JP2016503045A - 新規ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、炭酸脱水酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ）に対する結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関し、配列ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮ ＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＷＤを含むＣＡＩＸ結合ポリペプチドを提供する。本開示はまた、診断剤、予後診断剤および／または治療剤としてのそのようなＣＡＩＸ結合ポリペプチドの使用にも関する。

Description

本開示は、炭酸脱水酵素ＩＸ型（以下、ＣＡＩＸと呼ぶ）に対する結合親和性を有する操作されたポリペプチドのクラスに関する。本開示はまた、診断剤、予後診断剤および／または治療剤としてのそのようなＣＡＩＸ結合ポリペプチドの使用にも関する。
炭酸脱水酵素（ＣＡ）は、二酸化炭素の可逆的水和を触媒する亜鉛金属酵素の大ファミリーである。それらは、呼吸、石灰化、酸−塩基平衡、骨吸収、ならびに房水、脳脊髄液、唾液、および胃酸の形成などの様々な生物学的プロセスに参画する。それらは、組織分布およびその細胞内局在化における幅広い多様性を示す。ＣＡＩＸ（ＭＮとしても知られる）はＣＡ９遺伝子によりコードされる膜貫通タンパク質であり、がん腫瘍において発現することが示されている。
腫瘍微小環境
固形腫瘍の微小環境は、一方ではがん細胞、他方では支持間質細胞および血管細胞の間の生化学的および生理学的相互作用により形作られる。腫瘍は、通常はほとんどの正常組織のさらなる発達を妨げる宿主の血管系の血液供給能力を超える速度で増殖することが多い。しかしながら、腫瘍はこのネガティブフィードバックを回避し、高い呼吸速度を維持し、主要な血液が運ぶ基質である酸素が不足する場合であっても生存する。実際、低い酸素圧（低酸素状態）は、腫瘍環境の基本的特徴である（非特許文献１）。低酸素状態は、腫瘍呼吸の結果であるだけでなく、低酸素状態誘導遺伝子（非特許文献２；非特許文献３）を特徴付ける遺伝子発現プログラムの変更のためのトリガーでもあり、より侵攻的な疾患表現型に向かうがんの進行に関与する（非特許文献４）。低酸素状態により調節される多くの遺伝子は、さもなければ酸素の存在下で不活化される転写因子である低酸素状態誘導因子によって制御される。低酸素状態誘導因子の標的は、グルコース代謝、血管増殖、酸素運搬、鉄代謝および他の多数のプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
ＣＡＩＸの発現および機能
ＣＡＩＸはＰａｓｔｏｒｅｋおよび共同研究者（非特許文献５）により１９９０年代中期に元々クローニングされた。ＣＡＩＸは低酸素状態誘導酵素であり、高い速度の解糖的代謝の有害な効果と闘う細胞により誘発されるｐＨ調節系の成分である（非特許文献６）。
ＣＡＩＸ発現は、他のほとんどのＣＡアイソフォームの発現と違って、多くの腫瘍に関連する（非特許文献５；非特許文献７）。実際、有意なレベルのＣＡＩＸを発現する正常組織は非常に少なく（胃が顕著な例外である（非特許文献８））、従って、ＣＡＩＸに関する陽性染色は、今や腫瘍低酸素状態の確立されたマーカーであり、侵攻性のがん（例えば、乳がんおよび骨のがん）の臨床指標であり、予後不良である（非特許文献９に概説される）。
ＣＡＩＸは腫瘍細胞の増殖および生存にとって好ましい細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）をもたらし、維持するのを助けるように機能するが、同時に、酸性度の高い細胞外空間の生成に参画し、腫瘍細胞の侵襲性を容易にする。
ＣＡＩＸは膜に係留されており、その触媒ドメインは細胞外環境に直面している。ＣＡＩＸの結晶構造は解析されており、ＣＡＩＸが二量体として存在することを示している（非特許文献１０；非特許文献７）。このタンパク質は、細胞間接着および触媒プロセスの調節に関与し得るプロテオグリカン様ドメインおよび細胞内カルボキシ末端尾部を含有する。近年の研究（非特許文献１１）は、酸性アミノ酸残基に富むプロテオグリカンドメインの存在がＣＡＩＸ活性に対するＨ＋イオンの阻害効果を低下させると提唱した。これは、より高い酸性値に向かうｐＨ単位の半分までのＣＡＩＸ活性のｐＨ感受性のシフトとして観察され、ＣＡＩＸは固形腫瘍に典型的な酸性細胞外環境において触媒活性を保持することができる。
ＣＡＩＸとがん
ＣＡＩＸは、部分的にはそれが様々な固形腫瘍において過剰発現するが、正常組織中では限られた様式で発現するため、がん療法のための特に魅力的な標的である。ヒト組織中では、ＣＡＩＸの強力な発現は、一般に、十二指腸、空腸および回腸粘膜の増殖している陰窩腸細胞（ｃｒｙｐｔ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）の側底面に限られる（非特許文献８；非特許文献１２）。しかしながら、他の組織では広範性の弱いＣＡＩＸ発現も報告されている。
ＣＡＩＸは、多くの固形腫瘍において過剰発現し、ＣＡＩＸの発現と、患者の予後との間には確立した関係がある。組織切片の免疫組織化学染色により検出されるようなＣＡＩＸ発現は、肺、結腸、乳房、子宮頸部、膀胱、腎臓、脳、頭頸部、および口腔のがんにおいて上方調節され、予後不良に関連する（非特許文献９に概説されている）。さらに、近年の研究は、組織マイクロアレイ戦略を使用して数百人から数千人の患者のコホートにおいてＣＡＩＸの発現を検査してきた。この高スループットプラットフォームを使用して、ＣＡＩＸは乳がん、肺がん、卵巣がんおよび膀胱がんならびに星状細胞腫における予後不良のバイオマーカーとして検証されてきた（非特許文献９に概説されている）。
現在、臨床検出および予後評価のためのＣＡＩＸの使用がますます注目されている。相対的に小さい試料サイズを含む初期研究により、可溶性ＣＡＩＸが固形腫瘍を有する患者において血清中で上方調節されることが示され（非特許文献１３；非特許文献１４）、近年の研究により、可溶性ＣＡＩＸと患者の予後との間の関連が示された。外陰がんにおける術前血清ＣＡＩＸ濃度は、腫瘍内発現と相関し、血清ＣＡＩＸレベルの増加は予後不良に関連する（非特許文献１５）。転移性乳がんにおけるＣＡＩＸの血清レベルも予後不良、ならびに循環腫瘍細胞の発生とも相関していた（非特許文献１６）。同様に、ＮＳＣＬＣにおいては、ＣＡＩＸの高い血漿レベルは、有意により短い全生存に関連していた（非特許文献１７）。
モノクローナル抗体またはＣＡＩＸ特異的低分子阻害剤を使用するＣＡＩＸ触媒活性の薬理学的干渉は、がん細胞によるｐＨ調節を結果的に破壊し、原発性腫瘍増殖および転移を弱めることが近年示された。
しかしながら、モノクローナル抗体は、固形腫瘍の標的化にとって（診断的ペイロード目的にとっても、治療的ペイロード目的にとっても）常に最適であるというわけではない。治療効果は、腫瘍を通過する薬物の効率的分布に依存し、分子イメージングは腫瘍取込みと周囲の正常組織との間の高い比に依存する。
腫瘍浸透率（溢出を含む）は分子サイズに負に関連するため、相対的に大きい抗体分子は本質的に少ない組織分布および浸透能力を有する。さらに、分子イメージングのために、抗体の非常に長いｉｎ ｖｉｖｏでの半減期は、相対的に高い血液シグナルをもたらし、それによって、相対的に小さい腫瘍と血液の対比をもたらす。
ＣＡＩＸに対する高い親和性を有する薬剤の継続的提供は、依然として当分野における実質的な関心事である。疾患の処置および診断におけるそのような分子の使用の提供も重要である。
ＧａｔｅｎｂｙおよびＧｉｌｌｉｅｓ（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ４：８９１〜８９９頁 ＧｌｅａｄｌｅおよびＲａｔｃｌｉｆｆｅ（１９９８）Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ ４：１２２〜１２９頁 Ｈａｒｒｉｓ（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２：３８〜４７頁 Ｆａｎｇら（２００８）Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ １８：３３０〜３３７頁 Ｐａｓｔｏｒｅｋら（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２８７７〜２８８８頁 Ｗｙｋｏｆｆら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：７０７５〜７０８３頁 Ｄｅ ＳｉｍｏｎｅおよびＳｕｐｕｒａｎ（２０１０）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８０４：４０４〜４０９頁 Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：３９８〜４０８頁 ＭｃＤｏｎａｌｄら（２０１２）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ３：８４〜９７頁 Ａｌｔｅｒｉｏら（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１６２３３〜１６２３８頁 Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉら（２００９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １９：５８２５〜５８２８頁 Ｓａａｒｎｉｏら（１９９８）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４６：４９７〜５０４頁 Ｗｏｅｌｂｅｒら（２０１０）Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １１７：１８３〜１８８頁 Ｈｙｒｓｌら（２００９）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ：５６：２９８〜３０２頁 Ｋｏｃｋら（２０１１）Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ２１：１４１〜１４８頁 Ｍｕｌｌｅｒら（２０１１）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：１３：Ｒ７１頁 Ｉｌｉｅら（２０１０）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．５月２５日；１０２（１１）：１６２７〜３５頁
本開示の目的は、例えば、診断、予後診断および治療の適用のために使用することができる新規ＣＡＩＸ結合剤を提供することである。
本開示の目的は、現在の療法の上記欠点および他の欠点を軽減しながら、様々な形態のがんを標的とする効率的療法を可能にする分子を提供することである。
本開示のさらなる目的は、予後診断および診断の適用にとって好適な分子を提供することである。
本開示から当業者にとって明らかとなるこれらの目的および他の目的は、添付の特許請求の範囲で特許請求され、本明細書に一般的に開示される本発明の異なる態様により満たされる。
かくして、本開示の第１の態様において、
ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＷＤ
（式中、互いに独立に、
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択され；
Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｆ、Ｎ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ２０は、Ｋ、ＱおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択され；
Ｘ２５は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択される）；
ならびに
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるＣＡＩＸ結合モチーフＢＭを含む、炭酸脱水酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ）結合ポリペプチドが提供される。
関連する配列、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのクラスの上記定義は、いくつかの異なる選択実験においてＣＡＩＸとのその相互作用について選択された、親足場のいくつかの無作為ポリペプチドバリアントの統計分析に基づくものである。同定されるＣＡＩＸ結合モチーフ、または「ＢＭ」は、親足場の標的結合領域に一致し、この領域は３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で２つのアルファヘリックスを構成する。親足場において、２つのＢＭヘリックスの様々なアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。本開示において、結合表面残基の無作為なバリエーションおよびバリアントのその後の選択は、Ｆｃ相互作用能力を、ＣＡＩＸとの相互作用のための能力と置き換えた。
当業者であれば理解できるように、本開示のポリペプチドのＣＡＩＸ結合能力のような任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存する。従って、その機能に影響することなく、ポリペプチド中のアミノ酸の配列に対して小さい変化を作ることができる。かくして、本開示は、ＣＡＩＸ結合特性が保持されるようなものである、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドの改変バリアントを包含する。
このように、ｉ）に定義されたポリペプチドに対して８９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＡＩＸ結合ポリペプチドも、本開示により包含される。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは、ｉ）に定義されたポリペプチドと少なくとも９７％のような少なくとも９３％同一である配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態においては、そのような変化は、本明細書に開示されるＣＡＩＸ結合ポリペプチドの配列の全ての位置において作ることができる。他の実施形態においては、そのような変化は、足場アミノ酸残基とも呼ばれる、非可変位置においてのみ作ることができる。そのような場合、変化は、可変位置、すなわち、配列ｉ）中で「Ｘ」で示される位置で許容されない。例えば、ある特定の機能群のアミノ酸残基（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を、同じ機能群に由来する別のアミノ酸残基に交換することができる。
本明細書を通して使用される用語「同一性％」は、例えば、以下のように算出することができる。クエリー配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４））を使用して標的配列と整列させる。最短の整列された配列に対応するウィンドウにわたって比較を行う。最短の整列された配列は、いくつかの例においては、標的配列であってもよい。他の例においては、クエリー配列は、最短の整列された配列を構成してもよい。それぞれの位置でのアミノ酸残基を比較し、標的配列中に同一の一致を有するクエリー配列中の位置のパーセンテージを、同一性％として報告する。
第１の態様によるポリペプチドの一実施形態においては、配列ｉ）は、
ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０
Ｘ２１ＡＦＩＹＸ２６ＬＷＤ
（式中、互いに独立に、
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択され；
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｆ、Ｎ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｅ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ２０は、ＱおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択される）
により定義される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｈ、ＮおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、ＨおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、ＮおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、ＨおよびＮから選択される。
別の実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｈである。
別の実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｎである。
さらに別の実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２は、Ｗである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉ、Ｌ、Ｑ、ＲおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉ、Ｌ、ＱおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉ、Ｌ、ＲおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉ、ＬおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、ＩおよびＬから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｉである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ３は、Ｌである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ４は、Ａ、Ｆ、ＷおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ４は、Ａ、ＦおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ４は、ＦおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ４は、Ｆである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ４は、Ｗである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ６は、Ａ、ＧおよびＳから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ６は、ＡおよびＧから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ６は、ＧおよびＳから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ６は、Ｇである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ７は、Ｇ、Ｉ、ＶおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ７は、ＶおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ７は、ＩおよびＷから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ７は、Ｗである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、Ｄ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ｄ、ＳおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ａ、ＤおよびＳから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、ＤおよびＴから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、ＤおよびＳから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１０は、Ｄである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１１は、Ｄ、ＥおよびＳから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１１は、ＤおよびＥから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１１は、Ｄである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１６は、Ｎである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１６は、Ｔである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、ＴおよびＶから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＱおよびＶから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、ＴおよびＶから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＱおよびＶから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄ、Ｅ、ＩおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄ、ＥおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄ、ＥおよびＩから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、ＤおよびＥから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｅである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１７は、Ｄである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｈ、Ｑ、ＲおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｈ、ＱおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、ＨおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、ＱおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、ＤおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、ＱおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、ＨおよびＱから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｑである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ１８は、Ｄ、ＥおよびＹから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２０は、Ｒである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２１は、Ｄ、ＨおよびＮから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２１は、ＤおよびＮから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２１は、ＨおよびＮから選択される。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２１は、Ｎである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２５は、Ｙである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２６は、Ｋである。
