JP2016504042A

JP2016504042A - 改変ａｃｅ２ポリペプチド

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Publication number: JP2016504042A
Application number: JP2015552067A
Authority: JP
Inventors: ロイブナー，ハンス; ペバル，ベルンハルト; シュースター，マンフレート; シュトランナー，シュテファン
Original assignee: アペイロンバイオロジックスアーゲー
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2014-01-13
Publication date: 2016-02-12
Also published as: JP2019070019A; AU2014204769B2; CA2897251A1; US9757433B2; WO2014108530A1; KR20150110607A; EP2943216B1; RU2015127497A; ES2732282T3; EP2943216A1; CA2897251C; AU2014204769A1; JP6715963B2; CN105263512A; US20150353910A1

Abstract

本発明は改変アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）ポリペプチドならびにその医薬および分析用途に関する。特に、本発明はZn2+枯渇、Zn2+非含有、混合金属および金属イオン置換ACE2、ならびにこれらの変異体の製造方法およびその用途、例えば、これらのACE2変異体の治療および分析用途に関する。【選択図】なし

Description

本発明は改変アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）変異体およびその分析用途に関する。特に、本発明はZn²⁺枯渇、Zn²⁺非含有、混合金属および金属イオン置換ACE2、ならびにこれらの変異体の製造方法およびその用途、例えば、これらのACE2変異体の治療および分析用途に関する。

ACE2（アンジオテンシン変換酵素2; アンジオテンシン変換酵素関連カルボキシペプチダーゼとしても公知; EC（Enzyme Commission）番号: 3.4.17.23）はレニンアンジオテンシン系（RAS）の鍵メタロプロテアーゼである（Donoghueら, Circ. Res. 87, 2002: e1-e9; Tipnisら, J. Biol. Chem., 275(43), 2000, 33238-43を参照されたい）。ACE2は最初はACE類似体として特定された。TipnisらはCHO細胞からのACE2（その場合は尚もACEHと呼ばれていた）の単離およびそのcDNAの単離を記載している。

ACEおよびACE2は共に、触媒亜鉛原子を中心に有するメタロプロテアーゼである。ACEとACE2とは活性およびメカニズムの点で異なることが後に見出された。ACEは血圧を上昇させるが、ACE2は血圧を低下させる。メカニズム的には、ACEはペプチジルジペプチダーゼであるが、ACE2はカルボキシペプチダーゼである（Towlerら, J. Biol Chem 279, 2004, 17996-18007）。

ACE2は主として膜固定亜鉛メタロプロテアーゼとして存在し、これは血液循環中で作用し、罹患器官における局所作用および血液循環を介した全身作用を誘導する。ACE2は血管系およびほとんどの器官において発現されるが、主として腎臓、肝臓、心臓、肺および精巣において発現される。それはモノペプチダーゼとして多くの基質を切断し、それにより基質を活性化または不活性化する。そのような基質には、RASのペプチド、例えば、アンジオテンシン1-7（Ang 1-7）へと切断されるアンジオテンシンII（Ang II）、およびアンジオテンシン1-9（Ang 1-9）へと切断されるアンジオテンシンI（Ang I）、およびアペリン、Pro-ダイノルフィン、デス-Arg-ブラジキニンなどが含まれる（Vickers, C.ら, J. Biol. Chem., 277, 2002, 14838-14843）。ACE2はACE-Ang II-AT₁受容体軸に対する対抗調節体（counter-regulator）としてRAS内で中心的な役割を果たす。ACE2は、アンジオテンシンIIによりもたらされる炎症性、高血圧性、増殖性および血管収縮性軸から、Ang 1-7を生成するACE2によるAng IIの切断（Danilczyk, U. & Penninger, Circ. Res., 98, 2006, 463-471; Vickers, C.ら, J. Biol. Chem., 277, 2002, 14838-14843）、そしてより低い度合ではあるが、Ang 1-9を生成するACE2によるAng Iの切断により誘発される対抗調節軸へと変化することにより作用する。ACE2は恒常性の重要なモジュレーターであるとみなされている（Ferrario, C.M.ら, J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1998, 1716-1722）。ACE2の触媒活性はAngIIの場合にはAngIの場合より約400倍高い（Vickers, C.ら, J. Biol. Chem., 277, 2002, 14838-14843）。ACE2の可溶性形態も循環中に見出され、これは膜貫通ドメインを欠いている。多種多様な治療アプローチにおける活性化合物として使用されるのに膜結合形態より適しているのはこの可溶性形態である。

ACE2の可溶性および組換え形態は、生命を脅かす疾患、例えば急性肺および心臓病態ならびに線維性および腫瘍性疾患を治療するために開発されている。

ACE対抗調節体としてのACE2の機能は国際特許出願、国際公開番号WO2004/000367において最初に報告された。該出願は、高血圧、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、心筋梗塞、動脈硬化および腎不全ならびに肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）のような種々の疾患の治療的処置を開示している。

国際特許出願、国際公開番号WO2004/023270はACE2の結晶化を記載している。

国際特許出願、国際公開番号WO2008/151347および米国特許出願、公開番号US2010/310546はACE2グリコシル化およびACE2二量体を記載している。

ACE2活性の測定方法は、例えば国際特許出願、国際公開番号WO 2008/046125 Aおよび米国特許出願、公開番号US 2010/0261214に記載されている。

国際特許出願、国際公開番号WO2009/086572は、肝疾患、特に炎症性肝疾患および線維症の治療におけるACE2の使用を記載している。

国際特許出願、国際公開番号WO2009/076694はACE2での免疫療法を記載している。

国際特許出願、国際公開番号WO2009/124330はACE2での種々の腫瘍の治療を記載している。

ACE2は、亜鉛含有メタロプロテアーゼ、いわゆる亜鉛プロテアーゼとして記載されている。臨床的使用のための現在の十分に活性な製剤は等モルの亜鉛／タンパク質比を用いている。それにより、亜鉛は該酵素の活性中心内で錯体（複合体）形成している。薬品製剤は通常、酵素結合亜鉛の喪失を抑制することにより酵素活性を安定化させるために、ZnCl₂で補足される。

国際公開第2004/000367号パンフレット国際公開第2004/023270号パンフレット国際公開第2008/151347号パンフレット米国特許出願公開番号2010/310546号国際公開第2008/046125号パンフレット米国特許出願公開番号第2010/0261214号国際公開第2009/086572号パンフレット国際公開第2009/076694号パンフレット国際公開第2009/124330号パンフレット

Donoghueら, Circ. Res. 87, 2002: e1-e9; Tipnisら, J. Biol. Chem., 275(43), 2000, 33238-43 Towlerら, J. Biol Chem 279, 2004, 17996-18007 Vickers, C.ら, J. Biol. Chem., 277, 2002, 14838-14843 Danilczyk, U. & Penninger, Circ. Res., 98, 2006, 463-471; Ferrario, C.M.ら, J. Am. Soc. Nephrol., 9, 1998, 1716-1722

発明の簡潔な説明
第1の実施形態においては、活性部位内におけるZn²⁺が枯渇したレベルのアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）ポリペプチドの集団を提供する。

本発明の第1の態様においては、活性部位がいずれの金属イオンをも実質的に含有しないACE2ポリペプチドの集団を提供する。

本発明の第2の態様においては、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺ およびAl³⁺から選択される遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより活性部位が占拠された、ACE2ポリペプチドの集団を提供する。

本発明の第3の態様においては、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺ およびAl³⁺から選択される1以上の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより占拠されており亜鉛により占拠されていない活性部位、ACE2ポリペプチドの集団を提供する。

第2の実施形態においては、溶液中のACE2基質を切断するための、ACE2ポリペプチドの集団の使用を提供する。

第3の実施形態においては、
a．細胞系内でACE2ポリペプチドを発現させ、
b．該発現ポリペプチドを単離し、
c．金属-キレート化剤の添加により、活性部位内に結合した金属イオンの一部または全部を除去する工程を含む、ACE2ポリペプチドの集団の製造方法を提供する。

