JP2016506239A - 新規な細胞株スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月30日に出願された米国仮出願番号第61/732,156号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に明確に援用される。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書中に援用される。2013年11月27日に作成された上記ASCIIの写しは、34166−00002_SL.txtと称され、サイズは33,232バイトである。
組換え治療用タンパク質は、癌から不妊まで多数のヒト疾患を治療するために広く使用されている。組換え治療用タンパク質には、さまざまな血液凝固因子、インシュリン、成長ホルモン、酵素、Fc融合タンパク質、モノクローナル抗体および他のタンパク質が含まれる(Scott C, Bioprocess Int. 10(6): S72-S78, 2012)。多くの組換え治療用タンパク質は、正確なフォールディングおよびグリコシル化を含む翻訳後修飾の必要性から、哺乳類の宿主細胞を用いて製造される。中でも、治療用抗体は、タンパク質治療剤のうち最も大きな部門のひとつであり、2011年には、およそ30個の認可された抗体治療剤についておよそ500億ドルの世界市場となっている。
本開示のさらなる特徴および利点は、以下の説明に記載され、その一部が説明から明らかになる、または、本明細書中に開示される原則の実施により習得可能となるであろう。本開示の特徴および利点は、本明細書中に設けられる開示および例により実現および入手可能となるであろう。本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の説明および添付の請求項からより十分に明確になる、または、本明細書中に記載される原則の実施により習得可能となるであろう。
本明細書では、目的のタンパク質(POI)を培養培地に分泌する生産細胞の選択の改善のための組成物、方法および系が提供される。
本明細書および添付の請求項で使用する単数形は、文脈において別段の明記がない限り、複数形の記載を含むことに留意されるべきである。
本発明は、GOIの発現ベクターに挿入された、部位特異的DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接する膜アンカー型レポーター(MAR)または細胞内レポーターの配列が組込まれた一連の分子設計に関する。レポーターカセットは、プロモータとGOIとの間(図1A)、または、GOIの後にIRESもしくは別のプロモーターに続いて(図1B)、または、GOIのイントロンの中間(図1C)に存在し得る。レポーターは、まず発現され、たとえばFACSまたはMACSによる細胞選別が可能となり、次いで、適切な部位特異的DNAレコンビナーゼの一過性発現または直接の提供によってレポーターが欠失され、細胞を、レポーターの同時発現なしにPOIの分泌に切換える。MARは、FACSまたはMACSなどの高スループット方法論を用いて検出または選択される必要があり、MARは、膜結合ドメイン(MAD)に融合した任意の膜タンパク質または非膜タンパク質であり得、膜結合ドメイン(MAD)は、GPIアンカーシグナル配列(GASS)、または膜貫通ドメイン、または、細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドであり得る。たとえば、MARは、膜アンカー型GFPまたは膜アンカー型POIであり得る。細胞内レポータータンパク質の代わりに膜アンカー型レポータータンパク質を使用することの利点の1つとしては、レポータータンパク質の高濃度の蓄積後に生じるおそれのある細胞毒性を回避することである。配列番号1は、N末端のIL2シグナルペプチドおよびC末端のDAF GASSに融合したGFPのヌクレオチド配列を示す。ここでは、任意のGFP変異体または他の蛍光タンパク質、機能性シグナルペプチドまたは膜結合ドメインを使用することができる。
リツキサン重鎖可変配列(VH)を遺伝子合成し、制限部位Xba IとNhe Iとの間のヒトIgG1重鎖定常領域ゲノム配列を含む哺乳類発現ベクターにクローン化し、ベクターLB0−Hを作成した。シグナルペプチドを含むリツキサンVH配列は、配列番号9に示される。抗体重鎖の発現は、EF1αプロモータの制御下であった。当該ベクターは、安定な細胞選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子と、大腸菌増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを持っている。プラスミドマップを図9Aに示す。
DAF GPIアンカーシグナル配列(配列番号4)またはPDGFR TMドメイン配列(配列番号6)と、それに続くLoxPおよびイントロン3配列とに融合したヒトIgG1 CH3配列を合成し、LB1中の3番目のイントロンに挿入し、図5Cに示すように、ベクターLB3またはLB4をそれぞれ作成した。LB3およびLB4の重鎖定常領域の配列は、配列番号14および配列番号15にそれぞれ示される。LB0−K中の軽鎖発現カセットは、制限酵素EcoR VおよびAsc Iにより消化された。次いで、2625bpのDNAフラグメントをEcoR VおよびAsc I間のLB4にクローン化し、リツキサン発現ベクターLB37を作成した。プラスミドマップを図9Cに示す。リツキサン発現を評価するために、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、293F細胞に、軽鎖ベクターLB0−Kとともに、重鎖ベクターLB3、またはLB4を同時トランスフェクトした。
