KR20200095538A - 클로토 단백질 수준을 평가하고 증가시키기 위한 산물 및 방법 - Google Patents

클로토 단백질 수준을 평가하고 증가시키기 위한 산물 및 방법 Download PDF

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KR20200095538A
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조셉 에프. 타르시오
디네쉬 라투리
윌리엄 이언 라마지
제임스 알. 플랜트
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클로토 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

클로토 (Klotho) 단백질 수준을 모니터링하기 위한 및 포유동물 혈액 시료에서, 특히 실온에서 또는 냉동화 없이 일정 기간 동안 클로토 단백질을 안정화시키기 위한 산물 및 방법이 개시된다. 클로토 단백질 수준, 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준의 검출하고, 정량분석하는 방법, 포유동물 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법 및 클로토 단백질 수준 또는 생산, 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산을 증가시키는 방법 그리고 이를 수행하는데 유용한, 진단 키트 및 클로토 단백질 결핍을 치료하는 조성물을 포함하는 산물이 개시된다. 조성물은 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키고/거나, 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시키고/거나, 외인성 재조합 단백질로 클로토 단백질 수준을 보충하도록 구성되거나 제형화된다. 치료 방법 및 용도는 조성물을 인간 또는 비-인간 포유동물 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

클로토 단백질 수준을 평가하고 증가시키기 위한 산물 및 방법
본 발명은 환자에서 클로토 단백질 수준을 평가하고 증가시키는 것에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 내인성 및/또는 외인성 클로토 단백질의 수준을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정성분석하기 위한 및 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하기 위한 산물 및 방법 그리고 대상에서 클로토 단백질 수준을 증가시키는 약제학적 또는 영양제학적 조성물의 생산, 정제 및 투여에 관한 것이다.
클로토 (또는 알파-클로토, α-클로토 등)는 인간 염색체 13번에 위치한 KL (또는 클로토) 유전자에 의해 인코딩된 최근 특성화된 단백질이다. 대안의 RNA 스플라이싱을 통해 단일한 클로토 유전자로부터 나온 두 개의 전사체가 확인되어 왔다. 도 1 및 도 2 참조. 제 1 전사체는 클로토 이소형 1 - 짧은 세포질 미단 (인간 잔기 1,003 내지 1,012번), 막통과 (TM) 도메인 (인간 잔기 982 내지 1,002번) 및 두 개의 (주요한) 상동성 (내부 반복서열) 도메인 (KL1으로 명명됨 (인간 잔기 56 내지 506번, 이는 450개의 잔기 길이임) 및 KL2 (인간 잔기 515 내지 953번이고, 438개의 잔기 길이임), 이들 각각이 β-글루코시다제와 20% 내지 40%의 아미노산 서열 상동성을 공유하지만, 유사한 수준의 글루코시다제 촉매 활성은 부족할 수 있음)를 포함하는 세포외 영역 또는 도메인 (인간 잔기 1 내지 981번)을 갖는 전장 1,012개의 아미노산, 단일-통과 막통과 단백질 및 신호 서열 (SS) 도메인 (인간 잔기 1 내지 33번)을 인코딩하는 것으로 예측된다. SS, KL1 및 KL2 도메인 포함 세포외 영역 (인간 잔기 1 내지 981번)은 α/β세크레타제에 의해 효소적으로 절단될 수 있고, 가용성 클로토 (또는 s클로토, S-클로토, 알파 가용성 클로토 등)라고 명명된 130 kDa 순환 단백질로서 순환 혈류 내로 방출된다. 세포외 영역은 또한 별도의 68 kDa 단백질 (KL1 + SS) 및 64 kDa 단백질 (KL2)로 절단될 수 있다.
알파-클로토 mRNA의 스플라이싱 변이체인 제 2 전사체는 주로 KL1 도메인에 상응하는 클로토 단백질의 이소형 2를 인코딩한다. 내부 스플라이싱 공여자 부위는 클로토 유전자의 엑손 3번에 위치하는 것으로 생각된다. 결과적인 대안적으로 스플라이싱된 전사체는 엑손 3번 이후에 50 bp 삽입을 포함하고 (도 1; 회색), 이의 말단에 프레임을 맞춘 번역 종결 코돈을 갖는다. 발현된 단백질 산물은 순환으로 분비되며, 분비된 클로토 (또는 클로토 이소형 2)로 명명되며, 이는 아미노산 잔기 535 내지 549번에서 이소형 1의 정규 서열과 상이하다: DTTLSQFTDLNVYLW →SQLTKPISSLTKPYH 및 아미노산 잔기 550 내지 1012번 소실됨.
이에 따라, 유전자 발현, RNA 스플라이싱 및 효소적 절단에 의존하여, 임의의 주어진 시간에 순환하는 다수의 상이한 클로토 단백질이 존재할 수 있다. 다양한 형태의 알파-클로토 단백질의 존재에도 불구하고, 전장의 막-결합된 이소형 1만이 섬유모세포 성장인자 (FGF) 수용체와 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있으며, 소변으로 포스페이트 배출을 유도하는 뼈-유래 호르몬이고, P i 및 비타민 D 대사에 미치는 조절 역할을 갖는 FGF23에 대한 강제적인 공동-수용체로서의 기능을 한다.
클로토는 신장, 뇌에서 높게, 그리고 다른 장기에서는 더 적게 발현되며, 또한 포유동물의 혈액, 뇌척수액 및 소변에서도 발견될 수 있다. 인간을 포함한 포유동물에서 가용성 클로토 단백질의 순환 수준은 나이가 들면서 감소하는 것으로 생각된다. 또한, 클로토-결핍 마우스는 가속화된 노화 표현형을 나타내는 반면, 마우스에서 클로토의 과다발현이 수명을 연장하는 것으로 관찰되었다. 또한 클로토는 노화와 관련된 많은 세포성 과정에 연루되어 왔다. 전술한 바에 비추어, 발생 가설은 가용성 클로토가 인체에서 항-노화 화합물로서 기능할 수 있는 점을 진술하고 있다.
노화는 거의 모든 조직과 기관의 기능장애 및 파괴를 유발하는 불가피하고 진행성인 생물학적 과정으로, 궁극적으로는 사망에 이르게 한다. 예를 들어, 인체의 노화는 세포 기능의 저하와 관련되고, 이는 다양한 질환의 발생으로 이어질 수 있다. 노화는 유전적 및 후천적 요인 사이의 엄격하게 조절되고 복잡한 상호 작용에 의해 유발되는 것으로 생각되며, 전형적으로 노화의 증가, 줄기 세포의 정량적 및 정성적 감소, 및 조직 수준에서의 비정상적 구조를 특징으로 한다.
소위 "베이비 부머" 세대가 계속 나이가 들면서, 노령화 인구 (예로, 연령 60 내지 65세)는 전세계적으로 신속하게 증가하고 있다. 이 고령화 인구에 대한 의료 수요의 증가로 인해 모든 의료 시스템에 상당한 재정적 부담이 생긴다. 재조합 클로토 단백질은 노화 관련 건강 상태에 대응하도록 유망한 치료제를 제공할 수 있다. 지금까지 클로토와 관련된 모든 관련 치료 데이타는 동물 모델에서의 전임상 연구 시험이다. (i) 재조합 s-클로토 단백질 또는 단백질 변이체의 생산 및/또는 정제 (예로, 실질적인 균질성) 및 (ii) 재조합 s-클로토 단백질 또는 단백질 변이체 및/또는 S-클로토 단백질 수준-증가 건강 보조제의 대상 특히 인간에게 및/또는 노령화 인구 내에 투여를 기초로 하는 전략 및 건강 개입 산물 및 방법을 개발하는 것은 이러한 상황을 개선하는데 도움이 될 수 있다.
현재까지, 인간 용도에 적합한, 재조합 가용성 인간 알파-클로토 단백질 또는 단백질 변이체와 같은 인간 클로토 단백질의 외인성 형태, 특히 미국 식품 의약품 관리청 (FDA)이 결정하고 시행하는 바 최신 우수 제조화 관행 (cGMP) 규정을 준수하는 단백질을 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 활성 성분과 조합하여 제공하는 산물 또는 방법은 없다.
마찬가지로, 현재까지 내인성 클로토 단백질 수준 또는 단백질 생산, 특히 1994년 식이 보조제 건강 및 교육법 (DSHEA)를 준수하거나 최신 우수 제조화 관행 (cGMP) 규정을 준수하는 (예로, 미국 식품 의약품 관리청 (FDA)이 결정하고 시행하는 바) 산물을, 안전하고 효과적인 방식으로 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 활성 성분, 약물, 약제 또는 영양제와 조합하여, (자연적으로) 증가시키기 위한 산물 또는 방법은 없다.
더욱이, 현재까지 클로토 단백질 수준을 효율적으로, 신뢰가능하게, 재현가능하게, 실용적으로 및/또는 (상업적으로 또는 경제적으로) 생존가능하게 모니터링하는 산물 (예로, 키트 또는 시스템) 또는 방법, 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 클로토 단백질 수준, 보다 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 또는 단백질 변이체 수준의 주문형 및/또는 실시간 모니터링 및/또는 정량분석하거나, 인간 및 비-인간 동물에서 클로토 단백질 결핍, 구체적으로 혈청 가용성 클로토 단백질 결핍을 진단하기 위한 산물 또는 방법은 없다.
또한 현재까지 재조합 클로토 단백질, 구체적으로 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질을 포함하는 약제학적 등급의 재조합 클로토 단백질을 효율적으로, 신뢰가능하게, 재현가능하게, 실용적으로 및/또는 (상업적으로 또는 경제적으로) 생존가능하게 생산하고 정제하기 위한 적합한 대규모의 방법이 없다.
본 발명의 구현예는 환자에서 클로토 단백질 수준을 평가하고 증가시키기 위한 산물 및 방법으로 당 업계의 전술한 또는 다른 문제 중 하나 이상을 해결한다. 일부 구현예는 (1) 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 혈액 또는 혈청에서 클로토 단백질을 안정화시키는 조성물 및 방법, (2) 클로토 단백질 수준(들), 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들)을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량분석하기 위한 및/또는 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하기 위한 조성물 및 방법 및 이를 수행하는데 유용한 산물, 및 (3) 대상에서 클로토 단백질 수준을 증가시키는 약제학적 또는 영양제학적 조성물을 포함한다. 일부 구현예는 치료제로서, 클로토 단백질(들) 또는 이의 단편(들) 또는 변이체(들), 보다 구체적으로 cGMP-등급의 인간 (또는 비-인간) 재조합 가용성 알파-클로토 단백질(들) 또는 이의 단편(들) 또는 변이체(들), 또는 이를 포함하는 (약제학적) 조성물을 포함한다. 일부 구현예는 (재조합) 클로토 단백질(들) 또는 이의 단편(들) 또는 변이체(들)를 제조하고, 인간 또는 비-인간 대상에게 투여하기 위한, 구체적으로 혈청 가용성 클로토 단백질을 대상에서 증가시키기 위한 산물 및/또는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시키는 영양제학적 또는 건강 보조 조성물을 포함한다. 구체적으로, 일부 구현예는 대상에게 투여될 때 대상에서 클로토 단백질 (구체적으로 내인성 가용성 알파 클로토 단백질) 수준(들), 발현 또는 생산의 증가를 유도하는 산물, 및 (4) 재조합 클로토 단백질, 구체적으로 약제학적 등급의 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 및 재조합 클로토 융합 단백질을 정제하는 방법을 포함한다.
다양한 구현예는 조성물을 포함한다. 조성물은 (i) 하나 이상의 재조합 인간 클로토 단백질, 단백질 단편 및／또는 단백질 변이체, 발현 핵산 구조물 및/또는 벡터, 세포주 및/또는 세포 현탁 배양물, 및/또는 (ii) 대상에게 투여될 때 대상에서 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산, 구체적으로 내인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산의 증가를 야기하거나 유도하는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 특정 구현예는 본 발명의 조성물을 제조하고, 정제하고, (인간 또는 비-인간 동물) 대상에게 투여하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 (구체적으로 (외인성 및/또는 내인성) 가용성 알파 클로토 단백질) 수준(들), 발현 또는 생산을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 클로토 단백질 수준(들), 구체적으로 (내인성 및/또는 외인성) 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들)를 모니터링하고/거나, 검출하고/거나 정량분석하기 위한 및/또는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하기 위한 산물 (예로, 진단 키트) 및/또는 방법을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체 (예로, cGMP 등급의 인간 재조합 가용성 알파 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질); 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 포함하는 조성물 (예로, 치료 적 조성물, 약제학적 조성물, 약제, 제형물 등); 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질 및 (약제학적으로 허용가능한) 운반체를 포함하는 조성물; 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질 및 적어도 하나의 추가적인 (활성) 성분을 포함하는 조성물; 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 인코딩하는 핵산 구조물 또는 벡터; (i) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 인코딩하는 핵산 구조물 또는 벡터를 포함하고/거나, (ii) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 발현하는 세포주; (i) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 인코딩하는 핵산 구조물 또는 벡터를 포함하고/거나, (ii) 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포 (각각)을 포함하는 세포 현탁 배양물; 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 제조하고, 선택적으로 정제하는 방법; 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 약제 (또는 치료적 조성물 - 예로, 제형물)을 제조하는 방법; 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 (인간 또는 비-인간 동물) 대상에게 투여하는 방법; 대상의 클로토 단백질 결핍을 결정하는 진단적 방법; 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법; 대상을 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 투여에 의해 받을 필요가 있는 것으로서 진단하는 방법; 이를 필요로 하는 대상에 대한 효능을 평가하고/거나 단백질의 유효 용량을 결정하는 방법; 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 비-인간 포유동물)에서 특이적 의학적 또는 기타 병태를 치료하는데 사용되는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질; 인간 또는 비-인간 동물에서 특이적 의학적 또는 기타 병태의 치료를 위한 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 용도; 인간 또는 비-인간 동물에서 특이적 의학적 또는 기타 병태의 치료를 위한 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질을 포함하는 조성물의 용도; 및/또는 인간 또는 비-인간 동물에서 특이적 의학적 또는 기타 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질의 용도 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 재조합 클로토 단백질로서, 적어도 단백질의 일부가 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 재조합 클로토 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 재조합 단백질로서, 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 내지 서열번호 152 중 하나, 바람직하게 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 66, 서열번호 125 내지 서열번호 128, 서열번호 133 및 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 클로토 단백질 서열 그리고 선택적으로 면역글로불린 Fc 도메인 서열, 인간 혈청 알부민 서열, His (예로, 6개 His) 태그 서열 및/또는 트윈-스트렙 태그 서열의 적어도 일부를 이들 사이의 조건부 링커 서열이 있거나 없이 포함하는, 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 둘 이상의 클로토 재조합 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 약제학적 유효량의 본원에 기재된 재조합 클로토 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 약제학적 유효량의 재조합 가용성 클로토 단백질, 인간 알파 클로토 이소형 1 또는 이소형 2의 아미노산 잔기 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번의 적어도 하위집합 또는 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질의 적어도 일부, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 그리고 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 내지 서열번호 152 중 하나, 바람직하게 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 66, 서열번호 125 내지 서열번호 128, 서열번호 133 및 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 클로토 단백질 서열 및 선택적으로 면역글로불린 Fc 도메인 서열, 인간 혈청 알부민 서열, His (예로, 6개의 His) 태그 서열 및/또는 트윈-스트렙 태그 서열의 적어도 일부를 이들 사이의 조건부 링커 서열이 있거나 없이 포함하는 재조합 단백질의 유효량을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 둘 이상의 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 치료적 클로토 단백질 및 약물, 항체, 호르몬, 인간 세포, 조직, 세포성 또는 조직 기반의 산물 (HCT/P) 등과 같은 다른 활성 성분 중 적어도 하나를 포함하는 조성물 및/또는 또는 이를 인간 또는 비-인간 대상에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 조합 조성물 및 방법은 노화 관련 장애 또는 병태, 임상 (예로, 대사) 장애, 만성 질환 및 급성 부상 등을 갖는 대상을 치료하는데 유용할 수 있다. 명백한 병태 또는 장애가 없는 대상에 대한 조합 치료의 예방적 투여는 또한 본원에 기재된 특정 병태 또는 장애를 지연시키거나 예방하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예는 핵산 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구현예는 발현 벡터 또는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편 또는 단백질 변이체를 인코딩할 수 있다. 핵산은 고유의 또는 비-고유의 신호전달 서열을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 인코딩된 클로토 단백질 서열의 상류 (또는 N-말단에)의 비-고유의 신호전달 서열을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예는 재조합 서열로서, 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 내지 서열번호 152 중 하나, 바람직하게 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 66, 서열번호 125 내지 서열번호 128, 서열번호 133 및 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 클로토 단백질 서열 그리고 선택적으로 면역글로불린 Fc 도메인 서열, 인간 혈청 알부민 서열, His (예로, 6개 His) 태그 서열 및/또는 트윈-스트렙 태그 서열의 적어도 일부를 이들 사이의 조건부 링커 서열이 있거나 없이 포함하는, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 세포주를 포함할 수 있다. 세포주는 (다수의) 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK-293 세포 또는 다른 적합한 (단백질 발현) 세포주를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 CHO-S 세포와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 결핍 CHO 세포 또는 GS -/- CHO 세포와 같은 글루타민 합성효소 (GS) 결핍 CHO 세포일 수 있다. 세포는 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 (트랜스유전자 또는 cDNA를 포함하는) 하나 이상의 외인성 핵산 (이의 사본)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질을 포함할 수 있다. 외인성 핵산은 바람직하게 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 트랜스유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 (트랜스유전자와 관련된) 프로모터 및/또는 (기능적) 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), (기능적) 글루타민 합성효소 (GS) 등와 같은 조건부 (외인성) 효소를 (역시) 포함하거나 인코딩할 수 있다.
적어도 일 구현예는 바람직하게 탄소 공급원, 질소 공급원 및/또는 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보조제 또는 첨가제를 포함하는 액체 배지에서 성장하는 세포주를 포함하는 현탁 세포 배양물을 포함하여, 세포가 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 액체 배지는 (인간, 태아, 소 또는 기타) 혈청이 없고/거나, 동물 (동물-유래의) 단백질 (성분)이 없을 수 있다. 예를 들어, 액체 배지에는 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 등이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 현탁 세포 배양물은 액체 배지, 바람직하게 무-혈청 및/또는 동물 단백질 성분이 없는 액체 배지를 포함할 수 있고, 액체 배지는 바람직하게 탄소 공급원, 질소 공급원 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보조제 또는 첨가제를 포함하고, 더욱 바람직하게 액체 배지는 하이폭산틴, 티미딘 및/또는 글루타민이 결핍되며, 세포주는 액체 배지에서 성장하여 세포가 폴리펩티드가 재조합 클로토 단백질을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구현예는 세포, 액체 배지 또는 현탁 세포 배양물의 둘 다의 또는 이로부터의 추출물로서, 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 재조합 단백질을 포함하는, 추출물을 포함한다. 특정 구현예는 세포, 액체 배지 또는 둘 다 (예로, 현탁 세포 배양물)의 또는 이로부터의 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질 포함 추출물을 포함한다. 적어도 일 구현예는 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 재조합 단백질을 포함한다.
일부 구현예는 재조합 클로토 단백질 (예로, 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질)을 제조하는 방법을 포함할 수 있다. 예시적인 방법은 재조합 클로토 단백질을 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 HEK-293 세포, 바람직하게 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 결핍 CHO 세포, 더욱 바람직하게 CHO-S 세포 또는 바람직하게 글루타민 합성효소 (GS) 결핍 CHO 세포, 더욱 바람직하게 GS -/- CHO 세포에서 생산하는 것을 포함할 수 있고, 단백질은 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 제조하는 방법은 액체 배지에서 세포를 성장신키는 단계, 세포에서 재조합 가용성 클로토 단백질을 생산하는 단계 및/또는 재조합 가용성 클로토 단백질 포함 추출물을 세포, 액체 배지 또는 둘 다로부터 정제하는 단계를 포함한다. 추출물은 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 건조 중량 재조합 가용성 클로토 단백질 및/또는 약 1 내지 100 ppm 미만의 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함할 수 있다. 세포는 HEK-293 세포 또는 CHO-S 세포와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 결핍 CHO 세포 또는 GS -/- CHO 세포와 같은 글루타민 합성효소 (GS) 결핍 CHO 세포일 수 있다. 생산된 (발현된) 단백질은 세포로부터 액체 배지 내로에 방출 (예로, 분비)될 수 있고/거나, 이에 부착된 하나 이상의 글리칸을 갖을 수 있다.
세포는 단백질 및 선택적으로 다하이드로폴레이트 환원효소, 글루타민 합성효소 (GS) 등과 같은 기능성 효소를 인코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 외인성 핵산은 세포에서 외인성 단백질의 발현에 사용되는 통상적인 또는 전형적인 프로모터와 같은 프로모터 (예로, 강한 프로모터, 약한 프로모터 등)를 포함할 수 있다. 외인성 핵산은 바람직하게 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 트랜스유전자 또는 cDNA (예로, 프로모터의 조절 하), 또는 본원에 기재된 클로토 단백질 (예로, S-클로토 변이체)을 인코딩하는 임의의 다른 적합한 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 방법은 예컨대 형질감염에 의해 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 액체 배지는 (인간, 태아, 소 또는 기타) 혈청이 없고/거나, 동물 (동물-유래의) 단백질 (성분)이 없는 배지와 같은 액체 배지에서 세포를 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 배지는 바람직하게 생물반응기에서, 바람직하게 탄소 공급원, 질소 공급원 및/또는 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보조제 또는 첨가제를 포함한다. 특정한 세포주에 의존하여, 방법은 유효량의 메토트렉세이트 (MTX), 메티오닌 설폭시민 (MSX) 또는 기타 제제를 액체 배지 내로 도입하는 단계 및/또는 액체 배지에서 성장하는 생존 세포의 현탁 배양물을 (예로, 세포 서브클로닝, 제한 희석, 형광 활성화된 세포 선별 (FACS) 등에 의해) 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 선별 및/또는 유전자 증폭은 하이폭산틴 및/또는 티미딘 (예로, -HT 배지), 글루타민 등이 결여된 배지와 같은 선별 배지에서 형질감염된 세포를 배양함으로써 수행될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 저농도(들)의 MTX는 형질감염된 핵산 (또는 이의 유전자(들))을 증폭시키고, 이로써 단백질 발현 증가 (예로, DHFR 트랜스유전자로 형질감염된 DHFR 결핍 세포에서)에 대해 선별하도록 첨가되거나 사용될 수 있다. 대안적으로 (또는 추가적으로), 선별 및/또는 유전자 증폭은 MSX ((내인성) 글루타민 합성효소 (GS)의 저해제)를 적어도 하나의 (외인성) 글루타민 합성효소 (GS) 트랜스유전자를 갖는 세포의 현탁 배양에 첨가함으로써 수행될 수 있다.
상기 방법은 생존하는 세포 또는 배양물 (예로, MTX-저항성 및/또는 MSX-저항성 세포 또는 배양물)의 하위배양을 포함할 수 있다. 선별된 현탁 배양 및/또는 선별된 세포는 단백질의 생산 증가 (예로, 세포에 의해), 단백질의 농도 증가 (예로, 액체 배지에서) 및/또는 외인성 핵산의 사본수 증가 (예로, 세포 당)를 (예로, 선별되지 않은 현탁 배양물 또는 세포와 비교하여) 갖거나 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 액체 배지는 또한 MTX 및/또는 MSX의 유효량을 포함할 수 있다. 현탁 배양물 (또는 이의 세포)은 바람직하게 선별되지 않은 현탁 배양물과 비교하여 단백질의 생산 증가를 (예로, 세포에 의해) 나타내고/거나, 단백질의 농도 증가를 (예로, 액체 배지에서) 나타내고/거나, 단백질을 (예로, 액체 배지 내로) 분비하고/거나, 외인성 핵산의 사본수 증가를 (예로, 세포 당) 갖을 수 있다 (이를 위해 선별될 수 있다). 단백질은 이에 부착된 하나 이상의 글리칸을 갖을 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키거나, 개선하거나, 증가키도록 구성되거나 제형화된 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예는 대상에서 (내인성) 클로토 단백질 수준을 증가시키기 위한 조성물 또는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 수준, 구체적으로 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시키는 (영양제학적 또는 건강 보조) 조성물을 포함한다. 일부 구현예는 대상에게 투여될 때 대상에서 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산, 구체적으로 내인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산의 증가를 유도하는 산물을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예는 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시키도록 구성되거나 제형화된 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 조성물의 용도 또는 이를 인간 또는 비-인간 동물 대상을 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 인간 또는 비-인간 동물 대상에게의 투여를 포함하여 본 발명의 조성물이 관여하는 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 용도 및 치료 방법은 예컨대 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키고/거나 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시킴으로써 내인성 클로토 단백질 수준을 증가시킬 수 있다.
특정 구현예는 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 대상에게 투여될 때 인간 또는 비-인간 동물 대상에서 내인성 가용성 알파-클로토 단백질의 수준을 증가시키는 건강 보조제를 포함하는 물질의 조성물을 포함한다. 조성물 또는 건강 보조제 제형물은 (합성) 화학적 및/또는 고유의 구성성분 또는 성분을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 조성물 또는 건강 보조제의 구성성분 또는 성분은 (합성) 화학적 및/또는 천연 출처로부터 나오거나 유래될 수 있다. 예시적인 조성물은 적응 (또는 화학적으로 구성)되거나, 포유동물 대상에 의한 가용성 클로토 단백질의 내인성 생산을 증가시키거나 증진시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시키도록 적응된 (또는 화학적으로 구성된) 다수의 성분을 포함한다.
예시적인 조성물은 바람직하게 예를 들어 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 K, 3,5,4'- 트리하이드록시-트랜스-스틸벤 (레스베라트롤), 프테로스틸벤, N-아세틸시스테인 (NAC), 트로글리타존, 로시글리타존, 노토프테리지지움 인시숨 팅, 젠티안 (뿌리, 추출물), 코르디셉스 (코르디셉스 시넨시스 (CS) 균사체), 이소플라본 (콩), 제니스타인, 다이드제인, 퀘르세틴 (디하이드레이트; 딜, 월계수 잎, 오레가노), 도코사헥산산 (DHA), 아스트라잔틴, 세사민 (세멘 세사민 니그룸 (검정색)), 참깨 (종자 추출물), 로즈마린산 (RA, (마조람)), 테트라데실티오아세트산 (TTA), 이칼슘 포스페이트 (무수), 미세결정 셀룰로우스 (MCC), 소듐 클로스카멜로우스 (프리멜로우스), 스테아린산, 마그네슘 스테아레이트, 알파 리포산, 컨쥬게이트 (알파) 리놀레산 (CLA), 프리바이오틱, 활성탄 및 당 업계에 공지된 기타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
예시적인 조성물은 바람직하게 적합한 영양제학적 농도로, 바람직하게 예를 들어 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E, N-아세틸시스테인 (NAC), 퀘르세틴 (디하이드레이트), 로즈마린산 (RA), 프테로스틸벤, 도코사헥산산 (DHA), 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 및 하나 이상의 프로바이오틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로바이오틱은 비피도박테리움 종 및/또는 균주 비피도박테리움 락티스 BL-04, 비피도박테리움 비피디움/락티스 BB-02 및 비피도박테리움 롱굼 BL-05, 그리고 락토바실러스 종 및/또는 균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-14, 락토바실러스 람노수스 LR-32 및 락토바실러스 파라카제이 LPC-37의 유효량을 포함한다.
특정 성분 또는 구성성분은 노화로 발생하는 세포성 및 조직 기능장애와 관련된 하나 이상의 병태를 치료하거나 침범하는데 긍정적인 이점 및 매우 낮은 부작용을 갖을 수 있다. 특정 성분 또는 구성성분은 이의 투여 이후에 인간 또는 비-인간 동물 대상에서 가용성 알파 클로토 (s-클로토) 수준의 순환하는 혈장 수준을 (직접 또는 간접적으로) 증가시킬 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 1994년의 식이 보조제 건강 및 교육법 (DSHEA)을 준수하는 영양 보조제이거나 이를 포함할 수 있으며, 이는 OTC 판매되고/거나, 시판되고/거나, 소비자에게 직접 판매 (DTC)되고/거나 처방전/의사 주문이 없이 구입할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 승인된 식품 의약품 관리청 (FDA) 약제이거나, 이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 성분은 바람직하게 적어도 일부 공동-제형화를 통해 공동-투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 성분은 별도의 제형물로서 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 성분은 다중-알약, -캡슐 또는 용량 포장으로 공동-투여될 수 있다. 일부 성분은 고체, 과립, 분말, 액체 또는 다른 형태로 제공될 수 있다.
일부 구현예는 본원에 기술 된 바와 같은 하나 이상의 (추가적인) 성분 또는 구성성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 재조합 (예로, 인간 또는 포유동물) 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 포함할 수 있다. 특정 구현예는 발현 핵산 구조물 및/또는 벡터, 세포주 및/또는 세포 현탁 배양물 그리고 하나 이상의 재조합 (예로, 인간 또는 포유동물) 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 제조하고, 정제하고, (인간 또는 비-인간 동물) 대상에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 약제 또는 처방 약물 (예로, ARB (예로, 로사르탄, 발사르탄), 테스토스테론, 비타민 D 수용체 작용제 (예로, 칼시트리올, 파리칼시톨), PPAR (감마) 작동제 (예로, 티아졸리딘디온, 트로글리타존, 로시글리타존) 및/또는 상기에 통합된 특허 참고문헌에 기재된 기타)과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 하나 이상의 재조합 클로토 단백질의 약제학적 유효량 및 내인성 클로토 단백질 수준 또는 생산을 (예로, 포유동물 대상에서) 증가시키도록 제형화된 조성물 (예로, 건강 보조제)의 유효량을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 클로토 단백질은 조성물과 공동-투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 클로토 단백질은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 재조합 클로토 단백질은 외인성 클로토 단백질을 제공함으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시킬 수 있는 한편, 조성물은 환자 또는 대상에 의한 클로토 단백질의 (자연적인) 생산을 증가시키거나 증진시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 상승시킬 수 있다.
일부 구현예는 치료 방법을 포함할 수 있다. 본 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 조성물의 (약제학적) 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조성물은 (i) 본 발명의 하나 이상의 재조합 가용성 클로토 단백질 또는 단백질 변이체의 약제학적 유효량 및/또는 (ii) 내인성 클로토 단백질 수준 또는 생산을 (예로, 포유동물 대상에서) 증가시키도록 제형화된 조성물 (예로, 건강 보조제)의 유효량을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 (예로, 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 환자 또는 대상에서) 클로토 결핍을 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 방법은 선택적으로 또는 바람직하게 포유동물 대상을 클로토 결핍증으로 진단한 이후에 포유동물 대상에게 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 담체 또는 부형제에 배치된 약제학적 유효량의 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물, 및 포유동물 대상에 의한 가용성 클로토 단백질의 내인성 생산을 증가시키거나 증진시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 상승시키도록 적응된 다수의 성분을 포함하는 영양제학적 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 노화 관련 또는 다른 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 급성 신장 손상 (AKI), 만성 신장 질환 (CKD) 또는 다른 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법을 포함할 수 있다. 조성물이 투여되는 대상은 다양한 병태 (예로, 장애, 질환, 손상, 질병 등)으로 고생하거나 이의 위험에 처할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 신체적, 정신적, 신경학적 또는 다른 (인간) 노화와 관련된 병태와 같은 하나 이상의 만성 질환 및/또는 노화 관련 병태를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 하나 이상의 메커니즘 또는 작용을 통해 치유, 회복, 장수 및/또는 다른 유익한 결과를 촉진할 수 있다. 본 발명의 조성물(들)의 투여는 만성 및/또는 노화 관련 질환을 포함하는 병태 및 인간 대상의 장수의 경과 및 결과 그리고 이들의 특성화에 미치는 긍정적인 치료 효과를 갖을 수 있다.
조성물(들)의 약제학적 유효량은 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 혈청 밀리리터 당 가용성 클로토 단백질의 약 50 내지 3000 피코그램 이상 또는 이들 사이의 농도와 같은 미리 정해진 수준으로 상승시키거나 증가시키기에 충분할 수 있다. 양은 또한 또는 대안적으로 미리 정해진 기간 동안 미리 정해진 역치량 이상으로 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 유지하기에 충분할 수 있다. 구현예는 또한 조성물(들)을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하여 미리 정해진 기간 동안 미리 정해진 역치량 이상으로 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 유지할 수 있다.
구현예는 또한 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 본 발명의 조성물의 약제학적 유효량을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 또한 대상의 혈청에서 가용성 클로토 단백질의 감소 속도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 또한 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도가 결정된 속도를 기초로 하여 제 2 미리 정해진 수준 또는 이의 미만으로 될 후속적인 용량 시간을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 또한 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 제 2 미리 정해진 수준부터 제 1 미리 정해진 수준으로 상승시키기에 충분한 조성물의 후속 용량의 시간 및/또는 양을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 또한 조성물의 후속 용량의 양을 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예는 (예로, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도의 결정된 수준을 기초로 하여) 조성물의 규칙적인 (예로, 매일) 용량 또는 용량 형태를 대상에게 처방하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물 (예로, 단백질 또는 보조제) 또는 상승된 가용성 클로토 단백질 수준은 IGF-1 및/또는 Wnt 신호전달 경로를 조정하고/거나, β-글루쿠로니다제 및/또는 시알리다제 활성을 나타내고/거나, p53/P21 신호전달 경로를 억압하고/거나, 바람직하게 p53/P21 신호전달 경로의 억압을 통한 H2O2-유도된 세포 노화 및 세포사멸을 감소시킬 수 있다 (이에 효과적일 수 있다). 단백질 또는 상승된 단백질 수준은, 바람직하게 다면발현 활성을 나타내고/거나, 바람직하게 산화 스트레스, 성장인자 신호전달, 이온 항상성의 조절 및/또는 하나 이상의 이온 통로 단백질과 같은 세포 표면 상의 당단백질 및/또는 인슐린/인슐린-유사 성장인자-1 수용체와 같은 성장인자 수용체의 활성 조절에서 체액성 인자로서 기능하거나 기능적일 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물 (예로, 단백질 또는 보조제) 또는 상승된 가용성 클로토 단백질 수준은 연약함, 골밀도 손실 또는 골 무기질 밀도 손실, 체중 감소, 근육 위축증 또는 퇴행, 근육량 저하, 근력, 악력, 다리 힘 또는 체력의 저하, 운동, 운동의 자유, 삶의 질 평가, 방출 분율 또는 운동 능력의 저하, 학습, 학습 능력, 기억 또는 지능 지수의 저하, 인지 기능 악화 또는 건망증, 인지 능력 또는 기능의 저하, 시냅스 가소성 또는 시냅스 기능의 저하 및 세포성 노화와 같은 하나 이상의 노화 관련 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태)를 치료할 수 있다 (이에 효과적일 수 있다).
특정 구현예에서, 조성물 (예로, 단백질 또는 보조제) 또는 상승된 가용성 클로토 단백질 수준은 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매 또는 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 운동신경 질환 (MND), 동맥 세동, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 섬유 근육통, 성인 발병 당뇨병, 관절염 또는 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 녹내장, 백내장, 황반 변성 및 기타 안과 질환/장애, 다발성 경화증 (MS), 루푸스 및/또는 궤양성 대장염과 같은 하나 이상의 노화 관련 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태)를 치료할 수 있다 (이에 효과적일 수 있다).
특정 구현예에서, 조성물 (예로, 단백질 또는 보조제) 또는 상승된 가용성 클로토 단백질 수준은 하나 이상의 다른 질환 또는 병태를 치료할 수 있다 (이에 효과적일 수 있다). 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예는 암을 치료하고, 환자에서 혈청 포스페이트 수준을 감소시키고, 이러한 치료를 필요로 하는 대상에서 당뇨병 또는 당뇨병 관련 병태 (예로, 제 1형 당뇨병 등)를 치료하고, 대상에서 심장 병태 (예로, 심혈관 질환, 좌심실 비대증 (LVH), 병리학적 LVH 및/또는 울혈성 심부전 등)을 치료하고, 대상에서 급성 폐 손상을 치료하고 (예로, 나노입자를 사용함), 산화제 손상에 대해 환자의 폐를 보호하고, 중증 환자에서 초기 급성 신장 손상을 검출하고, 대상에서 혈관 석회화를 약화시키고, 인지를 개선하고, 신장 및/또는 간 허혈증을 치료하고, (인간) 노화 내피 세포에서 스트레스 반응을 조정하고, 급성 및/또는 만성 신장 손상, 질환 또는 질환 진행 및/또는 요도 심근병증을 예방적으로 및/또는 치료적으로 치료하고/거나, 예방하고/거나, 약화시키고/거나, 정지시키고/거나 역전시키고, 흑색종 또는 기타 암에서 노화 관련 요법 저항성을 역전시키거나 약화시키고, 노화 세포의 세포사멸을 표적하고, 바람직하게 이로써 조직 항상성을 회복시키는 것 및 기타 다양한 적응증 중 하나 이상에서 유용할 수 있다.
이에 따라, 구현예는 또한 하나 이상의 노화 관련 또는 다른 병태를 치료하는데 사용되는 조성물을 포함할 수 있다. 노화 관련 또는 다른 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 예시적인 방법은 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 (i) 본원에 기재된 바, 보조제 및/또는 (ii) 재조합 가용성 클로토 단백질 (예로, 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖음)을 포함할 수 있다. 선택적으로, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 내인성 및/또는 외인성 클로토 단백질, 보다 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질을 검출하고/거나 정량하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 클로토 단백질 수준, 보다 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준을 검출하고, 정량하는 산물 (예로, 시스템 또는 키트)을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 결핍을 치료하는 방법을 포함할 수 있다.
특정 구현예는 (포유동물) 피험자의 혈액 또는 혈청 시료, 바람직하게 모세관　혈액 및/또는 핑커 프릭 또는 다른 비-정맥절개 (비-사혈성) 혈액 채혈 기법으로부터 획득한 혈액을 포함하거나 이용할 수　있다. 그러나, 정맥절개 (사혈성) 및 다른 적합한 혈액 채혈 기법도 본원에 고려되는 것으로 이해될 것이다.
일부 구현예는 키트를 포함한다. 구현예는, 예를 들어 시료 수집 용기를 포함할 수 있다. 용기는 모세관　혈액을 받도록 구성된 개구부를 갖을 수 있다. 일부 구현예에서, 모세관　혈액은 일정량의 가용성 클로토 단백질을 포함하거나 포함하는 것으로 의심될 수 있다. 구현예는 바람직하게 EDTA 및 헤파린 중 하나 이상을 포함하는 시료 보존제 또는 항응고제를 포함할 수 있다. 시료 보존제 또는 항응고제는 일부 구현예에서 용기의 시료 수집 구획에 배치될 수 있다. 상기 용액은 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 및 최대 7일 동안 가용성 클로토 단백질을 안정화하도록 구성될 수 있다. 구현예는 선택적으로, 바람직하게 절개 장치 또는 란셋을 포함하는 모세관　혈액 시료화 장치를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 방법을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예는 포유동물의 혈액 시료에서 클로토 단백질을 안정화시키는 방법을 포함할 수 있다. 구현예는 예를 들어 모세관 혈액을 포유동물 대상으로부터 채혈하거나 획득하고, 모세관　혈액을 용기에 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 보관하는 것을 포함할 수 있다. 용기는 내부에 배치된 보존제 또는 항응고제를 갖을 수 있어, 보존제 또는 항응고제는 용기에서 모세관　혈액과 혼합될 수 있다. 보존제 또는 항응고제는 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 가용성 클로토 단백질을 안정화시킬 수 있다. 보존제 또는 항응고제는 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다.
구현예는 또한 용기에 모세관 혈액을 수집하는 것 및/또는 모세관 혈액을 보존제 또는 항응고제와 혼합하여 혼합물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 모세관　혈액을 채혈하는 것은 란셋으로 포유동물의 피부를 절개하는 것을 포함할 수　있다. 일부 구현예에서, 용기에 모세관 혈액을 수집하는 단계는 용기 내에 모세관 혈액을 적어도 또는 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL를 수집하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 3일 동안 혼합물을 보관하거나, 보관되도록 허용하는 것을 포함할 수 있고, 보존제 또는 항응고제는 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 3일 동안 가용성 클로토 단백질을 안정화시킨다.
일부 구현예는 선택적으로 가용성 클로토 단백질의 존재에 대해 혼합물을 검정하는 것을 포함할 수 있다. 가용성 클로토 단백질의 존재에 대해 혼합물을 검정하는 단계는 가용성 클로토 단백질을 검출하는 것 및/또는 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 것을 포함할 수 있다. 가용성 클로토 단백질을 검출하는 것 및/또는 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 것은 혼합물을 가용성 클로토 단백질에 결합하도록 구성된 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 가용성 클로토 단백질을 검출하는 것 및/또는 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 것은 가용성 클로토 단백질에 결합하도록 구성된 항체를 사용하여 혼합물 상에서 ELISA를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 다른 검출 방법으로는 질량 분광분석법 또는 다중-분석물기 프로파일화 (xMAP), 예컨대 루미넥스 기술학 (예로, 소형 액체 어레이 생체검정, 소형 레이저, 발광 다이오드 (LED), 디지털 신호 프로세서, 광 검출기 및/또는 전하-결합된 영상화 장치) 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 포유동물 대상에서 클로토 결핍을 진단하는 방법 또는 포유동물 대상에서 클로토 결핍을 치료하는 방법을 포함한다. 구현예는 예를 들어 체액 생물학적 시료를 제공하거나 획득하는 것을 포함할 수 있다. 시료는 바람직하게 모세관　혈액의 형태의 포유동물 혈청을 포함할 수 있다. 방법은 선택적으로 포유동물 혈청을 보존제 또는 항응고제와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 시료는 또한 또는 대안적으로, 바람직하게 모세관　혈액의 형태로의 포유동물 혈청 및 보존제 또는 항응고제를 포함할 수 있다. 방법은 가용성 클로토 단백질의 존재에 대해 혼합물을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. 가용성 클로토 단백질의 존재에 대해 혼합물을 검정하는 단계는 존재하는 경우 혼합물에서 가용성 클로토 단백질을 검출하는 것 및/또는 존재하는 경우 혼합물에서, 선택적으로 일정 기간 동안 실온에서 또는 냉동화 없이 클로토-안정화된 혼합물을 보관한 이후에, 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 혼합물에서 가용성 클로토 단백질이 전혀 검출되지 않을 때 또는 혼합물에서 정량화된 가용성 클로토 단백질의 양이 미리 정해진 양 미만일 때 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계는 컴퓨터 시스템의 사용자 인터페이스 상에서 클로토 결핍 결정 또는 진단을 디스플레이하고/거나 물리적 또는 전자적 형태로 클로토 결핍 결정 또는 진단을 디스플레이하는 파일 또는 리포트를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 체액 생물학적 시료를 제공하거나 획득하는 것은 포유동물 대상로부터 모세관　혈액을 채혈하는 것 및/또는 용기에서 모세관　혈액을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 클로토 단백질의 존재에 대해 혼합물을 검정하는 단계는 가용성 클로토 단백질에 결합하도록 구성된 항체를 사용하여 혼합물 상에서 ELISA를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 혼합물에서 가용성 클로토 단백질이 전혀 검출되지 않을 때 또는 혼합물에서 정량화된 가용성 클로토 단백질의 양이 미리 정해진 양 미만일 때 조성물을 포유동물 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 질량 분광분석법이 또한 또는 대안적으로 수행될 수 있다.
가용성 클로토의 순환 및/또는 내인성 수준을 증가시키도록 특이적으로 구성된 개시된 전략, 산물 및/또는 건강 개입 방법은 환자에서 클로토 수준 감소와 관련된 상황 및 문제를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예는 본 발명의 다른 양상 또는 구현예를 포함하여 본 발명의 다른 곳에 제시된 임의의 특징, 옵션 및/또는 가능성을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 전술한, 다음의 및/또는 다른 특징들 각각은 본 발명의 별개의 구현예를 나타내는 것이 또한 언급된다. 더욱이, 이러한 특징 중 임의의 둘 이상의 조합은 본 발명의 별개의 구현예를 나타낸다. 이러한 특징들 또는 구현예는 또한 본 발명의 범주를 벗어나지 않고도 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 조합될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 각각의 특징은 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 다른 특징과 조합가능할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 본원에 자세하게 설명된 예시적인 구현예의 특이적인 조합에 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적인 구현예의 추가적인 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명에서 제시될 것이고, 부분적으로 상세한 설명으로부터 자명할 것이거나, 이러한 예시적인 구현예의 실행에 의해 학습될 수 있다. 이러한 구현예의 특징 및 장점은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 지적된 기구 및 조합에 의해 실현되고 획득될 수 있다. 이들 및 다른 특징은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터보다 완전히 자명해질 것이거나, 이하 본원에 제시되는 이러한 예시적인 구현예의 실행에 의해 학습될 수 있다.
본 발명의 구현예는 인간 또는 비-인간 동물 (또는 포유동물) 대상에서 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시키는 조성물 및 방법, 클로토 단백질 수준(들), 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들)을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량분석하기 위한 및/또는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하고/거나 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 구현예는 (i) 재조합 인간 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체, 발현 핵산 구조물 및/또는 벡터, 세포주 및/또는 세포 현탁 배양물, 및/또는 (ii) 대상에게 투여될 때 대상에서 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산, 구체적으로 내인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산의 증가를 유도하는 하나 이상의 산물 (예로, 보조제)을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포함한다. 일부 구현예는 본 발명의 조성물을 제조하고, 정제하고, (인간 또는 비-인간 동물) 대상에게 투여하는 방법 및/또는 대상에서 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산, 구체적으로 (외인성 및/또는 내인성) 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 클로토 단백질 수준(들), 구체적으로 (내인성 및/또는 외인성) 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들)를 모니터링하고/거나, 검출하고/거나 정량분석하기 위한 및/또는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예를 자세하게 설명하기 이전에, 본 발명은 일 구현예와 다음의 것이 다를 수 있는 구체적으로 예시된 시스템, 방법 및／또는 산물의 특정한 매개변수, 용어 및 설명에만 제한되지 않는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 특정한 특징 (예로, 입체구조, 매개변수, 성질, 단계, 구성성분, 성분, 구성원, 요소, 부분 및/또는 일부 등)에 관하여 자세하게 설명될 것인 한편, 상세한 설명은 예시적인 것이며 본 발명 및/또는 청구된 발명의 범주를 제한하는 것으로서 고려되지 않아야 한다. 또한, 본원에 사용 된 용어는 구현예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명 및/또는 청구된 발명의 범위를 반드시 제한하도록 의도되지 않는다.
상세한 설명은 섹션들로 분리되어 있지만, 각 섹션 내의 섹션 제목 및 내용은 단지 구성상의 목적을 위한 것이며 자체 포함된 설명 및 구현예는 아니거나 설명 또는 청구범위의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 오히려, 상세한 설명 내의 각 섹션의 내용은 일 섹션의 요소가 다른 섹션과 관련되고/거나 이를 알릴 수 있는 총체적인 전체로서 해석되고 이해되도록 의도된다. 이에 따라, 일 섹션 내에 구체적으로 개시된 구현예는 또한 동일하고 /하거나 유사한 산물, 방법 및/또는 용어를 갖는 또 다른 섹션에서의 추가적인 및/또는 대안적인 구현예에 관한 것이고/거나, 이로서 작용할 수 있다.
이해를 용이하게 하기 위하여, 가능한 곳에서 유사한 참조 (즉, 구성성분 및/또는 요소의 유사한 명칭)가 본 발명의 상이한 구현예와 공통적인 유사한 요소를 지칭하는데 사용되었다. 유사하게, 유사한 구성성분 또는 유사한 기능을 갖는 구성성분은 가능한 곳에서 유사한 참조 명칭으로 제공될 것이다. 예시적인 구현예를 설명하도록 특정한 언어가 본원에서 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 범주가 이에 의해 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 오히려, 예시적인 구현예들을 설명하는데 사용된 언어는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 고려되어서는 안된다 (이러한 언어가 본원에 필수적인 것으로서 명시적으로 기술되지 않는 한).