第4の実施形態においては、ACE2ポリペプチドの集団と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

第5の実施形態においては、療法における使用のための、ACE2ポリペプチドの集団を提供する。

第6の実施形態においては、高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防における使用のための、ACE2ポリペプチドの集団を提供する。

第6の実施形態においては、高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の製造における、ACE2ポリペプチドの集団の使用を提供する。

第7の実施形態においては、高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防方法であって、それを要する患者にACE2ポリペプチドの集団の有効量を投与することを含む方法を提供する。

図1は、分子量参照標準（複数のピークを有する曲線）と比較されたZn非含有透析ACE2（8.4分の保持時間において1つの主ピークを有する曲線）のSEC + HPLC分析を示す。図2は、種々の製剤において蛍光性切断産物の検出により測定されたACE2活性を示す。図3は、rACE2サンプル、1μMの金属イオン濃度および15分間のインキュベーションに関してサイクル（1分）ごとにプロットされた測定された相対的蛍光単位（RFU）を示す。図4は、rACE2サンプル、1μMの金属イオン濃度および80分間のインキュベーションに関してサイクル（1分）ごとにプロットされた測定された相対的蛍光単位（RFU）を示す。図5はヒトACE2の完全長アミノ酸配列（配列番号1）を示す。アミノ酸1-17はシグナル配列であり、18-740は細胞外ドメインを形成しており、741-761は膜貫通ドメインを形成しており、762-805は細胞質ドメインを形成している。

発明の詳細な説明
亜鉛はACE2の構造および活性のための絶対的要件ではないことが見出された。また、亜鉛は、酵素活性を保持したままで他の金属イオンにより置換されうる。したがって、本発明はACE2ポリペプチドの更なる変異体、特に、活性部位における亜鉛のレベルが枯渇した、あるいは活性部位が亜鉛を（またはいずれの他の金属イオンをも）実質的に含有しないACE2ポリペプチド、活性部位が亜鉛以外の別の金属により占拠されているACEポリペプチド、および活性部位内に亜鉛と別の金属イオンとの混合物を有するACE2ポリペプチドの集団を提供する。

「Zn²⁺ 枯渇ACE2（ポリペプチド）」は「亜鉛枯渇ACE2（ポリペプチド）」または「活性部位内のZn²⁺（または亜鉛）のレベルが枯渇したACE2（ポリペプチド）」とも称され、本明細書の全体において互換的に用いられる語である。そのような亜鉛枯渇ACE2は、ACE2の亜鉛結合部位における亜鉛、特にZn²⁺の欠如またはそのレベルの低下により特徴づけられる。あるいは、亜鉛結合部位は本明細書においては「活性部位」と称される。ACE2ポリペプチドが二量体形態である場合、亜鉛枯渇二量体の一例は、該二量体内のACE2単量体の少なくとも1つが該単量体の活性部位（すなわち、亜鉛結合部位）内の亜鉛原子を欠いているものである。この語は、亜鉛:ACE2モル化学量論が1:1未満であるACE2ポリペプチドの集団をも意味する。当業者は、本明細書における記載が個別化形態のポリペプチドを意味しうる場合および該記載がポリペプチドの集団を必然的に意味する場合を容易に理解するであろう。

1つの実施形態においては、金属イオン非含有ACE2ポリペプチドである亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドを提供する。本明細書中で用いる「亜鉛非含有ACE2」および「金属イオン非含有ACE2（ポリペプチド）」は互換的に用いられる。そのような金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは、活性部位内に存在する亜鉛または他の金属イオンを実質的に含有しない。1つの実施形態においては、金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは、検出可能なレベルの亜鉛または他の金属イオンを活性部位内に有さない。

もう1つの実施形態においては、金属置換ACE2ポリペプチドである亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドを提供する。本明細書中で用いる「金属置換ACE2（ポリペプチド）」は、天然Zn²⁺イオン以外の1以上の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより活性部位が占拠された、ACE2ポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団を意味する。

もう1つの実施形態においては、混合金属ACE2ポリペプチドである亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドを提供する。本明細書中で用いる「混合金属ACE2（ポリペプチド）」は、活性部位内の天然で結合している亜鉛の一部が除去されており、別の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンで置換されている、ACE2ポリペプチドの集団を示すために用いられる。したがって、混合金属ACE2ポリペプチドの集団においては、ポリペプチドに対してほぼ等モル量の亜鉛が活性部位内に存在し、遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンの更に一部が他の活性部位内に存在するであろう。2以上の個々の金属イオンが単一活性部位を同時に占拠することは可能でないことが明らかに理解され、したがって、混合金属ACE2ポリペプチドにおいては、活性部位の占拠は集団全体で評価される。

本明細書中で用いる「集団」は、その集団の特徴が平均として理解される2以上のポリペプチドを意味する。特に、それは本明細書においては、例えば、例えば遷移金属イオンにより占拠された活性部位に対する特定の比率の空部位を有する、ACEポリペプチドの集団を示すために用いられる。該集団内では、個々のACE2ポリペプチドは、占拠された又は空の活性部位のみを有しうるが、全集団では、与えられた比率が達成される。

「遊離亜鉛」または「遊離金属イオン」は、遊離しており従ってACE2ポリペプチドの亜鉛結合部位への進入に利用可能な、それぞれ亜鉛または別の金属イオンとして理解されるべきであり、例えば、製剤または組成物における他の成分、例えばキレート化剤と錯体（複合体）形成していない金属イオンまたは亜鉛イオンとして理解されるべきである。

「貧金属（poor metal）（元素／イオン）」および「ポスト遷移（post-transition）金属（元素／イオン）」は本出願においては互換的に用いられる。この語は以下の金属イオンを含むと理解されるべきである：アルミニウム（Al）、ガリウム（Ga）、インジウム（In）、スズ（Sn）、タリウム（Tl）、鉛（Pb）、ビスマス（Bi）およびポロニウム（Po）。好ましくは、ポスト遷移金属は、アルミニウムおよびスズ、例えばAl²⁺、Al³⁺およびSn²⁺から選択される。この語は、全ての可能な正荷電酸化状態のポスト遷移金属、好ましくは、2+または3+の酸化状態のイオン、最も好ましくは、2+の酸化状態のイオンを含むと意図される。

「遷移金属（元素／イオン）」は周期表の第3族〜第12族かつ第4周期、第5周期、第6周期および第7周期の元素、例えば、クロム（Cr）、コバルト（Co）、ニッケル（Ni）、マンガン（Mn）、銅（Cu）、鉄（Fe）、亜鉛（Zn）、モリブデン（Mo）、ルテニウム（Ru）、ロジウム（Rh）、パラジウム（Pd）、銀（Ag）およびカドミウム（Cd）を意味する。この語は、全ての可能な正荷電酸化状態の遷移金属、好ましくは、2+または3+の酸化状態のイオンを含むと意図される。1つの実施形態においては、遷移金属元素は周期表の第3族〜第12族の第4周期または第5周期の元素である。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺およびPb²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺、Ni²⁺およびPb²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、金属イオンはFe³⁺、Cu²⁺およびMn²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺およびNi²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はFe³⁺およびMn²⁺から選択される。

ヒトACE2ポリペプチド（UniProt配列データベースエントリー: Q9BYF1）はシグナルペプチド（アミノ酸1-17）、細胞外ドメイン（アミノ酸18-740）、ヘリックス膜貫通ドメイン（アミノ酸741-761）および細胞質ドメイン（アミノ酸762-805）を含む。

ACE2の亜鉛結合領域は亜鉛結合モチーフHEXXHを含有し、これは配列番号1の完全な805アミノ酸長のACE2配列のアミノ酸374-378（太字）に対応する。ACE2の結晶構造は天然酵素（PDBデータベースエントリー: 1R42）に関して、およびインヒビター結合酵素（PBDデータベースエントリー: 1R4L）に関して公開されており、Zn²⁺結合部位における亜鉛イオンが例示されている。

