ES2710314T3 - Métodos de producción de inmunoconjugados - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar un inmunoconjugado activo, en el que dicho inmunoconjugado se desamida en uno o más restos, en el que la desamidación da como resultado una inhibición de la potencia de dicho inmunoconjugado, y en el que dicho inmunoconjugado se compone de dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro, comprendiendo el método replegar dicho inmunoconjugado en un proceso semicontinuo de replegamiento en un tampón de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos, y purificar el inmunoconjugado replegado utilizando una elución de dos ciclos en una columna de intercambio iónico, en la que la columna se separa entre una primera elución y una segunda elución con un tampón de separación que comprende etanolamina, arginina, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).

Description

DESCRIPCION
Metodos de produccion de inmunoconjugados
Campo de la invencion
La presente invencion proporciona metodos de preparacion de inmunoconjugados activos, que incluyen inmunoconjugados anti-CD22. De manera adecuada, los metodos incluyen un proceso semicontinuo y/o un proceso de elucion en columna que da como resultado un aumento en el rendimiento del inmunoconjugado sobre otros procesos que no utilizan los metodos.
1. Antecedentes de la tecnica
La purificacion economica a gran escala de proteinas es un factor critico en la produccion en la industria biofarmaceutica. Las proteinas terapeuticas se producen normalmente utilizando lineas celulares procariotas o eucariotas que estan disenadas para expresar la proteina de interes de un plasmido recombinante que contiene el gen que codifica la proteina. La separacion de la proteina deseada de la mezcla de componentes alimentados a las celulas y subproductos celulares a una pureza adecuada, por ejemplo, suficiente para su uso como agente terapeutico humano, plantea un desafio formidable para los fabricantes de productos biologicos por varias razones.
Los fabricantes de productos farmaceuticos basados en proteinas deben cumplir con estrictos estandares regulatorios, incluidos los requisitos de pureza extremadamente estrictos. Para garantizar la seguridad, las agencias reguladoras, como la Administracion de Alimentos y farmacos (FDA, de sus siglas en ingles), requieren que los productos farmaceuticos basados en proteinas esten sustancialmente libres de impurezas, incluidos los contaminantes relacionados con el producto, tales como los agregados, fragmentos y variantes de la proteina recombinante y los contaminantes relacionados con el proceso, tales como proteinas, componentes de medios, virus, ADN y endotoxinas de la celula hospedadora. Si bien varios esquemas de purificacion de proteinas estan disponibles y se utilizan ampliamente en la industria biofarmaceutica, normalmente incluyen una etapa de purificacion por afinidad, tal como la purificacion de proteina A en el caso de los anticuerpos, para alcanzar un grado de pureza farmaceuticamente aceptable.
El documento WO 2012/015912 desvela metodos para aislar un inmunoconjugado o polipeptido activo mediante la purificacion de una solucion que contiene tanto el inmunoconjugado como el polipeptido activo y una variante acida del mismo, tal como una variante desamidada, utilizando cromatografia de intercambio anionico.
El desarrollo de un esquema de purificacion aplicable tanto a una biomolecula particular como a varias biomoleculas que sea escalable, controlable y proporcione un alto rendimiento de una biomolecula purificada, permitira su integracion en el desarrollo del producto en una etapa muy temprana en el desarrollo general del farmaco. Por lo tanto, es deseable y ventajoso proporcionar un proceso simple y eficaz que pueda producir un farmaco de alta calidad y seguridad.
Breve sumario de la invencion
En una realizacion, se proporcionan metodos para preparar un inmunoconjugado activo. Adecuadamente, el inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, y la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia del inmunoconjugado. Adecuadamente, los metodos comprenden replegar el inmunoconjugado en un proceso semicontinuo y purificar el inmunoconjugado replegado en una o mas columnas de cromatografia.
En realizaciones adicionales de preparacion de un inmunoconjugado activo, en el que dicho inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, y en el que dicha desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho inmunoconjugado, el metodo comprende replegar dicho inmunoconjugado y purificar el inmunoconjugado replegado utilizando una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en la que la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que comprende etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).
En realizaciones de los metodos, el replegamiento del inmunoconjugado comprende un tampon de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos.
De manera adecuada, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende un Fab, un Fab’, un F(ab’)2, un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv ligado a disulfuro, un dominio V-NAR, una IgNar, un intracuerpo, una IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab’)3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio unico, DVD-IG, Fcab, AcM2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno se une a un receptor de la superficie celular, adecuadamente, CD22.
Adecuadamente, el inmunoconjugado comprende una toxina, por ejemplo, toxinas que incluyen, pero sin limitacion, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina de la difteria y subunidades de la misma, asf como toxinas botulmicas A a F y variantes, y derivados de las mismas.
En realizaciones ilustrativas, la toxina es una exotoxina de Pseudomonas, o una variante de la misma, que tiene, adecuadamente, una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-22.
En realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo comprende una secuencia VH y una secuencia VL, adecuadamente, la secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-11, y la secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, y 12-15.
En realizaciones ilustrativas, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de union a antfgeno del mismo y una PE o variante de la misma, adecuadamente, el inmunoconjugado es la inmunotoxina Moxetumomab pasudotox que comprende la subunidad VH-PE38 de SEQ ID NO: 1 y la subunidad VL de SEQ ID NO: 2.
En realizaciones, el tampon de replegamiento tiene un pH de 9,4.
En realizaciones adecuadas, el proceso semicontinuo utiliza una velocidad de adicion de aproximadamente 52 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a aproximadamente 13 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora, mas, adecuadamente, una velocidad de adicion de aproximadamente 35 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a aproximadamente 17 ml cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon replegado por hora, o una velocidad de adicion de aproximadamente 30 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon replegado por hora a aproximadamente 18 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora, o una velocidad de adicion de aproximadamente 26 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora.
De manera adecuada, el tampon de separacion para su uso en los diversos metodos comprende etanolamina de aproximadamente 30-60 mM, arginina de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,75 M, EDTA de aproximadamente 1 -3 mM, urea de aproximadamente 7-9 M y DTT de aproximadamente 9-11 mM.
Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un inmunoconjugado que tiene menos de entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 1 % de especies desamidadas, en las que el inmunoconjugado se prepara mediante los diversos metodos desvelados en el presente documento.
En el presente documento tambien se proporcionan metodos para preparar un inmunoconjugado activo, en los que el inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, y en los que la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho inmunoconjugado. De manera adecuada, el metodo comprende replegar el inmunoconjugado en un proceso semicontinuo en un tampon de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos, y purificar el inmunoconjugado replegado utilizando una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en la que la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que comprende etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).
De manera adecuada, una cantidad del inmunoconjugado recuperado del metodo de preparacion es al menos trescientos % (300 %) mayor que una cantidad del inmunoconjugado recuperado utilizando un metodo que no comprende un proceso de replegamiento semicontinuo y/o una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico que se ha separado utilizando el tampon de separacion.
Otras realizaciones, caracterfsticas y ventajas de las realizaciones, asf como la estructura y el funcionamiento de las diversas realizaciones, se describen en detalle a continuacion con referencia a los dibujos adjuntos.
Breves descripciones de los dibujos
La Figura 1 muestra un flujo adecuado del proceso de renaturalizacion y purificacion para Moxetumomab pasudotox como se describe en el presente documento.
La Figura 2 muestra los resultados de una etapa de captura con Fractogel TMAE (M) (Ciclo 1).
La Figura 3 muestra los resultados de una cromatograffa con hidroxiapatita.
La Figura 4 muestra los resultados de una cromatograffa con Phenyl 650 M.
La Figura 5 muestra los resultados de una cromatograffa con Q Sepharose HP. La carga maxima de la columna fue de 10,4 g/l.
La Figura 6 muestra los resultados de un analisis de IEC de Moxetumomab pasudotox parcialmente purificado. La Figura 7 muestra los resultados de una etapa de captura con Fractogel TMAE (M) (Ciclo 1).
La Figura 8 muestra los resultados de una cromatograffa con hidroxiapatita.
La Figura 9 muestra los resultados de una cromatograffa con Phenyl 650 M.
La Figura 10 muestra los resultados de una cromatograffa con Q Sepharose HP.
La Figura 11 muestra los resultados de un cromatograma de la etapa de captura con Fractogel TMAE (M).
La Figura 12 muestra los resultados de un cromatograma de transferencia con Fractogel TMAE (M).
La Figura 13 muestra los resultados de un cromatograma con Fractogel TMAE (M) que utiliza el tampon de solubilizacion de cuerpos de inclusion (CI) de Moxetumomab pasudotox para la limpieza de la columna.
La Figura 14 muestra los resultados de un cromatograma de transferencia con Fractogel TMAE (M) con tampon de solubilizacion de CI.
La Figura 15 muestra los resultados de un cromatograma de tampon en blanco con Fractogel TMAE (M) con tampon de solubilizacion de CI.
La Figura 16 muestra los resultados de un cromatograma de transferencia con Fractogel TMAE (M) despues de 9 ciclos de purificacion.
La Figura 17 muestra los resultados de un cromatograma representativo con Capto Blue Sepharose.
La Figura 18 muestra los resultados de un analisis de SDS-PAGE no reducido de las fracciones de purificacion con Capto Blue Sepharose mostradas en la Figura 17.
La Figura 19 muestra los resultados de un cromatograma representativo de la etapa de captura con Capto Blue Sepharose.
Descripcion detallada de la invencion
Deberia apreciarse que las implementaciones particulares mostradas y descritas en el presente documento son ejemplos y no pretenden limitar de ninguna otra manera el alcance de la solicitud.
Cualquier conflicto entre cualquier referencia mencionada en el presente documento y las ensenanzas especificas de esta memoria descriptiva se resolveran a favor de esta ultima. Asimismo, cualquier conflicto entre una definicion entendida en la materia de una palabra o frase y una definicion de la palabra o frase tal como se ensena especificamente en esta memoria descriptiva se resolvera a favor de esta ultima.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" especificamente tambien abarcan las formas plurales de los terminos a los que se refieren, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. El termino "aproximadamente" como se utiliza en el presente documento significa aproximadamente, en la region de, practicamente, o alrededor. Cuando el termino "aproximadamente" se utiliza junto con un intervalo numerico, modifica ese intervalo al extender los limites por encima y por debajo de los valores numericos establecidos. En general, el termino "aproximadamente" se utiliza en el presente documento para modificar un valor numerico por encima y por debajo del valor establecido por una variacion del 20 %.
Los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente documento tienen el significado comunmente entendido por un experto en la materia a la que se refiere la presente solicitud, a menos que se defina lo contrario. En el presente documento se hace referencia a diversas metodologias y materiales conocidos por los expertos en la materia. Los trabajos de referencia estandar que establecen los principios generales de la tecnologia de ADN recombinante incluyen Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2s Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Kaufman et al., Eds., "Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine," CRC Press, Boca Raton (1995); y McPherson, Ed., "Directed Mutagenesis: A Practical Approach," IRL Press, Oxford (1991).
Los terminos "polipeptido", "peptido", "proteina", y "fragmento de proteina" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polimero de restos de aminoacidos. Los terminos se aplican a los polimeros de aminoacidos en donde uno o mas restos de aminoacidos es un mimetico quimico artificial de un aminoacido correspondiente de origen natural, asi como a polimeros de aminoacidos de origen natural y a polimeros de aminoacidos de origen no natural.
El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos de origen natural y sintetico, asi como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de una manera similar a los aminoacidos de origen natural. Los aminoacidos de origen natural son los codificados mediante el codigo genetico, asi como aquellos aminoacidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Analogos de aminoacidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura quimica basica que la de un aminoacido de origen natural, por ejemplo, un carbono alfa que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfoxido, metionina metil sulfonio. Dichos analogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas peptidicas modificadas, pero retienen la misma estructura quimica basica que un aminoacido que se produce naturalmente. Mimeticos de aminoacidos se refiere a compuestos quimicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura quimica general de un aminoacido, pero que funcionan de manera similar a un aminoacido de origen natural. Los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico (o aspartato) y acido glutamico (o glutamato). Los aminoacidos cargados positivamente incluyen arginina, histidina y lisina.
La "composicion" a purificar en el presente documento comprende el polipeptido de interes y una o mas impurezas. La composicion puede estar "parcialmente purificada" (es decir, haber sido sometida a una o mas etapas de purificacion, o puede obtenerse directamente de una celula u organismo hospedador que produce el polipeptido (por ejemplo, la composicion puede comprender liquido de cultivo celular recogido).
Una "variante acida" es una variante de un polipeptido o inmunoconjugado que es mas acido (por ejemplo, segun lo determinado mediante cromatograffa de intercambio cationico) que el polipeptido de interes. Un ejemplo de una variante acida es una variante desamidada. Las protemas desamidadas son aquellas que han tenido algunos o todos los grupos funcionales amida libres hidrolizados en acidos carboxflicos, como la conversion de glutaminas en acido glutamico. La velocidad de esta reaccion depende de la secuencia primaria, estructura tridimensional, pH, temperatura, tipo de tampon, fuerza ionica y otras propiedades de la solucion. De manera importante, la reaccion de desamidacion introduce una carga negativa en la molecula. Como se describe adicionalmente a continuacion, la desamidacion de protemas puede tener un impacto negativo en la actividad de las protemas.
Como se utiliza en el presente documento, los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecfficos (por ejemplo, anticuerpos biespecficos siempre que exhiban la actividad biologica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se describe en el presente documento. La expresion "anticuerpo biespecffico" pretende incluir cualquier anticuerpo que tenga dos especificidades de union diferentes, es decir, el anticuerpo se une a dos epftopos diferentes, que pueden ubicarse en el mismo antfgeno diana o, mas habitualmente, en diferentes antfgenos diana.
Los anticuerpos e inmunoglobulinas nativas son generalmente glucoprotefnas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras identicas (L) y dos cadenas pesadas identicas (H). Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varfa entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene tambien puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VH) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. utiliza 82, 4592-4596 (1985)). Cinco clases de inmunoglobulina humana se definen en base a su composicion de cadena pesada, y se denominan IgG, IgM, IgA, IgG e IgD. Los anticuerpos clase IgG y clase IgA se dividen ademas en subclases, concretamente, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, e IgAl e IgA2. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de region constante, que se designan como CHI, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de region constante, CHI, CH2, CH3 y CH4. Por tanto, las cadenas pesadas tienen una region variable y tres o cuatro regiones constantes. Se revisan la estructura y la funcion de la inmunoglobulina, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capftulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).
La expresion "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porcion de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigenicas de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero, sin limitacion, a Fab, Fab', F(ab’)2, Fv y fragmentos de Fv de cadena sencilla, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecfficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La expresion "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos salvo por las posibles mutaciones que tienen lugar de manera natural que pueden estar presentes en pequenas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente especfficos y se unen a un solo antfgeno. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante del antfgeno. Que un anticuerpo "se une selectivamente" o "se une especfficamente" significa que el anticuerpo reacciona o se asocia con mayor frecuencia, mas rapidamente, con mayor duracion, con mayor afinidad, o con alguna combinacion de lo anterior con un epftopo que con sustancias alternativas, incluso protemas no relacionadas. "Se une selectivamente" o "se une especfficamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una protefna con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, pero mas generalmente al menos aproximadamente 1 pM. "Se une selectivamente" o "se une especfficamente" significa en ocasiones que un anticuerpo se une a una protema a veces con una Kd de al menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, y otras veces al menos aproximadamente 0,01 pM o mejor. Debido a la identidad de secuencia entre protemas homologas en diferentes especies, la union especffica puede incluir un anticuerpo que reconoce una protema marcadora de celulas tumorales en mas de una especie.