一実施形態においては、配列ｉ）中のＸ２６は、Ｓである。
ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのサブクラスを定義するより特定の実施形態においては、配列ｉ）は、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩ：
Ｉ．Ｘ２がＮである；
ＩＩ．Ｘ３がＩおよびＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ４がＦである；
ＩＶ．Ｘ６がＧである；
Ｖ．Ｘ７がＷである；
ＶＩ．Ｘ１０がＤおよびＳから選択される；
ＶＩＩ．Ｘ１１がＤである；
ＶＩＩＩ．Ｘ１６がＴである；
ＩＸ．Ｘ１７がＥおよびＤから選択される；
Ｘ．Ｘ１８がＤ、Ｙ、ＥおよびＳから選択される；
ＸＩ．Ｘ２１がＮである；ならびに
ＸＩＩ．Ｘ２６がＫである
のうちの少なくとも７つを満たす。
第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドのいくつかの例においては、配列ｉ）は、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも８つを満たす。より特には、配列ｉ）は、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも９つ、例えば、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも１０、例えば、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも１１、例えば、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの全部を満たすことができる。
以下の実験セクションに詳述されるように、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドバリアントの選択は、いくつかの個々のＣＡＩＸ結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定をもたらした。これらの配列は、この態様による配列ｉ）の個々の実施形態を構成する。個々のＣＡＩＸ結合モチーフの配列を、図１に、配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４として提示する。従って、この態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドの一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜１１３からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜４および配列番号６〜４１からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜４、配列番号６および配列番号８〜３７からなる群から選択される。別の実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜１４からなる群から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜８および配列番号１０〜１３から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜５から選択される。一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜４から選択される。一実施形態においては、配列ｉ）は、配列番号１〜３から選択される。
本開示のいくつかの実施形態においては、上記で定義されたＢＭは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン「の一部を形成する」。これは、ＢＭが元のドメイン中の類似する構造モチーフと置き換わるように、ＢＭの配列が、元の３ヘリックスバンドルドメインの配列中に「挿入」されるか、またはその上に「移植」されることを意味すると理解される。例えば、理論によって束縛されることを望むものではないが、ＢＭは３ヘリックスバンドルの３つのヘリックスのうちの２つを構成すると考えられ、従って、任意の３ヘリックスバンドル内のそのような２つのヘリックスモチーフを置き換えることができる。当業者であれば理解できるように、２つのＢＭヘリックスによる３ヘリックスバンドルドメインの２つのヘリックスの置き換えは、ポリペプチドの基本構造に影響しないように行われなければならない。すなわち、本発明のこの実施形態によるポリペプチドのＣα骨格の全体的な折畳みは、それが例えば、同じ順序などでの二次構造の同じ要素を有する一部を形成する３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインのものと実質的に同じである。かくして、本開示によるＢＭは、この態様のこの実施形態によるポリペプチドが元のドメインと同じ折畳みを有する場合、３ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成」し、基本的構造特性が共有されることを意味し、これらの特性は、例えば、類似するＣＤスペクトルをもたらす。当業者であれば、関連する他のパラメータを知っている。
特定の実施形態においては、かくして、ＣＡＩＸ結合モチーフ（ＢＭ）は、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループを有する２つのアルファヘリックスを本質的に構成することができる。特定の実施形態においては、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。そのようなドメインの非限定的な例は、ドメインＢ、およびその誘導体のような、黄色ブドウ球菌に由来するプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメインである。いくつかの実施形態においては、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢから誘導される、プロテインＺのバリアントである。
本発明のＣＡＩＸ結合ポリペプチドが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸａＸｂＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸｄＱ；
（式中、
［ＢＭ］は本明細書で定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり；
ＸａはＡおよびＳから選択され；
ＸｂはＮおよびＥから選択され；
ＸｃはＡ、ＳおよびＣから選択され；
ＸｄはＡおよびＳから選択される）ならびに
ｉｖ）ｉｉｉ）により定義された配列に対して少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
上記で論じたように、その三次構造および機能に大きく影響することなく上記アミノ酸配列と比較して小さい変化を含むポリペプチドも、本開示の範囲内にある。かくして、いくつかの実施形態においては、配列ｉｖ）は、ｉｉｉ）により定義された配列に対して、少なくとも８５％など、少なくとも８７％など、少なくとも８９％など、少なくとも９１％など、少なくとも９３％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％など、少なくとも８３％の同一性を有する。
一実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸａはＡである。代替的な実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸａはＳである。
一実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｂはＮである。代替的な実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｂはＥである。
一実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＡである。代替的な実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＳである。さらに別の代替的な実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｃはＣである。
一実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｄはＡである。代替的な実施形態においては、配列ｉｉｉ）中のＸｄはＳである。
一実施形態においては、配列ｉｉｉ）中、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり、ＸｄはＡである。
さらなる実施形態においては、配列ｉｉｉ）中、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり、ＸｄはＡである。
さらなる実施形態においては、配列ｉｉｉ）中、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり、ＸｄはＳである。
さらなる実施形態においては、配列ｉｉｉ）中、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり、ＸｄはＳである。
さらなる実施形態においては、上記のＣＡＩＸ結合ポリペプチドの定義における配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜２２６および配列番号３４５〜３４９から選択される。一実施形態においては、配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜２２６からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜１１７および配列番号１１９〜１５４からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜１１７、配列番号１１９〜１２１および配列番号１２３〜１５０からなる群から選択される。別の実施形態においては、配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜１２７からなる群から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜１２１および配列番号１２３〜１２６から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉｖは、配列番号１１４〜１１８から選択される。一実施形態においては、配列ｉｖは、配列番号１１４〜１１７から選択される。一実施形態においては、配列ｉｖは、配列番号１１４〜１１６から選択される。
また、さらなる実施形態においては、
ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は上記で定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり、ＸｃはＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉ）ｖ）により定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。
あるいは、
ｖｉｉ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は上記で定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり、ＸｃはＡおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）により定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。
上記で論じたように、その三次構造および機能に大きく影響することなく上記アミノ酸配列と比較して小さい変化を含むポリペプチドも、本開示の範囲内にある。かくして、いくつかの実施形態においては、上記で定義されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、例えば、ｖ）またはｖｉｉ）により定義された配列と少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である配列を有してもよい。
いくつかの実施形態においては、ＣＡＩＸ結合モチーフは、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。
一実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、配列番号３６５〜３６８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、
ｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ
（式中、［ＢＭ］は上記で定義されたＣＡＩＸ結合モチーフである）；および
ｘ）ｉｘ）に定義された配列に対して少なくとも８４％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
再度、その三次構造および機能に大きく影響することなく上記アミノ酸配列と比較して小さい変化を含むポリペプチドも、本開示の範囲内にある。かくして、いくつかの実施形態においては、上記で定義されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、例えば、ｉｘ）により定義された配列と少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である配列を有してもよい。
そのようなポリペプチドにおける配列ｉｘ）を、配列番号２２７〜３３９および配列番号３５０〜３５４のいずれか１つから選択することができる。一実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜３３９からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２３０および配列番号２３２〜２６７からなる群から選択される。一実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２３０、配列番号２３２〜２３４および配列番号２３６〜２６３からなる群から選択される。別の実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２４０からなる群から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２３４および配列番号２３６〜２３９から選択される。さらに別の実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２３１から選択される。一実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２３０から選択される。一実施形態においては、配列ｉｘ）は、配列番号２２７〜２２９から選択される。
本明細書で使用される用語「ＣＡＩＸ結合」および「ＣＡＩＸに対する結合親和性」とは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用によって試験することができるポリペプチドの特性を指す。例えば、以下の実施例に記載のように、ＣＡＩＸ結合親和性を、ＣＡＩＸ、またはその断片を装置のセンサーチップ上に固定化し、試験しようとするポリペプチドを含有する試料をチップ上に通過させる実験において試験することができる。あるいは、試験しようとするポリペプチドを、装置のセンサーチップ上に固定化し、ＣＡＩＸ、またはその断片を含有する試料を、チップ上に通過させる。次いで、当業者であれば、そのような実験により得られた結果を解釈して、ＣＡＩＸに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的尺度を確立することができる。例えば、相互作用に関するＫＤ値を決定するために、定量的尺度が望ましい場合、表面プラズモン共鳴法を使用することもできる。結合値を、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）装置中で定義することができる。好適には、ＣＡＩＸを装置のセンサーチップ上に固定化し、親和性を決定しようとするポリペプチドの試料を、連続希釈により調製し、無作為の順序で注入する。次いで、ＫＤ値を、例えば、装置の製造業者により提供される、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア、または他の好適なソフトウェアの１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して、結果から算出することができる。
一実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、相互作用のＫＤ値が多くても１×１０−６Ｍ、例えば、多くても１×１０−７Ｍ、例えば、多くても１×１０−８Ｍ、例えば、多くても１×１０−９ＭとなるようにＣＡＩＸに結合することができる。
当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく、特定の適用に対してポリペプチドを調整するために本明細書に開示される任意の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドに対して様々な改変および／または付加を行うことができることを理解できる。
例えば、一実施形態においては、Ｃ末端および／またはＮ末端のさらなるアミノ酸により伸長した、および／またはそれを含む、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖中の本当に最初および／または本当に最後の位置、すなわち、配列ｉ）またはｉｉ）のＮおよび／またはＣ末端に１つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドと理解されるべきである。かくして、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、任意の好適な数のさらなるアミノ酸残基、例えば、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。例えば、ポリペプチドの生成、精製、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定化、カップリング、または検出を改善するために、それぞれのさらなるアミノ酸残基を個別に、または集合的に付加することができる。そのようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングのために付加される１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この一例は、システイン残基の付加である。そのようなさらなるアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えば、Ｈｉｓ６タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）３タグ（「ＨＥＨＥＨＥ」タグ）または「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグまたはタグに特異的な抗体との相互作用のための「ＦＬＡＧ」タグまたはＨｉｓ６タグの場合、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）も提供することができる。
上記で論じたさらなるアミノ酸を、化学的コンジュゲーション（公知の有機化学的方法を使用する）により、または融合タンパク質としてのＣＡＩＸ結合ポリペプチドの発現などの任意の他の手段により、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドにカップリングするか、または任意の他の様式で、直接的に、もしくはリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを介して連結することができる。
上記で論じたさらなるアミノ酸は、例えば、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを含んでもよい。さらなるポリペプチドドメインは、例えば、さらに別の結合機能、もしくは酵素機能、もしくは毒性機能（例えば、イムノトキシン）、もしくは蛍光シグナリング機能、またはその組合せのような、別の機能を有するＣＡＩＸ結合ポリペプチドを提供してもよい。
さらなるポリペプチドドメインは、同じＣＡＩＸ結合機能を有する別のＣＡＩＸ結合部分をさらに提供してもよい。かくして、さらなる実施形態においては、多量体形態のＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。前記多量体は、単量体単位として本明細書に開示される少なくとも２つのＣＡＩＸ結合ポリペプチドを含むことが理解され、そのアミノ酸配列は、同じであるか、または異なっていてもよい。多量体形態のポリペプチドは、それぞれＣＡＩＸ結合モチーフを有し、それぞれ多量体内で単量体を形成する、好適な数のドメインを含んでもよい。これらのドメインは、同じアミノ酸配列を有してもよいが、あるいは、それらは異なるアミノ酸配列を有してもよい。換言すれば、本発明のＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ多量体、例えば、ホモまたはヘテロ二量体を形成してもよい。一実施形態においては、前記単量体単位が一緒に共有的にカップリングされたＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。別の実施形態においては、前記ＣＡＩＸ結合ポリペプチド単量体単位は、融合タンパク質として発現する。一実施形態においては、二量体形態のＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。
さらに、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、またはその多量体が、第１のドメイン、または第１の部分を構成し、第２の部分およびさらなる部分がＣＡＩＸの結合以外の他の機能を有する、「異種遺伝子型」融合ポリペプチドもしくはタンパク質、またはコンジュゲートも、本開示の範囲内に企図され、その中にある。そのようなタンパク質中の融合ポリペプチドまたはコンジュゲートの第２の部分およびさらなる部分は、好適には所望の生物活性を有する。
かくして、本開示の第２の態様において、第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドからなる第１の部分、および所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分を含む、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。別の実施形態においては、前記融合タンパク質またはコンジュゲートは、第２の部分の生物活性と同じであるか、または異なっていてもよい所望の生物活性を含む、さらなる部分をさらに含んでもよい。
