JP2016503062A

JP2016503062A - 免疫複合体の製造方法

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Publication number: JP2016503062A
Application number: JP2015549722A
Authority: JP
Inventors: ハンター，アラン; リンケ，トーマス; パブスト，ティム; ヴェンデラー，ミヒャエラ; ワン，シアンヤン; トンプソン，クリス; シー，グオリン; フルトン，アンドリュー
Original assignee: メディミューン，エルエルシー
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2016-02-01
Anticipated expiration: 2033-12-19
Also published as: EP2934597B1; AU2013361235B2; EP2934597A2; WO2014100443A2; HK1215547A1; DK2934597T3; ES2710314T3; EP3494992A1; WO2014100443A3; EP3494992B1; CN105007937B; HK1216142A1; CN110950955A; CA2894908A1; CA2894908C; EP2934597A4; ES2929876T3; CN105007937A; US9920124B2; JP6553515B2

Abstract

本発明は、抗ＣＤ２２免疫複合体などの活性免疫複合体を調製する方法を提供する。好適には、本方法は、本方法を使用しない他の製法と比較して、免疫複合体の収率増加をもたらすフェドバッチリフォールディングプロセスおよび／またはカラム溶出プロセスを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、抗ＣＤ２２免疫複合体などの活性免疫複合体を調製する方法を提供する。好適には、本方法は、本方法を使用しない他の製法と比較して、免疫複合体の収率増加をもたらすフェドバッチプロセスおよび／またはカラム溶出プロセスを含む。

大規模で経済的なタンパク質の精製は、バイオ医薬品産業の生産における１つの重要な因子である。治療用タンパク質は、通常、そのタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えプラスミドから目的のタンパク質を発現するよう操作された原核性または真核性細胞系を使用して製造されている。細胞に供給された成分と細胞の副生成物との混合物から、所望のタンパク質を十分な純度で、例えば、ヒトの治療用としての使用に十分な純度で分離することは、いくつかの理由でバイオ製剤の製造業者にとって困難な挑戦である。

タンパク質をベースとした医薬品の製造業者は、極めて厳しい純度要件を含む厳しい規制基準に従わなければならない。安全を保証するために、アメリカ食品医薬局（ＦＤＡ：ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）などの規制当局は、タンパク質をベースとする医薬品は、組み換えタンパク質の凝集体、フラグメントおよび変異体などの生成物に関連する汚染物、ならびに宿主細胞タンパク質、媒体成分、ウイルス、ＤＮＡおよび内毒素などのプロセスに関連する汚染物の両方を含む不純物を実質的に含まないことを要求している。各種のタンパク質精製スキームが利用可能であり、バイオ医薬品産業で広く使用されているが、それらには、薬学的に許容される程度の純度を得るために、通常、抗体の場合におけるプロテインＡの精製などの親和性精製工程が含まれる。

大規模化および制御が可能で、かつ高収率の精製生体分子をもたらす、特定の生体分子および各種生体分子の両方に適用可能な精製スキームの開発は、薬剤開発全体において非常に初期の段階の製品開発に統合化され得るであろう。ゆえに、高品質で、しかも安全性の高い薬剤物質を製造することができる、単純で効率的なプロセスを提供するのが望ましく、また有利である。

一実施形態では、活性免疫複合体を調製する方法が提供される。好適には、免疫複合体は１つまたは複数の残基で脱アミド化されており、かつその脱アミド化によって前記免疫複合体の効力の抑制が起こる。好適には、本方法は、フェドバッチプロセスで免疫複合体をリフォールディングする工程と、リフォールディングされた免疫複合体を１つまたは複数のクロマトグラフィカラムで精製する工程とを含む。

前記免疫複合体が、１つまたは複数の残基で脱アミド化され、かつその脱アミド化によって前記免疫複合体の効力の抑制が起こる、活性免疫複合体調製方法の別の実施形態では、本方法は、免疫複合体をリフォールディングする工程と、イオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて、リフォールディングされた免疫複合体を精製する工程とを含み、第１溶出と第２溶出との間に、カラムを、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする。

本方法の実施形態では、免疫複合体をリフォールディングする工程は、ｐＨが９．５以下のリフォールド緩衝液を含む。

好適には、免疫複合体は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。

例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞表面受容体、好適には、ＣＤ２２に結合する。

好適には、免疫複合体は、毒素、例えば、限定するものではないが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆおよびこれらの変異体、および誘導体などの毒素を含む。

例示的実施形態では、毒素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素またはその変異体であり、好適には、配列番号１６〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

ある実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬ配列を含み、好適には、ＶＨ配列は、配列番号６〜１１からなる群から選択され、ＶＬ配列は、配列番号２、および１２〜１５からなる群から選択される。

例示的実施形態では、免疫複合体は、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥまたはその変異体を含み、好適には、免疫複合体は、配列番号１のＶＨ−ＰＥ３８サブユニットおよび配列番号２のＶＬサブユニットを含むモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）免疫毒素である。

ある実施形態では、リフォールド緩衝液は、ｐＨ９．４を有する。

好適な実施形態において、フェドバッチプロセスでは、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約５２ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１３ｍＬの可溶化封入体の添加速度、より好適には、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３５ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１７ｍＬの可溶化封入体の添加速度、または毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３０ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１８ｍＬの可溶化封入体の添加速度、あるいは、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約２６ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する。

好適には、様々な方法で用いるストリッピング緩衝液は、約３０〜６０ｍＭエタノールアミン、約０．２５〜約０．７５Ｍアルギニン、約１〜３ｍＭＥＤＴＡ、約７〜９Ｍ尿素および約９〜１１ｍＭＤＴＴを含む。

また、約２５％〜約１％未満の脱アミド種を有する免疫複合体を含む組成物も提供され、ここで、前記免疫複合体は、本明細書に開示する様々な方法により調製される。

さらに、活性免疫複合体を調製する方法であって、前記免疫複合体は１つまたは複数の残基で脱アミド化されており、かつその脱アミド化によって前記免疫複合体の効力の抑制が起こる方法も提供される。好適には、本方法は、ｐＨが９．５以下のリフォールド緩衝液を用いて、フェドバッチプロセスで免疫複合体をリフォールディングする工程と、イオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて、リフォールディングされた免疫複合体を精製する工程とを含み、ここで、第１溶出と第２溶出の間に、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液を用いて前記カラムをストリッピングする。

好適には、調製方法から回収される免疫複合体の量は、フェドバッチリフォールディングプロセスおよび／またはストリッピング緩衝液を用いてストリッピングされたイオン交換カラムでの２サイクル溶出を含まない方法を使用して回収された免疫複合体の量と比較して、少なくとも三百％（３００％）多い。

さらなる実施形態、これら実施形態の特徴および利点、ならびに様々な実施形態の構造および操作について、添付の図面を参照しながら以下に詳しく説明する。

本明細書に記載するモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の好適な再生および精製プロセスを示す。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程（サイクル１）の結果を示す。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの結果を示す。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィの結果を示す。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィの結果を示す。カラムロード負荷は、１０．４ｇ／Ｌである。部分的に精製されたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のＩＥＣ分析の結果を示す。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程（サイクル１）の結果を示す。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの結果を示す。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィの結果を示す。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィの結果を示す。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程クロマトグラムの結果を示す。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）キャリーオーバークロマトグラムの結果を示す。カラム洗浄のためにモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）封入体（ＩＢ）可溶化緩衝液を用いたＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラムの結果を示す。ＩＢ可溶化緩衝液を用いたＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）キャリーオーバークロマトグラムの結果を示す。ＩＢ可溶化緩衝液を用いたＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）ブランク緩衝液クロマトグラムの結果を示す。９回の精製サイクル後のＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）キャリーオーバークロマトグラムの結果を示す。代表的なＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムの結果を示す。図１７に示すＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ精製画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。代表的なＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ捕捉工程クロマトグラムの結果を示す。

本明細書に提示および説明する具体的実装形態は例であって、その適用範囲を限定することを意図するものでは決してない。

本明細書で引用した公開特許、特許出願、ウェブサイト、社名、および科学文献は、それらの各々があたかも参照により組み込まれることが明確かつ個別に示されているのと同じ程度まで、それらの全内容を参照により本明細書に組み込むものとする。本明細書に引用したいずれかの参照文献と本明細書の具体的教示内容との間に何らかの矛盾が生じた場合、本明細書を優先して解決されるものとする。同様に、単語またはフレーズの当該技術分野で理解される定義と、本明細書で具体的に教示される単語またはフレーズの定義との間に何らかの矛盾が生じた場合も、本明細書を優先して解決されるものとする。

本明細書で用いるとき、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文面が明らかに他を指示しているのでない限り、それが指す用語の複数形も明確に包含する。用語「約」は、本明細書において、およそ、ほぼ、概して、または前後を意味するために用いられる。用語「約」が、数値範囲と一緒に用いられるとき、これは、その限界を、記載される数値の上下に延長することにより、上記範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書において、２０％の差異で記載値を上下して、数値を変更するために用いられる。

本明細書で用いる技術および科学用語は、別途定義されない限り、本出願が関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者には周知の様々な方法および材料を参照する。組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載する標準的参照文献としては、以下：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，”２ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，”ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ（１９９５）；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，“ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，”ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が挙げられ、これら各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク質フラグメント」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指す同義語として使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸に対して人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーにも、また天然のアミノ酸ポリマーや非天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。

用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似物、および天然アミノ酸と類似の機能を有するアミノ酸模倣物をいう。天然アミノ酸は、遺伝子コードでコードされたもの、および後で改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸塩およびＯ−ホスホセリンなどである。アミノ酸類似物は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合したアルファ炭素などを有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。そのような類似物は、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または改変されたペプチド主鎖を有することができるが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸に類似した機能を有する化合物をいう。負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸（またはアスパラギン酸塩）およびグルタミン酸（またはグルタミン酸塩）が挙げられる。正荷電アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンが挙げられる。

本明細書において、精製すべき「組成物」は、目的のポリペプチドと１種以上の不純物とを含む。組成物は、「部分的に精製する」（すなわち、１つ以上の精製工程にかけられている）ことができ、またはポリペプチドを生成する宿主細胞または器官から直接得ることができる（例えば、組成物は、取り込んだ細胞の培養液を含むことができる）。

「酸性変異体」は、目的のポリペプチドより酸性度が高い（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィにより測定される）、ポリペプチドまたは免疫複合体の変異体である。酸性変異体の例として、脱アミド変異体がある。脱アミドタンパク質は、グルタミンからグルタミン酸への転換などのように、フリーのアミド官能基のいくつかまたは全てをカルボン酸へと加水分解させたものである。この反応速度は、一次配列、３次元構造、ｐＨ、温度、緩衝液の種類、イオン強度および他の溶液特性に依存する。重要なのは、脱アミド反応は分子に負の電荷を導入することである。以下でさらに説明するように、タンパク質の脱アミド化は、タンパク質の活性に悪影響を与え得る。

本明細書では、用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味において同義語として使用され、モノクローナル抗体（例えば、完全長または完全なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいての二重特異性抗体）、および本明細書に記載する抗体フラグメントを含む。用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なる結合特異性を有する任意の抗体を含むことを意図するものである。すなわち、この抗体は、同じ標的抗原上、または、より一般的には、異なる標的抗原上に位置し得る２つの異なるエピトープに結合する。

自然抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）および２つの同じ重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖と結合するが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変化する。各重鎖および軽鎖はまた、一定の間隔を置いて鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間のインターフェースを形成すると考えられている（Ｃｌｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１−６６，１９８５；ＮｏｖｏｔｎｙａｎｄＨａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，４５９２−４５９６（１９８５））。５つのヒト免疫グロブリンクラスが、重鎖の構成に基づいて定義され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤと名付けられている。ＩｇＧクラスおよびＩｇＡクラスの抗体は、さらにサブクラスに、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類される。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体の重鎖は、ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３と呼ばれる３つの定常領域ドメインを有し、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体の重鎖は、ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の４つの定常領域ドメインを有する。したがって、重鎖は１つの可変領域と３つまたは４つの定常領域を有する。免疫グロブリンの構造と機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８８）に概説されている。

用語「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部をいい、かつ完全な抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび単鎖Ｆｖフラグメント、線形フラグメント、単鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書では、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかに存在し得る、自然に発生し得る突然変異体を除いて同じである。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に結合する。さらに、通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を対象とする。抗体が「選択的に結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体が、無関係のタンパク質を含む代替物質よりも、エピトープに対して、より頻繁に、より急速に、より長時間にわたって、より強い親和性で、またはこれらのいくつかの組み合わせで、反応、または結びつくことを意味する。「選択的に結合する」または「特異的に結合する」とは、例えば、抗体が、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭのＫ_Dでタンパク質と結合することを意味する。「選択的に結合する」または「特異的に結合する」とは、抗体が、時には少なくとも約０．１μＭまたはより良好なＫ_Dで、他の時には少なくとも約０．０１μＭまたはより良好なＫ_Dで、タンパク質と結合することを、時には意味する。異なる種の相同タンパク質の間に配列の同一性があるために、特異的結合には、腫瘍細胞マーカータンパク質を１種以上の種の中で認識する抗体が含まれ得る。