DAF GPIアンカーシグナル配列またはPDGFR TMドメイン配列ならびにそれに続くLoxPおよびイントロン3配列を合成し、LB1の3番目のイントロンに挿入し、図Dに示されるように、ベクターLB9またはLB10をそれぞれ作成した。LB9およびLB10の重鎖定常領域の配列は、配列番号16および配列番号17にそれぞれ示される。
コザック共通配列を持つ膜アンカー型GFP(配列番号1)に2つのLoxP部位を隣接させ、これをベクターLB0−HにおけるEF1αプロモータとリツキサンガンマ配列との間に挿入し、図1Aに記載したように、ベクターLB11を作成した。2つのLoxP部位間の配列をLB11において欠失させ、1つのLoxP部位のみを残してベクターLB11−LoxPを作成した。Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、293F細胞に、LB0−Kとともに、LB0−H、LB11、またはLB11−LoxPを同時トランスフェクトした。2日後、抗体レベルを実施例1に記載したのと同様にELISAによりアッセイした。LB11トランスフェクト細胞は、LB0−Hトランスフェクト細胞に対して10%未満しか生産せず(図10A)、これは、リツキサン重鎖遺伝子の上流におけるGFPカセットの存在が、リツキサンの発現を大きく減少させたことを示唆している。GFPカセットの除去後、LB11−LoxPは、LB0−Hと同等レベルでリツキサンを生産した(図10A)。LB11トランスフェクト細胞におけるGFPの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
IRES配列(配列番号18)をコザック共通配列を持つ膜アンカー型GFP(配列番号1)に融合させた。次いで、LoxP部位をN末端およびC末端の両方に付加した。全配列を、リツキサンガンマ終始コドンの下流でベクターLB0−HにおけるポリAシグナルの前に挿入し、図1Bに記載するように、ベクターLB14を作成した。293F細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いてLB14およびLB0−Kを同時トランスフェクトした。2日後、媒体中の抗体レベルを実施例1に記載したようにELISAによりアッセイし、これを図10Aに示す。LB11トランスフェクト細胞におけるGFPの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
Cre発現ベクターLB30を構築した。Cre cDNAは、ヒトコドン最適化され、核局在化のためにN末端においてMPKKKRK(配列番号19)のペプチドと融合させた。Creの発現は、ヒトEF1αプロモータによって進められた。
ヒュミラ軽鎖(配列番号20)の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Xba IとBsiW Iとの間のLB0−Kにクローン化し、ベクターLB42を作成した。ヒュミラ重鎖(配列番号22)の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Xba lとNhe Iとの間のLB4にクローン化し、ベクターLB25を作成した。LB42における軽鎖発現カセットは、制限酵素EcoR VおよびAsc Iにより消化された。次いで、2641bpのDNAフラグメントをEcoR VおよびAsc I間のLB25にクローン化し、ヒュミラ発現ベクターLB29を作成した。
実施例7で選択され、#27と称する1つの細胞株は、膜アンカー型ヒュミラを発現する。細胞株#27からの細胞を1μg/mlのビオチン化ヒトTNFα(ACRO Biosystems社)で30分間処理した。PBSで1回洗浄した後、細胞をストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲート(VectorLabs社)で30分間標識した。PBSで2回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析に共し、細胞表面ヒュミラ上でのTNFαの陽性の結合を示した(図14)。細胞株#27を、リツキサン発現ベクターLB37をトランスフェクトしたCHOS細胞の安定なプールに1:1000の比で添加した。ビオチン化TNFαおよびその後にストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートと結合後、細胞をFACS選別に供した。1000個の陽性細胞をプールに選別した。2週間培養後、FACS陽性細胞における抗体配列をRT−PCRにより増幅し、ヒュミラ抗体配列であることを確認した。
Claims (50)
- (a)プロモータと、(b)目的の遺伝子(GOI)と、(c)DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するレポーター遺伝子とを含む、DNA構築物。