本発明においては、ACE2ポリペプチドは完全長ACE2ポリペプチドまたはその断片でありうる。1つの実施形態においては、該断片は配列番号1のアミノ酸374-378を含む。1つの実施形態においては、ACEポリペプチドは配列番号1のアミノ酸1-740を含む。もう1つの実施形態においては、ACE2ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠く、および／またはN末端シグナルペプチドを欠く可溶性ACE2である。本発明のもう1つの実施形態においては、ACE2ポリペプチドはACE2の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。もう1つの実施形態においては、ACE2ポリペプチドは配列番号1のアミノ酸18-740またはアミノ酸18-615を含む、またはそれらからなる。

ACEポリペプチドまたはACE2ポリペプチド断片には、ヒトACE2またはその断片またはそのいずれかの相同オルソログ（同一または類似天然質的活性を有するもの）が含まれる。したがって、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類またはウシに由来するACE2も本発明に含まれる。1つの実施形態においては、ACE2ポリペプチドはヒト由来のものである。ACE2は、同一Ang II基質を有する、全哺乳動物における普遍的酵素である。したがって、治療用途には、ACEポリペプチドは外来生物において使用されうる。したがって、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類またはウシは、ACE2の起源には無関係に、本発明のACE2で治療されうる。好ましくは、免疫原性応答のリスクを最小にするために、治療用ACE2ポリペプチドは、治療されるべき同一生物に由来し、例えば、ヒト患者の治療にはヒト由来のACE2ポリペプチドが使用される。

本発明のACE2ポリペプチドは所望によりグリコシル化されていてもよい。天然ヒトACE2の可溶性ドメインは7個のN-グリコシル化部位を有する。1つの実施形態においては、配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690に対応する本発明のACE2ポリペプチドの可能なN-グリコシル化位置の3、4、5、6または7個がグリコシル化されており、および／またはACE2ポリペプチドは10%（全ACE2ポリペプチドに対する重量%）を超える、または11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%を超える、特に、20%、21%、22%、23%、24%または25%（重量%）を超える糖含量を有する。

ACE2ポリペプチドは単量体または二量体形態でありうる。二量体として存在する場合、1個または2個の亜鉛イオンが枯渇している、存在しない、および／または別の金属イオンで置換されていることが可能である。

ACE2ポリペプチドの製造方法は国際特許出願、国際公開番号WO2008/151347に記載されており、その実施例1および12頁第2完全段落〜13ページ第2完全段落末（参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。

本発明においては、亜鉛枯渇ACE2ポリペプチド、金属イオン非含有ACE2ポリペプチド、金属置換ACE2ポリペプチドおよび混合金属ACE2ポリペプチドは、特にアミノ酸配列、グリコシル化パターン、起源および二量体／単量体形態に関して前記に記載されているACE2ポリペプチドまたは断片のいずれかを含みうると理解されるであろう。

1つの実施形態においては、ACE2ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸18-740を含む；配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690からなる群から、独立して選択される1以上の位置でグリコシル化されている；および20重量%を超える糖含量を有する二量体ヒトACE2ポリペプチドである。

本発明の第1の態様においては、活性部位内のZn²⁺のレベルが枯渇した、ACE2ポリペプチドを提供する。1つの実施形態においては、Zn²⁺:ACE2のモル比は<1:1、例えば、<0.99:1、<0.98:1、<0.95:1、<0.92:1、または<0.90:1である。

本発明の第2の態様においては、亜鉛枯渇ACE2分子は亜鉛（Zn²⁺）を実質的に含有しない。しかし、少量の不純物が残存している可能性があり、それは本発明に含まれる。もう1つの実施形態においては、Zn²⁺:ACE2のモル比は<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1である。Zn²⁺:ACE2の比は、ACE2の亜鉛結合部位内に存在する亜鉛を意味する。これは、例えば、該ポリペプチドの天然精製または透析の後、得れらた固体物質をICP-MS分析に付すことにより測定されうる。1つの方法においては、亜鉛枯渇ACE2を抗ACE2抗体被覆ビーズへの結合により捕捉し、亜鉛非含有溶離液で溶出し、ついでICP-MS分析に付すことが可能である。これらの方法を用いて、亜鉛対ACE2ポリペプチドの、得られた比が、活性部位におけるポリペプチドへの亜鉛の錯体（複合体）形成によるものであることが確認されうる。

Zn²⁺が結合部位へ移動するのを避けるために、本発明の亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドの集団を含む製剤または組成物はまた、遊離亜鉛をほとんど（前記比に従う）または全く含まない。遊離亜鉛レベル（およびACE2の活性部位に結合している亜鉛）は、個々の製剤または組成物において、キレート化剤、例えばEDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよび／またはジメルカプロール（英国抗ルイサイトまたはBALとも称される）の添加により低減されうる。必要とされるキレート化剤の個々の過剰量は当業者により容易に決定され、とりわけ、使用されるキレート化剤の性質、pH値、および除去されるべき金属イオンのタイプに左右されるであろう。活性部位から天然亜鉛を除去するためには、100倍の範囲の過剰量のEDTAが適している（後記実施例2を参照されたい）。

したがって、亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドの集団を含む製剤または組成物においては、前記のZn²⁺:ACE2の比はACE2結合部位における亜鉛の量を意味する。もう1つの実施形態においては、製剤中の亜鉛イオンの量は金属-キレート化剤の添加により低減される。そのようなキレート化剤の量は後記のとおりのものでありうる。

本発明はまた、ACE2ポリペプチドを細胞内で発現させ、該ACE2ポリペプチドを単離し、好ましくは金属-キレート化剤を使用して、該ACE2ポリペプチドからZn²⁺を除去する工程を含む、Zn²⁺枯渇ACEポリペプチドの製造方法を提供する。ACEポリペプチドは亜鉛の存在下または非存在下で発現されうる。しかし、ほとんどの細胞系においては、亜鉛イオンが存在する可能性があり、したがって、発現されたACE2ポリペプチドは通常、活性部位内に亜鉛を含有する。この結合亜鉛は後に除去可能であり、例えば、金属-キレート化剤、例えばEDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよび／またはジメルカプロールを使用することにより、あるいはイオン交換クロマトグラフィーを使用することにより除去されうる。もう1つの実施形態においては、金属-キレート化剤は、過剰量で、例えば、該製剤または組成物中の亜鉛の全濃度（すなわち、溶液中および活性部位内の亜鉛濃度）の少なくとも2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍の濃度で使用される。

本発明の第3の態様においては、ACE2ポリペプチドの活性部位は、亜鉛を含むいずれの金属イオンをも実質的に含有しない。しかし、少量の不純物が残存している可能性があり、それは本発明に含まれる。もう1つの実施形態においては、金属イオン:ACE2のモル比は<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1である。金属イオン:ACE2の比は、ACE2の活性部位内に存在する金属イオンを意味する。これは、例えば、該ポリペプチドの天然精製または透析の後、得れらた固体物質をICP-MS分析に付すことにより測定されうる。1つの方法においては、金属イオン非含有ACE2を抗ACE2抗体被覆ビーズへの結合により捕捉し、金属イオン非含有溶離液で溶出し、ついでICP-MS分析に付すことが可能である。これらの方法を用いて、金属イオン対ACE2ポリペプチドの、得られた比が、活性部位におけるポリペプチドへの金属イオンの錯体（複合体）形成によるものであることが確認されうる。

金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは酵素的に不活性であるが、構造的に安定である。それらは凝集したり分解したりせず、適当な金属イオンを与えることにより活性ACE2へと再構成されうる。該ポリペプチドの高い安定性は、冷却期間の中断（例えば、輸送中）のような不良貯蔵条件中でさえも長い貯蔵寿命を伴って、貯蔵中に有利でありうる。理論に制限されるものではないが、長期安定性は活性の欠如ゆえに改善されうる可能性があり、活性の欠如は自己タンパク質分解を防ぐことが可能であり、および／またはルイス酸として作用することにより活性部位の亜鉛媒介性酸化を低減しうる。更に、本発明のACE2ポリペプチドを使用して、金属枯渇または置換によりACE2活性またはバイオアベイラビリティを調節または微調整することが可能である。