Los anticuerpos del presente documento incluyen especfficamente anticuerpos “quimericos" en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que el grupo de la(s) cadena(s) es identico u homologo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. utiliza 57:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia mmima procedente de inmunoglobulina no humana. En su mayona, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que los restos de una region hipervariable del receptor son sustituidos por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la region marco (FR) de la inmunoglobulina humana estan sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectuan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 327:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596 (1992). Veanse tambien los siguientes artfculos de revision y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 7: 105-1 15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido fabricado utilizando cualquiera de las tecnicas para producir anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especfficamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de union a antfgeno no humanos.
El termino "inmunoconjugado" o "conjugado" o "inmunotoxina" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que esta unido a un agente de union celular (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo) y se define mediante una formula generica: C-L-A, en donde C = citotoxina, L = conector y A = agente de union celular (por ejemplo, anticuerpos anti-CD22 o fragmento de anticuerpo). Los inmunoconjugados tambien pueden definirse mediante la formula generica en orden inverso: A-L-C.
El termino "citotoxina" o "agente citotoxico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la funcion de las celulas y/o produce la destruccion de las celulas. El termino pretende incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isotopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolfticas, antibioticos y toxinas tales como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerfgenos desvelados a continuacion. Los ejemplos de agentes citotoxicos incluyen, pero sin limitacion, abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina difterica (DT), toxina botulfnica, o toxinas modificadas de la misma. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente toxicos que normalmente causan la muerte por toxicidad hepatica. PE y DT, sin embargo, pueden modificarse en una forma para su uso como inmunotoxina mediante la eliminacion del componente de direccionamiento nativo de la toxina (por ejemplo, el dominio la de PE o la cadena B de DT) y reemplazarlo con una fraccion de direccionamiento diferente, tal como un anticuerpo.
En algunas realizaciones, la toxina es la exotoxina de Pseudomonas. La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una protefna monomerica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la sfntesis de protefnas en celulas eucariotas mediante la inactivacion del factor de alargamiento 2 (EF-2) mediante la catalizacion de su ADP-ribosilacion (catalizacion de la transferencia de la fraccion ribosilo ADP de NAD oxidado en EF-2).
Un "inmunoconjugado de PE" o "inmunotoxina de PE" es un inmunoconjugado o inmunotoxina que comprende un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo y una toxina de PE o una variante de la misma.
"Purificar" un polipeptido o inmunoconjugado de una composicion que comprende el polipeptido y una o mas impurezas, significa aumentar el grado de pureza del polipeptido en la composicion mediante la eliminacion (total o parcialmente) de al menos una impureza de la composicion. De acuerdo con la presente invencion, la purificacion se realiza sin el uso de una etapa de cromatograffa de afinidad.
El termino "cromatograffa" se refiere al proceso por el cual un soluto de interes en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las tasas a las cuales los solutos individuales de la mezcla migran a traves de un medio estacionario bajo la influencia de una fase en movimiento, o en procesos de union y elucion.
El termino "intercambio ionico" y "cromatograffa de intercambio ionico" se refiere al proceso cromatografico en el que un soluto de interes (como una protefna) en una mezcla interactua con un compuesto cargado unido (por union covalente) a un material de intercambio ionico de fase solida tal que el soluto de interes interactua no especfficamente con el compuesto cargado mas o menos que las impurezas de soluto o contaminantes en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla se eluyen de una columna del material de intercambio ionico mas rapido o mas lento que el soluto de interes o se unen o excluyen de la resina con respecto al soluto de interes. La "cromatografia de intercambio ionico" incluye especificamente intercambio de cationes, intercambio de aniones y la cromatografia de modo mixto.
La frase "material de intercambio ionico" se refiere a una fase solida que esta cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio cationico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio anionico). La carga puede proporcionarse mediante la union de uno o mas ligandos cargados a la fase solida, por ejemplo, mediante enlace covalente. Como alternativa, ademas, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase solida (por ejemplo, como es el caso de la silice, que tiene una carga negativa global).
Una "resina de intercambio anionico" se refiere a una fase solida que esta cargada positivamente, teniendo asi uno o mas ligandos cargados positivamente unidos a la misma. Se puede utilizar cualquier ligando cargado positivamente unido a la fase solida adecuado para formar la resina de intercambio anionico, tal como grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio anionico disponibles comercialmente incluyen celulosa DEAE, Poros PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, Sartobind Q de Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q y 30Q, Q, DEAE y ANX Sepharose Fast Flow, Q Sepharose de alto rendimiento, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (g E Healthcare), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT de J. T. Baker, Hydrocell DEAE y Hydrocell QA de Biochrom Labs Inc., U Osphere Q, Macro-Prep DEAE y Macro-Prep High Q de Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, T risacryl M y LS DEAE, Spherodex LS DeAe, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M y Mustang Q de Pall Technologies, resinas anionicas DOw Ex de malla fina de base fuerte de tipo I y tipo II y DOWEX MONOSPHER E 77, anion de base debil de las separaciones de liquidos Dow, membrana Intercept Q, Matrex Cellufine A200, A500, Q500 y Q800, de Millipore, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD DEAE y Fractogel EMD DMAE de EMD, intercambiadores de aniones Amberlite fuertes y debiles tipo I y II, intercambiadores de aniones DOWEX fuertes y debiles tipo I y II, intercambiadores de aniones Diaion fuertes y debiles tipo I y II, Duolite de Sigma-Aldrich, TSK gel Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl SuperQ-650S, 650M y 650C, QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C de Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q de Whatman.
Por "fase solida" se entiende una matriz no acuosa a la que pueden adherirse uno o mas ligandos argados. La fase solida puede ser una columna de purificacion, una fase discontinua de particulas discretas, una membrana o un filtro, etc. Los ejemplos de materiales para formar la fase solida incluyen polisacaridos (tal como agarosa y celulosa); y otras matrices mecanicamente estables tales como silice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirenodivinil)benceno, poliacrilamida, particulas ceramicas y derivados de cualquiera de los anteriores.
El termino "union especifica" como se utiliza en el presente documento, tal como para describir las interacciones entre una molecula de interes y un ligando unido a una matriz de fase solida, se refiere a la union generalmente reversible de una proteina de interes a un ligando a traves de los efectos combinados de complementariedad espacial de las estructuras de proteinas y ligandos en un sitio de union junto con fuerzas electrostaticas, enlaces de hidrogeno, fuerzas hidrofobas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de union. Cuanto mayor sea la complementariedad espacial y cuanto mas fuertes sean las otras fuerzas en el sitio de union, mayor sera la especificidad de union de una proteina para su ligando respectivo. Los ejemplos no limitantes de union especifica incluyen union de anticuerpo-antigeno, union de enzima-sustrato, union de enzima-cofactor, quelacion de ion metalico, union de ADN-proteina de union a ADN, interacciones protefna-protefna reguladoras, y similares.
La expresion "union no especifica" como se utiliza en el presente documento, tal como para describir las interacciones entre una molecula de interes y un ligando u otro compuesto unido a una matriz de fase solida, se refiere a la union de una proteina de interes al ligando o compuesto en una matriz de fase solida a traves de fuerzas electrostaticas, enlaces de hidrogeno, fuerzas hidrofobas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de union, pero que carece de complementariedad estructural que aumenta los efectos de las fuerzas no estructurales. Los ejemplos de interacciones no especificas incluyen, pero sin limitacion, fuerzas electrostaticas, hidrofobas y de van der Waals, asi como tambien enlaces de hidrogeno.
Un "tampon" utilizado en la presente invencion es una solucion que resiste cambios en el pH mediante la adicion de acido o base por la accion de sus componentes conjugados acido-base. Pueden emplearse diversos tampones en un metodo de la presente invencion dependiendo del pH deseado del tampon y la etapa particular en el proceso de purificacion [vease Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]. Los ejemplos no limitantes de componentes de tampon que pueden utilizarse para controlar el intervalo de pH deseable para un metodo de la invencion incluyen acetato, citrato, histidina, fosfato, tampones de amonio tales como acetato de amonio, succinato, MES, CHAPS, MOPS, MOPSO, HEPES, Tris, y similares, asi como combinaciones de estos TRIS-acido malico-NaOH, maleato, cloroacetato, formiato, benzoato, propionato, piridina, piperazina, ADA, PIPES, ACES, BES, TES, tricina, bicina, TAPS, etanolamina, CHES, CAPS, metilamina, piperidina, acido O-borico, acido carbonico, acido lactico, acido butanoandioico, acido dietilmalonico, glicilglicina, HEPPS, HEPPSO, imidazol, fenol, POPSO, succinato, TAPS, a base de amina, bencilamina, trimetil o dimetil o etil o fenil amina, etilendiamina o mofolina. Los componentes adicionales (aditivos) pueden estar presentes en un tampon segun sea necesario, por ejemplo, se pueden utilizar sales para ajustar la fuerza ionica del tampon, tal como cloruro de sodio, sulfato de sodio y cloruro de potasio; y otros aditivos tal como aminoacidos (tal como glicina e histidina), caotropos (tal como urea), alcoholes (tales como metanol, manitol, glicerol y alcohol bencilico), detergentes (vease supra.) y azucares (tal como sacarosa, manitol, maltosa, trehalosa, glucosa y fructosa). Los componentes y aditivos del tampon, y las concentraciones utilizadas, pueden variar de acuerdo con el tipo de cromatografia practicada en la invencion.
El "tampon de carga" es el que se utiliza para cargar la composicion que comprende la molecula polipeptidica de interes y una o mas impurezas en la resina de intercambio ionico. El tampon de carga tiene una conductividad y/o pH de modo que la molecula polipeptidica de interes (y generalmente una o mas impurezas) se une a la resina de intercambio ionico o dicha proteina de interes fluye a traves de la columna mientras que las impurezas se unen a la resina.
La expresion "tampon de lavado" cuando se utiliza aqui se refiere a un tampon utilizado para lavar o re-equilibrar la resina de intercambio ionico, antes de eluir la molecula polipeptidica de interes. De manera conveniente, el tampon de lavado y el tampon de carga pueden ser los mismos, pero esto no es necesario.
El "tampon de elucion" se utiliza para eluir el polipeptido de interes de la fase solida. La conductividad y/o el pH del tampon de elucion son tales que el polipeptido de interes se eluye de la resina de intercambio ionico.
El "pi" o "punto isoelectrico" de un polipeptido se refiere al pH en el cual la carga positiva del polipeptido equilibra su carga negativa, pudiendose calcular pi a partir de la carga neta de los restos de aminoacidos o restos de acido sialico de los carbohidratos unidos del polipeptido o se puede determinar mediante enfoque isoelectrico.
Por "union" de una molecula a un material de intercambio ionico, se entiende la exposicion de la molecula al material de intercambio ionico en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de modo que la molecula se inmoviliza de manera reversible en o sobre el material de intercambio ionico en virtud de interacciones ionicas entre la molecula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio ionico.
Por "lavado" del material de intercambio ionico se entiende el paso de un tampon apropiado a traves o sobre el material de intercambio ionico.
Para "eluir" una molecula (por ejemplo, polipeptido o impureza) de un material de intercambio ionico se entiende eliminar la molecula de la misma mediante la alteracion de la fuerza ionica del tampon que rodea el material de intercambio ionico de modo que el tampon compita con la molecula por los sitios cargados en el material de intercambio ionico.
Como se utiliza en la presente divulgacion y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno", "una", y "el" o "la", incluyen formas en plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
Se entiende que siempre que se describan realizaciones en el presente documento con el lenguaje "que comprende", se proporcionan tambien realizaciones analogas descritas en terminos de "que consisten en y/o" que consisten esencialmente en ".
La expresion "y/o" como se utiliza en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir tanto "A como B", "A o B", "A," y "B." Del mismo modo, la expresion "y/o" tal como se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
Exotoxinas de Pseudomonas y otras toxinas
Las toxinas pueden emplearse con anticuerpos de la presente invencion para producir inmunotoxinas. Las toxinas ejemplares incluyen ricina, abrina, toxina de la difteria y subunidades de la misma, asi como las toxinas botulnicas de la A a la F. Estas toxinas estan facilmente disponibles en fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). La toxina difterica se aisla de Corynebaclerium diphtheriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de ricino). El termino tambien hace referencia a variantes toxicas de la misma. Por ejemplo, vease, las Patentes de EE.UU. n.° 5.079.163 y 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA, de sus siglas en ingles) se presenta en dos formas designadas RCA60 y RCA120 de acuerdo con sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochem. Biophys. Acta 266:543 (1972)). La cadena A es responsable de inactivar la sintesis de proteinas y matar las celulas. La cadena B se une a la ricina con los restos de galactosa de la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A en el citosol (Olsnes, et al., Nature 249: 621 -631 (1974) y en la Patente de EE.UU. N° 3.060.165).
La abrina incluye lectinas toxicas de Abrus precalorius. Los principios toxicos, abrina a, b, c, y d, tienen un peso molecular de aproximadamente 63 y 67 kD y estan compuestos por dos cadenas polipeptidicas A y B unidas por disulfuro. La cadena A inhibe la sintesis de proteinas; la cadena B (abrina-b) se une a los restos de D-galactosa (vease, Funatsu, et al., Agr. Biol. Chem. 52: 1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335 (1978)).
En realizaciones preferidas de la presente invencion, la toxina es la exotoxina de Pseudomonas (PE). La exotoxina de Pseudomonas (o exotoxina A) es una exotoxina producida por Pseudomonas aeruginosa. La expresion "exotoxina de Pseudomonas", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una PE nativa de longitud completa (de origen natural) o una PE que ha sido modificada. Dichas modificaciones pueden incluir, pero sin limitacion, eliminacion del dominio la, varias deleciones de aminoacidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoacidos individuales y la adicion de una o mas secuencias en el extremo carboxilo, tal como KDEL (SEQ ID NO: 3) y REDL (SEQ ID NO: 4). Vease Siegall, et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989). En una realizacion preferida, el fragmento citotoxico de PE retiene al menos el 50 %, preferentemente el 75 %, mas preferentemente al menos el 90 %, y lo mas preferentemente el 95 % de la citotoxicidad de la PE nativa. En una realizacion mas preferida, el fragmento citotoxico es mas toxico que la PE nativa.
La exotoxina A de Pseudomonas (PE) nativa es una proteina monomerica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la sintesis de proteinas en celulas eucariotas. La secuencia de PE nativa se proporciona en la Patente de EE.UU. n.° 5.602.095 cedida de manera comun. El metodo de accion es la inactivacion de la ADP-ribosilacion del factor de elongacion 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actuan en concierto para causar citotoxicidad. El dominio Ia (aminoacidos 1-252) media la union celular. El dominio II (aminoacidos 253-364) es responsable de la translocacion al citosol y el dominio III (aminoacidos 400-613) media la ribosilacion de ADP del factor de elongacion 2. La funcion del dominio b (aminoacidos 365-399) permanece indefinida, aunque una gran parte de ella, aminoacidos 365-380, pueden eliminarse sin perdida de citotoxicidad. Vease Siegall, et al., (1989), supra.
La PE empleada en la presente invencion incluye la secuencia nativa, los fragmentos citotoxicos de la secuencia nativa y las variantes modificadas conservativamente de la PE nativa y sus fragmentos citotoxicos. Las variantes de PE utiles en la invencion se describen en los documentos US 7.355.012 y WO 2007/016150 y WO 2009/032954. Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen aquellos que son citotoxicos con o sin posterior procesamiento proteolitico u otro proceso en la celula diana (por ejemplo, como una proteina o pre-proteina). Los fragmentos citotoxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35.