간략하게, 본 발명은 수치 값의 목록 또는 범위를 언급할 수 있다. 그러나, 이러한 수치 값의 목록 또는 범위 (예로, 특정 값 이상, 미만, 최대 및/또는 약, 및/또는 두 인용 된 값 사이)가 개시되거나 인용된 곳에서, 개시된 값 또는 값의 목록 또는 범위 내에 속하는 임의의 특정한 값 또는 값의 범위는 마찬가지로 구체적으로 본원에 개시되고 고려되는 것으로 이해될 것이다. 예시적인 예로서, 특정한 성분 또는 구성성분의 "최대 1,000 mg"의 개시는 (i) 0.01 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 750 mg, 990 mg 및 1,000 mg을 포함하나 이에 한정되지 않는, 제로 초과 또는 1,000 밀리그램 이하의 임의의 값; 및/또는 (ii) 0.01 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 990 mg, 5 mg 내지 750 mg, 10 mg 내지 500 mg 및 50 mg 내지 100 mg을 포함하나 이에 한정되지 않는, 제로 초과 내지 1,000 밀리그램 이하로부터의 또는 이들 사이의 임의 값의 범위 중 구체적인 개시를 포함한다. 유사하게, "적어도 80% 아미노산 서열 동일성" 또는 "80% 내지 100% 아미노산 서열 동일성"의 개시는 (i) 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%, 뿐만 아니라 이들 사이의 백분율 값의 임의의 분율을 포함하는, 80% 내지 100% 사이의 임의의 전체 백분율 값; 및/또는 (ii) 비제한적인 예로서, 81% 내지 100%, 82% 내지 100%, 83% 내지 100%, 84% 내지 100%, 85% 내지 100%, 86% 내지 100%, 87% 내지 100%, 88% 내지 100%, 89% 내지 100%, 90% 내지 100%, 91% 내지 100%, 92% 내지 100%, 93% 내지 100%, 94% 내지 100%, 95% 내지 100%, 96% 내지 100%, 97% 내지 100%, 98% 내지 100% 및 99% 내지 100%를 포함하는, 80% 내지 100% 사이의 백분율 값의 임의의 범위 중 구체적인 개시를 포함한다.
정의된 용어의 간략된 목록
전술한 및 후술할 서면 설명 및 첨부된 청구범위의 범주 및 내용을 이해하는 것을 돕도록, 선택된 몇 개의 용어가 바로 하기에 정의된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
시스템, 방법 및/또는 산물을 포함하는 본 발명의 다양한 양태는 본질적으로 예시적인 하나 이상의 구현예에 관하여 설명될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "구현예"는 "예, 사례 또는 예시로서 제공하는"을 의미하며, 본원에 개시된 다른 양태보다 반드시 바람직하거나 유리한 것으로서 해석되어서는 안된다. 또한, 본 개시 또는 발명의 "구현예"에 대한 언급은 첨부된 청구범위에 의해 표시된 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서도 예시적인 예를 제공하도록 의도된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 각각은 달리 문맥 상 명백하게 진술되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 고려하고, 포함하고, 구체적으로 개시한다. 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나의 단백질, 뿐만 아니라 복수 (예로, 둘 이상, 셋 이상 등)의 단백질을 고려하고 구체적으로 개시한다. 유사하게, 복수의 대상물의 사용은 반드시 복수의 이러한 대상물을 요구하지는 않지만, 달리 문맥 상 명백하게 진술하지 않는 한, 단일의, 뿐만 아니라 복수의 이러한 대상물을 고려하고/거나, 포함하고/거나, 구체적으로 개시하고/거나, 지원한다.
본 발명 전반에 걸쳐 사용된 바, 단어 "할 수 있다" 및 "할 수 있다 (may)"는 의무적 의미 (즉, 해야 하다는 의미)가 아닌 허용적 의미 (즉, 가능성을 갖는 의미)로 사용된다. 또한, 용어 "포함하는", "갖는", "관여하는", "포함하는", "특징으로 하는", 이들의 변형 (예로, "포함하다", "갖는다" 및 "관여하다", 포함하다" 등) 및 청구범위를 포함하여 본원에 사용된 유사한 용어는 포괄적이고 /거나 개방적이어야 하고, 단어 "포함하는" 및 이의 변형 (예로, "포함하다" 및 "포함하다")과 동일한 의미를 가져야 하고, 예시적으로 언급되지 않은 추가적인 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
실시예에서 또는 달리 명시적으로 표시된 곳을 제외하고, 본 명세서에서 물질의 양 또는 반응의 조건 및/또는 용도를 나타내는 모든 수적 정량은 단어 "약"에 의해 수정된 것으로서 이해되어야 한다. 본원에 사용 된 바, 용어 "약"은 값과 관련하여 이로써 나타낸 진술된 값 또는 양의 +/- 10%를 의미한다. 예를 들어, 본 발명 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 구성성분 또는 성분의 백분율 농도 또는 조성과 연결하여 (예로, 유체 또는 액체 혼합물, 수용성 혼합물, 용액 등과 같은 혼합물에서, 선택적으로 또는 바람직하게 w/w 백분율, w/v 백분율, v/v 백분율 등으로서 측정됨) 사용된다. 이러한 경우에, 용어 "약" 및/또는 용어 "+/- 10%"는 인용된 백분율의 +/- 10% 지점과는 정반대로, 진술된 수치의 +/- 10%를 의미하고/거나, 이를 포함한다. 예로서, 구성성분 또는 성분의 20% w/w가 총 혼합물 100 mL 당 20 g의 구성성분 또는 성분을 반영하는 곳에서, 용어 "약" 및/또는 용어 "+/- 10%"는 10% w/w 내지 30% w/w의 범위가 아닌 18 g 내지 22g의 인용된 범위 (즉, 18% w/w 내지 22% w/w)를 의미하고/거나 포함한다. 소위 "약" 값 및/또는 +/-10%에 대한 대안은 진술된 값의 +/-1%, +/-2%, +/-3%, +/-4%, +/-5%, +/-6%, +/-7%, +/-8% 또는 +/-9%를 포함하고, 각각은 본원에서 용어 "약" 또는 +/-10%의 사용에 대한 적합한 대안 또는 대체물로서 고려된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "대략" 및 "실질적으로"는 진술된 (예로, 원하는 기능을 여전히 수행하거나 (원하는 또는 예상된) 결과를 달성하는) 양에 근접한 일정량 (또는 임의의 양)을 나타내거나 의미한다. 예를 들어, 용어 "대략" 및 "실질적으로"는 진술된 양의 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 또는 기타 백분율 이내 또는 미만인 양을 말할 수 있다. 본원에 사용된 바, 용어 "실질적으로 결여된"은 (1) 검출가능하지 않은 또는 정량가능하지 않은 양, (2) 일반적으로 당업자에 의해 검출가능한 또는 정량가능한 양을 반영하는 것으로 고려되는 양 이하 또는 미만, 및/또는 (3) 일반적으로 당업자에 의해 기능적이거나 (원하는 또는 예상된) 결과를 달성할 수 있는 것으로 고려되는 양 이하 또는 미만 (예로, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 또는 기타 백분율 이하)을 의미한다.
"충분량 (Quantum satis)" ("q.s."또는 "qs"라고도 지칭됨)은 충분한 양을 의미한다. 이에 따라, 구성성분 또는 성분 "qs 100%", "qs 100%로 제공되는" 또는 "qs 내지 100%"는 구성성분 또는 성분이 조성물을 완성하거나, 총량 (인용 여부와는 상관없이, 구성성분 모두)을 100%로 얻기에 충분한 양으로 제공되거나 포함되는 것을 나타낸다. 그러나, (최종) 구성성분 또는 성분 "qs 100%", "qs 100%로 제공되는" 또는 "qs 내지 100 %"는 혼합물이 "qs 100%" 구성성분 이전에 바로 나열되거나 인용된 구성성분으로 구성되거나, 필수적으로 구성되거나, 단지 포함함을 나타내지 않는 것으로 주목된다. 다시 말하면, "qs 100%" 및 유사한 용어는 나머지가 무엇이든 나머지의 출처를 나타내는 개방형 표현인 것을 의미한다.
본원에 사용된 바, 용어 "산물(들)"은 조성물, 제형물 및 혼합물, 뿐만 아니라 기구, 장치, 어셈블리, 키트 및 시스템 등을 포함한다. 유사하게, 용어 "방법"은 공정, 절차 및 단계 등을 포함한다.
본원에 사용된 바, 본 발명 또는 본원에 기술된 구현예의 "특징" 또는 "양태"는 근접한 대상물의 성질, 속성, 구성성분, 성분, 요소, 구성원, 부분, 일부, (방법) 단계 또는 다른 측면을 말한다.
본원에 사용된 단어 "또는"은 일반적으로 특정한 목록의 임의의 일 구성원을 의미할 뿐만 아니라, 상기 목록의 둘 이상의 구성원의 임의의 조합도 포함한다. 유사하게, 용어 "및"은 용어 "또는"과 상호교환가능할 수 있으며, 이들 중 어느 하나는 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "포함하는 (comprising)"은 "포함하는", "갖는", "포함하는" 또는 "특징으로 하는"과 동의어이다. 이들 용어는 포괄적이고 개방적이며, 추가적인, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
어구 "로 구성되는"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 이러한 문구가 청구범위의 본문의 절에 나타날 때, 바로 서문에 이어지지 않고 해당 절에 제시된 요소만을 제한하며, 다른 요소들은 전체적으로 청구범위로부터 배제되지 않는다.
어구 "필수적으로 구성되는"은 청구범위의 범주를 특정된 재료 또는 단계, 및 청구된 대상물의 기본 및 신규 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
용어 "포함하는", "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"은 대안적으로 사용될 수 있다. 이들 세 개의 용어 중 하나가 사용될 때, 현재 개시되고 청구된 대상물은 나머지 두 개의 용어 중 어느 하나의 사용을 포함할 수 있다.
용어 "복수" 및 "적어도 두 개"는 상호교환적으로 사용된다.
용어 "병태"는 당업자에게 이해되는 바와 같이, 환자에서 소견을 보이거나 예측되는 임의의 장애, 질환, 송상 또는 질병을 말한다. 이러한 병태의 소견은 사전 병태 증상, 징후 또는 마커를 포함하여 당 업계에 공지된 바와 같이 초기, 중간 또는 후기 단계 소견일 수 있다. 이러한 병태에 대한 예측은 과학적 또는 의학적 증거, 위험 평가 또는 단순한 염려 또는 공포에 근거하는지 여부와 상관없이 이의 예측, 예상, 구상, 추정, 추측 및/또는 사료된 발생이거나 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, 용어 "환자"는 용어 "대상"과 동의어이며, 일반적으로 해당 용어가 본원에 정의된 바와 같이, 특히 (i) 인간 (의사, 간호사 또는 의료 보조원 또는 자원 봉사자의 간호 하에) 및 (ii) 비-인간 포유동물과 같은 비-인간 동물 (수의사 또는 기타 수의 전문가, 보조원 또는 자원 봉사자의 간호 하에)에 관하여, 의료 전문가의 간호 하의 임의의 동물을 말한다.
본원에 사용된 바, 용어 "의료 전문가"는 일반적으로 면허가 있는 의료 서비스 제공자 또는 보조원, 기술자 및/또는 자원 봉사자와 같은 면허가 없는 서비스 제공자, 특히 보건 의료 서비스 제공자의 (담요) 라이센스 또는 보험이 적용되는 제공자에게 중점을 두어, 인간 및 비-인간 포유동물과 같은 비-인간 동물을 포함하는 동물에게 건강 관리를 제공하는데 책임지거나 참여하는 임의의 개인 또는 실체를 말한다. 이러한 용어는 문맥 상 적절한 경우 종양 전문의, 외과 의사, 의사의 조수, 간호사, 사혈 전문의, 수의사 등을 포함할 수 있다.
용어 "암"은 비정상적인, 전형적으로 조절되지 않는 세포의 성장을 말한다. 본원에 사용된 "암성 세포"는 비정상적인, 전형적으로 조절되지 않는 성장을 갖는 악성 세포를 포함한다. 이와 같이, 용어 암은 전형적으로 조절되지 않는 방식으로 성장하는 악성 세포를 특징으로 하는 복수의 상이한 독특한 질환을 포함하는 포괄적인 용어이다.
본원에 사용된 바, 용어 "진단" 또는 "진단하는" 및 유사한 용어는 미국 식품 의약품 관리청 (FDA), 기타 정부 또는 비정부 단체, 조직 또는 기관에 의해 요구되거나 규제되는 바, (모든 사례에서) 인증된, 규제-준수하는 의학적 진단을 전달하거나 요구하도록 의도되지 않는다. 오히려, "진단" 또는 "진단하는" 및 유사한 용어는 본원에 사용된 바, 병태를 나타내고/거나 병태와 관련된 결정을 내리는데 도움이 될 수있는 정보를 제공하는 것에 관한 것이다.
용어 "공동-투여" 및 유사한 용어는 둘 이상의 성분의 동시적, 순차적 및/또는 조합된 투여를 말한다. 예를 들어, 두 개의 성분은 각각의 성분을 별개의 용량으로 동시에, 동시에 또는 순차적으로 (예로, 일정 기간에 의해 분리된 별개의 투여) 투여함으로써 공동-투여될 수 있다. 일정 기간은 매우 짧거나 (예로, 실질적으로 제 1 투여에 바로 이어서) 더 길 수 있다 (예로, 1 내지 60초, 1 내지 60분, 1 내지 24시간, 1 내지 7일, 1 내지 4주 및 1 내지 12개월 등 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위).동시적 또는 동시 투여는 두 개 이상의 성분을 위한 투여 시간대를 중첩시키는 것 또는 둘 이상의 성분의 혼합물을 포함하는 조합 산물의 투여를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, "실온"은 동결점 (0℃또는 성분을 조정한 동결점의 존재에 의존하여 다른 (동등한) 냉동 온도) 초과 내지 정상 인체 온도 (37℃또는 성분을 조정한 비등점의 존재에 의존하여 다른 (동등한) 비등 온도) 미만, 바람직하게 약 4℃ 초과 내지 약 35℃미만, 더욱 바람직하게 약 5℃ 내지 약 32℃, 약 8℃ 내지 약 30℃, 약 10℃ 내지 약 30℃, 약 10℃ 내지 약 25℃, 약 10℃ 내지 약 20℃, 약 10℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 15℃ 내지 약 20℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 약 20℃ 내지 약 22℃ 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위인 임의의 온도를 말할 수 있다.
본원에 사용된 바, "냉장"은 동결점 (0℃ 초과 내지 32℃ 미만, 바람직하게 약 1℃ 초과 내지 약 30℃, 약 1℃ 내지 약 25℃, 약 1℃ 내지 약 20℃, 약 1℃ 내지 약 15℃, 약 2℃ 내지 약 20℃, 약 2℃ 내지 약 15℃, 약 3℃ 내지 약 20℃, 약 3℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 20℃, 약 4℃ 내지 약 15℃ 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위인 임의의 온도를 말할 수 있다.
본원에 사용된 바, "핵산" 및 유사한 용어는 DNA 또는 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 여부에 상관없이 자연 발생 또는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 구체적으로, 핵산은 DNA, RNA, cDNA, gDNA, ssDNA, dsDNA 또는 이들의 임의의 조합을 이에 한정되지 않지만 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 당 업계에 공지된 뉴클레오티드 또는 핵산 유사체 (예로, BrdU) 및 비-포스포디에스테르 (뉴클레오시드 간) 연결 또는 골격 (예로, 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 티오디에스테르 연결)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 유전자 산물, 발현 산물 또는 단백질을 말한다. 펩티드는 연속적인 아미노산으로 구성된다. 용어 "펩티드" 또는 "단백질"은 자연 발생 또는 합성 분자를 포괄한다.
본원에 사용된 바, 용어 "표준 아미노산"은 다음을 포함한다: 알라닌 - ala - A; 아르기닌 - arg - R; 아스파라긴 - asn - N; 아스파라긴산 - asp - D; 시스테인 - cys - C; 글루타민 - gln - Q; 글루탐산 - glu - E; 글리신 - gly - G; 히스티딘 - his - H; 이소류신 - ile - I; 류신 - leu - L; 리신 - lys - K; 메티오닌 - met - M; 페닐알라닌 - phe - F; 프롤린 - pro - P; 세린 - ser - S; 트레오닌 - thr - T; 트립토판 - trp - W; 타이로신 - tyr - Y; 및 발린 - val - V.
본원에 사용된 바, "코돈 최적화된"또는 "코돈 최적화"는 뉴클레오티드 서열에서 코돈을 분자의 발현에 사용된 유기체에서 바람직하거나 이의 코돈 사용도 양상과 더욱 잘 매칭되는 코돈으로 변형시키거나 변경하는 공정을 말한다. 따라서, 코돈은 핵산 발현의 효율성을 증진시키기 위해, 예로 더 신속한 번역 속도 및 높은 정확도를 달성하기 위해 유기체에서의 공지된 코돈 사용도를 기초로 한 발현이 바람직한 특정한 유기체에서의 사용도에 최적화될 수 있다. 특정한 유기체에서의 코돈 사용도는 알려져 있다.
인코딩 핵산 분자는 변형된 야생형 또는 코돈 최적화된 서열일 수 있으며, 여기서 코돈은 포유동물 세포, 예로 CHO 세포 또는 293 세포와 같은 특정한 숙주 세포에서 또는 진핵 세포인 효모 또는 식물 세포에서의 발현에 최적화된다.
특정한 예에서, 핵산 서열은 예를 들어 인코딩된 서열의 발현 수준을 증가시키도록 코돈 최적화될 수 있다. 특정한 코돈 사용도는 변형된 폴리펩티드가 발현되는 숙주 유기체에 의존적이다. 당업자라면 예를 들어 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시애를 포함한 포유동물 또는 인간 세포, 박테리아 또는 효모에서의 발현을 위한 최적의 코돈에 익숙하다. 예를 들어, 코돈 사용도 정보는 kazusa.or.jp.codon에서 입수가능한 코돈 사용도 데이타베이스로부터 입수가능하다 (예로, 데이타베이스의 설명을 위해 Richmond (2000) Genome Biology, 1: 241 참조). 또한, Forsburg (2004) Yeast, 10: 1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19: 4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12: 8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78 참조.
머리 글자 또는 다른 약어의 첫 번째 정의는 본원에서 동일한 약어의 모든 후속적 사용에 적용되며 처음 정의된 약어법의 정상적인 문법적 변형에 준용되고, 달리 명시적으로 진술되지 않는 한, 성질의 측정은 이전 또는 이후에 동일한 성질에 대해 언급된 것과 동일한 기법에 의해 결정된다.
예시적인 구현예
본 발명의 예시적인 구현예는 조성물, 물질의 조성물, 산물, 제조 물품, 제형물, 조합 산물, 공동-투여, 공동-제형물, 용량, 공정, 방법, 치료 프로토콜, 진단 방법 및 키트 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
혈액에서 클로토 단백질을 안정화시키는 산물 및 방법
혈액 또는 혈청에서, 구체적으로 실온에서, 보다 구체적으로 (연장된) 기간 동안 클로토 단백질 (예로, 가용성 클로토)의 안정성은 이전에 보고된 바 없다. 도 3은 연장된 기간에 걸쳐 실온뿐만 아니라 다른 온도에서 인간 혈청에서 클로토 단백질의 놀랍고도 예기치 못한 안정성을 나타낸다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 전형적인 혈액 또는 혈청 단백질 진단제는 단백질 (수준)을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량하는데 적합한 양의 혈액을 수집하도록 정맥혈 채혈을 요구한다. 더욱이, 채혈된 혈액 시료는 전형적으로 단백질 및/또는 시료 안정성을 보존하도록 시료화 직후 (예로, 동일한 날, 시료화 수분 또는 수시간 이내 등) 가공되거나, 냉장 (실온 미만)된다. 그러나, 본 발명자는 본 발명의 일부 구현예에서, 혈액 중 클로토 단백질이 실온에서 최대 7일, 9일, 14일 또는 그 이상 동안 안정할 수 있음을 발견하였다. 일부 구현예에서, 예를 들어 시료에 EDTA 및/또는 헤파린을 첨가하는 것은 실온에서 클로토 단백질을 적어도 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일 또는 30일 동안 안정화시킬 수 있다 (데이타 미도시). 비제한적인 예로서, 네 명의 공여자로부터 수집된 혈액 시료에서 클로토의 수준은 실온에서 EDTA 및/또는 헤파린이 첨가되어 7일 기간 (및 14일 기간)에 걸쳐 비교적 일정하였다 (도 3 참조). 또한, 테스트된 항응고제인 EDTA 및 헤파린은 클로토 농도의 견지에서 유의한 차이를 전혀 나타내지 않았다. 이것은 본 발명자에게 놀랍고도 예기치 못한 것이었다.
실온 보관은 수백, 수천, 수만 개 등의 시료의 냉장이 (논리적으로 및/또는 경제적으로) 상업적으로 실용적이지 않을 수 있는 시판되는 진단적 응용에 중요할 수 있다. 적합한 실온 안정화 방법으로, 본원에 기술된 바와 같이, 클로토 혈액 또는 혈청 수준의 시판되는 진단 테스트가 달성될 수 있다.
전술한 바에 비추어, 본 발명의 구현예는 EDTA 및/또는 헤파린을 클로토 단백질을 포함하는 생물학적 시료 (예로, 혈액 또는 혈청)에 조합하는 방법 및/또는 산물을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 산물은 시료 수집 용기 및 시료 보존 조성물을 포함하는 시료 수집 키트를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 포유동물 혈액 시료에서 클로토 단백질을 안정화시키는 방법을 포함한다. 방법은 포유동물 대상으로부터 모세관　혈액을 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 모세관　혈액은 일정량의 가용성 클로토 단백질을 포함할 수 있다 (또는 포함하는 것으로 의심될 수 있음). 방법은 적어도 24시간 (바람직하게 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 21, 28, 30일 또는 그 이상) 동안, 바람직하게 실온에서 모세관　혈액을 (예로, 용기에서) 보관하는 단계를 포함할 수 있다. 모세관　혈액 시료는 보존제 또는 항응고제와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 용기는 내부에 배치되거나 이에 첨가된 보존제 또는 항응고제를 갖을 수 있어, 보존제 또는 항응고제가 용기에서 모세관　혈액과 혼합될 수 있다. 보존제 또는 항응고제는 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 보존제 또는 항응고제는 적어도 24시간 (또는 그 이상) 동안 바람직하게 실온에서 가용성 클로토 단백질을 안정화시킬 수 있다. 그러나, 냉장 및/또는 냉동이 또한 본원에서 고려되는 것이 이해될 것이다.
또한, 본 발명자는 핑거 스틱 (약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 혈액)으로부터의 측정된 클로토 단백질 수준이 동일한 대상에서 정맥혈 채혈로부터 측정된 클로토 단백질 수준과 일치하는 점을 발견하였다. 따라서, 클로토 단백질은 비교적 적은 상업적으로 실용적인 혈액량으로 정확하게, 재현가능하게 및 신뢰가능하게 측정될 수　있다. 이것은 본 발명자에게 놀랍고도 예기치 못한 것이었다. 구체적으로, 본 발명자는 혈액에서 클로토 단백질을 정확하게, 재현가능하게, 신뢰가능하게 측정하기 위해 표준 바이알에 수집된 혈액의 정량이 필요할 것으로 예상하였다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 정맥혈 채혈 (예로, FDA 승인된 또는 기타 진단제의 경우)에는 전형적으로 전문적인 사혈 전문의를 요구한다. 정맥혈 채혈은 또한 환자에게 불편하고 고통스럽다. 반면에, 핑거 스틱 방법은 편리하고 저렴하다. 상업적으로, 소비자에게 직접 적용 (예로, 진단 키트)은 재택 혈액 시료화를 요구할 수 있다. 이러한 경우, 정맥혈 채혈은 바람직하지 않거나 실용적이지 않을 수 있다. 본 발명의 구현예는 간단하고 편리한 핑거 프릭 (또는 모세관　혈액을 시료화하는 다른 수단)으로 모세관　혈액 시료화를 허용할 수 있다. 시료화된 모세관　혈액의 양은 예를 들어 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 20 내지 800 μL, 더욱 바람직하게 약 30 내지 600 μL, 더욱 더 바람직하게 약 40 내지 400 μL, 더욱 더 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 모세관　혈액일 수 있다.
전술한 바에 비추어, 본 발명의 일부 구현예는 혈액 또는 혈청의 모세관 (비-정맥, 비-정맥절개 등) 시료화를 위한 산물 및 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 모세관 혈액 시료화 장치를 포함할 수 있다. 예시적으로, 모세관 혈액 시료화 장치는 절개 장치이거나, 이를 포함하고/거나, (혈액) 란셋을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액 시료화 또는 절개 장치는 (스프링-부착된) 핑거 프리커와 같은 핑거 스틱 장치이거나 이를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 핑거 및 신속한 프릭 장치에 한정되지 않음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 절개 장치 또는 이의 란셋은 일회용 및/는 교체가능할 수 있다. 구현예는 또한 혈액 시료를 수집하도록 키트를 사용하기 위한 서면 설명서를 포함할 수 있다.
포유동물 혈액 시료에서 클로토 단백질을 안정화시키는 예시적인 방법은 포유동물 대상으로부터 일정량의 가용성 클로토 단백질을 포함하는 모세관 혈액을 획득하는 단계 및 모세관 혈액을 실온에서 적어도 24시간 동안 용기에 보관하는 단계로서, 용기는 내부에 배치된 보존제 및 항응고제를 갖고, 보존제 또는 항응고제는 용기에서 모세관 혈액과 혼합되고, 보존제 또는 항응고제가 가용성 클로토 단백질을 실온에서 적어도 24시간 동안 안정화시키고, 보존제 또는 항응고제는 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는, 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보존제 또는 항응고제와 혼합된 모세관 혈액을 실온에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 21, 28 또는 30일 동안 보관하고, 보존제 또는 항응고제는 가용성 클로토 단백질을 실온에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 21, 28 또는 30일 동안 안정화시킨다. 혼합물의 시료는 또한 특정 구현예에서 냉장될 수　있다.
특정 구현예에서, 소량의 혈액 (1 내지 4 방울, 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL)은 (예로, 재택) 수집될 수 있고, 냉동되지 않거나, 냉장되지 않거나, 냉각되지 않은 (예로, 상온 또는 실온) 정상적인 운송 방법을 통해 진단 시설로 보내진다. 이것은 기존 방법 및 산물에 비해 실질적인 이점을 제공한다. 이에 따라, 개인, 재택 또는 다른 비-임상 기반의 테스트 또는 진단제 (예로, 정량화/측정 지표를 갖는 측면 플로우, 재택 ELISA 키트 등)가 본원에서 고려된다. 그러나, 임상 또는 클리닉 기반의 테스트 또는 진단제가 본원에서 고려되는 점이 또한 이해될 것이다.
클로토 단백질 수준을 측정하기 위한 산물 및 방법
일부 구현예는 내인성 및/또는 외인성 클로토 단백질, 보다 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질을 검출하고/거나 정량하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 클로토 단백질 수준, 보다 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준을 검출하고, 정량하는 산물 (예로, 시스템 또는 키트)을 포함한다. 일부 구현예는 대상에서 클로토 단백질 결핍을 진단하는 방법을 포함한다.
포유동물의 혈청에서 순환하는 가용성 클로토 단백질의 수준은 나이가 들어감에 따라 감소하는 것으로 추정되었다. 그러나, 본 발명 이전에, 인간 및 비-인간 동물에서 혈청 클로토 수준의 이러한 추정된 감소가 발생하기 시작할 수 있는 연령, 자연 발생의 순환하는 가용성 클로토 단백질의 정상 수준 (또는 범위), 인간 및 비-인간 동물에서 순환하는 클로토의 감소율, 인간 및 비-인간 동물에서 자연 발생의 순환하는 가용성 클로토 단백질의 수준 (또는 범위)이 낮아지는 정도에 대한 신뢰가능하고 재현가능한 데이타는 사용가능하지 않고, 널리 받아들여지지 않았다. 시판되는 항체는 (미가공 및/또는 실질적으로 정제되지 않은) 포유동물 혈액 또는 혈청 시료에서 (내인성 및 외인성) 클로토 단백질의 신뢰가능하고/거나, 재현가능하고/거나, 비용 효과적인 검출에 적합하지 않을 수 있다. 이에 따라, 적합한 항체 (예로, 혈액 시료 ELISA 검출의 경우)는 다음의 절차에 따라 개발되었다.
제 1상: 클로토 단백질 발현: (C-말단) 6×His 태그, (C-말단) Fc 태그 또는 (N- 및 C-말단) HAS 태그를 갖는 다양한 크기의 (마우스 및 인간) 알파 클로토 단백질 (예로, 인간의 경우 아미노산 잔기 34 내지 981번, 34 내지 549번 등)이 제조되었다. 상기 단백질에 상응하는 유전자 구조물을 합성하여 시판되는 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이는 다음으로 클로토 단백질 생산을 위해 HEK-293 세포 또는 CHO 세포 내로 형질감염되었다. 발현된 클로토 단백질은 본 발명에 공지되고 설명된 방법에 의해 정제되었다. 예시적으로, IMAC 및 IE 단백질 크로마토그래피를 사용하여, 330 mM NaCl, 20 mM Na-포스페이트 완충액, pH 8.0에서 0.78mg/mL 단백질 시료 (280nm에서 UV 흡광도에 의해 측정됨)을 산출하였다. 유사하게, 본원에 기술된 바와 같이 프로테인 A 크로마토 그래피에 이어지는 크기 배제 크로마토그래피가 단량체 및 다량체 (예로, 이량체 및 사량체) 형태의 활성을 갖는 단백질을 생성 하였다.
품질 관리: 정제된 단백질의 단백질 순도 및 특성을 겔코드 블루 시약으로 염색된 4 내지 20% SDS-PAGE (환원 및 비-환원)에서 분석하였다. 예로, 도 4 참조:
레인 1: 클로토 ECD, 로트 번호 170918A, 2 μg/레인, 환원.
레인 M: 단백질 분자량 마커.
레인 2: 클로토 ECD, 로트 번호 170918A, 2 μg/레인, 비-환원.
레인 3: BSA 표준, 2 μg/레인, 환원.
발현된 단백질의 이론적으로 계산된 분자량은 109.97 kDa이었다.
제 2상: 닭 다중클론 (IgY) 및 마우스 단일클론 (하이브리도마) 개발: 발현된 단백질을 단일클론 및 다중클론 항체의 개발을 위해 마우스 및 닭을 면역화하는데 항원으로서 사용하였다. 일부 구현예에서 마우스 단일클론이 ELISA 항체의 경우 바람직하다. 융합 과정 (골수종 세포를 갖는 비장세포) 이후, 2회의 하이브리도마 선별이 수행되었고, 대략 3,000개의 클론이 초기에 스크리닝되었고, 최종적으로 활성을 기초로 하여 10개의 클론으로 좁혀졌다. 이들 10개의 클론을 기탁하고, 또한 배양하여 정제하고 각각 ~ 5 mg의 정제된 항체를 생성하였다.
하기 표는 간접 ELISA (표준 ELISA 프로토콜, TMB 5분)에 의해 표적 항원을 사용한 예시적인 마우스 혈청 IgG 역가 평가를 제시한다.
항원 1 - 6×His 태그화 클로토, 50 mM Na-중탄산염 완충액에서 0.5 μg/mL.
항원 2 - 50 mM Na-중탄산염 완충액에서 클로토-Fc 0.5 μg/mL.
Figure pct00001
Figure pct00002
표 1의 요약: 비장 수집을 위해 마우스 M3 및 M5를 선택하였다.
클로토 하이브리도마의 일차 스크리닝: 표준 프로토콜에 따라 마우스 #M3 및 #M5로부터의 비장 세포가 수집되었고, 골수종 세포와 융합되었다.
하이브리도마 상청액은 표적 항원 (표준 간접 ELISA 프로토콜, TMB 10분)을 사용하는 간접 ELISA에 의해 평가되었다.
항원, 클로토 단백질 (로트 번호 170918A, 0.78 mg/mL) 50 mM Na-중탄산염에서 0.5 μg/mL, 100 μL/웰, 밤새 +4℃
항-마우스 HRP, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (서브클래스 1 + 2a + 2b + 3), Fcγ특이적 단편, SEDB에서 1 : 4000 (Jackson Lab., 카탈로그 번호 115-035-164), 100 μL/웰, 1 시간, RT.
선별 컷오프 OD 450 nm > 0.5.
하기 표는 일차 클로토 하이브리도마 스크리닝을 나타낸다. 0.5 내지 < 2의 OD 450nm을 갖는 클론은 노란색 (밝은 회색)으로 강조 표시된다. OD 450nm > 2를 갖는 클론은 주황색 (진한 회색)으로 강조 표시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
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Figure pct00018
표 2의 요약: 2,976개의 클론이 분리되어 분석되었다. 검증 스크리닝을 위해 66개의 표적 특이적 클론이 증식되었다.
클로토 하이브리도마의 이차 스크리닝: 하이브리도마 상청액은 표적 항원 (표준 간접 ELISA 프로토콜, TMB 10분)을 사용하는 간접 ELISA에 의해 평가되었다.
항원, (1) 클로토-6×His 단백질 (로트 번호 170918A, 0.78 mg/mL) 50 mM Na-중탄산염에서 0.5 μg/mL, 100 μL/웰, 밤새 +4℃(2) 클로토-Fc 단백질 (Vista, 0.1 mg/mL) 50 mM Na-중탄산염에서 0.5 μg/mL, 100 μL/웰, 밤새 +4℃
검출 Ab: 항-마우스 HRP, 퍼옥시다제 AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (서브클래스 1 + 2a + 2b + 3), Fcγ특이적 단편, SEDB에서 1 : 5000 (Jackson Lab., 카탈로그 번호 115-035-164), 100 μL/웰, 1 시간, RT.
Figure pct00019
Figure pct00020
표 3의 요약: 28개의 클로토-6×His 특이적 클론이 검증되었다 (OD450 컷오프: > 0.5, 클로토-6×His 플레이트) - 1F6, 2E1, 2E12, 3D2, 4H4, 4H5, 5D12, 7A12, 7F9, 8G11, 10A8, 10D1, 10G3, 11C9, 11F7, 11H3, 12G4, 12H3, 14B2, 14B7, 14B12, 15E9, 16H1, 18C2, 18G5, 21G12, 26G3, 28F11.
고유의 (태그화되지 않음) 클로토 ELISA 개발을 위해 권장되는 9개의 클로토-6×His 특이적 클론의 제 1 어레이 (OD450 > 2, 클로토-6×His 플레이트) - 2E12, 4H4, 4H5, 5D12, 11C9, 11F7, 14B12, 26G3, 28F11.
고유의 (태그화되지 않음) 클로토 ELISA 개발을 위해 권장되는 11개의 클로토-6×His 특이적 클론의 제 2 어레이 (OD450 > 1 및 < 2, 클로토-6×His 플레이트) - 1F6, 2E1, 3D2, 7A12, 7F9, 8G11, 10G3, 11H3, 14B7, 18C2, 18G5.
태그화되지 않은 및 클로토-Fc 단백질 (OD450 > 1.7, 클로토-6×His 및 클로토-Fc 플레이트) 둘 다를 측정할 수 있는 ELISA 개발을 위해 권장되는 10개의 클로토-6×His 및 클로토-Fc 특이적 클론의 제 1 어레이- 1F6, 2E12, 4H4, 4H5, 8G11, 11C9, 11F7, 14B12, 26G3, 28F11.
태그화되지 않은 및 클로토-Fc 단백질 (OD450 > 1.2 및 < 1.7, 클로토-6×His 및 클로토-Fc 플레이트) 둘 다를 측정할 수 있는 ELISA 개발을 위해 권장되는 2개의 클로토-6×His 및 클로토-Fc 특이적 클론의 제 2 어레이- 5D12, 14B7.
mIgG 이소형 결정: 클로토 하이브리도마 선별된 클론의 mIgG 이소형 결정: 선별된 하이브리도마 클론 배양 상청액으로부터의 항체 이소형 결정.
하이브리도마 배양 배지의 시료를 사용하여 제조사의 지침에 따라 신속한 ELISA 마우스 mAb 이소형 결정 키트 (ThermoFisher, 카탈로그 번호 37503)를 사용한 항체 이소형을 결정하였다.
하기 표는 클로토 하이브리도마 선별된 클론의 mIgG 이소형 결정의 결과를 제시한다.
Figure pct00021
표 4의 요약: mIgG 이소형 결정:
1F6, 2E12, 4H4, 4H5, 8G11 및 11F7: IgG1
11C9, 14B12, 26G3 및 28F11: IgG2b
품질 관리: 품질 관리를 위해 간접 ELISA를 수행하였다: ELISA 플레이트를 50 mM Na-중탄산염 완충액에서 0.5 μg/mL의 컨쥬게이션되지 않은 6×His 태그화 클로토 단백질 또는 클로토-Fc 단백질로 +4℃에서 밤새 코팅하였다. 정제된 1F6, 2E12, 4H4, 4H5, 8G11, 11C9, 11F7, 14B12, 26G3 및 28F11 항체를 500 ng/mL에서 시작하여 5배 일련의 희석으로 적용하였고, 이차 항체 염소 항-마우스 HRP를 0.16 μg/mL로 적용하였다. 반응은 7분 동안 현상되었다. 450 nm에서의 미가공 흡광도 데이타 및 상응하는 항체 역가측정 곡선.
Figure pct00022
또한, 도 5a, 도 5b 및 도 6에 각각 도시된 용량 반응 곡선 참조.
품질 관리: 정제된 항체의 순도 및 특성을 겔코드 블루 시약으로 염색된 4 내지 20% SDS-PAGE (환원 및 비-환원)에서 분석하였다. 도 7a 및 도 7b 각각 참조.
다중클론 IgY 항체: 다중클론 IgY 항체도 역시 개발되었다. 상기 설계는 필요에 따라 닭의 다중클론 IgY 항체의 생산에 적용되었다.
간접 ELISA (TMB: 5분)에 의해, 표적 항원을 사용한 닭 혈청 IgY 역가 평가. 450 nm에서 판독
항원: 50 mM Na-중탄산염에서 클로토 1 μg/mL (0.78 mg/mL, 로트 번호 170918A).
시료: 닭 #1, #2, RT, 1시간 (PBS에서 5% 밀크).
Figure pct00023
ELISA 플레이트를 50 mM Na-중탄산염 완충액에서 0.5 μg/mL의 6×His 태그화 클로토 단백질 또는 클로토-Fc 단백질로 +4℃에서 밤새 코팅하였다. 정제된 항-클로토 IgY 항체 (로트 번호 180327A)를 1000 ng/ mL에서 시작하여 5배 일련의 희석으로 적용하였고, 이차 항체 염소 항-닭 HRP를 0.16 μg/mL로 적용 하였다. 반응은 5분 동안 현상되었다. 450 nm에서의 미가공 흡광도 데이타 및 상응하는 항체 역가측정 곡선. 또한, 도 8a 및 도 8b 참조.
Figure pct00024
요약: HRP 및 바이오틴-항-클로토 IgY 둘 다는 간접 ELISA에서 유의한 신호를 나타낸다. Bio-IgY는 HRP-IgY보다 더 강한 신호를 갖는다.
도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, Ig/HRP-IgY 쌍에는 비교적 약한 신호가 존재한다. IgY/Bio-IgY는 낮은 농도 (0.25 μg/mL)에서도 비교적 높은 배경을 보여준다. IgY/Bio-4H5 쌍은 IgY/표지된-IgY 쌍보다 잘 작동하는 것으로 보인다.
포유동물의 혈청에서 순환하는 가용성 클로토 단백질의 수준은 나이가 들어감에 따라 감소하는 것으로 추정되었다. 인간 대상에서 자연 발생의 순환하는 가용성 클로토 단백질에 대한 기저선 측정은 다양한 공보에 보고되어 왔다. 철저한 문헌 리뷰는 표시된 인간 대상에서 순환하는 가용성 클로토 단백질에 대한 다음의 평균 범위(들)를 산출하였다 (표 8 및 표 9 참조).
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
상기 표에서, CKD: 만성 신장 질환; GH: 성장호르몬; T1D: 제 1형 당뇨병; T2D: 제 2형 당뇨병; CAD: 관상동맥 질환; COPD: 만성 폐쇄성 폐 질환; MS: 다발성 경화증.
문헌에서 관찰된 가변성에 비추어, 혈청 클로토 수준을 측정하는 더 강건하고, 더 일관되고 및/또는 더 정확한 수단이 필요하다. 본 발명의 구현예는 하기에 더 자세하게 기재된 바와 같이 클로토 진단 키트 및 이를 사용하는 방법을 포함한다.
표 10은 인간 대상 (임의의 치료, 예로 건강 보조제, 약제, 치료적　단백질 등을 받기 이전에)에서 자연 발생의 순환하는 가용성 클로토 단백질에 대한 기저선 측정을 제시한다. 도 10은 인간 대상에서 순환하는 클로토 단백질 수준의 (매일) 변화의 그래프 예시이다.
Figure pct00028
0650시간에 시작하여 시간 당 한 번, 인간 대상로부터 혈액 시료를 채취하고 클로토 단백질 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
본 발명의 구현예에 따른 정량적 ELISA는 인간 혈장 시료에서 (1) 고유의 (예로, 내인성) 클로토, (2) 재조합 클로토-Fc 융합, 및 (3) 재조합 6×His 클로토를 검출할 수 있다.
추가의 클로토 단백질의 측정은 하기 도 11a 내지 도 11b 및 표 11에 도시되고 제시된다.
Figure pct00029
ELISA 키트를 이용한 인간 혈장에서의 클로토 안정성
정맥 및 모세관 혈액 ("핑거") 혈액의 시료를 4명의 공여자 (A, B, C, D)로부터 수집하고, (i) EDTA 또는 (ii) 헤파린 포함 튜브에 보관하였다. 1.5 ng/mL의 클로토 (로트 번호 170918A - 인간 가용성 알파 클로토)를 공여자 A로부터 수집된 정맥 및 모세관 시료 세트 내에 스파이킹하였다. 수집된 혈액 (혈액 시료)을 실온에서 0, 1, 4, 16, 24, 48, 72, 96 또는 168시간 동안 보관한 다음 회전 분리하였다. ELISA 테스트 이전에 각 시료로부터의 혈장을 -80℃에서 보관하였다. ELISA 플레이트 맵, 미가공 데이타, 표준 곡선 데이타 및 농도는 하기 표 12 내지 표 21에 제시되어 있다.
Figure pct00030
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Figure pct00043
Figure pct00044
도 12는 RT에서 상이한 배양 시간에서의 클로토 수준을 도시한다.
하기 표 22는 혈장에서 평균 클로토 단백질 수준 (ng／mL)을 나타낸다:
Figure pct00045
하기 표 23은 스파이크된 클로토 회복율 (%)을 나타낸다.
Figure pct00046
운송 스트레스를 필적하는 다양한 온도에서의 클로토 안정성 테스트
사혈 전문의(들)이 각각의 공여자로부터의 > 12 mL의 혈액 (시료)을 헤파린 처리된 혈액 튜브 내에 수집하였다. 기술자(들)이 수집된 각 공여자의 시료로부터 300 내지 400 μL의 혈액을 별도의 헤파린 처리된 마이크로튜브 (BD사) 내로 즉시 분배하였다. 연구 설계에 따라 튜브를 보관하고 처리하였다 (하기 표 참조). 각각의 시간대에서 혈액을 처리하거나 원심분리하여 -80℃에서 보관하였다 (혈장). 모든 시료를 대략 17일째에 테스트하였다.
연구를 위해 14일에 걸쳐 6가지 조건을 나타내는 120개의 데이타 포인트가 수집되었다 (하기 참조).
Figure pct00047
플레이트 레이아웃 (표 25 참조)이 4명의 공여자 모두에 대해 동일하였다 (표 26 내지 표 29 참조).
Figure pct00048
가용성 클로토 ELISA 키트 (인간), IBL, 카탈로그번호 27998의 지침에 따라 ELISA 프로토콜을 수행 하였다. 미가공 데이타는 하기 표 26 내지 표 29에 나와 있다.
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
데이타 분석은 하기 표 30 내지 표 41에 나와 있다.
Figure pct00053
시료계산
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Figure pct00068
전술한 바에 비추어, 적어도 일 구현예는 클로토 검출 키트 및/또는 검정법을 포함한다. 본 발명의 키트 및/또는 분석은 임상 시료의 CLIA 실험실 테스트에 적합할 수 있다. 키트는 (1) 고유의 (예로, 내인성) 클로토, (2) 재조합 클로토 -Fc 융합, 및 (3) 재조합 6×His 클로토로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량분석하거나 이의 결핍을 진단하는데 사용하기 위해 (특이적으로) 구성될 수 있다. 클로토 단백질은 생물학적 시료에서 검출될 수 있다. 일부 구현예에서 시료는 (실질적으로) 정제되지 않을 수 있다. 예를 들어, 시료는 포유동물 (예로, 인간) 혈액 및/또는 혈장이거나, 이를 포함할 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 키트는 핑거 프릭에 적응되거나, 이를 위해 구성되거나, 이에 적합한 하나 이상의 란셋, 핑거 프릭으로부터 혈액을 수집하는데 적응되거나, 이를 위해 입체구성되거나, 이에 적합한 하나 이상의 시료 수집 용기, 일회용 (예로, 알코올) 와이퍼(들), 하나 이상의 접착 붕대, 호일 엔벨로프 또는 기타 생체포장과 같은 하나 이상의 방부제 요소 및 엔벨로프와 같은 운송 용기를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 포유동물 대상에서 클로토 결핍을 진단하는 방법을 포함할 수 있다. 방법은 (i) 선택적으로 모세관 혈액의 형태로, 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는 보존제 또는 항응고제와 혼합된 포유동물 혈청으로서, 일정량의 가용성 클로토 단백질을 갖는, 포유동물 혈청; 및 (ii) 선택적으로 모세관 혈액의 형태로, 일정량의 가용성 클로토 단백질을 갖는, 포유동물 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액 시료 혼합물을 획득하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 포유동물 혈청을 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는 보존제 또는 항응고제와 혼합되어 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 혼합물을 실온에서 적어도 24시간 이상 동안 보관하고, 보존제 또는 항응고제가 가용성 클로토 단백질을 실온에서 적어도 24시간 이상 동안 안정화시키는, 단계를 포함할 수 있다. 보관하는 단계 이후에, 방법은 혼합물에서 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한 혼합물에서 가용성 클로토 단백질의 정량화된 양이 미리 정해진 역치량 미만일 때 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 체액 시료 혼합물은 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 포유동물 대상으로부터의 모세관 혈액을 포함하거나, 체액 시료 혼합물을 획득하는 단계가 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 포유동물 대상으로부터의 모세관 혈액을 획득하는 것을 포함한다. 혼합물에서 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계는 가용성 클로토 단백질의 일부에 결합하는 제 1 항체를 사용하여 가용성 클로토 단백질을 검출하거나, 선택적으로 제 1 항체의 일부에 결합하는 검출 항체를 사용하여 가용성 클로토 단백질을 검출하거나, 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)를 수행하여 가용성 클로토 단백질을 검출하고 선택적으로 정량분석하는 것을 포함한다. 질량 분광분석법을 사용하여 단백질을 검출할 수도 있다.