そのような所望の生物活性の非限定的な例は、治療活性、結合活性、および酵素活性を含む。一実施形態においては、所望の生物活性を有する第２の部分は、治療活性ポリペプチドである。結合活性の非限定的な例は、融合タンパク質またはコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させる結合活性である。１つの特定の実施形態においては、前記結合活性は、融合タンパク質またはコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させるアルブミン結合活性である。一実施形態においては、前記アルブミン結合活性は、連鎖球菌プロテインＧまたはその誘導体のアルブミン結合ドメインを含む。
治療活性ポリペプチドの非限定的な例は、ヒト内因性酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカイン、サイトカインおよびリンホカインからなる群から選択される分子のような生体分子である。
本開示のこの態様の一実施形態においては、細胞傷害剤をさらに含む、ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。細胞傷害剤の非限定的な例は、オーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、エクテイナスシジン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、メトトレキサート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ボウガニン、ゲロニン、シュードモナス外毒素３８（ＰＥ３８）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、およびその類似体、ならびにその誘導体およびその組合せからなる群から選択される薬剤である。当業者であれば、細胞傷害剤の非限定的な例が前記薬剤の全ての可能なバリアントを含み、例えば、薬剤オーリスタチンが、例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、オーリスタチンＰＥ、およびその誘導体を含むことを理解できる。
当業者であれば理解できるように、第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、任意の他の部分との融合タンパク質中で、またはコンジュゲートパートナーとして有用であり得る。従って、治療活性ポリペプチドおよび細胞傷害剤の上記一覧は、いかなる意味でも限定と解釈されるべきではない。
融合ポリペプチドまたはコンジュゲートの作出に関する他の可能性も企図される。かくして、本発明の第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドを、標的結合に加えて、またはその代わりに、他の機能を示す第２の、またはさらなる部分に共有的にカップリングすることができる。一例は、１つまたはそれ以上のＣＡＩＸ結合ポリペプチドと、リポーターまたはエフェクター部分として働く酵素活性ポリペプチドとの融合物である。
本発明によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドを組み込んだ融合タンパク質またはコンジュゲートの上記説明に関して、第１の、第２のおよびさらなる部分の指定は、一方では本発明によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドと、他方では他の機能を示す部分とを区別するための明確性の理由から行われることに留意すべきである。これらの指定は、融合タンパク質またはコンジュゲートのポリペプチド鎖中の異なるドメインの実際の順序を指すことを意図されるものではない。かくして、例えば、前記第１の部分は、限定されるものではないが、融合タンパク質またはコンジュゲートのＮ末端に、中央に、またはＣ末端に出現してもよい。
上記態様は、第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチド、または第２の態様による融合タンパク質もしくはコンジュゲート中に含まれるＣＡＩＸ結合ポリペプチドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される標識のような標識をさらに含むポリペプチドをさらに包含する。そのような標識は、例えば、ポリペプチドの検出のために使用することができる。
例えば、標識されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドが本開示の第１の態様によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドと標識とを含む実施形態においては、標識されたポリペプチドを、例えば、ＣＡＩＸを発現する腫瘍細胞ならびに転移性細胞の間接的標識のために使用することができる。
他の実施形態においては、標識されたＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、所望の生物活性を有する第２の部分をも含む融合タンパク質またはコンジュゲート中の部分として存在する。標識を、いくつかの例においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドにのみカップリングさせ、いくつかの例においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドと、コンジュゲートまたは融合タンパク質の第２の部分の両方にカップリングさせることができる。さらに、標識を、第２の部分にのみカップリングさせ、ＣＡＩＸ結合部分にはカップリングさせなくてもよいことも可能である。従って、さらに別の実施形態においては、前記標識が第２の部分にのみカップリングされる、第２の部分を含むＣＡＩＸ結合ポリペプチドが提供される。
標識されたポリペプチドに言及する場合、これは、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドと、第２のおよび場合によりさらなる部分とを含む融合タンパク質およびコンジュゲートを含む、本明細書に記載のポリペプチドの全ての態様に対する言及と理解されるべきである。かくして、標識されたポリペプチドは、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのみ、および例えば、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドにキレート化するか、もしくは共有的にカップリングさせることができる治療的放射性核種を含有してもよいか、またはＣＡＩＸ結合ポリペプチド、治療的放射性核種および所望の生物活性、例えば、治療効能を有する低分子のような第２の部分を含有してもよい。
ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートを放射標識する実施形態においては、そのような放射標識されたポリペプチドは、放射性核種を含んでもよい。大部分の放射性核種は金属の性質を有し、金属は典型的にはタンパク質およびペプチド中に提示される元素と安定な共有結合を形成することができない。この理由から、放射性金属を用いるタンパク質およびペプチドの標識を、金属イオンと、キレートと呼ばれる非共有化合物を形成する、キレーター、すなわち、多座配位子を使用して行う。ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートの実施形態において、放射性核種の組込みを、放射性核種を、ポリペプチドと連係させる、キレート化させる、または複合体化させることができる、キレート化環境の提供により可能にする。
キレーターの一例は、ポリアミノポリカルボキシレート型のキレーターである。２つのクラスのそのようなポリアミノポリカルボキシレートキレーターを区別することができる：大環状キレーターおよび非環式キレーター。
一実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、システイン残基のチオール基またはリシン残基のイプシロンアミン基を介してＣＡＩＸ結合ポリペプチドにコンジュゲートされたポリアミノポリカルボキシレートキレーターにより提供されるキレート化環境を含む。
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニドおよび放射性ランタニドの放射性同位体のための最も一般的に使用される大環状キレーターは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）の様々な誘導体である。一実施形態においては、ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートのキレート化環境は、ＤＯＴＡまたはその誘導体により提供される。より特には、一実施形態において、本開示により包含されるキレート化ポリペプチドは、ＤＯＴＡ誘導体である１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）を前記ポリペプチドと反応させることにより得られる。
さらに、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）およびその誘導体を、キレーターとして使用することができる。従って、一実施形態においては、ポリアミノポリカルボキシレートキレーターが１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸またはその誘導体であるＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートが提供される。
最も一般的に使用される非環式ポリアミノポリカルボキシレートキレーターは、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−五酢酸）の様々な誘導体である。従って、ジエチレントリアミン五酢酸またはその誘導体により提供されるキレート化環境を有するポリペプチドも、本開示により包含される。
本開示の第３の態様において、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。また、ポリヌクレオチドを発現させることを含む上記のポリペプチドまたは融合タンパク質を生成する方法；該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および該発現ベクターを含む宿主細胞も本開示により包含される。
また、その発現ベクターからのポリペプチドの発現を許容する条件下で前記宿主細胞を培養すること、および該ポリペプチドを単離することを含む、前記ポリペプチドを生成する方法も包含される。
あるいは、本開示のＣＡＩＸ結合ポリペプチドを、アミノ酸および／または保護された反応性側鎖を有するアミノ酸誘導体を使用する非生物ペプチド合成により生成することができ、その非生物ペプチド合成は、
− 保護された反応性側鎖を有する第１の態様によるポリペプチドを形成するためのアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の段階的カップリング
− ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、ならびに
− 水性溶液中でのポリペプチドの折畳み
を含む。
別の態様においては、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む組成物が提供される。一実施形態においては、前記組成物は、少なくとも１つのさらなる活性薬剤、例えば、少なくとも２つのさらなる活性薬剤、例えば、少なくとも３つのさらなる活性薬剤をさらに含む。そのような組合せにおいて有用であるとわかる可能性があるさらなる活性薬剤の非限定的な例は、免疫刺激剤、放射性核種、毒性薬剤、酵素、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を動員する因子および光増感剤である。一実施形態においては、少なくとも１つのさらなる活性薬剤は、ＨＩＦ−１αの阻害剤のような、低酸素状態により誘導されるタンパク質の阻害剤であってもよい。ＣＡＩＸの酵素活性は、がん細胞の周囲の細胞外微小環境の酸性化において活性であり、かくして、腫瘍増殖および侵襲を容易にすると考えられるため、腫瘍進行にとって潜在的に重要であると提唱されている。従って、別の実施形態においては、前記少なくとも１つのさらなる活性薬剤は、ｐＨ調節剤であってもよい。さらに別の実施形態においては、前記少なくとも１つのさらなる活性薬剤は、血管新生阻害因子、細胞分裂阻害因子および細胞傷害剤を含む群から選択される。
本開示によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドは、それ自体で治療剤、診断剤もしくは予後診断剤として、または例えば、ＣＡＩＸに対する直接的もしくは間接的効果を有する他の治療剤もしくは診断剤を標的化するための手段として有用であってもよいと理解されるべきである。直接的治療効果は、例えば、ＣＡＩＸシグナリングを阻害することにより達成することができる。ＣＡＩＸはまた、肺がん、脳のがん、腎臓がんその他のようなある特定のがんの予後を予測するための有益なマーカーとして役立ち得る。例えば、肺腫瘍においては、ＣＡＩＸの存在は、全てがん疾患の進行および臨床転帰の不良の特徴である血管新生、アポトーシス阻害および細胞間接着破壊に関与するタンパク質の発現と特に関連している。
従って、本開示の別の態様においては、医薬、診断剤または予後診断剤としての使用のための、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が提供される。
一実施形態においては、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＩＸ機能をモジュレートするための医薬としての使用のための、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは組成物が提供される。本明細書で使用される用語「モジュレートする」とは、ＣＡＩＸ機能を低次形態にすること、ＣＡＩＸ機能を部分的に阻害すること、または完全に阻害することのような、活性を変化させることを指す。
一実施形態においては、がんのような、ＣＡＩＸ関連状態の処置、診断または予後診断における使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が提供される。一実施形態においては、少なくとも１つの細胞増殖マーカーと共に、予後診断または診断における使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物が提供される。細胞増殖マーカーの非限定的な例は、Ｋｉ−６７、ＡｇＮＯＲ、コリン、クラスピン、サイクリンＡ、ＣＹＲ６１、Ｃｄｋ１、ヒストンＨ３、ＨｓＭＣＭ２、ＩＬ−２、Ｋｉ−Ｓ１、Ｋｉ−Ｓ２、ＬｉｇＩ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、マイトシン、ｐ１２０、ＰＣＮＡ、ＰＤＰＫ、ＰＬＫ、ＳＴＫ１、ＴＫ−１、トポイソメラーゼＩＩアルファ、ＴＰＳからなる群から選択される細胞増殖マーカーである。
本明細書で使用される用語「がん」または過増殖性疾患とは、腫瘍疾患および／またはがん、例えば、転移性もしくは侵襲性のがん、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚もしくは眼内メラノーマ、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、結腸直腸がん、小腸のがん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣の癌腫、外陰癌腫、ホジキン病、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓もしくは尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性白血病、または未知の起源のがん、または他の過形成性もしくは新生物性ＣＡＩＸ関連状態、例えば、難治性型の上記のがんのいずれかまたは１つもしくはそれ以上の上記のがんもしくは過増殖性疾患の組合せを指す。ＣＡＩＸ関連状態の非限定的な例は、腎臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、脳のがん、頭頸部がん、軟部組織肉腫、星状細胞腫、口腔がんならびに低酸素状態およびＣＡＩＸ発現を示す固形腫瘍を呈する任意のがんからなる群から選択されるがんである。
関連する態様においては、ＣＡＩＸを含有すると疑われる試料を用意すること、前記試料を、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物と接触させること、およびＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、試料中のＣＡＩＸの存在を示すことを含む、ＣＡＩＸを検出する方法が提供される。一実施形態においては、前記方法は、試料を接触させた後に、結合しなかったポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物を除去するための中間洗浄工程をさらに含む。
一実施形態においては、対象におけるＣＡＩＸの存在を決定するための、診断方法または予後診断方法のような方法であって、
− 対象、または対象から単離された試料を、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物と接触させる工程、および
− 前記対象中で、または前記試料に結合したＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に対応する値を取得する工程
を含む、前記方法が提供される。
一実施形態においては、前記方法は、対象または試料を接触させた後、および値を取得する前に、結合しなかったポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物を除去するための中間洗浄工程をさらに含む。
一実施形態においては、前記方法は、前記値を参照と比較する工程をさらに含む。前記参照は、例えば、呈色反応に基づいて、数値、閾値または視覚的指標によりスコア化することができる。当業者であれば、当技術分野で公知である参照と比較するための様々な様式が使用にとって好適であり得ることを理解できる。
そのような方法の一実施形態においては、前記対象は、ヒト対象のような哺乳動物対象である。
一実施形態においては、前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実行される。
一実施形態においては、前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。
関連する態様においては、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＣＡＩＸ関連状態の処置方法が提供される。結果として、処置方法において、対象は、本発明によるＣＡＩＸ結合ポリペプチドまたはＣＡＩＸ結合組合せで処置される。前記方法のより特定の実施形態においては、本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＩＸ機能をモジュレートする。
一実施形態においては、前記ＣＡＩＸ関連状態は、腎臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、脳のがん、頭頸部がん、軟部組織肉腫、星状細胞腫、口腔がんならびに低酸素状態およびＣＡＩＸ発現を示す固形腫瘍を呈する任意のがんからなる群から選択されるがんのようながんである。
本発明を様々な例示的な態様および実施形態を参照して説明してきたが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、等価物をその要素に置換することができることを理解できる。さらに、多くの改変を加えて、特定の状況または分子を、本発明の教示に、その本質的な範囲から逸脱することなく適合させることができる。従って、本発明は企図される任意の特定の実施形態に限定されないが、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲内にある全ての実施形態を含むことが意図される。
本発明のＣＡＩＸ結合ポリペプチドに含まれるＣＡＩＸ結合モチーフの例（配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４）、本発明による４９ｍｅｒのＣＡＩＸ結合ポリペプチドの例（配列番号１１４〜２２６および配列番号３４５〜３４９）、本発明による５８ｍｅｒのＣＡＩＸ結合ポリペプチドの例（配列番号２２７〜３３９、配列番号３５０〜３５４および配列番号３６５〜３６８）のアミノ酸配列ならびにＺバリアントＺ０３６３９、Ｚ０３６３８、Ｚ０１１５５、Ｚ０８６９３、Ｚ０１１５７（配列番号３５５〜３５９）および本発明の例示のための選択、スクリーニングおよび特性評価に使用されるＣＡＩＸ（配列番号３６０）のアミノ酸配列の一覧である。 図１Ａの続き。 図１Ｂの続き。 図１Ｃの続き。 図１Ｄの続き。 図１Ｅの続き。 図１Ｆの続き。 図１Ｇの続き。 図１Ｈの続き。 図１Ｉの続き。 図１Ｊの続き。 図１Ｋの続き。 図１Ｌの続き。 実施例２に記載のようなＢｉａｃｏｒｅ装置中で行われる結合分析の結果を示す図である。センサーグラムは、ＣＭ５チップ上の表面上に固定化されたヒトＣＡＩＸ（配列番号３６０）上への示されたＺバリアント（Ｈｉｓ６−（Ｚ＃＃＃＃＃）２−Ｃｙｓ形式）Ｚ０４１８７（配列番号３５０）、Ｚ０４１９１（配列番号３５１）、Ｚ０４１９６（配列番号３５２）、Ｚ０４２０８（配列番号３５３）、Ｚ０４４２１（配列番号３５４）およびＨＢＳ−ＥＰの注入により得られた。 実施例２に記載のようなＬＳ１７４Ｔ細胞上でのＣＡＩＸの免疫蛍光染色の結果を示す図である。細胞を、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４４２１）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ（Ａ）、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４１８７）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ（Ｂ）、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４２０８）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ（Ｃ）および陰性ＺバリアントＨｉｓ６−Ｚ０１１５５−Ｃｙｓ−ＮＥＭ（Ｄ）で染色した。得られる画像は、ＬＳ１７４Ｔ細胞上での膜特異的染色を示す。 実施例５に記載のようなＳＫ−ＲＣ−５２細胞上でのＣＡＩＸの染色の結果を示す図である。成熟およびＣＡＩＸ特異的抗体に由来する１２の示されたＺバリアントを、ＳＫ−ＲＣ−５２細胞への結合について試験した。フローサイトメトリー分析により、１２のＺバリアントの全てが同様の強度でＳＫ−ＲＣ−５２細胞に結合することが示された。ＭＦＩ：平均蛍光強度。 実施例５に記載のようなＳＫ−ＲＣ−５２細胞上でのＣＡＩＸの免疫蛍光染色の結果を示す図である。細胞を、Ｚ０６９３６（配列番号２２７）（Ａ）、陰性Ｚバリアント（Ｂ）およびＣＡＩＸ特異的抗体（Ｃ）で染色した。得られる画像は、ＳＫ−ＲＣ−５２細胞上での膜特異的染色を示す。 実施例７に記載のように決定された、ＣＡＩＸを発現する細胞系ＳＫ−ＲＣ−５２に対する、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１（Ａ）、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２（Ｂ）、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３（Ｃ）、および９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４（Ｄ）の結合特異性の確認を示す図である。細胞関連放射活性を、添加された全放射活性のパーセンテージとして算出した。 図６−１の続き。 ＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片を担持するＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス中での９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の注入後１、４および８時間での、実施例８に記載の生態分布試験の結果を示す図である。放射活性の濃度は％ＩＤ／ｇ（ＧＩ管について以外）として表され、提示されるデータは平均（１時点あたりｎ＝４）±標準偏差である。内容物および残骸（ｃａｒｃａｓｓ）を含む消化管（ＧＩ）に関するデータは、全試料あたりの注入された放射活性の％として提示される。 ＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片を担持するＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス中での１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の注入後６および８時間での、実施例８に記載の生態分布試験の結果を示す図である。データは図７に記載のように提示されるが、１時点あたりのｎ＝３である。 実施例８に記載のような、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の注入後４時間でのＣＡＩＸを発現する異種移植片のガンマカメラ画像化に由来する画像を示す図である。矢印は腫瘍（Ｔ）および腎臓（Ｋ）を示す。