En realizaciones preferidas, la PE se ha modificado para reducir o eliminar la union celular no especifica, frecuentemente mediante la eliminacion del dominio Ia como se ensena en la Patente de EE.UU. n.° 4.892.827, aunque esto tambien se puede lograr, por ejemplo, mediante la mutacion de ciertos restos del dominio Ia. La Patente de EE.UU n.° 5.512.658, por ejemplo, desvela que una PE mutada en la que esta presente el dominio Ia, pero en la que los restos basicos del dominio Ia en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazan con restos acidos (acido glutamico o "E"). )) exhibe una citotoxicidad no especifica muy disminuida. Esta forma mutante de PE a veces se denomina PE4E.
PE40 es un derivado truncado de PE como se describio anteriormente en la materia, con una eliminacion del dominio la de la molecula de PE nativa. Vease, Pai, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci utiliza 55:3358-62 (1991); y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). PE35 es un fragmento carboxiterminal de 35 kD de PE en la que se han eliminado los restos de aminoacidos 1 -279 y la molecula comienza con una met en la posicion 280 seguida por los aminoacidos 281-364 y 381-613 de PE nativa. PE35 y PE40 se desvelan, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.602.095 y 4.892.827. PE4E es una forma de PE donde estan presentes todos los dominios de PE nativa, pero donde los restos basicos del dominio la en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazan con restos acidos (acido glutamina, o "E").
En algunas realizaciones preferentes, se emplea el fragmento citotoxico PE38. PE38 es una pro-proteina de PE truncada compuesta por los aminoacidos 253-364 y 381-613 que se activa a su forma citotoxica al procesarse dentro de una celula (vease, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Numeros 5.608.039, 7.355.012, y Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333:C1-C6 (1997)).
Como se ha senalado anteriormente, algunos o todos los dominios lb pueden eliminarse, y las porciones restantes se unen mediante un conector o directamente mediante un enlace peptidico. Parte de la porcion amino del dominio II puede ser eliminada. Y, el extremo C-terminal puede contener la secuencia nativa de los restos 609-613 (REDLK) (SEQ ID NO: 5), o puede contener una variacion encontrada para mantener la capacidad de la construccion para translocarse en el citosol, como REDL (SEQ ID NO: 4) o KDEL (SEQ ID NO: 3), y repeticiones de estas secuencias. Vease, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.854.044; 5.821.238; y 5.602.095 y el documento WO 99/51643. Mientras que en las realizaciones preferidas, el PE es PE4E, PE40 o PE38, cualquier forma de PE en la que se haya eliminado o reducido la citotoxicidad no especifica a niveles en los que no se produzca una toxicidad significativa para las celulas no diana, puede utilizarse en las inmunotoxinas de la presente invencion, siempre que siga siendo capaz de la translocacion y ribosilacion de EF-2 en una celula diana.
Variantes de PE modificadas conservativamente
Las variantes modificadas conservativamente de PE o fragmentos citotoxicos de las mismas tienen al menos un 80 % de similitud de secuencia, preferentemente al menos un 85 % de similitud de secuencia, mas preferentemente al menos un 90 % de similitud de secuencia, y lo mas preferentemente al menos un 95 % de similitud de secuencia a nivel de aminoacidos, con la PE de interes, tal como PE38.
La expresion "variantes modificadas de forma conservativa" se aplica a secuencias tanto de aminoacidos como de acido nucleico. Con respecto a secuencias de acidos nucleico concretas, las variantes modificadas de manera conservativa se refieren a aquellas secuencias de acido nucleico que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas, o si el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias de acido nucleico esencialmente identicas. A causa de la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier polipeptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoacido alanina. Por tanto, en cada posicion donde una alanina se especifica mediante un codon, el codon se puede alterar a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones de acido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservativa. Cada secuencia de acido nucleico del presente documento que codifica un polipeptido tambien describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del acido nucleico. Un experto reconocera que cada codon en un acido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el unico codon para la metionina) puede modificarse para producir una molecula funcionalmente identica. En consecuencia, todas las variaciones silenciosas de un acido nucleico que codifica un polipeptido estan implicitas en cada secuencia descrita.
Como secuencias de aminoacidos, un experto en la materia reconocera que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un acido nucleico, peptido, polipeptido o secuencia de proteinas que altera, anada o elimine un unico aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos de la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa" donde la alteracion da como resultado la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido quimicamente similar.
Las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la invencion pueden ensayarse para el nivel deseado de citotoxicidad mediante ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Por tanto, los fragmentos citotoxicos de PE y las variantes modificadas de manera conservativa de dichos fragmentos pueden analizarse facilmente para determinar la citotoxicidad. Un gran numero de moleculas de PE candidatas pueden analizarse simultaneamente para determinar la citotoxicidad mediante metodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los subgrupos de las moleculas candidatas pueden analizarse para determinar la citotoxicidad. Los subgrupos que reaccionan positivamente de las moleculas candidatas pueden subdividirse y reexaminarse continuamente hasta que se identifiquen el (los) fragmento(s) citotoxico(s) deseado(s). Dichos metodos permiten la deteccion rapida de grandes cantidades de fragmentos citotoxicos o variantes conservadoras de PE.
Inmunoconjugados anti-CD22/PE
En una realizacion, el polipeptido de interes comprende un anticuerpo que se une especificamente a CD22. "CD22" se refiere a un antigeno de linfocitos B con restriccion de linaje que pertenece a la superfamilia de Ig. Se expresa en el 60-70 % de los linfomas y leucemias de linfocitos B y no esta presente en la superficie celular en las etapas iniciales del desarrollo de los linfocitos B o en las celulas madre. Vease, por ejemplo, Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol.
77:267-297 (1991). En otra realizacion, el polipeptido de interes es un fragmento de anticuerpo que se une a CD22 (por ejemplo, Fab, o scFv).
Como se utiliza en el presente documento, el termino "anti-CD22" en referencia a un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se une especificamente a CD22 e incluye una referencia a un anticuerpo que se genera contra CD22. En algunas realizaciones, el CD22 es un CD22 de primate tal como CD22 humano. En una realizacion, el anticuerpo se genera contra CD22 humano sintetizado mediante un mamifero no primate despues de la introduccion en el animal de ADNc que codifica CD22 humano. En una realizacion adicional, el polipeptido de interes es un inmunoconjugado de anticuerpo CD22 que comprende la exotoxina PE38.
Un ejemplo de un inmunoconjugado CD22/PE38 es Moxetumomab pasudotox descrito en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional N° WO 2012/015912, WO 98/41641 y WO2003/27135, las patentes de EE.UU. n.° 7.541.034, 7.355.012 y la publicacion de EE.UU. n.° 2007/0189962. Moxetumomab pasudotox (CAT-8015) es una proteina de inmunotoxina recombinante compuesta por un fragmento Fv de anticuerpo basado en el anticuerpo anti-CD22 RFB4 fusionado a una forma truncada de la proteina de exotoxina de Pseudomonas, PE38. El fragmento Fv anti-CD22 consiste en dos dominios, un VL y un VH, donde este ultimo se modifico para mejorar la union a la diana CD22 humano. La proteina de Moxetumomab pasudotox esta compuesta por dos polipeptidos independientes, la cadena VL (SEQ ID NO: 2) y la cadena VH, fusionadas en el extremo C al dominio p E38 (VH-PE38) (SEQ ID NO: 1). Otras secuencias VL y VH-PE38 utiles en esta invencion se describen en los documentos US 7.541.034, 7.355.012, 2007/0189962 y WO 2012/015912. Ambos dominios se disenaron para que cada uno contenga restos de cisteina disenados para permitir la formacion de un enlace disulfuro intermolecular. Esta caracteristica aumenta la estabilidad de la proteina de fusion.
La secuencia de aminoacidos de la subunidad VH-P38 (SEQ ID NO: 1) de Moxetumomab pasudotox es la siguiente:
MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWVAYISS
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHW
GVLFAYWGOGTLVSAKASGGPE G G SL A A LTA H O A C H L PLETFTR H R O PR G W
EQLEQCGYPVQRLVALYIAARLSWNQVDQVIRALASPGSGGDLGEAIREQPE
QARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFL
GDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVF
GGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYV
PRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILG
WPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRED
LK (SEQ ID NO : 1)
La secuencia PE38 se muestra en negrita, y los cinco conectores de aminoacidos entre el dominio VH y el dominio PE38 se muestran subrayados.
La secuencia de aminoacidos de la subunidad VL (SEQ ID NO: 2) de Moxetumomab pasudotox es la siguiente:
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILH
SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWT FGCGTKLEIK (SEQ
ID NO : 2 )
En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoacidos del dominio VH del inmunoconjugado es uno de los siguientes:
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSIYDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GTHW
GVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO : 6 )
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSI YDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GYNW
GVLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO : 7 )
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSI YDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GTTW
GVLFA YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO : 8)
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSI YDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GSTY
GVLFA YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO : 9)
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSI YDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GTHW
GVLFA YWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 10)
ME V QLVES GGGL VKPGGSLKLS C A AS GFAFSIYDMS W VRQTPEKCLEW V A YIS S
GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDT AMYY C ARHSGY GS S Y G
VLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 11)
En realizaciones adicionales, la secuencia de aminoacidos del dominio VL del inmunoconjugado es uno de los siguientes:
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIARYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSIL
HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK
(SEQ ID NO: 12)
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIHGYLNW YQQKPDGTVKLLIYYTSIL
HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPW TFGCGTKLEIK
(SEQ ID NO: 13)
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIGRYLNW YQQKPDGTVKLLIYYTSIL
HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPW TFGCGTKLEIK
(SEQ ID NO: 14)
MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRGYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSIL
HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK
(SEQ ID NO: 15)
En otras realizaciones determinadas, la toxina PE del inmunoconjugado es una PE o variante de la misma seleccionada de entre las siguientes:
PE nativa
AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGN
DALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHE
KPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQP
TLAISHAGVSWMAQTQPRREKRWSEW ASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNL
DDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLET
FTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGD
LGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNY
PTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAA
QSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRV
YVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGW
PLAERTWIPS AIPTDPRNV GGDLDPS SIPDKEQAIS ALPD Y ASQPGKPPREDLK
(SEQ ID NO: 16)
PE40
GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSW
NQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDE
AGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTR
GTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAI
W RGFYIAGDP ALA Y GY AQDQEPD ARGRIRN G ALLR V Y VPRS S LPGFYRTS LTLA
APEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPR
NVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYAS QPGKPPREDLK (SEQ ID NO: 17)
PE38
GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSW
NQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDE
AGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQ
LEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYA
QDQEPD ARGRIRN GALLRV Y VPRS S LPGFYRTS LTLA APE A AGE VERLIGHPLPLR
LD AITGPEEEGGRLETILGWPLAERTWIPS AIPTDPRNV GGDLDPS SIPDKEQAIS A
LPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO: 18)
PE35
MWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQ
PEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLG
DGGD VSFSTRGTQNW TVERLLQAHRQLEERGYVFV GYHGTFLEA AQSIVFGGVR
ARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPG
FYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVI
PSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:
19)
PE-LR
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVF
VGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAR
GRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEE
EGGRLETILGWPLAERTVVIPS AIPTDPRNV GGDLDPS SIPDKEQAIS ALPDYASQP
GKPPREDLK (SEQ ID NO:20)
PE-LR-6X
RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNW TVERLLQAHRQLEEGGYVF
VGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAA
GRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEE
AGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQP
GKPPREDLK (SEQ ID NO:21)
PE-38 (Moxetumomab pasudotox)
PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLS
W NQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGND
EAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHR
QLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGY
AQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPL
RLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAIS
ALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:22)
La toxina PE del inmunoconjugado se fusiona o conjuga con el dominio VH o VL directamente o mediante un conector en el extremo N o en el extremo C del dominio VH o VL. Un ejemplo de un conector se describe anteriormente para Moxetumomab pasudotox y corresponde a la secuencia de aminoacidos KASGG (SEQ ID NO: 23). Se pueden generar facilmente conectores adicionales mediante tecnicas conocidas en la materia.
Expresion de un inmunoconjugado de PE
El inmunoconjugado de PE de la presente invencion se expresa, adecuadamente, en celulas, tales como celulas Bacterianas, y luego se aisla de cuerpos de inclusion. El inmunoconjugado de PE aislado de cuerpos de inclusion luego se purifica/aisla adicionalmente utilizando pasos posteriores como se describe en este documento.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresion en el hospedador para expresar el inmunoconjugado de PE de la presente invencion. Dichos sistemas de expresion en el hospedador representan vehiculos mediante los cuales las secuencias codificantes de interes pueden producirse y posteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias que codifican los nucleotidos adecuados, expresan una molecula de anticuerpo de la invencion in situ. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo,, E. coli, B. subtilis) transformadas con Ad N de bacteriofago recombinante, ADN plasmido o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresion en levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresion de plasmido recombinante que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; o sistemas de celulas de mamiferos (por ejemplo, celulas COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores procedentes del genoma de celulas de mamifero (por ejemplo, promotor de metalotioneina) o de virus de mamifero (por ejemplo, el promotor tardio de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
El ADN que codifica cada uno de los polipeptidos de la toxina VL y VH-PE (por ejemplo, VH-PE38) puede introducirse en un vector de expresion mediante tecnicas bien conocidas en la materia.
Un "vector" se refiere a cualquier vehiculo para la clonacion y/o transferencia de un acido nucleico a una celula hospedadora. Un vector puede ser un replicon al que se puede unir otro segmento de ADN para lograr la replicacion del segmento adjunto. Un "replicon" se refiere a cualquier elemento genetico (por ejemplo, plasmido, fago, cosmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autonoma de replicacion de Ad N in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El termino "vector" incluye vehiculos para introducir el acido nucleico en una celula in vitro, ex vivo o in vivo. Se puede utilizar un gran numero de vectores conocidos en la materia para manipular acidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores, tales como promotores inducibles, en genes, etc. Los vectores posibles incluyen, por ejemplo, plasmidos tales como pBR322 o derivados plasmidos pUC, o el vector Bluescript. Por ejemplo, la insercion de los fragmentos de ADN correspondientes a elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado se puede lograr mediante la union de los fragmentos de ADN apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios. Como alternativa, los extremos de las moleculas de ADN pueden modificarse enzimaticamente o cualquier sitio puede producirse mediante la union de secuencias de nucleotidos (conectores) en los extremos del ADN. Dichos vectores pueden disenarse para contener genes marcadores seleccionables que proporcionan la seleccion de celulas. Dichos marcadores permiten la identificacion y/o seleccion de celulas hospedadoras que expresan las proteinas codificadas por el marcador.
