のDNA構築物。
  8. 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項7に記載のDNA構築物。
  9. 前記スプライス受容体配列は、選択的スプライシングのための手段を与え、発現される前記目的のタンパク質は、膜結合型または分泌型であり得る、請求項8に記載のDNA構築物。
  10. 前記目的の遺伝子は、組換え型タンパク質をコードする、請求項1から9のいずれか1項に記載のDNA構築物。
  11. 前記目的の遺伝子は、抗体をコードする、請求項1から10のいずれか1項に記載のDNA構築物。
  12. 前記抗体をコードする前記目的の遺伝子は、抗体ガンマ定常領域コード配列の3番目のイントロンにスプライス受容体配列を含む、請求項11に記載のDNA構築物。
  13. 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む、目的の遺伝子を宿主細胞内に送達するための発現ベクター。
  14. 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む細胞。
  15. 請求項14の細胞を含む細胞培養液。
  16. 部位特異的DNAレコンビナーゼが前記細胞培養液に加えられる、請求項15に記載の細胞培養液。
  17. 前記部位特異的DNAレコンビナーゼは、前記DNAレコンビナーゼをコードする発現ベクターの前記細胞培養液の前記細胞へのトランスフェクションにより与えられる、請求項16に記載の細胞培養液。
  18. 前記レポーターをコードする配列が、前記細胞培養液の前記細胞において欠失された、請求項16に記載の細胞培養液。
  19. 前記目的の遺伝子が発現され、対応する目的のたんぱく質(POI)が前記細胞培養培地に分泌される、請求項18に記載の細胞培養液。
  20. (a)プロモータと、(b)複数の目的の遺伝子を含むライブラリと、(c)DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するレポーター遺伝子とを含むDNA構築物。
  21. 前記ライブラリ内の前記目的の遺伝子は、スプライス受容体配列を有するイントロンと、それに続く膜結合配列とを含む、請求項20に記載のDNA構築物。
  22. 前記スプライス受容体配列は、選択的スプライシングのための手段を設け、発現される前記目的の遺伝子は、目的の膜結合型タンパク質または分泌型タンパク質をコード可能である、請求項21に記載のDNA構築物。
  23. 前記ライブラリは、抗体ライブラリである、請求項20に記載のDNA構築物。
  24. 前記抗体ライブラリは、親和性成熟ライブラリである、請求項23に記載のDNA構築物。
  25. 請求項20から23のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む細胞ライブラリ。
  26. 請求項25の細胞ライブラリを含む細胞培養液。
  27. 細胞株スクリーニング方法であって、前記方法は、
    (a) 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物をトランスフェクトした宿主細胞を与えるステップと、
    (b) 前記トランスフェクト細胞を培養するステップとを含み、前記レポータータンパク質が発現され、目的のタンパク質が前記細胞培養培地に分泌されてもよく、前記方法はさらに、
    (c) 前記トランスフェクト宿主細胞をスクリーニングし、レポーター分子を発現する宿主細胞を選択するステップと、
    (d) 前記選択された細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップとを含み、前記曝露後、前記細胞はもはや前記レポータータンパク質を発現せず、前記方法はさらに、
    (e) 目的のタンパク質を前記細胞培養培地に分泌する細胞をスクリーニングするステップを含む、細胞株スクリーニング方法。
  28. 前記レポーター分子は、膜アンカー型レポーター(MAR)である、請求項27に記載の細胞株スクリーニング方法。
  29. 前記レポーター分子は、細胞内レポーターである、請求項27に記載の細胞株スクリーニング方法。
  30. 前記DNA構築物は、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択されるDRRSを含む、請求項27から29のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  31. 前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意のタンパク質である、請求項28に記載の細胞株スクリーニング方法。
  32. 前記MARは、FACSまたはMACSにより前記細胞表面上で検出される、請求項31に記載の細胞株スクリーニング方法。
  33. 前記DNA構築物によりコードされる前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項27から32のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  34. 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項33に記載の細胞株スクリーニング方法。
  35. 前記トランスフェクト宿主細胞は、部位特異的DNAレコンビナーゼに曝露される、請求項27から34のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  36. 前記目的のタンパク質は、抗体である、請求項27から35のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  37. (a) 培養培地に宿主細胞を与えるステップと、
    (b) 前記宿主細胞に請求項20に記載のDNA構築物をトランスフェクトするステップと、
    (c) 前記トランスフェクト宿主細胞をスクリーニングし、レポーター分子を発現する宿主細胞を選択するステップと、
    (d) 前記選択された宿主細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップと、
    (e) 前記宿主細胞を細胞培養培地で培養するステップと、
    (f) 前記細胞培養培地を所望の性質を有する目的のタンパク質についてスクリーニングするステップとを含む、細胞株スクリーニング方法。
  38. 前記レポーター分子は、膜アンカー型レポーター(MAR)である、請求項37に記載の細胞株スクリーニング方法。
  39. 前記レポーター分子は、細胞内レポーターである、請求項37に記載の細胞株スクリーニング方法。
  40. 前記DNA構築物は、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択されるDRRSを含む、請求項37から39のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  41. 前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意のタンパク質である、請求項38に記載の細胞株スクリーニング方法。
  42. 前記MARは、FACSまたはMACSにより前記細胞表面上で検出される、請求項41に記載の細胞株スクリーニング方法。
  43. 前記DNA構築物によりコードされる前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項37から42のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  44. 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項43に記載の細胞株スクリーニング方法。
  45. 前記トランスフェクト宿主細胞は、部位特異的DNAレコンビナーゼに曝露される、請求項37から44のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  46. 前記目的のタンパク質は、抗体である、請求項37から45のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
  47. 目的のタンパク質をスクリーニングする細胞ライブラリをスクリーニングする方法であって、前記方法は、膜アンカー型レポータータンパク質を有する細胞を、培養培地に目的のタンパク質を分泌する細胞に切換えることを含み、前記方法は、
    (a) 宿主細胞を培養培地に与えるステップと、
    (b) 前記宿主細胞に請求項20に記載のDNA構築物をトランスフェクトし、目的の膜アンカー型タンパク質のライブラリを発現する細胞ライブラリを生成するステップと、
    (c) 前記細胞ライブラリをスクリーニングし、所望の性質を有する目的の膜アンカー型タンパク質を発現する宿主細胞を選択するステップと、
    (d) 前記選択された宿主細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップと、
    (e) 前記目的のタンパク質のための前記細胞培養培地を所望の性質を有する前記目的のタンパク質についてスクリーニングするステップとを含む、スクリーニング方法。
  48. 前記ライブラリは、抗体ライブラリである、請求項47に記載のスクリーニング方法。
  49. 前記所望の性質は、抗原の結合である、請求項47に記載のスクリーニング方法。
  50. 前記所望の性質は、生物活性である、請求項47に記載のスクリーニング方法。
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