本明細書の抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の、対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は、他の種に由来するか、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびそのような抗体のフラグメント（これらが所望の生物学的活性を示す限り）の、対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５７：６８５１−６８５５（１９８４））。

非ヒト（例えば、マウスなど）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長目動物などの非ヒト種（ドナー抗体）の高度可変領域の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見られない残基を含むことができる。これらの改質は、抗体の働きをさらに高めるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、高度可変領域ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの全てを実質的に含むであろう。ヒト化抗体はまた、任意選択により、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。詳しくは、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２７：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。次のレビュー記事、およびそこでの引用文献も参照されたい。ＶａｓｗａｎｉａｎｄＨａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅａｎｄＧｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。

「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体、および／または本明細書に記載するヒト抗体の作製手法を使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。

本明細書では、用語「免疫複合体」または「複合体」または「免疫毒素」は、細胞結合剤（例えば、抗ＣＤ２２抗体またはそのフラグメント）に結合し、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａ（但し、Ｃ＝細胞毒、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤（例えば、抗ＣＤ２２抗体または抗体フラグメント））で定義される化合物またはその誘導体をいう。免疫複合体はまた、順序を逆にした一般式：Ａ−Ｌ−Ｃで定義することもできる。

本明細書では、用語「細胞毒」または「細胞毒薬物」は、細胞機能の抑制または妨害、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ²¹¹、Ｉ¹³¹、Ｉ¹²⁵、Ｙ⁹⁰、Ｒｅ¹⁸⁶、Ｒｅ¹⁸⁸、Ｓｍ¹⁵³、Ｂｉ²¹²、Ｐ³²およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素およびそのフラグメント、抗生物質、および低分子毒素、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性を有する毒素（これらのフラグメントおよび／または変異体を含む）、ならびに、後述する各種の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことを意図している。細胞毒薬物の例としては、アブリン、リシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、またはこれらの改質毒素が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的には肝毒性によって死に至る高毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥおよびＤＴは、この毒素固有の標的成分（例えば、ＰＥドメインｌａまたはＤＴのＢ鎖）を除去し、抗体などの異なる標的部分で置き換えることにより、免疫毒素として使用する形態に改変することができる。

いくつかの実施形態では、毒素はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素である。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ）は、非常に活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により分泌され、伸長因子２（ＥＦ−２）を、そのＡＤＰ−リボシル化を触媒する（酸化されたＮＡＤのＡＤＰリボシル部分のＥＦ−２への転移を触媒する）ことにより不活性化させて、真核細胞におけるタンパク質の合成を阻害する。

「ＰＥ免疫複合体」または「ＰＥ免疫毒素」は、抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥ毒素またはその変異体とを含む免疫複合体または免疫毒素である。

ポリペプチドおよび１種以上の不純物を含む組成物からポリペプチドまたは免疫複合体を「精製する」とは、組成物から少なくとも１種の不純物を（完全に、または部分的に）除去することにより、組成物中のポリペプチドの純度を高めることを意味する。本発明では、親和性クロマトグラフィの工程を使用せずに精製を行う。

用語「クロマトグラフィ」は、混合物の個々の溶質が移動相の影響下に固定媒体中を移動する速度、すなわち結合および溶出プロセスに差があることにより、混合物中の目的の溶質を混合物中の他の溶質から分離する方法をいう。

用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィ」は、混合物中の溶質不純物または汚染物質よりも、目的の溶質が、荷電化合物とより強くまたはより弱く非特異的に相互作用するように、混合物中の目的の溶質（タンパク質など）が、固相イオン交換物質に結合した（共有結合などにより）荷電化合物と相互作用するクロマトグラフィ法をいう。混合物中の汚染性溶質は、目的の溶質よりも、イオン交換物質のカラムから、より速くもしくはより遅く溶出するか、または目的の溶質と比べて、樹脂と結合するかもしくは樹脂から排除される。具体的には、「イオン交換クロマトグラフィ」には陽イオン交換、陰イオン交換および混合モードクロマトグラフィが含まれる。

「イオン交換物質」という句は、負に帯電（すなわち、陽イオン交換樹脂）または正に帯電（すなわち、陰イオン交換樹脂）した固相を意味する。帯電は、１種以上の荷電リガンドを、例えば共有結合により固相と結合させることにより行うことができる。あるいは、またはさらに、帯電は固相固有の特性であってもよい（例えば、全体として負に帯電しているシリカの場合のように）。

「陰イオン交換樹脂」は、正に帯電し、したがって、固相に結合した１種以上の正荷電リガンドを有する固相をいう。第４級アミノ基など、陰イオン交換樹脂の形成に適した、固相に結合する正荷電リガンドであれば、いかなるものも使用することができる。商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂としては、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＥＡＥセルロース、ＰｏｒｏｓＰＩ２０、ＰＩ５０、ＨＱ１０、ＨＱ２０、ＨＱ５０、Ｄ５０、ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒのＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑおよび３０Ｑ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＷＰＰＥＩ、ＷＰＤＥＡＭ、ＷＰＱＵＡＴ、ＢｉｏｃｈｒｏｍＬａｂｓＩｎｃ．のＨｙｄｒｏｃｅｌｌＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌＱＡ、ＢｉｏｒａｄのＵＯｓｐｈｅｒｅＱ、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＨｉｇｈＱ、ＰａｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤＱ、ｃｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤＤＥＡＥ、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＭおよびＬＳＤＥＡＥ、ＳｐｈｅｒｏｄｅｘＬＳＤＥＡＥ、ＱＭＡＳｐｈｅｒｏｓｉｌＬＳ、ＱＭＡＳｐｈｅｒｏｓｉｌＭおよびＭｕｓｔａｎｇＱ、ＤｏｗＬｉｑｕｉｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓのＤＯＷＥＸＦｉｎｅＭｅｓｈＳｔｒｏｎｇＢａｓｅＴｙｐｅＩａｎｄＴｙｐｅＩＩＡｎｉｏｎＲｅｓｉｎｓおよびＤＯＷＥＸＭＯＮＯＳＰＨＥＲＥ７７、弱塩基陰イオン、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＩｎｔｅｒｃｅｐｔＱｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭａｔｒｅｘＣｅｌｌｕｆｉｎｅＡ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００、ＥＭＤのＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＴＭＡＥ、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＡｍｂｅｒｌｉｔｅｗｅａｋｓｔｒｏｎｇａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓｔｙｐｅＩａｎｄＩＩ、ＤＯＷＥＸｗｅａｋａｎｄｓｔｒｏｎｇａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓｔｙｐｅＩａｎｄＩＩ、ＤｉａｉｏｎｗｅａｋａｎｄｓｔｒｏｎｇａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓｔｙｐｅＩａｎｄＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ、東ソー株式会社のＴＳＫｇｅｌＱ、およびＤＥＡＥ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＷｈａｔｍａｎのＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ＩｏｎＤおよびＥｘｐｒｅｓｓ−ＩｏｎＱが挙げられる。

「固相」は、１種以上の荷電リガンドが付着することができる非水性マトリックスを意味する。固相は、精製カラム、ばらばらの粒子からなる不連続相、膜またはフィルターなどであってよい。固相を形成する物質の例としては、ポリサッカリド（アガロースおよびセルロースなど）、ならびにシリカ（例えば、制御された多孔質ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、およびこれらの任意の派生物などの機械的に安定な他のマトリックスが挙げられる。

本明細書において、目的の分子と、固相マトリックスに結合しているリガンドとの相互作用を説明するためなどに使用される用語「特異的結合」は、結合部位における静電力、水素結合、疎水性力および／またはファンデルワールス力と、結合部位におけるタンパク質とリガンドの構造の空間的相補性とが組み合わされた複合効果による、目的のタンパク質のリガンドへの一般的な可逆的結合をいう。結合部位における空間的相補性が大きく、かつ他の力が強いほど、それぞれのリガンドに対するタンパク質の結合特異性は強くなるであろう。特異的結合の例としては、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−補助因子結合、金属イオンキレート化、ＤＮＡ結合性タンパク質−ＤＮＡ結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、目的の分子と、固相マトリックスに結合しているリガンドまたは他の化合物との相互作用を説明するためなどに使用される用語「非特異的結合」は、相互作用部位における静電力、水素結合、疎水性力および／またはファンデルワールス力により、目的のタンパク質が固相マトリックス上のリガンドまたは化合物に結合することをいうが、非構造的な力の効果を高める構造的相補性は有さない。非特異的相互作用の例としては、静電力、疎水性力およびファンデルワールス力の他、水素結合も挙げられるが、これらに限定されない。

本発明で使用する「緩衝液」は、酸−塩基複合体成分の作用によって、酸または塩基の添加によるｐＨの変化に抵抗する溶液である。本発明の方法では、緩衝液の所望のｐＨと精製プロセスの特定の工程に応じて、各種の緩衝液を使用することができる［Ｂｕｆｆｅｒｓ．ＡＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＵｓｅｏｆＢｕｆｆｅｒｓｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，ｅｄ．ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）を参照されたい］。本発明の方法に望ましい範囲のｐＨに制御するために使用することができる緩衝液成分の例としては、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム緩衝液、コハク酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓなどの他に、これらＴＲＩＳ−リンゴ酸−ＮａＯＨ、マレイン酸塩、クロロ酢酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、メチルアミン、ピペリジン、Ｏ−ホウ酸、炭酸、乳酸、ブタン二酸、ジエチルマロン酸、グリシルグリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、フェノール、ＰＯＰＳＯ、コハク酸塩、ＴＡＰＳ、アミンベースの、ベンジルアミン、トリメチルまたはジメチルまたはエチルまたはフェニルアミン、エチレンジアミン、またはモルフォリンの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、緩衝液中に追加成分（添加剤）を含有させることができ、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩を、緩衝液のイオン強度の調節に使用することができ、また、アミノ酸（グリシンおよびヒスチジンなど）、カオトロープ（尿素など）、アルコール（エタノール、マンニトール、グリセロールおよびベンジルアルコールなど）、洗剤（上記参照）、および糖（スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコースおよび果糖など）などの他の添加剤を含有させることができる。使用する緩衝液成分および添加剤と、それらの濃度は、本発明で実施するクロマトグラフィの種類によって変えることができる。

「ローディング緩衝液」は、目的のポリペプチド分子と１種以上の不純物とを含む組成物を、イオン交換樹脂にロードするために使用されるものである。ローディング緩衝液は、目的のポリペプチド分子（および、一般には、１種以上の不純物）がイオン交換樹脂に結合するか、または不純物が樹脂に結合している間、目的のタンパク質がカラム内を流れるような、電気伝導率および／またはｐＨを有する。

本明細書中で使用されるとき、用語「洗浄緩衝液」は、目的のポリペプチド分子を溶出させる前に、イオン交換樹脂を洗浄または再平衡化させるために使用する緩衝液をいう。都合のよいことに、洗浄緩衝液とローディング緩衝液が同じであってよい。しかし、このことは要求されない。

「溶出緩衝液」は、目的のポリペプチドを固相から溶出するために使用される。溶出緩衝液の電気伝導率および／またはｐＨは、目的のポリペプチドがイオン交換樹脂から溶出されるような値である。

ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷とバランスするｐＨをいう。ｐｉは、アミノ酸残基またはポリペプチド結合炭水化物のシアル酸残基の正味の電荷から計算するか、または等電点電気泳動により測定することができる。

分子をイオン交換物質に「結合させる」とは、分子とイオン交換物質の１つまたは複数の荷電基との間のイオン的相互作用によって、分子がイオン交換物質の内部または表面上に可逆的に固定化されるように、その分子を適当な条件（ｐＨ／電気伝導率）下でイオン交換物質に暴露することを意味する。

イオン交換物質を「洗浄する」とは、イオン交換物質の内部または表面に適当な緩衝液を流すことを意味する。

イオン交換物質から分子（例えば、ポリペプチドまたは不純物）を「溶出させる」とは、イオン交換物質上の荷電部位に対し緩衝液とその分子が競合するように、イオン交換物質を取り囲む緩衝液のイオン強度を変えることによって、その分子をイオン交換物質から除去することを意味する。

本開示および請求項で使用されるとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈がそうではないことを明確に示していない限り、複数形が含まれる。

本明細書において、実施形態が用語「〜を含む」を使用して記載されている場合は、常に、「〜からなる」および／または「実質的に〜からなる」という用語で記載される別の類似の実施形態もまた提供されていると理解される。

本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」のいずれもを含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用されるとき、用語「および／または」は、次の各実施形態：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含することを意図している。

シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素および他の毒素
毒素を本発明の抗体と共に使用して、免疫毒素を得ることができる。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびこれらのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は商業的供給源（例えば、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から容易に入手することができる。ジフテリア毒素は、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）から単離される。リシンは、リキヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマの実）からのレクチンＲＣＡ６０である。この用語はまた、この毒素変異体も参照する。例えば、米国特許第５，０７９，１６３号明細書および同第４，６８９，４０１号明細書を参照されたい。リキヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素（ＲＣＡ）は、それぞれ約６５および１２０ｋＤの分子量により、ＲＣＡ₆₀およびＲＣＡ₁₂₀と呼ばれる２つの形態で生ずる（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ＆Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２６６：５４３（１９７２））。Ａ鎖はタンパク質合成を不活性化し、細胞を殺滅する役割を担う。Ｂ鎖は細胞表面のガラクトース残基にリシンを結合させ、サイトゾル中へのＡ鎖の輸送を助ける（Ｏｌｓｎｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２４９：６２１−６３１（１９７４）および米国特許第３，０６０，１６５号明細書）。

アブリンには、アブルス・プレカロリウス（Ａｂｒｕｓｐｒｅｃａｌｏｒｉｕｓ）からの毒性レクチンが含まれる。毒性成分、アブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３および６７ｋＤの分子量を有し、２本のジスルフィド結合ポリペプチド鎖ＡおよびＢからなる。Ａ鎖はタンパク質の合成を抑制し、Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：１０９５（１９８８）；およびＯｌｓｎｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５０：３３０−３３５（１９７８）を参照されたい）

本発明の好ましい実施形態では、毒素はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）である。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（または外毒素Ａ）は、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により産生される外毒素である。本明細書では、用語「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素」は、完全長の天然（天然に存在する）ＰＥ、または改変されたＰＥをいう。そのような改変には、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩの各種アミノ酸の削除、単一アミノ酸の置換、およびカルボキシル末端での、ＫＤＥＬ（配列番号３）およびＲＥＤＬ（配列番号４）などの１種以上の配列の追加を含み得るが、これらに限定されない。Ｓｉｅｇａｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１（１９８９）を参照されたい。好ましい実施形態では、ＰＥの細胞毒フラグメントは、天然ＰＥの細胞毒性の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％を保持する。最も好ましい実施形態では、細胞毒フラグメントは、天然ＰＥより高い毒性を有する。

天然のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ）は、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により分泌される極めて活性の高い単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、真核細胞のタンパク質合成を抑制する。天然ＰＥの配列は、広く譲渡されている米国特許第５，６０２，０９５号明細書に示されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。作用の方法は、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活性化である。この外毒素は、協調して細胞毒性を引き起こす３つの構造ドメインを含む。ドメインＩａ（１−２５２位のアミノ酸）は、細胞結合を仲介する。ドメインＩＩ（２５３−３６４位のアミノ酸）はサイトゾルへの転移を担い、ドメインＩＩＩ（４００−６１３位のアミノ酸）は伸長因子２のＡＤＰリボシル化を仲介する。ドメインｂ（３６５−３９９位のアミノ酸）の機能は、依然未定義であるが、その大部分であるアミノ酸３６５−３８０は細胞毒性を損なうことなく削除することができる。上記のＳｉｅｇａｌｌ，ｅｔａｌ．，（１９８９）を参照されたい。

本発明で使用するＰＥには、天然配列、天然配列の細胞毒フラグメント、天然ＰＥおよびその細胞毒フラグメントを保存的に改変した変異体が含まれる。本発明で有用なＰＥ変異体は、米国特許第７，３５５，０１２号明細書、ならびに国際公開第２００７／０１６１５０号パンフレットおよび国際公開第２００９／０３２９５４号パンフレットに記載されており、これら各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥの細胞毒フラグメントには、その後の標的細胞中でタンパク質の分解その他の処理（例えば、タンパク質またはプレタンパク質として）を行うか否かにかかわらず、細胞毒性を有するものが含まれる。ＰＥの細胞毒フラグメントとしては、ＰＥ４０、ＰＥ３８およびＰＥ３５が挙げられる。

好ましい実施形態では、ＰＥは、非特異的細胞結合を低減または除去するために、米国特許第４，８９２，８２７号明細書に教示されているように、しばしばドメインＩａを除去することによって改変されているが、これはまた、例えば、ドメインＩａのある残基を変異させることによっても達成することができる。例えば、米国特許第５，５１２，６５８号明細書には、ドメインＩａは存在するが、ドメインＩａの５７位、２４６位、２４７位および２４９位の塩基性残基が、酸性残基（グルタミン酸、または「Ｅ」）により置換されている変異ＰＥでは、非特異的細胞毒性が大きく減少することが開示されている。ＰＥのこの変異体は、時にＰＥ４Ｅと呼ばれる。

ＰＥ４０は、当該技術分野で既に説明がなされているように、天然ＰＥ分子のドメインＩａが削除されている、ＰＥの短縮誘導体である。Ｐａｉ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ５５：３３５８−６２（１９９１）；およびＫｏｎｄｏ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５（１９８８）を参照されたい。ＰＥ３５は、１〜２７９位のアミノ酸残基が削除されていて、分子は２８０位のｍｅｔから始まり、天然ＰＥの２８１〜３６４位および３８１〜６１３位のアミノ酸が続く、ＰＥの３５ｋＤのカルボキシル末端フラグメントである。ＰＥ３５およびＰＥ４０については、例えば、米国特許第５，６０２，０９５号明細書および同第４，８９２，８２７号明細書に開示されている。ＰＥ４Ｅは、天然ＰＥの全てのドメインを含むが、ドメインＩａの５７、２４６、２４７および２４９位の塩基性残基が酸性残基（グルタミン酸または「Ｅ」）により置換されている、ＰＥの形態である。

いくつかの好ましい実施形態では、細胞毒フラグメントＰＥ３８が使用される。ＰＥ３８は、２５３〜３６４位および３８１〜６１３位のアミノ酸からなり、細胞内でのプロセシング時に、活性化されて細胞毒となる、短縮ＰＥプロタンパク質である（例えば、米国特許第５，６０８，０３９号明細書、同第７，３５５，０１２号明細書、およびＰａｓｔａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３３３：Ｃ₁〜Ｃ₆（１９９７）を参照されたい；尚、これら各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

上述したように、ドメインｌｂの一部または全部は削除され得るものであり、残りの部分はリンカーによって結合するか、またはペプチド結合によって直接結合している。ドメインＩＩのアミノ部分の一部は削除され得る。そして、Ｃ末端は、天然配列の６０９〜６１３位残基（ＲＥＤＬＫ）（配列番号５）、またはサイトゾルへの移行を構成する能力を維持することが見出されている、ＲＥＤＬ（配列番号４）またはＫＤＥＬ（配列番号３）などの変異体、およびこれらの配列の繰り返しを含み得る。例えば、米国特許第５，８５４，０４４号明細書、同第５，８２１，２３８号明細書および同第５，６０２，０９５号明細書、ならびに国際公開第９９／５１６４３号パンフレットを参照されたい。好ましい実施形態では、ＰＥは、ＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０またはＰＥ３８であるが、標的細胞中における移行およびＥＦ−２リボシル化能力を維持している限り、非標的細胞に対して重大な毒性を引き起こさないレベルにまで、非特異的細胞毒性が除去または低減されているものであれば、いかなる形態のＰＥも本発明の免疫毒素に使用することができる。

ＰＥの保存的に改変された変異体
ＰＥ３８などの目的のＰＥに関して、その保存的に改変された変異体またはその細胞毒フラグメントは、アミノ酸のレベルで、少なくとも８０％の配列類似性、好ましくは少なくとも８５％の配列類似性、より好ましくは少なくとも９０％の配列類似性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する。

用語「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸にも核酸配列にも適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変された変異体は、同一、または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、実質的に同一の核酸配列をいう。遺伝子コードの縮退のために、多数の、機能的に同一の核酸が、任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを記載された対応する任意のコドンに変更し得る。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、それらは保存的に改変された変異体の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、全ての可能性のある核酸のサイレント変異を示している。核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を改変して機能的に同一の分子を得ることができることは、当業者であれば認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記述された各配列に暗に示されている。

アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸または僅かな割合のアミノ酸を変更、追加または削除する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、削除または追加が、変更がアミノ酸をそれと化学的に類似したアミノ酸で置換することになる「保存的に改変された変異体」であることを認識するであろう。

本発明で使用するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素の所望するレベルの細胞毒性は、当業者によく知られた分析法によって分析することができる。したがって、ＰＥの細胞毒フラグメントと、そのようなフラグメントの保存的に改変された変異体の細胞毒性は、容易に分析することができる。当該技術分野でよく知られた方法で、多数の候補ＰＥ分子の細胞毒性を同時に分析することができる。例えば、候補分子のサブグループの細胞毒性を分析することができる。候補分子の陽性的に反応するサブグループは、所望の細胞毒フラグメントが同定されるまで、連続的に細分割し、再分析することができる。そのような方法により、多数の細胞毒フラグメントまたはＰＥの保存的変異体を迅速にスクリーニングすることができる。

抗ＣＤ２２／ＰＥ免疫複合体
一実施形態では、目的のポリペプチドはＣＤ２２と特異的に結合する抗体を含む。「ＣＤ２２」は、Ｉｇスーパーファミリーに属する系列制限Ｂ細胞抗原をいう。これはＢ細胞リンパ腫および白血病の６０〜７０％に発現し、Ｂ細胞の成長初期段階の細胞表面や幹細胞には存在しない。例えば、Ｖａｉｃｋｕｓｅｔａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ／Ｈｅｍａｔｏｌ．７７：２６７−２９７（１９９１）を参照されたい。他の実施形態では、目的のポリペプチドは、ＣＤ２２と結合する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。

抗体に関連する用語「抗ＣＤ２２」は、本明細書では、ＣＤ２２と特異的に結合する抗体をいい、ＣＤ２２に対して生ずる抗体の意味を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２は、ヒトＣＤ２２などの霊長目ＣＤ２２である。一実施形態では、この抗体は、非霊長目哺乳動物にヒトＣＤ２２をコードするｃＤＮＡを導入後、その動物よって合成されたヒトＣＤ２２に対して生ずる。さらに他の実施形態では、目的のポリペプチドは、ＰＥ３８外毒素を含むＣＤ２２抗体免疫複合体である。

ＣＤ２２／ＰＥ３８免疫複合体の一例は、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）であり、これは、国際公開第２０１２／０１５９１２号パンフレット、同第９８／４１６４１号パンフレットおよび同第２００３／２７１３５号パンフレット、米国特許第７，５４１，０３４号明細書、同第７，３５５，０１２号明細書、および米国特許出願公開第２００７／０１８９９６２号明細書に記載されており、これらの文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（ＣＡＴ−８０１５）は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素タンパク質ＰＥ３８の短縮形態に融合した、マウス抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４をベースとする抗体Ｆｖフラグメントからなる組み換え免疫毒素タンパク質である。抗ＣＤ２２Ｆｖフラグメントは、２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨからなり、後者はヒトＣＤ２２標的との結合が改善されるように改変されている。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）タンパク質は、２つの独立したポリペプチド、ＶＬ鎖（配列番号２）、およびＣ末端でＰＥ３８ドメインに融合したＶＨ鎖（ＶＨ−ＰＥ３８）（配列番号１）からなる。本発明に有用な他のＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８配列は、米国特許第７，５４１，０３４号明細書、同第７，３５５，０１２号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１８９９６２号明細書および国際公開第２０１２／０１５９１２号パンフレットに記載されており、これら各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。両ドメインとも、それぞれ、分子間ジスルフィド結合の形成を可能にする改変システイン残基を含むように設計されている。この特徴により、融合タンパク質の安定性が高まる。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のＶＨ−Ｐ３８サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）は次の通りである。

ＰＥ３８配列は太字で示し、ＶＨドメインおよびＰＥ３８ドメイン間の５個のアミノ酸からなるリンカーには下線を付している。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のＶＬサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）は次の通りである。

別の実施形態では、免疫複合体のＶＨドメインのアミノ酸配列は、次のうちの１つである。

さらに他の実施形態では、免疫複合体のＶＬドメインのアミノ酸配列は、次のうちの１つである。

特定の他の実施形態では、免疫複合体のＰＥ毒素は、次のものから選択されるＰＥまたはその変異体である。
天然ＰＥ

ＰＥ４０

ＰＥ３８

ＰＥ３５

ＰＥ−ＬＲ

ＰＥ−ＬＲ−６Ｘ

ＰＥ３８（モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ））

免疫複合体のＰＥ毒素は、直接またはリンカーを介して、ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端またはＣ末端で、ＶＨまたはＶＬドメインに融合または接合する。リンカーの一例は、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）について上に記載されており、アミノ酸配列ＫＡＳＧＧ（配列番号２３）に対応する。他のリンカーは、この技術分野で知られた方法で容易に生じさせることができる。

ＰＥ免疫複合体の発現
本発明のＰＥ免疫複合体は、細菌細胞などの細胞内で好適には発現し、その後、封入体から単離される。次いで、封入体から単離されたＰＥ免疫複合体は、本明細書に記載の通り下流の工程でさらに精製／単離される。