La expresion "vector de expresion" se refiere a un vector, plasmido o vehiculo disenado para permitir la expresion de una secuencia de acido nucleico insertada despues de la transformacion en el hospedador. El gen clonado, es decir, la secuencia de acido nucleico insertada, por ejemplo, un gen que codifica un VH anti-CD22, VL anti-CD22 o VH o VL anti-CD22 fusionado a una toxina PE, generalmente se coloca bajo el control de los elementos de control tales como un promotor, un promotor minimo, un potenciador o similar. Las regiones de control de iniciacion o promotores, que son utiles para dirigir la expresion de un acido nucleico en la celula hospedadora deseada, son numerosos y familiares para los expertos en la materia. Practicamente cualquier promotor capaz de dirigir la expresion de estos genes puede utilizarse en un vector de expresion, incluyendo, pero sin limitacion, promotores virales, promotores bacterianos, promotores animales, promotores de mamiferos, promotores sinteticos, promotores constitutivos, promotores especificos de tejido, promotores relacionados con patogenesis o enfermedades, promotores especificos del desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por luz; incluyendo, pero sin limitacion, la region promotora temprana de SV40 (SV40), el promotor contenido en la repeticion terminal larga (LTR, de sus siglas en ingles) de 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV, de sus siglas en ingles), el EIA o promotor tardio principal (MLP, de sus siglas en ingles) de adenovirus (Ad), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (HCMV, de sus siglas en ingles), el promotor timidina quinasa (TK) del virus herpes simplex (HSV, de sus siglas en ingles), el promotor IE1 baculovirus, el promotor del factor de elongacion 1 alfa (EF1), promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK), el promotor de la ubiquitina C (Ube), el promotor de albumina, las secuencias reguladoras del promotor metalotioneina-L de raton y las regiones de control de la transcripcion, los promotores ubicuos (HPRT, vimentina, p-actina, tubulina y similares), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, y similares), los promotores de genes terapeuticos (del tipo MDR, CFTR o factor VIII, y similares), promotores relacionados con patogenesis o enfermedades. Ademas, estas secuencias de expresion pueden modificarse mediante la adicion de secuencias potenciadoras o reguladoras y similares.
El termino "expresion" se refiere a la produccion biologica de un producto codificado por una secuencia codificante. En la mayoria de los casos, una secuencia de ADN, incluida la secuencia codificante, se transcribe para formar un ARN mensajero (ARNm). El ARN mensajero luego se traduce para formar un producto polipeptidico que tiene una actividad biologica relevante. Ademas, el proceso de expresion puede implicar etapas de procesamiento adicionales para el producto de transcripcion del ARN, como el empalme para eliminar intrones, y/o el procesamiento posterior a la traduccion de un producto polipeptidico.
Los polipeptidos VL y VH-PE38 se expresan, adecuadamente, en celulas, por ejemplo, celulas Bacterianas, tal como E. coli. Los polipeptidos se expresan, por ejemplo, en celulas de E. coli y se aislan de cuerpos de inclusion. En determinadas realizaciones, las subunidades VL y VH-PE38 se expresan en diferentes celulas. Por ejemplo, el VL se expresa en una celula en un primer vector y el VH-PE38 se expresa en una celula diferente en un segundo vector. En otras realizaciones, las subunidades VL y VH-PE38 se expresan en la misma celula en diferentes vectores, por ejemplo, el VL se expresa en una celula en un primer vector y el VH-PE38 se expresa en la misma celula en un vector diferente. En otras realizaciones determinadas, las subunidades VL y VH-PE38 se expresan en el mismo vector en la misma celula. Los cuerpos de inclusion de las celulas se recuperan, se solubilizan y las subunidades VL y VH-PE38 se combinan para formar un inmunoconjugado, como se describe en el presente documento.
Metodos de preparacion de inmunoconjugados
En realizaciones, en el presente documento se proporcionan metodos para preparar inmunoconjugados activos, es decir, inmunoconjugados capaces de unirse a una diana deseada y suministrar el compuesto (por ejemplo, inmunotoxina) que esta unida al agente de direccionamiento celular (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra proteina).
Los metodos descritos en el presente documento se utilizan, adecuadamente, para preparar inmunoconjugados que se desamidan en uno o mas restos. Tal como se describe en el presente documento, tal desamidacion a menudo da como resultado una inhibicion de la potencia de un inmunoconjugado, y por lo tanto, los metodos proporcionados son beneficiosos para preparar inmunoconjugados activos adecuados para entornos clinicos.
Tal como se describe en el presente documento, los inmunoconjugados se preparan, adecuadamente, utilizando sistemas de expresion de bacterias, incluyendo E. coli. Los cuerpos de inclusion de las celulas se recuperan, se solubilizan y las proteinas se recuperan. En realizaciones, las subunidades de toxina VL y VH disenadas para formar un inmunoconjugado, como se describe en el presente documento, se preparan en las celulas Bacterianas.
Tal como se describe en el presente documento, los cuerpos de inclusion que comprenden las subunidades de inmunoconjugado deseados se solubilizan, se concentran y se clarifican. Los metodos adecuados de aclaramiento se describen en el presente documento, asf como en la divulgacion y los ejemplos del documento WO2012/015912. T ras el aclaramiento, se lleva a cabo el replegamiento del inmunoconjugado.
En realizaciones, los metodos para preparar inmunoconjugados comprenden, adecuadamente, replegar un inmunoconjugado utilizando un proceso semicontinuo. Despues del replegamiento, el inmunoconjugado replegado se purifica con una o mas columnas de cromatograffa como se describe en el presente documento, asf como en el documento WO2012/015912.
Como se utiliza en el presente documento, "repliegue" se refiere al proceso bajo el cual una protefna, aislada de cuerpos de inclusion, se pliega en su estructura tridimensional caracterfstica y funcional a partir de una orientacion aleatoria previa.
Un proceso "semicontinuo" se refiere a un proceso de replegamiento en el que se agrega una mezcla de cuerpo de inclusion solubilizada (que contiene el inmunoconjugado deseado) (es decir, se inyecta o mezcla) a un tampon de replegamiento adecuado a una velocidad controlada durante un perfodo de tiempo. De manera adecuada, la adicion se produce a una velocidad constante durante todo el curso del tiempo, aunque la velocidad tambien puede variar durante el proceso, si se desea. Este curso de tiempo de adicion se denomina aquf como la "tasa de adicion", y se expresa, adecuadamente, en l/h.
Se ha descubierto inesperadamente que el uso de un proceso semicontinuo en el que las subunidades de un inmunoconjugado estan inicialmente presentes en una concentracion baja, y la concentracion aumenta luego durante un perfodo de tiempo relativamente prolongado (adecuadamente, a una velocidad de adicion fija durante el curso de 2, 3, 4, 5, 6 horas, etc.), da como resultado un aumento del rendimiento del inmunoconjugado en comparacion con los procesos no semicontinuos que utilizan una adicion masiva de subunidades, en las que la concentracion es inicialmente mayor y no cambia con el tiempo. Este descubrimiento es particularmente sorprendente cuando se utilizan las subunidades VL y VH-PE38 descritas en el presente documento, que deben replegarse juntas (es decir, unirse en una solucion diluida) para formar el inmunoconjugado final, en contraste con una protefna de un solo componente.
En realizaciones ilustrativas, el rendimiento de inmunoconjugado recuperado es, adecuadamente, al menos aproximadamente 20 % mayor, al menos aproximadamente 30 % mayor, al menos aproximadamente 40 % mayor, al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos aproximadamente 60 % mayor, al menos aproximadamente 70 % mayor, al menos aproximadamente 80 % mayor, al menos aproximadamente 90 % mayor, al menos aproximadamente 100 % mayor, al menos aproximadamente 125 % mayor, al menos aproximadamente 150 % mayor, al menos aproximadamente 175 % mayor, al menos aproximadamente 200 % mayor, al menos aproximadamente 300 % mayor, al menos aproximadamente 400 % mayor, al menos aproximadamente 500 % mayor, al menos aproximadamente 600 % mayor, al menos aproximadamente 700 % mayor, al menos aproximadamente 800 % mayor, al menos aproximadamente 900 % mayor, etc., en comparacion con los procesos no semicontinuos que utilizan una adicion masiva de subunidades y una concentracion constante de subunidades.
En determinadas realizaciones adicionales, el rendimiento de inmunoconjugado recuperado es, adecuadamente, al menos aproximadamente 20 % mayor, al menos aproximadamente 30 % mayor, al menos aproximadamente 40 % mayor, al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos aproximadamente 60 % mayor, al menos aproximadamente 70 % mayor, al menos aproximadamente 80 % mayor, al menos aproximadamente 90 % mayor, al menos aproximadamente 100 % mayor, al menos aproximadamente 125 % mayor, al menos aproximadamente 150 % mayor, al menos aproximadamente 175 % mayor, al menos aproximadamente 200 % mayor, al menos aproximadamente 300 % mayor, al menos aproximadamente 400 % mayor, al menos aproximadamente 500 % mayor, al menos aproximadamente 600 % mayor, al menos aproximadamente 700 % mayor, al menos aproximadamente 800 % mayor, al menos aproximadamente 900 % mayor, etc., en donde el inmunoconjugado se repliega en un proceso semicontinuo en un tampon de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos. En realizaciones adicionales, el inmunoconjugado replegado se purifica utilizando una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en donde la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que contiene etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT). En otras realizaciones, el proceso de recuperacion de dicho inmunoconjugado corresponde al de un proceso no semicontinuo, excepto que el replegamiento se realiza en un proceso semicontinuo en un tampon de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos y/o la purificacion de dicho inmunoconjugado utiliza una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en donde la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que contiene etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).
De manera adecuada, la velocidad de adicion (l/h) de los cuerpos de inclusion solubilizados se ajusta de manera que se agrega una mezcla de cuerpos de inclusion solubilizados a un tampon de replegamiento (adecuadamente preenfriado) en el transcurso de aproximadamente 2-8 horas, adecuadamente, 3-6 horas, 3-5 horas, o mas adecuadamente, en el transcurso de aproximadamente 4 horas.
En realizaciones, la adicion se realiza en el transcurso de 1 a 10 horas, utilizando una velocidad de adicion de aproximadamente 100 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a una velocidad de adicion de aproximadamente 5 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora (aproximadamente 100 ml/l/h a aproximadamente 5 ml/l/h). En realizaciones ilustrativas, la adicion se realiza en el transcurso de 2 a 8 horas, utilizando una velocidad de adicion de aproximadamente 52 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a una velocidad de adicion de aproximadamente 13 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora (aproximadamente 52 ml/l/h a aproximadamente 13 ml/l/h). En realizaciones adicionales, la adicion se realiza en el transcurso de 3 a 6 horas, utilizando una velocidad de adicion de aproximadamente 35 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a una velocidad de adicion de aproximadamente 17 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora (aproximadamente 35 ml/l/h a aproximadamente 17 ml/l/h). En realizaciones adicionales, la adicion se realiza en el transcurso de 3,5 a 5 horas, utilizando una velocidad de adicion de aproximadamente 30 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a una velocidad de adicion de aproximadamente 18 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora (aproximadamente 30 ml/l/h a aproximadamente 18 ml/l/h). En otras realizaciones adicionales, la adicion se realiza en el transcurso de aproximadamente 4 horas, utilizando una velocidad de adicion de aproximadamente 26 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora (aproximadamente 26 ml/l/h). En otras realizaciones, tambien pueden utilizarse velocidades de adicion adicionales en los procesos semicontinuos descritos en el presente documento.
Tambien se proporcionan metodos adicionales para preparar un inmunoconjugado, en los que el inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, y en los que la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia del inmunoconjugado. Adecuadamente, los metodos comprenden replegar el inmunoconjugado utilizando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento o como se desvela en el documento WO 2012/0152912. El inmunoconjugado replegado se purifica luego con una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico.
Tal como se describe en el presente documento, para la limpieza y reutilizacion de la columna, de manera adecuada, la columna se separa entre ciclos operativos (es decir, carga de la columna, lavado, elucion) del inmunoconjugado replegado utilizando un tampon de separacion. En realizaciones ilustrativas, el tampon de separacion que se utiliza en los metodos descritos en el presente documento comprende arginina, urea y ditiotreitol (DTT) tamponados. Los metodos descritos en el presente documento tambien pueden utilizar ciclos de 3, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, etc., columnas, segun se desee, con separacion con el tampon de separacion descrito entre cada ciclo consecutivo.
Se ha encontrado sorprendentemente que el uso de un tampon de separacion entre ciclos consecutivos que tienen la composicion descrita en el presente documento, que comprende, adecuadamente, urea y arginina, da como resultado un aumento del rendimiento del inmunoconjugado final, en comparacion con los metodos de elucion y las columnas que no utilizan un tampon de separacion como se describe en el presente documento entre eluciones consecutivas.
En realizaciones, el rendimiento de inmunoconjugado recuperado es, adecuadamente, al menos aproximadamente 20 % mayor, al menos aproximadamente 30 % mayor, al menos aproximadamente 40 % mayor, al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos aproximadamente 60 % mayor, al menos aproximadamente 70 % mayor, al menos aproximadamente 80 % mayor, al menos aproximadamente 90 % mayor, al menos aproximadamente 100 % mayor, al menos aproximadamente 125 % mayor, al menos aproximadamente 150 % mayor, al menos aproximadamente 175 % mayor, al menos aproximadamente 200 % mayor, al menos aproximadamente 300 % mayor, al menos aproximadamente 400 % mayor, al menos aproximadamente 500 % mayor, al menos aproximadamente 600 % mayor, al menos aproximadamente 700 % mayor, al menos aproximadamente 800 % mayor, al menos aproximadamente 900 % mayor, etc., en comparacion con los metodos de elucion y las columnas que no utilizan un tampon de separacion como se describe en el presente documento entre eluciones consecutivas
En realizaciones adecuadas, el tampon de separacion util en los metodos descritos en el presente documento comprende arginina de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,9 M, urea de aproximadamente 5-10 M y DTT de aproximadamente 7-15 mM. Mas adecuadamente, el tampon de separacion comprende, arginina de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,75 M, urea de aproximadamente 7-9 M y DTT de aproximadamente 9­ 11 mM. Mas adecuadamente, aproximadamente arginina de 0,45 a aproximadamente 0,55 M, urea de aproximadamente 7,5-8,5 M y DTT de aproximadamente 9,5-10,5 mM. De forma mas adecuada, el tampon de separacion comprende aproximadamente arginina 0,50 M, aproximadamente urea 8,0 M y aproximadamente DTT 10,0 mM.
En los diversos metodos descritos en el presente documento, el tampon de replegamiento que se utiliza en las etapas de replegamiento descritas en el presente documento tiene un pH menor de o aproximadamente 10,0, adecuadamente, menor de o aproximadamente 9,5, y mas adecuadamente, menor de o aproximadamente 9,4 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 10,0, aproximadamente 9,9, aproximadamente 9,8, aproximadamente 9,7, aproximadamente 9,6, aproximadamente 9,5, aproximadamente 9,3, aproximadamente 9,2, aproximadamente 9,1 o aproximadamente 9,0). Se ha encontrado sorprendentemente que el uso de un tampon de replegamiento que tiene un pH menor de o aproximadamente 10,0, menor de o aproximadamente 9,5 y lo mas adecuadamente, menor de aproximadamente 9,4, da como resultado un aumento del rendimiento del inmunoconjugado final, en comparacion con los procesos que utilizan tampones de replegamiento que tienen un pH mayor que estos valores citados.
En realizaciones, el rendimiento de inmunoconjugado recuperado es, adecuadamente, al menos aproximadamente 20 % mayor, al menos aproximadamente 30 % mayor, al menos aproximadamente 40 % mayor, al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos aproximadamente 60 % mayor, al menos aproximadamente 70 % mayor, al menos aproximadamente 80 % mayor, al menos aproximadamente 90 % mayor, al menos aproximadamente 100 % mayor, al menos aproximadamente 125 % mayor, al menos aproximadamente 150 % mayor, al menos aproximadamente 175 % mayor, al menos aproximadamente 200 % mayor, al menos aproximadamente 300 % mayor, al menos aproximadamente 400 % mayor, al menos aproximadamente 500 % mayor, al menos aproximadamente 600 % mayor, al menos aproximadamente 700 % mayor, al menos aproximadamente 800 % mayor, al menos aproximadamente 900 % mayor, etc., en comparacion con los procesos que utilizan tampones de replegamiento que tienen un pH mayor que estos valores citados.