本発明の亜鉛枯渇、亜鉛非含有および金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは、金属イオンを含む溶液中でACE2基質を切断するためのペプチダーゼとして使用されうる。あるいは、金属イオンを含む溶液中でACE2基質を亜鉛枯渇、亜鉛非含有および／または金属イオン非含有ACE2ポリペプチドと接触させることを含む、ACE2基質を切断する方法を提供する。金属イオンを含む溶液において、亜鉛枯渇、亜鉛非含有および／または金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは遊離金属イオンを取り込み、活性部位内でそれをキレート化し、それにより金属置換ACE2ポリペプチド、例えば亜鉛再構成ACE2へと再構成し、その触媒活性を再獲得する。

そのような金属含有溶液においては、該金属イオンは、元素の周期表の遷移金属元素またはポスト遷移金属元素から選択される。1つの実施形態においては、該金属イオンは正に、特に2+または3+に荷電している。いずれかのそのような金属はACE2の亜鉛結合部位を占拠して、ACE2の活性を維持させうる。亜鉛はまた、ACE2の活性を回復させるために、他の金属イオンにより置換されうる。元素の周期表の遷移元素は第4周期、第5周期、第6周期および第7周期における第3族〜第12族のものであり、Cr、Co、Ni、Mn、Cu、Fe、Zn、Mo、Ru、Rh、Pd、AgおよびCd、例えばCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺およびPb²⁺を包含する。他の実施形態においては、遷移元素は第4周期または第5周期の元素である。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺、Ni²⁺およびPb²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、金属イオンはFe³⁺、Cu²⁺およびMn²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺およびNi²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はFe³⁺およびMn²⁺から選択される。ポスト遷移金属は貧金属とも称され、Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、例えばAl²⁺、Al³⁺およびSn²⁺から選択される。1つの実施形態においては、ポスト遷移金属は例えばアルミニウムおよびスズから選択される。

ACE2基質の例には、アペリン、Pro-ダイノルフィン、デス-Arg-ブラジキニン、ブラジキニン、アンジオテンシンI（Ang I; これはアンジオテンシン1-9 [Ang 1-9]へと切断される）、アンジオテンシンII（Ang II; これはアンジオテンシン1-7 [Ang 1-7]へと切断される）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、幾つかの人工基質が存在し、例えば、US2010/0261214（3頁段落[0032]を参照されたい; それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているもの、例えばMca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH (Mca: (7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル)が挙げられる。人工基質は標識されることが可能であり、例えば、切断されると光学的シグナルを生成するように発蛍光団および消光団の両方を含みうる。ACE基質を切断するための亜鉛枯渇、亜鉛非含有および／または金属イオン非含有ACE2ポリペプチドの使用および方法は、切断産物を検出する工程を更に含みうる。

ACE基質を切断するための亜鉛枯渇、亜鉛非含有および／または金属イオン非含有ACE2ポリペプチドの使用および方法は、例えば、治療用途のために、または対象において或る生理的効果を得るために、インビボで実施されうる。あるいは、該方法および使用は、例えば、本発明のACE2ポリペプチドでAngIまたはAngIIを切断することによりAngIまたはAngIIを検出するために、サンプル中のACE2の基質を切断するためにインビトロで用いられうる。所望により、切断産物が検出される。1つの実施形態においては、サンプルは血漿または血清サンプルである。ヒト血漿中の金属イオン非含有ACE2ポリペプチドは亜鉛含有または亜鉛飽和ACE2と同じ酵素活性を示す（実施例3を参照されたい）。活性部位内に取り込まれ酵素活性を再構成させるのに十分な量の遊離亜鉛がヒト血漿中に存在すると考えられている。

本発明の第4の態様においては、1以上の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより活性部位が占拠されているがZn²⁺によっては活性部位が占拠されていない金属イオン置換ACE2ポリペプチドまたは金属イオン置換ACE2ポリペプチドの集団を提供する。1つの実施形態においては、該金属イオンは正に、特に2+または3+に荷電している。もう1つの実施形態においては、元素の周期表の遷移元素は第4周期、第5周期、第6周期および第7周期における第3族〜第12族のものであり、Cr、Co、Ni、Mn、Cu、Fe、Zn、Mo、Ru、Rh、Pd、AgおよびCd、例えばCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺およびPb²⁺を包含する。他の実施形態においては、遷移元素は第4周期または第5周期の元素である。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺、Ni²⁺およびPb²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、金属イオンはFe³⁺、Cu²⁺およびMn²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺およびNi²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はFe³⁺およびMn²⁺から選択される。ポスト遷移金属は貧金属とも称され、Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、例えばAl²⁺、Al³⁺およびSn²⁺から選択される。1つの実施形態においては、ポスト遷移金属はアルミニウムおよびスズから選択される。疑義を避けるために記載するものであるが、金属イオン置換ACE2ポリペプチドは、前記の遷移金属およびポスト遷移金属からの金属イオンのいずれかの組合せを含みうる。

ACE2の活性部位に結合した天然亜鉛イオンは、触媒活性を保有したまま他の金属イオンにより置換されうる。該金属イオンは前記の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンから選択される。金属置換ACE2ポリペプチドはこれらの金属のいずれか1つ又はそれらの組合せを含みうる。

金属置換ACE2ポリペプチドは、ACE2酵素が亜鉛を実質的に含有しない製剤または組成物中で提供されうる。しかし、亜鉛の少量の不純物が残存している可能性があり、これは本発明の範囲内であるとみなされる。

したがって、1つの実施形態においては、天然亜鉛は前記の別の遷移金属またはポスト遷移金属イオンにより実質的に完全に置換されている。もう1つの実施形態においては、該金属イオン:ACE2のモル比は>0.10:1、>0.15:1、>0.20:1、>0.25:1、>0.30:1、>0.35:1、>0.40:1、>0.45:1、>0.50:1、>0.55:1、>0.60:1、>0.65:1、>0.75:1、>0.80:1、>0.85:1、>0.90:1、>0.92:1、>0.95:1、>0.98:1、>0.99:1または約1.00:1である。更にもう1つの実施形態においては、各個のACE2ポリペプチドは1個の置換金属イオンを含有する。金属置換ACE2ポリペプチドの製剤または組成物はいずれかの金属置換体またはその組合せの過剰の金属イオンを含みうる。製剤または組成物は金属置換ACE2ポリペプチドの濃度の少なくとも1.1倍、1.3倍、1.5倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、7.5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍または更には100倍の濃度の追加的な金属イオンを更に含みうる。

本発明の第4の態様においては、一部のZn²⁺および一部の1以上の他の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオン（これは正に、特に2+または3+に荷電しうる）を活性部位内に含む混合金属ACE2ポリペプチドの集団を提供する。1つの実施形態においては、混合金属ACE2ポリペプチドの集団はZn²⁺と、Cr、Co、Ni、Mn、Cu、Fe、Mo、Ru、Rh、Pd、AgおよびCd、例えばCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺およびPb²⁺から選択される遷移元素から選択される少なくとも1つの金属イオンとを含む。他の実施形態においては、遷移元素は第4周期または第5周期の元素である。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺、Ni²⁺およびPb²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、金属イオンはFe³⁺、Cu²⁺およびMn²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はCo²⁺およびNi²⁺から選択される。もう1つの実施形態においては、遷移金属はFe³⁺およびMn²⁺から選択される。ポスト遷移金属はAl、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、例えばAl²⁺、Al³⁺およびSn²⁺から選択される。1つの実施形態においては、ポスト遷移金属はアルミニウムおよびスズから選択される。疑義を避けるために記載するものであるが、混合金属ACE2ポリペプチドは、前記の、亜鉛を伴う又は伴わない遷移金属およびポスト遷移金属からの金属イオンのいずれかの組合せを含みうる。