本発明のＰＥ免疫複合体を発現させるために、様々な宿主−発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主−発現ベクター系は、目的のコード配列を生成し、次いで精製し得るビヒクルを表すものであるが、また、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入されたとき、本発明の抗体分子をインサイチュで発現することができる細胞を表すものでもある。これらには、抗体コード配列を含む、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体コード配列を含む、組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させるか、または抗体コード配列を含む組み換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）、または哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含む組換え発現構成体を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ毒素（例えば、ＶＨ−ＰＥ３８）ポリペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡは、当分野でよく知られた方法で、発現ベクターに導入され得る。

「ベクター」は、ある核酸を宿主細胞へクローニングおよび／または転移させるための任意のビヒクルをいう。ベクターは、他のＤＮＡセグメントが結合して複製される複製子であってもよい。「複製子」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的管理単位として機能する、すなわち、それ自身のコントロール下で複製し得る任意の遺伝因子（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。用語「ベクター」には、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのビヒクルが含まれる。核酸の操作や、応答配列および誘導性プロモータなどのプロモータの遺伝子への組み込みなどのために、当分野で知られている多くのベクターを使用することができる。可能性のあるベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはブルースクリプトベクターが挙げられる。例えば、応答配列およびプロモータに対応するＤＮＡフラグメントの適切なベクターへの挿入は、適当なＤＮＡフラグメントを、相補的な付着端を有する選択されたベクターに結合させることによって行うことができる。あるいは、ＤＮＡ分子の末端を酵素により改変するか、または、ＤＮＡの末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合させることにより、任意のサイトを生成してもよい。そのようなベクターは、細胞を選択する選択マーカー遺伝子を含むよう操作することができる。そのようなマーカーにより、そのマーカーでコードされたタンパク質を発現する宿主細胞の同定および／または選択を行うことができる。

用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換後に挿入された核酸配列の発現を可能にするよう設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルをいう。クローン化された遺伝子、すなわち挿入された核酸配列、例えば抗ＣＤ２２ＶＨ、抗ＣＤ２２ＶＬ、またはＰＥ毒素に融合した抗ＣＤ２２ＶＨもしくはＶＬをコードする遺伝子は、通常、プロモータ、細小プロモータ、エンハンサーなどの調節因子のコントロール下に置かれる。所望の宿主細胞で核酸を発現させるのに有用な開始調節領域またはプロモータは多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を発現させることができるプロモータは、実質的にいかなるものも、発現ベクターにおいて使用することができ、限定はされないが、ウイルスプロモータ、バクテリアプロモータ、動物プロモータ、哺乳類プロモータ、合成プロモータ、構成プロモータ、組織特異性プロモータ、発病または病気関連プロモータ、成長特異的プロモータ、誘導性プロモータ、光制御プロモータが挙げられ；限定はされないが、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０）プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）に含まれるプロモータ、アデノウイルス（Ａｄ）のＥＩＡもしくは主要な後期プロモータ（ＭＬＰ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期プロモータ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、バキュロウイルスＩＥ１プロモータ、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモータ、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモータ、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、ユビキチンＣ（Ｕｂｅ）プロモータ、アルブミンプロモータ、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモータおよび転写調節領域の制御配列、ユビキタスプロモータ（ＨＰＲＴ、ビメンチン、β−アクチン、チューブリンなど）、中間径線維のプロモータ（デスミン、神経細線維、ケラチン、ＧＦＡＰなど）、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、または第ＶＩＩＩ因子タイプなどの）のプロモータ、発病または病気関連プロモータが挙げられる。さらに、これらの発現配列は、エンハンサーまたは制御配列などの追加によって改変することができる。

用語「発現」は、コード配列によってコードされた生成物の生物学的生成をいう。殆どの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成するために転写される。その後、メッセンジャーＲＮＡは翻訳され、関連する生物学的活性を有するポリペプチド生成物を生成する。発現のプロセスには、また、イントロンを除去するためのスプライシングなどの転写ＲＮＡ生成物に対するさらなる処理工程、および／またはポリペプチド生成物の翻訳後処理が含まれ得る。

ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８ポリペプチドを、細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞内で好適には発現させる。ポリペプチドは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内で発現させ、封入体から単離する。ある実施形態では、ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８サブユニットを、異なる細胞で発現させる。例えば、ＶＬを、１つの細胞内の第１のベクターに発現させ、ＶＨ−ＰＥ３８を、異なる細胞内の第２のベクターに発現させる。他の実施形態では、ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８サブユニットを、同じ細胞内の異なるベクターに発現させる。例えば、ＶＬを１つの細胞内の第１のベクターに発現させ、ＶＨ−ＰＥ３８を同じ細胞内の異なるベクターに発現させる。他のある実施形態では、ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８サブユニットを、同じ細胞内の同じベクターに発現させる。本明細書に記載するように、細胞から封入体を回収して可溶化し、ＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８サブユニットを混合して免疫複合体を形成する。

免疫複合体の調製方法
ある実施形態では、活性免疫複合体、すなわち、所望の標的に結合して、細胞標的物質（例えば、抗体、抗体断片または他のタンパク質）と結合した化合物（免疫毒素）を送達することができる免疫複合体を調製する方法が本明細書に提供される。

本明細書に記載する方法は、好適には、１つまたは複数の残基で脱アミド化されている免疫複合体を調製するために用いられる。本明細書に記載するように、このような脱アミド化によって、前記免疫複合体の効力の抑制が起こるため、記載される方法は、臨床の現場に好適な活性免疫複合体を調製するのに有益である。

本明細書に記載するように、免疫複合体は、好適には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌由来の発現系を用いて調製する。細胞から封入体を回収し、可溶化した後、タンパク質を回収する。ある実施形態では、本明細書に記載するように、免疫複合体を形成するように設計したＶＬおよびＶＨ毒素サブユニットを細菌細胞に調製する。

本明細書に記載するように、所望の免疫複合体サブユニットを含む封入体を可溶化し、濃縮した後、清澄化する。清澄化の好適な方法は、本明細書ならびに国際公開第２０１２／０１５９１２号パンフレットに記載されており、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。清澄化の後、免疫複合体のリフォールディングを実施する。

ある実施形態では、免疫複合体の調製方法は、好適には、フェドバッチプロセスを用いて、免疫複合体をリフォールディングすることを含む。リフォールディングの後、リフォールディングされた免疫複合体を、本明細書ならびに国際公開第２０１２／０１５９１２号パンフレットに記載されているように、１つまたは複数のクロマトグラフィカラムで精製する。

本明細書で用いるとき、「リフォールディング」は、封入体から単離したタンパク質が、以前のランダム配向からその特徴的かつ機能的な３次元構造に折り畳まれるプロセスを指す。

「フェドバッチ」プロセスは、可溶化された封入体混合物（所望の免疫複合体を含有する）を、所定の時間にわたり、制御された速度で好適なリフォールド緩衝液に添加（すなわち、注入または混合）するリフォールディングプロセスを指す。好適には、添加は、時間経過全体にわたって一定の速度で行うが、必要に応じて、プロセスの間に速度を変化させてもよい。この添加時間経過は、本明細書において「添加速度」と呼ばれ、Ｌ／時で表される。

意外なことに、免疫複合体のサブユニットは、初め低濃度で存在し、比較的長い時間をかけて（好適には、２、３、４、５、６時間などの時間にわたり一定の添加速度で）増加させれば、サブユニットのバルク添加を使用する非フェドバッチプロセス（濃度は、初め高いが、時間と共に変化しない）と比較して、免疫複合体の高い収率が得られることがみいだされた。この発見は、特に、単一成分タンパク質とは対照的に、最終免疫複合体を形成するのに一緒にリフォールド（すなわち、希釈溶液中に一緒に存在）しなければならない本明細書に記載のＶＬおよびＶＨ−ＰＥ３８サブユニットを使用する場合、驚くべきことである。

例示的実施形態では、回収される免疫複合体の収率は、サブユニットのバルク添加およびサブユニットの一定濃度を使用する非フェドバッチプロセスと比較して、好適には少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％等高い。

特定の別の実施形態では、回収される免疫複合体の収率は、好適には少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％等高く、ここで、免疫複合体は、フェドバッチプロセスにおいて、ｐＨが９．５以下のリフォールド緩衝液中でリフォールディングする。別の実施形態では、リフォールディングされた免疫複合体は、イオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて精製するが、ここで、第１溶出と第２溶出との間で、前記カラムを、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする。他の実施形態では、前記免疫複合体を回収する工程は、非フェドバッチプロセスの回収工程に相当するが、但し、リフォールドは、ｐＨが９．５以下のリフォールド緩衝液中で行われ、および／またはイオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて前記免疫複合体を精製し、ここで、第１溶出と第２溶出との間で、前記カラムを、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする。

好適には、可溶化封入体の添加速度（Ｌ／時）は、約２〜８時間、好適には３〜６時間、３〜５時間にわたって、またはより好適には約４時間にわたって、可溶化封入体混合物がリフォールド緩衝液（好適には、予冷した）に添加されるように設定する。

ある実施形態では、添加は、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１００ｍＬの可溶化封入体の添加速度〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約５ｍＬの可溶化封入体の添加速度（約１００ｍＬ／Ｌ／時〜約５ｍＬ／Ｌ／時）を用いて、１〜１０時間にわたり行う。例示的実施形態では、添加は、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約５２ｍＬの可溶化封入体の添加速度〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１３ｍＬの可溶化封入体の添加速度（約５２ｍＬ／Ｌ／時〜約１３ｍＬ／Ｌ／時）を用いて、２〜８時間にわたり行う。別の実施形態では、添加は、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３５ｍＬの可溶化封入体の添加速度〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１７ｍＬの可溶化封入体の添加速度（約３５ｍＬ／Ｌ／時〜約１７ｍＬ／Ｌ／時）を用いて、３〜６時間にわたり行う。さらに別の実施形態では、添加は、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３０ｍＬの可溶化封入体の添加速度〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１８ｍＬの可溶化封入体の添加速度（約３０ｍＬ／Ｌ／時〜約１８ｍＬ／Ｌ／時）を用いて、３．５〜５時間にわたり行う。また別の実施形態では、添加は、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約２６ｍＬの可溶化封入体の添加速度（約２６ｍＬ／Ｌ／時）を用いて、約４時間にわたり行う。他の実施形態では、本明細書に記載するフェドバッチプロセスで、さらに別の速度を使用することができる。

また、１つまたは複数の残基で脱アミド化され、この脱アミド化によって免疫複合体の効力の抑制が起こる、免疫複合体を調製する別の方法も提供される。好適には、本方法は、本明細書に記載する方法のいずれかを用いて、または本明細書ならびに国際公開第２０１２／０１５２９１２号パンフレットに開示されているように、免疫複合体をリフォールドすることを含む。次に、リフォールドした免疫複合体を、イオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて精製する。

本明細書に記載したように、カラム洗浄および再使用のために、好適には、リフォールディングされた免疫複合体の操作サイクル（すなわち、カラムロード、洗浄、および溶出）の間に、ストリッピング緩衝液を用いて、カラムをストリッピングする。例示的実施形態では、本明細書に記載する方法に使用するストリッピング緩衝液は、緩衝されたアルギニン、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。本明細書に記載する方法は、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−などのカラムサイクルも使用し、連続した各サイクルの間に、ストリッピング緩衝液を用いたストリッピングを行う。

驚くことに、本明細書に記載の組成物を有する連続サイクルの間に、好適には尿素およびアルギニンを含むストリッピング緩衝液を使用することによって、連続する溶出の間に、本明細書に記載するストリッピング緩衝液を使用しない溶出方法およびカラムと比較して、最終免疫複合体の収率増加がもたらされることが判明した。

ある実施形態では、回収される免疫複合体の収率は、連続する溶出の間に、本明細書に記載するストリッピング緩衝液を使用しない溶出方法およびカラムと比較して、好適には少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％等高い。

好適な実施形態では、本明細書に記載した方法で有用なストリッピング緩衝液は、約０．１０〜約０．９Ｍアルギニン、約５〜１０Ｍ尿素、および約７〜１５ｍＭＤＴＴを含む。より好適には、ストリッピング緩衝液は、約０．２５〜約０．７５Ｍアルギニン、約７〜９Ｍ尿素、および約９〜１１ｍＭＤＴＴを含む。より好適には、約０．４５〜約０．５５Ｍアルギニン、約７．５〜８．５Ｍ尿素、および約９．５〜１０．５ｍＭＤＴＴ。最も好適には、ストリッピング緩衝液は、約０．５０Ｍアルギニン、約８．０Ｍ尿素、および約１０．０ｍＭＤＴＴを含む。

本明細書に記載する様々な方法において、本明細書に記載するリフォールディング工程で使用されるリフォールディング緩衝液は、約１０．０以下、好適には約９．５以下、より好適には約９．４以下（例えば、約１０．０、約９．９、約９．８、約９．７、約９．６、約９．５、約９．３、約９．２、約９．１、または約９．０のｐＨ）のｐＨを有する。驚くことには、ｐＨが、約１０．０以下、約９．５以下、最も好適には約９．４未満のリフォールディング緩衝液を使用すると、前記の値より大きいｐＨを有するリフォールド緩衝液を使用するプロセスと比較して、最終免疫複合体の収率増加がもたらされることが判明した。