En los diversos metodos de preparacion descritos en el presente documento, adecuadamente, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo. Como se describe en todo el documento, adecuadamente, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende un Fab, un Fab’, un F(ab’)2, un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv ligado a disulfuro, un dominio V-NAR, una IgNar, un intracuerpo, una IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab’)3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio unico, DVD-IG, Fcab, AcM2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
Tal como se describe en el presente documento, de manera adecuada, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del inmunoconjugado se une a un receptor de la superficie celular. Un receptor de superficie celular ejemplar incluye CD22.
En realizaciones adecuadas, el inmunoconjugado que se prepara de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento comprende una toxina. Toxinas ejemplares y metodos de preparacion de dichas toxinas se describen en todo el documento. De manera adecuada, la toxina se selecciona entre el grupo que consiste en: exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina de la difteria y subunidades de la misma, asi como toxinas botulinicas A a F o variantes, o derivados de las mismas. En realizaciones, la toxina es una exotoxina de Pseudomonas, o una variante de la misma. Los metodos ejemplares de preparacion de exotoxina de Pseudomonas (PE) se describen en el presente documento en detalle asi como en el documento WO2012/015912.
En realizaciones, la exotoxina de Pseudomonas para su uso en los inmunoconjugados descritos en el presente documento tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-22. De manera adecuada, la exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma, tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22.
De manera adecuada, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que es un componente de la inmunotoxina comprende una secuencia VH y una secuencia VL. De manera adecuada, la secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-11, y la secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, y 12-15.
Como se describe en todo el documento, los metodos de preparacion de inmunoconjugados se utilizan, adecuadamente, para preparar inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de union a antigeno del mismo y una PE o variante de la misma. En realizaciones adecuadas, el inmunoconjugado que se prepara mediante los diversos metodos descritos en el presente documento es la inmunotoxina de Moxetumomab pasudotox que comprende la subunidad VH-PE38 de la s Eq ID NO: 1 y la subunidad VL de la SEQ ID NO: 2.
En realizaciones adicionales, se proporcionan metodos para preparar un inmunoconjugado activo que combinan los diversos procesos descritos en el presente documento que se han determinado para aumentar el rendimiento de un inmunoconjugado activo. De manera adecuada, el inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, y la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia del inmunoconjugado.
Tal como se describe en el presente documento, dichos metodos comprenden, adecuadamente, replegar un inmunoconjugado con un proceso semicontinuo en un tampon de replegamiento que tiene un pH inferior a 9,5 y purificar el inmunoconjugado replegado con una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en la que la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que comprende etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).
De manera adecuada, los diversos metodos descritos en el presente documento proporcionan una cantidad del inmunoconjugado recuperado de los metodos que es al menos trescientos % (300 %) mayor que una cantidad del inmunoconjugado recuperado utilizando un metodo que no comprende un proceso de replegamiento semicontinuo y/o una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico que se ha separado utilizando el tampon de separacion descrito y/o no utiliza un tampon de replegamiento con un pH inferior a 9,4.
En realizaciones, la cantidad de inmunoconjugado recuperado es, adecuadamente, al menos aproximadamente 20 % mayor, al menos aproximadamente 30 % mayor, al menos aproximadamente 40 % mayor, al menos aproximadamente 50 % mayor, al menos aproximadamente 60 % mayor, al menos aproximadamente 70 % mayor, al menos aproximadamente 80 % mayor, al menos aproximadamente 90 % mayor, al menos aproximadamente 100 % mayor, al menos aproximadamente 125 % mayor, al menos aproximadamente 150 % mayor, al menos aproximadamente 175 % mayor, al menos aproximadamente 200 % mayor, al menos aproximadamente 300 % mayor, al menos aproximadamente 400 % mayor, al menos aproximadamente 500 % mayor, al menos aproximadamente 600 % mayor, al menos aproximadamente 700 % mayor, al menos aproximadamente 800 % mayor, al menos aproximadamente 900 % mayor, etc., en comparacion con los procesos que no comprenden un proceso de replegamiento semicontinuo y/o una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico que se ha separado utilizando el tampon de separacion descrito y/o no utiliza un tampon de replegamiento con un pH inferior a 9,4.
Tal como se describe en el presente documento, adecuadamente, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo, que incluye un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del inmunoconjugado se une a un receptor de la superficie celular tal como CD22.
En realizaciones adecuadas, el inmunoconjugado comprende una toxina, de manera adecuada, exotoxina de Pseudomonas (PE). De manera adecuada, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que es un componente de la inmunotoxina comprende una secuencia VH y una secuencia VL. De manera adecuada, la secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-11, y la secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, y 12-15. Como se describe en todo el documento, los metodos de preparacion de inmunoconjugados se utilizan, adecuadamente, para preparar inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de union a antigeno del mismo y una PE o variante de la misma. En realizaciones adecuadas, el inmunoconjugado que se prepara mediante los diversos metodos descritos en el presente documento es la inmunotoxina de Moxetumomab pasudotox que comprende la subunidad VH-PE38 de la SEQ ID NO: 1 y la subunidad VL de la SEQ ID NO: 2.
En realizaciones adicionales, se proporcionan composiciones que comprenden un inmunoconjugado preparado mediante los diversos metodos descritos en el presente documento. De manera adecuada, los inmunoconjugados preparados mediante dichos metodos tienen menos de entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 1 % de especies desamidadas. Mas adecuadamente, menos de aproximadamente el 25 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 20 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 10 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 5 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 3 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 2 % de las especies desamidadas esta presente, o menos de aproximadamente el 1 % de las especies desamidadas esta presente.
Sera facilmente evidente para un experto en la materia que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los metodos y solicitudes descritas en el presente documento pueden realizarse sin apartarse del alcance de cualquiera de las realizaciones. Los siguientes ejemplos se incluyen aqui con fines ilustrativos unicamente y no pretenden ser limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Renaturalizacion y purificacion de Moxetumomab pasudotox Introduccion
CAT-8015 (Moxetumomab pasudotox) es una inmunotoxina recombinante producida en cuerpos de inclusion de E. coli. La generacion de Moxetumomab pasudotox activo utiliza, adecuadamente, el replegamiento de los precursores inactivos y la purificacion del producto replegado mediante un proceso de 4 columnas. La Figura 1 proporciona una vision general de los procesos de renaturalizacion y purificacion.
El fin del proceso de solubilizacion es extraer y transferir VH y VL, adecuadamente, de cuerpos de inclusion insolubles a la fase liquida y desnaturalizar ambas subunidades antes del replegamiento. La filtracion en profundidad elimina los restos celulares insolubles y los componentes de cuerpos de inclusion de VH y VL solubilizados. El filtrado se concentra posteriormente mediante filtracion de flujo tangencial a un peso fijo de retenido, que se determina mediante el factor de dilucion del retenido y el peso de replegamiento final. La funcion de la etapa de concentracion es asegurar condiciones de inicio de replegamiento consistentes en terminos de concentraciones de VH y VL y ditiotreitol (DTT) a la proporcion de glutation oxidado.
El objetivo del proceso de purificacion de 4 columnas es separar el de Moxetumomab pasudotox activo correctamente plegado de los contaminantes relacionados con el producto, tales como las variantes del producto mal plegadas, los agregados, los fragmentos y las isoformas de carga del producto inactivo biologicamente, asi como los contaminantes relacionados con el proceso, incluido el ADN de la celula hospedadora, las endotoxinas y las proteinas de la celula hospedadora.
Para lograr un proceso comercialmente viable, los rendimientos de replegamiento y purificacion se maximizan al tiempo que se mantiene la calidad, la actividad y la seguridad del producto. Los metodos y procedimientos descritos en el presente documento se han desarrollado para la fabricacion de inmunoconjugados, incluida el farmaco Moxetumomab pasudotox.
A. Materiales y metodos
1. Solubilizacion de cuerpos de inclusion
Los cuerpos de inclusion de VH-PE38 (VH) y VL producidos a partir de celulas adecuadas se descongelan durante 12-24 horas a temperatura ambiente. La concentracion inicial de la solubilizacion de VH y VL CI es de 0,3 g de VH por litro de replegamiento y 0,07 g de VL por litro de replegamiento. Los cuerpos de inclusion se combinan en una relacion molar 1:1 de VH a VL y se ajustan a una concentracion final de VH de 10 g/l mediante la adicion de tampon Tris/EDTA (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,4). Los cuerpos de inclusion se solubilizan mediante la adicion de 6 kg de tampon de solubilizacion de cuerpos de inclusion (etanolamina 50 mM, urea 8 M, arginina 0,5 M, EDTA 2 mM, DTT 10 mM, pH 9,3 ± 0,1) a cada kg de solucion de cuerpos inclusion ajustada a la concentracion. La solubilizacion se lleva a cabo durante 90 ± 15 minutos a temperatura ambiente con agitacion constante.
2. Aclaramiento y ultrafiltracion 1 de cuerpos de inclusion
Los cuerpos de inclusion solubilizados se clarifican mediante filtracion a traves de una serie de filtros de profundidad (vease documento WO 2012/059212). El filtrado clarificado se concentra mediante filtracion de flujo tangencial a 1/10 del peso de replegamiento final utilizando una membrana de ultrafiltracion de corte de peso molecular de 5 kDa (MWCO).
3. Replegamiento y Ultrafiltracion/Diafiltracion 2
Moxetumomab pasudotox se repliega mediante una dilucion de 10 veces (p/p) del filtrado de cuerpos de inclusion clarificado y concentrado en un tampon de replegamiento preenfriado (2-8 0C) (etanolamina 50 mM, arginina 1 M, EDTA 2 mM, glutation oxidado 1,0 mM, pH 9,4). La adicion (l/h) se ajusta de manera que el filtrado de cuerpos de inclusion clarificado y concentrado se agregue al tampon de replegamiento preenfriado en el transcurso de 4 horas (adecuadamente 26 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora). La reaccion de replegamiento se deja proceder durante 48-72 horas a 2-8 0C con mezclado continuo y se calienta a temperatura ambiente antes de la concentracion y la diafiltracion.
La solucion de replegamiento se concentra mediante filtracion de flujo tangencial con una membrana de MWCO de 10 kDa y luego se diafiltra con 10 volumenes de tampon de equilibrio TMAE (fosfato 20 mM, pH 7,4).
4. Cromatografia en columna
a. Cromatografia con Fractogel TMAE (M)
La solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada se filtra de forma esteril a traves de un filtro de 0,2 pm y se carga en una columna Fractogel TMAE (EMD Biosciences o equivalente) equilibrada con 10 volumenes de columna (VC) del tampon de equilibrio TMAE (tampon fosfato 20 mM, pH 7,4). Las etapas de cromatografia se realizan a un caudal lineal de 200 cm/h, a menos que se indique lo contrario. Despues de cargar, se lava primero la columna con 4 VC de tampon de equilibrio TMAE (fosfato 20 mM, pH 7,4), seguido de un lavado de 6 VC con tampon de lavado 1 (fosfato 20 mM, Triton X-100 al 0,1 %) y un lavado de 8 v C con tampon de lavado 2 (fosfato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4). El producto se eluye de la columna con 3 VC de tampon de elucion (fosfato 20 mM, cloruro sodico 200 mM, pH 7,4). Despues de la elucion, la columna se separa con 3 VC de tampon de separacion (etanolamina 50 mM, arginina 0,5 M, EDTA 2 mM, urea 8 M, DTT 10 mM, pH 9,3). El caudal puede reducirse durante el paso de separacion. A continuacion, la columna se lava con 3 VC de agua para inyeccion (WFI) y se regenera con 3 VC de solucion de regeneracion (NaCl 2 M). La columna se sanitiza con al menos 3 VC de solucion de sanitizacion (hidroxido de sodio 1 N) y se almacena con 3 VC de solucion de almacenamiento a corto plazo (hidroxido de sodio 0,1 N) o 3 VC de solucion de almacenamiento a largo plazo (fosfato 20 mM, etanol al 20 % (p/v), pH 7,4).
b. Cromatografia con hidroxiapatita
La etapa de cromatografia con hidroxiapatita se opera como una etapa de cromatografia de flujo continuo. Las etapas de cromatografia se realizan a un caudal lineal de 250 cm/h, a menos que se indique lo contrario. El producto de la etapa de captura se carga en una columna de hidroxiapatita ceramica (Bio-Rad Laboratories o equivalente) equilibrada con 5 VC de tampon de preequilibrio (fosfato 400 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,4) y 5 VC de tampon de equilibrio (fosfato de potasio 20 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 7,4). El producto se recoge en la fraccion a traves del flujo. Despues de cargar, se lava la columna con 3 VC de tampon de equilibrio. La columna se regenera con 3 VC de tampon de pre-equilibrio, se sanitiza con 3 VC de un tampon de sanitizacion (hidroxido de sodio 1 N) y se almacena en 3 VC de un tampon de almacenamiento (fosfato 10 mM, hidroxido de sodio 0,1 N) a temperatura ambiente.
c. Cromatografia con Phenyl 650 M y Ultrafiltracion/Diafiltracion 3
El producto de hidroxiapatita se diluye en una proporcion 1:1 (p/p) con tampon de preparacion de carga (fosfato 20 mM, sulfato de sodio 1,2 M, pH 7,4) y se carga en una columna de Phenyl 650 M (Tosoh o equivalente) equilibrada con 5 VC de tampon de equilibrio (fosfato 20 mM, sulfato de sodio 0,6 M, pH 7,4). Despues de cargar, se lava la columna con 1 VC de tampon de equilibrio. El producto se eluye con 20 VC de un tampon de elucion con gradiente lineal de 0 a 100 % (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4). La columna se separa con 2 VC de agua para inyeccion y se regenera con 2 VC de urea 8 M. La columna se sanitiza con 3 VC de tampon de sanitizacion (hidroxido de sodio 0,5 N) y se almacena con 3 VC de tampon de almacenamiento (fosfato 20 mM, etanol al 20 % (p/p), pH 7,4) a temperatura ambiente.
El conjunto de productos Phenyl 650 M se diafiltro con 10 volumenes de Tris 10 mM, pH 8,0, utilizando filtracion de flujo tangencial con una membrana de MWCO de 10 kDa.
d. Cromatografia con Q Sepharose HP y Ultrafiltracion/Diafiltracion 4
El producto Phenyl 650 M diafiltrado se carga en una columna de Q Sepharose HP (GE Healthcare o equivalente), se equilibra previamente con 5 VC de tampon de pre-equilibrio (Tris 10 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 8,0 y se equilibra con 5 VC de tampon de equilibrio (Tris 10 mM, pH 8,0). La columna se lava con 1 VC de tampon de equilibrio y luego se lava con 3 VC de tampon de equilibrio al 65 % (v/v), tampon de elucion al 35 % (v/v) (Tris 10 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 8,0). El producto se eluye con un gradiente lineal de 10 VC desde tampon de equilibrio al 65 % (v/v), tampon de elucion al 35 % (v/v) hasta tampon de equilibrio al 45 % (v/v), tampon de elucion al 55 % (v/v). La columna se separa con 2 VC de tampon de pre-equilibrio y se sanitiza con 3 VC de tampon de sanitizacion (hidroxido de sodio 1 N). La columna se almacena en 3 VC de una solucion de almacenamiento a corto plazo (hidroxido de sodio 0,1 N) o en 3 VC de una solucion de almacenamiento a largo plazo (fosfato 20 mM, etanol al 20 % (p/v), pH 7,4).