일부 구현예에서, 진단 또는 정보 보고서가 준비될 수 있다. 보고서에는 하나 이상의 클로토 단백질에 대한 측정된 클로토 수준(들)의 표시 또는 디스플레이가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 보고서는 다양한 연령의 평균 또는 중간 클로토 수준 및 선택적으로 다양한 연령의 25번째 백분수위 및/또는 75번째 백분위수의 표시를 도시하는 연령 기반의 그래프 상에 겹치는 측정된 수준을 나타내는 비교 차트 또는 그래프를 디스플레이할 수 있다. 도 13은 예시 보고서 그래프 또는 차트를 도시한다. 따라서, 일부 구현예에서, 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계는 컴퓨터 시스템의 사용자 인터페이스 상에서 클로토 결핍 결정, 또는 진단을 디스플레이하고/거나 물리적 또는 전자적 형태로 상기 클로토 결핍 결정, 표시 또는 진단을 디스플레이하는 파일 또는 리포트를 생성하는 것을 포함하고, 클로토 결핍 결정, 표시 또는 진단은 선택적으로 클로토 단백질의 정량화된 양 및/또는 미리 정해진 역치량을 포함한다.
본원에 사용된 바, 용어 "진단" 또는 "진단하는" 및 유사한 용어는 미국 식품 의약품 관리청 (FDA), 기타 정부 또는 비정부 단체, 조직 또는 기관에 의해 요구되거나 규제되는 바, (모든 사례에서) 인증된, 규제-준수하는 의학적 진단을 전달하거나 요구하도록 의도되지 않는 점이 이해될 것이다. 오히려, "진단" 또는 "진단하는" 및 유사한 용어는 병태를 나타내고/거나 병태와 관련된 결정을 내리는데 도움이 될 수있는 정보를 제공하는 것에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 분석물을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량할 수 있다. 예시적으로, 추가적인 분석물은 신장 질환, 섬유성 질환 및/또는 노화와 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 분석물은 FGF, PTH, 산화되지 않은 PTH, 비타민 D, 비타민 E, KIM-1, NGAL, 인터루킨 및 다른 염증성 바이오마커, 테스토스테론, 에스트로겐 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
치료적 단백질
본 발명의 구현예는 하나 이상의 치료적 및/또는 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
단백질은 인간 알파 클로토 이소형 1 또는 2의 1 내지 1012번, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 아미노산 잔기의 전부 또는 하위집합을 포함할 수 있다. 단백질은 인간 알파 클로토 이소형 1 또는 2의 1 내지 1012번, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 아미노산 잔기의 전부 또는 하위집합에 적어도 및/또는 약 80% 아미노산 동일성을 갖을 수 있다. 예를 들어, 적어도 단백질의 일부가 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 등의 아미노산 서열 동일성을 갖을 수 있다. 본 출원에 기재된 단백질 서열의 다른 부분 또는 단편이 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어, 일부 구현예는 서열번호 1 내지 75 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나의 임의의 적합한 부분과 적어도 80% 등의 아미노산 서열 동일성을 갖는 적어도 일부를 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구현예는 인간 알파 클로토 이소형 1과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 예시적으로, 단백질은 인간 C370 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 C370S 변경을 포함하며, 이로써 S370을 포함할 수 있다. 단백질은 일부 구현예에서 인간 F352 또는 F352V 이외의 것을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 단백질은 C370S 변경을 포함하여, 이로써 F352V 변이체 없이, 바람직하게 F352를 갖는 S370을 포함할 수 있다. 단백질은 H193 또는 H193R 변이체 이외의 것을 포함할 수 있다. 인간 알파 클로토 이소형 1의 아미노산 잔기 (또는 위치) 193번, 352번 및/또는 370번에서의 기타 표준 아미노산 치환 모두가 고려되고, 명시적으로 본원에 개시된다.
일부 구현예는 인간 알파 클로토 이소형 1의 아미노산 잔기 45번에서의 변경을 포함할 수 있다. 위치 45에서, 잔기는 발린 (Val; V), 페닐알라닌 (Phe; F) 또는 또 다른 아미노산일 수 있다.
단백질은 또한 (이에 부착된) 하나 이상의 글리칸을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고유의 인간 알파 클로토 이소형 1은 아미노산 106번, 159번, 283번, 344번, 604번, 612번 및/또는 694번에 (글리코실화를 통해) 부착된 글리칸을 갖을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 단백질 또는 이의 클로토 단백질 서열은 (예로, 동일한 아미노산 위치(들)에서) 이에 (글리코실화를 통해) 부착된 하나 이상의 동일한 (또는 유사한) 글리칸을 갖을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단백질은 동일한 아미노산 위치(들)에서 이에 부착된 동일하거나 유사한 (고유의 유형) 글리칸 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질은 신호 펩티드 또는 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 고유의 클로토 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 단백질은 비-고유의 또는 합성 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호전달 서열은 N-말단 신호전달 서열 및/또는 클로토 단백질 서열의 상류 (또는 N- 말단)일 수　있다. 다른 구현예에서, 신호전달 서열은 C-말단이거나, 달리 배치될 수 있다. 바람직하게, 신호전달 서열은 고유의 인간 알파 클로토 이소형 1 신호전달 서열, 고유의 인간 알파 클로토 이소형 2 신호전달 서열, 서열번호 71 또는 서열번호 72와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성이거나, 이를 포함하거나, 갖을 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 아미노산 태그를 포함할 수 있다. 태그는 C-말단 태그 및/또는 클로토 단백질 서열의 하류 (또는 C-말단)일 수 있다. 다른 구현예에서, 태그는 N-말단이거나, 달리 배치될 수 있다. 태그는 Fc-펩티드 (또는 Fc-융합 태그, Fc 도메인 등)이거나, 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 태그는 IgG1-Fc 단백질 서열이거나, 이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 태그는 서열번호 74와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성이거나, 이를 포함하거나 갖을 수 있다.
태그는 또한 또는 대안적으로 트윈-스트렙 태그 또는 단백질 서열 (예로, 당 업계에 공지된 바)과 같은 트윈-스트렙 단백질 서열을 포함하는 펩티드이거나, 이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 신호전달 서열은 서열번호 75, 서열번호 102, 서열번호 103, 서열번호 104와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성이거나, 이를 포함하거나, 갖을 수 있다.
태그는 또한 또는 대안적으로 폴리시알산 (PSA)이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, PSA 태그는 컨쥬게이션된 (클로토) 단백질이 하나 이상의 프로테아제에 대한 저항성이 되도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 컨쥬게이트에서 시알산의 양 (예로, 비교적 소량)을 유지하면 프로테아제 공격 및 후속적인 표적화, 파괴 및 분자의 (예로, 간을 통한) 제거를 방지할 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 태그는 단백질로부터 절단될 수 있다. 다른 구현예에서, 태그는 단백질의 일부로서 보유될 수 있다. 일부 구현예에서, 태그는 단백질의 용해도 및/또는 (혈청) 반감기를 증진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 태그는 단백질 정제 동안 (예로, 정제 메커니즘의 일부로서) 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 클로토 단백질 서열과 아미노산 태그 사이에 배치된 링커 (예로, 아미노산 링커)를 포함할 수 있다. 예시적으로, 링커는 1 내지 40개의 아미노산, 바람직하게 5 내지 20개의 아미노산, 더욱 바람직하게 6 내지 12개의 아미노산, 가장 바람직하게 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 일부 구현예에서 GS 링커 (예로, (G4S)2 링커) 또는 다른 링커 (예로, GGENLYFQ 링커)이거나, 이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 링커는 서열번호 73 또는 서열번호 105와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성이거나, 이를 포함하거나, 갖을 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 단백질은 미국 식품 의약품 관리청 (FDA)에 의해 결정되고 시행되는 바와 같이 cGMP 규제를 준수할 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 건조 중량으로 적어도 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 클로토 단백질 시료는 백만 당 약 1 내지 100 분율 (ppm) 미만, 10억 당 약 100 내지 1000 분율 (ppb) 미만 또는 약 1 내지 100 ppb 미만, 또는 이들 사이에 분포된 임의의 값 또는 값의 범위의 CHO 숙주 세포 단백질 (HCP), 핵산 및/또는 다른 세포 성분을 포함할 수 있다.
클로토 단백질 변이체
다양한 길이의 치료적 S-클로토 단백질 (예로, S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등)은 다양한 유익한 효과 및/또는 고유의 클로토 단백질에서 나타나지 않은 결과를 달성하도록 다양한 방식으로 변형될 수　있다. 예시적으로, 퀵체인지 XL 부위-유도된 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)를 사용하여 다양한 S-클로토 구조물의 핵산 서열을 변경시킬 수 있다. 당 업계에 공지된 다른 돌연변이 유발 방법 및 키트도 역시 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 서브클로닝 방법 및 키트가 당 업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 아미노산 변경은 단백질 발현, 단백질 안정성, 단백질 용해도, 단백질 결합, 단백질 특이성, 단백질 활성, 단백질 기능, 면역원성, 독성 등에 영향을 미칠 수 있다 (예로, 개선, 증진, 감소 등).
본 발명의 적어도 일 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 C-말단 태그 및/또는 N-말단 태그로 변형된다. 이러한 태그는 (하나 이상의 치료적 또는 기타 환경에서) 단백질의 혈청 및/또는 가용성 반감기를 연장하도록 기능할 수 있다. 태그는 또한 단백질의 존재 또는 진단적 국소화, 단백질의 단리 또는 제거, 단백질의 전달 또는 운반, 단백질의 하나 이상의 표적에 대한 결합 (예로, 단백질, 핵산, 소기관, 세포성 구조 성분 등), 효소 처리 또는 절단 등에 대한 마커로서 유용할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 단백질의 C-말단은 TEV-트윈-스트렙 태그 또는 서열, 면역글로불린 (IgG1) Fc 도메인 태그 또는 서열, 또는 당 업계에 공지되고/거나 본원에 추가로 기술된 다른 태그 또는 서열로 태그화될 수 있다. 추가적인 설명은 문헌 "Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters", "What is the future of PEGylated therapies?" 및“Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics"에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각의 전문이 본원에 상세한 참고문헌으로 통합되어 있다. 특정 구현예에서, 링커 또는 링커 펩티드는 (고유의 또는 변이체) 클로토 단백질 서열 및 태그 사이에 삽입되고/거나 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 클로토 단백질은 대안의 (예로, 고유의, 비-고유의 및/또는 합성) 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 고유의 신호 펩티드 서열은 대안의 신호 펩티드 또는 신호전달 서열 (SS)로 대체되고/거나, 보충될 수　있다. 일부 구현예에서, 클로토 단백질의 고유의 메티오닌 잔기는 제거될 수 있고, SS의 N-말단에서의 메티오닌 잔기가 포함될 수 있다. 추가적인 설명은 논문 "Generation of high expressing CHO cell lines for the production of recombinant antibodies using optimized signal peptides and a novel ER stress based selection system"에서 찾아볼 수 있고, 이의 전문이 본원에 상세한 참고문헌으로 통합되어 있다. 특정 구현예에서, 링커 또는 링커 펩티드는 (고유의 또는 변이체) 클로토 단백질 서열 및 대안의 SS 사이에 삽입되고/거나 배치될 수 있다.
일부 구현예는 하나 이상의 아미노산 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명은 자연 발생, 합성 또는 달리 입체구성되는 여부와 상관없이, 임의의 개시된 클로토 단백질에서 임의의 하나 이상의 고유의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 변경을 고려하는 점이 이해될 것이다.
S-클로토 V45F 단백질 변이체
본 발명자는 인간 알파 클로토 (V45F)의 (고유의) 위치 45번에서 발린 대신에 페닐알라닌을 대체하는 것이 놀랍고 예기치 못한 이점을 갖는 것으로 밝혀왔다. 예를 들어, V45F 가용성 클로토 및 이의 단편 또는 융합 단백질은 고유의 야생형 V45 단백질보다 CHO 및 HEK-293 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 상업적으로, 더 높은 수준의 가용성 단백질 발현을 달성하는 것은 바람직할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일부 구현예는 V45F 치환을 갖는 클로토 단백질을 포함한다.
S-클로토 C370S 단백질 변이체
인간에서 클로토 유전자는 염색체 13q12에 맵핑된다. KL-VS로 알려진 변이체는 대략 15 내지 25%의 백인에서 존재한다. 변이체는 6개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)으로 구성되며, 이 중 2개는 아미노산 치환을 유발한다 (즉, F352V 및 C370S - 페닐알라닌 352번은 발린으로, 시스테인 370번은 세린으로 변경됨). 시험관내 형질감염 검정은 클로토의 분비된 수준이 V352 변이체에 대해 6배 감소된 반면, S370 형태에 대해 거의 3배 증가된 것을 나타내었다. 그러나, 인간 클로토 유전자에서 이들 2개의 변이체는 함께 분리되어 1.6배 범위의 클로토 분비를 증가시키는 KL-VS 일배체형을 형성한다. 예를 들어, 지리적으로 및/또는 인종적으로 구별되는 집단으로부터 채취한 300명 이상의 개인을 스크리닝할 때, V352 변이체 또는 S370 변이체 중 하나만 보유한 개인은 한 명도 발견되지 않은 것으로 보고되었다.
본 발명의 구현예는 C370S 동종변이체를 갖는 (즉, F352V 변이체가 없음 (또는 이의 결실을 갖음)) 재조합 S-클로토 단백질을 포함한다. C370S 변이체는 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생산되고/거나 발현될 수 있다. 예를 들어, C370S 변이체는 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, (IgG) Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 이에 따라, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 길이일 수 있다.
구현예는 S370 이종접합 또는 동종접합 변이체 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 C370S 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 S370 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. S370 클로토 단백질은 F352V/C370S 단백질 및/또는 야생형 F352/C370 단백질보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현 예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로 토 C370S 단백질을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대상은 예를 들어 KL-VS 변이체를 보유하거나 발현할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 C370S 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 이에 따라, 치료적 재조합 S-클로토 C370S 단백질을 투여받는 대상에서 S-클로토의 순환하는 농도는 F352V 변이체가 존재할 때 관찰되는 희석 효과에 영향을 받지 않을 수 있다.
핵산 및 발현 벡터
일부 구현예는 핵산 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구현예는 발현 벡터 또는 핵산 구조물을 포함할 수 있다. 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 재조합 인간 알파 가용성 클로토 단백질, 단백질 단편 또는 단백질 변이체를 인코딩할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 핵산은 클로토 단백질 서열, 선택적 (고유의 또는 비 고유의) 신호전달 서열 (예로, 클로토 단백질 서열의 N- 말단 또는 N- 말단), 선택적 링커 서열을 암호화할　수　있다 본원에 기재된 바와 같은 (예로, GS 링커) 및／또는 아미노산 태그 (예로, IgG1-Fc 또는 TEV-Twin-Strep).
일부 구현예에서, 핵산은 인간 알파 클로토 이소형 1 또는 2의 1 내지 1012번, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 아미노산 잔기의 전부 또는 하위집합을 포함하는 단백질을 발현할 수 있다. 단백질의 적어도 일부는 인간 알파 클로토 (이소형 1 또는 2)의 1 내지 1012번, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 아미노산 잔기의 전부 또는 하위집합에 적어도 또는 약 80% 아미노산 동일성을 갖을 수 있다. 예를 들어, 적어도 단백질의 일부는 서열번호 1 내지 서열번호 75 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나의 전부 또는 일부와 적어도 및/또는 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단백질은 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 전부 또는 일부와 적어도 및/또는 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖을 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 핵산의 일부는 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나와 적어도 및/또는 약 80% (예로, 적어도 약 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 100%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나와 적어도 및/또는 약 80% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖을 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 또한 당 업계에 공지된 바와 같이, 종결 코돈 (예로, TGA, TAG, TAA)을 포함할 수 있다.
세포주 및 제조 방법
본 발명의 일 구현예는 세포주를 포함할 수 있다. 세포주는 CHO 세포, HEK 세포, HL-60 세포 또는 당 업계에 공지된 다른 세포주와 같은 임의의 적합한 세포 유형을 포함할 수 있다. 예시적으로, 세포주는 CHO 세포 (예로, 복수의 CHO 세포)를 포함할 수 있다. 간략하게, CHO 세포에 대한 언급은 HEK 세포 (예로, HEK-293 세포), HL-60 세포 및/또는 임의의 다른 당 업계에 공지된 (단백질 발현) 세포(들) 또는 세포주(들)에 대한 상세한 언급을 고려한다. 일부 구현예에서, 세포는 (각각) 외인성 핵산 (하나 이상의 사본)을 포함할 수 있다. 핵산은 서열번호 1 내지 서열번호 75 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나, 바람직하게 서열번호 2 내지 서열번호 70 중 하나의 적어도 일부와 적어도 및/또는 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
핵산은 적어도 하나의 트랜스유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 핵산의 일부는 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 또는 이들 둘 이상의 조합 중 하나, 바람직하게 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나와 적어도 및/또는 약 80% 핵산 서열 동일성을 갖을 수 있다. 핵산은 플라스미드 또는 핵산의 다른 (구조적) 형태이거나, 이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 외인성 핵산은 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및/또는 글루타민 합성효소 (GS)와 같은 기능적 효소를 인코딩할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 세포는 CHO-S 세포 또는 CHO-M 세포와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR)-결핍 CHO 세포이거나, 이를 포함할 수 있다. 핵산은 프로모터 (예로, 당업자라면 이해할 바와 같이 약한 내지 강한 프로모터)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 80% 등의 핵산 서열 동일성을 갖는 트랜스유전자와 연관된 (강한) 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 트랜스유전자는 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
편의상, CHO 세포 및/또는 세포주는 본 발명 전반에 걸쳐 언급된다. 그러나, 다른 세포, 세포주 및/또는 숙주 세포 (CHO 세포 이외)도 본 발명의 범주 내에서 고려되는 점에 유의한다. 이에 따라, CHO 세포 및/또는 세포주에 대한 언급은 또한 다른 공지된 세포, 세포주 및/또는 숙주 세포 (예로, HEK-293 세포와 같은 HEK 세포 및 HL-60 세포 등)에 대한 언급 및/또는 사용을 고려한다.
형질감염
세포주를 제조하는 방법은 외인성 핵산을 세포 내로, 바람직하게 당 업계에 공지된 형질감염 또는 다른 기법을 통해 도입하는 것을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 무-혈청 성장 최적화된 세포주의 세포 현탁이 프로모터, 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 인간 알파 S-클로토 트랜스 유전자 및 선별가능한 (효소) 마커를 포함하는 핵산 (플라스미드)의 삽입을 위한 숙주 세포로서 사용되었다. 트랜스유전자는 각각 인간 알파 가용성 클로토의 아미노산 1 내지 981번, 29 내지 981번 또는 34 내지 981번을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 트랜스유전자는 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나 이상에 상응하는 서열 부분(들)을 갖는다 (또는 서열번호 76 내지 서열번호 106 또는 서열번호 121 내지 서열번호 124 중 하나와 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖음). DHFR- 결핍 CHO 세포주 (예컨대, CHO-S 세포주)의 경우, 선별가능한 (효소) 마커는 외인성 DHFR이었다. 다른 세포주의 경우, 선별가능한 (효소) 마커는 외인성 GS이었다.
성장, 선별 및/또는 유전자 증폭
일부 구현예는 고체 배지 및/또는 액체 배지 상에서 (예로, 현탁 세포 배양에서), 바람직하게 무-혈청 및/또는 동물 (또는 동물 유래) 단백질 (성분)이 없는 배지에서 세포 (예로, 형질감염된 세포)를 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 일정 기간 동안 고체 성장 배지 상에 도말될 수 있다. 세포는 또한 또는 대안적으로 현탁 배양 및/또는 액체 배지에서 성장될 수　있다. 액체 배지는 바람직하게 탄소 공급원, 질소 공급원 및 하나 이상의 비타민, 무기질, 염, 아미노산, 보조제 또는 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 하이폭산틴 및 티미딘 (HT), 글루타민, 등이 결여될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 특정 기간 (예로, 형질감염 후 48시간) 이후에, 세포는 수집 (예로, 탈착)되고, 선택적으로 원심분리되고/거나 (예로, 100 x g에서 5분), 예컨대 96-웰 부착성 배양 플레이트 (예로, 보충된 혈청, -HT 및/또는 -글루타민 배지를 포함함) 내로 (예로, 대략 2000개 세포/웰) 접종된다. 배지는 또한 특정 구현예에서 MTX 및/또는 MSX를 포함할 수 있다. 형질감염되지 않은 세포는 선별 이후 7 내지 14일 이내에 (예로, -HT 및/또는 -글루타민 배지에서 MTX 및/또는 MSX에 대한 노출 이후) 죽을 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 외인성 핵산의 (예로, 세포 당) 적어도 약 2 내지 10개의 사본, 적어도 약 10 내지 20개의 사본, 적어도 약 20 내지 30개의 사본 또는 적어도 약 30 내지 50개의 사본을 포함할 수 있다 (포함하도록 선별될 수 있음). 이에 따라, 방법은 외인성 핵산의 (예로, 세포 당) 적어도 약 2 내지 10개의 사본, 적어도 약 10 내지 20개의 사본, 적어도 약 20 내지 30개의 사본 또는 적어도 약 30 내지 50개의 사본을 포함하는 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, (연속적으로 증가하는 수준의) MTX 및/또는 MSX가 세포에 (예로, 약 1 nM 내지 1 μM, 약 10 내지 100 nM 등의 농도로) 투여될 수 있다.
외인성 DHFR로 형질감염된 DHFR-결핍 CHO 세포 (예컨대 CHO-S 세포주)에서 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 증폭은 성장 배지에서 메토트렉세이트 (MTX)의 수준을 연속적으로 증가시킴으로써 달성되었다. 플라스미드는 DHFR을 포함하기 때문에, 이것은 MTX (10 내지 100 nM)에 대한 노출 시 숙주 세포 내에서 S-클로토 유전자 (단편)의 증폭을 허용한다. GS 유전자 발현 시스템은 또한 외인성 GS로 형질감염된 세포를 증폭시키는데 (예로, MSX에 대한 노출 시) 사용되었다. 대안적으로, GS-/- 숙주 세포주가 또한 사용되어 MSX에 대한 필요성을 없앴다. 이들 단계는 S-클로토 유전자의 수많은 사본 (예로, 세포 당 유전자의 10 내지 30개의 사본)의 생성 및 생성된 결과로 유전자 변환 세포주에서 S-클로토 단백질의 높은 수준의 발현을 유도하였다.
일부 구현예에서, 현탁 배양에서 단백질이 세포로부터 액체 배지 내로 분비될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 세포 및/또는 세포주는 최대 농도 액체 배지 리터당 단백질 200 내지 500 mg, 액체 배지 리터당 단백질 500 내지 2000 mg, 액체 배지 리터 당 단백질 2000 내지 5000 mg 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위 (단백질을 농축시키지 않음)로 분비할 수 있다 (또는 분비하도록 선별될 수 있음). 적어도 일 구현예에서, 고생산성 세포주 (또는 현탁 배양물)은, 배지 (선별된 현탁 배양물 또는 선별된 세포주의 현탁 배양물)에서 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질의 농도가 단백질을 농축시키지 않고도 적어도 200 mg/L, 바람직하게 적어도 500 mg/L, 더욱 바람직하게 적어도 1000 mg/L, 더욱 더 바람직하게 적어도 2000 mg/L, 더욱 더 바람직하게 적어도 5000 mg/L이 되도록 선택될 수 있다.
결과로 생성된 S-클로토를 고생산하는, 트랜스유전자-포함 콜로니의 제한된 세포 희석에 의한 서브클로닝을 시행하여 500 내지 2000 mg/L 범위의 S-클로토를 세포 조건부 배지 내로 분비하는 S-클로토-분비 세포주를 추가로 생성하였다. 모든 세포 구조물은 제한효소 소화되고 서열이 입증되었다.
일부 구현예에서, 세포는 적어도 10 리터, 바람직하게 적어도 25 리터, 더욱 바람직하게 50 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 100 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 250 리터, 더욱 바람직하게 적어도 500 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 1,000 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 2,000 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 2,500 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 5,000 리터, 더욱 더 바람직하게 적어도 10,000 리터의 부피 또는 작업 부피를 갖는 생물반응기에서 성장될 수 있다.
세포주 유지
선택적으로 세포 서브클로닝으로 이어지는, 증폭된 고생산성 S-클로토 세포주 (예로, DHFR/MTX 또는 GS/MSX 시스템에 의해 생성됨)의 경우, 규모 확장 (scale-up) 동안 및 최종 생물반응기 전개까지 생산 세포주에 투여된 농축된 배지 공급물의 신중한 사용은 무-혈청 및 동물성 단백질 성분이 없는 기본 배지에서 시행되었다.
진탕 플라스크 또는 웨이브 백 시스템의 세포 현탁액에서 세포 접종물 증식에 의한 고생산자 세포주의 규모 확장이 시행되었고, 100 L 및 다음 500 L 용량의 생물반응기에서 생산된 세포의 연속적인 접종이 어어졌다. 진탕 플라스크, 웨이브 백 또는 생물반응기에서 성장 주기 전반에 걸쳐 세포 생존도는 85% 초과의 생존 세포로 유지되고, 다음으로 CHO S 세포 성장의 정체기 동안 생물반응기에서 80% 이상의 생존 세포 계수에서 최대 1 내지 3 g/L의 생산된 S-클로토의 동시적인 생산을 갖는다 ("고생산자"로 지칭됨).
단백질 생산
특정 구현예는 포유동물 (예로, CHO) 세포에서 치료량의 클로토 단백질의 생산을 위해 강한 프로모터 서열 및/또는 높은 사본수 플라스미드를 이용하는 재조합 DNA 전략을 채용할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 예를 들어, DHFR-결핍 CHO 세포에서 디하이드로폴 레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 증폭은 메토트렉세이트 (MTX)의 제공 및/또는 (연속적으로 증가하는 수준의) 사용을 포함할 수 있다. 유사하게, 외인성 글루타민 합성효소 (GS) 유전자-포함 세포는 메티오닌 설폭시민 (MSX)으로 처리될 수 있다.
클로토 단백질은 또한 (이에 부착된) 하나 이상의 글리칸을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고유의 인간 알파 클로토 이소형 1 (서열번호 1)은 아미노산 106번, 159번, 283번, 344번, 604번, 612번 및/또는 694번에 (글리코실화를 통해) 부착된 글리칸을 갖을 수 있다. 본 발명의 클로토 단백질은 (예로, 동일한 아미노산(들)에서) 이에 (글리코실화를 통해) 부착된 하나 이상의 동일한 (또는 유사한) 글리칸을 갖을 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 단백질은 미국 식품 의약품 관리청 (FDA)에 의해 결정되고 시행되는 바와 같이 cGMP 규제를 준수할 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 건조 중량으로 적어도 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 클로토 단백질 시료는 백만 당 약 1 내지 100 분율 (ppm) 미만, 10억 당 약 100 내지 1000 분율 (ppb) 미만 또는 약 1 내지 100 ppb 미만, 또는 이들 사이에 분포된 임의의 값 또는 값의 범위의 CHO 숙주 세포 단백질 (HCP), 핵산 및/또는 다른 세포 성분을 포함할 수 있다.
생산된 S-클로토 단백질에 존재하는 글리칸 구조는 인간 체액 (즉, 혈액, 혈청, 소변, 뇌척수액)으로부터 분리된 고유의 S-클로토 단백질 상의 구조와 비교하여 유사하거나 동일할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 고유의 유사 글리칸의 검증은 올바른 고유의 번역후 변형 (PTM)이 세포 생산된 S-클로토 단백질에서 생성되고 안정적으로 유지되는 것을 입증할 수 있다.
클로토 단백질의 용해도 및/또는 반감기 연장
인간 S-클로토 단백질의 반감기를 연장시키고 이의 용해도를 증가시키기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 또한, 이러한 결과를 달성하도록 이렇게 생산된 단백질 구조물의 정제 및 특성화도 본 발명의 주제이다. 클로토 유전자 또는 핵산 구조물의 서열 (서열번호 76 내지 96 참조)에 만들어진 핵산 변화 및/또는 클로토 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 1 내지 70 참조)에서의 변화 또는 화학적 변경 및/또는 클로토 단백질의 아미노산 서열에 대한 화학적 기, 펩티드 또는 단백질의 첨가 또는 차감에 관한 적절한 정보는 생물학적 기질 (예컨대 혈액, 뇌척수액, 소변 또는 다양한 인간 조직)에서 고유의 클로토 분자보다 생물학적 반감기 증가 또는 용해도 증가를 갖는 결과로 생성된 인간 클로토 변이체 단백질 (신규한 조성물)을 획득하기 위하여 본 발명에 교시된다. 이들 신규 조성물은 S-클로토 단백질의 변형에 대해 본원에 기재된 방법을 통해 제조될 수 있다.
예시적으로, 융합 단백질 구조물은 S-클로토 단백질을 항체 (IgG)의 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 알부민, 인간 트랜스페린 (TF)과 같은 트랜스페린, 및/또는 XTEN®과 같은 독점적인 재조합 폴리펩티드과 조합시킴으로써 생산될 수 있다. 신규한 단백질은 또한 S-클로토 단백질을 폴리시알산 (PSA) 또는 PEG화와 같은 번역후 변형으로 컨쥬게이션 (또는 변형)시킴으로써 생산될 수 있다. 더욱이, PEG화를 통해 신규한 S-클로토 단백질을 생산할 수 있다. 전술한 및 다른 (반감기 연장) 방법론은 S-클로토의 성능을 S-클로토 투여 간격의 증가; 우수한 환자 편의성 및 유사한 순응도의 제공; 투여 빈도 요건의 감소로 전체 약물의 사용 감소의 유도; 약물 비용의 절감; 모체 단백질과 동일한 투약 간격으로 약물 정량의 감소; 용량 제형물의 단순화 및 피하 제형물로의 가능성; 모체 단백질과 동일한 용량 및 투약 간격을 사용하여 더 높은 약물 수준을 제공하여 더 긴 약물 노출 및 잠재적으로 더 우수한 효능의 유도; 및 S-클로토의 면역원성의 감소 중 하나 이상에 의해 개선시킬 수 있다.
S-클로토의 Fc 도메인 융합 단백질 구조물의 생산
항체 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 폴리시알산 (PSA)은 인간 S-클로토 단백질의 반감기를 연장시키고, 이의 용해도를 증가시키는 효과에 대해 테스트되었다. Fc 융합은 펩티드, 단백질 또는 수용체 엑소도메인의 항체의 Fc 부분과의 융합을 포함한다. Fc 및 알부민 융합 둘 다는 펩티드 약물의 크기를 증가시킴으로써 연장된 반감기를 달성할뿐만 아니라, 연장된 단백질을 신생 Fc 수용체, FcRn에 결합시킴으로써 신체의 자연적 재생 메커니즘을 이용한다. 연장된 단백질을 FcRn 수용체에 결합시킨 후, 세포의 엔도좀에서 융합 단백질의 분해가 방지된다. Fc 또는 알부민의 첨가를 기초로 한 융합은 3 내지 16일 범위의 생물학적 반감기를 유도할 수 있으며, 이는 전형적인 PEG화된 또는 지질화된 펩티드에 대해 보고된 것보다 훨씬 더 길다. 더욱 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는 더욱 생체양호한 약물을 제조하도록 Fc 융합 단백질, 인간 혈청 알부민에 대한 융합, 카르복시-말단 펩티드에 대한 융합 및 다른 폴리펩티드 융합 접근법과 같은 단백질 융합 기법론의 사용을 설명하는 리뷰를 위해 Strohl WR 참조. Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters. Biodrugs. 2015; 29(4): 215-239, 이의 전문이 본원에 상세한 참조문헌으로 통합된다.
따라서 Fc 도메인은 모체 단백질 (S-클로토)에 첨가되어 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 친화도를 증가시켰다. FcRn은 혈관을 라이닝하는 내피 세포의 리소좀 내에 존재하며, 대부분의 단백질을 순환 시 수명을 단축시키는 분해로부터 항체를 구제하는 기능을 한다. FcRn과의 상호작용의 결과로서, 단백질은 수일부터 수주까지의 반감기를 갖으며, 새로 생성된 문제의 조성물을 갖지 않는 생물학적 제제보다 단백질 약물의 연장된 형태의 덜 빈번한 투여를 허용한다.
Fc의 이량체 특성 대비 HSA의 단량체 구조는 HSA와 대조적으로 이량체 또는 단량체로서 Fc 융합 펩티드를 제시할 수 있다. 펩티드 Fc 융합의 이량체 특성은 S-클로토에 대한 표적 수용체가 서로 충분히 밀접하게 이격되어 있거나, 자체가 특정한 인간 표적 기관에서 이량체인 경우, 총 결합력 효과를 생성할 수 있다. 이것은 표적에 의존하여 바람직하거나 그렇지 않을 수 있다. S-클로토 단백질의 항체 Fc와의 융합은 또한 본 발명에서 S-클로토의 용해도 및 안정성을 개선시키기도록 교시된다. 놀랍게도, Fc- 융합 클로토 단백질은 개선된 결합, 활성 및/또는 면역원성을 갖는 것으로 보인다. S-클로토에 Fc 도메인의 첨가는 또한 인간 대상에서 투여 시 융합 단백질이 덜 면역원성이 되도록 할 것이다.
S-클로토 단백질의 인간 혈청 알부민 (HSA)과의 컨쥬게이션
인간 IgG와 유사한 66.5 kDa 단백질 HSA는 19일 범위에서 긴 평균 반감기를 갖는다. ~ 50 mg/mL (~ 600 μM)의 농도에서 HSA는 인간 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고, 이는 혈장 pH 유지, 대사물 및 지방산 운반, 혈압 유지의 역할 등 여러 기능을 갖는다. 신장에 의한 단백질의 사구체 여과를 위한 크기의 상한에 있는 HSA는 또한 강하게 음이온성이어서 신장을 통한 여과를 더욱 더 지연하도록 도움을 준다. IgG와 마찬가지로, HSA는 또한 pH-의존적 방식으로 FcRn에 결합하지만, IgG 결합과는 상이한 위치 및 구별된 메커니즘을 통하며, IgG와 유사하게 재순환되어 반감기 연장을 유도한다. HSA는 또한 종양 및 염증 유발된 조직에 축적되는 경향이 있는데, 이는 알부민에 대한 융합 또는 결합이 잠재적으로 이들 부위에 단백질 또는 펩티드를 표적화하도록 도움을 줄 수 있음을 시사한다.
이들 분자의 혈청 반감기의 연장을 위해 본질적으로 짧은 HSA에 대한 반감기 특성을 갖는 펩티드 또는 단백질의 융합이 1990년대 초반 이래로 광범위하게 연구되어 왔다. 이후로, 수십 개의 상이한 펩타이드 및 작은 단백질이 혁신적이면서도 강력한 더욱 생체양호한 분자로서 HSA에 융합되었다. 시판 승인을 받은 최초의 HSA-펩티드 또는 단백질 융합 산물은 인간 게놈 과학으로 발견되어 글락소스미스클라인사에 의해 개발되어 시판되는 DPP-4 저항성 GLP-1-HSA 융합 단백질인 Tanzeum®(유럽 연합에서 Eperzan®으로 시판됨)이었다. Tanzeum®(알비글루티드)은 2014년 3월 및 4월에 각각 유럽 의약품 관청 (EMA) 및 FDA에 의해 승인을 받았다. 따라서 HSA는 약리학적으로 활성이 있는 GLP-1의 반감기를 고유의 GLP-1의 경우 1 내지 2분으로부터 4 내지 7일로 개선하였고, 이는 매주 1회 투약을 허용한다. 7개의 다른 알려진 HSA 융합 단백질 산물 후보 물질이 현재 개발 중이거나 최근에 개발 완료되었다. 또한, 노보자임사는 더욱 더 긴 반감기 성질을 소유할 수 있는 "차세대" HSA-단백질 융합물의 제작을 위해 개선된 FcRn 결합을 갖는 재조합 HSA의 변형된 버전을 개발하여 왔다. 이것은 FcRn에 대해 12배 이상의 큰 친화도를 갖는 것으로 밝혀진 HSA의 K573P 돌연변이체의 사용을 기초로 하고, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 둘 다에서 야생형 분자보다 HSA 상에 더 긴 반감기를 부여 하였다. 이러한 HSA의 더 긴 반감기 돌연변이체는 융합 단백질의 반감기를 개선시키는데 융합 단백질로서 더 유용할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본원에서 발명자들은 인간 혈액, 뇌척수액 및 기타 인간 생물학적 매트릭스에서 유의하게 연장된 반감기를 갖는 클로토 융합 분자(들)를 생산하도록 클로토 단백질의 야생형 HSA 또는 돌연변이 형태의 HSA와의 융합을, 우수한 환자 편의성 및 유사한 순응도, 투여 빈도 감소로 전체 약물의 사용 감소, 및/또는 제품 비용의 감소와 같은 전략적 치료 이점을 제공하기 위하여 개시한다. 또한, 모체 단백질과 동일한 투약 간격에서 더 적은 약물 정량은 용량 제형물을 단순화하고, 피하 제형물을 가능하게 하거나 S-클로토의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 놀랍게도, HAS-융합 클로토 단백질은 개선된 결합, 활성 및/또는 면역원성을 갖는 것으로 보인다.
S-클로토 단백질의 인간 트랜스페린 (TF)과의 컨쥬게이션
트랜스페린은 혈청에서 3 내지 4 mg/mL으로 발견되는 매우 풍부한 혈청 당단백질로, 철에 단단하지만 가역적으로 결합하고, 철을 조직으로 운반하는 기능을 한다. 트랜스페린은 679개의 아미노산 잔기를 갖고, 크기는 약 80kDa이며, 하나는 N-말단 도메인 및 나머지 하나는 C-말단 도메인에 있는 두 개의 고친화성 Fe3+-결합 부위를 보유한다. 인간 트랜스페린의 반감기는 7 내지 10일 또는 10 내지 12일인 것으로 보고되었다. 전체 트랜스페린 풀의 약 2 내지 8%를 차지하는 글리코실화되지 않은 형태의 인간 트랜스페린은 14 내지 17일의 약간 더 긴 반감기를 갖는다. 인간 혈청에서 트랜스페린의 연장된 지속성은 클라트린-의존성 트랜스페린 수용체-매개된 메카니즘에 기인하며, 이는 수용체-결합된 트랜스페린을 순환 내로 다시 재순환시킨다.
인간 트랜스페린에 대한 펩티드 및 단백질의 융합은 N- 및 C-말단에, 뿐만 아니라 트랜스페린의 두 개의 주요 로브를 함께 연결하는 중심에 위치한 힌지 영역에 만들어졌다. 트랜스페린의 N-말단은 자유롭고, 직접적으로 융합될 수 있다. C-말단은 더욱 묻히고, 인근의 디설파이드 결합에 의해 제한되므로, 단백질이 C-말단에 융합될 때 가용성 링커가 전형적으로 사용된다. 이러한 능력은 특이적 표적에 대해 펩티드 라이브러리를 만든 다음 해당 라이브러리로부터의 결합제를 당화되지 않은 트랜스페린 (N-말단, C-말단, 루프 또는 링커 영역) 내에 융합하여 반감기가 연장된 치료적 융합 단백질로 개발함으로써 확장되었다.
생명공학 회사 BioRexis Technologies, Inc.는 2002년에 트랜스페린 융합 단백질 플랫폼을 개발하기 위해 설립되었고, 이는 치료적 플랫폼으로서 "트랜스 바디" 플랫폼으로 명명되었다. 이들의 선도 분자 BRX-0585는 제 2형 당뇨병 (T2DM)의 치료를 위한 트랜스페린-GLP-1 융합 단백질이었다. 트랜스페린과의 GLP-1의 융합은 GLP-1의 반감기를 유의하게 증진하는 것으로 입증되었다. BioRexis사는 2007년 3월에 화이자사에게 인수되었다. 결정될 수 있는 한, BioRexis 유래 융합 단백질은 현재 클리닉에 없다. 클로토 단백질은 인간 트랜스페린에 융합되어 클로토 융합 분자를 생산할 수 있으며, 이는 생체내에서 인간 생물학적 매트릭스의 반감기 또는 안정성을 유의하게 연장시키도록 임상적으로 투여될 수 있다.
S-클로토 단백질의 아뮤닉스사로부터의 XTEN과의 컨쥬게이션
XTEN®은 치료적 페이로드의 생체내 반감기를 연장시키는 독점적인 재조합 폴리펩티드이다. XTEN은 자연 발생의 친수성 아미노산으로 구성되며 생분해가능하다. 단백질, 펩타이드 및 합성 화합물과 같은 약제는 화학적 컨쥬게이션 또는 유전자 융합을 통해 XTEN화될 수 있다. XTEN 단백질은 이차 및 삼차 구조가 결여되고, 이들의 용액 거동은 매우 큰 유체역학적 반경을 갖는 화학적으로 제조된 중합체와 유사하다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해, XTEN 단백질 중합체는 유사한 분자량의 전형적인 구형 단백질보다 훨씬 더 크게 보인다. XTEN의 대형화 효과는 부착된 분자의 신장 제거율을 크게 감소시키고, 이로써생체내 반감기를 크게 증가시킨다. 본 발명에서, 클로토 단백질에 부가된 XTEN 중합체의 길이는 약동학 및 부착된 클로토 단백질 페이로드의 생체 분포를 최적화하도록 맞추어질 것이다.
따라서 XTEN은 S-클로토 단백질(들)에 재조합으로 융합되어 분자생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 하나의 이점은 유전자 S-클로토-XTEN 융합 구조물로, 치료적 및 대형화 모이어티 둘 다를 포함하는 단일 분자의 발현, 정제 및 특성화의 편의성을 갖는 분자가 생산되는 것이다. 재조합 융합은 정확하게 정의된 위치에 단백질 당 다수의 XTEN 사슬을 부착할 수 있으며 치료 약물 제조사에 의해 성공적으로 사용되어 XTEN화된 성장호르몬 (베르사르티스사로부터의 소마바라탄) 및FVIII-XTEN (바이오겐사)에 의해 예시된 바와 같이 동급 최고의 약동학을 유도한다. 예를 들어, 다른 용량의 소마바라탄을 투여받은 어린이들에서 수행된 약동학적 연구는 XTEN화가 신장 제거율와 더불어 수용체-매개된 제거율 감소로 인해 동급 최고의 반감기를 유도하는 것을 보여주었다.
XTEN 단백질 중합체는 펩티드, 펩티드모방체 및 다른 합성 분자에 대한 화학적 컨쥬게이션을 위한 유리 중간체로서 생산될 수 있다. 반응기 (티올, 아민)은 시스테인 또는 리신 잔기의 XTEN-인코딩된 유전자 내로의 도입에 의해 정확하게 정의된 위치에 삽입된다. 아뮤닉스사는 파트너에게 제공될 수 있는 다양한 간격을 갖는 1 내지 9개의 티올기를 포함하는 XTEN을 개발하였다. 따라서, 본 발명에서 XTEN에서 아미노기 및 티올기에 대한 정규의 컨쥬게이션은 클로토-XTEN 분자의 생산을 용이하게 한다.
단백질의 정제
클로토 단백질은 세포 (예로, CHO 세포주)의 세포 현탁 배양물로부터 추출될 수 있다. 세포는 클로토 단백질을 생산하고 선택적으로 (예로, 액체 배지 내로) 분비할 수 있다. S-클로토의 사용된 배지 내로의 분비도 역시 관찰되었다.
본 발명의 재조합 단백질의 정제는 당 업계에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 추출법, 침전법, 크로마토그래피 및/또는 전기영동법을 포함하는 임의의 통상적인 절차에 의해 수행될 수 있다. 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 추가의 정제 절차는 표적 단백질(들)에 결합하는 단일클론 항체를 사용한 친화 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예는 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 IgG-태그화된 단백질, Fc-태그화된 단백질, His-태그화된 단백질, HSA-태그화된 단백질, GST-태그화된 단백질 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 IgG1과 같은 IgG의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합 단백질을 포함하는 미가공 조제물은 적합한 단일클론 항체가 고정화된 컬럼을 통과한다. 다른 태그의 경우, 해당하는 태그-결합 친화성 실체가 컬럼에 배치될 수 있다. 칼럼을 세척한 이후, pH 또는 이온 강도를 변화시킴으로써 단백질을 젤로부터 용리시킨다. 예를 들어, CHO-S 고생산자 세포주로부터의 사용된 배지는 접선 유동 여과를 통해 농축되고, S-클로토 단백질을 친화 크로마토그래피에 이어서 이온 교환 카트리지 또는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제 하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 또한 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 다양한 순서의 크로마토그래피 유형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 크로마토그래피 단계 또는 컬럼의 임의의 적합한 조합이 본원에서 고려된다.
대안의 프로토콜에서, 하나 이상의 친화성 정제-전 또는 -후 단계가 수행되었다. 이러한 단계는 예를 들어, (초)원심분리, 투석, 막 및/또는 접선 유동 여과, 이온 교환과 같은 크로마토그래피 분리, (수용성) 2개 상의 추출과 같은 액체-액체 추출 또는 다른 공지된 정제 단계를 포함할 수 있다.. 특정 구현예에서 하나 이상의 정제-후 프로세싱 단계가 수행되었다. 이러한 정제-후 프로세싱 단계는 예를 들어 일렬의 음이온/양이온 유동-통과 크로마토그래피 (결합 및 용리 크로마토그래피와 정반대되는 바), 막 여과 또는 당업자에게 알려진 다른 수단에 의한 바이러스 및/또는 박테리아 제거 (예로, 0.2 마이크론, 0.1 마이크론 등)를 포함할 수 있다.
특정 구현예는 재조합 클로토 단백질을 정제하는 방법을 포함한다. 방법은 현탁 세포 배양으로 재조합 클로토 단백질을 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 예로 현탁 배양 배지 및/또는 세포를 수집함으로써 클로토 단백질을 수확하는 것을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 방법은 제 1 정제 단계를 포함할 수 있다. "제 1" 정제 단계는 가장 먼저 또는 임의의 다른 정제 단계(들) 이전에 또는 임의의 다른 정제 단계(들) 이후에 일어날 필요가 없는 점이 이해될 것이다. 제 1 정제 단계는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC), 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다. 제 1 정제 단계는 친화 크로마토그래피를 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다. 친화　크로마토그래피는 클로토 단백질의 태그 또는 다른 단백질 융합 실체를 기초로 할 수 있다. 예를 들어, His-태그화된 단백질은 His-태그 친화　크로마토그래피 (예로, HisTrap 또는 니켈 컬럼 크로마토그래피)에 의해 정제될 수 있다. 유사하게, GST-컨쥬게이션된 단백질은 GST-친화　크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 특이적 태그(들)에 의존하여, 상응하는 태그-결합 친화성 실체가 단백질 정제에 사용하기 위해 크로마토그래피 칼럼에 배치될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 제 1 정제 단계는 예를 들어 Ig-태그화된 또는 Fc-융합 클로토 단백질의 정제를 위해 프로테인 A 또는 프로테인 A-컨쥬게이션된 입자 또는 비드 (예로, 프로테인 A 세파로스 4 고속 유동 칼럼 (0.75 mL) (0.5 cm x 3 cm)을 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다. 컬럼은 적절한 용액으로 평형화될 수 있다. 용액은 적합한 농도 (예로, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)로의 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 양의 단백질-포함 시료 (예로, 선택적으로 1.5 M 트리스-HCl, pH 8.0을 사용하여 pH 8.0으로 조정된 현탁 세포 배양 상청액)를 컬럼에 로딩하고 (예로, 0.75 mL/분의 유속으로), 선택적으로 적합한 세척 완충액 (예로, 10 mM 트리스/아르기닌-HCl, pH 8.0)으로 세척하고, 적합한 용리 완충액 (예로, 4 M MgCl2, pH 3 (즉, 낮은 pH, 고염))으로 컬럼으로부터 적합한 유속 (예로, 약 0.50 내지 0.25 mL/분 또는 등가물)에서 용리시키고/거나 농축된 시료를 생산할 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 용리 완충액은 약 pH 3을 갖을 수 있다. 일부 구현예에서, 용리 완충액는 약 pH 2 내지 약 pH 6, 바람직하게 약 pH 2 내지 약 pH 5, 더욱 바람직하게 약 pH 2 내지 약 pH 4, 더욱 더 바람직하게 약 pH 2.5 내지 약 pH 3.5의 pH를 갖을 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 용리 완충액은 적어도 하나의 염을 포함할 수 있다. 예시적으로, 염은 바람직하게 약 4 M의 농도에서의 MgCl2이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1 M 내지 약 6 M, 바람직하게 약 2 M 내지 약 5 M, 더욱 바람직하게 약 3 M 내지 약 5 M, 더욱 더 바람직하게 약 3.5 M 내지 약 4.5 M의 염 농도를 갖을 수 있다.