ある実施形態では、回収される免疫複合体の収率は、前記の値より大きいｐＨを有するリフォールド緩衝液を使用するプロセスと比較して、好適には少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％等高い。

本明細書に記載する様々な方法において、好適には、免疫複合体は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。全体を通して記載するように、好適には、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）₃、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ₂、（ｓｃＦｖ）₂、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。

例示的実施形態では、免疫複合体の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞表面受容体に結合する。例示的細胞表面受容体は、ＣＤ２２を含む。

好適な実施形態において、本明細書に記載する方法により調製される免疫複合体は毒素を含む。例示的毒素およびこのような毒素を調製する方法は、本明細書全体を通じて記載する。好適には、毒素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆもしくはこれらの変異体、または誘導体からなる群から選択される。ある実施形態では、毒素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはその変異体である。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）を調製する例示的方法は、本明細書において詳細に記載し、また、国際公開第２０１２／０１５９１２号パンフレットにも記載されている。

ある実施形態では、本明細書に記載する免疫複合体で用いられるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素は、配列番号１６〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。好適には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはその変異体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。

好適には、免疫複合体の１成分である抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬ配列を含む。好適には、ＶＨ配列は、配列番号６〜１１からなる群から選択され、ＶＬ配列は、配列番号２、および１２〜１５からなる群から選択される。

全体を通して記載するように、免疫複合体を調製する方法は、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥまたはその変異体を含む免疫複合体を調製するために好適に用いられる。好適な実施形態では、本明細書に記載する様々な方法によって調製される免疫複合体は、配列番号１のＶＨ−ＰＥ３８サブユニットおよび配列番号２のＶＬサブユニットを含むモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）免疫毒素である。

さらに別の実施形態では、活性免疫複合体を調製する方法であって、活性免疫複合体の収率を増加することが判明した本明細書に記載の様々なプロセスを組み合わせる方法が提供される。好適には、免疫複合体は、１つまたは複数の残基で脱アミド化され、この脱アミド化によって、免疫複合体の効力の抑制が起こる。

本明細書に記載するように、このような方法は、好適には、免疫複合体を、ｐＨが９．５未満のリフォールド緩衝液中でのフェドバッチプロセスでリフォールディングする工程と、イオン交換カラムでの２サイクル溶出を用いて、リフォールディングされた免疫複合体を精製する工程を含み、ここで、第１溶出と第２溶出の間に、前記カラムを、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする。

好適には、本明細書に記載する様々な方法は、フェドバッチリフォールディングプロセスおよび／または前記ストリッピング緩衝液を用いてストリッピングされたイオン交換カラムでの２サイクル溶出を含まない、および／またはｐＨが９．４未満のリフォールディング緩衝液を使用しない方法を用いて回収された免疫複合体の量より、少なくとも３百％（３００％）高い、前記方法から回収される免疫複合体の量を提供する。

ある実施形態では、回収される免疫複合体の量は、フェドバッチリフォールディングプロセスおよび／または前記ストリッピング緩衝液を用いてストリッピングされたイオン交換カラムでの２サイクル溶出を含まない、および／またはｐＨが９．４未満のリフォールディング緩衝液を使用しない方法を用いて回収された免疫複合体の量と比較して、好適には少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％等高い。

本明細書に記載するように、好適には免疫複合体は、ＣＤ２２などの細胞表面受容体に結合する免疫複合体の抗体またはその抗原結合フラグメントなど、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。

好適な実施形態では、免疫複合体は、毒素、好適にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）を含む。好適には、免疫毒素の１成分である抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨおよびＶＬ配列を含む。好適には、ＶＨ配列は、配列番号６〜１１からなる群から選択され、ＶＬ配列は、配列番号２、および１２〜１５からなる群から選択される。全体を通して記載されるように、免疫複合体を調製する方法は、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥまたはその変異体を含む免疫複合体を調製するために好適に用いられる。好適な実施形態では、本明細書に記載する様々な方法によって調製される免疫複合体は、配列番号１のＶＨ−ＰＥ３８サブユニットおよび配列番号２のＶＬサブユニットを含むモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）免疫毒素である。

別の実施形態では、本明細書に記載する様々な方法により調製される免疫複合体を含む組成物が提供される。好適には、こうした方法により調製される免疫複合体は、約２５％〜約１％未満の脱アミド化種を有する。より好適には、約２５％未満の脱アミド化種が存在するか、または約２０％未満の脱アミド化種が存在するか、または約１０％未満の脱アミド化種が存在するか、または約５％未満の脱アミド化種が存在するか、または約３％未満の脱アミド化種が存在するか、または約２％未満の脱アミド化種が存在するか、または約１％未満の脱アミド化種が存在する。

当業者には、本明細書に記載する方法および適用に対する他の好適な変更形態および改変形態が、これら実施形態のいずれの範囲も逸脱することなく、実施可能であることは容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的で含まれるにすぎず、限定を意図するものではない。

実施例１：モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の再生および精製
概説
ＣＡＴ−８０１５（モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体に産生される組換え免疫毒素である。活性モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の生成には、好適には、不活性前駆体からのリフォールディングと、リフォールディングされた生成物の４カラムプロセスによる精製を使用する。図１は、再生および精製プロセスの概略を示す。

可溶化プロセスの目的は、ＶＨおよびＶＬを抽出し、好適には不溶性封入体から液相に転移させて、リフォールディングの前に両サブユニットを変性することである。深層濾過により、不溶性細胞残屑および可溶化ＶＨおよびＶＬからの封入体成分を除去する。次に、濾過物をタンジェント流濾過により固定リテンテート重量まで濃縮するが、これは、リテンテート希釈倍率および最終リフォールド重量により決定する。濃縮工程の役割は、ＶＨおよびＶＬ濃度およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）と酸化グルタチオンの比に関して、一貫したリフォールド開始条件を確実にすることである。

４カラム精製プロセスの目的は、例えば、ミスフォールド生成物変異体、凝集体、断片、および生理不活性物質負荷異性体などの生成物関連の混入物、ならびに宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質および外毒素などのプロセス関連混入物から正しくフォールドされた活性モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を分離することである。

商業的に実現可能なプロセスを達成するためには、生成物の品質、活性および安全性を維持しながら、リフォールドおよび精製収率を最大化する。本明細書に記載する方法および手順は、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）薬剤物質などの免疫複合体の製造のために開発された。

Ａ．材料および方法
１．封入体可溶化
好適な細胞から産生されたＶＨ−ＰＥ３８（ＶＨ）およびＶＬ封入体を室温で１２〜２４時間解凍する。ＶＨおよびＶＬＩＢ可溶化開始濃度は、リフォールド１リットル当たり０．３ｇのＶＨおよび０．０７ｇのＶＬである。封入体は、１：１モル比でＶＨとＶＬを混合し、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を添加することにより、最終ＶＨ濃度１０ｇ／Ｌに調節する。濃度調節封入体溶液１ｋｇずつに、６ｋｇの封入体可溶化緩衝液（５０ｍＭエタノールアミン、８Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ９．３±０．１）を添加することにより、封入体を可溶化する。可溶化は、定速で撹拌しながら、室温で９０±１５分間実施する。

２．封入体清澄化および限外濾過１
可溶化した封入体を一連の深層フィルターを通した濾過（国際公開第２０１２／０５９２１２号パンフレットを参照）により清澄化する。清澄化した濾過物は、５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）限外濾過膜を用いて、最終リフォールド重量の１／１０までタンジェント流濾過により濃縮する。

３．リフォールディング限外濾過／ダイアフィルター２
モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、予冷した（２〜８℃）リフォールディング緩衝液（５０ｍＭエタノールアミン、１Ｍアルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、１．０ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ９．４）への清澄化および濃縮封入体濾過物の１０倍（ｗ／ｗ）希釈によりリフォールドする。添加（Ｌ／時）は、清澄化および濃縮封入体濾過物が、４時間にわたって予冷リフォールド緩衝液に添加される（好適には、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり２６ｍＬの可溶化封入体）ように設定する。リフォールド反応は、連続的に混合しながら、２〜８℃で４８〜７２時間進行させた後、室温まで温めてから、濃縮およびダイアフィルターを行う。

リフォールド溶液は、１０ｋＤａＭＷＣＯ膜を用いたタンジェント流濾過により濃縮した後、１０倍体積のＴＭＡＥ平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）を用いて膜濾過する。

４．カラムクロマトグラフィ
ａ．ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィ
濃縮およびダイアフィルターリフォールド溶液を０．２μｍフィルターにより滅菌濾過し、１０倍カラム容積（ＣＶ）のＴＭＡＥ平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥカラム（ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたは同等物）にロードする。クロマトグラフィ工程は、他に注記のない限り、２００ｃｍ／時の線流速で実施する。ロードした後、まずカラムを４ＣＶのＴＭＡＥ平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）で洗浄した後、洗浄緩衝液１（２０ｍＭリン酸塩、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いた６ＣＶ洗浄および洗浄緩衝液２（２０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いた８ＣＶ洗浄を実施する。生成物を３ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４でカラムから溶出する。溶出後、カラムを３ＣＶのストリッピング緩衝液（５０ｍＭエタノールアミン、０．５Ｍアルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ９．３）でストリッピングする。ストリップ工程中に、流速を低下させてもよい。続いて、カラムを３ＣＶの注射用蒸留水（ＷＦＩ）で洗浄した後、３ＣＶの再生溶液（２ＭＮａＣｌ）で再生させる。カラムを少なくとも３ＣＶの殺菌溶液（１Ｎ水酸化ナトリウム）で殺菌した後、３ＣＶの短期保存液（０．１Ｎ水酸化ナトリウム）または３ＣＶの長期保存液（２０ｍＭリン酸塩、２０％（ｗ／ｖ）エタノール、ｐＨ７．４）を用いて保存する。

ｂ．ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ工程は、フロースルークロマトグラフィ工程として操作する。クロマトグラフィ工程は、他に注記のない限り、２５０ｃｍ／時の線流速で実施する。５ＣＶの前平衡化緩衝液（４００ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）および５ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸カリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたは同等物）に、捕捉ステップ生成物をロードする。生成物をフロースルー画分中に回収する。ロードした後、カラムを３ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄する。カラムを３ＣＶの前平衡化緩衝液で再生し、３ＣＶの殺菌緩衝液（１Ｎ水酸化ナトリウム）で殺菌した後、室温で３ＣＶの保存緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、０．１Ｎ水酸化ナトリウム）中に保存する。

ｃ．Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィおよび限外濾過／ダイアフィルター３
ヒドロキシアパタイト生成物をロード調製緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、１．２Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で１：１比（ｗ／ｗ）に希釈し、５ＣＶの平衡化緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、０．６Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍカラム（Ｔｏｓｏｈまたは同等物）にロードする。ロードした後、カラムを１ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄する。生成物を０〜１００％溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）の２０ＣＶの直線的勾配で溶出させる。カラムを２ＣＶの注射用蒸留水で洗浄した後、２ＣＶの８Ｍ尿素で再生させる。カラムを３ＣＶの殺菌緩衝液（０．５Ｎ水酸化ナトリウム）で殺菌した後、３ＣＶの保存緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、２０％（ｗ／ｗ）エタノール、ｐＨ７．４）を用いて室温で保存する。

Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物のプールを、１０ｋＤａＭＷＣＯ膜を用いたタンジェント流濾過により、１０倍体積の１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０でダイアフィルターする。

ｄ．ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィおよび限外濾過／ダイアフィルター４
ダイアフィルターしたＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅまたは同等物）にロードした後、５ＣＶの前平衡化緩衝液（１０ｍＭトリス、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で前平衡した後、５ＣＶ平衡化緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で平衡する。カラムを１ＣＶ平衡化緩衝液で洗浄した後、３ＣＶの６５％（ｖ／ｖ）平衡化緩衝液、３５％（ｖ／ｖ）溶出緩衝液（１０ｍＭトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）で洗浄する。６５％（ｖ／ｖ）平衡化緩衝液、３５％（ｖ／ｖ）溶出緩衝液から４５％（ｖ／ｖ）平衡化緩衝液、５５％（ｖ／ｖ）溶出緩衝液への１０ＣＶ直線的勾配を用いて、生成物を溶出する。カラムを２ＣＶの前平衡化緩衝液でストリッピングした後、３ＣＶの殺菌緩衝液（１Ｎ水酸化ナトリウム）で殺菌する。３ＣＶの短期保存液（０．１Ｎ水酸化ナトリウム）または３ＣＶ長期保存液（２０ｍＭリン酸塩、２０％（ｗ／ｖ）エタノール、ｐＨ７．４）のいずれかで、カラムを保存する。

１０ｋＤａＭＷＣＯ膜を用いたタンジェント流濾過により、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物を目標タンパク質濃度１．３〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。濃縮したＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物は、少なくとも６倍体積の製剤化緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、４％（ｗ／ｖ）スクロース、８％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ７．４０）を用いてダイアフィルターする。ダイアフィルターしたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物は、製剤化緩衝液を用いて０．９５〜１．０５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈する。