混合金属ACE2ポリペプチドは前記の亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドから製造される。したがって、1つの実施形態においては、金属置換ACE2ポリペプチドにおけるZn²⁺:ACE2のモル比は<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1である。Zn²⁺:ACE2の比は、ACE2の亜鉛結合部位内に存在する亜鉛を意味する。これは前記のとおりに測定されうる。

Zn²⁺が結合部位へ移動するのを避けるために、本発明の亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドの集団を含む製剤または組成物はまた、遊離亜鉛をほとんど（前記比に従う）または全く含まない。遊離亜鉛レベル（およびACE2の活性部位に結合している亜鉛）は、個々の製剤または組成物において、同様に前記のとおりのキレート化剤の添加により低減されうる。

本発明は更に、ACE2ポリペプチドを細胞内で発現させ、該ACE2ポリペプチドを単離し、好ましくは金属-キレート化剤を使用して、該ACE2ポリペプチドからZn²⁺を除去または部分的に除去して、亜鉛非含有または亜鉛枯渇ACE2ポリペプチドを得、ついで該ポリペプチドを遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンと接触させる工程を含む、金属置換ACE2ポリペプチドまたは混合金属ACE2ポリペプチドの製造方法を提供する。ACEポリペプチドは亜鉛の存在下または非存在下で発現されうる。しかし、ほとんどの細胞系においては、亜鉛イオンが存在する可能性があり、したがって、発現されたACE2タンパク質は通常、活性部位内に亜鉛を含有する。この結合亜鉛は後に除去可能であり、例えば、金属-キレート化剤、例えばEDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよび／またはジメルカプロールを使用することにより、あるいはイオン交換クロマトグラフィーを使用することにより除去されうる。もう1つの実施形態においては、金属-キレート化剤は、過剰量で、例えば、該製剤または組成物中の亜鉛の全濃度（すなわち、溶液中および活性部位内の亜鉛濃度）の少なくとも2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍の濃度で使用される。亜鉛（および所望により金属-キレート化剤）の完全または部分的除去の後、遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンを亜鉛枯渇または亜鉛非含有ACE2ポリペプチドと接触させ、これは該酵素の亜鉛結合部位内に容易に取り込まれる。

金属置換および混合金属ACE2ポリペプチドの酵素活性は金属置換体のそれぞれに関して異なる。幾つかの金属イオンは低濃度においては、天然亜鉛含有ACE2ポリペプチドと同一の活性を示すが、より高い濃度においては、低下した触媒活性を有することが示されている。他の金属イオンは、より高い濃度においてのみ、天然亜鉛含有ACE2ポリペプチドに類似した触媒活性を達成する（実施例4を参照されたい）。したがって、金属置換または混合金属ACE2ポリペプチドの比触媒活性は、種々の金属イオンおよびそれらの供給濃度を選択することにより微調整されうる。いずれかの特定の用途のための適当な金属イオンおよび濃度を選抜し選択することは当業者の能力の範囲内である。

したがって、ACE2ポリペプチドの集団の触媒活性をモジュレーションするための、遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオン（前記で定義されたとおり）の使用であって、一部の亜鉛イオンを該金属イオンで置換することを含む使用も提供する。更に、一部の亜鉛イオンを遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオン（前記で定義されたとおり）で置換することを含む、ACE2ポリペプチドの集団の触媒活性をモジュレーションする方法を提供する。更に、溶液中のACE2基質を切断するための、金属置換ACE2ポリペプチドまたは混合金属ACE2ポリペプチドの集団の使用を提供する。また、ACE2基質を溶液中で金属置換ACE2または混合金属ACE2ポリペプチドの集団と接触させることを含む、ACE2基質を切断する方法を提供する。

ACE基質を切断するための亜鉛枯渇、亜鉛非含有および／または金属イオン非含有ACE2ポリペプチドの使用および方法は、例えば、治療用途のために、または対象において或る生理的効果を得るために、インビボで実施されうる。あるいは、該方法および使用は、例えば、本発明のACE2ポリペプチドでAngIまたはAngIIを切断することによりAngIまたはAngIIを検出するために、サンプル中のACE2の基質を切断するためにインビトロで用いられうる。所望により、切断産物が検出される。1つの実施形態においては、サンプルは血漿または血清サンプルである。

本発明の第5の態様においては、亜鉛枯渇ACE2ポリペプチド、亜鉛非含有ACE2ポリペプチド、金属置換ACE2ポリペプチドおよび混合金属ACE2ポリペプチドは医薬組成物の形態で提供されうる。組成物、医学用途および治療方法の以下の説明は亜鉛枯渇ACE2ポリペプチド、金属イオン非含有ACE2ポリペプチド、金属置換ACE2ポリペプチドおよび混合金属ACE2ポリペプチドのそれぞれに適用可能であり、それらは以下において「本発明のACE2ポリペプチド」と称される。

したがって、本発明のACE2ポリペプチドと医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、医薬上許容される塩（および本発明のACE2ポリペプチドの塩）、ならびに所望により、追加的なバッファー、等張性調節剤、医薬上許容されるビヒクルおよび／または安定剤を更に含みうる。医薬上許容される担体または希釈剤は、該組成物の許容性を改善するために、そして有効成分のより良好な可溶性およびより良好なバイオアベイラビリティを可能にするために使用される。具体例には、乳化剤、増粘剤、酸化還元成分、デンプン、アルコール溶液、ポリエチレングリコールまたは脂質が含まれる。適当な医薬担体または希釈剤の選択は、該組成物がどのように投与されるべきかに大きく左右される。経口投与には液体もしくは固体担体または希釈剤が使用され、一方、注射には液体組成物が必要とされる。

本発明の医薬組成物はバッファーまたは等張性調節剤を更に含みうる。該組成物のpHはバッファーにより生理的pHに対応するように調節可能であり、pHの変動も緩衝化されうる。バッファーには、例えば、リン酸バッファーまたはMES（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）バッファーが含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、医薬組成物のpHは4〜10、例えば5〜9.5、例えば6〜9である。等張性調節剤は、該組成物のモル浸透圧濃度を調節するために使用され、イオン性物質、例えば無機塩、例えばNaCl、または非イオン性物質、例えばグリセロールもしくは炭水化物を含有しうる。

本発明の医薬組成物は全身、局所、経口または鼻腔内投与のために適切に製造される。医薬組成物のこれらの投与方法は活性物質の迅速かつ複雑でない取り込みを可能にする。例えば、経口投与には、固体および／または液体医薬が直接的に投与可能であり、あるいは溶解および／または希釈された後で投与されうる。1つの実施形態においては、医薬組成物は液体、特に水性組成物である。

本発明の医薬組成物は静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、腹腔内または皮下投与のために適切に製造されうる。例えば、注射剤または注入剤が使用されうる。血流内への直接的な投与は、該組成物の活性物質が全身療法のために全身に行き渡り、標的組織に迅速に到達する点で有利である。1つの実施形態においては、該医薬組成物は静脈内投与のために製造され、液体形態でありうる。

本発明のACE2ポリペプチドは、亜鉛含有ACE2ポリペプチドに関して当技術分野で先例として示されているとおりに種々の疾患の治療において使用されうる。

本発明の第6の態様においては、療法における使用のための、例えば、種々の疾患および病態（状態）の治療のための、本発明のACE2ポリペプチドまたはACEポリペプチドの集団を提供する。また、本発明のACE2ポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団の有効量を、それを要する患者に投与することを含む、種々の疾患および病態の治療方法を提供する。本発明は更に、種々の疾患および病態の治療のための医薬の製造における、本発明のACE2ポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団の使用を提供する。そのような種々の疾患および病態を、以下に、より詳細に説明する。