El producto de Q Sepharose HP se concentra mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana de MWCO de 10 kDa a una concentracion de proteina diana de 1,3-2 mg/ml. El producto concentrado de Q Sepharose se diafiltra con al menos seis volumenes de tampon de formulacion (fosfato de sodio 25 mM, sacarosa al 4 % (p/v), glicina al 8 % (p/v), pH, 7,40). El producto de Q Sepharose HP diafiltrado se diluye con tampon de formulacion hasta una concentracion de proteina final de 0,95-1,05 mg/ml.
5. Formacion del farmaco (SF) Moxetumomab pasudotox
El producto de Q Sepharose HP diafiltrado se diluye con tampon de formulacion hasta una concentracion final de proteina de 0,95-1,05 mg/ml y luego se ajusta con al 0,02 % (p/v) de polisorbato-80 con solucion de picos de formulacion (polisorbato-80 al 10 % (p/v)) para hacer el farmaco. el farmaco es filtra en botellas de HDPE esteriles de 0. 2.pm y almacenadas a < -70 0C.
Ejemplo 2: Replegamiento de 250 litros de Moxetumomab pasudotox, Ensayo 1
A. Materiales y metodos
1. Filtros y membranas
Los filtros Millistak+ HC POD C0HC y X0HC (de 0,55 m2 cada uno) fueron de Millipore. Las membranas de filtracion de flujo tangencial Pellicon 2 BioMax-5 (pantalla V, 2 m2) y Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 y 2,5 m2) fueron de Millipore. Los filtros Durapore Millipak 20, SHC Opticap XL150 y SHC Opticap XL300 fueron de Millipore.
2. Medios e Instrumentacion de cromatografia
Fractogel TMAE (M) fue de EMD. La hidroxiapatita, tipo 1,40 pm, fue de BioRad. Phenyl 650 M era de Tosoh. Q Sepharose HP era de GE Healthcare. La purificacion con Fractogel TMAE se realizo en una columna BPG 140x500 (GE Healthcare). La purificacion con hidroxiapatita y Phenyl 650 M se realizo en una columna BPG 100x500. La purificacion con Q Sepharose HP se realizo en una columna Millipore QuikScale 70x550 (Millipore). Todas las purificaciones se realizaron en un sistema de cromatografia AKTA Pilot.
3. Renaturalizacion en la escalera de replegamiento de 250 litros
Se diluyeron 3,39 kg de suspension de cuerpos de inclusion (CI) del VH y 0,33 kg de suspension de CI del VL con 3,77 kg de tampon TE hasta una concentracion final de VH de 10 g/l. Los CI se solubilizaron con 44,9 kg de tampon de solubilizacion de CI durante 90 minutos a temperatura ambiente. La solucion de CI solubilizada se aclaro con un filtro de profundidad C0HC (0,55 m2) conectado en serie con un filtro de profundidad X0HC (0,55 m2). La solucion de CI solubilizada y aclarada se concentro hasta un peso de retenido de ultrafiltrado final (UF) 1 de 25,5 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-5 (pantalla V, 2 m2). Veinticinco kg de retenido de UF 1 se ajustaron a la temperatura a 2-8 0C y se agregaron en el transcurso de 4 horas a 225 kg de tampon de replegamiento previamente enfriado (pH 9,4) con mezcla constante (adecuadamente 26 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora). El replegamiento se termino despues de 66 horas mediante el aumento de la temperatura de la solucion de replegamiento a temperatura ambiente. La solucion de replegamiento se concentro a 24,9 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 2,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 10 volumenes de tampon de equilibrio TMAE.
4. Purificacion en la escalera de replegamiento de 200 litros
La purificacion de Moxetumomab pasudotox se realizo como se describe anteriormente. 9,9 l y 9,3 l de solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada se cargaron en una columna Fractogel TMAE (M) empaquetada (altura del lecho: 18cm, volumen: 2,77 l). Se realizaron dos ciclos de purificacion (con tampon de separacion utilizado entre eluciones consecutivas). Las fracciones de eluato de Fractogel TMAE (M) se combinaron en un unico conjunto de productos de TMAE (7,1 kg) y se cargaron en una columna de hidroxiapatita (altura del lecho: 21,8 cm; volumen: 1,71 l). El flujo de hidroxiapatita a traves del conjunto se diluyo 1:1 con 7,91 kg de tampon de preparacion de carga y se cargo en una columna Phenyl 650M (altura del lecho: 17,5 cm; volumen: 1,37 l). El conjunto de productos Phenyl 650M (11,6 kg) se concentro hasta 8,1 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 10 volumenes de tampon de equilibrio Q Sepharose HP. El producto Phenyl 650 M concentrado y diafiltrado se cargo en una columna de Q Sepharose HP (altura del lecho: 18,2 cm; volumen 0,70 l). El conjunto de productos Q Sepharose HP (2,8 kg) se concentro hasta 2 g/l mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 7 volumenes de tampon de formulacion. El producto de Q Sepharose HP concentrado y diafiltrado se diluyo con tampon de formulacion hasta una concentracion final de proteina de 1,02 g/l (volumen: 4,7 kg) y posteriormente se ajusto a un 0,02 % (p/v) de polisorbato-80 con solucion de picos de formulacion. El Moxetumomab pasudotox formulado se filtro de forma esteril con filtros Durapore Millipak 20 en botellas PETG y se almaceno a < -70 0C.
B. Resultados y discusion
1. Renaturalizacion
La solubilizacion, el aclaramiento y los rendimientos en UF 1 se evaluaron mediante RP-HPLC y se muestran en las Tablas I y II. La eficacia del aclaramiento se evaluo mediante mediciones de turbidez antes y despues de la filtracion en profundidad (Tabla III).
T l I R r i n V r r i n ni r -r l l mi n
Figure imgf000022_0002
T l II R r i n V r r i n ni r -r l l mi n
Figure imgf000022_0001
Tabla III A rofundidad
Figure imgf000022_0003
Los datos en las Tablas IV y II demuestran la eficacia de la composicion del tampon de solubilizacion de CI en la extraccion y transferencia de VH y VL desde cuerpos de inclusion a la fase liquida. Ambas subunidades se recuperaron cuantitativamente en la solucion de CI solubilizada. La serie de filtros de profundidad COHC-X0HC logro una reduccion de 8 veces en la turbidez de la solucion de CI solubilizada y produjo una solucion opticamente transparente adecuada para su posterior procesamiento mediante filtracion de flujo tangencial. Los rendimientos de la etapa de aclaramiento fueron comparables para VH y VL (89,4 y 78,8 % respectivamente) a pesar de la diferencia de 4 veces en el peso molecular de las dos subunidades. El rendimiento optimo de las operaciones de las unidades de replegamiento previo se demuestra por el hecho de que el rendimiento final de VH de UF 1 cumplio con la cantidad requerida para lograr una concentracion de replegamiento diana de 0,3 g de VH por l de replegamiento.
El replegamiento de Moxetumomab pasudotox se inicio mediante una dilucion de 10 veces de UF 1 retenido en tampon de replegamiento. El retenido de UF 1 se anadio en el transcurso de 4 horas al tampon de replegamiento para maximizar los rendimientos de replegamiento. El tftulo de replegamiento de Moxetumomab pasudotox se determino mediante LC-MS, la concentracion de Moxetumomab pasudotox en el conjunto de UFDF 2 mediante RP-HPLC. El rendimiento de replegamiento se calculo basandose en la concentracion de VH inicial en la reaccion de replegamiento, en funcion de la relacion de dilucion y la concentracion de VH en RP-HPLC en el grupo de retenido de UF 1. El tftulo de replegamiento, la concentracion de Moxetumomab pasudotox en UFDF2 y los rendimientos por etapas se muestran en la Tabla IV.
T l IV R l mi n R n imi n r n FDF
Figure imgf000023_0001
El replegamiento de protefnas heterodimericas representa un desaffo importante debido al hecho de que las subunidades separadas pueden avanzar a lo largo de multiples vfas de plegamiento improductivas y formar agregados insolubles o variantes de productos inactivos mal plegados. Por lo tanto, el replegamiento de protefnas heterodimericas se caracteriza a menudo por tftulos de replegamiento y rendimientos por etapas bajos. Las condiciones de replegamiento descritas en el presente documento se han optimizado cuidadosamente para lograr una utilizacion eficaz de los materiales de partida de los cuerpos de inclusion y maximizar los tftulos de replegamiento (Tabla IV). Como resultado, los tftulos de replegamiento y los rendimientos por etapas fueron aproximadamente 2-3 veces mas altos en comparacion con los procesos de replegamiento anteriores.
La funcion de la operacion de las unidades de filtracion de flujo tangencial posterior al replegamiento es terminar el replegamiento mediante la eliminacion de los componentes del tampon de replegamiento y la preparacion del material replegado para la purificacion de la etapa de captura. Un rendimiento por etapas de casi el 87 % de Moxetumomab pasudotox replegado estuvo dentro del intervalo esperado para este tipo de operacion unitaria y material de partida.
Los datos en las Tablas III-IV demuestran el rendimiento de los metodos desvelados y la capacidad de este proceso para generar Moxetumomab pasudotox biologicamente activo a partir de precursores inactivos adecuados para la fabricacion del farmaco Mabetumomab pasoxotoum.
2. Purificacion
Moxetumomab pasudotox se purifico a partir de solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada a la escala de replegamiento de 200 l mediante cromatograma con Fractogel TMAE (M), hidroxiapatita, Phenyl 650 M y Q Sepharose HP. Los cromatogramas para cada etapa de purificacion se muestran en las Figuras 2-5.
El cromatograma con Fractogel TMAE (M) muestra que no solo el Moxetumomab pasudotox replegado, sino tambien la mayorfa de las impurezas relacionadas con el producto y el proceso, se unen a la columna con poca o ninguna protefna detectada en el flujo de la columna a traves de la fraccion. Algunas impurezas unidas de manera hidrofoba se eliminaron de la columna con el detergente no ionico Triton X-100 (lavado 1), mientras que las impurezas unidas de manera ionica debiles se eliminaron con un lavado de sal de baja concentracion (lavado 2). La elucion de Moxetumomab pasudotox plegado se logro con cloruro de sodio 200 mM tamponado. La mayor parte de las impurezas unidas se separaron de la columna Fractogel TMAE con tampon de solubilizacion de CI (separacion 1). La eficacia de este tampon para la limpieza de la columna se demuestra mediante la observacion de que muy poca protefna se eluyo de la columna durante una segunda separacion con cloruro de sodio 2 M (separacion 2).
El cromatograma en la figura 3 muestra que Moxetumomab pasudotox no se unio a hidroxiapatita en presencia de fosfato 20 mM y se recupero en el flujo a traves de la fraccion. Los contaminantes relacionados con el proceso, tales como las protefnas, el ADN y la endotoxina de la celula hospedadora se unieron estrechamente a la hidroxiapatita en estas condiciones y posteriormente se eliminaron de la resina con un tampon de separacion fosfato 400 mM, cloruro de sodio 200 mM.
El cromatograma muestra que Moxetumomab pasudotox y las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se unen a la resina Phenyl 650 M con poca o ninguna protefna detectada en el flujo de la columna a traves de la fraccion. Moxetumomab pasudotox se eluyo con un gradiente de sal decreciente y se recupero de la columna en el intervalo de conductividad 60-30 mS/cm. Las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se separaron de la columna con un lavado con agua (Separacion) y solucion de urea 8 M (Regeneracion). La eficacia del protocolo de limpieza posterior a la elucion se demuestra mediante la observacion de que no se observa un aumento de la absorbancia a 280 nm durante la etapa de sanitizacion con hidroxido de sodio 0,5 N.
El cromatograma con Q Sepharose HP en la Figura 5 muestra que bajo las condiciones de union actuales Moxetumomab pasudotox y las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se unen a la columna. No se detecto protefna en el flujo de la columna a traves de la fraccion (Carga, Persecucion) o fraccion de lavado (Lavado). El Moxetumomab pasudotox se recupero de la columna con un gradiente salino tamponado creciente desde cloruro de sodio 175 mM a cloruro de sodio 275 mM a pH 8,0. Moxetumomab pasudotox se eluyo fuera de la columna en un intervalo de conductividad muy estrecho entre 21 y 24 mS/cm. Las impurezas restantes se eluyeron de la columna con una separacion con cloruro sodico 1 M y una solucion de hidroxido sodico 1 N.
Se determinaron los rendimientos de la protefna total mediante medidas de absorbancia a 280 nm. En la tabla V se muestran los rendimientos por etapas de proteinas totales para el lote de purificacion 250L3.
T l V T l r n imi n r r fn l
Figure imgf000024_0002
La solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada (producto UFDF2, muestra de carga de TMAE) contiene Moxetumomab pasudotox replegado, pero tambien otras proteinas, incluidas las variantes de productos agregados y mal plegados y las proteinas de la celula hospedadora. Por lo tanto, las mediciones de la concentracion de proteinas basadas en la absorbancia a 280 nm no son especificas para Moxetumomab pasudotox correctamente plegado y, como consecuencia, no reflejan el rendimiento especifico de Moxetumomab pasudotox en la etapa de captura con Fractogel TMAE (M). Por el contrario, los rendimientos por etapas de la protefna total y de Moxetumomab pasudotox para la etapa de purificacion con hidroxiapatita estan mucho mas alineados entre si debido al aumento de la pureza del conjunto de productos Fractogel TMAE (M) (carga de hidroxiapatita) en el que la mayoria de las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se han eliminado. Tambien se obtuvieron altas recuperaciones para las etapas posteriores de purificacion e intercambio de tampon. El rendimiento de purificacion final fue de 4,6 g de farmaco a la escala de replegamiento y purificacion de 200 l.
La Tabla VI muestra la depuracion de contaminantes relacionados con el producto, incluidos los agregados y fragmentos de Moxetumomab pasudotox desamidado.
T l VI D r i n n min n r l i n n l r n l r rifi i n
Figure imgf000024_0001
La actividad biologica de Moxetumomab pasudotox depende de la amplitud de la desamidacion de la asparagina 358 en la subunidad VH. La desamidacion de Moxetumomab pasudotox se analizo mediante cromatografia de intercambio ionico de alto rendimiento (IEC, de sus siglas en ingles) y se correlaciona con el % medido del area antes del pico (vease Figura 6).
Los datos en la Tabla VI demuestran que el area antes del pico en la IEC de Moxetumomab pasudotox en el producto TMAE fue menor al 5 % y que la cromatografia con Q Sepharose HP redujo el area antes del pico de la IEC a menos del 2 %, proporcionando un producto biologicamente activo.
La cromatografia con Fractogel TMAE (M) produjo un aumento significativo en la pureza del monomero y elimino la mayoria de las proteinas y fragmentos de bajo peso molecular de la corriente del proceso, segun lo medido mediante cromatografia de exclusion de tamano de alto rendimiento (HPSEQ, de sus siglas en ingles). La cromatografia con Phenyl 650 M proporciono una depuracion adicional de fragmentos y agregados y genero un conjunto de productos de Moxetumomab pasudotox que tenia una pureza del 99 % del monomero mediante analisis HPSEQ.
La Tabla VII muestra la depuracion de contaminantes relacionados con el proceso, incluidas las proteinas, el ADN y las endotoxinas de la celula hospedadora.