５．モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）薬剤物質（ＤＳ）の形成
ダイアフィルターしたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物を、製剤化緩衝液を用いて、最終濃度０．９５〜１．０５ｍｇ／ｍＬまで希釈した後、製剤化スパイク溶液（１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０）を用いて、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０まで調節することにより、薬剤物質を製造した。薬剤物質を０．２μｍで濾過して滅菌ＨＤＰＥボトルに入れ、≦−７０℃で保存する。

実施例２：モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）２５０リットルリフォールド、試験１
Ａ．材料および方法
１．フィルターおよび膜
Ｃ０ＨＣおよびＸ０ＨＣＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣＰＯＤフィルター（各々０．５５ｍ²）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−５（Ｖスクリーン、２ｍ²）およびＰｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、０．５および２．５ｍ²）タンジェント流濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。ＤｕｒａｐｏｒｅＭｉｌｌｉｐａｋ２０、ＳＨＣＯｐｔｉｃａｐＸＬ１５０およびＳＨＣＯｐｔｉｃａｐＸＬ３００フィルターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。

２．クロマトグラフィ媒体および計器類
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）はＥＭＤ製であった。ヒドロキシアパタイト、タイプ１、４０μｍは、ＢｉｏＲａｄ製であった。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍは、Ｔｏｓｏｈ製であった。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰは、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製であった。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ精製は、ＢＰＧ１４０×５００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ヒドロキシアパタイトおよびＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ精製は、ＢＰＧ１００×５００カラムで実施した。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ精製は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＱｕｉｋＳｃａｌｅ７０×５５０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実施した。全ての精製は、ＡＫＴＡＰｉｌｏｔクロマトグラフィシステムで実施した。

３．２５０リットルリフォールド規模での再生
３．３９ｋｇのＶＨ封入体（ＩＢ）スラリーおよび０．３３ｋｇのＶＬＩＢスラリーを３．７７ｋｇのＴＥ緩衝液で、最終濃度１０ｇ／Ｌまで希釈した。４４．９ｋｇのＩＢ可溶化緩衝液を用い、９０分間室温でＩＢを可溶化させた。可溶化ＩＢ溶液を、Ｘ０ＨＣ深層フィルター（０．５５ｍ²）と連続して接続したＣ０ＨＣ深層フィルター（０．５５ｍ²）で清澄化した。可溶化および清澄化ＩＢ溶液を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−５（Ｖスクリーン、２ｍ²）膜を用いたタンジェント流濾過により、最終限外濾過物（ＵＦ）１リテンテート重量２５．５ｋｇまで濃縮した。２５ｋｇのＵＦ１リテンテートを２〜８℃に温度調節し、４時間にわたり、定速で混合しながら（好適には、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり２６ｍＬの可溶化封入体）、２２５ｋｇの予冷リフォールド緩衝液（ｐＨ９．４）に添加した。リフォールドは、リフォールド溶液の温度を室温まで上昇させることにより、６６時間後に停止させた。リフォールド溶液は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、２．５ｍ２）膜を用いたタンジェント流濾過により、２４．９ｋｇまで濃縮した後、１０倍体積のＴＭＡＥ平衡化緩衝液を用いてダイアフィルターした。

４．２００リットルリフォールド規模での精製
モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の精製を前述のように実施した。９．９Ｌおよび９．３Ｌの濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液をパックしたＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）カラムにロードした（ベッド高さ：１８ｃｍ、体積：２．７７Ｌ）。２つの精製サイクルを実施した（連続した溶出の間にストリッピング緩衝液を用いた）。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）溶出液画分を合わせて単一のＴＭＡＥ生成物プールとし（７．１ｋｇ）、ヒドロキシアパタイトカラムにロードした（ベッド高さ：２１．８ｃｍ、体積：１．７１Ｌ）。ヒドロキシアパタイトフロースループールを、７．９１ｋｇロード調製緩衝液で１：１希釈してから、Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍカラムにロードした（ベッド高さ：１７．５ｃｍ、体積：１．３７Ｌ）。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物プール（１１．６ｋｇ）を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０膜（Ａスクリーン、０．５ｍ²）を用いたタンジェント流濾過により、８．１ｋｇに濃縮した後、１０倍体積のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ平衡化緩衝液を用いてダイアフィルターした。濃縮およびダイアフィルターしたＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムにロードした（ベッド高さ：１８．２ｃｍ、体積：０．７０Ｌ）。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物プール（２．８ｋｇ）をＰｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、０．５ｍ²）膜を用いたタンジェント流濾過により、２ｇ／Ｌに濃縮した後、７倍体積の製剤化緩衝液を用いてダイアフィルターした。濃縮およびダイアフィルターしたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物を、製剤化緩衝液を用いて最終タンパク質濃度１．０２ｇ／Ｌまで希釈した（量：４．７ｋｇ）後、製剤化スパイク溶液で、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０に調節した。製剤化したモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）をＤｕｒａｐｏｒｅＭｉｌｌｉｐａｋ２０フィルターで滅菌濾過して、ＰＥＴＧボトルに導入し、≦−７０℃で保存した。

Ｂ．結果および論考
１．再生
可溶化、清澄化およびＵＦ１工程の収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより評価し、表ＩおよびＩＩに示す。深層濾過の前後に、清澄化効率を濁度測定値により評価した（表ＩＩＩ）。

表ＩＶおよびＩＩ中のデータは、封入体からＶＨおよびＶＬを抽出し、液相に移す上でのＩＢ可溶化緩衝液の有効性を明らかにしている。いずれのサブユニットも、可溶化ＩＢ溶液に定量的に回収した。ＣＯＨＣ−Ｘ０ＨＣ深層フィルタートレーンにより、可溶化ＩＢ溶液の濁度の８倍低減が達成され、タンジェント流濾過による更なる処理に好適な高透明性溶液が生成された。清澄化ステップの収率は、２つのサブユニットの分子量に４倍の差があるにもかかわらず、ＶＨとＶＬで同等であった（それぞれ、８９．４および７８．８％）。リフォールド前ユニット操作の光学的性能は、最終ＵＦ１ＶＨ収率が、リフォールド１Ｌ当たり０．３ｇＶＨの目標リフォールド濃度を達成するのに必要な量を満たしたことにより証明される。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のリフォールディングは、リフォールド緩衝液へのＵＦ１リテンテートの１０倍希釈により開始した。リフォールド収率を最大化するために、ＵＦ１リテンテートを４時間かけてリフォールド緩衝液に添加した。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）リフォールド力価はＬＣ−ＭＳにより決定し、ＵＦＤＦ２プール中のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）濃度はＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。リフォールド収率は、リフォールド反応物中の初期ＶＨ濃度に基づいて算出したが、この濃度は、希釈率およびＵＦ１リテンテートプール中のＶＨのＲＰ−ＨＰＬＣ濃度により基づく。リフォールド力価、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ＵＦＤＦ２濃度および工程収率を表ＶＩに示す。

ヘテロ二量体タンパク質のリフォールディングは、個別のサブユニットが、複数の非生産的フォールディング経路を経由して、不溶性凝集体またはミスフォールドされた不活性生成物変異体を形成し得るため、大きな課題を呈示する。そのため、ヘテロ二量体タンパク質は、低いリフォールド力価および工程収率を特徴とすることが多い。本明細書に記載するリフォールド条件は、封入体出発材料の効率的利用と、リフォールド力価の最大化に向けて注意深く最適化されている（表ＩＶ）。その結果、リフォールド力価および工程収率は、以前のリフォールド工程と比較して、約２〜３倍高かった。

リフォールド後のタンジェント流濾過ユニット操作の役割は、リフォールド緩衝液成分を除去し、捕捉工程精製のためにリフォールディングされた材料を用意することによって、リフォールドを停止することである。約８７％というリフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の工程収率は、このタイプのユニット操作および出発材料に関して予測された範囲内であった。

表ＩＩＩ〜ＩＶ中のデータは、開示した方法の性能、ならびにこのプロセスが、不活性前駆体から、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）薬剤物質の製造に好適な生理活性モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を生成する能力を明らかにしている。

２．精製
モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液から２００Ｌリフォールド規模で、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）、ヒドロキシアパタイト、Ｐｈｅｎｙｌ６５０ＭおよびＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィにより精製した。各精製工程のクロマトグラムを図２〜５に示す。

ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラムは、リフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）だけではなく、生成物およびプロセス関連の不純物のほとんどがカラムに結合し、カラムフロースルー画分中にはほとんどまたは全くタンパク質が検出されなかったことを示している。一部の疎水結合不純物は、非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でカラムから除去し（洗浄１）、弱イオン結合不純物は、低濃度塩洗浄水で除去した（洗浄２）。フォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の溶出は、緩衝２００ｍＭ塩化ナトリウムで達成した。結合した不純物のほとんどは、ＩＢ可溶化緩衝液で、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥカラムからストリッピングした（ストリップ１）。カラム洗浄用のこの緩衝液の有効性は、２Ｍ塩化ナトリウムを用いた２回目のストリップ（ストリップ２）中に、カラムから極めてわずかなタンパク質しか溶出しなかったという観測結果によって証明される。

図３のクロマトグラムは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）が、２０ｍＭリン酸塩の存在下でヒドロキシアパタイトと結合しないで、フロースルー画分中に回収されたことを示す。宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび外毒素などのプロセス関連の混入物は上記の条件下でヒドロキシアパタイトと密に結合したが、これらは、後に４００ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ塩化ナトリウムストリップ緩衝液を用いて、樹脂から除去した。

クロマトグラムは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ならびに生成物およびプロセス関連の不純物が、Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂に結合し、カラムフロースルー画分中にはタンパク質がほとんどまたは全く検出されなかったことを示している。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を下降塩勾配で溶出させ、６０〜３０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率の範囲でカラムから回収した。生成物およびプロセス関連の不純物を洗浄水（ストリップ）および８Ｍ尿素溶液（再生）を用いて、カラムからストリッピングした。溶出後洗浄プロトコルの有効性は、２８０ｎｍでの吸光度の上昇が、０．５Ｎ水酸化ナトリウム殺菌工程中に認められなかったという観測結果によって証明される。

図５のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラムは、本結合条件下で、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ならびに生成物およびプロセス関連の不純物が、カラムに結合したことを示している。タンパク質はカラムフロースルー画分（ロード、チェイス）または洗浄画分（洗浄）中に一切検出されなかった。１７５ｍＭ塩化ナトリウムから２７５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）に増加する緩衝塩勾配を用いて、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）をカラムから回収した。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、２１〜２４ｍＳ／ｃｍの非常に狭い電気伝導率の範囲でカラムから溶出した。残った不純物は、１Ｍ塩化ナトリウムストリップおよび１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてカラムから溶出させた。

全タンパク質工程収率を２８０ｎｍでの吸光度測定により決定した。精製ロット２５０Ｌ３の全タンパク質工程収率をＶに示す。

濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液（ＵＦＤＦ２生成物、ＴＭＡＥロード試料）は、リフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を含んだが、ミスフォールディングおよび凝集した生成物変異体および宿主細胞タンパク質などの他のタンパク質も含有していた。そのため、２８０ｎｍでの吸光度に基づくタンパク質濃度測定値は、正しくフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）に固有のものではなく、従って、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）に固有の収率を表していない。対照的に、ヒドロキシアパタイト精製工程の全タンパク質およびモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）工程収率は、生成物およびプロセス関連の不純物のほとんどが除去されているＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）生成物プール（ヒドロキシアパタイトロード）の純度増大によって、互いにはるかに近接して並んでいる。続く精製および緩衝液交換工程についても高い回収量が得られた。２００Ｌリフォールド規模および精製規模で、最終精製収率は、４．６ｋｇの薬剤物質であった。

表ＶＩは、脱アミド化モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、凝集体および断片を含む生成物関連混入物のクリアランスを示す。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の生理活性は、ＶＨサブユニット中のアスパラギン３５８の脱アミド化の程度に応じて変動する。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の脱アミド化を高性能イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）により分析し、測定された％プレピーク面積と相関させた（図６参照）。

表ＶＩのデータは、ＴＭＡＥ生成物中のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のＩＥＣプレピーク面積が、５％未満であること、ならびにＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィにより、ＩＥＣプレピーク面積が２％未満まで減少し、生理活性物質ももたらしたことを明らかにしている。

ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィによって、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ）により測定されるように、モノマー純度の有意な増大がもたらされ、プロセスストリームから低分子量タンパク質および断片が除去された。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィによって、断片および凝集体のさらなるクリアランスが達成され、ＨＰＳＥＣ分析により９９％モノマー純度を有するモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）生成物プールが生成された。

表ＶＩＩは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび外毒素などのプロセス関連混入物のクリアランスを示す。