概要
以下の実施例は、ファージディスプレイ技術に基づく、炭酸脱水酵素ＩＸ型（ＣＡＩＸ）を標的とする新規Ｚバリアント分子の開発を開示する。本明細書に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチドを配列決定し、そのアミノ酸配列を、配列番号２２７〜３３９、配列番号３５０〜３５４および配列番号３６５〜３６８の配列識別子と共に図１に列挙する。また、これらの選択された結合バリアントの推定される結合モチーフを、配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４の配列識別子と共に図１に列挙する。
別途注記される場合を除いて、本研究を通して使用されたのは以下の材料である：
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＲＲＩΔＭ１５（Ｒｕｔｈｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：５７６５〜５７７２頁、１９８２）
・大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２００２６８）
・ヒトＣＡＩＸ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１８８−ＣＡ）。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの選択およびスクリーニング
材料および方法
標的タンパク質のビオチン化：ヒトＣＡＩＸを、製造業者の説明書に従って透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ３．５Ｋ、３５００ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３３３）を使用してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）へのバッファー交換にかけた。
ヒトＣＡＩＸを、２０倍モル過剰でＮｏ−Ｗｅｉｇｈ ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３２７）を使用して室温（ＲＴ）で３０分間、製造業者の推奨に従ってビオチン化した。その後のＰＢＳへのバッファー交換を、製造業者の説明書に従って上記のように行った。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：バクテリオファージ上に展示され、本質的にはＧｒｏｎｗａｌｌら（Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２８：１６２〜１８３頁、２００７）に記載のファージミドｐＡＹ０２０４７中で構築されたプロテインＺの無作為バリアントのライブラリーを使用して、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドを選択した。Ｚｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉライブラリーは、融合パートナーとしてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９（配列番号３４６）（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １２：８７３〜８７８頁、１９９９に記載、その中ではＺＴａｑＳ１−１と命名された）を用いた。このライブラリーは、１．４×１０１０のバリアントの実際のサイズを有していた。
ファージストックを、２０ｌの発酵器中で調製した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉを含有するグリセリンストックからの細胞を、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ；３０ｇ／ｌのＴＳＢ、５ｇ／ｌの酵母抽出物）２０ｌ中に接種した。培養物を、発酵器（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ、ＢＲ２０）中、３７℃で増殖させた。細胞が０．７〜０．８の光学密度（ＯＤ）に達した時、約２．６ｌの培養物を、１０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）を使用して感染させた。細胞を３０分間インキュベートし、その際、発酵器に０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（発現の誘導のためのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌカルベニシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥを２０ｌまで充填し、細胞を３０℃で２２時間増殖させた。培養物中の細胞を、１５，９００ｇでの遠心分離によりペレット化し、培地中に残存するファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）中で２回沈降させ、濾過し、Ｇｒｏｎｗａｌｌら、上掲に記載のようにＰＢＳおよびグリセリン中に溶解した。ファージストックを、使用前に−８０℃で保存した。
選択を、２つの異なるトラックに分割されたビオチン化ヒトＣＡＩＸに対して５サイクルで行った。ファージストック調製、選択手順および選択サイクル間のファージの増幅を、本質的にはＷＯ２００９／０７７１７５で別の標的に対する選択について記載されたように行った。０．１％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳを、最初の４サイクル中の選択バッファーとして、０．１％ゼラチンおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳを、５サイクル目中の選択バッファーとして使用した。バックグラウンド結合剤の量を減少させるために、ファージストックをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ＳＡ−ビーズ、Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１１２．０６）と共にＲＴで１時間インキュベートすることにより、予備選択を行った。選択において使用した全てのチューブおよびビーズを、選択バッファーで予めブロッキングした。選択をＲＴで溶液中で行った後、ＳＡ−ビーズ上での標的−ファージ複合体の捕捉を行い、ビオチン化ＣＡＩＸ ４μｇあたりビーズ１ｍｇを使用した。大腸菌株ＲＲＩΔＭ１５を、ファージ増幅のために使用した。選択のサイクル１において、１００ｎＭを使用し、ＰＢＳＴ０．１％（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ）を用いる２回の洗浄を行い、ここで１回目の洗浄は２５分継続し、２回目は１分継続した。標的濃度の低下および洗浄回数の増加を使用する高いストリンジェンシーを、その後のサイクルにおいて適用した。サイクル２においては、５０ｎＭビオチン化ＣＡＩＸを使用し、サイクル３〜５においては、２０ｎＭビオチン化ＣＡＩＸを使用した。サイクル２、３および４において；ＰＢＳＴ０．１％を使用して、２または４、４または８、５または１２回の洗浄をそれぞれ行った。最後の５回目のサイクルにおいて、全てＰＢＳＴ０．５％を使用して、２分で３回の洗浄を行った後、７分で１回の洗浄を行い、最後に２分で１回の洗浄を行った。洗浄した後、結合したファージを０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２ ５００μｌで溶出した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ ５０μｌおよびＰＢＳ ４５０μｌを用いる即時の中和を行った。
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：選択されたＺバリアント分子がＣＡＩＸと実際に相互作用し得ることを検証するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２７８７５２）中の１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地１ｍｌ中に、選択されたものから単一のコロニーを接種することにより、Ｚバリアントを生成した。プレートを３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳＴ０．０５％ ４００μｌ中に再懸濁し、−８０℃で凍結して、細胞のペリプラズム画分を遊離させた。次いで、凍結試料を水浴中で解凍し、細胞を遠心分離によりペレット化した。ペリプラズム上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［Ｚ０３６３９］−ＹＶＰＧと表される、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９との融合物としてＺバリアントを含有していた。Ｚ＃＃＃＃＃は、個々の５８アミノ酸残基のＺバリアントを指す。
ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９０）を、Ｚ０３６３９に特異的な１μｇ／ｍｌのＺバリアント分子（Ｈｉｓ６−（Ｚ０１１５７）２）を含有する５０μｌ／ウェルのコーティングバッファー（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。溶液を捨て、ウェルを、ゆっくりと振とうしながらＲＴで１時間、２％無脂肪乾燥ミルク溶液（Ｓｅｍｐｅｒ ＡＢ）を補充したＰＢＳ−Ｔ０．１ １００μｌでブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、ペリプラズム溶液５０μｌをウェルに添加し、ゆっくりと振とうしながらＲＴで１．５時間インキュベートした。上清を捨て、ウェルをＰＢＳＴ０．０５％で４回洗浄した。次いで、ＰＢＳＴ０．０５％中の０．５または１μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ヒトＣＡＩＸ ５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートをＲＴで１．５時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ０．０５％中で１：５，０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ；Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｐ０３９７）をウェルに添加し、プレートを１時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質５０μｌ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０２１）をウェルに添加し、プレートを製造業者の推奨に従って処理した。ブロッキングから読取りまでの全工程を、Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｆｒｅｅｄｏｍ ２００ロボット（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＬＴＤ）中で行った。ウェルの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーＴｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ ３８４（Ｔｅｃａｎ）中で４５０ｎｍで読み取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ ｖ．５．０ソフトウェア（Ｔｅｃａｎ）を用いて評価した。
陰性対照として、ＰＢＳＴ０．０５％をペリプラズム画分の代わりに使用し、次いで、ビオチン化ＣＡＩＸを使用した。配列決定を、ビオチン化ヒトＣＡＩＸに対する正の吸光度値を有するクローンについて行った。
配列決定：ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいて、陽性と見なされた全クローンの一部を配列決定のために拾った。標準的なＰＣＲプログラムならびにプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ；配列番号３６１）およびＡＦＦＩ−２２（５’−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ；配列番号３６２）を使用して、単一コロニーから２段階でＰＣＲ断片を増幅させた。増幅断片の配列決定を、製造業者のプロトコールに従って使用して、ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ；配列番号３６３）およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３３６９１９）を使用して行った。配列決定反応物を、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（ＮｏｒＤｉａｇ）を使用して磁気ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｅｔａｃｈ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｅａｄｓ、Ｎｏｒｄｉａｇ、カタログ番号２０１２−０１）への結合により精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析した。配列決定の結果を、インポートし、ＡＬＤ ＬＩＭＳ Ｎａｕｔｉｌｕｓ（商標）２００３ Ｒ２ Ｂ３ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて分析した。
結果
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのファージディスプレイ選択：個々のクローンを、ビオチン化ヒトＣＡＩＸに対する４および５サイクルのファージディスプレイ選択後に得た。
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：４および５サイクルの選択後に得られたクローンを、９６ウェルプレート中で生成し、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＣＡＩＸ結合活性についてスクリーニングした。陰性対照の少なくとも２倍に対応するシグナルを示す応答を与える全クローンを、ＣＡＩＸに対する陽性の結合剤と考えた。
配列決定：ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてＣＡＩＸに対する正の吸光度値を有するクローンについて配列決定を行った。各バリアントにユニークな識別番号＃＃＃＃＃を与え、個々のバリアントをＺ＃＃＃＃＃と呼んだ。５８アミノ酸残基長のＺバリアントのアミノ酸配列を、配列番号３５０〜３５４として図１および配列表に列挙する。これらのＺバリアントの推定されるＣＡＩＸ結合モチーフを、配列番号３４０〜３４４として図１および配列表に列挙する。これらのＺバリアントのそれぞれの中で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３４５〜３４９として図１および配列表に列挙する。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの生成および特性評価
材料および方法
Ｚバリアントのサブクローニング：５つのＣＡＩＸ結合Ｚバリアント、Ｚ０４１８７（配列番号３５０）、Ｚ０４１９１（配列番号３５１）、Ｚ０４１９６（配列番号３５２）、Ｚ０４２０８（配列番号３５３）、およびＺ０４４２１（配列番号３５４）のＤＮＡを、ライブラリーベクターｐＡＹ０２０４７から増幅させた。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＣ末端Ｃｙｓを有する二量体Ｚバリアント分子の構築のためのサブクローニング戦略を、標準的な分子生物学手法を使用して、および別の標的に結合するＺバリアントについてＷＯ２００９／０７７１７５に詳述されたように適用した。Ｚ遺伝子断片を、発現ベクターｐＡＹ０１４４９中にサブクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＣを得た。
培養および精製：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの二量体遺伝子断片を含有するプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地８００ｍｌ中、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝２で、ＩＰＴＧを添加して、０．５ｍＭの最終濃度でタンパク質発現を誘導し、培養物をさらに５時間、３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により収獲した。
約１．５ｇの各細胞ペレットを、２９Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１．０１６５４．０００１）を補充した結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）３５ｍｌ中に再懸濁し、細胞を超音波処理により破壊した。細胞破片を遠心分離により除去し、それぞれの上清を、Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１−００３３−９９）１ｍｌ上に加えた。洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することにより夾雑物を除去した後、ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントを溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。それぞれ精製されたＣＡＩＸ結合Ｚバリアント約１ｍｇに対応する画分を、１Ｍ ＤＴＴの添加により３０ｍＭの最終濃度で還元した。還元された二量体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に移した。Ｎ−エチルマレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３０３０）を１０倍モル過剰で添加して、Ｃ末端システインと反応させた後、サイズ排除クロマトグラフィーにより二量体をＰＢＳ（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、０．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に移した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計およびそれぞれのタンパク質の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。ＣＡＩＸ結合Ｚ二量体の純度を、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。それぞれ精製されたＣＡＩＸ結合Ｚ二量体の同一性を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を使用して確認した。
ＣＤ分析：二量体形式の精製されたＺバリアントを解凍し、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。それぞれの希釈されたＺバリアントについて、２５０〜１９５ｎｍでのＣＤスペクトルを２０℃で取得した。さらに、変動温度測定（ＶＴＭ）を行って、融点（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭにおいては、温度を２０℃から９０℃まで、５℃／分の温度勾配で上昇させながら、吸光度を２２１ｎｍで測定した。ＣＤ測定を、１ｍｍの光路長を有するセルを使用してＪａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ）上で行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：５つのＮＥＭ処理されたＨｉｓ６−タグ付二量体ＣＡＩＸ結合ＺバリアントとヒトＣＡＩＸとの相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で分析した。ヒトＣＡＩＸを、ＣＭ５チップ表面（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル中に固定化した。製造業者のプロトコールに従ってアミンカップリング化学を使用して固定化を行った。チップ上の１つのフローセル表面を活性化し、分析物注入中にブランクとしての使用のために脱活性化した。分析物、すなわち、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で最終濃度１μＭに希釈した二量体Ｚバリアントを、１０μｌ／分の流速で５分間注入した。解離の５分後、表面を、１０ｍＭ ＨＣｌの１回の注入を用いて再生した。結果を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で分析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線から差し引いた。
フローサイトメトリー分析のための免疫蛍光染色：表面上にＣＡＩＸを発現する、結腸直腸癌腫細胞ＬＳ１７４Ｔを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ）を補充したＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。アッセイの日に、ＬＳ１７４Ｔ細胞をトリプシン処理し、計数し、０．１〜０．２×１０６個の細胞を５ｍｌファルコンチューブに添加した。細胞を１２００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、上清を除去した。細胞を、Ｈｉｓ６−（Ｚ＃＃＃＃＃）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ形態の様々な精製されたＺバリアントで染色した。スクリーニングのために、２％ＦＣＳを補充したＰＢＳ（ＰＢＳ２％ＦＣＳ）中で１０μｇ／ｍｌに希釈した様々な結合剤１００μｌを添加し、細胞を４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳをバックグラウンド対照として使用し、非関連Ｚバリアント（Ｚ０３６３８（配列番号３５６））を陰性対照として使用した。ＰＢＳをチューブに充填し、遠心分離により細胞をペレット化することにより、細胞を１回洗浄した。ペレット化された細胞を、５μｇ／ｍｌヤギ抗ＺバリアントＩｇ（カタログ番号２０．１０００．０１．０００５；Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ、スウェーデン）１００μｌ中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。ヤギ抗ＣＡＩＸ特異的抗体ＭＡＢ２１８８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照として使用した。続いて、細胞を記載のようにＰＢＳ中で洗浄し、１０μｇ／ｍｌの濃度のＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌ中に再懸濁した。４℃で４５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ ３００μｌ中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏｌｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリー分析にかけた。