Tabla VII Depuracion de contaminantes relacionados con el proceso en el proceso de purificacion
Figure imgf000025_0001
La Tabla VII ilustra la eficacia de la etapa de captura de Fractogel TMAE (M) y la cromatografia con hidroxiapatita para eliminar los contaminantes relacionados con el proceso de la corriente del proceso Moxetumomab pasudotox. La cromatografia con Fractogel TMAE (M) redujo las concentraciones de proteina de la celula hospedadora en 5 veces y las concentraciones de endotoxinas en 600 veces. La cromatografia con hidroxiapatita redujo ademas las concentraciones de proteinas de la celula hospedadora aproximadamente 8 veces, las concentraciones de endotoxinas en mas de 36 veces y las concentraciones de ADN residual en mas de 1000 veces por debajo del limite de cuantificacion. La cromatografia con Phenyl 650 M logro una reduccion adicional de 6,5 veces en la concentracion de proteinas de la celula hospedadora mientras que la cromatografia con Q Sepharose HP proporciono una reduccion adicional de 20 veces en la concentracion de endotoxinas.
Los datos en las Tablas VI y VII demuestran el rendimiento de los metodos de purificacion descritos en el presente documento y la capacidad de estos procesos para generar un farmaco de alta calidad adecuada para ensayos clinicos.
Ejemplo 3: Replegamiento de 250 litros de Moxetumomab pasudotox, Ensayo 2
A. Materiales y metodos
1. Filtros y membranas
Los filtros Millistak+ HC POD C0HC y X0HC (de 0,55 m2 cada uno) fueron de Millipore. Las membranas de filtracion de flujo tangencial Pellicon 2 BioMax-5 (pantalla V, 2 m2) y Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 y 2,5 m2) fueron de Millipore. Los filtros Durapore Millipak 20, SHC Opticap XL150 y SHC Opticap XL300 fueron de Millipore.
2. Medios e Instrumentacion de cromatografia
Fractogel TMAE (M) fue de EMD. La hidroxiapatita, tipo 1,40 pm, fue de BioRad. Phenyl 650 M era de Tosoh. Q Sepharose HP era de GE Healthcare. La purificacion con Fractogel TMAE se realizo en una columna BPG 140x500 (GE Healthcare). Las purificaciones con hidroxiapatita, Phenyl 650 M y Q Sepharose HP se realizaron en una columna BPG 100x500. Todas las purificaciones se realizaron en un sistema de cromatografia AKTA Pilot.
3. Renaturalizacion en la escalera de replegamiento de 250 litros
Se diluyeron 3,40 kg de suspension de CI VH y 0,33 kg de suspension de CI VL con 3,77 kg de tampon TE hasta una concentracion final de VH de 10 g/l. Los CI se solubilizaron con 45,0 kg de tampon de solubilizacion de CI durante 90 minutos a temperatura ambiente. La solucion de CI solubilizada se aclaro con un filtro de profundidad C0HC (0,55 m2) conectado en serie con un filtro de profundidad X0HC (0,55 m2). La solucion de CI solubilizada y aclarada se concentro hasta un peso de retenido de UF 1 de 25,5 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-5 V, 2 m2). Veinticinco kg de retenido de UF 1 se ajustaron a la temperatura a 2-8 0C y se agregaron en el transcurso de 4 horas a 225 kg de tampon de replegamiento previamente enfriado (pH 9,4) con mezcla constante (adecuadamente 25 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora). El replegamiento se termino despues de 66 horas mediante el aumento de la temperatura de la solucion de replegamiento a temperatura ambiente. La solucion de replegamiento se concentro a 22,6 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 2,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 10 volumenes de tampon de equilibrio TMAE.
4. Purificacion en la escalera de replegamiento de 200 litros
La purificacion de Moxetumomab pasudotox se realizo como se describe anteriormente. Nueve y 8,7 l de solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada se cargaron en una columna Fractogel TMAE (M) empaquetada (altura del lecho: 18cm, volumen: 2,77 l). Se realizaron dos ciclos de purificacion, separando con el tampon de separacion desvelado entre eluciones consecutivas. Las fracciones de eluato de Fractogel TMAE (M) se combinaron en un unico conjunto de productos de TMAE (6,2 kg) y se cargaron en una columna de hidroxiapatita (altura del lecho: 21,8 cm; volumen: 1,71 l). El flujo de hidroxiapatita a traves del conjunto se diluyo 1:1 con 6,7 kg de tampon de preparacion de carga y se cargo en una columna Phenyl 650M (altura del lecho: 17,5 cm; volumen: 1,37 l). El conjunto de productos Phenyl 650M (10,1 kg) se concentro hasta 8,0 kg mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 10 volumenes de tampon de equilibrio Q Sepharose HP. El producto Phenyl 650 M concentrado y diafiltrado se cargo en una columna de Q Sepharose HP (altura del lecho: 18,2cm; volumen 1,4 l). El conjunto de productos Q Sepharose HP (5,1 kg) se concentro hasta 2 g/l mediante filtracion de flujo tangencial utilizando una membrana Pellicon 2 BioMax-10 (pantalla A, 0,5 m2) y posteriormente se diafiltro con 7 volumenes de tampon de formulacion. El producto de Q Sepharose HP concentrado y diafiltrado se diluyo con tampon de formulacion hasta una concentracion final de proteina de 1,05 g/l (volumen: 5,4 kg) y posteriormente se ajusto a un 0,02 % (p/v) de polisorbato-80 con solucion de picos de formulacion. El Moxetumomab pasudotox formulado se filtro de forma esteril con filtros Durapore Millipak 20 en botellas PETG y se almaceno a < -70 0C.
B. Resultados y discusion
1. Renaturalizacion
La solubilizacion, el aclaramiento y los rendimientos en etapas de UF 1 se evaluaron mediante RP-HPLC y se muestran en las Tablas VIII y IX. La eficacia del aclaramiento se evaluo mediante mediciones de turbidez antes y despues de la filtracion (Tabla 3.2.2.1-3).
T l VIII R r i n V r r i n ni r -r l l mi n
Figure imgf000026_0003
T l IX R r i n V r r i n ni r -r l l mi n
Figure imgf000026_0002
Tabla X ofundidad
Figure imgf000026_0004
Los datos en las tablas VIII y IX muestran que VH y VL se recuperaron cuantitativamente de la suspension inicial de CI en el conjunto de retenido UF 1 segun se midio mediante analisis de RP-HPLC. La filtracion en profundidad redujo la turbidez de la solucion de CI solubilizada aproximadamente 6 veces y produjo una solucion transparente optica que se concentro adicionalmente mediante filtracion de flujo tangencial antes del replegamiento.
El replegamiento de Moxetumomab pasudotox se inicio mediante una dilucion de 10 veces de retenido de UF 1 en un tampon de replegamiento previamente enfriado en el transcurso de 4 horas. El retenido de UF 1 se mantuvo a 2-8 0C durante la adicion al tampon de replegamiento para minimizar la generacion de variantes de productos desamidados. El titulo de replegamiento de Moxetumomab pasudotox se determino mediante LC-MS. La concentracion de Moxetumomab pasudotox en el conjunto de UFDF 2 se determino mediante RP-HPLC. El rendimiento por etapas de replegamiento se calculo basandose en la concentracion de VH inicial en la reaccion de replegamiento, determinada mediante la concentracion de UF 1 VH y el factor de dilucion. Los rendimientos por etapas de replegamiento y UFDF2 se muestran en la Tabla XI.
T l XI R n imi n n FDF r l mi n
Figure imgf000026_0001
El titulo de replegamiento fue aproximadamente de 2 a 3 veces mas alto en comparacion con los procesos de replegamiento anteriores de Moxetumomab pasudotox. El rendimiento por etapas del 10 % fue comparable a los procesos de replegamiento anteriores de Moxetumomab pasudotox.
La funcion de la operacion de las unidades de filtracion de flujo tangencial posterior al replegamiento es terminar el replegamiento mediante la eliminacion de los componentes del tampon de replegamiento y la preparacion del material replegado para la purificacion de la etapa de captura. Los datos de rendimiento por etapas en la tabla XI muestran que el Moxetumomab pasudotox replegado se recupero cuantitativamente de la operacion de la unidad UFDF2.
Los datos de las tablas VIII a IX demuestran el rendimiento de los metodos desvelados y la capacidad de estos procesos para generar inmunoconjugados biologicamente activos (adecuadamente, Moxetumomab pasudotox) a partir de los precursores inactivos adecuados para la fabricacion de farmacos.
2. Purificacion
Moxetumomab pasudotox se purifico a partir de solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada a la escala de replegamiento de 200 l mediante cromatografia con Fractogel TMAE (M), hidroxiapatita, Phenyl 650 M y Q Sepharose HP. Los cromatogramas para cada etapa de purificacion se muestran en las Figuras 7-10.
El cromatograma con Fractogel TMAE (M) muestra que Moxetumomab pasudotox replegado y la mayoria de las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se unen a la columna. La progresion de la proteina se observo al final de la etapa de carga; a diferencia de la purificacion en el Ejemplo 2, en el que no se detecto la progresion de proteinas al final de la etapa de carga de la columna.
El cromatograma en la figura 8 muestra que Moxetumomab pasudotox no se unio a hidroxiapatita en presencia de fosfato 20 mM y se recupero en el flujo a traves de la fraccion.
El cromatograma en la Figura 9 muestra que Moxetumomab pasudotox y las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se unen a la resina Phenyl 650 M con poca o ninguna proteina detectada en el flujo de la columna a traves de la fraccion. Moxetumomab pasudotox se eluyo con un gradiente de sal decreciente y se recupero de la columna en el intervalo de conductividad 60-30 mS/cm.
El cromatograma con Q Sepharose HP en la Figura 10 muestra que Moxetumomab pasudotox y las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se unen a la columna. No se detecto proteina en el flujo de la columna a traves de la fraccion (Carga, Persecucion) o fraccion de lavado (Lavado). El Moxetumomab pasudotox se recupero de la columna con un gradiente salino tamponado creciente desde cloruro de sodio 175 mM a cloruro de sodio 275 mM a pH 8,0. El Moxetumomab pasudotox activo se eluyo fuera de la columna en un intervalo de conductividad muy estrecho entre 21 y 24 mS/cm. Las impurezas restantes se eluyeron de la columna con una separacion con cloruro sodico 1 M y una solucion de hidroxido sodico 1 N.
Se determinaron los rendimientos de la proteina total mediante medidas de absorbancia a 280 nm. Los rendimientos por etapas de proteinas totales se muestran en la Tabla XII.
T l XII T l r n imi n r r in M x m m x
Figure imgf000027_0001
Al igual que en el caso anterior, la solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada (producto UFDF2, muestra de carga de TMAE) contiene Moxetumomab pasudotox replegado, pero tambien otras proteinas, incluidas las variantes de productos agregados y mal plegados y las proteinas de la celula hospedadora. Por lo tanto, las mediciones de la concentracion de proteinas basadas en la absorbancia a 280 nm no son especificas para Moxetumomab pasudotox correctamente plegado y, como consecuencia, no reflejan el rendimiento especifico de Moxetumomab pasudotox de la etapa de captura con Fractogel TMAE (M). Por el contrario, los rendimientos por etapas de la proteina total y de Moxetumomab pasudotox para la etapa de purificacion con hidroxiapatita estan mucho mas alineados entre si debido al aumento de la pureza del conjunto de productos Fractogel TMAE (M) (carga de hidroxiapatita) en el que la mayoria de las impurezas relacionadas con el producto y el proceso se han eliminado. Los rendimientos por etapas de Phenyl 650 M y UFDF3 para el Ejemplo 3 fueron comparables a los rendimientos por etapas logrados en el Ejemplo 2 para las mismas operaciones de unidades. Aqui, el volumen de la columna Q Sepharose HP se incremento de 0,7 l a 1,4 l para disminuir la carga maxima de columna para esta etapa de purificacion. Como resultado, la carga maxima de columna disminuyo de 10,4 g/l de resina en el Ejemplo 2 a 4,5 g/l de resina en el Ejemplo 3. El rendimiento por etapas de Q Sepharose HP mejoro en casi un 20 % desde el 69 % en el Ejemplo 2 al 88 % en el Ejemplo 3. Los rendimientos por etapas de Q Sepharose HP fueron 2-3 veces mas altos en comparacion con los rendimientos anteriores del proceso de Moxetumomab pasudotox con Q Sepharose HP. El rendimiento de purificacion final fue de 5,6 g de farmaco a la escala de replegamiento y purificacion de 200 l.
La Tabla XIII muestra la depuracion de los contaminantes relacionados con el producto, incluidos los agregados y fragmentos de Moxetumomab pasudotox desamidado.
Figure imgf000028_0001
La correlacion de % del area de pre-pico en la IEC, desamidacion y actividad biologica de Moxetumomab pasudotox ha sido discutida anteriormente. Los datos en la tabla XIII muestran que el area antes del pico en IEC de Moxetumomab pasudotox en el conjunto de productos de hidroxiapatita del Ejemplo 3 fue 2 veces mayor que en el Ejemplo 2. La cromatografia con Phenyl 650M y Q Sepharose HP redujo el area de pre-pico en IEC en aproximadamente un 5 % a menos de un 3,5 %, proporcionando un producto biologicamente activo.
La Tabla XIII demuestra que la cromatografia con Fractogel TMAE (M) aumenta significativamente la pureza del monomero y elimina la mayoria de las proteinas y fragmentos de bajo peso molecular de la corriente del proceso, medida mediante cromatografia de exclusion de tamano de alto rendimiento (HPSEQ). La cromatografia con Phenyl 650 M proporciono una depuracion adicional de fragmentos y agregados y genero un conjunto de productos de Moxetumomab pasudotox que tenia una pureza del 99,5 % del monomero mediante analisis HPSEQ.
La Tabla XIV muestra la depuracion de contaminantes relacionados con el proceso, incluidas las proteinas, el ADN y las endotoxinas de la celula hospedadora.
Tabla XIV De r i n n min n r l i n n l r n l r de purificacion
Figure imgf000028_0002
Los datos en la Tabla XIV demuestran la eficacia de la etapa de captura con Fractogel TMAE (M) y la cromatografia con hidroxiapatita en la eliminacion de contaminantes relacionados con el proceso de la corriente del proceso Moxetumomab pasudotox. La cromatografia con Fractogel TMAE (M) redujo las concentraciones de proteina de la celula hospedadora en aproximadamente 20 veces y las concentraciones de endotoxinas en mas de 800 veces. La cromatografia con Fractogel TMAE (M) logro la depuracion del ADN de la celula hospedadora por debajo del limite de cuantificacion. La cromatografia con hidroxiapatita redujo ademas la concentracion de proteina de la celula hospedadora aproximadamente 2 veces y las concentraciones de endotoxinas en mas de 10 veces. La cromatografia con Phenyl 650 M logro una reduccion de casi 9 veces en la concentracion de proteinas de la celula hospedadora mientras que la cromatografia con Q Sepharose HP proporciono una reduccion adicional de 30 veces en la concentracion de endotoxinas.
3. Resumen
Se logro un rendimiento de farmaco comparable para las dos purificaciones descritas en los Ejemplos 2 y 3. Los datos demuestran la reproducibilidad de los metodos de renaturalizacion y purificacion descritos en el presente documento y la capacidad de estos metodos para generar un farmaco de alta calidad adecuada para ensayos clinicos.