本発明のACE2ポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団は、高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群を治療または予防するために使用されうる（例えば、WO2004/000367に開示されているとおり; その7頁23行〜8頁3行および21頁3行〜26行; それを参照により本明細書に組み入れることとする）。本発明のACEポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団は、血圧を低下させるために使用されうる。好ましくは、該治療は心臓または腎臓または肺または血管のものである。本発明は本発明のACE2ポリペプチドまたはACE2ポリペプチドの集団の投与による心疾患、肺疾患および腎疾患、高血圧および多臓器機能不全症候群の治療を提供する。肺疾患には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ARDS、ALI、COPD、肺炎、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧症、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、肺癌、アテローム性動脈硬化症、多発性嚢胞腎（PKD）、肺の浮腫、および場合によっては肺高血圧。腎臓疾患には、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全および急性腎障害が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、WO2009/076694（4頁および5頁の第1段落を参照されたい; それを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおりの炎症の治療的治療または予防に関する。炎症は、好ましくは、組織もしくは器官の局所炎症および／または全身炎症である。一般的メカニズムに基づけば、慢性および急性炎症を治療することが可能である。特に、炎症には、リウマチ、敗血症、変形性関節症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症または混合性結合組織病が含まれうるが、これらに限定されるものではない。これらの病態は、器質的または化学的な細胞損傷または組織損傷または創傷、感染、特にウイルス、細菌または真菌のような病原体、臓器移植を含む移植（インプラント）、および投薬により引き起こされうる。1つの実施形態においては、炎症は感染により引き起こされる。

炎症は自己免疫疾患をも含みうる。該疾患は、例えば抗糸球体基底膜疾患、神経系の自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（SLE）、アジソン病、抗リン脂質症候群、IgA糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、デューヒング（Durhing）疱疹状皮膚炎、膜性糸球体腎炎、グレーブス病、交感性眼炎、自己免疫多腺性内分泌障害、多発性硬化症および／またはライター病でありうる。

本発明は、例えばWO2009/086572の3頁第4段落〜6頁第1段落（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている線維症の治療に関する。1つの実施形態においては、線維症は組織または器官の局所線維症である。そのような器官特異的線維症には、肝線維症、肺線維症、結合組織線維症、特に筋隔膜の線維症、腎線維症および皮膚の線維症、例えば炎症-強皮症と組合されたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。線維症は内臓、例えば肝臓、腎臓、肺、心臓、胃、腸、膵臓、腺、筋肉、軟骨、腱、靭帯または関節の線維症でありうる。嚢胞性線維症またはリウマチ性線維症は線維症の一種である。もう1つの実施形態においては、線維症は炎症、例えば肝炎（炎症性肝疾患）と同時に生じる。もう1つの実施形態においては、線維症は臓器移植に関連している。

線維症は、好ましくは、細胞外マトリックスの成分、特にコラーゲンのようなタンパク質の過剰沈着に起因するものである。コラーゲンは結合組織、特に細胞外マトリックスの構造タンパク質である。特にSMA（平滑筋アクチン）マーカーと組合されたコラーゲンの形成は線維症の進行と直接相関する。本発明において、ACE2によるコラーゲンの沈着の有効な抑制が観察されている。

また、一般的メカニズムに基づけば、慢性線維症の治療も可能である。特に、該線維症は、器質的または化学的な細胞または組織の損傷または創傷、癌または腫瘍、感染、特にウイルス、細菌または真菌のような病原体、臓器移植を含む移植（インプラント）、および投薬により引き起こされうる。感染は、例えば肝炎ウイルス感染、特にHCVによる感染の場合のように器官特異的でありうる。本発明のACE2ポリペプチドで治療されうる他の好ましい線維性疾患には、例えば一次または二次線維症、特に自己免疫応答、オーモンド病（後腹膜線維症）により引き起こされる線維症が含まれる。

本発明は、例えばWO2009/086572に開示されている肝疾患の治療に関する。幾つかの実施形態においては、線維症または肝疾患は炎症、例えば肝炎（炎症性肝疾患）と同時に生じる。

本発明は、例えばWO2009/124330（6頁〜9頁第5段落を参照されたい; それを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている腫瘍疾患および癌の治療に関する。好ましくは、腫瘍疾患は、生殖器官の腫瘍疾患、特に卵巣癌、精巣癌、前立腺癌または乳癌、消化管の腫瘍疾患、特に胃癌、腸癌、直腸癌、膵臓癌、食道癌および肝臓癌、腎臓癌、肺癌、黒色腫または神経芽細胞腫から選択される。

もう1つの実施形態においては、本発明は、糖尿病性腎症を含む糖尿病の治療に関する。

本発明は以下の図面および実施例により更に例示されるが、本発明のこれらの特定の実施形態に限定されるものではない。
（実施例）
実施例1: ACE2標準
等モルの亜鉛／タンパク質の比を用いて、既に記載されているとおりに（WO 2008/151347; 実施例1を参照されたい）、ACE2製剤を得た。この1:1の比は亜鉛含量のICP-MS分析および定量的アミノ酸分析により確認された。ICP分析は以下のとおりに行った。分析前に、サンプルをHNO₃（超純粋, 1:100 v/v）で希釈し、酸性化した（これは若干の濁りを引き起こしたが、測定の結果に影響を及ぼさなかった）。亜鉛含量をONORM EN ISO 17294-2による誘導結合質量分析により決定した。

この物質を、完全に酵素的に活性なACE2に関する標準として使用した。したがって、酵素活性に対する亜鉛または他の金属の影響を調べる全ての更なる比較研究のために、その活性を100%に設定する。

実施例2: 亜鉛の枯渇
150mM NaClおよび50μM ZnCl₂を含有する100mM グリシンバッファー（pH 7.5）中で製剤化された2.0mgのACE2（例えば、実施例1に記載されているとおりに製造される; 400μl）を100μlの0.5M EDTA（pH 8.0）と混合して100mM EDTAの最終濃度を得た。該サンプル中の全亜鉛濃度は約100μMである。これは1:1000の亜鉛対EDTAのモル比（すなわち、1000倍過剰のEDTA）を与える。該溶液を穏やかに混合し、室温で14時間インキュベートした。

300mM NaClを含有する1mlの50mM MES-バッファー（pH 6.5）を加えることにより、Vivaspin濃縮装置を使用するバッファー交換により、EDTAの除去を行った。これを更に2回繰返した。

最終体積は190μlであり、このサンプル中のACE2濃度は、280nｍでのその吸光度による測定、および163,680 l/mol×cmの吸光係数を使用した計算によると、8.2mg/mlであった。

図1に示されているとおり、サイズ排除クロマトグラフィーにより、亜鉛枯渇ACE2を分析した。分子量は、GF標準（チログロブリン、IgG、オボアルブミンおよびミオグロビン）に対する直接比較により決定したところ、270640 Daであることが判明した。ACE2は8.4分の保持時間において単一ピークとして溶出した。12分の保持の後のシグナルは小さなバッファー成分によるものである。この研究は該酵素製剤の完全性を証明している。なぜなら、ACE2が単一ピークとして溶出し、したがって、亜鉛の除去中に該タンパク質の凝集も断片化も生じていないからである。興味深いことに、亜鉛非含有ACE2製剤は安定であり、凝集も分解もしない。

実施例3: ACE2活性の亜鉛依存性
亜鉛の添加を伴う及び伴わない反応バッファーにおいて、そしてまた、全身投与後の状況を模擬するためにヒトヘパリン血漿において、ACE2の酵素活性を調べた。それぞれの対照は、亜鉛を含有しない同じバッファーであった。蛍光標識ACE2基質Mca-Ala-Pro-Lys-DNPを、酵素活性を定量するために使用した。DNP（ジ-ニトロ-フェニル）部分は天然ペプチドのMca（メトキシ-クマリン-酢酸）蛍光を消光するが、ACE2により切断されると蛍光シグナルが検出可能となる。約30分間のインキュベーションの後、全てのサンプルをH₂Oで1:10の比で希釈した。最後に、50μlの各サンプルを50μlのMca-Ala-Pro-Lys-DNPと混合し（MES-NaClバッファーで1:5で前希釈）、直ちに発光波長としての430nmおよび励起波長としての320nmで測定した。蛍光-時間曲線を記録し、初期勾配を用いて、それぞれのACE2活性を定量した。結果を図2に示す。測定された時間依存的相対蛍光単位（RFU）を各サンプルに関してプロットした。曲線を2次多項式曲線y=B0 + B1t +B2t2（ここで、B1はt=0におけるそれぞれの曲線の初期勾配である）でフィットさせた。B1値は表1に示されており、最大切断活性に対応する。