- 前記DRRSは、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択される、請求項1に記載のDNA構築物。
- 前記レポーター遺伝子の上流にIRESをさらに含む、請求項1または3に記載のDNA構築物。
- 前記レポーター遺伝子は、膜アンカー型レポーター(MAR)分子をコードし、前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意の分子である、請求項1から3のいずれか1項に記載のDNA構築物。
- 前記MARは、膜アンカー型GFP、および目的の膜アンカー型タンパク質からなる群から選択される、請求項4に記載のDNA構築物。
- 前記レポーター遺伝子は、細胞内レポーター分子をコードする、請求項1から5のいずれか1項に記載のDNA構築物。
- 前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項1から6のいずれか1項に記載のDNA構築物。
- 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項7に記載のDNA構築物。
- 前記スプライス受容体配列は、選択的スプライシングのための手段を与え、発現される前記目的のタンパク質は、膜結合型または分泌型であり得る、請求項8に記載のDNA構築物。
- 前記目的の遺伝子は、組換え型タンパク質をコードする、請求項1から9のいずれか1項に記載のDNA構築物。
- 前記目的の遺伝子は、抗体をコードする、請求項1から10のいずれか1項に記載のDNA構築物。
- 前記抗体をコードする前記目的の遺伝子は、抗体ガンマ定常領域コード配列の3番目のイントロンにスプライス受容体配列を含む、請求項11に記載のDNA構築物。
- 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む、目的の遺伝子を宿主細胞内に送達するための発現ベクター。
- 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む細胞。
- 請求項14の細胞を含む細胞培養液。
- 部位特異的DNAレコンビナーゼが前記細胞培養液に加えられる、請求項15に記載の細胞培養液。
- 前記部位特異的DNAレコンビナーゼは、前記DNAレコンビナーゼをコードする発現ベクターの前記細胞培養液の前記細胞へのトランスフェクションにより与えられる、請求項16に記載の細胞培養液。
- 前記レポーターをコードする配列が、前記細胞培養液の前記細胞において欠失された、請求項16に記載の細胞培養液。
- 前記目的の遺伝子が発現され、対応する目的のたんぱく質(POI)が前記細胞培養培地に分泌される、請求項18に記載の細胞培養液。
- (a)プロモータと、(b)複数の目的の遺伝子を含むライブラリと、(c)DNAレコンビナーゼ認識配列(DRRS)が隣接するレポーター遺伝子とを含むDNA構築物。
- 前記ライブラリ内の前記目的の遺伝子は、スプライス受容体配列を有するイントロンと、それに続く膜結合配列とを含む、請求項20に記載のDNA構築物。
- 前記スプライス受容体配列は、選択的スプライシングのための手段を設け、発現される前記目的の遺伝子は、目的の膜結合型タンパク質または分泌型タンパク質をコード可能である、請求項21に記載のDNA構築物。
- 前記ライブラリは、抗体ライブラリである、請求項20に記載のDNA構築物。
- 前記抗体ライブラリは、親和性成熟ライブラリである、請求項23に記載のDNA構築物。
- 請求項20から23のいずれか1項に記載のDNA構築物を含む細胞ライブラリ。
- 請求項25の細胞ライブラリを含む細胞培養液。
- 細胞株スクリーニング方法であって、前記方法は、
(a) 請求項1から12のいずれか1項に記載のDNA構築物をトランスフェクトした宿主細胞を与えるステップと、
(b) 前記トランスフェクト細胞を培養するステップとを含み、前記レポータータンパク質が発現され、目的のタンパク質が前記細胞培養培地に分泌されてもよく、前記方法はさらに、
(c) 前記トランスフェクト宿主細胞をスクリーニングし、レポーター分子を発現する宿主細胞を選択するステップと、
(d) 前記選択された細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップとを含み、前記曝露後、前記細胞はもはや前記レポータータンパク質を発現せず、前記方法はさらに、