表ＶＩＩは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）プロセスストリームからのプロセス関連混入物を除去する上でのＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの有効性を示している。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度が５倍超、外毒素濃度が６００倍超低減した。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度が約８倍、外毒素濃度が３６倍超、ならびに残留ＤＮＡ濃度が１０００倍超〜検出下限未満まで、さらに低減した。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度のさらに６．５倍低減が達成され、また、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィにより、外毒素濃度のさらに２０倍低減がもたらされた。

表ＶＩおよびＶＩＩ中のデータは、本明細書に記載の精製方法の性能、ならびに上記プロセスが、臨床試験に好適な高品質薬剤物質を生成する能力を証明している。

実施例３：モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）２５０リットルリフォールド、試験２
Ａ．材料および方法
１．フィルターおよび膜
Ｃ０ＨＣおよびＸ０ＨＣＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣＰＯＤフィルター（各々０．５５ｍ²）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−５（Ｖスクリーン、２ｍ²）およびＰｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、０．５および２．５ｍ²）タンジェント流濾過膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。ＤｕｒａｐｏｒｅＭｉｌｌｉｐａｋ２０、ＳＨＣＯｐｔｉｃａｐＸＬ１５０およびＳＨＣＯｐｔｉｃａｐＸＬ３００フィルターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった。

２．クロマトグラフィ媒体および計器類
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）はＥＭＤ製であった。ヒドロキシアパタイト、タイプ１、４０μｍは、ＢｉｏＲａｄ製であった。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍは、Ｔｏｓｏｈ製であった。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰは、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製であった。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ精製は、ＢＰＧ１４０×５００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ヒドロキシアパタイト、Ｐｈｅｎｙｌ６５０ＭおよびＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ精製は、ＢＰＧ１００×５００カラムで実施した。精製は全て、ＡＫＴＡＰｉｌｏｔクロマトグラフィシステムで実施した。

３．２５０リットルリフォールド規模での再生
３．４０ｋｇのＶＨＩＢスラリーおよび０．３３ｋｇのＶＬＩＢスラリーを３．７７ｋｇのＴＥ緩衝液で、最終濃度１０ｇ／Ｌまで希釈した。４５．０ｋｇのＩＢ可溶化緩衝液を用い、ＩＢを９０分間室温で可溶化させた。可溶化ＩＢ溶液を、Ｘ０ＨＣ深層フィルター（０．５５ｍ²）と連続して接続したＣ０ＨＣ深層フィルター（０．５５ｍ²）で清澄化した。可溶化および清澄化ＩＢ溶液を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−５（Ｖスクリーン、２ｍ²）膜を用いたタンジェント流濾過により、２５．５ｋｇの最終ＵＦ１リテンテート重量まで濃縮した。２５ｋｇのＵＦ１リテンテートを２〜８℃に温度調節し、４時間にわたり、定速で混合しながら（好適には、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり２５ｍＬの可溶化封入体）、２２５ｋｇの予冷リフォールド緩衝液（ｐＨ９．４）に添加した。リフォールドは、リフォールド溶液の温度を室温まで上昇させることにより、６６時間後に停止させた。リフォールド溶液は、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、２．５ｍ²）膜を用いたタンジェント流濾過により、２２．６ｋｇまで濃縮した後、１０倍体積のＴＭＡＥ平衡化緩衝液を用いてダイアフィルターした。

４．２００リットルリフォールド規模での精製
モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の精製を前述のように実施した。９リットルおよび８．７リットルの濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液をパックしたＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）カラムにロードした（ベッド高さ：１８ｃｍ、体積：２．７７Ｌ）。２つの精製サイクルを実施し、連続した溶出の間に、開示するストリッピング緩衝液を用いてストリッピングを行った。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）溶出液画分を合わせて単一のＴＭＡＥ生成物プール（６．２ｋｇ）とし、ヒドロキシアパタイトカラムにロードした（ベッド高さ：２１．８ｃｍ、量：１．７１Ｌ）。ヒドロキシアパタイトフロースループールを、６．７ｋｇロード調製緩衝液で１：１希釈してから、Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍカラムにロードした（ベッド高さ：１７．５ｃｍ、体積：１．３７Ｌ）。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物プール（１０．１ｋｇ）を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０膜（Ａスクリーン、０．５ｍ²）を用いたタンジェント流濾過により、８．０ｋｇに濃縮した後、１０倍体積のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ平衡化緩衝液を用いてダイアフィルターした。濃縮およびダイアフィルターしたＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ生成物をＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムにロードした（ベッド高さ：１８．２ｃｍ、量：１．４Ｌ）。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物プール（５．１ｋｇ）をＰｅｌｌｉｃｏｎ２ＢｉｏＭａｘ−１０（Ａスクリーン、０．５ｍ²）膜を用いたタンジェント流濾過により、２ｇ／Ｌに濃縮した後、７倍体積の製剤化緩衝液を用いてダイアフィルターした。濃縮およびダイアフィルターしたＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ生成物を、製剤化緩衝液を用いて最終タンパク質濃度１．０５ｇ／Ｌまで希釈した（量：５．４ｋｇ）後、製剤化スパイク溶液を用いて、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート−８０に調節した。製剤化したモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）をＤｕｒａｐｏｒｅＭｉｌｌｉｐａｋ２０フィルターで滅菌濾過して、ＰＥＴＧボトルに導入し、≦−７０℃で保存した。

Ｂ．結果および論考
１．再生
可溶化、清澄化およびＵＦ１工程の収率をＲＰ−ＨＰＬＣにより評価し、表ＶＩＩＩおよびＩＸに示す。深層濾過の前後に、清澄化効率を濁度測定値により評価した（表３．２．２．１〜３）。

表ＶＩＩＩおよびＩＸ中のデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって測定されるように、ＵＦ１リテンテートプール中の初期ＩＢスラリーから、ＶＨおよびＶＬが定量的に回収されたことを示している。深層濾過により、可溶化ＩＢ溶液の濁度が約６倍低減し、高透明性溶液が生成されたが、これをタンジェント流濾過によりさらに濃縮した後、リフォールディングに付した。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のリフォールディングは、予冷リフォールド緩衝液でのＵＦ１リテンテートの４時間にわたる１０倍希釈により開始した。脱アミド化生成物変異体の生成を最小化するために、ＵＦ１リテンテートは、リフォールド緩衝液への添加中、２〜８℃に維持した。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）リフォールド力価をＬＣ−ＭＳにより決定した。ＵＦＤＦ２プール中のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）濃度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。リフォールド工程収率は、リフォールド反応物中の初期ＶＨ濃度に基づいて算出したが、この濃度は、ＵＦ１ＶＨ濃度および希釈倍率により決定した。リフォールドおよびＵＦＤＦ２工程収率を表ＸＩに示す。

リフォールド力価は、以前のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）リフォールドプロセスと比較して、約２〜３倍高かった。１０％という工程収率は、以前のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）リフォールドプロセスと同等であった。

リフォールド後のタンジェント流濾過ユニット操作の役割は、リフォールド緩衝液成分を除去し、捕捉工程精製のためにリフォールディングされた材料を用意することによって、リフォールドを停止することである。表ＸＩ中の工程収率データは、リフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）が、ＵＦＤＦ２ユニット操作から定量的に回収されたことを示している。

表ＶＩＩＩ〜ＩＸ中のデータは、開示した方法の性能、ならびに上記のプロセスが、不活性前駆体から、薬剤物質の製造に好適な活性免疫複合体（好適には、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ））を生成する能力を証明している。

２．精製
モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液から２００Ｌリフォールド規模で、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）、ヒドロキシアパタイト、Ｐｈｅｎｙｌ６５０ＭおよびＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィにより精製した。各精製工程のクロマトグラムを図７〜１０に示す。

ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラムは、リフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ならびに生成物およびプロセス関連の不純物のほとんどがカラムに結合したことを示している。タンパク質の破過（ｂｒｅａｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）がロード工程の終了時に観測され；カラムロード工程の終了時にタンパク質破過が検出されなかった実施例２の精製とは対照的である。

図８のクロマトグラムは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）が、２０ｍＭリン酸塩の存在下でヒドロキシアパタイトと結合しないで、フロースルー画分中に回収されたことを示す。

図９のクロマトグラムは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ならびに生成物およびプロセス関連の不純物が、Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂に結合し、カラムフロースルー画分中にはタンパク質がほとんどまたは全く検出されなかったことを示している。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を下降塩勾配で溶出させ、６０〜３０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率の範囲でカラムから回収した。

図１０のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラムは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ならびに生成物およびプロセス関連の不純物が、カラムに結合したことを示している。タンパク質はカラムフロースルー画分（ロード、チェイス）または洗浄画分（洗浄）中に一切検出されなかった。１７５ｍＭ塩化ナトリウムから２７５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）に増加する緩衝塩勾配を用いて、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）をカラムから回収した。活性モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）は、２１〜２４ｍＳ／ｃｍの非常に狭い電気伝導率の範囲でカラムから溶出した。残留する不純物は、１Ｍ塩化ナトリウムストリップおよび１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてカラムから溶出させた。

全タンパク質工程収率を２８０ｎｍでの吸光度測定値により決定した。全タンパク質工程収率を表ＸＩＩに示す。

前述と同様、濃縮およびダイアフィルターしたリフォールド溶液（ＵＦＤＦ２生成物、ＴＭＡＥロード試料）は、リフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を含むが、ミスフォールディングおよび凝集した生成物変異体や宿主細胞タンパク質などの他のタンパク質も含有している。そのため、２８０ｎｍでの吸光度に基づくタンパク質濃度測定値は、正しくフォールディングされたモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）に固有のものではなく、従って、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）に固有の収率を表していない。対照的に、ヒドロキシアパタイト精製工程の全タンパク質およびモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）工程収率は、生成物およびプロセス関連の不純物のほとんどが除去されているＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）生成物プール（ヒドロキシアパタイトロード）の純度増大によって、互いにはるかに近接して並んでいる。実施例３のＰｈｅｎｙｌ６５０ＭおよびＵＦＤＦ３工程収率は、同じユニット操作について実施例２で達成された工程収率と同等であった。ここでは、この精製工程に関するカラムロード負荷を低減するために、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムの体積を０．７Ｌから１．４Ｌに増加した。その結果、カラムロード負荷は、実施例２の１０．４ｇ／Ｌ樹脂から実施例３の４．５ｇ／Ｌ樹脂へと低減した。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ工程収率は、実施例２の６９％から実施例３の８８％へと、約２０％改善した。ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ工程収率は、以前のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ工程収率と比較して、２〜３倍高かった。２００Ｌリフォールド規模および精製規模で、最終精製収率は、５．６ｇの薬剤物質であった。

表ＸＩＩＩは、脱アミド化モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、凝集体および断片を含む生成物関連混入物のクリアランスを示す。

ＩＥＣプレピーク面積％、脱アミド化およびモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の生理活性の相関について上に述べた。表ＸＩＩＩのデータは、実施例３のヒドロキシアパタイト生成物プール中のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）のＩＥＣプレピーク面積が、実施例２と比較して２倍超高いことを示している。Ｐｈｅｎｙｌ６５０ＭおよびＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィにより、ＩＥＣプレピーク面積が３．５％未満へと、約５％減少し、生理活性物質がもたらされた。

表ＸＩＩＩは、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィによって、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ）で測定されるように、モノマー純度の有意な増大がもたらされ、プロセスストリームから低分子量タンパク質および断片のほとんどが除去されたことを明らかにしている。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィによって、断片および凝集体のさらなるクリアランスが達成され、ＨＰＳＥＣ分析による９９．５％モノマー純度を有するモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）生成物プールが生成された。

表ＸＩＶは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび外毒素などのプロセス関連混入物のクリアランスを示す。

表ＸＩＶ中のデータは、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）プロセスストリームからのプロセス関連混入物を除去する上でのＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉工程およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィの有効性を示している。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度が約２０倍、外毒素濃度が８００倍超低減した。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）クロマトグラフィによって、宿主細胞ＤＮＡの検出下限未満までクリアランスが達成された。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度が約２倍、外毒素濃度が１０倍超さらに低減した。Ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍクロマトグラフィによって、宿主細胞タンパク質濃度の約９倍の低減が達成され、また、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰクロマトグラフィによって、外毒素濃度のさらに３０倍の低減がもたらされた。

３．まとめ
実施例２および３に記載の２つの精製について、同等の薬剤物質収率が達成された。これらのデータは、本明細書に記載の再生および精製方法の生産性、ならびにこれらの方法が、臨床試験に好適な高品質薬剤物質を生成する能力を証明している。

本明細書に記載の方法はまた、従来のモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）再生および精製方法と比較して、全体的プロセス収率の有意な向上にも寄与する。これらのプロセス向上は、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の製造を経済的に実現可能なプロセスにする上で重要な役割を果たすであろう。

実施例４：ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）洗浄方法
経済的に実現可能な精製方法の操作には、複生産サイクルにクロマトグラフィ樹脂を用いることが必要である。これは、効率的なカラム洗浄方法と共に、生成物ならびに生成物およびプロセス関連の混入物が、次の精製サイクルの開始前に、カラムから許容可能なレベル未満まで除去されるという立証を必要とする。