추가적인 정제 단계(들)는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC), 이온 교환 크로마토 그래피, 친화　크로마토그래피, 크기 배제 (또는 젤 여과) 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 방법은 제 2 정제 단계를 포함할 수 있다. "제 2" 정제 단계는 두 번째로 또는 임의의 다른 정제 단계(들) 전에 또는 이전에 일어날 필요가 없는 점이 이해될 것이다. 제 2 정제 단계는 단백질-포함 시료(들)을 분별하거나, 분해하거나, 정화하거나, 정제하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 (및 적합한 이동상 완충액)를 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 제 2 정제 단계에서, 단백질-포함 용리 시료(들) (제 1 정제 단계로부터의)을 선택적으로 완충액 교환하고, 적합한 이동상 완충액에서 크기 배제 크로마토그래피 (예로, 슈퍼덱스 200 (1cm X 30 cm) 컬럼)를 사용하여 정제할 수 있다. 적어도 일 구현예, 이동상 완충액은 적합한 완충제 (예로, 100 mM 트리스-HCl) 및 하나 이상의 조건부 환원제 (예로, 5 mM L-메티오닌 및/또는 0.6% 나트륨 티오글리콜레이트)를 적합한 pH (예로, 약 pH 8)에서 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 완충제는 포스페이트-포함 완충액 이외의 것일 수 있다 (예로, 트리스, 시트레이트 등). 적어도 일 구현예에서, 환원제는 바람직하게 효과적인 환원 농도(들)에서 L-메티오닌 및/또는 소듐 티오글리콜레이트이거나, 이를 포함할 수 있다. 대안의 환원제는 아세틸시스테인 (즉, N-아세틸-L-시스테인, N-아세틸-D-시스테인 및 라세미 N-아세틸 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 및 N-아세틸-D-시스테인의 (라세미) 혼합물을 포함하는 N-아세틸시스테인 (NAC)), 아스코르브산, 디티오나이트, 에리티오르베이트, 시스테인, 글루타치온, 디티오트레이톨, 2-머캅토에탄올, 디에리트리톨, 레진-지지된 티올, 레진-지지원 포스파인, 비타민 E 및/또는 트로록스 또는 이들의 염, 소듐 시트레이트, 포타슘 시트레이트, 포타슘 요오드, 염화암모늄, 구아이페네신 (또는 구아이페네신), 톨루 발삼, 바사카, 암브록솔, 카보시스테인, 에르도스타인, 메시스테인 및 도르나제 알파 등을 포함할 수 있다.
적어도 일 구현예, 이동상 완충액은 약 pH 8을 갖을 수 있다. 일부 구현예에서, 용리 완충액는 약 pH 6 내지 약 pH 10, 바람직하게 약 pH 7 내지 약 pH 9, 더욱 바람직하게 약 pH 7.2 내지 약 pH 8.8, 더욱 더 바람직하게 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 갖을 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 단량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 다량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용리된 단백질은 이량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용리된 단백질은 사량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용리된 단백질은 육량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용리된 단백질은 팔량체성 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 단량체 및 다량체성 둘 다의 클로토 단백질이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 단량체 또는 다량체성 클로토 단백질 둘 중 하나의 단일 종이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 단량체 또는 다량체성 클로토 단백질 둘 중 하나의 단일 종이 약 80% 이상이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 용리된 단백질은 단량체 또는 다량체성 클로토 단백질 둘 중 하나의 단일 종이 약 82%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상이거나, 이를 포함할 수 있다.
추가적인 정제 단계(들)는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC), 이온 교환 크로마토 그래피, 친화　크로마토그래피, 크기 배제 (또는 젤 여과) 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피를 포함하거나, 관여하거나, 사용할 수 있다.
클로토 단백질의 분석
단백질 순도는 SDS-PAGE 또는 당 업계에 공지된 다른 검정법 또는 수단에 의해 입증될 수 있다. 예를 들어, 적어도 일 구현예에서, 클로토 단백질 시료 (50 μg)를 사전캐스트 SDS-PAGE 젤 (4 내지 15%, 10개 웰; 카탈로그 번호 456-1083; BioRad) 상에서 분별하고 쿠마시블루 염색으로 염색하였다. 모든 시료는 시료 간 오염을 피하도록 젤 사이의 또는 별도의 젤 상에 빈 레인을 사용하여 전개되었다. 98% 초과의 S-클로토는 쿠마시블루 염색 및 밀도 측정 추적에 의해 또는 은염색 촬영에 의해 또는 HPLC 또는 RP-HPLC에 의해 결정된 바, CHO S 조건부 배지로부터 단리된 것으로 관찰되었다. 서열 정보를 획득하기 위해, 단백질은 (환원 및 S- 카르복시메틸화 이후에) 시아노겐 브롬화물, 트립신 및/또는 프로테아제 K로 절단될 수 있고, 펩티드가 단백질 화학의 공지된 방법에 따라 HPLC에 의해 분리될 수 있다. 다음으로, 이같이 제조된 시료를 유출부와 연결된 온라인 자동 HPLC PTH 아미노산 분석기 (Applied Biosystems사 모델 120, ABI 상기참조)를 갖는 자동 가스상 마이크로시퀀싱 장치 (Applied Biosystems 모델 470A, ABI, Foster City, Calif., USA)에서 서열 결정되었다.
단백질은 또한 질량 분광분석법을 통해 분석되었다. 질량 분광분석법을 위한 시료 준비와 관련하여, 정확한 S-클로토 단백질로 분석을 제한하기 위하여, 75 내지 150 kDa의 젤 밴드만을 분석을 위해 절단하였다. 젤 분획을 멸균 블레이드로 마쇄하고, 젤 내 소화시켰다. 젤 분획을 80 μL의 50% 아세토니트릴 (ACN)/50 mM 탄산수소 암모늄으로 3회 세척하여 탈색시키고 100% ACN으로 세척하였다. 표적 α-클로토 펩티드로부터의 시스테인 잔기가 없는 경우 알킬화 단계를 생략하였다. 트립신 소화는 50 mM 탄산수소 암모늄 (0.005 μg/μL)에서 60 μL 트립신 (변형된 시퀀싱 등급, 카탈로그 번호 V511A; Promega)으로 37℃에서 밤새 수행되었다. 이 과정은 5 μL (S-클로토의 경우 1 μL)이 나노 LC (Dionex Ultimate 3000 UHPLC)에 연결된 오비트랩 나노-ESI Q-이그잭티브 질량 분광분석기 (써모 사이언티픽사)에서 액체 크로마토그래피-전자스프레이 이온화 일렬 질량 분광분석법 (MS／MS) 및 PRM 분석에 착수되는 25 μL를 수득하였다. MS/MS 분석은 본 발명의 구현예에 의해 생산된 인간 재조합 알파 S-클로토가 인간 혈액, 혈청, 소변 또는 뇌척수액에서 발견된 것과 실질적으로 유사한 점 (예로, 상응하는 아미노산 서열에서 동일함)을 검증하였다.
상기 정제 방법을 사용하여, 오염된 CHO 숙주 세포 단백질 (HCP)의 수준이 정제된 S-클로토 단백질에서 허용가능한 것으로 결정되었다. 최종 S-클로토 산물에서 HCP가 < 1 내지 100 ppm으로 제거되었다. 사용된 CHO S 생산 세포주 (세포 및/또는 액체 배지)로부터 적어도 90%, 최대 98% 순도의 S-클로토 단백질 산물을 분리하였다. 구체적으로, 인간 대상에서 임상 투여에 적합한 분석 프로파일을 갖는 cGMP 등급의 인간 알파 S-클로토가 생산되고 정제되었다. 예를 들어, 인간 재조합 알파 S-클로토의 분석 프로파일은 ProteomeXchange 데이타베이스에서 참조 번호 PXD002775로 지정되며, 이는 http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD002775에서 찾아볼 수 있다. NIH 전체 S-클로토 단백질 데이타세트는 http://www[dot]ncbi[dot]nlm[dot]nih[dot]gov/ protein/Q9UEF7에 있다.
임상 투여에 적합하고 본 발명의 구현예에서 획득된 S-클로토에 대한 분석 프로파일은 S-클로토 μg 당 0.1 ng (1 EU/μg) 미만의 내독소 수준을 포함하였다. 또한, 정제된 인간 재조합 S-클로토는 또한 SDS PAGE에 의해 98% 이상의 순도를 갖는 것으로 나타났다.
CHO S 세포-생산된 S-클로토 상에 존재하는 글리칸 구조는 인간 체액 (즉, 혈액, 혈청, 소변 및 뇌척수액)로부터 분리된 고유의 S-클로토의 구조와 비교하여 동일하였다. 이것은 동일한 고유의 번역-후 변형 (PTM)이 생성되고 세포 생산된 S-클로토 단백질에서 안정적으로 유지되는 것을 입증하였다. 이에 따라, 본원에 기재된 생산 및 정제 방법을 사용하여, 본 발명자들은 인간 대상에서 임상 투여에 적합한 분석 프로파일을 갖는 cGMP 등급의 인간 S-클로토를 생산하는데 성공하였다.
치료적 조성물
본 발명의 일부 구현예는 약제학적 조성물, 예컨대 치료적 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 추가적인 성분으로 구성된 (약제학적으로 허용가능한) 운반체, 담체 또는 부형제와 함께 재조합 가용성 알파 클로토 단백질 혼합물의 치료적 유효량을 포함할 수 있다. 클로토 단백질은 예로 약 0.001 내지 1000 mg, 약 0.01 내지 100 mg, 약 0.1 내지 10 mg, 약 1 내지 5 mg 또는 이들 사이의 임의의 양 또는 양의 범위와 같은 임의의 적합한 양으로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학 또는 치료적 유효량의 클로토 단백질을 (예로, 조성물이 투여되는 대상에서 혈청 클로토 수준을 미리 정해된 수준으로 상승시키도록) 포함할 수 있다.
성분은 하나 이상의 응집 저해제, 완충액, 장력 개질제 및 추가적인 부형제를 포함할 수 있다. 담체에서의 일차 용매는 특성이 수용성 또는 비-수용성일 수 있다. 본 발명의 정제된 클로토 단백질을 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합함으로써 조성물을 제조할 수 있다.
당업자라면 조성물에 포함되는 다양한 성분의 조합은 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있고, 즉 완충액이 먼저, 중간에 또는 마지막에 첨가될 수 있고, 장력 개질제도 역시 먼저, 중간에 또는 마지막에 추가될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자라면 또한, 이들 화학물질 중 일부는 특정 조합에서 양립가능하지 않을 수 있고, 이에 따라 유사한 성질을 갖지만 관련 혼합물에서 호환가능한 상이한 화학 물질로 용이하게 대체될 수 있음을 이해해야 한다.
응집 저해제는 폴리펩티드가 부적절하거나 원치않는 삼차 또는 사차 복합체에 결합하는 경향을 감소시킨다. 아미노산 L-아르기닌 및/또는 L-시스테인은 제형물에서 Fc 도메인 포함 폴리펩티드의 응집을 장기간, 예로 2년 이상 동안 감소시키도록 작용할 수 있다. 제형물에서 응집 저해제의 농도는 바람직하게 약 1 mM 내지 1 M, 더욱 바람직하게 약 10 mM 내지 약 200 mM, 더욱 바람직하게 약 10 mM 내지 약 100 mM, 더욱 더 바람직하게 약 15 mM 내지 약 75 mM, 또한 더욱 바람직하게 약 25 mM이다. 이러한 화합물은 시판하는 공급업체로부터 입수가능하다.
본 발명의 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 원하는 범위에서 pH를 유지한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 다양한 완충액은 히스티딘, 포타슘 포스페이트, 알칼리 염, 소듐 또는 포타슘 포스페이트 또는 이들의 수소 이수소염, 소듐 시트레이트 또는 포타슘 시트레이트/시트르산, 소듐 아세테이트/아세트산 또는 말레산, 암모늄 아세테이트, 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄 (트리스), 다양한 형태의 아세테이트 및 디에탄올아민, 및 당 업계에 공지된 임의의 다른 약제학적으로 허용가능한 pH 완충제를 포함하여 용액의 pH를 원하는 범위로 유지한다. 이들 완충제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
조성물에 유용한 완충제의 양은 사용된 특정한 완충제 및 용액의 pH에 크게 좌우된다. 예를 들어, 아세테이트는 pH 6보다 pH 5에서 더욱 효율적인 완충제이므로 pH 6보다 pH 5에서 용액에 더 적은 아세테이트가 사용될 수 있다. 바람직한 제형물의 바람직한 pH는 4.0 내지 5.0의 범위일 것이고, 원하는 pH를 획득하기 위하여 염산, 시트르산, 수산화나트륨 또는 이의 염과 같은 pH 조절제가 또한 포함될 수 있다.
일 바람직한 완충액은 완충 용량이 pH 6.2 또는 이 근접하기 때문에 소듐 포스페이트이다. 그러나, 임의의 바람직한 pH 완충화를 달성하도록 다른 완충액이 선택될 수 있음이 이해될 것이다. 제형물에서 완충액의 농도는 바람직하게 약 1 mM 내지 약 1 M, 더욱 바람직하게 약 10 mM 내지 약 200 mM이다. 완충액은 당 업계에 공지되어 있고, 공지된 방법에 의해 제조되며 시판하는 공급업체로부터 입수 가능하다.
약제학적 조성물의 pH가 생리학적 수준 또는 이의 근처에 설정될 때, 투여 시 환자의 안락함이 최대화된다. 구체적으로, pH는 pH 약 5.8 내지 8.4의 범위 이내인 것이 바람직하고, 약 6.2 내지 7.4가 바람직하지만, 특정한 제형물에서 폴리펩티드의 안정성 및 용해도를 최대화하기 위해 필요에 따라 pH를 조정할 수 있고, 이와 같이생리학적 범위를 벗어난 pH가 여전히 환자에게 인내가능지만, 본 발명의 범위 이내이다.
본 발명의 제형물은 하나 이상의 장력 개질제를 (예로, 용액을 주사를 위해 환자의 혈액과 등장성이 되도록) 추가로 포함할 수 있다. 장력 개질제는 용액의 삼투압에 기여하는 분자인 것으로 이해된다. 약제학적 조성물의 삼투압은 바람직하게 활성 성분의 안정성을 최대화하고 또한 투여 시 환자에게 불편함을 최소화하기 위해 조절된다. 여기서 혈청은 킬로그램 당 대략 300 +/- 50 밀리몰이다. 약제학적 조성물은 혈청과 등장성, 즉 동일하거나 유사한 삼투압을 갖는 것이 바람직하고, 이는 등장성 개질제를 첨가함으로써 달성되며, 따라서 삼투압은 약 180 내지 약 420 밀리몰일 수 있는 것으로 고려되지만, 삼투압이 특정한 조건이 요구하는 바 높거나 낮을 수 있음을 이해해야 한다.
전형적인 장력 개질제는 당 업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 염, 아미노산 또는 다당류를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 적합한 아미노산의 비제한적인 예는 글리신을 포함한다. 적합한 다당류의 비제한적인 예는 슈크로스, 만니톨 및 소르비톨을 포함한다. 하나 이상의 장력 개질제가 즉시 사용될 수 있고, 예를 들어 소르비톨 및 글리신이 조합되어 제형물의 장력을 변형시킬 수 있는 것으로 이해된다.
삼투압을 변형시키기에 적합한 장력 개질제의 추가적인 예는 아미노산 (예로, 아르기닌, 시스테인, 히스티딘 및 글리신), 염 (예로, 염화나트륨, 염화칼륨 및 소듐 시트레이트) 및/또는 당류 (예로, 슈크로스, 포도당 및 만니톨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제형물에서 장력 개질제의 농도는 바람직하게 약 1 mM 내지 1 M, 더욱 바람직하게 약 10 mM 내지 약 200 mM이다. 장력 개질제는 당 업계에 공지되어 있고, 공지된 방법에 의해 제조되며 시판하는 공급업체로부터 입수 가능하다.
용액 중에 (건조 또는 냉동 형태로도) 폴리펩티드를 안정화시키는, 화학 첨가제, 보조 용질 또는 보조 용매로도 말하는 부형제가 또한 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 부형제는 본원에서 원하는 효과, 예로 안정화, 등장성을 제공하도록 약제학적조성물에 첨가된 비-치료제로서 정의된다. 바람직한 부형제의 공통적인 속성은 수용성, 비-독성, 비-반응성, 신체로부터의 신속한 제거 및 면역 원성의 부재이다. 또한, 부형제는 단백질의 고유의 입체형태를 안정화시킬 수 있어 가공, 보관 및 환자에게 투여하는 동안 약물의 효능 및 안전성을 유지하여야 한다. 예로는 슈크로스, 락토스, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 트레할로스, 글루코스와 같은 당/폴리올; 혈청 알부민 (소혈청 알부민 (BSA), 인간 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 하이드록시에틸셀룰로우스 (HEC)와 같은 중합체; 다수산기 알콜, (예로, PEG, 에틸렌글리콜 및 글리세롤) 디메틸설폭시드 (DMSO) 및 디메틸포름아미드 (DMF)와 같은 비-수용성 용매; 프롤린, L-세린, 소듐 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신 염산, 사르코신 및 감마-아미노부티르산과 같은 아미노산; 트윈-80™(폴리소르베이트 80), 트윈-20™(폴리소르베이트 20), SDS, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체와 같은 표면활성제; 및 포타슘 포스페이트, 소듐 아세테이트, 암모늄 설페이트, 마그네슘 설페이트, 소듐 설페이트, 트리메틸아민 N-옥사이드, 베타인, 금속 이온 (예로, 아연, 구리, 칼슘, 망간 및 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트와 같은 기타 부형제 또는 상기의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 주의할 점으로서, 독성이 높은 흰색 헬보아 (Veratrum album)는 젠티안으로 오인될 수 있음을 유의한다.
본 발명의 제형물에서 하나 이상의 부형제의 농도는 바람직하게 약 0.001 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게 약 0.1 내지 2 중량%이다. 부형제는 당 업계에 공지되어 있고, 공지된 방법에 의해 제조되며 시판하는 공급업체로부터 입수 가능하다.
일 예시적인 구현예에서, 본 발명의 제형물은 HEPES, MES 또는 트리스-HCl으로 pH 7.3 내지 7.4로 완충된 약 150 mM NaCl 및 선택적으로 본원에 기술된 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다.
일 예시적인 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 10 mM 내지 약 100 mM L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM 소듐 포스페이트, 약 0.75% 내지 약 1.25%의 슈크로스 및/또는 약 50 mM 내지 약 150 mM NaCl에서 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0로 일정량 (치료적 유효량)의 클로토 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, L-아르기닌은 제형물에서 L-시스테인으로 (약 1 내지 약 500 마이크로몰에서) 대체될 수 있다. 또한 또 다른 구현예에서, pH는 약 pH 7.0일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 25mM L-아르기닌, 약 25 mM 소듐 포스페이트, 약 98 mM 염화나트륨 및/또는 약 1% 슈크로스에서 약 pH 6.2로 일정량 (치료적 유효량)의 클로토 단백질을 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 10 mM 내지 약 100 mM L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM 소듐 포스페이트, 약 0.75% 내지 약 1.25%의 슈크로스, 약 50 mM 내지 약 150 mM NaCl에서 약 pH 6 내지 약 pH 7로 일정량 (치료적 유효량)의 클로토 단백질을 포함할 수 있다. 상세한 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 25 mM 소듐 포스페이트, 약 98 mM 염화나트륨 및/또는 약 1% 슈크로스에서 약 pH 6.2로 일정량 (치료적 유효량)의 클로토 단백질을 포함한다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 10 mM 내지 약 100 mM L-아르기닌, 약 10 mM 내지 약 50 mM 소듐 포스페이트, 약 0 내지 약 5% 만니톨 및/또는 0 내지 0.2% 트윈-20TM (폴리소르베이트 20)에서 약 pH 6 내지 약 pH 7로 유효량의 Fc 도메인 포함 클로토 융합 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형물은 약 25 mM L-아르기닌, 약 25 mM 소듐 포스페이트, 약 4% 만니톨, 0.02% 트윈-20TM (폴리소르베이트 20) 및/또는 약 pH 6.0에서 유효량의 클로토 단백질을 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물을 치료하는 방법으로서, 포유동물은 조성물에서 Fc 도메인 포함 폴리펩티드로 유리하게 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는, 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인 포함 폴리펩티드는 조성물로 치료되는 종과 동일한 종의 포유동물로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 포유동물은 치료가 필요한 인간 환자이다. 조성물의 Fc 도메인 포함 폴리펩티드가 클로토-Fc일 때, 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 예는 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 베게너 질환 (과립종증), 크론병 (또는 염증성 장 질환), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 건선 및 아토피성 피부염, 또는 하나 이상의 클로토 유전자에서 돌연변이를 갖는 유전병을 갖는 사람을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 클로토-Fc로 치료될 수 있는 추가적인 질환 또는 장애는 국제특허출원 WO 00/62790, WO 01/62272 및 미국 특허출원 2001/0021380에 기술된 것들을 포함하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고문헌으로 통합된다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물에서 Fc 도메인 포함 폴리펩티드의 안정성의 가속화된 안정성을 테스트하는 방법으로서, 본 발명에 따라 제형화된 폴리펩디드의 활성을 보관 전에 즉 0시간째 테스트하는 단계, 조성물을 37℃에서 1개월 동안 보관하는 단계 및 폴리펩티드의 안정성을 0시간부터 1개월 시점까지 비교하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 이러한 정보는 초기에는 안정성이 우수하지만 장기간 동안 잘 보관되지 않는 배치 또는 로트를 조기에 제거하는 데 도움이 된다.
더욱이, 약제학적 조성물은 활성 성분, 예로 Fc 도메인 포함 폴리펩티드가 액체 또는 냉동 상태로 보관하는 과정에 걸쳐 안정하도록 장기 보관을 제공한다. 본원에 사용된 바, 어구 "장기" 보관은 약제학적 조성물이 3개월 이상, 6개월 이상, 1년 이상, 바람직하게 2년 이상 동안 보관될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 장기 보관은 또한 약제학적 조성물이 2 내지 8℃에서 액체로서 보관되거나, 예로 -20℃ 이하에서 (예로, -20℃ 또는 -80℃)에서 냉동됨을 의미하는 것으로 이해된다. 또한 조성물을 한 번 이상 동결 및 해동할 수 있는 것으로 고려된다. 장기 보관과 관련하여 용어 "안정한"은 약제학적 조성물의 활성 폴리펩티드가 보관 시작 시 조성물의 활성과 비교하여 이의 활성을 20% 초과, 더욱 바람직하게 15%, 더욱 바람직하게 10%, 더욱 더 바람직하게 5% 초과하여 상실하지 않음을 의미하는 것으로 이해된다.
하나 이상의 항산화제가 본 발명의 제형물에 포함될 수 있다. 제형물의 제조에 사용이 고려되는 항산화제는 글리신 및 리신과 같은 아미노산, EDTA 및 DTPA와 같은 킬레이팅제, 그리고 소르비톨 및 만니톨과 같은 자유 라디칼 제거제를 포함한다.
(경구 또는 비경구) 변형된 방출 제형물 (예로, 코팅, 캡슐화, 서방형, 조절된 방출, 연장된 방출, 지연된 방출, 지속된 방출, 시간 방출, 데포트 등), 흡입성 미스트, 경구-활성 제형물, 좌제 및 임플란트 또는 이식가능한 의료 장치와 같은 다른 효과적인 투여 형태가 또한 본원에 고려된다. 이와 같이, 제형물은 또한 대형 침식 중합체 (예로, 폴리(락트산-글리콜산) (PLGA) 공중합체, PLGA 중합체 배합물, PEG의 블록 공중합체, 락트산 및 글리콜산, 폴리(시아노아크릴레이트)); 표면 침식 중합체 (예로, 폴리(무수물) 및 폴리(정규 에스테르)); 하이드로겔 에스테르 (예로, 플루로닉 폴리올, 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레 무수물-알킬비닐에테르 공중합체, 셀룰로우스, 하이알루론산 유도체, 알기네이트, 콜라겐, 젤라틴, 알부민, 전분 및 덱스트란) 및 이의 조성물 시스템과 같은 중합체 화합물의 미립자 조제물; 또는 리포좀 또는 미세구의 조제물도 관여할 수 있다. 이러한 제형물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 원하는 단백질을 위한 최적의 약제학적 제형물은 투여 경로 및 원하는 용량에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 약제학적 제형물은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042, pages 1435-1712에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고문헌으로 통합된다.
생물학적 활성
인간 재조합 알파 가용성 클로토의(환자, 대상 또는 연령 관련 장애 또는 임상적 (예로, 대사) 장애를 나타내는 개인에 대한) 효능을 평가하고/거나, 유효량을 결정하는 방법은 (예비적으로) 유기체-기반의 검정법을 (예로, 포유 동물 (예로, 마우스, 래트, 영장류 또는 일부 다른 비-인간) 을 사용하여) 수행하는 단계를 포함한다. 클로토 단백질은 유기체에 한번 또는 요법 (규칙적 또는 불규칙적)으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 주어진 기간에 (예로, 매월, 반달, 매주, 반주, 매일 등) 적절한 횟수로 (예로, 한 번, 두 번 등)로 투여될 수 있다. 유기체의 매개변수 (예로, 연령 관련 매개변수)가 평가될 수 있다. 관심있는 클로토 단백질은 기준 (예로, 대조군 유기체의 매개변수)에 대비하여 매개변수에 영향을 주거나 이의 변화를 초래할 수 있다. 다른 매개변수 (예로, 독성, 제거율 및 약동학 관련)도 평가될 수 있다.
본 발명의 클로토 단백질은 연령 관련 또는 연령 관련 장애 또는병상태, 임상적 (예로, 대사) 장애 또는 병태 등와 같은 특정한 장애 또는 병태를 갖거나 나타내는 동물 (모델)을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 장애 및 병태는 또한 생리학에 미치는 단백질의 효과가 관찰될 수 있는 민감화된 시스템을 제공할 수 있다. 예시적인 장애는 예를 들어, 신경차단, 무질서 위축증, 임상적 (예로, 대사) 장애 (예로, 비만 및/또는 당뇨병 동물, 예컨대 db/db 마우스, ob/ob 마우스 등), 대뇌 장애, 간 허혈증 또는 다른 간 장애, 시스플라틴/텍솔/빈크리스틴 모델, 신장 허혈증/재관류 모델, 다양한 조직 (이종이식편) 이식, 트랜스유전자 뼈 모델, 통증 증후군 (예로, 염증성 및 신경병증성 장애), 파라콰트, 유전 독성, 산화 스트레스 모델 및 종양 (I) 모델을 포함한다.
본 발명의 S-클로토 단백질을 평가하기 위하여, 단백질을 적합한 동물에 (적당한 처리 기간 동안) 투여할 수 있고 동물의 매개변수를 평가한다 (예로, 10 내지 60분, 1 내지 24시간, 1 내지 30일, 1 내지 12개월, 1 내지 5년 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위와 같은 적합한 기간 이후에). 동물은 자유롭게 또는 정상적으로 사료 공급될 수 있다 (예로, 일부 매개변수가 이러한 조건 하에 평가 될 수 있지만 칼로리 제한 하에는 아님). 전형적으로, 이러한 동물의 집단이 검정법에 사용된다. 일반적으로, 테스트 폴리펩티드가 칼로리 제한을 받는 유사한 동물의 표현형 방향으로 매개변수에 영향을 주는 경우, 테스트 폴리펩티드는 동물에서 수명 조절을 바람직하게 변경시키는 것으로 표시될 수 있다. 이러한 테스트 폴리펩티드는 유기체의 칼로리 섭취를 박탈할 필요 없이도 칼로리 제한의 수명 조절 효과 (예로, 이러한 효과의 하위집합)의 적어도 일부를 유발할 수 있다.
테스트될 매개변수(들)는 연령 관련 또는 질환 관련 매개변수(들) (예로, 동물 모델과 관련된 장애의 증상)일 수 있다. 유리하게 지시된 테스트 단백질은 폴리펩티드로 처리되지 않은 유사한 기준 동물에 비해 증상의 개선을 유발할 수 있다. 장애 또는 노화와 관련된 다른 매개변수는 항산화제 수준 (예로, 항산화 효소 수준 또는 활성), 스트레스 저항성 (예로, 파라콰트 저항성), 코어 체온, 포도당 수준, 인슐린 수준, 갑상샘 자극 호르몬 수준, 프로락틴 수준 및 황체형성 호르몬 수준을 포함할 수 있다.
연령 관련 장애를 치료하기 위한 본 발명의 S-클로토 단백질의 효과를 측정하기 위해, 클로토 발현이 감소되었던 동물 (예로, 돌연변이체 또는 결실된 클로토 유전자를 갖는 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 테스트 단백질은 돌연변이 마우스에게 투여될 수 있고, 연령 관련 매개변수가 모니터링된다. 유리하게 지시된 테스트 단백질은 단백질로 처리되지 않은 유사한 기준 동물에 비해 증상의 개선을 유발할 수 있다.
임상적 (예로, 대사) 장애 또는 노화와 관련한 매개변수는 체중 측정, 생식 능력 획득에 대한 검사, 혈당 수준의 측정, 수명의 관찰, 피부 관찰, 걷기 등과 같은 운동 기능의 관찰에 의해 평가될 수 있다. 흉선 무게의 측정, 흉강 내부 표면 상에 형성된 석회화된 결절의 크기의 관찰 등에 의해 역시 평가될 수 있다. 또한, 클로토 유전자 또는 클로토 단백질에 대한 mRNA의 정량적인 측정이 또한 평가에 유용할 수 있다.
또 다른 (생체내) 모델 및 유기체 검정법은 임상 (예로, 대사) 매개변수, 예로 인슐린 장애인 제 II 형 당뇨병과 관련한 매개변수에 대해 동물을 평가하는 것을 포함한다. 예시적인 대사 매개변수는 포도당 농도, 인슐린 농도 및 인슐린 민감성을 포함한다.
테스트 단백질이 수명 조절을 변경할 수 있는지 여부를 평가하는데, 다수의 연령 관련 매개변수 또는 바이오마커가 모니터링되거나 평가될 수 있다. 예시적인 연령 관련 매개변수는 (i) 세포 또는 유기체의 수명; (ii) 생물학적 연령-의존적 발현 양상을 갖는 세포 또는 유기체에서의 유전자 전사체 또는 유전자 산물의 존재 또는 풍부도; (iii) 스트레스에 대한 세포 또는 유기체의 저항성; (iv) 세포 또는 유기체의 하나 이상의 대사 매개변수 (예시적인 매개변수는 순환하는 인슐린 수준, 혈당 수준, 지방 함량, 코어 체온 등을 포함함); (v) 유기체에 존재하는 세포 또는 세포 집합의 증식 능력; 및 (vi) 세포 또는 유기체의 신체적 외모 또는 행동을 포함한다.
용어 "평균 수명"은 유기체 집단의 사망 연령의 평균을 말한다. 일부의 경우에, "평균 수명"은 동제된 환경 조건 하에서 유전적으로 동일한 유기체의 집단을 사용하여 평가된다. 사고로 인한 사망은 버린다. 통제된 환경 조건 하에서 평균 수명이 (예로, 인간의 경우) 결정될 수 없는 경우, 충분히 큰 인구에 대한 신뢰가능한 통계 정보 (예로, 보험 통계표에서)가 평균 수명으로서 사용될 수 있다.
두 개의 이러한 유기체, 예로 하나의 기준 유기체 및 나머지의 S-클로토 단백질로 처리된 유기체 사이의 분자적 차이의 특성화는 유기체의 생리학적 상태의 차이를 나타낼 수 있다. 기준 유기체 및 처리된 유기체는 전형적으로 동일한 (또는 실질적으로 동일한) 생활연대 연령 및/또는 성별이다. 본원에 사용된 용어 "생활연대 연령"은 임신, 정의된 배아 또는 태아 단계, 또는 더욱 바람직하게 출생과 같은 미리 선택된 사건 이래로 경과된 시간을 말한다. 다양한 기준이 유기체가 비교 분석을 위해 "동일한" 생활연대 연령인지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
전형적으로, 요구되는 정확성의 정도는 야생형 유기체의 평균 수명의 함수이다. 예를 들어, 연구실 야생형 균주 N2가 일부 통제된 조건 하에서 평균 약 16일 동안 사는 선충 C. 엘레간스의 경우, 동일한 연령의 유기체가 동일한 일수 동안 살았을 수 있다. 마우스의 경우, 동일한 연령의 유기체가 동일한 주 또는 개월수 동안, 영장류 또는 인간의 경우 동일한 햇수 (또는 2, 3 또는 5년 이내) 동안 및 기타 등이 살았을 수 있다. 일반적으로, 동일한 생활연대 연령의 유기체는 해당 종의 야생형 유기체의 평균 수명의 15, 10, 5, 3, 2 또는 1% 이내의 기간 동안 살았을 수 있다. 바람직하게, 유기체는 성체 유기체이다 (예로, 유기체는 평균 야생형 유기체가 생식 능력이 있는 연령으로 성숙되는 기간 동안 적어도 살았음).
유기체 스크리닝 검정법은 유기체가 노화의 명백한 신체적 특징을 나타내기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 유기체는 동일한 종의 야생형 유기체의 평균 수명의 10, 30, 40, 50, 60 또는 70%만 살았던 성체일 수 있다. 대사, 면역력 및 염색체 구조의 연령 관련 변화가 보고되어 왔다. 임의의 이들 변화는 테스트 대상 (예로, 유기체 기반의 검정법의 경우)에서, 또는 본원에 기재된 치료제로의 치료 이전 또는 이후에 평가될 수 있다 (예로, (인간 또는 포유동물) 환자의 경우).
칼로리 제한과 관련된 마커는 또한 스크리닝 검정법의 대상 유기체 (또는 치료된 대상)에서 평가될 수 있다. 이들 마커가 연령-관련되지 않을 수 있더라도, 이들은 클로토 또는 클로토 관련 경로가 조정될 때 변경되는 생리학적 상태를 나타낼 수 있다. 마커는 칼로리 제한 동물에서 풍부도가 변화하는 mRNA 또는 단백질일 수 있다. 본원에 기재된 동물의 세포로부터 유래되거나 본원에 기재된 동물 모델과 유사한 세포 모델이 세포-기반의 검정법에 사용될 수 있다.
근육 위축증에 미치는 테스트 단백질의 효과를 평가하기 위한 모델은 1) 예로, 허벅지 중간에서 우측 좌골 신경을 절단함으로써 신경차단으로 인한 래트 내측 비복근 질량 손실; 2) 고정화로 인한 (예로, 90도 굴곡에서 우측 발목 관절을 고정함으로써) 래트 내측 비복근 질량 손실; 3) 뒷다리 걸기으로 인한 래트 내측 비복근 질량 손실; 4) 악액질 사이토카인, 인터루킨-1 (IL-1)으로의 치료로 인한 골격근 위축증; 및 5) 글루코코르티코이드, 덱사메타손으로의 치료로 인한 골격근 위축증을 포함한다.
산물, 조성물, 제형물, 보조제 등
본 발명의 일부 구현예는 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키고/거나, 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시키도록 구성되거나 제형화된 조성물, 그리고 이와 관련된 방법, 키트, 제형물, 조합 산물, 공동-투여, 보조-제형물, 용량, 공정, 방법, 치료 프로토콜 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 조성물의 용도 또는 이를 인간 또는 비-인간 동물 대상을 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 인간 또는 비-인간 동물 대상에게의 투여를 포함하여 본 발명의 조성물이 관여하는 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 용도 및 치료 방법은 예컨대 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키고/거나 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시킴으로써 내인성 클로토 단백질 수준을 증가시킬 수 있다.
특정 구현예는 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 대상에게 투여될 때 인간 또는 비-인간 동물 대상에서 내인성 가용성 알파-클로토 단백질의 수준을 증가시키는 건강 보조제를 포함하는 물질의 조성물을 포함한다. 조성물 또는 건강 보조제 제형물은 (합성) 화학적 및/또는 천연 구성성분 또는 성분을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 조성물 또는 건강 보조제의 구성성분 또는 성분은 (합성) 화학적 및/또는 천연 출처로부터 나오거나 유래될 수 있다.
예시적인 조성물은 바람직하게 예를 들어 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 C, 비타민 K, 3,5,4'- 트리하이드록시-트랜스-스틸벤 (레스베라트롤), 프테로스틸벤, N-아세틸시스테인 (NAC), 트로글리타존, 로시글리타존, 노토프테리지지움 인시숨 팅, 젠티안 (뿌리, 추출물), 코르디셉스 (코르디셉스 시넨시스 (CS) 균사체), 이소플라본 (콩), 제니스타인, 다이드제인, 퀘르세틴 (디하이드레이트; 딜, 월계수 잎, 오레가노), 도코사헥산산 (DHA), 아스트라잔틴, 세사민 (세멘 세사민 니그룸 (검정색)), 참깨 (종자 추출물), 로즈마린산 (RA, (마조람)), 테트라데실티오아세트산 (TTA), 이칼슘 포스페이트 (무수), 미세결정 셀룰로우스 (MCC), 소듐 클로스카멜로우스 (프리멜로우스), 스테아린산, 마그네슘 스테아레이트, 알파 리포산, 컨쥬게이트 (알파) 리놀레산 (CLA), 프리바이오틱, 활성탄 및 당 업계에 공지된 기타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
특정 성분 또는 구성성분은 노화로 발생하는 세포성 및 조직 기능장애와 관련된 하나 이상의 병태를 치료하거나 침범하는데 긍정적인 이점 및 매우 낮은 부작용을 갖을 수 있다. 특정 성분 또는 구성성분은 이의 투여 이후에 인간 또는 비-인간 동물 대상에서 가용성 알파 클로토 (s-클로토) 수준의 순환하는 혈장 수준을 (직접 또는 간접적으로) 증가시킬 수 있다.
다음의 예는 단지 예시적인 것이다. 다음의 예는 본 발명의 구현예의 시행에 유용할 수 있는 다양한 조건부 성분, 구성성분, 방법 단계 등을 예시한다.
본 발명의 구현예는 개별적으로 세포성 및 조직 기능장애와 관련되었던 및/또는 노화로 발생할 수 있는 하나 이상의 병태를 겨냥하고/거나, 치료하고/거나, 침범하고/거나, 대응하는데 긍정적인 이점 및/또는 매우 낮은 부작용의 잠재력을 갖을 수 있는 여러 구성성분 (또는 성분)의 제형물 (조성물, 공동-투여 등)을 포함한다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 본 발명의 일부 구성성분 또는 성분은 클로토 유전자의 프로모터 (예로, 인간 HEK293/kl 세포주에서)를 활성화하거나, 간, 신장 및 기타 조직에서 클로토의 발현에서의 연령 관련 저하를 역전시킬 수 있다. 일부 성분은 클로토 단백질 또는 클로토 유전자에 대한 산화적 또는 다른 손상을 약화시키고/거나, 감소시키고/거나, 억제하고/거나, 예방할 수 있다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 일부 성분은 세포성 및 조직 기능장애와 관련되었던 및/또는 노화로 발생할 수 있는 하나 이상의 병태를 겨냥하고/거나, 치료하고/거나, 침범하고/거나, 대응하는데 긍정적인 이점 및/또는 매우 낮은 부작용의 잠재력을 갖도록 하나 이상의 동물 및 인간 임상적 연구에 의해 확인되어 왔다. 본 발명은 내인성 클로토 단백질 수준을 증가시키기 위한 조성물 및 방법에서 이들 다양한 성분을 이용한다. 구체적으로, 본 발명은 고유의 가용성 알파 클로토 단백질 생산을 증대시키고/거나, 클로토 단백질 손상 또는 분해를 약화시키도록 구성되거나 제형화된 조성물에서 이들 다양한 성분을 이용한다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 일부 구현예에서 특정 개별 성분은 포유동물 (예로, 인간 또는 비-인간) 동물에서 가용성 알파 클로토의 순환하는 혈장 수준을 증가시킬 수 있다. 예시적인 성분은 클로토 발현을 증가시키고, 인산뇨를 증가시키며, 고인산혈증을 교정하고, 혈청 섬유모세포 성장인자-23 (FGF-23)을 낮추어 만성 신장병을 앓는 마우스에서 관련된 대동맥 석회화 감소를 유도하는 것으로 생각되는 N-아세틸시스테인 (NAC), 항산화제; 비타민 D3 (1,25-디하이드록시비타민 D3 [1,25(OH)2D3])과 같은 비타민 D; 및/또는 비타민 D 수용체 작동제 (예로, 칼시트리올, 파리칼시톨), 그리고 근위 세관에서 연령 관련 결정질뇨 및 신장 손상을 개선시키는 것으로 생각되는 비타민 C 및/또는 비타민 E를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
추가의 예시 성분은 예를 들어 도코사헥사에노산 (DHA), 리놀레산, 공액 리놀레산 (CLA), 이소플라본 (예로, 제니스타인, 다이드제인, 퀘르세틴), 로즈마린산, 세사민 및 아스타잔틴 (식품 유래 항산화제) 및 테트라데실티오아세트산 (TTA)과 같은 알파 클로토의 노화 방지 성질을 보완할 수 있는 비-처방 성분을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 노화 뇌는 구체적으로 학습 및 기억의 감소를 초래할 수 있는 염증성 및 산화적 변경이 취약하며, DHA와 같은 오메가-3 다중불포화 지방산 (PUFA)가 노화 뇌를 신경퇴행성 질환의 발병으로부터 보호한다. 이에 따라, 특정 식 E는 알파 리놀레산이 DHA의 제조 시 인체에 사용되는 전구체 분자로서 작용할 수 있기 때문에 알파 리놀레산 또는 공액 알파 리놀레산을 포함할 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 하나 이상의 DHA 전구체 또는 LA 또는 CLA와 같은 오메가-3 지방산이 제형물에서 생략될 수 있다. 임의의 이론에 구애받지 않고, LA 또는 CLA와 같은 오메가-3 지방산은 혈액 희석제 효과를 증가시키고 출혈 위험을 상승시킬 수 있다. 약물의 예로는 특히 와파린 (쿠마딘), 클로피도그렐 (플라빅스) 및 아스피린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, DHA가 제형물에 포함될 수 있다. 임의의 이론에 구애받지 않고도, DHA는 혈액 희석을 직접적으로 유발하지 않을 수 있다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 미토콘드리아 손상은 다양한 독성 공격, 저산소증 또는 외상으로 인한 세포 손상의 원인 및 결과가 될 수 있다. 신장 근위 세뇨관 세포 (RPTC) 손상 이후 미토콘드리아의 생체생성을 증가시키면 이러한 손상 후 미토콘드리아 및 세포성 기능의 회복을 가속화할 수 있다. 이러한 관찰과 관련하여, 다이드제인 및 제니스타인과 같은 이소플라본은 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 감마 보조활성화제 (PGC)-1 알파 발현을 증가시키고, ATP 합성효소 베타 및 NADH:유비퀴틴 산화환원효소 코어 서브유닛 6 (ND6)의 발현 증가에 의해 지시된 바와 같이 미토콘드리아 생물발생을 유도할 수 있으며, 이는 RPTC에서 호흡 및 ATP의 1.5배 증가를 유도할 수 있고, 손상된 RPTC의 회복에 유익을 준다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 다이드제인은 장내에서, 특정한 장내 세균총에 의해 대사되어 생체활성 화합물 에쿠올을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서 에쿠올도 포함될 수 있다. 한편, 이소플라본인 퀘르세틴은 프로테아좀 - 산화적으로 변형되거나 손상된 단백질을 인식하여 제거함으로써 산화 환원 균형의 유지에 중요한 역할을 하는 세포성 단백질 부하의 적절한 조절을 부여하는 대형 단백질 복합체에서 산화적 스트레스 저항성을 증가시킴으로써 노화의 유해한 영향에 대응할 수 있다.
로즈마린산은 또한 일부 제형물에서 성분으로서 첨가될 수 있다. 로즈마린산 (RA)은 자연 발생의 페놀성 화합물이며, 허브, 향신료 및 약용 식물의 유익한 건강 증진 효과에 기여할 수 있다. 노화된 마우스에게 30일 동안 매일 한 번 kg 당 200 mg의 용량으로 RA를 투여하면 RA를 투여받지 않은 노화 대조군과 비교하여, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD), 카탈라제 (CAT) 및 글루타치온 퍼옥시다제 (GSH-Px)의 활성을 말론디알데히드 (MDA)의 감소와 함께 유의하게 증가시킬 수 있다 (p < 0.05 또는 p < 0.01). 따라서, RA는 노화 마우스의 간 및 신장 조직에서 유의한 항산화 효소 활성을 촉진할 수 있다.
일부 구현예는 또한 아스타잔틴 (A) 및/또는 세사민 (S)과 같은 식품-유래 항산화제를 을 포함할 수 있다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 이들 성분 둘 다 (아스타잔틴은 연어, 새우, 게 및 미세조류에서 발견되는 적색 카로티노이드이고, 세사민은 참깨 추출물에서 발견되는 주요 리그난임)가 결합되어 (즉, AS), 경미한 인지 장애 (MCI)를 갖는 대상에게 매일 투여될 때, 위약 실험군과 비교하여 AS 실험군에서 정신 운동 속도 및 처리 속도의 유의한 개선이 관찰되었다. 이에 따라, AS의 매일 보충은 복잡한 업무를 신속하고 정확하게 이해하고 수행하는 능력과 관련된 인지 기능을 개선시킬 수 있다.
테트라데실티오아세트산 (TTA)과 같은 하나 이상의 퍼옥시좀 증식제-활성화된 수용체 (PPAR-γ작동 제가 또한 특정 구현예에 첨가될 수 있다. PPAR-γ작동제는 아미노산 대사 및 L-카르니틴 생합성의 조절을 통해 심장 근육에 미치는 유리한 효과를 갖을 수 있다.
상기 기재된 정제된 화학적 화합물과 더불어, 일부 구현예는 하나 이상의 (예로, 여러) 천연 성분 또는 추출물을 포함할 수 있다. 이들은 젠티안 뿌리 추출물, 코르디셉스 버섯 및 노토프테리지움 인시슘 팅의 추출물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예는 락토바실러스 종 (예로, acidophilus, brevis, bμLgaricus, casei, gasseri, johnsonii, lactis, plantarum, paracasei, rhamnosus, salivarius, sake 등), 비피도박테리움 종 (예로, bifidum, breve, infantis, lactis, longum 등), 스트렙토코커스 종 (예로, thermophiles 등), 바실러스 종 (예로, laterosporus 등), 페디오코커스 종 (예로, acidilactici 등) 및 당 업계에 공지된 다른 종과 같은 (프리바이오틱) 박테리아 중 하나 이상의 (선택적인) 균주를 포함할 수 있다. 임의의 이론에 구애받지 않고도, 프로바이오틱은 노화로 인한 산화적 스트레스를 완화시키고 노화의 바이오마커의 발현을 (예로, 마우스에서) 개선시킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 포함될 수 있는 프로바이오틱스에 관한 추가적인 정보는 Sabina Fijan에 의해, Int J Environ Res Public Health, 2014 May; 11(5): 4745-4767에 발표된 문헌“Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of Recent Literature"에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문이 본원에 상세한 참고문헌으로 통합되어 있다.