(e) 目的のタンパク質を前記細胞培養培地に分泌する細胞をスクリーニングするステップを含む、細胞株スクリーニング方法。 - 前記レポーター分子は、膜アンカー型レポーター(MAR)である、請求項27に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記レポーター分子は、細胞内レポーターである、請求項27に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記DNA構築物は、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択されるDRRSを含む、請求項27から29のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意のタンパク質である、請求項28に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記MARは、FACSまたはMACSにより前記細胞表面上で検出される、請求項31に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記DNA構築物によりコードされる前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項27から32のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項33に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記トランスフェクト宿主細胞は、部位特異的DNAレコンビナーゼに曝露される、請求項27から34のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記目的のタンパク質は、抗体である、請求項27から35のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- (a) 培養培地に宿主細胞を与えるステップと、
(b) 前記宿主細胞に請求項20に記載のDNA構築物をトランスフェクトするステップと、
(c) 前記トランスフェクト宿主細胞をスクリーニングし、レポーター分子を発現する宿主細胞を選択するステップと、
(d) 前記選択された宿主細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップと、
(e) 前記宿主細胞を細胞培養培地で培養するステップと、
(f) 前記細胞培養培地を所望の性質を有する目的のタンパク質についてスクリーニングするステップとを含む、細胞株スクリーニング方法。 - 前記レポーター分子は、膜アンカー型レポーター(MAR)である、請求項37に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記レポーター分子は、細胞内レポーターである、請求項37に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記DNA構築物は、FRT配列(フリッパーゼまたはFLPのためのDRRS)、LoxP(CreのためのDRRS)、およびattBまたはattP(φC31インテグラーゼのためのDRRS)からなる群から選択されるDRRSを含む、請求項37から39のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記MARは、細胞表面上で検出可能な任意のタンパク質である、請求項38に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記MARは、FACSまたはMACSにより前記細胞表面上で検出される、請求項41に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記DNA構築物によりコードされる前記目的の遺伝子は、2つ以上のエクソンおよび1つ以上のイントロンを有する、請求項37から42のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記目的の遺伝子のイントロンは、スプライス受容体配列と、それに続く膜結合配列とを含む、請求項43に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記トランスフェクト宿主細胞は、部位特異的DNAレコンビナーゼに曝露される、請求項37から44のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 前記目的のタンパク質は、抗体である、請求項37から45のいずれか1項に記載の細胞株スクリーニング方法。
- 目的のタンパク質をスクリーニングする細胞ライブラリをスクリーニングする方法であって、前記方法は、膜アンカー型レポータータンパク質を有する細胞を、培養培地に目的のタンパク質を分泌する細胞に切換えることを含み、前記方法は、
(a) 宿主細胞を培養培地に与えるステップと、
(b) 前記宿主細胞に請求項20に記載のDNA構築物をトランスフェクトし、目的の膜アンカー型タンパク質のライブラリを発現する細胞ライブラリを生成するステップと、
(c) 前記細胞ライブラリをスクリーニングし、所望の性質を有する目的の膜アンカー型タンパク質を発現する宿主細胞を選択するステップと、
(d) 前記選択された宿主細胞をDNAレコンビナーゼに曝露するステップと、
(e) 前記目的のタンパク質のための前記細胞培養培地を所望の性質を有する前記目的のタンパク質についてスクリーニングするステップとを含む、スクリーニング方法。 - 前記ライブラリは、抗体ライブラリである、請求項47に記載のスクリーニング方法。
- 前記所望の性質は、抗原の結合である、請求項47に記載のスクリーニング方法。
- 前記所望の性質は、生物活性である、請求項47に記載のスクリーニング方法。
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