フローサイトメトリー分析の後、細胞をガラススライドに添加し、ＲＴで１５分間、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド中で固定した。ＰＢＳ中で注意深く洗浄した後、スライドを乾燥し、抗退色溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せた。Ｌｅｉｃａ ＤＭ−ＬＡ ＵＶ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色を分析した。
結果
培養および精製：５つのＣＡＩＸ結合Ｚバリアント、Ｚ０４１８７、Ｚ０４１９１、Ｚ０４１９６、Ｚ０４２０８およびＺ０４４２１は、二量体として構築され、Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグおよびＣ末端Ｃｙｓを含み、大腸菌中で良好に発現した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより分光光度的に決定された、細菌ペレット約１．５ｇからのＩＭＡＣ精製されたタンパク質の量は、様々なＣＡＩＸ結合Ｚ二量体について１５ｍｇ〜２４ｍｇの範囲であった。
それぞれの最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、これらのものが主にそれぞれのＣＡＩＸ結合Ｚ二量体を含有することが示された。それぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの正確な分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により確認した。
ＣＤ分析：ＣＤスペクトルにより、Ｚバリアント分子が２０℃でαヘリックス構造を有することが示された。この結果は、融点（Ｔｍ）を決定する変動温度測定においても検証された（表１）。
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：５つの二量体Ｚバリアント（Ｚ０４１８７、Ｚ０４１９１、Ｚ０４１９６、Ｚ０４２０８およびＺ０４４２１）のヒトＣＡＩＸへの結合を、ＣＡＩＸを含有する表面上にＺバリアントを注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ装置中で試験した。表面上でのリガンド固定化レベルは、５９０ＲＵのヒトＣＡＩＸであった。試験したＺバリアントは全て、ＣＡＩＸへの結合を示した。得られる曲線を図２に示し、ここでＺ０４１９６がヒトＣＡＩＸに対する最も遅い解離曲線を示した。
フローサイトメトリー分析のための免疫蛍光染色：ＬＳ１７４Ｔ細胞を、一次結合剤Ｈｉｓ６−（Ｚ０４１８７）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４１９１）２−Ｃｙｓ
−ＮＥＭ、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４１９６）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４２０８）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭおよびＨｉｓ６−（Ｚ０４４２１）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭを用いて染色した。ＣＡＩＸ特異的抗体を陽性対照として含めた。全ての結合剤は、フローサイトメトリー分析において陽性であり、平均蛍光強度（ＭＦＩ）のシフトが見られた。蛍光顕微鏡観察による細胞の検査により、様々な強度でＬＳ１７４Ｔ細胞上での膜特異的染色が示された。図３は、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４１８７）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭ、Ｈｉｓ６−（Ｚ０４２０８）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭおよびＨｉｓ６−（Ｚ０４４２１）２−Ｃｙｓ−ＮＥＭによる膜染色を示す。単量体形式での非関連Ｚバリアント、Ｈｉｓ６−Ｚ０１１５５−Ｃｙｓ−ＮＥＭ（配列番号３５７）を、陰性対照として使用した（図３）。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの成熟ライブラリーの設計および構築
本実施例では、成熟ライブラリーを構築した。このライブラリーを、ＣＡＩＸ結合ポリペプチドの選択のために使用した。成熟ライブラリーからの選択は通常、親和性が高い結合剤をもたらすと予想される（Ｏｒｌｏｖａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６、６６（８）：４３３９〜４８頁）。この研究では、無作為化二本鎖リンカーを、ライゲーションを使用するトリヌクレオチド構成要素の無作為化されたセットの組込みおよびその後構築される二本鎖ＤＮＡの制限を可能にする、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術により作成した。
材料および方法
ライブラリー設計：ライブラリーは、実施例１および２に記載のヒトＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの配列の選択に基づいていた。新しいライブラリーにおいて、Ｚ分子足場中の１３の可変位置を、配列番号３５０〜３５４（Ｚ０４１８７、Ｚ０４１９１、Ｚ０４１９６、Ｚ０４２０８およびＺ０４４２１）に定義されたＺバリアント配列に主に基づく戦略に従って、ある特定のアミノ酸残基に向かって偏らせた。制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩに隣接した、アミノ酸配列５’−ＡＡ ＡＴＡ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＡＣ ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＡＲ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＲ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＡＲ ＡＴＹ ＮＮＮ ＮＮＮ ＹＴＲ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＴＡ ＡＣＳ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＡＲ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＣＭ ＴＴＣ ＡＴＣ ＮＮＮ ＡＡＡ ＴＴＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＴＴ Ａ−３’（配列番号３６４；無作為のコドンをＮＮＮとして例示する）の１４７ｂｐの部分的に無作為化されたヘリックス１および２を含有する、二本鎖ＤＮＡのＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーを、Ｓｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ（Ｐｕｃｈｅｉｍ、ドイツ）から注文した。１２の可変Ｚ位置を含む新しいライブラリー中のアミノ酸残基の理論的分布を、表２に与える。
ライブラリーの構築：１２サイクルのＰＣＲ中にＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１８１６）を使用してライブラリーを増幅し、プールされた生成物を、供給業者の推奨に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８１０６）を用いて精製した。無作為化されたライブラリー断片の精製されたプールを、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４６Ｌ、およびカタログ番号Ｒ０１５６Ｌ）で消化し、ＰＣＲ精製キットを使用して濃縮した。続いて、生成物を分離用１％アガロースゲル電気泳動上で泳動し、供給業者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８７０６）を使用して精製した。
ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２（本質的にはＧｒｏｎｗａｌｌら、上掲に記載のｐＡｆｆｉ１である）を、同じ酵素で制限処理し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈降を使用して精製した。制限処理された断片および制限処理されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）を用いて、ＲＴで２時間、５：１のモル比でライゲートした後、４℃で一晩インキュベートした。ライゲートされたＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈降により回収した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中に溶解した。かくして、得られるライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２は、連鎖球菌プロテインＧから誘導されるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）にそれぞれ融合されたＺバリアントのライブラリーをコードした。
ライゲーション反応（約１５０ｎｇのＤＮＡ／形質転換）を、エレクトロコンピテントな大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞（１００μｌ）中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後、ＳＯＣ培地（ＴＳＢ−ＹＥ培地、１％グルコース、５０μＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＭｇＳＯ４、５０μＭ ＮａＣｌおよび１２．５μＭ ＫＣｌ）約１ｍｌを添加した。形質転換された細胞を、３７℃で５０分間インキュベートした。試料を力価測定および形質転換体の数の決定のために取った。その後、細胞をプールし、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地１０ｌ中、３６℃で一晩培養した。細胞を４，０００ｇで１５分間ペレット化し、ＰＢＳ／グリセリン溶液（グリセリン約４０％）中に再懸濁した。細胞をアリコートにし、−８０℃で保存した。内容物を検証し、ライブラリー設計に対する構築されたライブラリーの結果を評価するために、Ｚバリアントのライブラリーからのクローンを配列決定した。配列決定を実施例１に記載のように行い、アミノ酸分布を検証した。
ファージストックの調製：ファージミドライブラリーを含有するファージストックを、２０ｌの発酵器中で調製した。ファージミドライブラリーを含有するグリセリンストックからの細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した規定のプロリン非含有培地［リン酸水素二カリウム７ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／ｌ、ウラシル０．０２ｇ／ｌ、ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏアミノ酸、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）６．７ｇ／ｌ、グルコース一水和物５．５ｇ／ｌ、Ｌ−アラニン０．３ｇ／ｌ、Ｌアルギニン一塩酸塩０．２４ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１１ｇ／ｌ、Ｌシステイン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．３ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン０．１ｇ／ｌ、グリシン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−リシン一塩酸塩０．２５ｇ／ｌ、Ｌ−メチオニン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．２ｇ／ｌ、Ｌセリン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−トレオニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−チロシン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−バリン０．１ｇ／ｌ］２０ｌ中に接種した。ＯＤ６００が０．７５に達するまで培養物を３７℃で発酵器（Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ、ＢＲ２０）中で増殖させた。以後の工程は全て、ライブラリーＺｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉに関する実施例１に記載のように行った。培養後、細胞を１５，９００ｇでの遠心分離によりペレット化した後、培地中に残存するファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ中で２回沈降させ、濾過し、実施例１に記載のようにＰＢＳおよびグリセリン中に溶解した。ファージストックを、選択における使用まで−８０℃で保存した。
結果
ライブラリー構築：新しいライブラリーを、検証された結合特性を有するＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのセットに基づいて設計した（実施例１および実施例２）。設計されたライブラリーの理論的サイズは、１．０×１０１０のＺバリアントであった。大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５細胞への形質転換後の力価測定により決定された、ライブラリーの実際のサイズは、１．３×１０１０の形質転換体であった。
９４の形質転換体を配列決定し、その実際の配列を理論的設計と比較することにより、ライブラリーの品質を試験した。設計されたライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は十分なものであることが示された。設計されたアミノ酸配列中の固定された位置（位置３５におけるＷ）は、予想されるアミノ酸のみがその位置に存在する点で実際の配列に反映されていた。かくして、ヒトＣＡＩＸ結合ポリペプチドに対する潜在的な結合剤の成熟ライブラリーが上手く構築された。
成熟ライブラリーからのＺバリアントの選択、スクリーニングおよび特性評価
材料および方法
ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：標的タンパク質ヒトＣＡＩＸを、実施例１に記載のようにビオチン化した。実施例３に記載のＺバリアント分子の新しいライブラリーを使用して、本質的には実施例１に記載のようにＣＡＩＸに対してファージディスプレイ選択を行った。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを、１回目のサイクルにおけるファージ増幅のために使用し、ＲＲＩΔＭ１５をその後のサイクルにおいて使用した。選択を、２つの平行トラックにおいて最初に行った。一方のトラックにおいては、選択の時間は２〜３時間であったが、他方のトラックにおいては、１０分の選択時間を使用した。後者のトラックにおいて、標的を選択前にＳＡ−ビーズ上に固定化した。これらの２つのトラック（１および２）を、２回目のサイクルにおいてさらに分割し、標的濃度および洗浄条件が異なる合計６つのトラックを得た（１ａ〜ｃおよび２ａ〜ｃ）。選択を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＰＢＳＴ０．１％中で合計４サイクルで行った。選択のサイクル１においては、５０ｎＭヒトＣＡＩＸを使用し、ＰＢＳＴ０．１％を用いる３回の洗浄を行った。標的濃度の低下および洗浄回数の増加を使用する高いストリンジェンシーを、その後の３回のサイクルにおいて適用した。サイクル２および３においては；１３、１３または１０ｎＭ ＣＡＩＸを使用し、サイクル４においては；４．４、４．４または０．５ｎＭ ＣＡＩＸを使用した。サイクル２および３においては；６、１１または１１回の洗浄を行った；サイクル４においては；９、１８または１８回の洗浄をＰＢＳＴ０．１％を使用して行った。
潜在的な結合剤の配列決定：異なる選択トラックからの個々のクローンを、配列決定のために拾った。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて実行した全てのクローンを配列決定した。遺伝子断片の増幅および遺伝子断片の配列分析を、本質的には実施例１に記載のように行った。
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｚバリアント（実施例３に記載のようにＺバリアントＡＢＤ融合タンパク質として発現する）を含有する単一のコロニーを、ＣＡＩＸ成熟ライブラリーの選択されたクローンから無作為に拾い、実施例１に記載のように培養物１ｍｌ中で増殖させた。ペリプラズムタンパク質を、６回反復凍結−解凍サイクルにより遊離させた。ＥＬＩＳＡスクリーニングを、以下の例外で本質的には実施例１に記載のように行った。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティングバッファー中に希釈した２μｇ／ｍｌのＡＢＤ特異的ヤギ抗体（社内で生成）で被覆した。抗体溶液を捨て、ウェルをＲＴで１．５時間、ＰＢＳＣ（０．５％カゼインを補充したＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ８６５４）１００μｌでブロッキングした。ビオチン化ヒトＣＡＩＸを、ＰＢＳＣ中に希釈した０．２５μｇ／ｍｌ（６ｎＭ）の濃度で使用し、インキュベーションを１時間行った。ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号Ｎ１００）から取得し、ＰＢＳＣ中で１：３０，０００に希釈した後、ウェルに添加し、４５分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２１）５０μｌをウェルに添加し、プレートを製造業者の推奨に従って処理した。ウェルの吸光度を、マルチウェルプレートリーダーＶｉｃｔｏｒ３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍで測定した。無関係のタンパク質に結合するＺバリアントを陰性対照として使用し、ペリプラズム工程を省略することによってブランクを作出した。
ＣＡＩＸ結合剤のＥＬＩＳＡ ＫＤ分析：ＣＡＩＸ結合剤の選択を、上記のようにＥＬＩＳＡを使用してビオチン化ヒトＣＡＩＸの希釈系列に対する応答の分析にかけた。全てのペリプラズム試料を、ＰＢＳＴ０．０５％中で１：１に希釈した。ビオチン化タンパク質を、１μｇ／ｍｌ（２４ｎＭ）の濃度で添加し、１．６ｎｇ／ｍｌ（３８ｐＭ）まで下方に１：５に段階的に希釈した。バックグラウンド対照として、標的タンパク質を添加していない全てのＺバリアントもアッセイした。Ｚバリアントを含有しないペリプラズム試料も、陰性対照として含めた。取得された値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５および非線形回帰を使用して分析した。
結果
ＣＡＩＸ結合ポリペプチドのファージディスプレイ選択：選択を、それぞれ４サイクルを含有する合計６つの平行トラック中で行った。異なる選択トラックは、以下のように選択時間、標的濃度および洗浄条件において異なっていた：１ａ）２〜３時間の選択時間、高濃度、数回の洗浄、１ｂ）２〜３時間の選択時間、高濃度、激しい洗浄、１ｃ）２〜３時間の選択時間、低濃度、激しい洗浄、２ａ）１０分の選択時間、高濃度、数回の洗浄、２ｂ）１０分の選択時間、高濃度、激しい洗浄、および２ｃ）１０分の選択時間、低濃度、激しい洗浄。それぞれのラウンドにおいて、全てのトラックは溶出液中に十分な量のファージ粒子を与えた。最も高い標的濃度および２〜３時間の選択時間である、トラック１ａおよびｂにおいてはほとんどのファージ粒子が見出された。
配列決定：無作為に拾ったクローン（２７９）を配列決定した。それぞれ個々のＺバリアントは、実施例１に記載のように識別番号Ｚ＃＃＃＃＃を与えられた。合計で、１１３の新しいユニークなＺバリアント分子が同定された。配列決定されたクローンのうち、２５の配列が２回またはそれ以上出現した。
５８のアミノ酸残基長のＺバリアントのアミノ酸配列を、配列番号２２７〜３３９として図１および配列表に列挙する。これらのＺバリアントの推定されるＣＡＩＸ結合モチーフを、配列番号１〜１１３として図１および配列表に列挙する。これらのＺバリアントのそれぞれの中で完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１１４〜２２６として図１および配列表に列挙する。
ＺバリアントのＥＬＩＳＡスクリーニング：４回の選択サイクルの後に得られたクローンを、９６ウェルプレート中で生成し、ＥＬＩＳＡを使用してヒトＣＡＩＸ結合活性についてスクリーニングした。無作為に拾ったクローンの全てを分析した。２０１のユニークなＺバリアントのうちの１１３が、０．２５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＣＡＩＸに対して陰性対照の３倍またはそれより高い（０．３〜３．０ＡＵ）近似応答を与えることがわかった。全ての選択トラックからのクローンが、陽性シグナルを示した。陰性対照は、約０．１ＡＵの吸光度を有していた。
ＣＡＩＸ結合剤のＥＬＩＳＡ ＫＤ分析：Ｚバリアントのサブセットを、上記のＥＬＩＳＡ実験における結果（１．０ＡＵを超える吸光度）に基づいて選択し、ＥＬＩＳＡ形式での標的力価測定にかけた。ペリプラズム試料を、ビオチン化ＣＡＩＸの連続希釈液と共にインキュベートした。Ｚバリアントを含まないペリプラズム試料も陰性対照としてアッセイした。取得された値を分析し、そのそれぞれのＫＤ値を算出した（表３）。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのサブセットのサブクローニング、生成および特性評価
材料および方法
発現ベクター中へのＺバリアント分子のサブクローニング：配列分析およびヒトＣＡＩＸに対する力価測定ＥＬＩＳＡにおける性能に基づいて、１２のクローンを、発現ベクターｐＡＹ０１４４８中へのサブクローニングのために選択した。最良の一次結合剤を、サブクローニング中に含めた。単量体Ｚバリアント断片を、ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２から増幅させ、ｐＡＹ０１４４８中へのサブクローニングを、実施例２に記載のように行い、タンパク質配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤをコードするベクターを得た。