표 42는 상세한 구현예 (KSF 101로 지칭됨) 내에 제형화될 수 있는 성분의 목록을 제공한다.
Figure pct00069
비-제한적인 예로서, KSF 101 제형물은 경구로 투여되는 DSHEA-준수하는 제형물 또는 조성물일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 이에 따라, 일부 예에서, KSF 101 보조제는 소비자에게 직접적으로 (DTC) 및/또는 처방전/의사 주문 없이 시판되고/거나 판매될 수 있다. 그러나, KSF 101은 본 발명의 범주를 벗어나지 않고도 다른 용량 형태로 및/또는 FDA 승인된 약물로서 제형화 될 수 있음을 이해할 것이다. KSF 101에서 성분 농도는 150 파운드 (68 kg)의 표준 성인 기준을 기초로 한다. 당업자라면 이해되는 바와 같이, 대안의 용량(들)도 또한 본원에서 고려된다.
표 43은 본 발명의 또 다른 구현예 내로 제형화될 수 있는 잠재적인 (예로, 바람직한 및 조건부) 성분을 나열한다.
Figure pct00070
표 44는 본 발명의 또 다른 구현예 내로 제형화될 수 있는 잠재적인 (예로, 바람직한 및 조건부) 성분을 나열한다.
Figure pct00071
표 42 내지 표 44의 성분은 임의의 적합한 조합으로 선택적으로 조합될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 대안의 제형물(들)은 경구로 투여되는 DSHEA-준수하는 제형물 또는 조성물일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 그러나, 대안의 제형물(들)은 본 발명의 범주를 벗어나지 않고도 다른 용량 형태로 및/또는 FDA 승인된 약물로서 제형화 될 수 있음을 이해할 것이다. 대안의 제형물(들)에서 각각의 성분 농도는 150 파운드 (68 kg)의 표준 성인 기준을 기초로 한다. 당업자라면 이해되는 바와 같이, 대안의 용량(들)도 또한 본원에서 고려된다.
예시적인 성분 (예로, 영양제학적 조성물)은 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E, N-아세틸시스테인 (NAC), 퀘르세틴 (디하이드레이트), 로즈마린산 (RA), 프테로스틸벤, 도코사헥산산 (DHA), 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 및 하나 이상의 프로바이오틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로바이오틱은 (i) 비피도박테리움 종 및/또는 균주 비피도박테리움 락티스 BL-04, 비피도박테리움 비피디움/락티스 BB-02 및 비피도박테리움 롱굼 BL-05로부터 선택된 균주 중 하나 이상, 및/또는 (ii) 락토바실러스 종 및/또는 균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-14, 락토바실러스 람노수스 LR-32 및 락토바실러스 파라카제이 LPC-37로부터 선택된 균주 중 하나 이상의 유효량을 포함할 수 있다.
예시적으로, 조성물 (또는 제형물)은 프로 바이오틱 성분을 매일 용량 당 최대, 적어도 및/또는 약 500 억 CFU를 포함한다. 대안의 구현예는 프로바이오틱 성분을 최대, 적어도, 이들 사이 및/또는 약 200억개 CFU (매일 용량 당), 300억개 CFU (매일 용량 당), 400억개 CFU (매일 용량 당), 600억개 CFU (매일 용량 당), 700억개 CFU (매일 용량 당) 및/또는 800억개 CFU (매일 용량 당)로 포함할 수 있다. 예시적으로, 프로바이오틱 성분은 단일 프로바이오틱 (박테리아) 종 또는 균주, 또는 최대, 적어도 및/또는 대략 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 프로바이오틱 (박테리아) 종 또는 균주를 포함하거나, 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 프로바이오틱 성분은 다음의 프로바이오틱 (박테리아) 종 또는 균주를 포함한다: 300억개 CFU/일의 각각의 비피도박테리움 종 및/또는 균주 비피도박테리움 락티스 BL-04, 비피도박테리움 비피둠/락티스 BB-02 및 비피도박테리움 롱굼 BL-05. 특정 구현예는 전술한 비피도박테리움 종 및/또는 균주 중 하나 또는 두 개를 최대, 적어도, 이들 사이 및/또는 약 100억개 CFU (매일 용량 당), 약 200억개 CFU (매일 용량 당), 300억개 CFU (매일 용량 당), 400억개 CFU (매일 용량 당) 및/또는 500억개 CFU (매일 용량 당)의 양으로 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 적어도 일 구현예에서, 프로바이오틱 성분은 다음의 프로바이오틱 (박테리아) 종 또는 균주를 포함한다: 200억개 CFU/일의 각각의 락토바실러스 종 및/또는 균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-14, 락토바실러스 람노서스 LR-32 및 락토바실러스 파라카제이 LPC-37. 그러나, 특정 구현예는 전술한 락토바실러스 종 및/또는 균주 중 하나 또는 두 개를 최대, 적어도, 이들 사이 및/또는 약 50억개 CFU (매일 용량 당), 약 100억개 CFU (매일 용량 당), 200억개 CFU (매일 용량 당), 300억개 CFU (매일 용량 당) 및/또는 400억개 CFU (매일 용량 당)의 양으로 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
적어도 일 구현예에서, 비타민 C는 매일 용량 및/또는 농도로 약 500 mg 또는 약 100 내지 2000 mg, 바람직하게 약 200 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게 약 250 내지 1200 mg, 더욱 더 바람직하게 약 400 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 750 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 C는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 C는 매일 용량 및/또는 농도로 약 2500 mg, 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg 또는 750 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 비타민 D3는 매일 용량 및/또는 농도로 약 1000 mg 또는 약 100 내지 2500 mg, 바람직하게 약 200 내지 2000 mg, 더욱 바람직하게 약 250 내지 1800 mg, 더욱 더 바람직하게 약 400 내지 1500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 1500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 750 내지 1250 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 D3는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 1250 mg, 1500 mg 또는 2000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 D3는 매일 용량 및/또는 농도로 약 3000 mg, 2500 mg, 2000 mg 또는 1500 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 비타민 E는 매일 용량 및/또는 농도로 약 400 mg 또는 약 100 내지 2000 mg, 바람직하게 약 150 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게 약 200 내지 1200 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 750 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 300 내지 750 mg, 더욱 더 바람직하게 약 300 내지 500 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 E는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 비타민 E는 매일 용량 및/또는 농도로 약 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg, 750 mg 또는 500 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, N-아세틸시스테인 (NAC)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 600 mg 또는 약 100 내지 2000 mg, 바람직하게 약 150 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게 약 200 내지 1200 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 750 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 750 mg이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, N-아세틸시스테인 (NAC)은 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, N-아세틸시스테인 (NAC)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg 또는 750 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 퀘르세틴 (디하이드레이트)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 150 mg 또는 약 10 내지 1000 mg, 바람직하게 약 25 내지 750 mg, 더욱 바람직하게 약 50 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 250 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 200 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 퀘르세틴 (디하이드레이트)은 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg 또는 250 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 퀘르세틴 (디하이드레이트)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 1000 mg, 750 mg, 500 mg, 400 mg, 300 mg, 250 mg 또는 200 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 로즈마린산 (RA)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 500 mg 또는 약 100 내지 2000 mg, 바람직하게 약 200 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게 약 250 내지 1200 mg, 더욱 더 바람직하게 약 400 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 750 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 로즈마린산 (RA)은 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 로즈마린산 (RA)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 2500 mg, 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg 또는 750 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 프테로스틸벤은 매일 용량 및/또는 농도로 약 50 mg 또는 약 10 내지 200 mg, 바람직하게 약 20 내지 150 mg, 더욱 바람직하게 약 25 내지 120 mg, 더욱 더 바람직하게 약 25 내지 120 mg, 더욱 더 바람직하게 약 40 내지 100 mg, 더욱 더 바람직하게 약 50 내지 100 mg, 더욱 더 바람직하게 약 50 내지 75 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 프테로스틸벤은 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg 또는 100 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 프테로스틸벤은 매일 용량 및/또는 농도로 약 250 mg, 200 mg, 150 mg, 100 mg 또는 75 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, DHA (바람직하게 식물성 DHA)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 200 mg 또는 약 10 내지 1000 mg, 바람직하게 약 25 내지 750 mg, 더욱 바람직하게 약 50 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 250 mg, 더욱 더 바람직하게 약 150 내지 250 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 200 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 퀘르세틴 (디하이드레이트)은 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg 또는 500 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 퀘르세틴 (디하이드레이트)은 매일 용량 및/또는 농도로 약 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg, 750 mg, 500 mg, 400 mg, 300 mg 또는 250 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 리보시드 (NR)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 500 mg 또는 약 100 내지 2000 mg, 바람직하게 약 200 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게 약 250 내지 1200 mg, 더욱 더 바람직하게 약 400 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 1000 mg, 더욱 더 바람직하게 약 500 내지 750 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 리보시드 (NR)는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 리보시드 (NR)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 2500 mg, 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg 또는 750 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 300 mg 또는 약 50 내지 2000 mg, 바람직하게 약 100 내지 1000 mg, 더욱 바람직하게 약 150 내지 750 mg, 더욱 더 바람직하게 약 200 내지 600 mg, 더욱 더 바람직하게 약 200 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 200 내지 400 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 250 내지 400 mg, 더욱 더 바람직하게 약 300 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 300 내지 400 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 50 mg, 100 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg 또는 1000 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg, 750 mg, 500 mg, 400 mg 또는 350 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 200 mg 또는 약 10 내지 1000 mg, 바람직하게 약 25 내지 750 mg, 더욱 바람직하게 약 50 내지 500 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 250 mg, 더욱 더 바람직하게 약 150 내지 250 mg, 더욱 더 바람직하게 약 100 내지 200 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN)는 매일 용량 및/또는 농도로 적어도 약 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg 또는 500 mg (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NNM)는 매일 용량 및/또는 농도로 약 2000 mg, 1500 mg, 1000 mg, 750 mg, 500 mg, 400 mg, 300 mg 또는 250 mg 이하 (매일 또는 용량 당)이 포함될 수 있다.
임의의 이론에 구애받지 않고, NAD+ 및/또는 NAD+ 전구체(들) (NR 및/또는 NMN)을 포함하는 구현예에서, NAD+ 및/또는 NAD+ 전구체(들)은 설하 적용을 위한 로젠지 형태일 수 있다 (예로, 혈류로 유입되도록, 처음에 간을 우회하여 간에서 이들이 NAM으로 전환될 때까지 시간을 연장시킴). 다른 성분들은 또한 별도로 투여되거나 공동-투여될 수　있다. 일부 구현예에서, 성분은 바람직하게 적어도 일부 공동-제형화를 통해 공동-투여되거나, 다중-용량 조성물로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 다중-알약, -캡슐, 또는 다른 용량 키트 또는 포장이거나, 이를 포함하거나, 이로서 제공될 수 있다. 구현예는 알약, 캡슐 등과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 투약 성분을 포함할 수 있다. 일부 성분은 고체, 과립, 분말, 액체 또는 기타 형태로 제공될 수 있다.
표 45는 본 발명의 구현예에 따른 예시적인 제형물을 제시한다.
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표 45의 성분은 임의의 적합한 조합으로 선택적으로 조합될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 대안의 제형물(들)은 경구로 투여되는 DSHEA-준수하는 제형물 또는 조성물일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 그러나, 대안의 제형물(들)은 본 발명의 범주를 벗어나지 않고도 다른 용량 형태로 및/또는 FDA 승인된 약물로서 제형화 될 수 있음을 이해할 것이다. 대안의 제형물(들)에서 각각의 성분 농도는 150 파운드 (68 kg)의 표준 성인 기준을 기초로 한다. 당업자라면 이해되는 바와 같이, 대안의 용량(들)도 또한 본원에서 고려된다.
일부 구현예는 본원에 기재된 바, 내인성 클로토 단백질 수준 또는 생산을 (예로, 포유동물 대상에서) 증가시키도록 제형화되거나, 공동-제형화된 조성물 (예로, 건강 보조제)의 유효량을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 조성물의 약제학적 유효량은 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 (혈청 밀리리터 당 가용성 클로토 단백질의 약 50 내지 3000 피코그램 이상 또는 이들 사이의 농도와 같은 미리 정해진 수준으로) 증가시키거나 상승시키에에 충분할 수 있다. 조성물의 약제학적으로 허용가능한 양은 또한 또는 대안적으로 (예로, 미리 정해진 기간 동안) 미리 정해진 역치량 이상으로 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 유지하기에 충분할 수 있다.
특정 구현예에서, 가용성 클로토 단백질 수준에서 충분하거나 적합한 증가는 IGF-1 및/또는 Wnt 신호전달 경로를 조정하고/거나, β-글루쿠로니다제 및/또는 시알리다제 활성을 나타내고/거나, p53/P21 신호전달 경로를 억압하고/거나, 바람직하게 p53/P21 신호전달 경로의 억압을 통한 H2O2-유도된 세포 노화 및 세포사멸을 감소시킬 수 있다 (이에 효과적일 수 있다). (상승된) 단백질은, 바람직하게 다면발현 활성을 나타내고/거나, 바람직하게는 산화 스트레스, 성장인자 신호전달, 이온 항상성의 조절 및/또는 하나 이상의 이온 통로 단백질과 같은 세포 표면 상의 당단백질 및/또는 인슐린/인슐린-유사 성장인자-1 수용체와 같은 성장인자 수용체의 활성 조절에서 체액성 인자로서 기능하거나 기능적일 수 있다.
본 발명의 제형화된 조성물 (예로, 건강 보조제)는 환자 또는 대상에 의한 클로토 단백질의 (자연적인) 생산을 증가시키거나 증진시키거나, 클로토 단백질 또는 클로토 유전자의/에 대한 산화적 또는 기타 손상 또는 분해를 약화 (예로, 감소, 억제 및/또는 예방)시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 상승시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 약제학적 조성물, 예컨대 치료적 조성물 또는 약물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 약제 또는 처방 약물 (예로, ARB (예로, 로사르탄, 발사르탄), 테스토스테론, 비타민 D 수용체 작동제 (예로, 칼시트리올, 파리칼시톨), PPAR (감마) 작동제 (예로, 티아졸리딘디온, 트로글리타존, 로시글리타존) 또는 기타와 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.. 일부 구현예는 혈관확장 수용체 차단제 (ARB) (즉, 로사르탄, 발사르탄) 또는 비타민 D 수용체 작동제 (VDRA) (즉, 칼시트리올 또는 파리칼시톨)와 같은 처방된 약물과 조합한 제형물 또는 공동-제형물을 포함할 수 있다. 제형물과 함께 투여될 수 있는 다른 처방 약물은 둘 다 퍼옥시다제 증식제-활성화된 수용체 (PPAR-γ) 작동제인 트로글리타존 (200 mg/kg/일) 및 로지글리타존 (20 mg/kg/일)을 포함한다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 클로토는 배양된 인간 신장 세포에서뿐만 아니라 생체내 마우스 신장에서 PPAR-γ의 표적 유전자인 것으로 생각된다. 더욱이, 클로토 단백질 발현은 PPAR-γ작동제 (예로, 설명된 경구용량)로의 치료에 의해 증진 (또는 상향조절)될 수 있다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 로사르탄은 인간 제 2형 당뇨병에서 순환하는 α-클로토 수준을 평균 23% (542 pg/mL부터 668 pg/mL까지, p = 0.001)로 (유의하게) 증가시킬 수 있다. 또한, 선형 회귀 분석은 혈장 α-클로토의 증가가 관련된 소변 알부민/크레아티닌 비율의 감소 (β = -0.263, p = 0.029)에 의해 관찰된 바와 같이 증진된 건강한 신장 기능을 달성하였던 점을 제시한다. 유사하게, 발사르탄은 α-클로토 수준을 상당히 증가시킬 수 있다 (432.7 ± 179부터 506.4 ± 226.8 pg/mL까지).
또한, 상기와 관련하여, 칼시트리올 또는 파리칼리트롤 (현재 이차 부갑상샘 기능항진증의 치료에 승인되어 있는, 인간 대상로부터 외삽된 VDRA 용량)로 만성 신장 질환 (CKD)을 갖는 마우스의 치료가 VDRA가 없는 경우와 비교하여 대동맥 석회화의 절반을 유도하는 것으로 생각된다. 구체적으로, 마우스에 칼시트리올 또는 파리칼시톨이 3주 동안 매주 3회 정맥내로 (투여: 30 ng/kg의 칼시트리올 (C30) 또는 100 ng/kg의 파리칼시톨 (P100) 또는 300 ng/kg의 파리칼시톨 (P300)) 주어지고, 마우스는 혈청 및 소변 클로토 수준 증가, 인산뇨증 증가, 고인산혈증의 교정, 및 혈청 섬유모세포 성장인자-23의 저하를 나타낼 수 있다. 클로토 및 오스테오폰틴은 또한 혈청 부갑상샘 호르몬 및 칼슘의 변화와 무관하게 VDRA 요법에 의해 상향조절 될 수 있다.
일부 구현예 또는 이의 약제학적 성분은 하나 이상의 재조합 (예로, 인간 또는 포유동물) 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 활성 성분 또는 약제학적 성분은 환자 또는 대상에서 내인성 클로토 단백질 (생산) 수준의 증가에 기여할 수 있다. 치료제, 재조합 단백질, 약제 및/또는 처방 약물과 같은 (다양한 및/또는 추가적인) 활성 성분의 추가적인 설명은 상기에 통합된 특허 문헌 (즉, (i) 2017년 6월 2일에 출원된 PCT／US2017／035755, (ii) 2017년 11월 22일에 출원된 PCT／US2017／063149 및 (iii) 2017년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/595,567)에 기술되어 있다. 이러한 활성 성분은 환자 또는 대상에서 내인성 클로토 단백질 (생산) 수준의 증가에 기여할 수 있다.
약제학적 조성물 또는 성분은 유형에 상관없이 일반적으로 약물 성분을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 성분으로 구성된 (약제학적으로 허용가능한) 운반체, 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 성분은 하나 이상의 응집 저해제, 완충액, 장력 개질제 및 추가적인 부형제를 포함할 수 있다. 담체에서의 일차 용매는 특성이 수용성 또는 비-수용성일 수 있다.
일부 구현예는 재조합 단백질 클로토 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 포함하는 조합 산물, 조성물 또는 제형물을 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 본원에 기재된 성분, 약물, 물질, 치료 조성물 등 또는 당 업계에 공지된 다른 것 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 주사가능한 (예로, 근육내, 정맥내 등), 섭취가능한, 경피, 흡입가능한, 국소 또는 기타 제형물 내로 공동-제형화될 수 있다. 대안적으로, 조합 치료 또는 공동-투여는 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분의 처리 또는 투여를 포함할 수 있지만, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분이 조합 산물, 조성물 또는 제형물 내로 조합되거나 제형화되지는 않는다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 별도의 주사가능한 (예로, 근육내, 정맥내 등), 섭취가능한, 경피, 흡입가능한, 국소 또는 기타 제형물을 각각 포함하거나 이에 포함될 수 있다.
일부 구현예는 내인성 클로토 단백질 수준 또는 생산을 (예로, 포유동물 대상에서) 증가시키도록 제형화되거나 공동-제형화된, 본원에 기재된 바 조성물 (예로, 건강 보조제)의 유효량 및 선택적으로 재조합 클로토 단백질 및/또는 약제 또는 처방 약물의 유효 (예로, 약제학적 유효)량을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 클로토 단백질 및/또는 약제 또는 처방 약물은 조성물과 공동-투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 클로토 단백질 및/또는 약제 또는 처방 약물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적으로 투여된, 조건부 재조합 클로토 단백질은 외인성 클로토 단백질을 제공함으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 상승시킬 수 있는 한편, 선택적으로 투여된 조건부 약제 또는 처방 약물은 환자 또는 대상에 의한 클로토 단백질의 (자연적인) 생산을 증가 또는 증진시키거나, 클로토 단백질 또는 클로토 유전자의/에 대한 산화적 또는 기타 손상 또는 분해를 약화 (예로, 감소, 억제 및/또는 예방)시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 상승시킬 수 있다.
또한, 공동-투여는 두 개 이상의 성분의 동시 투여 또는 두 개 이상의 성분의 별도의 투여를 포함할 수 있고, 별도의 투여는 바람직하게 일정 기간으로 분리될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 기간은 매우 짧을 수 있다. 예를 들어, 제 2 성분은 제 1 성분의 투여 직후에 실질적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 제 1 및 제 2 투여는 1 내지 60초, 1 내지 60분, 1 내지 24시간, 1 내지 7일, 1 내지 4주, 1 내지 12개월 등 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위로 분리될 수 있다. 유사하게, 동시 투여는 두 개 이상의 성분을 위한 투여 시간대를 중첩시키는 것을 포함할 수 있다.
임의의 전술한 또는 다른 조성물, 제형물 및/또는 공동-투여는 임의의 개별 성분의 단독 효과보다 부가 적 또는 상승 작용적 효과를 갖을 수 있다. 예를 들어, 다양한 건강 보조제 성분 또는 건강 보조제 조성물과 활성 성분 (예를 들어, 재조합 클로토 단백질, 제약 약물 등)과의 공동 투여는 개별 투여 결과의 합보다 더 큰 치료 결과를 초래할　수　있다. 유사한 농도의 개별 성분 만. 또한, 상승 작용적 효과는 성분을 단독으로 투여한 개별 결과와 유사한 치료 결과이지만, 더 낮은 농도에서의 결과를 포함할 수 있다. 상승 작용적 효과는 또한 하나 이상의 성분의 최대 유효 용량을 증가시키는 것, 하나 이상의 성분의 독성을 감소시키는 것, 또는 개별 치료 결과의 단순한 부가 효과 이상의 임의의 다른 유리한 결과를 포함할 수 있다. 또한, 개별 치료 결과의 부가 효과는 하나 이상의 상승 작용적 효과를 포함할 수 있다. 이러한 부가적인/상승 작용적 효과는 개별 성분의 특성 및 이해를 고려할 때 예측되거나 기대되지 않을 수 있다.
특정 구현예는 발현 핵산 구조물 및/또는 벡터, 세포주 및/또는 세포 현탁 배양물 그리고 하나 이상의 재조합 (예로, 인간 또는 포유동물) 클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체를 제조하고, 정제하고, (인간 또는 비-인간 동물) 대상에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다.
건강 보조제, 제형물, 공동-제형물, 공동-투여, 조합 산물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전술한 내용 각각은 "조성물" 또는 "본 발명의 조성물"로서 언급될 수 있음을 이해할 것이다.
외인성 S-클로토의 투여
본 발명은 S-클로토 제형물, 임상적 용량 및 투여 (예로, 정상인 및/또는 청년 (예로, 연령 18 내지 30세)의 범위 내에서 (예로, 임의의 만성 병태가 없음) S-클로토의 혈청 농도를 증가시키고/거나 유지하도록)에 관한 것이다.
본 발명의 양태 또는 구현예는 예를 들어 (cGMP- 및/또는 임상 등급) 인간 재조합 알파 가용성 클로토 단백질 또는 단백질 단편 (이소형 1)을 이를 필요로 하는 (인간) 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 구현예는 또한 ((인간) 대상에서) 혈청 S-클로토 수준 또는 농도를 (예로, 질량 분광석법 (MS) 또는 ELISA에 의해) 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 측정은 S-클로토 투여 이전, 이후 및/또는 동안 일어날 수 있으며, 필요에 따라 혈청 S- 로토 수준 및/또는 혈청 S-클로토 수준의 대사, 분해 또는 감소 속도를 결정하도록 반복될 수 있다. MS는 당 업계에 잘 알려진 기법이다. MS는 대상의 혈청에서 하나 이상의 (고유의 및/또는 재조합) 클로토 단백질의 수준을 확인하고 심지어 정량하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 단백질이 또한 대상의 혈청에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 클로토 관련 및/또는 노화 관련 단백질 (예로, FGF21, GDF-11, TIMP2, NAD+, CCL11, 호르몬 테스토스테론, 에스트로겐 등) 및/또는 신장 기능 단백질 (예로, KIM-1, 시스타틴-C, 크레아티닌, BUN, NGAL 등)은 혈청에서 클로토 측정과 별도로 또는조합하여 측정될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, 혈액 시료과 같은 혈청 시료가 획득된다. 시료는 당 업계에 공지된 바와 같이 혈액 채혈에 의해 획될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핑거 프릭 또는 혈액 시료를 얻는 다른 덜 침습적인 수단이 사용될 수 있다. 이에 따라, 혈액 시료는 더 빈번하게 (예로, 하루 종일 및/또는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 간마다) 채취될 수 있다. MS는 총 클로토 단백질 혈청 농도, 뿐만 아니라 고유의 클로토 종 (예로, 가용성 클로토, 절단된 클로토, 분비된 클로토 등) 및/또는 하나 이상의 본 발명의 클로토 단백질과 같은 다양한 알파 클로토 단백질 종의 혈청 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 클로토 수준은 치료적 재조합 클로토 단백질 투여 전 및 다시 하루 종일 및/또는 투여 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간 중 모두 (또는 한 번 이상) 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 클로토 수준은 투여 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 21, 25, 28, 30, 36, 40, 45, 50, 60 또는 90일 (또는 주) 중 모두 (또는 한 번 이상) 측정될 수 있다.
구현예는 또한 이러한 대상의 혈청 내에 S-클로토 농도를 정상 청년의 혈청 S-클로토 농도 이내에서 유지하기 위해 이러한 속도를 결정하고/거나 치료 프로토콜 (예로, S-클로토의 (후속적) 투여(들)의 빈도, 양 및/또는 지속 기간을 포함함)을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, S-클로토의 농도는 혈청 밀리리터 (pg/mL) 당 대략 1000 피코그램의 (S-클로토) 단백질로 유지될 수 있다.
적어도 일 구현예에서, (인간에서) S-클로토 투여 전략은 S-클로토의 하나 이상의 약동학적 매개변수의 측정을 포함할 수 있다. 예를 들어, S-클로토 투여에 반응하여 혈청, 소변 및 뇌척수액에서 S-클로토 수준의 생체내 결과 변화를 측정할 수 있다. 일부 구현예는 하나 이상의 임상 지표에 관한 S-클로토 투여의 효과를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 병태, 질환 및 장애에 대한 임상 지표는 당 업계에 공지되어 있고, 본원에 추가로 기재된다.
구현예는 또한 (기저선) S-클로토 수준 측정(들)을 (예로, 0시간 (임의의 외인성 S-클로토의 투여 전) 및/또는 치료 전 및/또는 치료 프로토콜 전체에 걸쳐 (S-클로토의 투여 전후) 상이한 시간에) (인간) 대상(들)에서 임의의 일주기 리듬 효과를 설명하기 위하여 시행하는 것을 포함할 수 있다.
구현예는 또한 S-클로토 투여의 적합한 빈도, 양 및/또는 지속 기간을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, (예로, MS 또는 ELISA 면역검정 정량분석에 의해 결정된 바와 같이) 낮은 S-클로토 혈청 수준을 갖는 대상은 혈청 S-클로토 수준을 제 1의 미리 정해진 수준 (예로, 약 1000 pg/mL)으로 만들도록 구성되고/거나 적응된 클로토의 제 1 투여가 제공될 수 있고, 이는 대상에서 혈청 S-클로토 농도 (이의 변화 결과)를 측정하고/거나 (예를 들어, MS 또는 ELISA에 의해), 혈청 S-클로토 수준의 대사, 분해 또는 감소의 수준 및/또는 속도 (제 1 투여 후)를 측정하고/거나, 투여된 S-클로토의 반감기를 계산하고/거나, 후속적 S-클로토의 제 2 투여가 (예로, 혈청 S-클로토 수준을 제 2의 미리 정해진 수준 이상으로 유지하기 위해) 제공되어야 하는 빈도 및/또는 시간대를 결정한다. 적어도 일 구현예에서, 제 2 미리 정해진 수준은 제 1 미리 정해진 수준의 이들 사이 및/또는 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 및/또는 5%일 수 있다.
추가의 투여는 대상에서 정상 성별-매칭된 청년 혈청 유지 수준 (예로, 대략 1000 p/mL)의 S-클로토 혈청 수준과 동등한 대상 (장기간) S-클로토 혈청 수준을 생성하는데 적합한 기간에 걸쳐 제공될 수 있다. ((인간) 대상에게) S-클로토 투여의 총 시간 범위는 1일 내지 5년 이상일 수 있다. 임상적 약점 점수 및 다른 측정의 사용을 기초로 하여 대상에서 약점의 측정 및/또는 결정이 또한 시간대에 걸쳐 시행될 수 있다.
본 발명의 구현예는 S-클로토의 용량을 증가시켜서 정상 범위 (예로, 예시적으로 적어도 약 500 내지 1000 pg/mL 혈청)를 초과하는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상의 S-클로토 수준의 증가를 유지하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현예는 S-클로토 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 투여의 적합한 경로의 비-제한적인 예는, 주사 (예로, 볼루스, 점진적, 정맥내, 피부내, 복강내, 근육내, 피내 및/또는 피하 주사), 또는 경구 또는 경구 관련 투여 (예로, 섭취, 구강 투여 및/또는 설하 투여), 국소 투여, 경피 투여, 직장 투여, 질내 투여, 흡입 등을 포함한다.
예시적인 구현예는 S-클로토 단백질 또는 조성물을 단일 볼루스 또는 연장된 (IV) 주사 (예로, 연장된 기간에 걸쳐 적하)로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, 대상의 체중 킬로그램 당 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 2.75, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20 마이크로그램 이상의 S-클로토가 치료마다 투여될 수 있다. 적합한 투여 양은 당 업계에 공지된 하나 이상의 방법을 통해 계산될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 상대성장 측정 (allometric scaling) 방법이다. 예를 들어, 래트 실험에서, 투여 당 0.01 mg의 S-클로토/kg 체중, 또는 10 μg/kg이 사용되었다. 예시적으로, 인간 상대성장 측정된 등가 0.16을 사용하여, 인간 등가 용량 (HED) = 10 μg/kg x 0.16 = 1.6 μg/kg. 따라서, 70 kg의 인간 개인은 70 kg × 1.6 μg/kg = 112 μg를 요구할 것이고, 60 kg의 인간은 60 kg × 1.6 = 96 μg을 요구할 것이다. 하기 표 46은 신체 표면적을 기초로 하여 다양한 동물 용량의 인간 등가 용량 (HED)으로의 전환을 입증한다. 이 전환은 60 kg의 인간을 가정한다.
HED는 본원에 참고문헌으로 통합되는 Reagan-Shaw (2008)에 의해 기술된 공정인 체표면적에 대한 정규화를 사용하여 확립되었다. 상대성장 측정으로 명명된 이러한 과정은 다른 종들 사이의 대사 속도의 기본적인 차이를 교정하고, 단순한 용량 외삽을 능가하여 바람직할 수 있다. 예시적으로, 동물 종 용량이 알려져 있을 때, HED는 다음과 같이 계산될 수 있다: HED = 동물 용량 mg/kg × 해당 적절한 동물 종의 상대성장 측정 팩터. 다음으로 환자에게 투여될 실제 용량은 HED에 환자의 체중을 곱함으로써 계산될 수 있다.
Figure pct00073
다수의 요인이 인간에서 (재조합 단백질 투여 전 및/또는 후) S-클로토의 양 및/또는 생체이용도, 투여될 S-클로토의 총량 및/또는 농도, 및/또는 재조합 단백질 투여 후 (시간 경과 시) 혈청 수준 반응을 결정하고/거나, 측정하고/거나 추정하는데 고려되거나 이를 고려할 수 있다. 이러한 요인은 예를 들어 희석제의 조성, 투여 경로, 투여 부위, 대상의 조직 및 기관 내의 분포, 대상의 대사 또는 다른 속도, 약동학 (PK), 약력학 (PD), 독성학 (Tox) 등을 포함할 수 있다.
적어도 일 구현예에서, (정상) 농도의 S-클로토는 (예로, 건강한 젊은 (18 내지 30세) 인간 성인에서) 혈청에서 대략 1000 pg/mL일 수 있다. 전형적인 성인은 대략 5 리터의 혈액량을 갖을 수 있으며, 여성은 일반적으로 남성보다 혈액량이 적다. 인간 혈액의 약 55%는 혈청으로 구성될 수 있다. 따라서, (5 리터의 혈액／성인) x (0.55 혈청／리터 혈액) = 2.75 리터 (2750 mL)의 혈청／성인. 내인성 혈청 S-클로토가 없음을 가정하면, 총 혈액 혈청에서 1000 pg/mL의 최종 농도를 달성하기 위하여; 2750 ml × 1000 pg/mL = 2,750,000 pg (또는 2750 ng, 또는 2.75 μg) 외인성 S-클로토가 성인 대상 당 투여될 수 있다.
용해성 클로토를 전형적인 건강한 수준 (예로, 1500 pg/mL 혈청)보다 50% 더 증가시키기 위하여, 4.125 마이크로그램/대상의 용량이 투여될 수 있다. 용해성 클로토를 전형적인 건강한 수준 (예로, 2000 pg/mL 혈청)보다 100% 더 증가시키기 위하여, 5.5 마이크로그램/대상의 용량 등이 투여될 수 있다.
약제학적으로 유효한 및/또는 충분한 양의 정제된 재조합 S-클로토 단백질은 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 임의의 적합한 수준, 예컨대 혈청 밀리리터 당 약 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000 20,000, 25,000, 30,000 40,000, 50,000, 75,000, 100,000 피코그램 이상의 가용성 클로토 단백질 이상 또는 이들 사이, 또는 혈액에서 가용성 클로토 단백질의 전형적인 건강한 수준보다 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1200%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000%, 4000%, 5000% 이상 또는 이들 사이로 상승시키도록 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상은 재조합 인간 S-클로토 단백질의 하나 이상의 (볼루스) 정맥내, 피부내, 복강내, 근육내, 피내, 피하 및/또는 기타 주사로, 적합한 부피의 클로토 완충제 (예로, 150 mM NaCl 및 10 mM HEPES pH 7.4) 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 중 약 0.01 mg/kg 체중 이상 또는 이들 사이의 용량에서 투여될 수 있다. 따라서, 160 파운드의 대상 (즉, 체중 72.57 kg)은 투여 당 약 0.73 mg의 S-클로토 (볼루스) 주사로 투여될 수 있다 (0.01 mg S-클로토/kg X 72.57 kg 체중의 계산을 기초로 함). 마찬가지로, 170 파운드의 사람은 투여 당 0.77 mg의 S-클로토를 투여받을 수 있다. 총 투여 횟수 및 빈도는 혈청에서 예를 들어 1000 pg/mL의 S-클로토 (0.000001 mg/mL 혈청과 동등함)의 농도를 달성하고 유지하는 것을 기초로 하여 결정될 수 있다. 후자는 MS에 의해 또는 인간 S-클로토 ELISA 검정법에 의해 측정된 바와 같이 확증될 수 있다.
다른 구현예에서, 용량은 약 0.0001 내지 10 mg／kg 체중, 0.0001 내지 10 μg/kg 체중, 0.0001 내지 10 ng/kg 체중, 0.0001 내지 10 pg/kg 체중 이상 또는 이들 사이 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위일 수 있다. 소변 및/또는 혈액은 의료 절차 또는 재조합 클로토 단백질의 제 1 투여 (용량) 이후에 (예로, 투여에 반응하여 및/또는 시간 경과 시 혈청 S-클로토 수준 및 변화를 측정하고/거나, 테스트하고/거나, 결정하기 위하여) 하나 이상의 시점, 예컨대 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 40분, 45분, 60분, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 2.5일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일, 4주, 1개월, 2개월, 3개월 이상의 초과, 미만, 동등, 이들 사이 및/또는 대략적 시점에서 수집될 수 있다.
하나 이상의 구현예는 S-클로토 활성 약물 산물의 독특한 제형물 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 조합의 생산 및/또는 (후속적) 투여를 포함한다. 담체는 IV 및/또는 볼루스 주사에 적합할 수 있다. 구현예는 또한 불활성 S-클로토가 생체내에서 활성화되어 동물 또는 인간 대상에서 생물학적으로 유효한 S-클로토를 방출할 수 있도록 S-클로토의 독특한 불활성 전구약물 제형물 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체와의 조합의 생산 및/또는 (후속적) 투여를 포함할 수 있다. 이러한 전구약물 제형물은 코팅 또는 시간-방출 제형물을 포함할 수 있다.
치료 방법, 용도 등
일부 구현예는 방법 또는 치료 방법 (예로, 하나 이상의 방법 단계를 포함함)을 포함한다. 일부 구현예는 환자에게, 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 대상 (예로, 이를 필요로 하는 대상)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물(들)의 투여는 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 미리 정해진 역치량 이상으로 상승시키거나, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 일정 기간 동안 미리 정해진 역치량 이상으로 유지하기에 충분할 수 있다.
조성물은 예를 들어 (i) 본 발명에 기재된 바와 같은 치료적 재조합 클로토 단백질 또는 이의 단편 또는 융합 단백질, 및/또는 (ii) 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 산물이 투여되는 환자에서의 수준(들)을 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지지하는 산물을, 선택적으로 (iii) 하나 이상의 추가적인 (활성 또는 불활성) 성분 또는 조성물과 함께 포함할 수 있다. 당업자라면 재조합 치료적 클로토 단백질 및 이와 관련된 산물, 조성물 및 방법과 관련하여 본원에 개략된 각각의 치료 효과, 적응증 및/또는 치료가 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 수준(들)을 (자연적으로) 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지지함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자라면 또한 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 수준(들)을 (자연적으로) 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지지하는 것과 관련하여 본원에 개략된 각각의 치료 효과, 적응증 및/또는 치료가 재조합 치료적 클로토 단백질 및 이에 관련된 산물, 조성물을 및 방법을 통해 투여함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 이에 따라, 간략하게 본 발명은 (i) 재조합, 치료적 클로토 단백질의 투여 및 (ii) 본원에 명백하게 고려된 바와 같은 본 발명의 건강 보조제 또는 영양제학적 조성물의 투여 둘 다에 관하여 각각의 기재된 치료 효과, 적응증 및/또는 치료를 다시 살펴볼 필요가 없다.
특정 구현예는 하나 이상의 질환, 장애, 부상 및/또는 (의학적) 병태를 치료하는데 사용되는, 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함할 수 있다. 유사하게, 구현예는 하나 이상의 질환, 장애, 부상 및/또는 (의학적) 병태를 치료 (또는 완환, 해결, 예방, 억제 등)하는 방법을 포함할 수 있다. 예시적인 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 임의의 이론에 구애받지 않고도, 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하면 대상에서 혈청 가용성 클로토 단백질 농도의 증가 (또는 사승)을 유발 또는 유도할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물의 "유효량"은 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 미리 정해진 역치량 이상으로 상승 또는 증가시키거나, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 미리 정해진 기간 동안 미리 정해진 역치량 이상으로 유지하기에 충분한 양일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 조성물의 "유효량"은 조성물이 투여되는 환자에서 유리한 치료 효과를 달성하는데 효과적인 양일 수　있다.
방법, 조성물 또는 (상승된) 단백질은 또한 하나 이상의 질환, 장애, 부상 및/또는 (의학적) 병태를 치료하는데 효과적일 수 있다. 예시적으로, 병태는 연약함, 골밀도 손실 또는 골 무기질 밀도 손실, 체중 감소, 근육 위축증 또는 퇴행, 근육량 저하, 근력, 악력, 다리 힘 또는 체력의 저하, 운동, 운동의 자유, 삶의 질 평가, 방출 분율 또는 운동 능력의 저하, 학습, 학습 능력, 기억 또는 지능 지수의 저하, 인지 기능 악화 또는 건망증, 인지 능력 또는 기능의 저하, 시냅스 가소성 또는 시냅스 기능의 저하 및 세포성 노화와 같은 연령 관련 병태 또는 노화 관련 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태)이거나, 이를 포함할 수 있다. 그러나, 병태가 또한 또는 대안적으로 임의의 신체적, 정신적, 정서적 또는 다른 결핍이거나 이를 포함하거나, 증가된 혈청 클로토 수준이 유리한 치료 효과를 본 발명에 기술된 것 및 당 업계에 공지된 것을 포함하여 제공할 수 있는 점을 요구하거나 원할 수 있음이 이해될 것이다.
방법, 조성물 또는 (상승된) 단백질은 또한 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매 또는 혈관성 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 운동신경 질환 (MND), 동맥 세동, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 섬유 근육통, 성인 발병 당뇨병, 관절염 또는 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 녹내장, 백내장, 황반 변성 및 기타 안과 질환/장애, 다발성 경화증 (MS), 루푸스 및/또는 궤양성 대장염과 같은 하나 이상의 노화 관련 병태 (또는 (인간) 노화와 관련된 병태)를 치료하는데 효과적일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 암을 치료하고, 환자에서 혈청 포스페이트 수준을 감소시키고, 이러한 치료를 필요로 하는 대상에서 당뇨병 또는 당뇨병 관련 병태 (예로, 제 1형 당뇨병 등)를 치료하고, 대상에서 심장 병태 (예로, 심혈관 질환, 좌심실 비대증 (LVH), 병리학적 LVH 및/또는 울혈성 심부전 등)을 치료하고, 대상에서 급성 폐 손상을 치료하고 (예로, 나노입자를 사용함), 산화제 손상에 대해 환자의 폐를 보호하고, 중증 환자에서 초기 급성 신장 손상을 검출하고, 대상에서 혈관 석회화를 약화시키고, 인지를 개선하고, 신장 및/또는 간 허혈증을 치료하고, (인간) 노화 내피 세포에서 스트레스 반응을 조정하고, 급성 및/또는 만성 신장 손상, 질환 또는 질환 진행 및/또는 요도 심근병증을 예방적으로 및/또는 치료적으로 치료하고/거나, 예방하고/거나, 약화시키고/거나, 정지시키고/거나 역전시키고, 흑색종 및 기타 암, 뿐만 아니라 DMD를 포함한 근육 위축증에서 노화 관련 요법 저항성을 역전시키거나 약화시키고, 노화 세포의 세포사멸을 표적하고, 바람직하게 이로써 조직 항상성을 회복시키는 것 및 기타 다양한 적응증 중 하나 이상에서 유용할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 하나 이상의 다른 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 병태는 본원에 기술되거나 개시될 수 있다. 이러한 병태는 당업자에게 클로토 혈청 수준과 관련되는 것으로 알려질 수 있다.
간략하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 조성물의 다양한 용량 형태 및/또는 투여 방법을 포함하고 고려한다. 일부 구현예는 경구 용량 형태로 투약되고/거나 경구로 투여될 수 있다 (예로, 팅크제, 정제, 캡슐, 분말, 차 등을 포함한 하나 이상의 편리한 형태). 예를 들어, 허브 또는 천연 성분의 알코올- 또는 글리세린-기반의 추출물로 구성된 팅크제가 유리 점 적기 병에 포장될 수 있다. 글리세린-기반의 팅크제는 단맛을 제공하여 제형물을 더 쉽게 삼킬 수 있게 한다. 팅크제는 또한 점적기로 투여될 수 있다. 팅크제는 라벨 상에 용량 범위 (예로, 성인 용량 당 20 내지 40 방울)를 포함할 수 있다.
캡슐 및 정제는 또한 보조제의 경구 투여를 위한 대중적인 형태이다. 예를 들어, 건조된 허브는 분말화되어 젤라틴 캡슐 내에 압축될 수 있다. 보조제는 캡슐 및/또는 정제로 공급될 수 있다. 보조제는 용기 상에 나열된 사용될 용량의 양을 갖는 병 또는 엔벨로프 내에 분말로서 공급될 수 있다. 용량 당 적절한 양의 분말이 또한 용량 캡슐을 개방하고 내용물을 음료 또는 음식에 분사함으로써 획득될 수 있다.
차 (예로, 허브 주입)는 일반적인 형태의 약초 치유법이며 약초를 복용하여 위로하는 방식이다. 적은 양의 약초를 컵에 넣고 끓는 물로 컵을 채우고 이를 가만히 담금으로써 허브 주입을 할 수 있다. 차 형태에서, 보조제의 허브 성분은 연장된 담금 시간에 따라 효능이 증가할 수 있으며, 차는 적어도 10분 동안 담금을 유지하는 것이 가장 좋다. 컵을 덮으면 (작은 종지가 잘 작동함) 증기가 안에서 유지되고, 차가 더 오래 뜨겁게 유지된다.
일부 구현예는 노화 관련 또는 다른 병태, 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 포유동물 대상에서 병태, 질환 또는 장애, 바람직하게는 노화와 관련된 병태, 질환 또는 장애를 치료하고/거나 예방하는 방법으로서, 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 급성 신장 손상 (AKI), 급성 신장 질환 (CKD) 또는 다른 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법으로서, 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 포유동물 대상에서 신장 손상을 치료하고/거나 예방하는 방법으로서, 본 발명의 조성물의 유효량을 선택적으로 예방적으로 의료 절차 또는 네프로톡신의 투여 이전에 및/또는 의료 절차 또는 네프로톡신의 투여 이후에 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본 발명의 조성물을 이를 필요로하는 인간 또는 비-인간 동물 (예로, 포유동물) 대상에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 조성물이 투여되는 대상은 다양한 병태 (예로, 장애, 질환, 손상, 질병 등)으로 고생하거나 이의 위험에 처할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 신체적, 정신적, 신경학적 또는 다른 (인간) 노화와 관련된 병태와 같은 하나 이상의 만성 질환 및/또는 노화 관련 병태를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예는 하나 이상의 메커니즘 또는 작용을 통해 치유, 회복, 장수 및/또는 다른 유익한 결과를 촉진할 수 있다.
조성물의 약제학적 유효량은 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 (혈청 밀리리터 당 가용성 클로토 단백질의 약 50 내지 3000 피코그램 이상 또는 이들 사이의 농도와 같은 미리 정해진 수준으로) 증가시키거나 상승시키기에에 충분할 수 있다. 조성물의 약제학적으로 허용가능한 양은 또한 또는 대안적으로 (예로, 미리 정해진 기간 동안) 미리 정해진 역치량 이상으로 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 유지하기에 충분할 수 있다.
특정 구현예에서, 단백질 수준에서 적합한 증가는 IGF-1 및/또는 Wnt 신호전달 경로를 조정하고/거나, β-글루쿠로니다제 및/또는 시알리다제 활성을 나타내고/거나, p53/P21 신호전달 경로를 억압하고/거나, 바람직하게 p53/P21 신호전달 경로의 억압을 통한 H2O2-유도된 세포 노화 및 세포사멸을 감소시킬 수 있다 (이에 효과적일 수 있다). (상승된) 단백질은, 바람직하게 다면발현 활성을 나타내고/거나, 바람직하게는 산화 스트레스, 성장인자 신호전달, 이온 항상성의 조절 및/또는 하나 이상의 이온 통로 단백질과 같은 세포 표면 상의 당단백질 및/또는 인슐린/인슐린-유사 성장인자-1 수용체와 같은 성장인자 수용체의 활성 조절에서 체액성 인자로서 기능하거나 기능적일 수 있다.