ヒト血漿のみ及びMESバッファー中のZn枯渇ACE2は蛍光標識基質を有意な度合で切断しなかった。最大活性はそれぞれ4±4および25±4 FU/分であった。これは、ヒト血漿が重要な固有のACE2活性を示さないこと、およびZn枯渇ACE2がその酵素活性を喪失することを結論づけるものである。この観察とは対照的に、Zn²⁺含有ACE2サンプルはMESバッファー中で強力な活性を示す（708±8 FU/分）。この活性はヒト血漿中ではほぼ2倍になる（1436±18 FU/分）。MESバッファーへの0.5mg/ml Zn²⁺の添加はACE2活性を1176±27 FU/分まで増加させ、活性をZn枯渇ACE2（1139±25 FU/分）にほぼ完全に戻す。

興味深いことに、亜鉛枯渇ACE2は、Zn²⁺のいずれの外的添加をも伴うことなく、ヒト血漿中で完全に酵素的に活性になる（1254±12 FU/分）。この活性は、Zn含有ACE2の1つと比較した場合、ほぼ同一である。

実施例4: ACE2活性の金属イオン依存性
異なる組合せの反応バッファーにおいて、ACE2の酵素活性も調べた。該反応バッファーは、Zn²⁺を他の正荷電金属イオンにより置換するために種々の金属イオンで補足されたものであった。前記と同じ蛍光標識ACE2基質 Mca-Ala-Pro-Lys-DNPを使用して、生じた酵素活性を定量した。したがって、枯渇ACE2をMES-NaClバッファーで20μg/mlの濃度まで前希釈した。0、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.15および0.063μg/mlのACE2を含有する系列希釈物を、50μM Zn²⁺、25μM Co²⁺、50μM Ni²⁺、50μM Fe²⁺、25μM Fe³⁺、50μM Pb²⁺、50μM Mg²⁺、50μM Mn²⁺および50μM Cu²⁺溶液で希釈することにより調製し、30分間インキュベートした。50μlの各サンプルを50μlの基質Mca-Ala-Pro-Lys-DNPと混合し（MES-NaClバッファーで1:5で前希釈）、直ちに発光波長としての430nmおよび励起波長としての320nmで測定した。蛍光-時間曲線を記録し、初期勾配を用いて、それぞれのACE2活性を定量した。時間依存的相対蛍光単位（RFU）を各サンプルに関してプロットした。曲線を2次多項式曲線y=B0 + B1t +B2t2（ここで、B1はt=0におけるそれぞれの曲線の初期勾配である）でフィットさせた。B1値は最大活性に対応し、表2に示されている。

亜鉛枯渇ACE2は酵素的に不活性であった。10μg/mlの濃度においては、ACE2および50μM Zn²⁺（1:250のモル比に相当）は最高ACE2比活性を示し、したがって、これを100%に設定した。Co²⁺（78%）ならびにNi²⁺およびPb²⁺（共に約69%）において、比較しうる活性が得られた。

全ての他の被検金属イオンは10μg/ml ACE2において有意により低い活性を示した。Fe²⁺およびMn²⁺補足ACE2は13%の範囲であり、Cu²⁺は9%であった。Fe³⁺、Mg²⁺および金属イオン枯渇ACE2は実質的に不活性であった。

興味深いことに、10μg/mlにおいて共にZn²⁺含有ACE2より有意に低かったFe³⁺およびMg²⁺は、0.625および1.25μg/mlの、より低いACE2濃度において、Zn²⁺と比較して実質的に同じ比活性を示した。

実施例5: ACE活性の金属イオン依存性
rhACE2ストック溶液（前記実施例1および2において製造されたもの）を細胞培養等級水で1μM溶液まで希釈した。1μMの濃度のCuCl₂、ZnCl₂、NiCl₂、MnCl₂およびCaCl₂の金属イオン溶液を10mMストック溶液から調製した。酵素対可溶性金属イオンの等モル比を得るために、1μM金属イオン溶液の存在下のインキュベーションを15分間および80分間行った。酵素活性試験のために、サンプルを相応金属イオン溶液で1:10希釈し、MES-NaClバッファーで更に1:10希釈した。0.5μM EDTA補足物を含有する活性バッファー中の50μlの200μM基質溶液を50μlのサンプル希釈物に加えることにより活性試験を行い、直ちに、励起用の320nmおよび発光用の430nmの波長フィルターを伴う蛍光検出器Anthos Zenyth 3100, Ser. No. 26001070による測定を行った。測定された相対蛍光単位（RFU）を各rACE2サンプルに関してサイクル（1分）ごとにプロットした（図3および4を参照されたい）。勾配値を計算するために、各曲線を2次多項式曲線（Y = B0 + B1^*X +B2^*X^∧2）によりフィットさせた。B1値を以下に示す。

陰性対照として、Zn²⁺枯渇ACE2は酵素的に不活性であった。Zn²⁺インキュベートサンプルの比活性を100%に設定した。80分間のインキュベーションの後、Cu²⁺（112%）およびNi²⁺（92%）において、比較しうる活性が得られた。Mn²⁺またはCa²⁺イオンの存在下のインキュベーションは有意により低い活性（最大40%）を示した。