タンパク質の発現および精製：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの遺伝子断片を含有するプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地８００ｍｌ中、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝２で、ＩＰＴＧを添加して、０．１７ｍＭの最終濃度でタンパク質発現を誘導し、培養物をさらに５時間、３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により収獲した。
それぞれの細胞ペレット約１．５ｇを、２９Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を補充した結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）３５ｍｌ中に再懸濁し、超音波処理により細胞を破壊した。細胞破片を、遠心分離により除去し、それぞれの上清をＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１ｍｌ上に加えた。洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することにより夾雑物を除去した後、ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントを溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。それぞれのＺバリアントを、サイズ排除クロマトグラフィーによりＰＢＳ（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、０．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に移した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計およびそれぞれのタンパク質の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。それぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの純度を、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。それぞれの精製されたＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの同一性を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を使用して確認した。
フローサイトメトリー分析のための免疫蛍光染色：ＳＫ−ＲＣ−５２細胞（腎明細胞癌腫細胞系；Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデンにより寄贈された）を、１０％ＦＣＳ、１％グルタミンおよび１％ＰＥＳＴ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。アッセイの日に、ＳＫ−ＲＣ−５２細胞をトリプシン処理し、計数し、０．１〜０．２×１０６個の細胞を５ｍｌファルコンチューブに添加した。細胞を１２００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、上清を除去した。細胞を、単量体形式の以下の成熟Ｚバリアント；Ｚ０６９１９、Ｚ０６９３６、Ｚ０６９４２、Ｚ０６９５９、Ｚ０６９６１、Ｚ０６９７６、Ｚ０６９８４、Ｚ０６９８６、Ｚ０６９９９、Ｚ０７０８４、Ｚ０７０８９およびＺ０７０９１で染色した。スクリーニングのために、ＰＢＳ２％ＦＣＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈した１２の異なる結合剤１００μｌを添加し、細胞を４℃で２時間インキュベートした。あるいは、結合剤を、４つの異なる濃度：２、０．５、０．０５および０．００３μｇ／ｍｌでＥＣ５０値算出のために力価測定した。実施例１で同定されたＺバリアントＺ０４１９６に対応するが、アミノ酸置換Ａ５４Ｓを有するＺバリアントＺ０８６９３を、比較のためにアッセイに含めた。非関連標的に結合するＺバリアントを陰性対照として使用し、ＰＢＳをバックグラウンド対照として使用した。ＰＢＳをチューブに充填し、遠心分離により細胞をペレット化することにより、細胞を１回洗浄した。ペレット化された細胞を、ヤギ抗Ｚバリアント特異的Ｉｇ、５μｇ／ｍｌ １００μｌ中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。ヤギ抗ＣＡＩＸ特異的抗体ＭＡＢ２１８８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照として含めた。続いて、細胞を記載のようにＰＢＳ中で洗浄し、１０μｇ／ｍｌの濃度のＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌ中に再懸濁した。４℃で４５分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ ３００μｌ中に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏｌｌを使用するＦＡＣＳ分析にかけた。ＭＦＩを記録した。
顕微鏡観察のための免疫蛍光染色：ＳＫ−ＲＣ−５２細胞を、マルチウェルスライド（Ｈｉｓｔｏｌａｂ、８ウェル／スライド）上に播種し、インキュベータ中で一晩、完全培地中で培養した。次の日、細胞をＲＴで１５分間、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒド中に固定した。スライドあたり約２〜３ｍｌのＰＢＳを使用して注意深く洗浄することにより、ホルムアルデヒドを除去した。細胞を、成熟Ｚバリアント、非関連結合剤（陰性対照）またはＰＢＳ２％ＦＣＳ（バックグラウンド対照）で染色した。ＰＢＳ２％ＦＣＳ中、０．５μｇ／ｍｌに希釈した結合剤５０μｌを、マルチウェルスライド上の選択されたウェルに添加した。細胞をＲＴで２時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回、注意深く洗浄した。ヤギ抗ＺバリアントＩｇ（ＰＢＳ２％ＦＣＳ中の５μｇ／ｍｌ）と共に１．５時間インキュベートすることにより、Ｚバリアントを検出した。ＣＡＩＸ特異的抗体ＭＡＢ２１８８（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度で陽性対照として含めた。Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヤギ抗体（ＰＢＳ２％ＦＣＳ中の１０μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした後、スライドをＰＢＳ中で注意深く洗浄し、乾燥し、抗退色溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せた。染色を、デジタルカメラを装備したＬｅｉｃａ ＤＭ−ＬＡ ＵＶ顕微鏡を用いて分析した。代表的な写真をそれぞれ個々の結合剤について撮影した。
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：４つのＨｉｓ６タグ付ＣＡＩＸ結合Ｚバリアント（Ｚ０６９３６、Ｚ０６９４２、Ｚ０６９７６およびＺ０７０８４）と、ヒトＣＡＩＸとの相互作用を、本質的には実施例２に記載のようにＢｉａｃｏｒｅ ２０００装置中で分析した。分析物、すなわち、Ｚバリアントを、１０、３０、９０、２７０および８１０ｎＭの最終濃度までＨＢＳ−ＥＰ泳動バッファー中でそれぞれ希釈し、３０μｌ／分の流速で５分間注入した。解離の５分後、表面をグリシン、ｐＨ３ １ｍｌの２回の注射により再生した。結果を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。
結果
タンパク質の発現および精製：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを含む、一次選択に由来する結合剤Ｚ０４１９６に対応するが、アミノ酸置換Ａ５４Ｓを含有する結合剤Ｚ０８６９３、および１２の成熟ＣＡＩＸ結合Ｚバリアント：Ｚ０６９１９（配列番号２３２）、Ｚ０６９３６（配列番号２２７）、Ｚ０６９４２（配列番号２２８）、Ｚ０６９５９（配列番号２３３）、Ｚ０６９６１（配列番号２３４）、Ｚ０６９７６（配列番号２２９）、Ｚ０６９８４（配列番号２３６）、Ｚ０６９８６（配列番号２３７）、Ｚ０６９９９（配列番号２３８）、Ｚ０７０８４（配列番号２３１）、Ｚ０７０８９（配列番号２３９）、およびＺ０７０９１（配列番号２３０）は、大腸菌中で良好に発現した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより分光光度的に決定された、細菌ペレット約１．５ｇからのＩＭＡＣ精製されたタンパク質の量は、様々なＣＡＩＸ結合Ｚバリアントについて２ｍｇ〜２２ｍｇの範囲であった。
それぞれの最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、これらのものが主にそれぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントを含有することが示された。それぞれのＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの正確な分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳにより確認した。
フローサイトメトリー分析および顕微鏡観察のための免疫蛍光染色：ＳＫ−ＲＣ−５２細胞を、１２の異なる成熟結合剤Ｚ０６９１９、Ｚ０６９３６、Ｚ０６９４２、Ｚ０６９５９、Ｚ０６９６１、Ｚ０６９７６、Ｚ０６９８４、Ｚ０６９８６、Ｚ０６９９９、Ｚ０７０８４、Ｚ０７０８９およびＺ０７０９１で染色した。ＣＡＩＸ特異的抗体ＭＡＢ２１８８を、陽性対照として含めた。染色の強度を、フローサイトメトリーを用いて分析した。１２の異なる結合剤に関する幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれ図４に示す。全てのＣＡＩＸ特異的Ｚバリアントが、対照抗体と比較して約半分のＭＦＩ値でＳＫ−ＲＣ−５２細胞に同等に良好に結合するように見えた。しかしながら、前記抗体は２つの結合部位を有し、かなりより大きく（１５０ｋＤａ）、かくして、相対的に小さいＺバリアント（６ｋＤａ）と比較して蛍光標識された第２の工程の抗体（抗ヤギＩｇ Ａｌｅｘａ４８８）の結合にとって利用可能なより多くの部位が存在する。１２のＺバリアントの結合を互いに分離するために、力価測定を行った。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍおよび非線形回帰式を使用して、ＥＣ５０値を算出した。結合剤のＥＣ５０値は、３７ｎＭのＥＣ５０を有していたＺ０７０８４を除いて、１０〜２０ｎＭであった（表４）。Ｚ０８６９３に関する算出されたＥＣ５０値は、約１８００ｎＭであり、これは成熟が約１００倍の結合能力の増加をもたらしたことを示している。
結合の特異性を、蛍光顕微鏡観察を用いて調査したところ、全ての結合剤が陽性対照と類似するパターンでＳＫ−ＲＣ−５２細胞の細胞表面に結合していた。図５は、１２全部の結合剤の代表である、Ｚ０６９３６（配列番号２２７）の膜染色を示す。かくして、結合は形態的に正確であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：Ｈｉｓ６タグ付ＣＡＩＸ結合ＺバリアントＺ０６９３６、Ｚ０６９４２、Ｚ０６９７６およびＺ０７０８４と、ヒトＣＡＩＸとの相互作用を、様々な濃度のＺバリアントを、固定化されたＣＡＩＸを含有する表面上に注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ装置において分析した。１：１相互作用モデルを使用するＣＡＩＸに対するＺバリアントの結合に関する見かけの動的パラメータ（ＫＤ、ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ））の概要を、以下の表５に与える。
ＣＡＩＸ結合Ｚバリアントの放射標識および特性評価
本実施例は、それぞれ、Ｚ０６９３６（配列番号２２７）、Ｚ０６９４２（配列番号２２８）、Ｚ０６９７６（配列番号２２９）およびＺ０７０８４（配列番号２３１）のＢＭと同一であるＣＡＩＸ結合モチーフ（ＢＭ）を有するが、「ＶＤ」の代わりに「ＡＥ」により始まり、ならびにＨｉｓ６タグの代わりにＮ末端（ＨＥ）３タグが前にあるＺポリペプチドを有する、４つのＣＡＩＸ結合Ｚバリアント、Ｚ０９７８１（配列番号３６５）、Ｚ０９７８２（配列番号３６６）、Ｚ０９７８３（配列番号３６７）およびＺ０９７８４（配列番号３６８）の生成、放射標識および特性評価を記載する。
材料および方法
Ｚバリアントのクローニングおよび生成：Ｎ末端ＨＥＨＥＨＥタグを用いるＺバリアント分子の構築のためのサブクローニング戦略を、標準的な分子生物学手法を使用して、および別の標的に結合するＺバリアントについてＷＯ２００９／０７７１７５に詳述されたように適用した。Ｚ遺伝子断片を発現ベクターｐＡＹ０３０８６中にサブクローニングして、コードされる配列ＨＥＨＥＨＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを得た。大腸菌中での生成およびＩＭＡＣによる精製を、本質的には実施例５に記載のように行った。逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を使用してさらなる精製を行い、バッファーをＰＢＳに交換した。
［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］＋および１２５ＩによるＺバリアントの標識：［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３］＋を用いる（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３および（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４バリアントの放射標識を、Ｏｒｌｏｖａら（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４７：５１２〜５１９頁、２００６）およびＴｏｌｍａｃｈｅｖら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、２１：２０１３〜２０２２頁、２０１０）により以前に記載されたように行った。簡単に述べると、０．９％ＮａＣｌ中の９９ｍＴｃＯ４ −溶出液４００〜５００μｌ（約３ＧＢｑ）（ＵｌｔｒａＴｅｃｈｎｅＫｏｗジェネレータ（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）から溶出された過テクネチウム酸）を、凍結乾燥したＩｓｏＬｉｎｋキット（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に添加した。混合物を１００℃で３０分間インキュベートした。その後、混合物４０μｌを、ＰＢＳ ４０μｌ中のそれぞれのＺバリアント１００μｇを含有するバイアルに移した。インキュベーションを、５０℃で合計１２０分間行った。
放射化学標識収率を、ＩＴＬＣ １５０−７７１ ＤＡＲＫ ＧＲＥＥＮストリップ（Ｔｅｃ−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙストリップ、Ｂｉｏｄｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、試料１μｌを加えて６０および１２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで溶出した後に薄層クロマトグラフィーにより分析した。
Ｎ−スクシンイミジル−パラ−（トリメチルスタニル）−ベンゾエート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用する（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３および（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４バリアントの間接的放射性ヨード化を、Ｏｒｌｏｖａら（Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．５０：４１７頁、２００９）により以前に記載されたように行った。
放射標識されたＺバリアントを、ＰＢＳで予め平衡化されたＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した後、溶出にも使用した。それぞれの調製物の純度を、上記のような薄層クロマトグラフィーを使用して評価した。
ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）結合分析：ＣＡＩＸを発現する腎明細胞癌腫細胞系ＳＫ−ＲＣ−５２を、細胞培養皿（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、サイズ １００６２０、ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）の局部エリアに播種した。生細胞への９９ｍＴｃ標識Ｚバリアントの結合を、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）Ｙｅｌｌｏｗ（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スウェーデン）および確立された方法（Ｂｊｏｒｋｅｌｕｎｄら、Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔ．６８：２３７２〜６頁、２０１０）を使用して４℃でリアルタイムでモニタリングした。適切な親和性の見積もりにとって必要とされる濃度スパンをカバーするために、それぞれの放射標識Ｚバリアントを様々な濃度：９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１（３０、９０、および１５０ｎＭ）、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２（６および１８ｎＭ）、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３（２、６、および１８ｎＭ）、ならびに９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４（６、１２、および２４ｎＭ）で添加した。動的パラメータを、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定した。
結果
放射標識：全てのＺバリアントを、それぞれ、９９ｍＴｃおよび１２５Ｉで効率的に標識した。［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３・（Ｈ２Ｏ）３］の（ＨＥ）３タグ付Ｚバリアントへのカップリングは、時間依存的であった。Ｚバリアントと、カルボニル−テクネチウム複合体との５０℃でのインキュベーションにより、６０分後に５０〜６５％の収率および１２０分後に７０〜８０％の収率が得られた。使い捨てＮＡＰ−５カラムを用いる精製後に、テクネチウム標識されたバリアントの放射化学純度は９９．５％を超えていた。１２５Ｉ−ＰＩＢ−（ＨＥ）３標識されたＺバリアントの全体的収率は、１４〜２８％であった。ＮＡＰ−５カラムを使用する精製後の１２５Ｉ−ヨード化Ｚバリアントの放射化学純度は、９７％を超えていた。
ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）結合分析：ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）Ｙｅｌｌｏｗを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＡＩＸを発現するＳＫ−ＲＣ−５２細胞に対する９９ｍＴｃ−標識Ｚバリアントの動的測定により、ＣＡＩＸに対するその高い親和性が放射標識後にも保持されることが確認された。データ分析により、生きているＣＡＩＸを発現する細胞への放射標識コンジュゲートの結合が、９９ｍＴｃ−標識（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３および（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４構築物に関する２つの結合事象により媒介されることが示された。ＣＡＩＸを発現する細胞へのＺバリアントの結合に関する見かけの動的パラメータ（ＫＤ、ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ））の概要を、表６に与える。
放射標識されたＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合特異性および細胞プロセシング
９９ｍＴｃ−標識（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２、（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３および（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４バリアントの結合特異性および細胞プロセシング試験を、腎明細胞癌腫ＳＫ−ＲＣ−５２細胞系を使用して行った。
材料および方法
ＣＡＩＸ受容体に対する９９ｍＴｃ−標識Ｚバリアントの特異性およびその細胞プロセシングを、ＷａｌｌｂｅｒｇおよびＯｒｌｏｖａ（Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２３：４３５〜４４２頁、２００８）により記載されたように査定した。簡単に述べると、それぞれの放射標識されたＺバリアントについて、ＳＫ−ＲＣ−５２細胞（約１×１０６細胞／皿）の単層を含有する３つの皿の別々のセットを、１００倍過剰の同じ未標識Ｚバリアントポリペプチドまたは試験に含まれた他の３つのＺバリアントのうちの１つで予め飽和させた。未標識のＺバリアントとのインキュベーションを、それぞれ、放射標識されたコンジュゲート：１３ｎＭ ９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１、６１ｎＭ ９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８２、４５ｎＭ ９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８３、および９０ｎＭ ９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８４の添加の前に１５分間行った後、加湿インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で１時間インキュベートした。その後、培地を収集し、細胞を冷無血清培地で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン、バッファー中の０．０２％ＥＤＴＡ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を添加した。剥離した細胞を１０分後に収集した。細胞および培地の放射活性を、３インチＮａＩ（Ｔｌ）検出器を備えた自動化ガンマカウンター（１４８０ＷＩＺＡＲＤ、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）を使用して測定し、細胞に結合した放射活性のパーセンテージを算出した。
細胞プロセシングを評価するために、ＳＫ−ＲＣ−５２細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、放射標識されたＺバリアントと共にインキュベートした。指定された時点（１、２、４、８および２４時間）で、３つの皿のセットをインキュベータから取り出し、培地を収集し、細胞を氷冷無血清培地で洗浄した。次いで、細胞を、尿素４Ｍを含有する０．２Ｍグリシンバッファー、ｐＨ２ ０．５ｍｌで、氷上で５分間処理した。酸性溶液を収集し、細胞をグリシンバッファー０．５ｍｌで洗浄した。酸性画分をプールした。次いで、細胞を、３７℃で少なくとも２０分間、１Ｍ ＮａＯＨ ０．５ｍｌと共にインキュベートした。細胞破片を収集し、皿をＮａＯＨ溶液０．５ｍｌでさらに洗浄した。アルカリ画分をプールした。酸性溶液中の放射活性を、膜結合と考え、アルカリ画分中の放射活性を内在化と考えた。