특정 구현예는 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 결정하는 것, 유효량을 계산하는 것, 대상의 혈청에서 가용성 클로토 단백질의 저하 속도를 결정하는 것, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도가 결정된 속도를 기초로 하여 제 2 미리 정해진 수준 이하가 될 후속 용량 시간을 계산하는 것, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도를 제 2 미리 정해진 수준부터 제 1 미리 정해진 수준까지 상승시키기에 충분한 조성물의 후속 용량의 양을 계산하는 것, 및/또는 대상의 조성물의 후속 용량의 양을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예는 (예로, 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질 농도의 결정된 수준을 기초로 하여) 조성물의 규칙적인 (예로, 매일) 용량 또는 용량 형태를 대상에게 처방하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예는 (치료) 방법을 포함한다. 치료 방법은 본 발명의 다양한 조성물의 치료 효과 또는 건강 이점의 연구 이후에 유사하고/거나 모델화될 수 있다. 다양한 조성물의 투여 결과는 인간 대상에서 모니터링된다. 일단 대상이 자발적으로 연구에 참여하기로 동의하고 환자 동의서에 서명하면, 신체 검사와 혈액 및 타액 검사를 받는다. 연구 프로토콜의 포함 판정기준을 충족시킬 시, 대상은 다음으로 연구에 등록된다. 예시적으로, 이 연구에는 현재 비타민 D 보조제를 사용하지 않고 밝은 환경에서 살지 않는 100명의 건강한 개인이 포함될 수 있다. KLVS 변이체 (클로토 과다 발현인자) 및/또는 클로토 유전자(들)의 다른 유전자 변이체를 갖는 대상은 연구에서 제외될 수 있다. 등록 후, 대상은 이중-맹검 연구에서 본 발명의 클로토 보조제 제형물 또는 위약의 3개월 공급을 투여받는다. 대상은 표시되지 않은 보조제 제형물 또는 위약 병을 무료로 받는다. 대상은 이 보조제를 3개월 동안 매일 복용한다.
이러한 3개월 기간의 종료 시, 공복 혈액 테스트를 위해 혈액을 채혈하고, 대상의 체중, 혈압을 측정하고, 알파 클로토 (α-클로토) 인간 가용성 ELISA 검정 키트 (예를 들어, 카탈로그 번호 27998, IBL America, Minneapolis, MN, USA)에 의해 결정된 혈장 알파 클로토의 농도와 함께 기록한다.
본 연구에서 인간 대상에 관한 연구/설계 절차는 하기와 같다.
연구 설계/절차:
최대 100명의 환자
기간: 보조제를 복용하기로 선택한 위약 환자를 포함하여 3개월 내지 제 1 종점, 교차, 6개월에서 제 2 종점.
다음을 포함하는 기본 설문지: 현재 약물 (스타틴, ARB), 영양 보조제, 혈압, 운동 빈도, 알코올 소비.
등록 이전:
혈액 시료 및 볼 면봉을 수집한다 (PI 사무소 또는 이동식 사혈 전문의)
KLVS 변이체 (클로토 과다발현인자)를 결정한다 - 볼 면봉을 연구실로 보내 KLVS 변이체 (클로토 과다발현인자) 상태를 결정한다.
클로토 수준, 비타민 D 및 E의 실험실 분석 및 전처리 기저선에 대한 기타 분석.
보충: 참가자에게 배송됨 (3개월 공급). (활성 보조제 및 위약 대조군, 활성 보조제 및 위약 대조군의 갯수가 동일함)
결과 측정: 참가자는 규정 준수 및 설문지 (운동, 혈압)를 모니터링하도록 모바일 애플리케이션을 다운로드한다.
3개월 및 6개월에 혈액 시료 수집을 추적한다.
보조제의 성분은 매우 낮은 위험을 부여하는 영양 성분으로 구성된다. 대상이 제형물에 대해 임의의 불편함 또는 부작용을 경험하면 산물의 복용을 중단하고 연구 담당 의사에게 연락하도록 지침을 받을 것이다.
임의의 유의한 부작용은 48시간 이내에 연구의 IRCM 기관 검토위원회 (IRB)에게 보고될 것이다.
예시 병태
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물(들) 및/또는 방법(들)으로 치료된 병태, 질환 또는 장애는 바람직하게, 예를 들어 연약함; 골밀도 손실; 골 무기질 밀도 손실; 체중 감소; 근육 위축증; 근육 퇴화; 근육량 저하; 근력 저하; 악력 저하; 다리 힘의 저하; 체력의 저하; 운동의 저하; 운동 자유의 저하; 삶의 질 평가의 저하; 방출 분율의 저하; 운동 능력의 저하; 학습의 저하; 학습 능력의 저하; 기억력의 저하; 지능 지수의 저하; 인지 기능 악화; 건망증; 인지 능력의 저하; 인지 기능의 저하; 시냅스 가소성의 저하; 시냅스 기능의 저하; 세포성 노화; 만성 신장 질환 (CKD); 만성 신장 질환- 무기질 및 뼈 장애 (CKD-MBD); 다낭성 신장 질환 (PKD); 상염색체 우성 다낭성 신장 질환 (ADPKD); 급성 신장 손상 (AKI); 급성 관상 괴사 (ATN); 급성 알레르기성 간질 신염 (AAIN); 사구체 신염; 신장 질환; 신부전; 알포트 증후군; 비-감뇨기 신부전; 알코올 중독; 고인산혈증; 근육 디스트로피 (MS); 제 1형 당뇨병; 제 2형 당뇨병; 심혈관 질환 (CVD); 심혈관 석회화; 뇌 혈관 부전; 혈관 석회화; 관상 동맥 질환; 심부전; 좌심실 비대; 요도 심근병증; 혈압의 이상; 염-민감성 고혈압; 조직 석회화; 석회화 죽상경화성 혈전 부하; 석회증; 가족 종양성 석회증; 암; 하나 이상의 종양; 미엘린 관련 질환; 미엘린화 질환; 신경 퇴행성 질환; 신경 혈관 질환; 진행성 핵상 마비 (PSP); 폼프병; 니만-픽병; 미세교아증; 파버병 (FD); 골량 질환; 골다공증; 골감소증; 골감소증 (구체적으로, 피질골의 BMD 손실); 폐기종; 폐 섬유증; 낭포성 섬유증; 특발성 (즉, 원인 불명) 폐 섬유증; 방사선 유도성 폐 손상; 간경변; 담도 폐쇄증; 심방 섬유증; 심내근 섬유증; (구) 심근 경색; 교아 흉터; 동맥 경화; 관절 섬유증; 크론병; 두푸이트렌 경축; 켈로이드; 종격동 섬유증; 골수 섬유증; 페이로니병; 신장생성 전신 섬유증; 진행성 과다 섬유증; 등복막 섬유증; 경피증/전신 경화증; 접착성 캡슐염; 피부 위축증; 흉선 위축증; 신장 간질 매트릭스의 축적; 사구체 경화증; 빈혈; 알부민뇨증; 단백뇨증; 불임; 알츠하이머병; 파킨슨병; 치매; 혈관성 치매; 근위축 측삭 경화증 (ALS); 운동 신경 질환 (MND); 심방 세동; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD); 섬유 근육통; 성인 발병 당뇨병; 관절염; 류머티스성 관절염; 골관절염; 녹내장; 백내장; 황반 변성; 다발성 경화증 (MS); 루푸스; 궤양성 대장염; 악액질; 비만; 비타민 D 관련 병태; 뼈 질환; 뼈 재형성을 통한 뼈 질환; 장 질환 및 관련 병태; 줄기세포 고갈; 바다 병; 공간 적응 증후군 (SAS); 멀미; 현기증; 비-알콜성 지방간염 (NASH), 간경변 및 알코올성 지방 간염:으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
클로토 혈청 수치는 또한 손상후 근육 치유와 같은 근육 회복과 관련되는 것으로서 보고되어 왔다. 구체적으로, 임의의 이론에도 구애받지 않고도, α-클로토의 연령 관련 저하는 전구 세포 미토콘드리아 기능장애 및 근육 재생 손상을 유발할 수 있다. 임상적으로, 이것은 근육 손상을 입거나 근육이 손상되는 수술을 받았던 노인의 치료로 이어질 수 있다. 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 바와 같이 예방적으로 및/또는 수술후에 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 시점(들)에서의 투여는 근육 재생을 증진하거나 지원할 수 있으며, 더욱 완벽한 회복을 유도할 수 있다. 혈청 클로토 단백질 수준은 또한 운동 선수 및 기타 환자의 근육 재생을 증진하거나 지원할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 바와 같이 예방적으로 (운동 전) 및/또는 운동 후 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
인간 및 비-인간 포유동물에서 연령 관련 연약함을 치료하기 위한 조성물의 투여
본 발명의 예시적인 구현예는 연령 관련 연약함을 (에로, 인간 또는 비-인간 동물에서) 치료하는 조성물의 투여에 관한 것이다. s-클로토는 인간 질환의 동물 모델에서 근육생성 줄기세포를 복구하고/거나, 근육 회복을 개선하고/거나, 섬유증을 억압할 수 있다. 따라서, s-클로토 수준을 증가시키는 조성물은 연약한 징후를 나타내는 노화된 인간 대상에서 근육 퇴화에 대응하기 위한 유망한 접근법일 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 대상에서 s-클로토의 유지 혈청 농도를 유지하기 위하여 정상인 및/또는 청년 (예로, 연령 18 내지 30세)의 범위 내에서 (예로, 임의의 만성 병태가 없음) 연약한 및/또는 고령의 사람 (예로, 연령 60 내지 95세)에게 s-클로토 수준을 증가시키는 조성물, 제형물 및 용량 그리고 이의 투여에 관한 것이다.
연장된 기간 동안 이러한 클로토 치료는 고령, 연약 또는 달리 생리학적 노화에서 하나 이상의 노화 관련 지표 또는 병태를 회복시키고/거나, 개선시킬 수 있다.
인간 및 비-인간 포유동물에서 근육 위축증을 치료하기 (감소시키기) 위한 조성물의 투여
본 발명의 예시적인 구현예는 골격근 조직량에 의해 측정되는 바와 같이 인간에서 근육 위축증을 치료 하는 (예로, 이의 (속도)를 감소시키는) 조성물의 투여, 바람직하게는 상기 조성물 및 근육 위축증에 대응하는 투여의 효과에 관한 지침을 제공하는 분자적 지표의 동시적 사용에 관한 것이다.
근육 위축증은 기아, 영양 결핍, 대사 스트레스, 당뇨병, 노화, 근육 디스트로피 또는 근병증, 뿐만 아니라 수많은 신경근육, 대사, 면역학적 및 신경학적 장애 및 질환을 포함할 수 있다. 노화 과정에서 근육 위축증이 발생할 수 있다. 근육 위축증은 또한 근육의 사용 감소 또는 비사용으로 인해 발생할 수 있다. 증상은 골격근 조직량의 저하를 포함한다. 인간 남성에서, 근육량은 연령 50세 내지 80세 사이에 1/3로 감소된다. 근육 위축증의 일부 분자적 특징은 유비퀴틴 라이게이즈의 상향조절 및 근섬유 단백질의 손실을 포함할 수 있다. 이들 단백질의 파괴는, 예를 들어 미오신의 특정 근육에서 (예로, 액틴의 특이적 성분인 3-메틸-히스티딘 생산을 측정함으로써) 모니터링될 수 있다. 크레아틴 키나제 (세포 손상 마커)의 방출이 또한 나타날 수 있다.
인간 및 비-인간 포유동물에서 근육 복구 또는 회복을 치료 (개선)하기 위한 조성물의 투여
클로토 혈청 수치는 또한 손상후 근육 치유와 같은 근육 회복과 관련되는 것으로서 보고되어 왔다. 구체적으로, 임의의 이론에도 구애받지 않고도, α-클로토의 연령 관련 저하는 전구 세포 미토콘드리아 기능장애 및 근육 재생 손상을 유발할 수 있다. 임상적으로, 이것은 근육 손상을 입거나 근육이 손상되는 수술을 받았던 노인의 치료로 이어질 수 있다. 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 바와 같이 예방적으로 및/또는 수술후에 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적절한 시점(들)에서의 투여는 근육 재생을 증진하거나 지원할 수 있으며, 더욱 완벽한 회복을 유도할 수 있다. 혈청 클로토 단백질 수준은 또한 운동 선수 및 기타 환자의 근육 재생을 증진하거나 지원할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 구현예는 본원에 기재된 바와 같이 예방적으로 (운동 전) 및/또는 운동 후 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
노령에서 및/또는 인간 수명에 걸친 정신 및/또는 인지 저하를 치료하기 위한 조성물의 투여
본 발명의 예시적인 구현예는 인지 기능(들)의 (노화 관련) 저하를 개선하고/거나 대응하기 위한 본 발명의 조성물의 투여에 관한 것이다. 본 발명의 시점에서, 본 발명의 조성물의 투여가 인간의 인지 저하에 대응할 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. 그러나, 클로토의 전신적 과다발현을 갖는 트랜스유전자 마우스는 다수의 학습 및 기억 테스트에서 대조군보다 우수하게 수행하였다. 마우스에서 클로토를 상승시키는 것은 또한 장기 강화 작용, 시냅스 가소성의 형태, 및 학습과 기억에서 핵심 기능을 갖는 N-메틸-D-아스파테이트 수용체 (NMDAR) 서브유닛의 강화된 시냅스 GluN2B를 증진하였다. GluN2B의 차단은 클로토-매개된 효과를 없앴다.
클로토 조절된 경로는 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매의 진행을 늦추는 것과 관련이 있을 수 있다. 53세 이상의 400명 이상의 건강한 남성과 여성의 뇌 스캔은 특정한 클로토 유전자 변이체의 단일 사본을 보유하는 사람들이 계획 및 의사 결정을 다루는 더 큰 뇌 영역을 갖고 있음을 발견하였다. 이 실험군에 관한 추가의 테스트는 확대된 우측 배측 전전두엽 피질 (rDLPFC)을 갖는 사람들이 일련의 정신적 업무에서 더 나은 점을 확인하였다.
약 5명 중 1명은 KL-VS로 알려진 유전자 변이체 또는 대립 유전자의 단일 사본을 물려받는데, 이는 심장 및 신장 기능을 개선하고, 평균적으로 인간 수명을 약 3년 늘인다. 그러나 뇌 기능에 관해서, rDLPFC가 더 큰 것은 사람의 정신 테스트 점수에서 단지 12%의 개선만을 차지하는 반면, 편집자가 지적한 바와 같이 KL-VS 대립 유전자의 하나의 사본을 보유하는 것은 rDLPFC의 구조 및 기능의 예상된 저하에 대항하는 수십 년의 반동을 부여하는 것으로 보인다. 따라서, KL-VS 이형접합성은 우측 배측 전전두엽 피질 (rDLPFC)에서의 더 큰 부피와 관련되는 것으로 보인다.
rDLPFC는 실행 기능에 중요하기 때문에, 연구자는 또한 개인의 작업 기억 및 처리 속도도 분석하였다. KL-VS 이형접합성은 검사된 수명에 걸쳐 실행 기능의 증진과 관련될 수 있다. 간단하게, 결과는 클로토 유전자의 변화가 더 큰 뇌 부피 및 더 나은 기능과 관련될 수 있음을 제시할 수 있다.
본 발명의 예시적인 구현예는 생체내 클로토 단백질 수준 및/또는 (세포성, 분자적 및/또는 하류의) 효과를 증대시키기 위한 (예로, 인간 수명 내내 인지를 증진시키고 인지 결함을 대응하기 위해) 본 발명의 조성물의 투여에 관한 것이다. s-클로토 수준 증가 조성물의 투여는 인지 기능을 (예로, 인간에서) 보존하고/거나 개선할 수 있다.
인간 장수 및/또는 수명을 치료하기 (연장시키기) 위한 조성물의 투여
예시적인 구현예는 평균 수명을 개선하기 위해 본 발명의 조성물을 생활연대 (예로, 출생부터 연령-매칭됨) 및 성별 매칭된 인간 대상에게 투여하는 것에 관한 것이다. 조성물 투여 (인간 대상의 실험군)로 획득된 평균 수명에 관한 결과는 조성물을 투여받지 않는 대상 (대조군) 및/또는 충분히 큰 인구에 대한 통계적 정보 (예로, 보험 통계표)와 신뢰가능하게 비교될 수 있다.
다른 임상 적응증을 치료하기 위한 조성물의 투여
본 발명의 예시적인 구현예는 인간 연약함 (증가), 장수 (감소), 세포성 노화 (감소), 근력 (저하), 골 손실 및 골밀도 (감소), 인지 (감소), 근육량 (저하), 체력 (저하), 악력 (저하), 다리 강도 (저하) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 임의의 연령 관련 또는 달리 연령 관련되지 않은 병태를 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 투여에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폐경 이후 감소되는 골 무기질 밀도 (BMD)를 증가시키고 (예로 남성이 아닌 여성에서), BMD (예로, 고령의 여성에서)를 증가시키고, (퇴행성) 골격근의 퇴화를 감소시키고, 걸음 걸이를 개선시키고, 공간 학습 및 기억, 운동, 운동의 자유, 삶의 질 평가, 방출 분율, 운동 변화 및 운동 개선 등을 개선시키는 (또는 이의 저하를 감소시킴) 등을 위한 본 발명의 조성물의 투여에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인지 악화 또는 건망증을 감소시키고, 인지 능력을 증가시키며, 인지 기능 및 시냅스 가소성을 개선하고, 학습, 학습 능력 또는 IQ의 저하를 감소시키고, 학습, 학습 능력 또는 IQ를 개선시키는 등을 위한 본 발명의 조성물의 투여에 관한 것이다.
급성 신장 손상 (AKI)을 치료하기 위한 조성물의 투여
이전에 급성 신부전 (ARF)으로 불린 급성 신장 손상 (AKI)은 경미한 기능 상실부터 부전에 이르기까지 신장 기능장애의 갑작스런 발병으로 종종 정의된다. AKI는 매년 입원 환자의 대략 4% 내지 7%에서 발생하는 보편적인 임상적 합병증이며 예후는 나쁠 수 있다. AKI와 관련된 사망률은 5% 내지 35%의 범위이다. 신장 클로토 발현은 AKI에 이어서 억압는 것으로 관찰되었다. 클로토의 아데노바이러스성 유전자 전달은 AKI에서 세포보호적일 수 있다.
급성 신장 손상 (AKI)은 매년 입원 환자의 대략 4.9% 내지 7%에서 보고되었다. AKI의 비율은 (입원한) 고령자에서 60%, 고령의 또는 중환자에서 20 내지 30%로 높을 수 있다. AKI는 또한 사망률 증가, 체류 기간 (LOS), 30일의 재투여 비율 및 병원 비용과 관련된다.
AKI는 신장 이식 또는 다른 수술, 급성 관상 괴사 (ATN), 급성 알레르기성 간질 신염 (AAIN), 신염 (예로, 사구체 신염), 신장 독성 (예로, 약물-유도된 신장 독성), 저혈압, 패혈증 또는 패혈증 병태 또는 기타 기여 요인(들)으로 인해 적어도 부분적으로 유발될 수 있다. 신장 이식 및 기타 수술은 신장에 급성 손상 또는 상처를 입히거나, 신장 질환 및/또는 부전을 유발할 수 있다. 신장 독성은 AKI, ATN, AAIN, 신염 등에 기여할 수 있다. 약물 (예로, 임상적으로 투여되거나, 처방, 불법 또는 기타 약물)은 모든 AKI 사례의 15 내지 25%와 관련되는 것으로 보고되었다. 조영제 단독으로는 병원에서 획득한 급성 신부전 (예로, 조영제-유도된 급성 신장 손상 CIAKI를 통해)의 전체 사례 중 10%를 차지하고, 신장 관류 감소 및 수술 신장 기능부전 이후의 병원 내 신장 기능 악화의 세 번째 주요 원인이 된다.
일부 경우에, 약물-유도된 AKI는 항균-유도된 신장 독성 (항균 처리의 결과)이거나, 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 (그램 음성) 박테리아 감염은 하나 이상의 아미노글리코시드, 예컨대 파로모마이신, 토브라마이신, 젠타마이신, 아미카신, 카나마이신 및 네오마이신 등으로 치료 될 수 있다. 아미노글리코시드는 신장 독성인 것으로 관찰되어 왔다. 표 47은 아미노글리코시드를 투여받은 성인 환자 상에서 수집된 치료 데이타를 제시한다. 표 47에 도시된 바와 같이, 보편적인 아미노글리코시드인 아미카신으로 치료받은 환자의 거의 23%가 급성 신장 질환을 발생시켰고, 아미카신으로 치료받은 환자의 17% 이상이 퇴원하기 전에 사망하였다. 젠타마이신 및 토브라마이신을 포함하여 다른 아미노글리코시드도 역시 신장 질환을 유도하였다 (또는 이와 관련되거나 이에 기여함).
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도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이, 다양한 연령군의 120만 명 이상의 성인 환자가 2010년에 아미노글리코시드로 치료되었다. 다른 항균제는, 예를 들어 페니실린, 앰피실린, 세팔로스포린, 설폰아미드, 시프로플록사신, 반코마이신, 마크로라이드, 테트라사이클린 및 리팜핀 등을 포함한다.
약물-유도된 신장 독성은 또한 아스피린 (아세틸살리실산), 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토 도락, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살사레이트, 술린닥 및 톨메틴 등과 같은 하나 이상의 비-스테로이드 항염증성 약물 (NSAID)로의 치료로부터 유발될 수 있다.
약물-유도된 신장 독성은 또한 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 저해제 (예로, 발데콕시브, 로페콕시브, 셀레콕시브 등), 양성자 펌프 저해제 (예로, 오메프라졸, 란소프라졸 등), 항경련제 (예로, 페니토인, 발프로산 등), 히스타민 H2 수용체 길항제 (예로, 니자티딘, 라니티딘, 파모티딘, 시메티딘 등), 이뇨제 (예로, 탄산 탈수효소 저해제, 루프 이뇨제 (예로, 부메타니드, 에타크린산, 토르세미드, 퓨로세미드 등), 칼륨 절약 이뇨제 (예로, 트리암테렌, 스피로놀락톤, 아밀로리드 등), 티아자이드 이뇨제 (예로, 인다파미드, 클로르탈리돈, 메톨라존, 메틸클로티아자이드, 하이드로클로로티아자이드, 클로로티아자이드, 벤드로플루메티아자이드, 폴리티아자이드, 하이드로플루메티아자이드 등), 또는 파마브롬, 만니톨 등과 같은 기타 이뇨제 중 하나 이상으로의 치료로부터 유발될 수 있다.
약물-유도된 신장 독성은 또한 신체의 신경 및 근육 세포를 통한 나트륨의 유도에 영향을 줄 수 있고, 종종 과잉 행동, 성급한 말, 나쁜 판단, 수면, 공격성 및 분노의 필요성 감소를 특징으로 하는 양극성 장애의 조증 에피소드를 치료하는데 사용할 수 있는 리튬으로의 치료로부터 유발될 수 있다. 리튬은 또한 조증 에피소드를 예방하거나, 이의 강도를 감축하는데 도움이 될 수 있다. 약물-유도된 신장 독성은 또한 금, 수은, 구리 또는 기타 원소 물질로의 치료 또는 이에 대한 노출로 인해 유발될 수 있다.
약물-유도된 신장 독성은 또한 킬레이팅제 부류의 약물이고, 경피증, 윌슨병 (소변을 통한 제거를 위해 축적된 구리에 결합), 시스틴뇨증 (시스테인과 결합하여 시스테인보다 가용성인 혼합된 디설파이드를 생성함)을 치료하는데 사용될 수 있는 (D-)페니실라민, 직접-작용 평활근 이완제 (예로, 히드라라진), 항경련제 (예로, 카리소프로돌, 사이클로벤자프린, 메탁살론, 메토카르바몰, 디아제팜, 클로리딘 및 기타 이미다졸린 화합물과 같은 벤조디아제핀, 티자니딘,, 바클로펜, 하이단토인 유도체 및 단트롤렌 등으로의 치료로 인해 유발될 수 있다.
약물-유도된 신장 독성의 다른 형태는 예를 들어, 조영제-유도된 신장 독성 (예로, 방사성 조영제-유도된 신병증 (CIN)으로도 알려져 있고, (요오드화된) 조영 매질에 대한 노출 이후에); 마약성- (오피오이드-) 유도된 신장 독성 (예로, 코카인, 헤로인 등과 같은 특정 마약 (예로, 오피오이드)의 사용 또는 남용 이후에); 화학요법-유도된 신장 독성 (예로, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴과 같은 암 치료제; 벤다무스틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 테모졸로미드, 멜팔란 등과 같은 알킬화제; 미토마이신 C, 블레오마이신, 안트라사이클린 및 관련 제제 등과 같은 항종양 항생제; 카페시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 젬시타빈, 사이타라빈 등과 같은 항대사물; 빈카 알칼로이드; 토포테칸; 에토포시듸 택산; 이리노테칸; 레날리도미드; 에리불린; 비소 트리옥사이드; 익사조밉 등과 같은 암 치료제로의 치료 이후에) 등을 포함할 수 있다. 실제로, 매우 다양한 신장 독성 약물이 신장 독성을 유발하여 AKI로 이어질 수 있다. 약물-유도된 신장 독성 (및 다른 형태의 AKI)은 치료하지 않으면 생명을 위협할 수 있으며 치료에 막대한 비용 (환자, 병원 및 보험사)이 발생할 수 있다.
본 발명의 구현예는 급성 신장 손상 (AKI), 만성 신장 질환 (CKD), 또는 다른 상태를 치료하거나 예방하는 (예로, 예방적으로 또는 적어도 하나의 사건에 반응하여) 방법을 포함할 수 있다. 방법은 본 발명의 조성물을 이를 필요로하는 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 또한 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 (미리 정해진 기간 동안 미리 정해진 역치량 이상으로 대상의 혈청 가용성 클로토 단백질의 농도를 상승시키고/거나 유지하도록) 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조성물은 (i) 치료적 재조합 클로토 단백질 또는 이의 단편 또는 융합 단백질, 및/또는 (ii) 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 산물이 투여되는 환자에서의 수준(들)을 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지원하는 산물을, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 성분 또는 조성물과 함께 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 병태는 (i) 급성 관상 괴사 (ATN), 급성 알레르기성 간질 신염 (AAIN), 신염, 사구체 신염 및/또는 신장 독성; 또는 (ii) 패혈증, 신장 이식 또는 다른 수술 또는 의학적 절차, 급성 관상 괴사 (ATN), 급성 알레르기성 간질 신염 (AAIN), 신염, 사구체 신염, 신장 독성 또는 저혈압으로 인해 적어도 부분적으로 유발되는 AKI를 포함할 수 있다. 병태는 약물-유도된 (예로, 아미노글리코시드-유도된) 신장 독성을 포함할 수 있다. 단백질은 예방적으로, 예를 들어 신장 이식, 신장 독소 투여, 또는 AKI를 유발하거나 이에 기여할 것으로 알려진 또는 기대되는 다른 활성, 치료, 또는 사건 이전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 단백질은 AKI에 반응하여, 신장 이식 또는 다른 수술, 아미노글리코시드 또는 다른 신장독소 투여, 또는 AKI를 유발하거나 이에 기여할 것으로 알려진 또는 기대되는 다른 활성, 치료, 또는 사건 이후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 신장 독소 또는 다른 약물은 예를 들어, 하나 이상의 아미노글리코시드 (예로, 파 로모마이신, 토브라마이신, 젠타마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신 등); 하나 이상의 항진균제 (예로, 암포테리신 B, 플루사이토신 등); 하나 이상의 조영제 (예로, (요오드화) 방사성 조영 매질, 약 1.5 : 1의 요오드 대 분자 비를 갖는 고-삼투압 조영 매질 (HOCM), 약 3 : 1의 요오드 대 분자 비를 갖는 저-삼투압, 비이온성 조영 매질 (LOCM), 약 6 : 1의 요오드 대 분자 비를 갖는 이소몰 (이소삽투압) 조영 매질 (IOCM) 등); 하나 이상의 항레트로바이러스성 제제 (예로, 아데포비르, 시도포비르, 테노포비르, 포스카르네트 등); 하나 이상의 암 (또는 화학요법) 치료제 (예로, 시스플라틴, 카보플 라틴, 옥살리플라틴, 알킬화제 (예로, 벤다무스틴, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 테모졸로미드, 멜팔란 등), 항종양 항생제 (예로, 미토마이신 C, 블레오마이신, 안트라사이클린 및 관련 제제 등), 항대사물 (예로, 카페시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 프랄라트렉세이트, 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 젬시타빈, 사이타라빈 등), 빈카 알칼로이드, 토포테칸, 에토포시드, 택산, 이리노테칸, 레날리도미드, 에리불린, 비소 트리옥사이드, 익사조밉 등); 하나 이상의 비스포스포네이트 또는 이의 유도체 (예로, 졸레드로네이트/졸레드론산, 이반드로네이트, 알렌드로네이트, 알렌드로네이트/콜레칼시페롤, 에티드로네이트, 리세드로네이트 (선택적으로, 탄산 칼슘과 함께), 파미트로네이트, 틸루드로네이트 등); 및/또는 코카인, 헤로인 등과 같은 하나 이상의 마약 (예로, 오피오이드)이거나, 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예는 본 발명의 조성물을 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 방법은 AKI 또는 AKI와 관련된 하나 이상의 병태를 치료하거나 예방하기 위해 (예방적으로) 인간 또는 비-인간 대상에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 대상에서 혈청 가용성 클로토의 수준을 결정하는 단계, 대상에서 혈청 가용성 클로토 수준을 미리 정해진 수준 또는 정상 수준의 백분율로 증가시키기에 충분한 본 발명의 조성물의 제 1 용량을 계산하는 단계, 대상에게 경구, 볼루스 또는 점진적 투여와 같은 제 1 용량을 투여하는 단계, 대상의 혈청에서 예컨대 제 1 용량의 투여 후 가용성 클로토의 저하 속도를 결정하는 단계, 후속 용량 시간 및 양을 계산하는 단계, 및/또는 대상에게 단백질의 후속 용량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
만성 신장 질환 (CKD)을 치료하기 위한 조성물의 투여
임의의 이론에 구애받지 않고, 클로토는 인간 만성 신장 질환에 관여될 수 있다. 혈액 순환에서 클로토는 만성 신장 질환 (CKD) 2 단계에서 조기에 감소하기 시작하고, 소변 클로토는 가능하게 심지어 CKD 1 단계에서 더 조기에 감소하기 시작한다. 따라서, 가용성 클로토는 신장 기능 저하의 조기 및 민감한 마커로서 작용할 수 있다. 더욱이, 전임상 동물 데이타는 클로토 결핍이 단지 바이오마커일뿐만 아니라, 심혈관 질환 및 무기질 대사 교란을 포함한 CKD 진행 및 신장외 CKD 합병증에 대한 병원성 인자임을 지지하고 있다. 클로토 감소의 방지, 내인성 클로토 생산의 재활성화 또는 외인성 클로토 보충은 모두 신장 섬유증의 약화, CKD 진행의 지연, 무기질 대사의 개선, 심근병증의 개선 및 CKD에서의 혈관 석회화의 완화에 모두 기여할 수 있다.
CKD는 ESRD의 위험이 높은 신장 기능의 점진적인 악화를 특징으로 한다. CKD 위험은 연령에 따라 증가하며, CKD 단계 ≥ 3 사례의 약 절반은 70세 이상의 대상에서 발생한다. CKD는 노화가 가속화된 상태로서 관찰될 수 있다. 25세 내지 34세의 투석 환자의 심혈관 사망률의 상대적 위험은 75세 이상의 CKD가 아닌 환자와 유사하다. 심혈관 질환은 CKD 및 ESRD 환자의 주요 사망 원인이다. CKD 및 ESRD 환자는 신장 클로토 발현이 낮고 순환하는 클로토의 수준도 낮다. CKD의 초기 단계에서의 신장 클로토 결핍은 주로 생존 신장 세뇨관의 손실보다는 클로토 발현의 억압에서 기인한다. 더욱이, 일부 투석 환자는 여전히 검출가능한 순환하는 클로토를 갖으며, 신장 클로토 발현이 완전히 억제되지 않고 클로토는 신장의 기원이 명백하지는 않지만 신장외 출처(들)로부터 나올 수 있음을 시사한다. 신장 생산이 실패할 때 클로토의 신장외 출처를 확립하고 이들이 상향조절할 수 있는 방식을 특성화하는 것이 가장 중요하다.
본 발명의 조성물의 투여는 CKD에서 동반 사망을 예방하고, 지연시키고, 이의 부담을 감소시키도록 도울 수 있다.
장 질환 및 관련 병태를 치료하기 위한 조성물의 투여
임의의 이론에 구애받지 않고, 카잘의 간질 세포 (ICC)는 연동 운동을 조절하는 지속적인 기능을 갖는 GI관의 다른 세포 사이에 있는 간질 세포이다. ICC (주요) 기능은 장에서 평활근 수축의 리듬을 조절하는 전기 신호를 생성하는 것일 수 있다 (위창자계의 다른 영역에는 연동으로 불리는 수축의 빈도가 상이함). ICC는 장 (및 다른 많은 기관)에서 중간엽 줄기세포의 이동을 안내할 수 있다.
장에서, ICC는 클로토에 의해 생성되고/거나 활성화될 수 있어, 최적화 재생 과정을 유도할 수 있다. 클로토 녹아웃 마우스에서, ICC가 감소되어 연동 과정의 손상을 유도하고, 노인에서 발생하는 장 장애를 모방한다.
본 발명의 조성물의 투여는 적어도 장에서 연동 과정의 손상을 예방하고, 지연시키고, 감소시키고/거나, 재생 과정을 증대시키고/거나, 지원하고/거나, 최적화하도록 도울 수 있다. 이들 효과는 추가로 장 건강을 지원하고/거나, 장 질환 및 관련된 병태의 발생 및/또는 중증도를 예방하고, 지연시키고, 감소시킬 수　있다.
연령 관련 병태의 요법적 치료
연구자들은 입원한 고령 환자에서 임상 상태의 지표로서 보편적으로 받아들여지는 클로토와 생물학적 매개변수 사이의 연관성을 발견하였다. 본 연구자들은 594명의 입원한 고령의 환자 (65 내지 99세)의 KL 유전자 좌위에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) rs9536314, rs1207568 및 rs564481을 유전형 분석하고, 연속적으로 노인과 병동에 참석하여 이들 KL 변이체와 생물학적 정량적 형질을 공분산 및 유전적 위험 점수 모델의 분석을 사용하는 테스트하였다. rs9536314와 헤모글로빈, 알부민 및 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (HDL-C)의 혈청 수준의 유의한 연관성, 뿐만 아니라 rs564481과 헤모글로빈, 공복 인슐린 및 공복 포도당의 혈청 수준의 유의한 연관성이 관찰되었다. 성별 분류 분석은 이러한 연관성을 검증하였고, KL 유전형과 HDL-C, 공복 포도당 및 공복 인슐린 수준의 연관성은 여성 성별에 의해 주도될 수　있는 반면, 헤모글로빈의 혈청 수준과의 연관성은 남성 성별에 의해 주도될 수 있음을 시사한다. KL 유전형과 크레아틴 수준의 연관성은 여성에서 발견된 한편, 인슐린 유사 성장인자-1 (IGF-1) 및 림프구 계수 (LC)와의 연관성은 남성에서 발견되었다. 유전적 위험 점수 (GRS) 모델은 KL SNP 및 헤모글로빈, 총 콜레스테롤 및 HDL-C 사이에 유의한 연관성을 추가로 검증하였다. GRS-태그화된 접근법으로의 성별 분류 분석은 여성에서 HDL-C, 공복 포도당 및 공복 인슐린 수준 및 남성에서 헤모글로빈 및 LC와의 연관성을 검증하였다. 결과는 KL 유전자 좌위가 입원한 고령 환자에서 지질, 공복 포도당, 알부민 및 헤모글로빈의 혈청 수준과 같은 정량적인 형질에 영향을 미칠 수 있으며, 크레아틴, IGF-1 수준 및 LC에 대해 제시된 일부 성별 차이는 이로써 연령 관련 질환 및 수명에 기여할 수 있는 유전적 요인 중 하나가 된다.
본 발명의 구현예는 본 발명의 조성물을 이를 필요로 하는 대상 (예로, 선택적으로 고령 및/또는 노화 관련 병태, 낮은 내인성 s-클로토 단백질 발현 및/또는 연령 관련 병태의 증상 또는 수명 감소로 고생하는, 개인 또는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물(들)의 투여는 혈액 s-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 투여는 노화 관련 병태의 해로운 효과를 역전시키거나 이에 대응하고/거나, 양성 치료 방식으로 총 콜레스테롤, HDL-C, 공복 포도당, 공복 인슐린, 알부민, 크레아틴, IGF-1, 헤모글로빈 및 림프구 계수의 혈청 수준과 같은 정량적인 형질에 영향을 줄 수 있다 (예로, 입원한 및/또는 고령의 환자에서).
예방적 조성물 투여
전술한 내용에 추가하여, 본 발명의 구현예는 예방적 목적 및/또는 특정 건강 속성의 유지를 위해 본 발명의 조성물을 이를 필요로하는 개인 또는 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 조성물의 투여는 선택적으로 진단된 노화 관련 병태로 아직 고생하지 않는 나이든 환자에서 젊음을 유지하도록 도울 수　있다. 이에 따라, 본 발명의 특정 구현예는 환자의 병태를 치료하는 것에 관련되고/거나 이를 포함할 수 있는 한편, 다른 구현예는 하나 이상의 병태를 예방, 예방하고/거나. 이의 발생을 억제하고/거나, 예방적으로 해결하는 것에 관련되고/거나 이를 포함할 수 있다.
유전적 결함을 치료하기 위한 외인성 S-클로토의 투여
본 발명의 예시적인 구현예는 공지된 인간 유전적 결함을 치료하기 (예로, 교정)하기 위한 외인성 S-클로토의 투여에 관한 것이다. 예를 들어, 가족 종양성 석회증 및 클로토 돌연변이를 갖는 13세 소녀가 보고되었다. 가족 종양성 석회증은 FGF23 또는 GALNT3에서의 불활성화 돌연변이로 인한 이소성 석회화 및 고인산혈증을 특징으로 하는 상염색체 열성 대사 질환이다. FGF23은 포스페이트의 신장 배출에 필요한 호르몬인 한편, GALNT는 FGF23의 성숙과 분비에 기여하는 효소이다. 클로토 유전자의 동형접합 돌연변이는 13세 소녀에서 확인되었다. 클로토는 FGF23에 의해 방출된 신호를 이의 수용체로 전달하는데 필요한 분비 단백질을 인코딩한다. 외인성 인간 재조합 S-클로토의 투여는 가족 종양성 석회증과 관련된 기능장애 및 증상을 해결하도록 고도로 표적화되고 효과적인 요법을 구성한다.
다른 성분(들)과 조합하여 S-클로토 및/또는 보조제를 포함하는 조성물 및 치료
적어도 일 구현예에서, 조성물, 약물, 용량 또는 요법적 치료는 치료적 인간 재조합 가용성 알파 클로토 (S-클로토) 단백질 및 내인성 클로토 생성 또는 이의 하나 이상의 성분을 증가시키는 천연 보조제 조성물을 포함할 수 있다. 내인성 또는 외인성 (재조합) 여부와 상관없이 클로토는 또한 인간 건강 및 복지의 하나 이상의 양태에 영향을 미치도록 다른 화합물 및/또는 성분과의 부가적 또는 상승 작용적 문제에 작용할 수 있다. 예를 들어, 치료적 인간 재조합 가용성 알파 클로토 (S-클로토) 단백질 및/또는 내인성 클로토 생성을 증가시키는 천연 보조제 조성물을 하나 이상의 추가적인 활성 성분과 조합하여 및/또는 동시에 포함하는 치료는 인간 환자에게 유익할 수 있다. 이러한 치료는 클로토 단백질 및/또는 다른 성분(들)이 치료 효과를 갖을 수 있는 임의의 인간 병태에 예방적이거나 반응할 수 있다. 이러한 병태는 예를 들어 연령 관련 병태, 임상적 (예로, 대사) 병태, 만성 또는 급성 병태 등을 포함할 수 있다. 특이적 병태의 특정한 비-제한적인 예는 본원에 개시되어 있다.
S-클로토는 성장/분화 인자 11 (GDF-11)과 같은 다른 혈액 매개 항노화 화합물과 함께 인체에 존재할 수 있다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 치료적 S-클로토는 치료적 GDF-11과 함께 (예로, 동시에, 순차적으로 및/또는 조합하여) 공동-투여될 수 있다. 이러한 투여는 일부 구현예에서 부가적인 또는 상승 작용적 항노화 또는 다른 효과를 갖을 수 있다. 마찬가지로, S-클로토를 인간 대상에게 CCL11에 대한 (중화) 항체 또는 이의 억제제와 함께 공동-투여하는 것은 노화 또는 다른 병태애 대응하도록 연합하여 작용할 수 있다 (CCL11 (에오탁신-1으로도 알려짐)는 줄기세포 회춘의 음성 조절인자인 것으로 이해됨). S-클로토는 또한 또는 대안적으로 다른 에오탁신, 예컨대 에오탁신-2 (CCL24) 및/또는 에오탁신-3 (CCL26)과 공동-투여될 수 있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 형질전환 성장인자 β-1(TGF-β1의 억제제 또는 이에 대한 항체와 공동-투여될 수 있다. S-클로토 투여는 신장 및 다른 조직 섬유증을 유발하는 내인성 항-세포성 상피 대 중간엽 이동 (항-EMT)에 관여하는 TGF-β1신호 경로의 작용을 방해할 수 있다. 항-EMT는 또한 EMT를 억제하는 것이 암 세포 상에 전이 능력을 부여할 수 있는 암 세포에 관련이 있으며, 이러한 후자의 과정은 클로토에 의해 방해되는 것으로 이해된다. 이에 따라, S-클로토 및 형질전환 성장인자 β-1(TGF-β1의 억제제 또는 이에 대한 항체의 공동-투여는 상승 작용적 또는 부가적인 효과를 갖을 수　있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 인슐린 성장인자-1 (IGF-1)에 대한 항체 또는 이의 억제제와 함께 공동-투여될 수 있다. 클로토는 세포내 인슐린/IGF-1 신호전달 연쇄반응을 억제하는 호르몬인 것으로 이해되며, 이 억제는 포유동물의 세포 및 유기체 수준에서 산화 스트레스에 대한 저항성을 증가시킨다; 메커니즘은 수명 연장을 위해 진화적으로 보존되는 것으로 고려된다. 이에 따라, S-클로토 및 인슐린 성장인자-1 (IGF-1)의 억제제 또는 이에 대한 항체의 공동-투여는 상승 작용적 또는 부가적인 효과를 갖을 수　있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 비타민 D (예로, 비타민 D3) 또는 1,25-디하이드록시 비타민 D3 [1,25(OH)2D3], FGF-15, FGF-19 및/또는 클로토 β와 조합하여 투여될 수 있으며, 수많은 연구에서 클로토 α-Kl, FGF23 및 1,25(OH)2D의 상호 조절된 양성/음성 피드백 작용 및/또는 클로토 β-Kl, FGF15/인간 FGF19 및 담즙산/콜레스테롤 대사를 조절하는 담즙산으로 구성된 유사한 조절 연결망이 관여하는 무기질 항상성의 포괄적인 조절 과정을 밝혀주었기 때문이다. 이러한 공동-투여는 신체의 수많은 병태 및/또는 과정에 상승 작용적 또는 부가적인 효과를 갖을 수 있다. 일부 구현예에서, S-클로토는 FGF-21과 조합하여 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 탄산 탈수효소 저해제, 예컨대 아세타졸아미드, 메타졸아미드, 디클로르 펜아미드, 도르졸아미드, 브린졸아미드 및/또는 토피라메이트와 공동-투여될 수 있다. 이러한 조합적 투여는 강직성 척추염 (AS), 류마티스 관절염 (RA) 및 다양한 기타 병태의 치료에 유용할 수 있다. 다양한 연구는 뼈의 재흡수 증가가 AS 및 RA의 특성이며 탄산 탈수효소 저해제는 뼈의 재흡수를 억제함으로써 항관절염 작용을 담당하는 것을 보여주었다. 뼈의 수준에서, S-클로토는 상이한 메커니즘을 통해 최근에 확인된 파골세포 기능 조절인자인 TRPV5에 작용하여 뼈의 재흡수 및 포스페이트 방출을 자극시킨다. S-클로토 투여로 인한 1,25(OH)2D3의 증가된 수준은 파골세포 분화 및 뼈의 재흡수를 자극하여 이로써 포스페이트 방출을 자극할 수 있다. 따라서, S-클로토 및 탄산 탈수효소 저해제의 공동-투여는 특히 뼈 건강 증진, 구체적으로 AS 및 RA에서 부가적인 또는 상승 작용적 효과를 갖을 수 있다.
S-클로토는 중증 활성 류마티스 관절염의 치료를 위해 하나 이상의 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD)과 함께 투여될 수 있다.
S-클로토는 사이클로스포린이 클로토 mRNA 및 단백질을 감소시키고 산화 스트레스를 증가시켜 사이클로스포린-유도된 신장 손상 (CsA)을 유발하기 때문에 사이클로스포린과 조합하여 투여될 수 있다. 클로토 mRNA 및 단백질의 관련된 감소 및 산화 스트레스 증가는 S-클로토의 외인성 공동-투여에 의해 대응될 수　있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 로사르탄 및/또는 사이클로스포린과 공동-투여될 수 있다. 안지오텐신 II 제 1형 (AT1) 수용체 차단제인 로사르탄으로의 치료는 사이클로스포린으로 관찰되는 클로토 발현의 감소를 역전시켰다. 로사르틴은 또한 신장 조직학을 동시에 개선시켰다 (로사르탄은 사이클로스포린에 의해 유발된 세관 간질 섬유증을 감소시킴).
일부 구현예에서, S-클로토는 아미카신, 젠타마이신, 토브라마이신 등과 같은 하나 이상의 아미노글리코시드와 공동-투여될 수 있다. 이러한 치료는 아미노글리코시드가 (그램 음성) 병원균 감염을 치료하는데 사용될 때 신장 독성 및/또는 급성 신장 손상 (AKI)을 예방하는데 유용할 수 있으며, 이는 감염을 치료하는 아미노글리코시드의 용도를 크게 확장시킬 수 있다. S-클로토의 AKI를 차단하는데 사용되었던 베라파밀 및/또는 딜티아젬과의 공동-투여는 AKI로부터의 신장 기능장애의 치료 및/또는 예방에서 치료제일 수 있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 테스토스테론 또는 안드로겐 수용체 (AR) 상향조절 화합물과 공동-투여될 수 있다. 최근의 보고서는 인성, 심리학적 안정 또는 기분과 관련하여 남성의 테스토스테론 치료의 유익한 효과가 전혀 관찰되지 않음을 보여준다. 또한, 심혈관 건강, 성기능, 신체 기능, 기분 또는 인지 기능에 대한 낮은-T에 대한 테스토스테론 보충 처방은 무작위 임상 시험으로부터 지지받지 못하는 것으로 고려되었다. 그러나, 테스토스테론 보충은 일관되게 근력을 증가시키는 것으로 밝혀졌지만, 신체 기능에 유익한 영향을 미치지 않았다. S-클로토를 테스토스테론 및/또는 안드로겐 수용체 (AR) 상향조절 화합물과 조합하여 투여하면 테스토스테론 또는 S-클로토가 이들 처리군에서 단독으로 갖을 수 있는 임의의 효과를 능가하여 고령의, 연약한 또는 낮은 T 남성의 근력 및/또는 신체 기능을 유의하게 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 에스트로겐 또는 에스트로겐 호르몬 (예로, 에스트라디올, 에스트리올, 에스트론 등)과 공동-투여될 수 있다. 이러한 공동-투여는 여성 (예로, 월경, 폐경기 또는 폐경기 전이 여성)의 건강 지표를 개선하고/거나, 불임, 다낭성 난소 질환 또는 장애, 비만, 호르몬 불균형 및 관련 병태 및/또는 기타 여성 건강 병태를 치료할 수 있다.