陰性対照として、Zn²⁺枯渇ACE2は酵素的に不活性であった。Zn²⁺インキュベートサンプルの比活性を100%に設定した。80分間のインキュベーションの後、Cu²⁺（112%）およびNi²⁺（92%）において、比較しうる活性が得られた。Mn²⁺またはCa²⁺イオンの存在下のインキュベーションは有意により低い活性（最大40%）を示した。
[１] 活性部位内において枯渇したレベルのZn ²⁺ を有するアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）ポリペプチドの集団。
[２] Zn ²⁺ :ACE2ポリペプチドの比が1:1未満、好ましくは<0.99:1、<0.98:1、<0.95:1、<0.92:1または<0.90:1である、1記載のACE２ポリペプチドの集団。
[３] Zn ²⁺ :ACE2ポリペプチドの比が<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1である、2記載のACE2ポリペプチドの集団。
[４] 該比が、実施例4記載の方法に従うICP-MSにより測定される、2または3記載の集団。
[５] ACE2ポリペプチドがヒトACE2ポリペプチドである、前記１〜４のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[６] ACE2ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1-740または配列番号1のアミノ酸18-740または配列番号1のアミノ酸18-615からなる、5記載のACE2ポリペプチドの集団。
[７] ACE2ポリペプチドが二量体形態で存在する、前記１〜６のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[８] ACE2ポリペプチドが、配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690からなる群から、独立して選択される1以上の部位でグリコシル化されている、前記１〜７のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[９] ACE2ポリペプチドが、20重量%を超える全糖含量を有する、8記載のACE2ポリペプチドの集団。
[１０] 活性部位がZn ²⁺ を実質的に含有しない、前記１〜９のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[１１] 活性部位がいかなる金属イオンをも実質的に含有しない、前記１〜１０のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[１２] 少なくとも1つの金属イオンを含む溶液中のACE2基質を切断するための、前記１〜１１のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
[１３] 金属イオンがCo ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Cu ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Fe ²⁺ 、Pb ²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Pb ²⁺ 、Al ³⁺ 、Al ²⁺ およびSn ²⁺ 、例えばZn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Cu ²⁺ 、Mn ²⁺ およびAl ³⁺ から選択される、12記載の使用。
[１４] ACE2基質がAng IIおよびMca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OHから選択される、12または13記載の使用。
[１５] a．細胞系内でACE2ポリペプチドを発現させ、
b．該発現ポリペプチドを単離し、
c．金属-キレート化剤の添加により、活性部位内に結合した金属イオンの一部または全部を除去する工程を含む、1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の製造方法。
[１６] 金属キレート化剤がEDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよび／またはジメルカプロールから選択される、15記載の製造方法。
[１７] 金属-キレート化剤が（ポリペプチドと比較して）10〜1000倍過剰で存在する、16記載の製造方法。
[１８] 1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団を含む組成物であって、1:1未満、95:1未満、<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1の、全亜鉛または他の金属イオンとACE2とのモル比を含む組成物。
[１９] 1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団を含む組成物であって、該組成物中の亜鉛のモル量と比較して10〜1000倍モル過剰の金属キレート化剤を含む組成物。
[２０] Co ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Cu ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Fe ²⁺ 、Pb ²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Pb ²⁺ 、Al ³⁺ 、Al ²⁺ およびSn ²⁺ 、例えばZn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Cu ²⁺ 、Mn ²⁺ およびAl ³⁺ から選択される遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより活性部位が占拠された、10記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２１] 亜鉛によっては占拠されていない活性部位が、Co ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Cu ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Fe ²⁺ 、Pb ²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Pb ²⁺ 、Al ³⁺ 、Al ²⁺ およびSn ²⁺ 、例えばZn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Cu ²⁺ 、Mn ²⁺ およびAl ³⁺ から選択される1以上の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより占拠された、1〜9のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２２] 金属イオン:ACE2ポリペプチドのモル比が>0.10:1、>0.15:1、>0.20:1、>0.25:1、>0.30:1、>0.35:1、>0.40:1、>0.45:1、>0.50:1、>0.55:1、>0.60:1、>0.65:1、>0.75:1、>0.80:1、>0.85:1、>0.90:1、>0.92:1、>0.95:1、>0.98:1、>0.99:1または約1.00:1である、20または21記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２３] ACE2ポリペプチドがヒトACE2ポリペプチドである、20〜22のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２４] ACE2ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1-740または配列番号1のアミノ酸18-740または配列番号1のアミノ酸18-615からなる、20〜23のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２５] ACE2ポリペプチドが二量体形態で存在する、20〜24のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２６] ACE2ポリペプチドが、配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690からなる群から、独立して選択される1以上の部位でグリコシル化されている、20〜25のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２７] ACE2ポリペプチドが、20重量%を超える全糖含量を有する、20〜26のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[２８] a．細胞系内でACE2ポリペプチドを発現させ、
b．該発現ポリペプチドを単離し、
c．金属-キレート化剤の添加により、活性部位内に結合した金属イオンの一部または全部を除去し、
d．得られたACE2ポリペプチドを、Co ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Cu ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Fe ²⁺ 、Pb ²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo ²⁺ 、Zn ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Pb ²⁺ 、Al ³⁺ 、Al ²⁺ およびSn ²⁺ 、例えばZn ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Cu ²⁺ 、Mn ²⁺ およびAl ³⁺ から選択される遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンを含む溶液と接触させる工程を含む、20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の製造方法。
[２９] 基質を切断するための、20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
[３０] 1〜11または20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
[３１] 療法に用いるための、1〜11または20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[３２] 高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防における使用のための、1〜11または20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
[３３] 高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の製造における、1〜11または20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
[３４] 高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防方法であって、それを要する患者に1〜11または20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の有効量を投与することを含む方法。

Claims

活性部位内において枯渇したレベルのZn²⁺を有するアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）ポリペプチドの集団。
Zn²⁺:ACE2ポリペプチドの比が1:1未満、好ましくは<0.99:1、<0.98:1、<0.95:1、<0.92:1または<0.90:1である、請求項1記載のACE２ポリペプチドの集団。
Zn²⁺:ACE2ポリペプチドの比が<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1である、請求項2記載のACE2ポリペプチドの集団。
該比が、実施例4記載の方法に従うICP-MSにより測定される、請求項2または3記載の集団。
ACE2ポリペプチドがヒトACE2ポリペプチドである、前記請求項１〜４のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1-740または配列番号1のアミノ酸18-740または配列番号1のアミノ酸18-615からなる、請求項5記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが二量体形態で存在する、前記請求項１〜６のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが、配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690からなる群から、独立して選択される1以上の部位でグリコシル化されている、前記請求項１〜７のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが、20重量%を超える全糖含量を有する、請求項8記載のACE2ポリペプチドの集団。
活性部位がZn²⁺を実質的に含有しない、前記請求項１〜９のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
活性部位がいかなる金属イオンをも実質的に含有しない、前記請求項１〜１０のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
少なくとも1つの金属イオンを含む溶液中のACE2基質を切断するための、前記請求項１〜１１のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
金属イオンがCo²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺およびAl³⁺から選択される、請求項12記載の使用。
ACE2基質がAng IIおよびMca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OHから選択される、請求項12または請求項13記載の使用。
a．細胞系内でACE2ポリペプチドを発現させ、
b．該発現ポリペプチドを単離し、
c．金属-キレート化剤の添加により、活性部位内に結合した金属イオンの一部または全部を除去する工程を含む、請求項1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の製造方法。
金属キレート化剤がEDTA、EGTA、8-ヒドロキシキノリン、フェナントロリンおよび／またはジメルカプロールから選択される、請求項15記載の製造方法。
金属-キレート化剤が（ポリペプチドと比較して）10〜1000倍過剰で存在する、請求項16記載の製造方法。
請求項1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団を含む組成物であって、1:1未満、95:1未満、<0.50:1、<0.45:1、<0.40:1、<0.35:1、<0.30:1、<0.25:1、<0.20:1、<0.15:1、<0.10:1、<0.05:1、<0.02:1または<0.01:1の、全亜鉛または他の金属イオンとACE2とのモル比を含む組成物。
請求項1〜11のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団を含む組成物であって、該組成物中の亜鉛のモル量と比較して10〜1000倍モル過剰の金属キレート化剤を含む組成物。
Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺およびAl³⁺から選択される遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより活性部位が占拠された、請求項10記載のACE2ポリペプチドの集団。
亜鉛によっては占拠されていない活性部位が、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺およびAl³⁺から選択される1以上の遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンにより占拠された、請求項1〜9のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
金属イオン:ACE2ポリペプチドのモル比が>0.10:1、>0.15:1、>0.20:1、>0.25:1、>0.30:1、>0.35:1、>0.40:1、>0.45:1、>0.50:1、>0.55:1、>0.60:1、>0.65:1、>0.75:1、>0.80:1、>0.85:1、>0.90:1、>0.92:1、>0.95:1、>0.98:1、>0.99:1または約1.00:1である、請求項20または21記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドがヒトACE2ポリペプチドである、請求項20〜22のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1-740または配列番号1のアミノ酸18-740または配列番号1のアミノ酸18-615からなる、請求項20〜23のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが二量体形態で存在する、請求項20〜24のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが、配列番号1のAsn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690からなる群から、独立して選択される1以上の部位でグリコシル化されている、請求項20〜25のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
ACE2ポリペプチドが、20重量%を超える全糖含量を有する、請求項20〜26のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
a．細胞系内でACE2ポリペプチドを発現させ、
b．該発現ポリペプチドを単離し、
c．金属-キレート化剤の添加により、活性部位内に結合した金属イオンの一部または全部を除去し、
d．得られたACE2ポリペプチドを、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Pb²⁺ Al、Ga、In、Sn、Tl、Pb、BiおよびPo、好ましくはCo²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Al²⁺およびSn²⁺、例えばZn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺およびAl³⁺から選択される遷移金属イオンまたはポスト遷移金属イオンを含む溶液と接触させる工程を含む、請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の製造方法。
基質を切断するための、請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
請求項1〜11または請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
療法に用いるための、請求項1〜11または請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防における使用のための、請求項1〜11または請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団。
高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防のための医薬の製造における、請求項1〜11または請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の使用。
高血圧（高い血圧を含む）、うっ血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎不全、腎臓不全、および肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺高血圧、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎損傷および多臓器機能不全症候群から選択される疾患の治療または予防方法であって、それを要する患者に請求項1〜11または請求項20〜27のいずれか1項記載のACE2ポリペプチドの集団の有効量を投与することを含む方法。