結果
未標識のＺバリアントを使用する受容体の飽和後に、ＣＡＩＸを発現するＳＫ−ＲＣ−５２細胞への９９ｍＴｃ−標識Ｚバリアントの結合の有意な（ｐ＜０．００５）減少が観察されたが、これは、放射標識されたバリアントの結合が受容体媒介性であったことを示唆している（図６）。さらに、試験に含まれた他の３つのバリアントのそれぞれを使用して各バリアントの結合を遮断することができたが、これは、それらが全てＣＡＩＸ上の同じ部位に結合することを示している（図６）。
細胞プロセシング試験により、全ての放射性コンジュゲートの内在化が、アッセイを通じて相対的に低く、わずかに増加することが示された。２４時間のインキュベーション後のＳＫ−ＲＣ−５２細胞による内在化された放射活性の量を、表７に示す。
放射標識されたＣＡＩＸ結合Ｚバリアントのｉｎ ｖｉｖｏでの評価
Ｚ０９７８１（配列番号３６５）を、ｉｎ ｖｉｖｏでの生体分布および画像化試験のために選択した。
材料および方法
動物および細胞：生体分布試験を、雌のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて行った。試験の２週間前に、腎明細胞癌腫に由来する１０×１０６個の細胞（ＳＫ−ＲＣ−５２細胞系）を、ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウスの右後脚に移植した。実験時に、平均腫瘍重量は０．３０±０．１４ｇであり、平均動物体重は１７．１±１．３ｇであった。
９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１を使用する生体分布試験：最適な注射用量を決定するために、３群のマウス（ｎ＝４）に、ＰＢＳ １００μｌ中の３つの異なる用量（それぞれ、０．３μｇ、１μｇ、および５μｇ）の９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１を静脈内注射（尾静脈）し、注射後４時間で屠殺した。別の３群のマウス（ｎ＝４）に、１μｇを注射して、注射後１、４および８時間で９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１のクリアランスプロファイルを追跡した。９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の異種移植片標的化の特異性を調べるために、１群のマウス（ｎ＝４）に、未標識の（Ｈｉｓ）６−Ｚ０６９３６（（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１に対する親Ｚバリアント）５００μｇを皮下的に予備注射し、注射後４時間で屠殺した。
血液、肺、肝臓、脾臓、胃、結腸、十二指腸、腎臓、唾液腺、筋肉、骨、腸、腫瘍、および残存する残骸を収集した。臓器および組織試料を計量し、その放射活性を測定した。組織取込み値を、全試料あたりの％ＩＤとして算出された腸および残骸を除いて、組織１グラムあたりの注射用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）として算出した。
１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１を使用する生体分布試験：２群のマウス（ｎ＝３）に、ＰＢＳ １００μｌ中の１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１ １μｇを静脈内注射した。マウスを、注射後６および８時間で屠殺した。
臓器を収集し、上記のように分析した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化：画像化を行って、生体分布データの視覚的確認を得た。２つのＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片担持マウスに、それぞれ９９ｍＴｃ−Ｚ０９７８１ １０ＭＢｑ（３μｇ）を注射した。注射後４時間で、マウスを頸椎脱臼により屠殺した。画像化実験を、Ｌｏｗ−Ｅｎｅｒｇｙ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＥＨＲ）コリメータを装備したＩｎｆｉｎｉａ γ−カメラ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。
結果
放射標識されたＺバリアントの生体分布試験：ＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片を担持する雌のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス中に３つの異なる用量（０．３、１または５μｇ）の９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１を注射した後、生体分布における有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。１μｇの注射用量はわずかにより高い腫瘍：脾臓比を提供し、従って、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ試験のために選択された。注射後１、４および８時間でのＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片を担持する雌のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス中での９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１（１μｇ）の生体分布を、図７に示す。身体からの放射性コンジュゲートのクリアランスは、腎臓を介するものであり、その後再吸収された。最も高いレベルの腎臓放射活性は、注射後１時間であった。９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１は、注射後１時間で既に迅速な血中クリアランスを示していた。血液関連放射活性は１〜４時間で約４倍減少したが、注射後さらに８時間では減少しなかった。
放射活性の腫瘍取込みは、１時間で最も高く（２２．３±３．２％ＩＤ／ｇ）、４時間で約２倍減少したが（９．７±０．７％ＩＤ／ｇ）、その後、注射後８時間まで一定なままであった。全体として、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の腫瘍：血液比および腫瘍：臓器比（腫瘍：結腸比を除く）は、４時間で最も高く、注射後８時間でわずかに減少した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの特異性試験により、非飽和ＣＡＩＸ発現異種移植片中での９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の注射後４時間での腫瘍取込み（９．７±０．７％ＩＤ／ｇ）は、未標識の（Ｈｉｓ）６−Ｚ０６９３６バリアントで予め飽和させた異種移植片における取込み（０．４±０．１％ＩＤ／ｇ）よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いことが示された。
注射後６および８時間でのＳＫ−ＲＣ−５２異種移植片を担持する雌のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス中での１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の生体分布を、図８に示す。注射後６および８時間で生体分布と腫瘍取込みとの間ならびに１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の腫瘍：血液比と腫瘍：臓器比との間に有意差はなかった。１２５Ｉ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１の腫瘍：肺、腎臓、筋肉および骨の比は、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１についてよりも高かった。しかしながら、全体の腫瘍取込みは、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１について感知できる程度により高かった。
ｉｎ ｖｉｖｏでの画像化：ガンマカメラ画像（注射後４時間）により、９９ｍＴｃ−（ＨＥ）３−Ｚ０９７８１を使用するＣＡＩＸ発現異種移植片のｉｎ ｖｉｖｏでの画像化の実現性が確認された（図９）。収集された画像は腫瘍を明確に視覚化し、生体分布データと良好に一致していた。腎臓は、顕著な放射活性取込みを示す唯一の臓器であった。
実施形態の項目別表
１． ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＷＤ
（式中、互いに独立に、
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択され；
Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｆ、Ｎ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ２０は、Ｋ、ＱおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択され；
Ｘ２５は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択される）；ならびに
ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるＣＡＩＸ結合モチーフＢＭを含む、ＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２．配列ｉ）は、
ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０
Ｘ２１ＡＦＩＹＸ２６ＬＷＤ
（式中、互いに独立に、
Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択され；
Ｘ３は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ４は、Ａ、Ｆ、Ｎ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ７は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ１１は、Ｄ、Ｅ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ２０は、ＱおよびＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択され；
Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択される）
により定義される、項目１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３．配列ｉ）中のＸ２はＨ、Ｎ、ＱおよびＷから選択される、項目１または２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４．配列ｉ）中のＸ２はＤ、Ｈ、ＮおよびＱから選択される、項目１または２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５．配列ｉ）中のＸ２はＨ、ＮおよびＷから選択される、項目３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６．配列ｉ）中のＸ２はＨおよびＷから選択される、項目５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７．配列ｉ）中のＸ２はＮおよびＷから選択される、項目５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８．配列ｉ）中のＸ２はＨおよびＮから選択される、項目４または５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９．配列ｉ）中のＸ２はＨである、項目６または８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０．配列ｉ）中のＸ２はＮである、項目７または８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１．配列ｉ）中のＸ２はＷである、項目６または７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２．配列ｉ）中のＸ３はＩ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＷから選択される、項目１〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３．配列ｉ）中のＸ３はＩ、Ｌ、Ｑ、ＲおよびＷから選択される、項目１２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４．配列ｉ）中のＸ３はＩ、Ｌ、ＱおよびＷから選択される、項目１３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１５．配列ｉ）中のＸ３はＩ、Ｌ、ＲおよびＷから選択される、項目１３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１６．配列ｉ）中のＸ３はＩ、ＬおよびＷから選択される、項目１４または１５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１７．配列ｉ）中のＸ３はＩおよびＬから選択される、項目１６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１８．配列ｉ）中のＸ３はＩである、項目１７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１９．配列ｉ）中のＸ３はＬである、項目１７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２０．配列ｉ）中のＸ４はＡ、Ｆ、ＷおよびＹから選択される、項目１〜１９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２１．配列ｉ）中のＸ４はＡ、ＦおよびＷから選択される、項目２０に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２２．配列ｉ）中のＸ４はＦおよびＷから選択される、項目２１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２３．配列ｉ）中のＸ４はＦである、項目２２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２４．配列ｉ）中のＸ４はＷである、項目２２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２５．配列ｉ）中のＸ６はＡ、ＧおよびＳから選択される、項目１〜２４のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２６．配列ｉ）中のＸ６はＡおよびＧから選択される、項目２５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２７．配列ｉ）中のＸ６はＧおよびＳから選択される、項目２５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２８．配列ｉ）中のＸ６はＧである、項目２６または２７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
２９．配列ｉ）中のＸ７はＧ、Ｉ、ＶおよびＷから選択される、項目１〜２８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３０．配列ｉ）中のＸ７はＶおよびＷから選択される、項目２９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３１．配列ｉ）中のＸ７はＩおよびＷから選択される、項目２９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３２．配列ｉ）中のＸ７はＷである、項目３０または３１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３３．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択される、項目１〜３２のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３４．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目３３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３５．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから選択される、項目３４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３６．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目３４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３７．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴから選択される、項目３６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３８．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される、項目３５または３６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
３９．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、Ｅ、ＳおよびＴから選択される、項目３７または３８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４０．配列ｉ）中のＸ１０はＤ、Ｅ、ＳおよびＴから選択される、項目３９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４１．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、Ｄ、ＳおよびＴから選択される、項目３９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４２．配列ｉ）中のＸ１０はＤ、ＳおよびＴから選択される、項目４０または４１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４３．配列ｉ）中のＸ１０はＡ、ＤおよびＳから選択される、項目４１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４４．配列ｉ）中のＸ１０はＤおよびＴから選択される、項目４２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４５．配列ｉ）中のＸ１０はＤおよびＳから選択される、項目４２または４３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４６．配列ｉ）中のＸ１０はＤである、項目４４または４５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４７．配列ｉ）中のＸ１１はＤ、ＥおよびＳから選択される、項目１〜４６のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４８．配列ｉ）中のＸ１１はＤおよびＥから選択される、項目４７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
４９．配列ｉ）中のＸ１１はＤである、項目４８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５０．配列ｉ）中のＸ１６はＮである、項目１〜４９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５１．配列ｉ）中のＸ１６はＴである、項目１〜４９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５２．配列ｉ）中のＸ１７はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、ＴおよびＶから選択される、項目１〜５１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５３．配列ｉ）中のＸ１７はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＱおよびＶから選択される、項目５２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５４．配列ｉ）中のＸ１７はＤ、Ｅ、Ｉ、Ｑ、ＴおよびＶから選択される、項目５２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５５．配列ｉ）中のＸ１７はＤ、Ｅ、Ｉ、ＱおよびＶから選択される、項目５３または５４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５６．配列ｉ）中のＸ１７はＤ、Ｅ、ＩおよびＱから選択される、項目５５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５７．配列ｉ）中のＸ１７はＤ、ＥおよびＱから選択される、項目５６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５８．配列ｉ）中のＸ１７はＤ、ＥおよびＩから選択される、項目５６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
５９．配列ｉ）中のＸ１７はＤおよびＥから選択される、項目５７または５８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６０．配列ｉ）中のＸ１７はＥである、項目５９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６１．配列ｉ）中のＸ１７はＤである、項目５９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６２．配列ｉ）中のＸ１８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＹから選択される、項目１〜６１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６３．配列ｉ）中のＸ１８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される、項目６２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６４．配列ｉ）中のＸ１８はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される、項目６３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６５．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される、項目６４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６６．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｈ、Ｑ、ＲおよびＹから選択される、項目６５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６７．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｈ、ＱおよびＹから選択される、項目６６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６８．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、ＨおよびＱから選択される、項目６７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