일부 구현예에서, S-클로토는 하나 이상의 향정신제 (스마트 약물 또는 인지 증진제으로도 불림)과 공동-투여될 수 있다. 향정신제 약물, 보조제 및/또는 기타 물질은 인지 기능, 구체적으로 실행 기능, 기억, 창의성, 동기 부여, 업무 능력 (업무를 수행하는 동기 부여), 수행력 (특히 많은 노력을 요구하는 지루한 업무)을 개선시킬 수 있고, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 ADHD와 같은 장애에 기인한 인지 또는 운동 기능 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 양태의 인지를 개선하는 것으로 알려진 가장 공통적으로 사용되는 약물 부류는 자극제, 특히 전전두엽 피질에서 도파민 수용체 D1, 아드레날린 수용체 A2 또는 둘 다의 수용체의 직접 작동제 또는 간접 작용제로서 작용함으로써 인간의 인지 증진 효과를 나타내는 자극제의 부류이다. 자극제는 예를 들어, 특히 ADHD를 갖는 개인에서 인지 기능의 범위 (예로, 억제성 조절, 에피소드 기억, 작업 기억 및 주목 양태)에 유익할 수 있는 암페타민 (예로, 암페타민, 덱스트로암페타민, 리스덱스암페타민 등); 신체 수행력, 주의력, 반응 시간 등을 개선할 수 있는 1,3-디메틸아밀아민과 같은 디메틸아밀아민 (DMAA); 다양한 인지 기능을 (예로, 작업 기억, 에피소드 기억 및 억제성 조절, 주목의 양태 및 계획 잠복기)를 개선할 수 있는 메틸페니데이트 - 치환된 펜에틸아민; 특히 수면 장애를 받는 개인에서 주의력을 증가시키고, 추론 및 문제 해결을 용이하게 하며, 기면증, 근로 수면 장애 및 수면 무호흡 치료 후 남은 주간 졸림을 치료할 수 있는 각성 촉진제 등으로서 기능할 수　있고 진통제 (예로, 아르모다피닐, 모다피닐 등); 주의력, 수행력 및/또는 기억을 증가시킬 수 있는 크산틴 (예로, 카페인 등); 니코틴 등을 포함한다.
일부 구현예에서, S-클로토는 당 업계에 공지된 바와 같이 골다공증 및/또는 골감소증 약물 중 하나 이상과 공동-투여될 수 있다. 클로토의 부재가 동물에서 뼈의 무기질 밀도의 감소를 유도할 수 있기 때문에, 클로토는 뼈의 무기질 밀도를 조절하는 역할을 담당할 수 있다. 예를 들어, 클로토 녹아웃 마우스는 시간 경과 시 감소된 뼈의 무기질 밀도를 나타낸다. 클로토 발현은 시간 경과 시 클로토 녹아웃 마우스에 의해 관찰된 뼈의 무기질 밀도 감소와 같은 뼈의 결함을 복구할 수 있다. 역학적 연구는 다양한 클로토 유전자 변이체 및 뼈의 무기질 밀도 및 손 관절염의 유병률의 변화 사이의 연관성을 보여주었다.
S-클로토는 화학치료제와 같은 하나 이상의 항암 치료 및/또는 예방과 조합하여 투여될 수 있다. 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 같은 폐암에서, S-클로토 투여는 시스플라틴 및/또는 다른 화학요법에 대한 폐암 세포의 내성에 영향을 줄 수 있다. 또한, S-클로토는 폐암, 위암, 췌장암 (샘암종) 및 기타 형태의 암에서 잠재적인 종양 억제제로서 작용할 수 있다. S-클로토는 간세포 암종 (HCC)의 치료를 위해 소라페닙 화학요법과 조합하여 투여될 수 있다. 가용성 클로토 단백질로의 치료뿐만 아니라 클로토의 과다발현은 간세포 성장을 시험관내 및 생체내에서 감소시킬 수 있다. S-클로토 공동-투여로 치료될 수 있는 다른 암 유형에는 간세포 암종 (HCC), 중추신경계 (CNS) 암 (예로, 뇌 (예로, 교아종, 뇌인두종, 속질모세포종 및 수막종), 척수 및 기타 종양, 림프종 등) 및 (전이성) 결장암 등을 포함한다.
S-클로토는 또한 암 환자에서 화학요법-유도된 연약함을 치료하도록 화학치료제(들)과 조합하여 투여될 수 있다. S-클로토는 또한 다른 알려진 치료에 이어서 암 환자에서 암-유도된 연약함을 치료도록 투여될 수 있다.
S-클로토는 신장 투석 또는 다른 절차와 조합하여 투여될 수 있다. S-클로토는 연약함이 투석 시 환자의 나쁜 결과와 연관되기 때문에 투석 환자의 연약함을 치료하도록 투여될 수 있다.
S-클로토는 적절한 양의 BDNF가 뇌의 정상 신경 회로를 개발하고 유지하는데 도움을 줄 수 있기 때문에 하나 이상의 알츠하이머병 치료 또는 예방 또는 뇌 유래 신경영양인자 (BDNF)와 조합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 클로토가 중추신경계 (CNS)에 진입하여 CNS 관련 병태를 치료하거나 예방하기 위하여 혈액-뇌 장벽을 교차하는 클로토의 능력을 증가시키는 하나 이상의 분자와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, S-클로토 또는 BDNF는 모두 혈액-뇌 장벽을 교차하지 못하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 구현예는 알츠하이머병을 치료하고/거나 알츠하이머병이 걸리지 않은 개인의 인지 능력을 개선시키기 위해 S-클로토 및/또는 BDNF와 함께 S-클로토의 CNS로의 투여를 위해 혈액-뇌 장벽 전달 기법을 이용하는 것을 포함한다.
S-클로토는 5' 아데노신 모노포스페이트-활성화 단백질 키나제 (AMPK) 또는 AMPK 활성화 약물, 또는 지방산 산화 및 자가포식을 포함하여 세포성 ATP 공급을 보충하는 신호전달 경로를 양성으로 조절하거나, 신생당생성, 지질 및 단백질 합성을 포함하여 ATP 소모 생합성 과정을 음성으로 조절하는 성분과 조합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 하나 이상의 항당뇨병 약물, 예컨대 인슐린, 플로리드진 또는 항산화 티론과 조합하여 투여될 수 있으며, 이들 조합 치료는 당뇨병 장애에서 생성된 산화 스트레스에 의한 신장 손상의 예방에서 장점을 갖을 수 있다. S-클로토의 제 1 형 당뇨병에 대한 다른 항당뇨병 약물과 공동-투여는 인테그린 β1-FAK/Art 경로의 활성화를 통해 β-세포 세포사멸을 억제함으로써 β-세포를 보호할 수 있으며, 이는 캐스파제 3 절단의 억제를 유도한다.
S-클로토는 과체중 및 비만 당뇨병 대상에서 혈당 조절 및 혈관 기능을 개선시키기 위해 메트포르민과 같은 하나 이상의 제 2형 항당뇨병 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
S-클로토는 하나 이상의 혈압 약물, 칼슘 조절제, 또는 만성 신장 질환 (CKD)의 치료 또는 예방과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 연조직 석회화는 CKD의 현저한 특징이며, 클로토는 인산뇨증을 강화하고 사구체 여과를 유지하며 혈관 평활근에 의한 포스페이트 흡수를 직접적으로 억제함으로써 혈관 석회화를 개선시킬 수 있다.
S-클로토는 TM5441 또는 PAI-1의 다른 저해제 (플라스미노겐 활성인자 1)와 조합하여 투여될 수 있고, 이는 PAI-1 억제 또는 결핍이 노화의 발생을 지연시키고, 장기의 구조 및 기능을 보호하면서 클로토 결핍 (kl/kl) 마우스의 수명을 연장하는 것으로 생각되기 때문이다.
S-클로토는 시르투인 1 (SIRT1) 또는 레스베라트롤과 같은 SIRT1-활성화 화합물 (STAC)과 조합하여 투여될 수 있다. 제 III형 단백질 탈아세틸라제인 SIRT1은 세포성 노화/노화 및 염증의 조절에 관여하는 신규한 항노화 단백질인 것으로 생각된다. SIRT1 수준 및 활성은 산화 스트레스에 의해 유발된한 폐 염증 동안 감소된다. 염증에 대한 SIRT1 매개된 보호작용의 메커니즘은 염증, 조기 노화, 텔로미어 마모, 노화 관련 분비 표현형 및 DNA 손상 반응의 조절과 관련된다. 다양한 식이 폴리페놀 및 약리학적 활성제는 SIRT1을 조절하여 제 2형 당뇨병, 암, 심혈관 질환 및 염증과 관련된 만성 폐쇄성 폐 질환의 진행을 간섭하는 것으로 관찰된다.　따라서, SIRT의 건강 이익의 일부 또는 전부는 S-클로토와 함께 제공된 SIRT1 및/또는 SIRTI-활성화 화합물의 공동-투여에 의해 증대될 수 있다.
S-클로토는 FDA에 의해 인식된 바와 같이 하나 이상의 인간 세포, 조직 및 세포성 및 조직- 기반의 산물 (HCT/P)과 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 산물은 예를 들어 뼈 (탈염된 뼈, 인대, 힘줄, 근막, 연골, 안구 조직 (각막 및 공막), 피부, 혈관 이식편 (정맥 및/또는 동맥), 선택적으로 (또는 기타) 보존된 제대 정맥, 심낭막, 양막 (안구 복구를 위해 단독으로 (첨가된 세포 없이) 사용될 때), 경질막, 심장 판막 동종이식편, 말초혈액 또는 제대혈로부터 유래한 조혈 줄기세포, 정액, 난모세포 또는 배아 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, HCT/P는 하나 이상의 줄기세포이거나, 이를 포함할 수 있다. 손상된 신체 조직 및 기관을 위한 줄기세포 치료는 계속해서 인기를 얻고 있다. 줄기세포와 조합하여 치료적 재조합 클로토 단백질의 투여는 이를 필요로 하는 대상에게 놀랍고, 예기치 못한, 심지어 상승 작용적 결과를 제공하였다.
본 발명의 구현예는 인간 줄기세포와 조합하여 치료적 재조합 클로토 단백질을 포함하는 조합 산물을 추가로 포함한다. 조성물은 또한 본원에 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 FDA에 의해 인식된 바와 같이 중증 또는 생명을 위협하는 질환 또는 병태를 치료하거나, 병형시키거나, 역전시키거나, 치료하도록 재생 약물로서 포함되거나 분류될 수 있다. 예비적인 임상 증거는 상기 조성물 (약물)이 이러한 질환 또는 병태에 대한 충족되지 않은 의학적 필요성을 해결할 잠재력이 있음을 나타낸다.
예시적으로, 줄기세포는 인간 제대 또는 태반과 같은 중간엽 줄기세포 (MSC)이거나, 이를 포함할 수 있다. 적어도 일 구현예에서, huMSC 및 본 발명의 치료적 재조합 클로토 단백질을 포함하는 조성물은 AKI에서 발생하는 염증 및 산화 스트레스 반응을 약화시키고/거나 노화 관련 단백질 및 마이크로RNA의 발현을 감소시켰다.
S-클로토는 하나 이상의 노화 저해제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질은 Pin1-FOXM1 및/또는 다른 노화 저해제와 조합되어 이러한 치료를 받는 환자의 결과를 증진시킬 수 있다.
S-클로토는 다음 중 하나 이상과 조합하여 투여될 수 있다: 클로토 자극제 (예로, 비타민 D, 로사르탄, 테스토스테론), GDF-11, 트리코스타틴 A 항진균제 (예로, GDF-11 자극제), TIMP-2, CCL-11 저해제/항체, 다사티닙, 니코틴아미드 리보시드 (예로, NAD+), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) (예로, NDA+), AMPK 자극제 (예로, 레스베라트롤, 아스피린, 살리실레이트, 식물성 화학물질, DR), C60 풀러렌, 라파마이신, FGF 저해제, FOXO4-p53 간섭 펩티드 (예로, FOXO4-DRI)와 같은 세노라이틱 약물/화합물, 항-세포사멸 단백질 BCL-2 및 BCL-xL.
전술한 또는 다른 치료 또는 공동-투여 중 임의의 치료는 임의의 단독으로 치료의 효과를 능가하는 부가적인 또는 상승 작용적 효과를 갖을 수 있다. 예를 들어, 전술한 하나 이상과 클로토 단백질의 공동-투여는 성분을 단독으로 유사한 농도로 투여한 개별 결과의 합보다 더 큰 치료 결과를 유도할 수 있다. 또한, 상승 작용적 효과는 성분을 단독으로 투여한 개별 결과와 유사한 치료 결과이지만, 더 낮은 농도에서의 결과를 포함할 수 있다. 상승 작용적 효과는 또한 하나 이상의 성분의 최대 유효 용량을 증가시키는 것, 하나 이상의 성분의 독성을 감소시키는 것, 또는 개별 치료 결과의 단순한 부가적인 효과보다 큰 임의의 다른 유리한 결과를 포함할 수 있다. 또한, 개별 치료 결과의 부가적인 효과는 하나 이상의 상승 작용적 효과를 포함할 수 있다. 이러한 부가적인/상승 작용적 효과는 개별 성분의 특성 및 이해를 고려할 때 예측되거나 기대되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바, 조합 치료 또는 공동-투여는 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 포함하는 조합 산물, 조성물 또는 제형물의 처리 또는 투여를 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 본원에 기재된 성분, 약물, 물질, 치료 조성물 등 또는 당 업계에 공지된 다른 것 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 주사가능한 (예로, 근육내, 정맥내 등), 섭취가능한, 경피, 흡입가능한, 국소 또는 기타 제형물 내로 공동-제형화될 수 있다.
대안적으로, 조합 치료 또는 공동-투여는 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분의 처리 또는 투여를 포함할 수 있지만, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분이 조합 산물, 조성물 또는 제형물 내로 조합되거나 제형화되지는 않는다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분은 별도의 주사가능한 (예로, 근육내, 정맥내 등), 섭취가능한, 경피, 흡입가능한, 국소 또는 기타 제형물을 각각 포함하거나 이에 포함될 수 있다.
또한, 공동-투여는 두 개 이상의 성분의 동시 투여 또는 두 개 이상의 성분의 별도의 투여를 포함할 수 있고, 별도의 투여는 바람직하게 일정 기간으로 분리될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 기간은 매우 짧을 수 있다. 예를 들어, 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분 중 제 2 성분은 실질적으로 클로토 단백질 및 하나 이상의 추가적인 활성 성분 중 제1 성분의 투여 직후에 투여 (예로, 주사)될 수 있다. 대안적으로, 제 1 및 제 2 투여는 1 내지 60초, 1 내지 60분, 1 내지 24시간, 1 내지 7일, 1 내지 4주, 1 내지 12개월 등 또는 이들 사이의 임의의 값 또는 값의 범위로 분리될 수 있다. 유사하게, 동시 투여는 두 개 이상의 성분을 위한 투여 시간대를 충첩시키는 것을 포함할 수 있다.
고인산혈 가족 종양성 석회증 (HFTC)의 요법적 치료
침범된 인간 개인에서, HFTC는 S-클로토의 아미노산 (AA) 위치 193번에서 히스티딘 (H)에서 아르기닌 (R)으로의 돌연변이- rs121908423에 의해 유발된다. 임의의 이론에도 구애받지 않고, HFTC 개인에서의 H193R 돌연변이는 S-클로토가 FGF23 및 FGFR1c와 삼차 복합체를 형성하는 능력을 손상시키고, 이는 KL-의존적 FGF23 신호전달을 손상시키는 것으로 생각된다. 결과적으로, 침범된 대상은 피부 및 피하 조직에서 고인산혈증 및 대량의 칼슘 침착의 소견을 보이는 중증 대사 장애를 나타낸다. 일부 환자는 골막 반응 및 피질 과다골증 및 피부 침범의 부재의 방사선촬영 관찰과 관련된 긴 뼈의 재발성, 일시적, 통증성 부종의 소견 보인다.
본 발명의 구현예는 H193을 갖는 S-클로토 단백질을 포함한다. H193 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, H193 변이체는 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 따라서, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 입체구조일 수 있다.
구현예는 H193 이종접합 또는 동종접합 변이체 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 H193 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 H193 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. H193 클로토 단백질은 또한 R193 (또는 H193R) 단백질보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로토 H193 단백질을 이를 필요로 하는 대상 (예로, HFTC 개인, HFTC로 진단된 개인 또는 H193R (rs121908423) 또는 기타 변이체를 보유하는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 H193 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 투여는 HFTC로 침범된 개인에서 인간 클로토 유전자에서 발견된 H-대-R193 점 돌연변이의 결과로서 HFTC 개인에서 전사되고 순환되는 R193 돌연변이의 유해한 효과를 역전시키거나 이에 대응할 수 있다. 이에 따라, S-클로토 H193의 순환 농도는 H193R 또는 HFTC 개인에서 관찰되는 효과를 대응하는데 도움이 될 수 있다.
말기 신장 질환 (ESRD)을 갖는 CC 유전형 환자의 요법적 치료
말기 신장 질환 (ESRD)을 갖는 대략 350,000명의 환자는 만성 혈액 투석의 첫 해에 매우 높은 사망률로 고생한다. 비타민 D 및 섬유모세포 성장인자 (FGF)-23 수준 둘 다는 이들 환자들의 생존과 상관된다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 클로토는 비타민 D/FGF-23 신호전달 경로의 단백질로 동물 모델에서 노화의 가속화 및 조기 사망률과 관련되어 왔다. 클로토 유전자의 유전적 변화가 ESRD를 갖는 대상의 생존과 관련될 수 있는 것으로 가정되었다. 연구자들은 혈액 투석 시 이들의 첫 해 동안 클로토 유전자에서 12개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 ESRD 환자 집단의 사망률 사이의 연관성을 테스트하였다 (n = 1307명의 백인 및 아시아인). 하나의 태그 SNP의 CC 유전형, rs577912 (인트론 1에 위치한 클로토 유전자 서열 내에서 소수 대립 유전자 빈도 [MAF] > 0.05를 갖는 공통적인 HapMap 변이체) 및 1년 사망률의 위험 증가 사이에 유의 한 연관성이 발견되었다 (RR, 1.76; 95% CI, 1.19-2.59; p = 0.003). CC 유전형을 갖는 개인들에서 이러한 효과는 활성화된 비타민 D 보충으로 치료받지 않은 환자들 중에서 훨씬 더 현저하였다 (HR, 2.51; 95% CI, 1.18-5.34; p = 0.005). HapMap 대상로부터 유래된 림프모성 세포주에서, CC 유전형은 AA 또는 AC 유전형과 비교하여 16 내지 21% 더 낮은 클로토 발현과 관련이있다. 그러나, 상기 기재된 rs577912 SNP 뉴클레오티드 변화는 클로토 단백질에서 아미노산 변화를 전혀 초래하지 않는다. 이에 따라, 이 기능적 SNP (rs577912)는 mRNA 수준에서 클로토 유전자 발현에 정량적으로 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 구현예는 AA 또는 AC 유전형으로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 이에 따라, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 길이일 수 있다.
구현예는 AA 또는 AC 이종접합 또는 동종접합 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. AA 또는 AC 이종접합 또는 동종접합 세포에서 발현된 클로토 단백질은 CC 세포에서보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로토 단백질을 이를 필요로 하는 대상 (예로, 하나의 태그 SNP, rs577912에서 CC 돌연변이를 보유하고/거나, 낮은 내인성 S-클로토 단백질 발현을 갖는/거나, 말기 신장 질환 (ESRD)을 갖는 개인 또는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 투여는 침범된 개인에서 인간 클로토 유전자에서 발견된 점 돌연변이의 결과로서 개인에서 전사되고 순환되는 CC 돌연변이(들)의 유해한 효과를 역전시키거나 이에 대응할 수 있다. 이에 따라, S-클로토의 순환 농도는 CC 개인에서 관찰된 효과, 특히 말기 신장 질환 (ESRD), 즉 만성 혈액 투석을 받는 ESRD 환자의 첫 해 사망률로의 효과에 대응하도록 도움이 될 수 있다.
방사선촬영상 손 골관절염 (OA) 및 골 증식의 요법적 치료
골관절염 (OA)은 강력한 유전가능한 성분을 갖는 보편적인 복합 질환이다. 연구자들은 큰 여성 백인 인구에서 클로토 유전자의 4개 추정되는 기능적 유전자 변이체 및 손 OA 사이의 연관성을 연구하였다. 연구자들은 SNP G-395A 및 방사선촬영상 손 OA 및 골 증식 형성의 유무 사이에 유의한 연관성을 발견하였다. 대립 유전자 G는 1.44 (P = 0.008, 95% 신뢰 구간 (CI) 1.09-1.91) 및 1.36 (P = 0.006, 95% CI 1.09-1.70)의 교차비 (OR) 각각으로 방사선촬영상 손 OA 및 골 증식의 위험을 유의하게 증가시켰다. 로지스틱 회귀 모델링으로부터, 유전형 GG는 유전형 AA와 비교할 때 방사선촬영상 손 OA (OR = 3.10, 95% CI 1.10-8.76) 및 골 증식 (OR = 3.10, 95% CI 1.10-8.75) 둘 다의 경우 3배 이상의 증가된 위험을 보여주었다. 연령 조정 이후이, 유전형 GG에 대한 OR은 방사선촬영상 손 OA의 경우 4.39 (P = 0.006, 95% CI 1.51-12.74)로, 골 증식의 경우 4.47 (P = 0.005, 95% CI 1.56-12.77)로 추가로 증가하였다. 연구자들은 또한 클로토 유전자의 하나의 변이체 (SNP G-395A)가 손 OA의 감수성과 관련되고, 연골 손상이 아닌 골 증식 형성을 통해 작용하는 것으로 보임을 제시하였다.
본 발명의 구현예는 SNP G395A를 갖는 구조물로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 결과로 생성된 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, A395 변이체는 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 이에 따라, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 길이일 수 있다.
구현예는 G395A 이종접합 또는 동종접합 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. A395 이종접합 또는 동종접합 세포에서 발현된 클로토 단백질은 G396 세포에서보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로토 단백질을 이를 필요로 하는 대상 (예로, G395 SNP 및/또는 방사선촬용 손 골관절염 (OA) 및/또는 골 증식 (이의 발생 위험)을 보유하는 개인 또는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 투여는 침범된 개인에서 전사되고 순환되는G395 SNP의 유해한 효과를 역전시키거나 이에 대응할 수 있다. 이에 따라, S-클로토의 순환 농도는 G395 개인, 특히 발사선촬영상 손 골관절염 (OA) 및/또는 골 증식을 발생시킬 위험이 있는 개체에서 관찰되는 효과에 대응하는데 도움이 될 수 있다. 따라서, G-395A S-클로토 단백질의 투여는 환자 (예로, G395 SNP를 보유한 환자)에서 발사선촬영상 손 골관절염 (OA) 및 골 증식 형성의 위험을 감소시킬 수 있다.
대사 증후군의 요법적 치료
복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증 및 고혈압을 포함한 심장대사 위험요인의 군집인 대사 증후군 (MetS)의 위험 및/또는 발병율은 나이가 들면서 증가한다. 고령의 성인에서, MetS는 심혈관 질환 및 제 2형 당뇨병의 위험을 증가시킬뿐만 아니라, 인지 기능 저하 및 불구와 관련된다. 현재의 증거는 MetS가 부분적으로 유전가능하고, 유전적 요인이 MetS의 발병에 관한 환경적 요인보다 더 큰 역할을 담당하는 것을 시사한다. 연구자들은 중국의 90대 및 100대 연령층의 인구 중에서 G-395A 다형성 및 대사 증후군 (MetS) 사이의 연관성을 발견하였다. 대상은 두지안지안 (PLAD)의 장수 및 노화 프로젝트로부터 나왔다. 클로토 유전자의 프로모터 영역에서 G-395A (rs1207568)의 유전형 분석은 TaqMan 대립 유전자 구별 검정법을 사용하여 수행되었다. MetS는 국제 당뇨병 연합 (International Diabetes Federation) 판정기준에 따라 진단되었다. 연령 93.5 ± 3.2세의 695명의 대상이 포함되었다. G 및 A 대립 유전자 빈도는 각각 0.852 및 0.148이었다. 전체 인구에서, MetS 빈도는 GG 및 GA + AA 유전형 실험군에서 각각 10.8% 및 5.9%이었다 (p = 0.004). -395A 대립 유전자 보균자는 전체 인구 (교차비 [OR] 0.50, 95% 신뢰 구간 [CI] 0.25-0.98) 및 여성 (OR 0.51, 95% CI 0.24-0.97)에서 MetS의 위험이 유의하게 낮았지만, 남성 (OR 0.42, 95% CI 0.05-3.85)에서는 아니었다. 전체 인구 및 여성에서, 클로토 G-395A SNP 및 MetS의 관계는 고혈압 (각각 OR 0.48, 95% CI 0.34-0.67; OR 0.47, 95% CI 0.31-0.71) 및 고중성지방혈증 (각각 OR 0.66, 95% CI 0.39-0.95; 또는 OR 0.54, 95% CI 0.31-0.98)에 미치는 이의 영향으로 기인할 수 있다. 남성에서, 이러한 관계는 고혈압 (OR 0.47, 95% CI 0.25-0.90) 및 낮은 HDL-C (OR 0.69, 95% CI 0.27-0.93)에 미치는 이의 영향으로 기인할 수 있다. 연구자들은 클로토 유전자의 -395A 대립 유전자 보균자가 중국의 90대 및 100대 연령층, 특히 여성에서 MetS의 낮은 위험과 상관되는 것으로 결론지었다.
본 발명의 구현예는 -395A 대립 유전자를 갖는 구조물로부터 발현된 S-클로토 단백질을 포함한다. 결과로 생성된 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, A395 대립 유전자는 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 이에 따라, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 길이일 수 있다.
구현예는 -395A 이종접합 또는 동종접합 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. A395 이종접합 또는 동종접합 세포에서 발현된 클로토 단백질은 G396 세포에서보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로토 단백질을 이를 필요로 하는 대상 (예로, G395 SNP 및/또는 대사 증후군 (MetS) (이의 발생 위험)을 보유하는 개인 또는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다. 투여는 침범된 개인에서 전사되고 순환되는G395 SNP의 유해한 효과를 역전시키거나 이에 대응할 수 있다. 이에 따라, S- 클로토의 순환 농도는 G395 개인, 특히 대사 증후군 (MetS)을 발생시킬 위험이 있는 개인에서 관찰되는 효과에 대응하는데 도움이 될 수 있다. 따라서, G-395A S-클로토 단백질의 투여는 환자 (예로, 노령의 인간 및/또는 여성에서 G395 SNP를 보유한 환자)에서 대사 증후군 (MetS)의 위험을 감소시킬 수 있다.
암의 요법적 치료
S-클로토는 기저 Wnt 신호전달 활성을 억제하고, 이로써 결장직장암 (CRC)에 대한 종양 억제제로서 기능하는 것으로 생각된다. 또한, 수명 차이와 관련된 클로토 유전자 변이체는 부틸레이트-매개된 Wnt 과다활성화를 억제하여 CRC의 위험을 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 존재하는 클로토 변이체의 유형 및 이의 상대적 발현은 식이로부터 유도된 부틸레이트의 수준과 상호작용하여 CRC 위험을 변경시킬 수 있는 것으로 가정되었다. 더욱이, mTOR 신호전달은 인간 노화와 관련이 있으며, Wnt 및 mTOR 신호전달 사이의 교차누설은 결장 종양생성에 영향을 미칠 수 있다
KL-VS 변이체 또는 다른 구조물은 SNP (예로, KL-VS 내의)가 S-클로토에 기본 Wnt 신호전달의 감소 및/또는 부틸레이트 매개된 Wnt 과다활성화의 억압 - S-클로토 종양 억압과 관련되었던 후자의 Wnt 관련 활성을 생성하도록 영향을 미치는지를 조사하는 운반체로서 작용할 수 있다. 구현예는 KL-VS 변이체의 종양 억압 작용에 영향을 미치는 것으로 나타난 적절한 아미노산 (예로, S-클로토의 KL-VS 스트레치에서)을 변형시키는 것을 포함한다. 본 발명의 구현예는 6개의 SNP의 KL-VS 스트레치에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는 재조합 S-클로토 단백질을 포함한다. 단백질은 본원에 기재된 임의의 단백질 구조물의 맥락에서 생성되고/거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 S-클로토, 이소형 1 또는 2, 1 내지 981번, 29 내지 981번, 34 내지 981번, 36 내지 981번, 131 내지 981번, 1 내지 549번, 29 내지 549번, 34 내지 549번, 36 내지 549번 또는 131 내지 549번 등의 맥락에서 태그 (예로, Fc-태그, TEV-트윈-스트렙 태그, TEV 서열 등)가 있거나 없이 생산되거나 발현될 수 있다. 이에 따라, 단백질이 발현되는 핵산 구조물 또는 cDNA는 상응하는 길이일 수 있다.
구현예는 이종접합 또는 동종접합 변이체 구조물을 생성하고/거나, S-클로토 단백질을 인코딩하는 생성된 구조물을 적절한 발현 시스템 (예로, CHO 세포) 내로 전달하고/거나 (예로, 형질감염을 통해), S-클로토 단백질을 일시적으로 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 클로토 단백질은 야생형을 포함한 다른 클로토 단백질보다 더 높은 수준으로 발현될 수 있다. 구현예는 치료적 투여를 위해 발현된 단백질을 정제 (선택적으로 품질 관리 테스트)하는 것을 포함할 수 있다. 구현예는 치료적 또는 치료적 유효량의 S-클로토 단백질을 이를 필요로 하는 대상 (예로, 결장직장암 (CRC) 또는 또 다른 종양을 갖거나 이의 발생 위험이 있는 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 대상은 예를 들어 Wnt 억제 활성이 감소된 클로토 변이체를 보유하거나 발현할 수 있다. 대안적으로, 대상은 야생형의 다른 돌연변이체 또는 변이체 유형일 수 있다. 재조합 S-클로토 단백질의 투여는 혈액 S-클로토 수준의 유익한 증가를 유도할 수 있다.
비-인간 포유동물의 요법적 치료
전술한 내용에 추가하여, 하나 이상의 비-인간 포유동물 클로토 단백질 또는 단백질 서열 (또는 이의 일부(들))이 본 발명의 특정 구현예를 구현하는데 유용할 수 있다. 서열번호 121 내지 124는 다양한 비-인간 포유동물 클로토 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 제시한다. 서열번호 111 내지 120은 다양한 비-인간 포유동물의 아미노산 서열을 제시한다. 이들 클로토 단백질 서열 (또는 이의 일부(들))은 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 발현되고/거나, 정제되고/거나, 조성물로 제형화되고/거나, 동물에게 투여될 수 있다. 재조합 클로토 (융합) 단백질의 치료적 투여는 본원에 개략된 비-인간 포유동물 버전의 의학적 및 기타 병태를 치료하는데 효과적일 수있다. 구체적으로, 본 발명의 구현예는 당업자에게 이해될 바와 같이 수의학적 치료 방법, 단백질 및 조성물을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1
표 48은 HEK 및/또는 CHO 세포주에서 인용된 클로토 변이체의 일시적 발현 및 정제로부터의 결과를 도시한다. 하기 표 48에 제공된 결과에서, 다음의 약어화된 프로토콜을 따랐다.
Fc 융합 단백질의 경우, 표준 방법을 사용하여 단백질 발현 벡터를 HEK293.sus 또는 CHO 내에 형질감염시켰다. 간략하게, 세포를 7일 동안 성장시키고 수확하였다. 세포 계수는 주해 섹션에 주어진다. 상청액 pH를 1M 헤페스 pH 7.4로 조정하고 소듐 아자이드를 첨가하였다. KanCap A 레진을 사용하여 단백질을 포획하였다. 레진을 PBS로 세척하였다. 레진을 PBS + 1 M NaCl로 세척하였다. 레진을 PBS로 세척하였다. 단백질을 50 mM 시트레이트 pH 3.5, 100 mM NaCl로 용리시켰다. 단백질을 1 M 트리스 pH 8, 0.5 M 아르기닌으로 즉시 중화시켰다. 이 단계에서 SDS PAGE 젤 시료를 제거하였다. 단백질을 PBS로 완충액 교체하였다. 단백질을 OD280으로 정량분석하고, 계산된 소멸 계수를 사용하여 정량 및 농도를 결정하였다. 환원 및 비-환원 SDS-PAGE (바이오래드 기준 트리스/글리신/SDS, 4-20%)를 사용하여 순도 및 대략적인 분자 질량을 결정하였다. 응집 상태는 세팍스 제닉스-C SEC-300, 3 μm, 300Å, 4.6 × 150 mm 크기 배제 컬럼 및 PBS 전개 완충액을 사용하여 280 nm에서의 검출과 함께 HPLC에 의해 결정되었다. 단백질은 필터 멸균화, 액체 질소에서 급속 냉동된 이후 일정량으로서 운송되었다. 정제 전후에 SDS-PAGE 상에서 전개된 시료로부터 결정된 바와 같이, PBS 내로 탈염하는 동안 일부 Fc 단백질의 경우 단백질 손실이 관찰되었다. 이들 단백질은 발현되지만, HPLC로부터 PBS에서의 실리카 HPLC 컬럼 상의 탈염화 또는 검정 동안 문제가 발생하였다. 이에 따라, 완충액 선택은 단백질 손실을 감소시키도록 최적화되었다.
스트렙 태그화 단백질의 경우, 표준 방법을 사용하여 단백질 발현 벡터를 HEK293.sus 또는 CHO 내에 형질감염시켰다. 간략하게, 세포를 7일 동안 성장시키고 수확하였다. 상청액 pH를 1M 헤페스 pH 7.4로 조정하고 소듐 아자이드를 첨가하였다. BioLock 바이오틴 격리 시약을 첨가하였다. StrepTactin 수퍼플로우 레진을 사용하여 단백질을 포획하였다. 레진를 100 mM 트리스 pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA로 세척하였다. 단백질을 100 mM 트리스 pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA + 2.5 mM 데스티오비틴으로 용리시켰다. 단백질을 OD280으로 정량분석하고, 계산된 소멸 계수를 사용하여 정량 및 농도를 결정하였다. 환원 및 비-환원 SDS-PAGE (바이오래드 기준 트리스/글리신/SDS, 4-20%)를 사용하여 순도 및 대략적인 분자 질량을 결정하였다. 응집 상태는 세팍스 제닉스-C SEC-300, 3 μm, 300Å, 4.6 × 150 mm 크기 배제 컬럼 및 PBS 전개 완충액을 사용하여 280 nm에서의 검출과 함께 HPLC에 의해 결정되었다. 단백질은 필터 멸균화, 액체 질소에서 급속 냉동된 이후 일정량으로서 운송되었다. 스트렙 태그화 단백질의 경우, 시료가 용리 완충액에서 검정된 점이 언급되어야 한다. 이 용리 완충액은 매우 '중성'이며, 단백질에 해롭지 않다. 또한, SEC 컬럼의 전개 완충액은 PBS이어서, 단백질이 검정 동안 완충액 교체를 거쳤다. 7분 초과의 시간대에서 흡광도는 소분자이다.
Figure pct00075
Figure pct00076
특정 구현예에서, EDTA 및/또는 다른 금속 킬레이팅제(들)는 하나 이상의 (예로, 모든) 정제 단계 및/또는 완충제로부터 제거된다 (또는 이들에 포함되지 않음). 일부 구현예에서, EDTA 및/또는 다른 금속 킬레이팅제(들)는 클로토 단백질의 비활성화에 기여하거나, 이를 유발할 수 있다.
추적 연구에서, 일시적 발현된 Fc-클로토 단백질을 Aquity UPLC BEH200 SEC 분석 컬럼을 사용하여 정제하였다: 1.7 μg, 4.6 × 150 mm; 이동상: 100 mM 소듐 포스페이트, 200 mM 염화나트륨, pH 6.8; 유속: 0.35 mL/분; 전개 시간: 9분; 검출: A280, MALS & RI 검출기; 주변 시료 구획, 30C 컬럼 구획; 100 μL의 시료 주입 (37 μg). 도 14는 클로토 -Fc 단백질의 크로마토그래프를 도시한다. 대부분의 Fc 클로토 단백질은 공백 용적 근처의 MW 마커의 첫 번째 피크와 중첩되는 것으로 보인다. 이것은 주요 피크 (메가달톤 단위)에서 관찰된 매우 높은 분자량에 해당하며, 이는 고유의 클로토보다 훨씬 높다. 비-환원 SDS-PAGE에 의해, 피크 (분획)는 단량체 크기의 단백질을 포함하며, 이는 용액에서의 비공유 결합을 시사한다. 주요 클로토 피크의 미단 상에 작은 숄더가 관찰되고 (점선 타원으로 표시됨), 이것은 MW 마커에 비해 SEC 컬럼에서 용리 시간에 의해 IgG보다 더 큰 MW 및 광 산란에 의해 ~ 700 kDa (LS 신호는 매우 낮고 응집의 미단을 갖기 때문에 과다평가되었을 수 있음)을 갖는 총 클로토 피크 면적의 < 1%이다. 이러한 피크는 다량체, 아마도 이량체 또는 사량체에 해당한다.
상이한 컬럼, 완충액, 조건 등을 포함한 다양한 대안의 정제 과정이 단백질 응집 및 다량체 형성으로의 문제를 해결하는데 사용되었다. 그러나, 적어도 일 구현예에서, 다량체 (이량체, 사량체 등) 클로토 단백질이 정제될 수 있다.
실시예 2
서열번호 52 (N'-인간 알파 클로토 34-981 이소형 1_(G4S)2 링커_인간 IgG1 Fc-C'), 서열번호 54 (N'-인간 알파 클로토 34-549 이소형 2_(G4S)2 링커_인간 IgG1 Fc-C') 및 서열번호 66 (N'-인간 알파 클로토 34-981 이소형 1_트윈-스트렙 절단 부위 잔기)로 나타내는 (인간) 클로토 유래 단백질의 안정한 발현이 CHO 세포에서 수행되었다. 3개의 클로토 단백질 구조물 각각은 비-자연 발생 N-말단 신호 서열로 발현되었고, 이는 다음으로 안정한 발현/정제 과정 동안 절단되어 N-말단 (클로토 단백질) 아미노산을 수득하였다. 서열번호 52 및 54에서 클로토 단백질 서열의 C-말단은 GS 링커 (GGGGSGGGGS) 및 Fc-융합 태그 (인간 IgG1 Fc 도메인)이며, 이는 발현된 단백질에 보유된다 (또는 보유되는 것으로 보임). 서열번호 52에서 클로토 단백질 서열의 C-말단은 TEV-트윈-스트렙 태그 (GS 링커를 갖음) (GGENLYFQ/SSAWSHPQFEK-GGGSGGGSGGS-SAWSHPQFEK)이고, 이는 TEV-트윈-스트렙 태그의 글루타민 8 (Q8)에 이어서 (즉, GGENLYFQ--) 절단되어 트윈-스트렙 태그 부분 (SSAWSHPQFEK-GGGSGGGSGGS-SAWSHPQFEK)을 방출하고 TEV (프로테아제 인식 또는 공통) 서열의 적어도 일부 (GGENLYFQ-C')를 보유한다.
코딩 서열은 DNA2.0 독점 알고리즘을 사용하여 코돈 최적화되었다. 유전자를 합성하고 Pd3600 트랜스포존 골격 기반의 발현 구조물을 조립하였다.
GS 녹아웃 CHOK1 유도체 숙주 세포주를 사용하여 인간 클로토 변이체를 발현하였다. 세포는 3개의 상이한 h클로토 설계 및 Leap-In 트랜스포사제를 코딩하는 Leap-In 트랜스포존 기반의 발현 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 형질감염은 네온 장치 (Thermo)를 사용하는 전기천공법에 의해 수행되었다. 형질감염된 세포를 글루타민이 없는 조건 하에서 선별하고, 생성된 안정한 풀을 동결보존하였다. 확립된 안정한 풀로부터의 세포를 진탕 플라스크 내에 접종하고, 소규모 확립된 배지공급 및 세포 배양 조건을 사용하여 유가식 배치 생산 연구를 수행하였다. 정화된 수확 시료를 수집하고 항-Fc 항체-(서열번호 52 및 54) 또는 스트렙-택틴-(서열번호 66) HRP 컨쥬게이트 기반의 검출을 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 시행하였다. 웨스턴 블럿의 예시는 도 15a 내지 도 16b에 나타낸다.
FL-ECD (34-981)-Fc 클로토 유도체 (서열번호 52)를 발현하는 안정한 풀 291645는 예상된 크기에서 단백질을 우세하게 생산한다 (도 15a 참조). 전장의 세포외 도메인-Fc 융합 단백질 단량체의 예측된 크기는 139 kDa이다. 우세한 항-Fc 양성 밴드는 예측된 ~ 140 kDa 크기 (화살표)에 있으며, 발현 구조물 291645가 정확한 크기의 융합 단백질을 발현함을 나타낸다. 단백질은 자연 및 비-환원 조건 하에서 이량체화된다 (도 15b 참조). 비-환원 조건 하에서, 전장의 세포외 도메인-Fc 융합 단백질은 동종이량체를 형성할 수 있다. 비-환원 웨스턴 블럿 (화살표) 상에서 항 Fc 항체에 의해 검출된 우세한 밴드의 크기는 예측된 동종이량체의 형성과 부합한다.
안정한 풀 291647 (서열번호 66)에 의해 발현된 FL-ECD (34-981)-TEV-트윈-스트렙 분자는 또한 웨스턴 블럿 상에서 정확한 크기를 나타내고, 자연 및 비-환원 조건 하에서 단량체를 유지한다 (도 16a 및 도 16b 참조). 예상된 크기의 이소형-2-Fc 변이체는 분비된 인간 클로토 단백질을 나타낸다. 성숙한 전장의 ECD (34-981)-트윈-스트렙 태그화된 클로토 단백질 (서열번호 66)의 예측된 분자 질량은 ~ 109 kDa이다. 비-환원 웨스턴 블럿 분석은 발현 구조물 291647에 의해 코딩된 CHO 세포로부터 정확한 크기의 단백질의 성공적인 발현을 입증한다 (도 16a 참조). 비-환원 변성된 웨스턴 블럿 분석은 h클로토의 전장의 세포외 도메인이 CHO 세포로부터 분비될 때 공유적 동종이량체를 형성하지 않음을 나타낸다 (도 16b 참조). 첨부된 서열 목록에 예시된 다른 단백질 구조물도 역시 준비되었다. 도 17은 다양한 표시된 재조합 클로토 단백질 구조물의 젤이다. 도 18은 각각의 표시된 재조합 클로토 단백질 구조물의 일련의 젤이다.
본원에 개시되지만 표 48에 도시되지 않은 하나 이상의 다른 클로토 변이체에 추가하여, 표 48에 개시되고/거나 도 15a 내지 도 18에 도시된 클로토 변이체의 발현 및/또는 정제가, 일부 구현예에서 고유의 클로토의 발현 및/또는 정제를 능가하는 장점을 유도하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 클로토 변이체를 발현하고/거나 정제할 때 대안의 산물의 수 및/또는 유형이 감소될 수　있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 고유의 클로토의 발현 수준과 비교하여 원하는 클로토 변이체의 발현 수준이 증가할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 원하는 클로토 변이체는 비슷한 조건 및 방법 하에서 더욱 순수한 형태로 발현되고/거나 정제된다 (예로, 원하는 클로토 변이체의 농도가 발현되고/거나 정제된 부산물의 동시적 감소와 함께 증가됨). 예비적인 결과는 설계된 재조합 융합 단백질이 적합한 역가 범위에서 발현되고 정제되며, 허용가능한 완충액, 담체 및 부형제에 가용성임을 나타냈다.
밀도, 생존도 및 생산에 대해 추가의 세포주가 개발되고 평가되었다. 상위 10개 클론의 데이타가 도 19 내지 도 22에 도시되어 있다. 상위 4개 클론의 데이타가 도 23 내지 도 26에 도시되어 있다. 유가식 배치 순위를 기초로 하여, 상위 2개의 클론은 138 D9 및 145 G8인 것으로 보인다. 유사-관류 누적 생산성을 기초로 하여, 138 D9가 최상의 성능인 것으로 보인다. 140 F6이 가장 높은 VCD에 도달하였다. 사본수 안정성도 역시 도 27에 도시된 바와 같이 평가되었다. 총 RNA를 추출하고, RNA 분리를 RNeasy 미니키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 74104)를 사용하여 수행하였다. RNA 분리에 이어서, 옴니스크립트 RT 키트 (Qiagen, 카탈로그 번호 205111)를 사용하여 주형의 증폭을 수행하였다. 모든 cDNA 서열은 예상한 바와 같았다.
5개의 클론의 안정성을 도 28 내지 도 32에 도시된 바와 같이 추가로 테스트하였다. 이들 클론은 글루타민이 있거나 없는 성장 배지에서 성장하였고, 글루타민이 없는 조건과 비교하여 4 mM 글루타민의 존재 시 더 높은 성장률을 갖는 것으로 관찰되었다. 두 세트 모두에서 > 60회 집단 배가 동안 성장률 변화는 관찰되지 않았다. 7일 경과 시 생존 세포 밀도 및 클론의 생존률 백분율은 도 30 및 도 31에 도시되어 있다. 4 mM 글루타민의 존재 (+) 및 부재 (-) 시, 시간 0, 60PD의 7일 유가식 배치 배양에서 클론의 부피 생산성은 도 32에 도시되어 있다. 글루타민이 없는 세포의 T0 및 PD60에 의한 부피 생산성은 비슷하다. PD60 + 글루타민 부피 생산성은 비슷하거나 다소 낮지만 T0 값의 ~ 70%보다 낮지는 않다.
세포는 EX-CELL, ActiPro 및 CD OptiCHO 배지에 대해 100%로, CD CHO, CD FortiCHO, BalanCD CHO 성장 A 및 설렉트 CD1000 배지에 대해 거의 100%로 적응되었다.
실시예 3
정제된 클로토 단백질은 도 33에 도시된 바와 같이 ELISA에 이어서 젤 상에서 관찰되었다. 표 49는 ELISA 플레이트 맵 키 (상단 2개 섹션) 및 히트 맵-표지된 ELISA 450 nm 데이타 (하단 2개 섹션)를 나타낸다. 표 50은 세포 배양 상청액 및 인간 혈청 시료로부터의 클로토 단백질에 대한 ELISA 데이타를 나타낸다. 표 51은 각 시료 실험군에서 클로토의 평균 농도를 나타낸다.
표 52는 재조합 클로토 단백질 주사 이전 (상단 2개 섹션) 및 이후 (하위 2개 섹션)에 인간 혈청 클로토 수준에 대한 ELISA 플레이트 맵 키를 나타낸다. 표 53은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 재조합 혈청 단백질 주사 이전 (상단 2개 섹션) 및 이후 (하단 2개 섹션)에 인간 혈청 시료에서 클로토 단백질 수준에 대한 히트 맵-표지된 ELISA 450 nm 데이타를 나타낸다. 인간 혈청 시료를 클로토 ELISA 검정 시료 희석 완충액을 사용하여 2배 희석하고, 세포 배양 상청액을 5,000배 희석하였다. 혈청 B1 및 세포 배양 상청액을 대조군으로서 ELISA 플레이트 둘 다에 포함시켰다. TMB 30분. 표 54는 표시된 시료에서 클로토 단백질의 평균 농도의 요약을 나타낸다.
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표 55는 복제 클로토 단백질 시료의 농도 및 단일클론성을 나타낸다.
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Figure pct00084
농도의 추정을 위한 예시적인 방법은 BSA 표준에 대한 PAGE에 의한 정량화 (정량분석)가 관여하였다. 농도 추정을 위한 예시적인 방법은 정제된 클로토 표준에 대한 측정이 관여하였다.