低リフォールド力価であるが、高濃度の生成物およびプロセス関連の不純物（例えば、凝集体、ミスフォールドタンパク質、細菌ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質および外毒素）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体ベースの薬剤物質製造プロセスにおけるリフォールド後捕捉カラムに重要な課題を呈する。

モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）製造プロセスの場合、不純物の大部分は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）樹脂と密に結合することがわかっており、２Ｍ塩化ナトリウムまたは非緩衝８Ｍ尿素のいずれかを含む２つの洗浄液では、カラムから効率的に除去されなかった。８Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、５０ｍＭエタノールアミン、２ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭＤＴＴを含むｐＨ９．３の緩衝液は、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）樹脂からプロセスおよび生成物関連の混入物を除去するのに有効であることが判明した。

Ａ．材料および方法
１．クロマトグラフィ媒体および計器類
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）はＥＭＤ製であった。精製は、Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２００カラムで実施した。全ての精製は、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィシステムで実施した。

２．ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）精製およびキャリーオーバー分析
ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）精製を前述のように実施した。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）カラムに、濃縮し、ダイアフィルターしたリフォールド溶液を２０ｇタンパク質／Ｌ樹脂までロードした。キャリーオーバー分析のために、前述と同様に、しかしタンパク質をロードせずに、また、記載されていれば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００洗浄緩衝液なしで、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥカラムをランした。

３．結果および論考
図１１は、カラム洗浄および殺菌溶液として、２ＭＮａＣｌ（ストリップ１）、８Ｍ尿素（ストリップ２）および１Ｎ水酸化ナトリウムを用いた、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ捕捉工程クロマトグラムを示す。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）精製順序を表ＸＶに記載する。

カラム洗浄工程中に、いくつかのピークが観測された。次に、タンパク質ロードおよび洗浄１緩衝液なしのブランクランを同じカラムで実施した。表ＸＶＩは、ブランクランのＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ精製順序を記載する。

図１２は、事前に洗浄したカラムを２ＭＮａＣｌ（ストリップ１）および８Ｍ尿素（ストリップ２）で再度ストリッピングしたとき、有意なキャリーオーバーピークが観測されたことを示している。表ＸＶＩに従って実施した少なくとも２つの別のランについても同じプロフィールが認められるが、このことは、前述した洗浄および殺菌方法が、樹脂から生成物およびプロセス関連の混入物を有効に除去しなかったことを示している。

８Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニンおよび１０ｍＭＤＴＴを含有する緩衝液が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体を溶解することができなかったという観測結果に基づき、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ＩＢ可溶化緩衝液（５０ｍＭエタノールアミン、８Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ９．５）を捕捉工程カラム洗浄溶液として試験した。精製順序を表ＸＶＩＩに記載する。

図１３は、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）ＩＢ可溶化緩衝液を用いた５ＣＶストリップを含むＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥＭ捕捉クロマトグラムを示す。カラムをＩＢ可溶化緩衝液で洗浄したとき（ストリップ１）、非常に強いピークが観測され；続く高塩洗浄（ストリップ２）または殺菌工程では、それ以上のタンパク質はほとんどまたは全くカラムから溶出しなかった。

図１４は、タンパク質ロードのない、次のＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）捕捉クロマトグラムを示す。精製順序を表ＸＶＩＩＩに記載する。

生成物およびプロセス関連の混入物のキャリーオーバーは観測されなかった。ストリップおよび殺菌工程中に観測された吸光度ピークは、ＩＢ可溶化緩衝液成分のバックグラウンド吸光度によるものであった（新しい樹脂を用いたブランク緩衝液クロマトグラムについては図１５を参照）。図１６に示す、９回の精製サイクル後のＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＭＡＥ（Ｍ）キャリーオーバークロマトグラムは、図１５に示す、新しい樹脂を用いたブランク緩衝液クロマトグラムと全く同じであり、これは、ＩＢ可溶化緩衝液が、樹脂を有効に洗浄し、その元の状態に再生することを明らかにしている。

実施例４：ＣａｐｔｏＢｌｕｅ捕捉
陰イオン交換捕捉に代わる手段として、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＤｙｅクロマトグラフィを用いて、やや酸性の条件下でリフォールド後ＵＦ／ＤＦ２プールからモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）を捕捉した。モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）とＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ色素リガンドとの相互作用は、天然において多モードであり、しかもかなり強度が高い。ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ樹脂へのモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の選択的結合は、イオン成分や、疎水性成分（プロピレングリコールなど）で調節することができる。本明細書に記載するようなＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＤｙｅによるモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の捕捉。

Ａ．材料および方法
１．クロマトグラフィ媒体および計器類
ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅは、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製であった。ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ精製は、ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。精製は全て、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィシステムで実施した。

２．精製
ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ精製は、前述のように実施した。濃縮し、ダイアフィルターし、調節したリフォールド溶液をＣａｐｔｏＢｌｕｅカラム（カラム容積：３９ｍＬ）上に、１０ｇモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）／Ｌ樹脂のロード負荷までロードした。

３．結果および論考
ロード中、非結合不純物に起因し得るフロースルー吸収シグナルが認められたが、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）生成物のほぼ全部が、ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂によって捕捉された。図１７は、代表的なＣａｐｔｏＢｌｕｅ捕捉工程クロマトグラムを示す。ごくわずかのモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）しかロードフロースルー画分に検出されないため、図１８のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の選択的結合を認めることができる。ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅは、高分子量種の優れた除去を示した。図１８からわかるように、ＵＦ／ＤＦ２プールは、高レベルの高分子量種を含有しており、これは、フロースルー画分ならびに８Ｍ尿素ストリップピーク中でも認められたが、溶出プールには検出されなかった。その結果、溶出プールは、ＵＦ／ＤＦ２プールと比較して、非常に清浄であった。

図１９は、第２の代表的ＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ捕捉工程クロマトグラムを示す。表ＸＩＸは、図１９に示したＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ精製の性能の概要を示す。

非結合不純物の破過がロード中に観測された後、塩化ナトリウム溶出勾配中に溶出ピークが現れた。表ＸＩＸから、ＵＦ／ＤＦ２プールは、５８３．７ミリグラムの全タンパク質（２８０ｎｍでの吸光度により測定）を含有していたが、５８．４ミリグラムのモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）生成物（ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定）しか含有しなかったことがわかる。ＣａｐｔｏＢｌｕｅプールは、５８．４ミリグラムの全タンパク質を含有し、そのうち５３．５ｇはモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）であり、従って、全タンパク質の収率は９．４％に過ぎないが、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）の収率は９１．７％であった。ＨＣＰの４．６倍低減がＣａｐｔｏＢｌｕｅクロマトグラフィ工程により達成された。プロピレングリコールを塩化ナトリウムと組み合わせて、溶出緩衝液に添加することにより、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）結合を調節した。塩化ナトリウムを単独で用いた溶出は、ブロードな溶出ピークもたらしたが、塩化ナトリウム勾配溶出中のプロピレングリコールの存在によって、溶出ピークがシャープになり、生成物収率が増加した。

図１７〜１９は、本明細書に記載するＣａｐｔｏＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ精製方法の再現率、ならびにインタクトな生成物と、ミスフォールディングし、凝集した生成物変異体およびプロセス関連の不純物からなる複合溶液から、モキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）などのリフォールディングされた免疫複合体を選択的に捕捉するそれらの能力を証明している。

本願で引用した全ての文書、特許、雑誌の記事および他の資料は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

添付の図面を参照しながら、本発明の複数の実施形態とともに、本発明全体を説明してきたが、当業者には各種の変更形態と修正形態が明白であり得ることは理解されるべきである。そのような変更形態および修正形態は、それらが本発明の範囲から逸脱していない限り、添付の特許請求の範囲で定義されている本発明の範囲に含まれると理解されるべきである。

Claims

活性免疫複合体を調製する方法であって、前記免疫複合体は、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチド鎖から構成されており、フェドバッチリフォールディングプロセスで前記免疫複合体をリフォールディングする工程と、リフォールディングされた前記免疫複合体を１つまたは複数のクロマトグラフィカラムで精製する工程とを含む、方法。
活性免疫複合体を調製する方法であって、前記免疫複合体は、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチド鎖から構成されており、前記免疫複合体をリフォールディングする工程と、リフォールディングされた前記免疫複合体を、陰イオン交換カラムを用いて精製する工程とを含み、カラムサイクル同士の間に、前記カラムを、アルギニン、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする、方法。
前記免疫複合体のリフォールディングが、ｐＨ９．５以下のリフォールド緩衝液を含む、請求項２または３に記載の方法。
前記免疫複合体が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体または抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ²、（ｓｃＦｖ）₂、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項４に記載の方法。
前記抗体または抗原結合フラグメントが、細胞表面受容体に結合する、請求項４または５に記載の方法。
前記細胞表面受容体が、ＣＤ２２である、請求項６に記載の方法。
前記免疫複合体が、毒素を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記毒素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆおよびこれらの変異体、および誘導体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記毒素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはその変異体である、請求項８または９に記載の方法。
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはその変異体が、配列番号１６〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、またはその変異体が、配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＶＨおよびＶＬ配列を含む、請求項４または５に記載の方法。
前記ＶＨ配列が、配列番号６〜１１からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記ＶＬ配列が、配列番号２、および１２〜１５からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記免疫複合体が、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥまたはその変異体を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記免疫複合体が、配列番号１のＶＨ−ＰＥ３８サブユニットおよび配列番号２のＶＬサブユニットを含むモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）免疫毒素である、請求項１６に記載の方法。
前記リフォールド緩衝液が、ｐＨ９．４を有する、請求項３に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約５２ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１３ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項１に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３５ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１７ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項１９に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３０ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１８ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項２０に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約２６ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項２１に記載の方法。
ストリッピング緩衝液が、約０．２５〜約０．７５Ｍアルギニン、約７〜９Ｍ尿素および約９〜１１ｍＭＤＴＴを含む、請求項２に記載の方法。
約２５％〜約１％未満の脱アミド種を有する免疫複合体を含む組成物であって、前記免疫複合体が、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法により調製される、組成物。
約２５％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約２０％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約１０％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約５％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約３％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約２％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
約１％未満の前記脱アミド種が存在する、請求項２４に記載の組成物。
活性免疫複合体を調製する方法であって、前記免疫複合体は、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチド鎖から構成されており、ｐＨが９．５以下のリフォールド緩衝液を用いて、フェドバッチリフォールディングプロセスで前記免疫複合体をリフォールディングする工程と、リフォールディングされた前記免疫複合体を、イオン交換カラムを用いて精製する工程とを含み、カラムサイクル同士の間に、前記カラムを、アルギニン、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むストリッピング緩衝液でストリッピングする、方法。
前記調製方法から回収される免疫複合体の量が、フェドバッチリフォールディングプロセスおよび／または前記ストリッピング緩衝液を用いてストリッピングされたイオン交換カラムでの精製を含まない方法を使用して回収された免疫複合体の量と比較して、少なくとも三百％（３００％）多い、請求項３２に記載の方法。
前記ポリペプチドまたは免疫複合体が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項３３に記載の方法。
前記抗体、または抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、四重特異性抗体、三重特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ²、（ｓｃＦｖ）₂、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項３３に記載の方法。
前記抗体、または抗原結合フラグメントが、細胞表面受容体に結合する、請求項３５に記載の方法。
前記細胞表面受容体が、ＣＤ２２である、請求項３６に記載の方法。
前記ポリペプチドまたは免疫複合体が、毒素を含む、請求項３３に記載の方法。
前記毒素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆおよびこれらの変異体、および誘導体からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
前記毒素が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素またはその変異体である、請求項３８または３９に記載の方法。
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素またはその変異体が、配列番号１６〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素またはその変異体が、配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントが、ＶＨおよびＶＬ配列を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
前記ＶＨ配列が、配列番号６〜１１からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
前記ＶＬ配列が、配列番号２および１２〜１５からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
前記免疫複合体が、抗ＣＤ２２抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＰＥまたはその変異体を含む、請求項３３に記載の方法。
前記免疫複合体が、配列番号１のＶＨ−ＰＥ３８サブユニットおよび配列番号２のＶＬサブユニットを含むモキセツモマブ・パスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂｐａｓｕｄｏｔｏｘ）免疫毒素である、請求項４６に記載の方法。
前記リフォールド緩衝液が、ｐＨ９．４を有する、請求項３３に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約５２ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１３ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項３３に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３５ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１７ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項４９に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約３０ｍＬの可溶化封入体〜毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約１８ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項５０に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスにおいて、毎時リフォールド緩衝液１Ｌ当たり約２６ｍＬの可溶化封入体の添加速度を使用する、請求項５１に記載の方法。
ストリッピング緩衝液が、約０．２５〜約０．７５Ｍアルギニン、約７〜９Ｍ尿素および約９〜１１ｍＭＤＴＴを含む、請求項３３に記載の方法。
前記フェドバッチプロセスが、約２〜約８時間の時間にわたって行われる、請求項１９〜２２または４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。