Los metodos descritos en el presente documento tambien contribuyen a una mejora significativa en los rendimientos generales del proceso en comparacion con los metodos de renaturalizacion y purificacion de Moxetumomab pasudotox previos. Estas mejoras en el proceso desempenaran un papel importante en la fabricacion de Moxetumomab pasudotox en un proceso economicamente viable.
Ejemplo 4: Metodo de limpieza con Fractogel TMAE (M)
La operacion de un proceso de purificacion economicamente viable dicta que las resinas de cromatografia se utilizan para multiples ciclos de produccion. Esto requiere metodos eficaces de limpieza de la columna y la demostracion de que el producto, asi como los contaminantes relacionados con el producto y el proceso, se eliminan de la columna por debajo de los niveles aceptables antes del inicio del proximo ciclo de purificacion.
Los titulos de replegamiento bajos, pero las altas concentraciones de impurezas relacionadas con el producto y el proceso, incluidos los agregados, las proteinas mal plegadas, el ADN bacteriano, las proteinas y las endotoxinas de la celula hospedadora, representan un desafio importante para las columnas de captura post-repliegue en los procesos de fabricacion de farmacos basados en cuerpos de inclusion de E. coli.
Para el proceso de fabricacion de Moxetumomab pasudotox, se encontro que la mayoria de las impurezas se unian fuertemente a la resina Fractogel TMAE (M) y no se eliminaron de manera eficaz de la columna con dos soluciones de lavado que contenian cloruro sodico 2 M o urea 8 M no tamponada. Se encontro que un tampon que contenia urea 8 M, arginina 0,5 M, etanolamina 50 mM, EDTA 2 mM y DTT 10 mM a pH 9,3 era eficaz para eliminar los contaminantes relacionados con el proceso y el producto de la resina Fractogel TMAE (M).
A. Materiales y metodos
1. Medios e Instrumentacion de cromatografia
Fractogel TMAE (M) fue de EMD. Las purificaciones se realizaron en una columna Tricorn 5/200. Todas las purificaciones se realizaron en un sistema de cromatografia AKTA Explorer.
2. Purificacion y analisis de transferencia con Fractogel TMAE (M)
Las purificaciones con Fractogel TMAE (M) se realizaron como se describe anteriormente. Las columnas de Fractogel TMAE (M) se cargaron con solucion de replegamiento concentrada y diafiltrada en 20 g de proteina/l de resina. Para el analisis de la transferencia, las columnas Fractogel TMAE se ejecutaron como se describe anteriormente pero sin carga de proteinas y, donde se indique, sin tampon de lavado T riton X-100.
3. Resultados y discusion
La Figura 11 muestra un cromatograma de la etapa de captura con Fractogel TMAE utilizando NaCl 2 M (Separacion 1), urea 8 M (Separacion 2) e hidroxido de sodio 1 N como soluciones de limpieza y sanitizacion de columnas. La secuencia de purificacion con Fractogel TMAE (M) se describe en la Tabla XV.
T l XV n i rifi i n n Fr l TMAE M r l Fi r 11
Figure imgf000029_0001
Se observaron varios picos durante las etapas de limpieza de la columna. Posteriormente, se realizo una ejecucion en blanco sin carga de proteina ni tampon de lavado 1 en la misma columna. La Tabla XVI describe la secuencia de purificacion con Fractogel TMAE para la ejecucion en blanco.
T l XVI n i rifi i n n Fr l TMAE M r l Fi r 12
Figure imgf000030_0003
La Figura 12 muestra que se observaron picos de transferencia significativos cuando la columna limpiada previamente se separo nuevamente con NaCl 2 M (Separacion 1) y urea 8 M (Separacion 2). Se observo el mismo perfil durante al menos dos ensayos adicionales ejecutados de acuerdo con la tabla XVI, lo que demuestra que el metodo de limpieza y sanitizacion descrito anteriormente no elimino de manera eficaz los contaminantes relacionados con el producto y el proceso de la resina.
Basandose en la observacion de que un tampon que contenia urea 8 M, arginina 0,5 M y DTT 10 mM era capaz de disolver cuerpos de inclusion de E. coli, el tampon de solubilizacion de CI de Moxetumomab pasudotox (etanolamina 50 mM, urea 8 M, arginina 0,5 M, EDTA 2 mM, DTT 10 mM, pH 9,5) se probo como solucion de limpieza de la columna en la etapa de captura. La secuencia de purificacion se describe en la tabla XVII.
T l XVII n i rifi i n n Fr l TMAE M r l Fi r ^ 1
Figure imgf000030_0001
La Figura 13 muestra un cromatograma de captura con Fractogel TMAE M con una separacion de 5 VC que utiliza el tampon de solubilizacion de CI de Moxetumomab pasudotox. Se observo un pico muy fuerte cuando la columna se limpio con tampon de solubilizacion de CI (Separacion 1); con poca o ninguna proteina adicional que se eluya de la columna en el subsiguiente lavado con alto contenido de sal (Separacion 2) o paso de sanitizacion.
La Figura 14 muestra el cromatograma con Fractogel TMAE (M) posterior sin carga de proteina. La secuencia de purificacion se describe en la tabla XVIII.
T l XVIII n i rifi i n n Fr l TMAE M r l Fi r 14 1
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000031_0001
No se observo transferencia de contaminantes relacionados con el producto y el proceso. Los picos de absorbancia observados durante las etapas de separacion y sanitizacion se debieron a la absorbancia de fondo de los componentes del tampon de solubilizacion de CI (vease Figura 15 para el cromatograma de tampon en blanco con resina nueva). El cromatograma transferido con Fractogel TMAE (M) despues de 9 ciclos de purificacion observado en la Figura 16 era identico al cromatograma de tampon en blanco con nueva resina observada en la Figura 15, lo que demuestra que el tampon de solubilizacion de CI limpia y regenera eficazmente la resina a su estado original.
Ejemplo 4: Captura con Capto Blue
La cromatografia con colorante azul de Cibacron se uso para capturar Moxetumomab pasudotox del conjunto de UF/DF 2 post-replegamiento en condiciones ligeramente acidas como alternativa a la captura de intercambio anionico. La interaccion de Moxetumomab pasudotox con el ligando de colorante azul de Cibacron es de naturaleza multimodal y bastante fuerte. La union selectiva de Moxetumomab pasudotox en resinas azul de Cibacron se puede modular con componentes ionicos, asi como con componentes hidrofobos como el propilenglicol. Captura de Moxetumomab pasudotox mediante colorante azul de Cibacron como se describe en el presente documento.
A. Materiales y metodos
1. Cromatografia e instrumentacion
Capto Blue Sepharose era de GE Healthcare. Las purificaciones con Capto Blue Sepharose se realizaron en columnas XK16/20 (GE Healthcare). Todas las purificaciones se realizaron en el sistema de cromatografia AKTA Explorer. 2. Purificacion
Las purificaciones con Capto Blue Sepharose se realizaron como se describe anteriormente. La solucion de replegamiento concentrada, diafiltrada y ajustada se cargo en una columna Capto Blue (volumen de columna: 39 ml) hasta una carga maxima de 10 g de Moxetumomab pasudotox/l de resina.
3. Resultados y discusion
Durante la carga, se observo una serial de absorbancia de flujo que puede atribuirse a impurezas no unidas, mientras que casi todo el producto de Moxetumomab pasudotox fue capturado mediante la resina Capto Blue Sepharose. La Figura 17 muestra un cromatograma de captura con Capto Blue representativo. La union selectiva de Moxetumomab pasudotox se puede ver en el gel SDS-PAGE en la Figura 18, ya que se detecto muy poco Moxetumomab pasudotox en el flujo de carga a traves de las fracciones. Capto Blue Sepharose mostro una excelente eliminacion de especies de alto peso molecular. Como se ve en la Figura 18, el conjunto UF/DF 2 contenia altos niveles de especies de alto peso molecular que tambien se observaron en las fracciones de flujo continuo, asi como en el pico de la banda de urea 8 M, pero que no se detectaron en el conjunto de elucion. Como resultado, el conjunto de elucion estaba bastante limpio en comparacion con el conjunto UF/DF 2.
La Figura 19 muestra un segundo cromatograma representativo de etapa de captura con Capto Blue Sepharose. La Tabla XIX resume el rendimiento de la purificacion con Capto Blue Sepharose que se muestra en la Figura 19.
Tabla XIX Resumen del rendimiento de la columna Ca to Blue
Figure imgf000031_0002
El avance de las impurezas no unidas se observo durante la carga, seguido de un pico de elucion durante el gradiente de elucion del cloruro de sodio. La Tabla XIX muestra que el conjunto de UF/DF 2 contenfa 583,7 miligramos de protefna total (medida mediante absorbancia a 280 nm) pero solo 58,4 miligramos de producto de Moxetumomab pasudotox (medido mediante RP-HPLC). El conjunto de Capto Blue contenfa 58,4 miligramos de protefna total, de los cuales 53,5 miligramos fueron Moxetumomab pasudotox, lo que dio como resultado un rendimiento total de protefnas de solo el 9,4 %, pero un rendimiento de Moxetumomab pasudotox del 91,7 %. Se logro una reduccion de 4,6 veces en HCP mediante la etapa de cromatograffa con Capto Blue. Tambien se anadio propilenglicol a los tampones de elucion en combinacion con cloruro de sodio para modular la union de Moxetumomab pasudotox. La elucion con cloruro de sodio solo dio como resultado un pico de elucion amplio; sin embargo, la presencia de propilenglicol en la elucion del gradiente de cloruro de sodio agudizo el pico de elucion y aumento el rendimiento del producto.
Las Figuras 17-19 demuestran la reproducibilidad de los metodos de purificacion con Capto Blue Sepharose descritos en el presente documento y su capacidad para capturar selectivamente inmunoconjugados replegados, incluyendo Moxetumomab pasudotox, de una solucion compleja que consiste en un producto intacto, asf como en variantes de productos agregadas y mal plegadas e impurezas relacionadas con el proceso.
Aunque la presente invencion se ha descrito completamente junto con varias realizaciones de la misma con referencia a los dibujos adjuntos, debe entenderse que diversos cambios y modificaciones pueden ser evidentes para los expertos en la materia. Tales cambios y modificaciones deben entenderse como incluidos dentro del alcance de la presente invencion tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, a menos que se aparten de el.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para preparar un inmunoconjugado activo, en el que dicho inmunoconjugado se desamida en uno o mas restos, en el que la desamidacion da como resultado una inhibicion de la potencia de dicho inmunoconjugado, y en el que dicho inmunoconjugado se compone de dos cadenas polipeptidicas unidas por un enlace disulfuro, comprendiendo el metodo replegar dicho inmunoconjugado en un proceso semicontinuo de replegamiento en un tampon de replegamiento que tiene un pH de 9,5 o menos, y purificar el inmunoconjugado replegado utilizando una elucion de dos ciclos en una columna de intercambio ionico, en la que la columna se separa entre una primera elucion y una segunda elucion con un tampon de separacion que comprende etanolamina, arginina, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), urea y ditiotreitol (DTT).
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que una cantidad del inmunoconjugado recuperado del metodo de preparacion es al menos trescientos % (300 %) mayor que una cantidad del inmunoconjugado recuperado utilizando un metodo que no comprende un proceso de replegamiento semicontinuo y/o una purificacion en una columna de intercambio ionico que se ha separado utilizando el tampon de separacion.
3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el polipeptido o inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo.
4. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende un Fab, un Fab’, un F(ab’)2, un Fd, un Fv monocatenario o scFv, un Fv ligado a disulfuro, un dominio V-NAR, una IgNar, un intracuerpo, una IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab’)3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio unico, DVD-IG, Fcab, AcM2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
5. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el polipeptido o inmunoconjugado comprende una toxina.
6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que la toxina es una exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma.
7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que dicha exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-22.
8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que dicha exotoxina de Pseudomonas, o variante de la misma, tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22.
9. El metodo de la reivindicacion 3 o 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo comprende una secuencia VH y una VL.
10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-11.
11. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, y 12-15.
12. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de union a antigeno del mismo y una PE o variante de la misma.
13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el inmunoconjugado es la inmunotoxina Moxetumomab pasudotox que comprende la subunidad VH-PE38 de SEQ ID NO: 1 y la subunidad VL de SEQ ID NO: 2.
14. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el tampon de replegamiento tiene un pH de 9,4.
15. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el proceso semicontinuo utiliza una velocidad de adicion de:
a) aproximadamente 52 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a aproximadamente 13 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora; b) aproximadamente 35 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a aproximadamente 17 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora; c) aproximadamente 30 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora a aproximadamente 18 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora; o d) aproximadamente 26 ml de cuerpos de inclusion solubilizados por l de tampon de replegamiento por hora.
16. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el tampon de separacion comprende arginina de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,75 M, urea de aproximadamente 7-9 M y DTT de aproximadamente 9-11 mM.
17. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15-16, en el que el proceso semicontinuo ocurre durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 horas.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2964640T3 (es) 2015-08-13 2024-04-08 Amgen Inc Filtración en profundidad cargada de proteínas de unión al antígeno
CN115210262B (zh) * 2020-09-29 2023-07-14 昆明赛诺制药股份有限公司 人源化抗-cd22重组免疫毒素及其应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3060165A (en) 1962-10-23 Preparation of toxic ricin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5079163A (en) 1985-03-29 1992-01-07 Cetus Corporation Recombinant ricin toxin fragments
US4689401A (en) 1986-03-06 1987-08-25 Cetus Corporation Method of recovering microbially produced recombinant ricin toxin a chain
US4892827A (en) 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
ATE182175T1 (de) 1990-05-11 1999-07-15 Us Health Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität
US5608039A (en) 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
EP0646175B1 (en) 1992-06-18 2005-12-28 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
EP0970227B1 (en) * 1997-03-20 2008-01-09 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to cd-22 bearing cells and tumors
US6296843B1 (en) 1998-04-03 2001-10-02 The Penn State Research Foundation Mutagenized IL 13-based chimeric molecules
ES2342929T3 (es) 2001-09-26 2010-07-19 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of Health and Human Anticuerpos anti-cd22 con afinidad aumentada por las celulas leucemicas que expresan cd22.
KR20060038461A (ko) * 2003-07-24 2006-05-03 이나뜨 파르마 Ｎｋ 세포 강화 화합물을 사용하여 치료용 항체의 효율을높이는 방법 및 조성물
WO2005012495A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Methods for expression and purification of immunotoxins
US7982011B2 (en) * 2003-11-25 2011-07-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutated anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
CN1676531A (zh) * 2004-04-02 2005-10-05 北京安波特基因工程技术有限公司 一种含（Arg) 9肽段的基于假单胞菌外毒素的重组免疫毒素
ES2702650T3 (es) 2005-07-29 2019-03-04 The Government Of The Us Secretary Of Health And Human Services Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida
EP1845103B1 (en) 2006-04-10 2015-02-25 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Method for refolding a protein
ZA200809776B (en) * 2006-05-30 2010-03-31 Genentech Inc Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
SG162834A1 (en) * 2006-07-14 2010-07-29 Genentech Inc Refolding of recombinant proteins
WO2009032954A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity
CA2773665C (en) * 2009-09-11 2018-02-20 Ira H. Pastan Improved pseudomonas exotoxin a with reduced immunogenicity
EP2613857B1 (en) * 2010-07-30 2018-05-30 MedImmune, LLC Method for purifying immunoconjugates
EP2451238B1 (en) 2010-11-05 2015-01-07 Alcatel Lucent Control message encoding
WO2012152912A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Newvectys Genetically modified pig as a cancer prone model

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