하나의 데이타 해석은 고유-유사 재조합 (트윈스트렙-TEV 태그 제거된) 클로토 단백질이 재조합 Fc-태그화된 클로토 단백질보다 더 잘 발현하고, 더 잘 정제되고/거나, 더 많은 활성을 보유하는 점일 수　있다. 이것은 놀랍고도 예기치 못하였다. 대안의 해석은 단백질 또는 Fc-융합 단백질이 둘 다 고유-유사 단백질 이상으로 ELISA 항체에 대한 클로토 단백질 반응 수준을 나타내지 않았던 점이다. 이에 따라, 본 발명자들은 고유-유사 재조합 클로토 단백질 및 Fc-융합 클로토 단백질의 발현, 정제, 보관 및/또는 투여가 예상한 바와 같이 단순하지 않고 표준 기법이 잘 작동하지 않았음을 확인할 수 있었다. 나중의 해석을 기초로 하여 진행하면서, 절차를 추가의 해석을 위해 데이타를 계속 처리하면서 더 많은 활성 단백질을 얻도록 변경하였다.
클로토 단백질을 위한 시판되는 3가지 ELISA 검출 키트는 또한 본 발명의 특정 구현예에 따라 적합성에 대해 테스트되었다. 하기 표 57 및 표 58 참조. IBL 키트는 낮은 배경, 혈청 시료의 라이너 희석, 1 : 4 희석 후 허용가능한 스파이크 회복을 보여준다. 클라우드-클론 키트는 배경이 높고, 혈청 시료의 라이너 희석이 없으며 허용가능한 스파이크 회복이 없음을 보여준다. EIAab 키트는 배경이 낮고, 혈청 시료에서 클로토 농도가 매우 낮고, 혈청 시료의 라이너 희석이 없으며, 허용가능한 스파이크 회복이 없음을 보여준다.
총 8개의 인간 혈청 시료를 각 키트의 희석 완충액으로 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8로 희석하였다. 이들 8개의 혈청 시료 중 4개를 1 : 20 희석에서 각 키트로부터의 표준의 최고 농도로 스파이크하였다. 제공된 지침에 따라 각 키트로부터의 프로토콜을 따랐다.
도 34a 내지 도 34c는 각각의 시료에서 관찰된 클로토 단백질 농도 및 스파이크 회복을 도시한다.
Figure pct00085
예비적인 글로벌 글리칸 분석이 또한 도 35a 및 도 35b에 도시된 바와 같이 수행되었다. 글리칸 분석에 대한 실험 조건 및 결과는 표 59에 제시되어 있다.
Figure pct00086
하기 표 60 및 표 61는 도 35a 및 도 35b에 도시된 데이타를 각각 나타낸다.
Figure pct00087
Figure pct00088
9개 클론의 추가적인 풀 (하기 표 62 참조)이 적합성에 대해 평가되었다.
Figure pct00089
각 세포주의 성장, 생존도 및 역가가 하기 표 63에 제시된다.
Figure pct00090
도 36a 내지 36c는 각각의 세포주에 대한 성장, 생존도 및 역가 곡선을 각각 도시한다.
3개 클론의 추가적인 풀 (하기 표 64 참조)이 적합성에 대해 평가되었다.
Figure pct00091
각 세포주의 성장, 생존도 및 생산은 하기 표 65에 제시된다.
Figure pct00092
도 37a 내지 37c는 각각의 세포주에 대한 성장, 생존도 및 역가 곡선을 각각 도시한다.
유망한 클론 중 1개 (하기 표 66 참조)가 성장, 생존도 및 생산에 대해 재평가되었다.
Figure pct00093
도 38a 내지 38c는 세포주에 대한 성장, 생존도 및 역가 곡선을 각각 도시한다.
실시예 5
웨스턴 블럿 분석이 도 39a 및 도 39b에 도시된 바와 같이 발현된 단백질 풀 상에서 수행되었다. 도 39a는 클로토 ECD (34-981) 6×His 단백질을 나타내고, 도 39b는 표시된 클로토 단백질을 나타낸다. 예기치 않게, 클로토 단백질이 더 높은 분자량 다량체 내로 응집되는 것으로 보이다.
5 L 생물반응기 발현 전개를 진행한 이후, 어댑터 정제 프로토콜을 수행하였다. 제 1 정제 단계에서, 프로테인 A 세파로스 4 고속 유동 (0.75 mL) (0.5 cm × 3 cm) 컬럼을 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0에서 평형화하였다. 단백질 시료 (1.5 M 트리스-HCl, pH 8.0 (~ 1 mL)으로 pH 8.0으로 조정된 100 mL의 세포 상청액)를 0.75 mL/분의 유속으로 로딩하고, 10 mM 트리스/아르기닌-HCl, pH 8.0 완충액으로 세척하고, 0.50 M 내지 0.25 mL/분에서 4 M MgCl2, pH 3 (즉, 저 pH, 고염)으로 용리하여 농축된 시료를 생성하였다. 도 40a 참조. 컬럼을 (염 침전물을 방지하도록) 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0로 재평형화하고, 과다 가압을 피하도록 0.1 M NaOH: 0.5 내지 0.3 mL/mL로 살균하였다. 최소의 클로토 단백질이 재평형화 및 살균 위생 동안 용리되었다.
프로테인 A 용리로부터의 피크 #1 및 피크 #2가 별도로 분석되었고, 완충액이 교환되었으며, 수퍼덱스 200 (1 cm × 30 cm) 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 0.5 mL/분으로 100 mM 트리스-HCl/5 mM L-메티오닌/0.6% 소듐 티오글리콜레이트, pH 8.0 이동상과 함께 사용하여 분획화하였다. 도 40b 참조. 트리스를 포스페이트 포함 완충액 대신에 이동상을 완충시키는데 사용하여 마그네슘 염의 침전을 방지하였다. 클로토-Fc의 산화를 방지하도록 환원제 (L-메티오닌)를 사용하였다. 소듐 티오글리콜레이트를 클로토-Fc의 유리 설프하이드릴 시스테인기의 스크램블링을 방지하는데 사용하였다. 완충액 성분은 FDA에 의해 나열된 GRAS이다.
단일 분리된 피크 #1 및 피크 #2로부터의 슈퍼덱스 200 분획은 각각 상이한 MW 종의 클로토-Fc 단백질을 나타낸다. 도 41a 및 도 41b 참조. 요약하면, SDS-PAGE에 의한 수확된 단백질 (배지 내의)의 분석은 클로토-Fc가 다양한 응집 상태로 존재함을 시사한다. 정제는 이량체 (≤ 300 kDa) 및 사량체 (≤ 600 kDa)에 상응하는 다량체 클로토-Fc의 두 개 군집을 생성 하였다. 프로테인 A로부터의 결합/용리 프로토콜은 훨씬 우수한 산물 용리 프로파일을 보여주며 살균 위생 이후의 최소의 단백질을 생성한다. 제형물이 환원제로서 티오글리콜레이트를 갖기 때문에, 산물은 가열 후에 단량체 그리고 젤 전기 영동에서 가열하지 않고 단량체 및 이량체로서 분리된다. 이러한 새로운 정제 절차로 인해 응집되지 않은 Fc-클로토 단백질이 생성되었다.
실시예 6
생체검정법은 고유의 및 Fc-클로토 단백질 둘 다의 활성을 테스트하도록, 구체적으로 포르테바이오사 (ForteBio)에 의한 BLITZ를 사용하여 FGF 23에 대한 클로토 단백질의 결합 친화도를 테스트하도록 개발되었다. 처음에, 재조합 마우스 클로토의 마우스 FGF-23에 대한 결합 친화도가 표면 플라스몬 공명 (SPR) 결합 방법을 사용하여 평가되었다. SPR은 분석물, 이동 분자, 리간드 및 센서에 결합된 고정화된 분자 인 리간드 사이의 분자적 상호작용을 검출하는데 사용되는 광학 기법으로서, 상호작용 시 센서의 굴절률을 변화시킨다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 6개 농도의 재조합 마우스 클로토 (400 μg/mL부터 12.5 μg/mL까지의 2배 일련 희석) 항체와 마우스 FGF-23의 친화도를 비교하였다. 항-HIS (HIS2) 센서를 사용하여, 마우스 FGF-23을 센서에 결합시킨 다음, 후속적으로 이들 센서를 6개 상이한 농도의 마우스 클로토에 대한 결합 곡선을 생성하는데 사용하였다. 항체에 대해 생성된 6개의 결합 및 해리 곡선으로부터, 항체의 해리 상수 (Kd) 값이 결정된다. 검정법을 수행하고 데이타를 검증하였다 (데이타 미도시).
인간 재조합 클로토 단백질의 경우, HIS-태그 바이오센서 팁을 RT에서 10분 동안 PBS에서 수화시켰다. PBS에서의 300 μg/mL으로 HIS-태그 표지된 FGF23 (ProSpec, 카탈로그 번호 CYT-374)이 2분 동안 바이오센서에 커플링되었다. 기저선은 BLITZ 기기 상에서 30초 동안 확립되었다. 다음으로, 5개의 2배 일련 희석 (400 μg/mL 내지 12.5 μg/mL)에서 고유의 및 Fc-s클로토 단백질의 고정화된 FGF23에 대한 결합이 PBD에서 2분 동안 테스트되고, 후속적으로 PBS에서 2분 동안 해리되었다. 글로벌 분석을 사용하여 Kon (결합), Koff (해리) 및 KD (Koff/Kon)를 분석하였다. 도 42 참조.
추가의 검정은 세포 기반의 기능 검정법을 사용하여 클로토 단백질의 생물학적 활성을 테스트하도록, 구체적으로 NIH/3T3 세포의 증식을 자극하는데 미치는 이들의 효과를 측정함으로써 고유의 및 Fc-클로토 단백질 둘 다의 생체활성을 테스트하도록 수행되었다. 클로토의 생물학을 기초로 하여, 이러한 검정법 개발의 근거는 FGFR을 발현하는 NIH-3T3 세포의 증식을 자극하는데 미치는 클로토의 효과를 테스트하는 것이다.
성장기 세포를 배양 배지 (10% FBS-DMEM)에 5000개 세포/웰/96-웰 플레이트의 밀도로 접종하였고, 밤새 배양한 다음, 배지를 0.5% FBS로 교환하여 밤새 배양하였다. 세포를 30 μg/mL로 시작하는 10개 용량, 2배 일련 희석, 각각의 용량을 세 벌씩 각각의 클로토 단백질로 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. 세포 증식을 셀 타이터-Glu 검정 키트를 사용하여 측정하였고, 데이타를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)으로 4 의 매개변수-재단 곡선을 사용하여 분석하였다. 데이타는 정제된 클로토 단백질, 고유-His 및 Fc-클로토 둘 다가 용량-의존적 방식으로 세포 증식을 자극하였던 점을 나타낸다. 도 43a 내지 도 43e 참조.
실시예 7
수컷 스프라그-돌리 래트에서 정맥내 투여 후 알파 인간 고유의 클로토 및 알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질의 급성 내약 용량 (ATD)을 결정하는 연구가 수행되었다. 급성 내약 용량 연구에서, 테스트 항목 알파 인간 고유의 클로토 및 알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질의 안전성을 수컷 스프라그-돌리 래트에서 평가하였다. 용량 투여 전에, 21 마리의 동물에게 트랜스폰더를 피하 이식하였다. 연구 -1일째에, 동물을 체중을 기준으로 3마리의 7개 실험군으로 무작위화하였다. 알파 인간 고유의 클로토 단백질은 연구 0일째 운반체 (PBS, pH 7.2) 중의 1 mL/kg의 용량 부피로 (개체의 체중을 기준으로) 정맥내로 투여된 10 μg/kg, 30 μg/kg 및 100 μg/kg (개체의 체중을 기준으로)의 3가지 용량 농도에서 테스트되었다.
알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질은 또한 연구 0일째 운반체 (PBS, pH 7.2) 중의 1 mL/kg의 용량 부피로 (개체의 체중을 기준으로) 정맥내로 투여된 3 μg/kg, 10 μg/kg 및 30 μg/kg (개체의 체중을 기준으로)의 3가지 용량 농도에서 테스트되었다. 투약은 연구 0일째 운반체 (PBS, pH 7.2) 단독 실험군, 10 μg/kg 알파 인간 고유의 클로토 단백질 실험군 및 3 μg/kg 알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질 실험군으로 시작하였고, 각각의 테스트 항목 용량 수준 실험군 사이에 적어도 24시간이교차하도록 하였다. 모든 투약은 각각의 시작일에 한 번 제공되었다. 동물은 처리에 이어서 최대 14일 동안 임의의 부작용을 관찰하였다.
수명 측정에는 유병율 및 사망률에 대한 매일 2회 점검이 포함되었고, 임상적 관찰이 매일 기록되었다. 체중 측정은 매일 기록되었다. 관찰 단계가 완료된 후, 모든 동물을 심장 사혈을 통해 안락사시켰다. 최종 측정에는 혈액 혈액학, 혈청 생화학 및 응고가 포함되었다. 부검 시 모든 동물에 대해 총 병리학 변화가 기록되었고 10개의 기관 (부신, 뇌, 부고환, 심장, 신장, 간, 비장, 고환, 갑상샘/부갑상샘 및 흉선)의 무게가 측정되었다.
표 67은 연구 동물의 요약을 나타낸다.
Figure pct00094
표 68은 연구 설계의 요약을 나타낸다.
Figure pct00095
실험군 할당: 개별 측정값을 모든 선택된 동물의 평균과 매칭시키는 알고리즘을 사용하는 최적화된 분포 방법인 매칭된 쌍 분포가 수행되었다. 이 방법은 모든 선택된 동물의 평균에 근접하여 평준화된 매칭 쌍을 얻음으로써 시작한 다음, 이들을 모든 선택된 동물의 평균의 평균 (또는 가능한 한 근접한)을 매칭시킬 실험군 내에 분포시킨다. 동물은 각 실험군의 측정 평균이 가능한 한 모든 선택된 동물의 평균에 근접하도록 분포된다.
통계 분석을 위해, 설명적인 통계가 연구 데이타로부터 생성되었다. 데이타가 매개변수 또는 비-매개변수적 분석이 적절한지 여부를 결정하도록 평가되었다. 매개변수적 데이타의 경우, 분산 분석 (ANOVA)에 이어서 포스트-혹 (post-hoc) 테스트를 수행하여 처리, 시점 및/또는 실험군 사이의 유의한 차이를 결정하였다. 비-매개변수적 데이타의 경우, 적절한 통계 분석이 수행되었다 (예로, 카플란-마이어 생존, 크루스칼-월리스 원웨이 ANOVA, 만-휘트니 또는 윌콕스 랭크 합 등).
표 69는 시료 수집 절차를 요약하고 있다.
Figure pct00096
표 70은 시료 수집 업무를 요약하고 있다.
Figure pct00097
체중이 초기 체중의 85% 미만으로 강하되거나 중증의 연장된 유해한 임상적 징후를 나타내는 동물은 안락사시켜야 하였다. 동물이 상기에 나타낸 바와 같이 혈장, 혈청 및 전혈의 수집을 위해 심장 출혈을 통해 안락사되었다.
예비적인 결과는 래트가 이에 투여된 비교적 높은 용량의 재조합 클로토 단백질을 견디는 것을 나타내었다.
실시예 8
수컷 스프라그 돌리 래트에서 IV 투약에 이어서 알파 인간 고유의 클로토 및 알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질의 약동학을 결정하는 연구가 시행되었다. 연구 0일째 이전에 동물에게 트랜스폰더를 피하 이식하였다. 연구 -1일째에, 체중을 획득하고 체중을 기준으로 동물을 무작위화하였다. 연구 0일째에, 실험군 5, 6 및 7의 동물 (실험군 당 10마리의 동물)은 각각 1 mL/kg 운반체 (PBS, pH 7.2) 중의 3, 10 및 30 μg/kg으로 알파 인간 Fc-융합 클로토 단백질의 단일 용량을 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여받았다 (하기에 자세한 투약 스케줄 참조). 연구 1일째에, 실험군 2, 3 및 4의 동물 (실험군 당 10마리의 동물)은 각각 1 mL/kg 운반체 (PBS, pH 7.2) 중의 10, 30 및 100 μg/kg으로 알파 인간 고유의 클로토 단백질의 단일 용량을 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여받았다 (하기에 자세한 투약 스케줄 참조). 운반체 실험군 1의 동물 (3 마리의 동물)에게 또한 연구 1일째에 단백질이 없는 1 mL/kg 운반체 (PBS, pH 7.2)가 투약되었다. 각 동물에 투여된 투약 용액의 부피를 연구 -1일째에 획득된 측정된 개별 체중을 기준으로 계산하고 조정하였다.
모든 시점에 대해 각 실험군 (2 내지 7)으로부터 3개의 혈액 시료를 획득하였으며, 이는 래트 당 3개의 혈액 시료와 동등하다 (하기에 자세한 혈액 수집 스케줄 참조). 시점 혈액 시료를 하기 표 71에 제시된 바와 같이, 용량 전, 용량 후 3분, 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간 (실험군 2, 3 및 4)에 획득하였다.
Figure pct00098
시점 혈액 시료를 하기 표 72에 제시된 바와 같이, 용량 전, 용량 후 3분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 7일 (실험군 5, 6 및 7)에 획득하였다. 투약 후 14일째에 추가적인 혈액 수집이 실험군 5, 6 및 7에서 획득되었다.
Figure pct00099
운반체 실험군 1의 동물은 하기 표 73에 제시된 바와 같이 용량 투여 후 1시간째 1회 말단 출혈되었다.
Figure pct00100
결과로 생성된 혈청 시료를 알파 클로토 인간 가용성 ELISA 키트를 통해 분석하였다.
표 74는 연구 동물의 요약을 나타낸다.
Figure pct00101
표 75는 연구 설계의 요약을 나타낸다.
Figure pct00102
실험군 할당을 위해, 유사한 크기의 측정값을 갖는 동물의 "비닝"을 사용하는 최적화되지 않은 무작위화 방법인 계층화된 시료화가 사용되었다. 이러한 방법에 의해, 동물의 풀은 이들을 오름차순으로 관심있는 측정값에 의해 분류함으로써 계층화된다. 다음으로 동물을 측정값의 크기에 따라 "빈" 또는 계층으로 조직화한다. 계층의 수는 실험군 당 할당될 동물의 수에 의해 결정된다. 예를 들어, 실험군 당 3 마리의 동물이 있으면, 소형, 중형 및 대형의 3개의 빈이 생성될 것이다. 각 크기의 빈으로부터 한 마리의 동물이 각 실험군에 무작위로 할당된다. 계층화된 시료화는 각 실험군이 각 크기 빈으로부터 무작위로 한 마리의 동물을 받고 각 실험군의 수단이 다른 실험군과 유사하게 유지될 것을 입증한다. 이 방법은 실험군 평균과 표준 편차 및 풀 크기 편차의 대조군 사이의 차이를 균형 맞춘다.
통계 분석을 위해, 설명적인 통계가 연구 데이타로부터 생성되었다. 데이타가 매개변수 또는 비-매개변수적 분석이 적절한지 여부를 결정하도록 평가되었다. 매개변수적 데이타의 경우, 분산 분석 (ANOVA)에 이어서 포스트-혹 (post-hoc) 테스트를 수행하여 처리, 시점 및/또는 실험군 사이의 유의한 차이를 결정하였다. 비-매개변수적 데이타의 경우, 적절한 통계 분석이 수행되었다 (예로, 카플란-마이어 생존, 크루스칼-월리스 원웨이 ANOVA, 만-휘트니 또는 윌콕스 랭크 합 등).
표 76은 시료 수집 절차를 요약하고 있다.
Figure pct00103
표 77은 시료 수집 업무를 요약하고 있다.
Figure pct00104
체중이 초기 체중의 85% 미만으로 강하되거나 중증의 연장된 유해한 임상적 징후를 나타내는 동물은 안락사되었다 (데이타 미도시). 동물이 상기에 나타낸 바와 같이 혈장, 혈청 및 전혈의 수집을 위해 심장 출혈을 통해 안락사되었다.
실시예 9
위스타 래트에서 알파 인간 Fc-클로토 및 알파 인간 고유의 클로토의 I/R 유도된-AKI 및 신장 바이오마커에 미치는 용량 의존적 효과를 (혈장 신장 손상 바이오마커의 신장 I/R 유도된 증가를 측정함으로써) 결정하는 연구를 수행하였다. 구체적으로, 본 연구의 목적은 래트에서 혈장 신장 손상 바이오마커의 신장 I/R 유도된 증가에 미치는 알파 인간 Fc-클로토 및 알파 인간 고유의 클로토의 용량 의존적 효과를 평가하는 것이었다. 연구는 양측 신장 허혈-재관류 (I/R) 손상 (30' 허혈 지속) 수술 (n = 63) 대비 샴 수술 (n = 4), 화합물 투약 (1회 정맥 주사/래트), 대사 사육상자 수용을 통한 일련의 소변 수집 (3회 수집/래트; D1, D2 및 D7), 크레아티닌 및 단백질에 대한 일련의 소변 표본의 임상화학 분석 (D1, D2 및 D7), 일련의 혈액 수집 (3회 수집/래트; D1, D2 및 D7), 크레아티닌 및 BUN에 대한 일련의 혈장 표본의 임상화학 분석 (D1, D2 및 D7), 수술 후 종결점에 걸쳐 매일 체중 및 건강 관찰, 종결점 조직 수집 및 처리로부터 또는 이들과 관련된 데이타를 표 및 그래프 형식으로 제시된 데이타로 제공하도록 설계되었다.
또한 종 특이적 ELISA를 통한 Kim-1에 대한 일련의 소변 표본 분석 (D1, D2 및 D7), 종 특이적 ELISA 를 통한 NGAL에 대한 일련의 소변 표본 분석 (D1, D2 및 D7), 좌측 및/또는 우측 신장 mRNA 발현 분석 (1-2개 신장/동물: n = 67 시료; 10개 분석물이 3개의 정규화 유전자를 포함함; 애피메트릭스 퀀티진 플렉스 2.0 플랫폼을 사용하여 수행됨; MCP-1, TGF-β,α-SMA, Col1A1, Col3A1, Fn-1, CTGF) 그리고 좌측 및/또는 우측 신장 피질 면역조직화학 및 ED-1+ 대식세포 염색의 특이적 염색 및 정량분석를 통한 대식세포 침윤의 정량분석도 역시 선택적으로 수행된다.
표 78은 해당 연구 매개변수를 나타낸다.
Figure pct00105
표 79는 연구 설계의 요약을 나타낸다.
Figure pct00106
체중이 대략 151 내지 175g인 67 마리의 수컷 위스타 래트가 획득되었고, 표준 조건 하에 수용된 실험군을 표준 차우 다이어트 (Harlan 8640)로 사육하였으며, 연구에 등록하기 전에 적어도 7일 동안 순응시켰다. 연구 개시 이전에, 연구 래트를 체중-매칭된 처리 실험군에 나두었다. 동물은 수술일 당 실험군 당 대략 동일한 수의 동물이 등록되고, 가장 무거운 동물이 먼저 등록되어 동물 연령의 차이를 최소화하도록, 균형 잡힌 설계를 사용하여 연구에 등록되었다. 대사 사육상자 수용이 아닐 때, 래트를 정적 사육상자의 표준 조건 하에 수용된 실험군이었다.
t-0.5시간에, 연구 래트를 노스콘 상에서 이소플루란 마취제로 마취시켜 수술을 준비하고, 신장 I/R 수술 절차 이전에 코어 온도를 평형화하였다. 래트에게 체액 부피의 교란을 최소화하도록 10 mL/kg의 따뜻한 멸균 식염수 (피하; 수술 전 25% 및 수술 후 75%)를 투여하였다. 코어 온도는 허혈 지속 기간 내내 정상 (37 ± 0.2℃)으로 유지되었다. t-0.5시간에, 실험군 7 및 8의 동물은 또한 적절한 경우 화합물의 정맥 주사를 투여받았다.
다음으로 개복 수술이 수행되었다. t0에서, 래트는 열 멸균된 기구, 혈관 폐색 클램프 및 무균 수술 기법을 사용하여 샴 (실험군 1, n = 4) 또는 양측 신장 동맥 허혈 (실험군 2 내지 8; n = 9/실험군)에 적용되었다. 30분의 연속 허혈 시간 (t+0.5) 이후, 폐색 클램프를 제거하고, 신장을 재관류시키며, 복부 상처를 멸균 실크 봉합사로 봉합하였다. 래트에게 수술 후 진통제로서 0.01 mg/kg 부프레노르핀을 투여하고, 깨끗한 가열된 사육상자에서 잠깐 동안 회복하도록 하였다. t+1시간에, 실험군 1 내지 6의 래트를 잠깐 제한하고, 운반체 또는 운반체에서의 클로토 화합물을 적절한 경우 정맥내 주사하였다. 실험군 7 및 8의 래트는 또한 스트레스를 통제하도록 잠깐 동안 제한되었다 (주사 없이). 다음으로, 래트를 즉시 대사 사육상자에 나두었다.
재관류 이후 24시간째 (D1), 모든 동물의 소변 부피를 측정하고 시료화하였다. 다음으로 모든 동물은 Li-헤파린 상에서 직접 꼬리 정맥 스틱에 의해 혈액 (500 μL)을 수집하였다. 출혈 직후에, 래트는 500 μL의 따뜻한 식염수를 투여받았다. D2 (재관류 후 48시간째) 및 D7 (재관류 후 168시간째)에서 소변 및 혈액 수집을 다시 반복하였다. D2 내지 D5에서, 모든 래트를 정적 사육상자의 표준 조건 하에 수용하여 그룹화하고, 체중을 측정하고 매일 건강 관찰을 시행하였다. 혈장 생산을 위해 전혈 (500 μL)을 적절하게 처리하고, 기재된 바와 같이 처리하였다.
투약의 개시에 이어서 매일 1회 임상 관찰이 시행되었다. 데이타/수집/계산될 조직과 관련하여, 수술 절차에 이어서 매일 동물 건강이 관찰되었고, 신장 질량 (좌측 및 우측 신장 무게)이 경골 길이 및 체중에 인덱스화되었다. 소변을 D1, D2 및 D7에 수집하였다 (표적화 n = 3 시료/동물; 500 μL/시료). 적어도 하나의 시료를 임상화학 분석 (크레아티닌, 단백질)에 적용하였고, 적어도 하나의 시료는 Kim-1 및 NGAL 분석에 선택적으로 사용되었다. 혈장을 D1, D2 및 D7에 Li-헤파린 상에서 수집하였다 (표적화 n = 2 시료/동물; 125 μL/시료). 적어도 하나의 시료를 임상화학 분석 (크레아티닌, BUN)에 적용하였다.
D7에서, 출혈에 이어서 바로 래트를 이소플루란으로 마취시키고 조직을 수확하였다. 좌측 및 우측 신장 둘 다를 바로 얼음으로 차가운 0.9% NaCl에 넣고, 피막을 제거하여 무게를 측정하였다. 조직 수확 (조직학적 및 기타 분석을 위해) 이후에, 각각의 샴 및 허혈성 신장 (각 동물로부터의 좌측 및 우측 신장; 1개의 튜브/신장/동물)로부터의 남은 모든 내부 피질/외부 속질 (즉, S3/THAL 농축됨)이 적절히 라벨이 붙은 튜브에서 급속 냉동되고, 미래의 잠재적인 생화학적 분석을 위해 -80℃에 보관되었다. 임의의 분석이 수행되기 이전에, 피질 조직은 선택적으로 동결 분말화되고, 생화학적 검정에 걸쳐 조직 시료의 더 우수한 균질성을 가능하게 할뿐만 아니라 피질 생검에서 발생할 수 있는 시료화 편차의 도입을 제한하도록 혼합되었다. 조직학적 분석을 위해 각각의 샴 및 허혈성 신장 (각 동물로부터 좌측 및 우측)의 적어도 하나의 중간 횡단면을 선택적으로 수집하고, 10% 중성 완충 포르말린에 침지 고정시켰다. 다음으로 래트를 희생시켰다.
실시예 10
연구 래트의 체중을 측정하여 대상에 미치는 클로토 단백질 투여의 효과에 대해 테스트하였다. 표 80은 연구 동물의 요약을 나타낸다.
Figure pct00107
도 44는 12일 연구 (매일) 과정 내내 각각의 실험군에서 래트의 평균 (평균) 체중 (+/- 평균의 표준 오차; SEM 막대)을 그래프로 도시한다. 하기 표 81은 도 44에 도시된 평균 체중에 대한 상응하는 데이타를 제시하고, 하기 표 82는 도 44에 도시된 상응하는 SEM을 제시하고, 하기 표 83은 12일 연구 (매일) 과정 내내 각각의 실험군에서 래트의 평균 체중의 변화 백분율을 제시한다.
실시예 11
신장 허혈 재관류 손상 (IRI)에 이어서 급성 신장 손상 (AKI)에 미치는 클로토 투여의 치료적 효과를 연구하기 위해 스프라그-돌리 래트를 샴 또는 AKI 실험군으로 무작위로 나누고, 각각의 실험군의 동물을 운반체 또는 클로토 치료로 무작위로 할당하였다. 인간에서, AKI는 주로 허혈 또는 신장 독소로부터 유발되는 무서운 임상 문제이고, 완전 회복부터 투석 의존성 또는 사망이 되는 만성 신장 질환의 발병에 이르는 결과를 갖는다. 클로토 실험군의 동물은 재관류 이후 30분 또는 60분에 재조합 마우스 클로토 단백질 (0.01 mg/kg 체중)을 1회 볼루스 복강내 주사를 투여받았고, 운반체 실험군의 래트는 동일한 부피의 클로토 완충액 (150 mM NaCl 및 10 mM HEPES pH 7.4)를 투여받았다. 수술 후 1, 2 및 7일째에 24시간 소변 및 혈액을 수집하였다. 이러한 연구는 손상 후 30분에 마우스 S-클로토의 단일 볼루스 주사가 인간 병태의 동물 모델에서 약화시키는데 (AKI) 효과적임을 보여주었다.
실시예 12
클로토가 산화제 손상으로부터 폐를 보호하는지 여부를 결정하기 위해 스프라그-돌리 래트 (체중 ~ 300 g)를 3가지 조제물: 클로토 (클로토 CM; ~ 60 pmol) 또는 빈 벡터 (대조군 CM)를 과다발현하는 CHO 세포로부터의 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 조건부 배지 (CM) 중 하나의 복강내 주사를 받으면서 (각각 n = 6 내지 8 마리의 동물), 3일 동안 정상 산소 (N: 21% 흡입 O) 또는 산소 과잉 (H: 90% O)에 노출되었다. 주사는 12시간 전에 제공되었고, 노출 동안 24시간 및 48시간째에 반복되었다.
또한, 3LL 세포를 피하 주사 (마우스 당 2 × 106개 세포)에 의해 무흉선 마우스의 측면에 이식하고, 10일 동안 격일로 클로토 단백질 (0.01 mg/kg, 복강내) 또는 운반체로 처리하였다. 이식 후 21일째 폐를 수확하고 전이성 결절의 수를 계수하였다.
Figure pct00108
결론
기존의 클로토 단백질 측정은 재택 수집 및/또는 정량적 진단을 위해 엄청나게 비싸고/거나 기술적으로 어려울 수 있다. 본 발명의 구현예는 대상에서 클로토 단백질 수준(들), 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들)을 모니터링하고/거나, 검출하고/거나, 정량분석하는 방법, 보다 구체적으로, 가용성 알파 클로토 단백질 수준, 클로토 단백질 결핍을 진단하는 것 및/또는 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산, 구체적으로 내인성 및/또는 외인성 가용성 알파 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산을 증가시키는 것, 클로토 단백질 결핍을 치료하기 위한 진단 키트 및 조성물을 포함하여 이를 수행하는데 유용한 산물을 제공한다.
또한, 유전자 요법이 동물 모델 또는 연구에서 특정 단백질 수준을 증가시키는데 효과적일 수 있는 반면, 유전자 요법의 안전성, 특히 인간 치료에 대한 안전성은 여전히 의문의 여지가 있다. 클로토 유전자의 동물 (세포)로의 바이러스성 전달과 비교하여, 인간에서 외인성 및/또는 재조합 단백질의 투여는 (내분비) 클로토 수준을 회복시키도록 더 안전하고, 더 쉽고, 더 직접적인 양식일 수 있다. 전임상 데이타는 연령 관련 장애 및 클로토 결핍 관련 질환에 대한 가용성 클로토 단백질의 치료적 잠재력을 지지한다. 역학적 자료에 따르면 노령의 성인에서 용해성 클로토가 젊은 성인보다 낮으며, 용해성 클로토의 수준이 연령과 반비례 관계가 있음을 보여주며, 노화가 용해성 클로토 저하와 관련될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 일반적으로 인간에게 외인성 및/또는 재조합 단백질의 생산 및 투여는 정부 및 다른 실체에 의해 엄격하게 규제된다. 규제 준수와 관련된 시간과 비용 때문에, 이러한 치료의 비용은 개발자, 제조사 및 환자 등에게 엄청나게 막대하다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법은 다른 해법과 관련된 하나 이상의 결점이 없이 인간 및 비-인간 동물에서 내인성 클로토 단백질 수준을 증가시키기 위한 실행가능하고 효과적인 옵션을 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일부 구현예는 (최신 우수 제조화 관행(cGMP)-등급의) 인간 재조합 가용성 알파-클로토 단백질, 단백질 단편 및/또는 단백질 변이체와 같은, 산물, 조성물 및/또는 재조합 인간 클로토 단백질을 제조하고/거나 사용하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 일부 구현예는 (양양제 또는 건강 보조제) 산물, 조성물 및/또는 환자 또는 대상에서 (내인성 및/또는 혈청 가용성) 클로토 단백질 수준(들), 발현 또는 생산을 (자연적으로) 증가시키는 방법을 포함한다.
당업자라면 재조합 치료적 클로토 단백질 및 이와 관련된 산물, 조성물 및 방법과 관련하여 본원에 개략된 각각의 치료 효과, 적응증 및/또는 치료가 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 수준(들)을 (자연적으로) 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지지함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자라면 또한 내인성 클로토 단백질 생산 및/또는 수준(들)을 (자연적으로) 증가시키고/거나, 증진시키고/거나, 증대시키고/거나, 지지하는 것과 관련하여 본원에 개략된 각각의 치료 효과, 적응증 및/또는 치료가 재조합 치료적 클로토 단백질 및 이에 관련된 산물, 조성물을 및 방법을 통해 투여함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 이에 따라, 간략하게 본 발명은 (i) 재조합, 치료적 클로토 단백질의 투여 및 (ii) 본원에 명백하게 고려된 바와 같은 본 발명의 건강 보조제 또는 영양제학적 조성물의 투여 둘 다에 관하여 각각의 기재된 치료 효과, 적응증 및/또는 치료를 다시 살펴볼 필요가 없다.
전술한 자세한 설명이 특정한 예시적인 구현예를 언급하는 한편, 본 발명은 이의 정신 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않고도 다른 특이적인 형태로 구현될 수 있다. 이에 따라, 설명된 구현예는 모든 측면에서 단지 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 적절한 기술분야에서 숙련되고 본 발명의 권리를 갖는 당업자에게 일어날 본원에 기술되고/거나 도시된 본 발명의 특징의 다양한 치환, 변경 및/또는 변형 및 본원에 기술되고/도시된 원리의 추가적인 적용은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 기술되고/거나 도시된 구현예로 만들어질 수 있다. 이러한 치환, 변경 및/또는 변형은 본 발명의 범주 내에서 고려되어 야한다.
따라서, 본 발명의 범주는 전술한 설명이 아니라 첨부된 청구범위에 의해 나타낸다. 청구범위에 인용된 제한은 청구범위에 채용된 언어를 기초로 하여 광범위하게 해석되어야 하고, 전술한 자세한 설명에 기술된 특정한 실시예에 제한되지 않으며, 실시예는 배타적 또는 소모적이 아닌 것으로서 해석되어야 한다. 청구범위의 의미 및 동등성의 범위 내에서 나오는 모든 변경은 이들의 범주 내에 포함되어야 한다.
특정 구현예들의 다양한 특징들은 본 발명의 다른 구현예들과 양립가능하고/거나, 조합되고/거나, 이에 포함되고/거나, 통합될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현예에 따른 시스템, 방법 및/또는 산물은 본원에 개시되고/거나 설명된 다른 구현예에서 기술된 특징을 포함하거나, 통합하거나, 달리 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 구현예와 비교한 특정 특징의 개시는 상기 특이적 구현예의 특징의 적용 또는 포함을 제한하는 것으로서 고려되어서는 안된다.
또한, 달리 특정한 구현예에서 특징이 요구되는 것으로서 기술되지 않는 한, 다양한 구현예에서 설명된 특징은 선택적일 수 있고 본 발명의 다른 구현예에 포함되지 않을 수 있다. 더욱이, 달리 특징이 이와 조합하여 또 다른 특징을 요구하는 것으로서 기술되지 않는 한, 본원의 임의의 특징은 본원에 개시된 동일하거나 상이한 구현예의 임의의 다른 특징과 조합 될 수 있다. 특징이 특정 구현예에서 선택적일 수 있는 한편, 이러한 구현예에 특징이 포함될 때, 본 발명에서 설명 된 바와 같이 특이적 구성을 갖도록 요구될 수 있음을 이해할 것이다.
마찬가지로, 본원에 기술되고/거나 청구범위에서 인용된 임의의 방법 또는 공정에 인용된 임의의 단계는 임의의 적합한 순서로 실행될 수 있고, 달리 (명시적으로 또는 암시적으로) 진술되지 않는 한, 기술되고/거나 인용된 순서에 반드시 제한되지는 않는다. 그러나, 이러한 단계들은 또한 본 발명의 특정 구현예에서 특정한 순서 또는 임의의 적합한 순서로 수행되도록 요구될 수 있다.
또한, 예시적인 시스템, 방법 및 산물 등의 다양한 잘 알려진 양태는 예시 구현예의 양태를 모호하게 하는 것을 피하기 위해 본원에서 매우 자세하게 설명되지 않는다. 그러나, 이러한 양태도 역시 본원에서 고려된다.

Claims (21)

  1. 포유동물의 혈액 시료에서 클로토 단백질을 안정화시키는 방법으로서,
    포유동물 대상으로부터 일정량의 가용성 클로토 단백질을 포함하는 모세관 혈액을 획득하는 단계; 및
    상기 모세관 혈액을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 용기에 보관하는 단계로서, 상기 용기는 내부에 배치된 보존제 및 항응고제를 갖고, 상기 보존제 또는 항응고제는 상기 용기에서 상기 모세관 혈액과 혼합되며, 상기 보존제 또는 항응고제가 상기 가용성 클로토 단백질을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 안정화시키고, 상기 보존제 또는 항응고제에는 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는, 단계:를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 보존제 또는 항응고제와 혼합된 모세관 혈액을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 3일 동안 보관하는 단계로서, 상기 보존제 또는 항응고제가 상기 가용성 클로토 단백질을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 3일 동안 안정화시키는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 보존제 또는 항응고제와 혼합된 모세관 혈액을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 7일 동안 보관하는 단계로서, 상기 보존제 또는 항응고제가 상기 가용성 클로토 단백질을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 7일 동안 안정화시키는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 보관하는 단계 이후에 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계 또는 상기 가용성 클로토 단백질의 존재를 검정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계는 질량 분광분석법, 다중-분석물 프로파일화 (xMAP) 및/또는 상기 가용성 클로토 단백질의 일부에 결합하는 제 1 항체를 사용하여 상기 클로토 단백질을 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계는 제 1 항체의 일부에 결합하는 검출 항체를 사용하여 상기 가용성 클로토 단백질을 검출하거나, 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)를 수행하여 상기 가용성 클로토 단백질을 검출하고 선택적으로 정량분석하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 모세관 혈액을 획득하는 단계는 포유동물의 피부를 란셋으로 한 번 이상 절개하고 상기 용기에 상기 모세관 혈액을 수집하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 모세관 혈액은 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 상기 모세관 혈액이거나, 상기 모세관 혈액을 획득하는 단계가 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 상기 모세관 혈액을 획득하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 포유동물 대상에서 클로토 결핍을 진단하는 방법으로서,
    다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체액 시료 혼합물을 획득하는 단계:
    선택적으로 모세관 혈액의 형태로, 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는 보존제 또는 항응고제와 혼합된 포유동물 혈청으로서, 일정량의 가용성 클로토 단백질을 갖는 포유동물 혈청; 및
    선택적으로 모세관 혈액의 형태로, 일정량의 가용성 클로토 단백질을 갖는 포유동물 혈청으로서, 상기 방법은 상기 포유동물 혈청을 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는 보존제 또는 항응고제와 혼합하여 상기 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 포유동물 혈청;
    상기 혼합물을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 보관하는 단계로서, 상기 보존제 또는 항응고제가 상기 가용성 클로토 단백질을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 안정화시키는, 단계;
    상기 보관하는 단계 이후에, 상기 혼합물에서 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계; 및
    상기 혼합물에서 상기 가용성 클로토 단백질의 정량화된 양이 미리 정해진 역치량 미만일 때 상기 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계:를 포함하는, 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 체액 시료 혼합물은 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 상기 포유동물 대상으로부터의 모세관 혈액을 포함하거나, 상기 체액 시료 혼합물을 획득하는 단계가 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL의 상기 포유동물 대상으로부터의 모세관　혈액을 획득하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 혼합물에서 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계는 질량 분광분석법, 다중-분석물 프로파일화 (xMAP) 및/또는 상기 가용성 클로토 단백질의 일부에 결합하는 제 1 항체 및 선택적으로 제 1 항체의 일부에 결합하는 검출 항체를 사용하여 상기 가용성 클로토 단백질을 검출하거나, 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)를 수행하여 상기 가용성 클로토 단백질을 검출하고 선택적으로 정량분석하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계는 컴퓨터 시스템의 사용자 인터페이스 상에서 클로토 결핍 결정 또는 진단을 디스플레이하고/거나 물리적 또는 전자적 형태로 상기 클로토 결핍 결정 또는 진단을 디스플레이하는 파일 또는 리포트를 생성하는 것을 포함하고, 상기 클로토 결핍 결정 또는 진단은 선택적으로 상기 클로토 단백질의 상기 정량화된 양 및/또는 상기 미리 정해진 역치량을 포함하는, 방법.
  13. 포유동물 대상에서 클로토 결핍을 치료하는 방법으로서,
    포유동물 대상으로부터 일정량의 가용성 클로토 단백질을 포함하는 혈청 또는 모세관 혈액을 획득하는 단계;
    상기 혈청 또는 모세관 혈액을 실온에서 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 용기에 보관하는 단계로서, 상기 용기는 내부에 배치된 보존제 및 항응고제를 갖고, 상기 혈청 또는 모세관 혈액과 혼합되어 혼합물을 형성하며, 상기 보존제 또는 항응고제는 상기 가용성 클로토 단백질을 실온에서 또는 냉동화 없이 적어도 24시간 동안 안정화시키고, 상기 보존제 또는 항응고제가 헤파린, 리튬 헤파린, EDTA 및 K2 EDTA 중 하나 이상을 포함하는, 단계;
    상기 보관하는 단계 이후에, 상기 혼합물에서 상기 가용성 클로토 단백질의 양을 정량분석하는 단계;
    상기 혼합물에서 상기 가용성 클로토 단백질의 정량화된 양이 미리 정해진 역치량 미만일 때 상기 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단하는 단계; 및
    상기 포유동물 대상을 클로토 결핍으로 진단한 이후에 상기포유동물 대상에게 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계:
    약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 상기 담체 또는 부형제에 배치된 약제학적 유효량의 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질을 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물;
    상기 포유동물 대상에 의한 상기 가용성 클로토 단백질의 내인성 생산을 증가시키거나 증진시킴으로써 혈청 가용성 클로토 단백질 수준을 증가시키도록 적응된 다수의 성분을 포함하는 하나 이상의 영양제학적 조성물; 및
    선택적으로 혈압 약물, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 안지오텐신 전환효소 (ACE) 저해제, 로사르탄, 발사르탄, 텔미사르탄, AT1 수용체 길항제 또는 차단제, 테스토스테론, 성장호르몬, 성장호르몬 방출 펩티드, 세르모렐린, 처방 또는 처방-강도 비타민 D, 1,25-디하이드록시콜레칼시페롤, 칼시트롤, 파리칼시트롤, 인독실 설페이트 결합제, 크레메진, AST-120, 스타틴, PPAR 작동제, 트로글리타존 및 로시글리타존으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 내인성 클로토 단백질 수준을 증가시키는 하나 이상의 약제학적 조성물:을 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 투여하는 단계는
    선택적으로 변형된 방출 형태로, 선택적으로 섭취, 구강 투여 및 설하 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 또는 경구 관련 투여;
    선택적으로 변형된 방출 형태로, 선택적으로 정맥내, 피부내, 복강내, 근육내, 피내 및 피하 주사로부터 선택되는 1회 이상의 볼루스 또는 점진적 주사:를 포함하는, 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 혈청 또는 모세관 혈액을 획득하는 단계는
    상기 포유동물 대상의 피부를 란셋으로 절개하는 것;
    모세관 혈액의 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL을 획득하는 것; 및
    상기 모세관 혈액을 내부에 배치된 또는 이에 첨가된 보존제 또는 항응고제를 갖는 용기에 선택적으로 약 10 내지 1000 μL, 바람직하게 약 50 내지 200 μL이 되도록 수집하는 것: 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질의 약제학적 유효량을 포함하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 가용성 클로토 단백질 서열의 적어도 일부와 이들 사이의 링커 서열이 있거나 없이 융합된 면역글로불린 Fc 도메인 서열 또는 인간 혈청 알부민 서열의 적어도 일부를 포함하는 재조합 클로토 융합 단백질의 약제학적 유효량을 포함하는, 방법.
  18. 제 13항에 있어서, 상기 영양제학적 조성물은 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E, N-아세틸시스테인 (NAC), 퀘르세틴 디하이드레이트, 로즈마린산 (RA), 프테로스틸벤, 도코사헥산산 (DHA), 니코틴아미드 리보시드 (NR), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 (NMN) 및 하나 이상의 프로바이오틱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 성분을 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로바이오틱은 비피도박테리움 종 및/또는 균주 비피도박테리움 락티스 BL-04, 비피도박테리움 비피디움/락티스 BB-02 및 비피도박테리움 롱굼 BL-05, 그리고 락토바실러스 종 및/또는 균주 락토바실러스 아시도필러스 LA-14, 락토바실러스 람노수스 LR-32 및 락토바실러스 파라카제이 LPC-37의 유효량을 포함하는, 방법.
  20. 약제학적 등급의 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질을 정제하는 방법으로서,
    (i) 상기 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질 및 (ii) 하나 이상의 오염물을 포함하는 현탁액 세포 배양액을 획득하는 단계;
    상기 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편, 또는 재조합 클로토 융합 단백질이 프로테인 A 또는 다른 친화성 실체에 결합되고, 선택적으로 세척되고, 약 pH 2 내지 약 pH 6의 pH 및 약 1 M 내지 약 6 M의 염 농도를 갖고, 선택적으로 염은 MgCl2를 포함하는 용출 완충액으로 프로테인 A로부터 용리되는 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 단계;
    상기 용리된 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질이 이동상 완충액에 추가로 용리되고, 상기 이동상 완충액은 완충제 및 하나 이상의 조건부 환원제를 갖고, 상기 완충제는 선택적으로 포스페이트-포함 완충액이 아니고, 상기 환원제는 선택적으로 L-메티오닌 및/또는 소듐 티오글리코레이트를 포함하고, 상기 이동상 완충액은 선택적으로 약 pH 6 내지 약 pH 10의 pH를 갖는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 단계:를 포함하고,
    상기 추가로 용리된 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질 중 적어도 일부는 선택적으로 다량체 형태인, 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 재조합 클로토 단백질, 재조합 클로토 단백질 단편 또는 재조합 클로토 융합 단백질은 서열번호 2 내지 서열번호 70 또는 서열번호 107 내지 서열번호 120 또는 서열번호 125 내지 서열번호 128 또는 서열번호 133 또는 서열번호 152 중 하나의 적어도 일부와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 방법.
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