６９．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、ＱおよびＹから選択される、項目６７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７０．配列ｉ）中のＸ１８はＤおよびＱから選択される、項目６８または６９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７１．配列ｉ）中のＸ１８はＱおよびＹから選択される、項目６９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７２．配列ｉ）中のＸ１８はＨおよびＱから選択される、項目６８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７３．配列ｉ）中のＸ１８はＱである、項目７０〜７２のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７４．配列ｉ）中のＸ１８はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される、項目６２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７５．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される、項目７４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７６．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される、項目７５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７７．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される、項目７６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７８．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＹから選択される、項目７７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
７９．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、Ｅ、ＳおよびＹから選択される、項目７８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８０．配列ｉ）中のＸ１８はＤ、ＥおよびＹから選択される、項目７９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８１．配列ｉ）中のＸ２０はＲである、項目１〜８０のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８２．配列ｉ）中のＸ２１はＤ、ＨおよびＮから選択される、項目１〜８１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８３．配列ｉ）中のＸ２１はＤおよびＮから選択される、項目８２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８４．配列ｉ）中のＸ２１はＨおよびＮから選択される、項目８２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８５．配列ｉ）中のＸ２１はＮである、項目８３または８４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８６．配列ｉ）中のＸ２５はＹである、項目１〜８５のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８７．配列ｉ）中のＸ２６はＫである、項目１〜８６のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８８．配列ｉ）中のＸ２６はＳである、項目１〜８７のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
８９．配列ｉ）は、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩ：
Ｉ．Ｘ２がＮである；
ＩＩ．Ｘ３がＩおよびＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ４がＦである；
ＩＶ．Ｘ６がＧである；
Ｖ．Ｘ７がＷである；
ＶＩ．Ｘ１０がＤおよびＳから選択される；
ＶＩＩ．Ｘ１１がＤである；
ＶＩＩＩ．Ｘ１６がＴである；
ＩＸ．Ｘ１７がＥおよびＤから選択される；
Ｘ．Ｘ１８がＤ、Ｙ、ＥおよびＳから選択される；
ＸＩ．Ｘ２１がＮである；ならびに
ＸＩＩ．Ｘ２６がＫである
のうちの少なくとも７つを満たす、項目１〜８８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９０．配列ｉ）は１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも８つを満たす、項目８９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９１．配列ｉ）は１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも９つを満たす、項目９０に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９２．配列ｉ）は１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも１０を満たす、項目９１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９３．配列ｉ）は１２の条件Ｉ〜ＸＩＩのうちの少なくとも１１を満たす、項目９２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９４．配列ｉ）は１２の条件Ｉ〜ＸＩＩの全てを満たす、項目９３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９５．配列ｉ）は配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４から選択される、項目１〜９４のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９６．配列ｉ）は配列番号１〜１１３から選択される、項目９５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９７．配列ｉ）は配列番号１〜４および配列番号６〜４１から選択される、項目９６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９８．配列ｉ）は配列番号１〜４、配列番号６および配列番号８〜３７から選択される、項目９７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
９９．配列ｉ）は配列番号１〜１４である、項目９６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１００．配列ｉ）は配列番号１〜８および配列番号１０〜１３である、項目９９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０１．配列ｉ）は配列番号１〜５である、項目１００に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０２．配列ｉ）は配列番号１〜４である、項目９８または１０１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０３．配列ｉ）は配列番号１〜３である、項目１０２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０４．前記ＣＡＩＸ結合モチーフは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項目１〜１０３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０５．前記ＣＡＩＸ結合モチーフは、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループを有する２つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目１０４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０６．前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは細菌受容体ドメインから選択される、項目１０５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０７．前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは黄色ブドウ球菌に由来するプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される、項目１０６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０８．ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸａＸｂＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸｄＱ；
（式中、
［ＢＭ］は項目１〜１０３のいずれか１項に定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり；
ＸａはＡおよびＳから選択され；
ＸｂはＮおよびＥから選択され；
ＸｃはＡ、ＳおよびＣから選択され；
ＸｄはＡおよびＳから選択される）；ならびに
ｉｖ）ｉｉｉ）により定義された配列に対して少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０７のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１０９．配列ｉｉｉ）中のＸａはＡである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１０．配列ｉｉｉ）中のＸａはＳである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１１．配列ｉｉｉ）中のＸｂはＮである、項目１０８〜１１０のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１２．配列ｉｉｉ）中のＸｂはＥである、項目１０８〜１１０のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１３．配列ｉｉｉ）中のＸｃはＡである、項目１０８〜１１２のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１４．配列ｉｉｉ）中のＸｃはＳである、項目１０８〜１１２のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１５．配列ｉｉｉ）中のＸｃはＣである、項目１０８〜１１２のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１６．配列ｉｉｉ）中のＸｄはＡである、項目１０８〜１１５のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１７．配列ｉｉｉ）中のＸｄはＳである、項目１０８〜１１５のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１８．配列ｉｉｉ）中、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＡであり、ＸｄはＡである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１１９．配列ｉｉｉ）中、ＸａはＡであり；ＸｂはＮであり；ＸｃはＣであり、Ｘｄは
Ａである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２０．配列ｉｉｉ）中、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＳであり、ＸｄはＳである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２１．配列ｉｉｉ）中、ＸａはＳであり；ＸｂはＥであり；ＸｃはＣであり、ＸｄはＳである、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２２．配列ｉｉｉ）が配列番号１１４〜２２６および配列番号３４５〜３４９のいずれか１つから選択される、項目１０８〜１２１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２３．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜２２６のいずれか１つから選択される、項目１２２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２４．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１１７および配列番号１１９〜１５４のいずれか１つから選択される、項目１２３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２５．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１１７、配列番号１１９、配列番号１２１〜１５０のいずれか１つから選択される、項目１２４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２６．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１２７のいずれか１つから選択される、項目１２３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２７．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１２１および配列番号１２３〜１２６のいずれか１つから選択される、項目１２６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２８．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１１８である、項目１２７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１２９．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１１７である、項目１２５または１２８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３０．配列ｉｉｉ）は配列番号１１４〜１１６である、項目１２９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３１．ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は項目１〜１０３のいずれか１項に定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり、ＸｃはＡ、ＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉ）ｖ）により定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３２．ｖｉｉ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
（式中、［ＢＭ］は項目１〜１０３のいずれか１項に定義されたＣＡＩＸ結合モチーフであり、ＸｃはＡおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）により定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１０８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３３．
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は項目１〜１０３のいずれか１項に定義されたＣＡＩＸ結合モチーフである）
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１０８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３４．配列番号３６５〜３６８から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１３３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３５．ｉｘ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は項目１〜１０３のいずれか１項に定義されたＣＡＩＸ結合モチーフである）；および
ｘ）ｉｘ）に定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜１３３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３６．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜３３９および配列番号３５０〜３５４から選択される、項目１３５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３７．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜３３９から選択される、項目１３６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３８．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２３０および配列番号２３２〜２６７から選択される、項目１３７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１３９．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２３０、配列番号２３２および配列番号２３４〜２６３から選択される、項目１３８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４０．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２４０から選択される、項目１３７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４１．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２３４および配列番号２３６〜２３９から選択される、項目１４０に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４２．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２３１である、項目１４１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４３．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２３０である、項目１３８または１４２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４４．配列ｉｘ）は配列番号２２７〜２２９である、項目１４３に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４５．相互作用のＫＤ値が多くても１×１０−６Ｍ、例えば、多くても１×１０−７Ｍ、例えば、多くても１×１０−８Ｍ、例えば、多くても１×１０−９ＭとなるようにＣＡＩＸに結合することができる、項目１〜１４４のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４６．Ｃ末端および／またはＮ末端にさらなるアミノ酸を含む、項目１〜１４５のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４７．前記さらなるアミノ酸は、ポリペプチドの生成、精製、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定化、カップリング、または検出を改善する、項目１４６に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４８．アミノ酸配列は同じであるか、または異なっていてもよい、少なくとも２つのＣＡＩＸ結合ポリペプチド単量体単位を含む、多量体形態の項目１〜１４７のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１４９．前記ＣＡＩＸ結合ポリペプチド単量体単位は一緒に共有的にカップリングされる、項目１４８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１５０．ＣＡＩＸ結合ポリペプチド単量体単位は融合タンパク質として発現する、項目１４９に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１５１．二量体形態の、項目１４８に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
１５２．− 項目１〜１５１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
− 所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５３．前記所望の生物活性は治療活性である、項目１５２に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５４．前記所望の生物活性は結合活性である、項目１５２に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５５．前記結合活性は、融合タンパク質またはコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させるアルブミン結合活性である、項目１５４に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５６．前記アルブミン結合活性は連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を含む、項目１５５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５７．前記所望の生物活性は酵素活性である、項目１５２に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５８．所望の生物活性を有する第２の部分は治療活性ポリペプチドである、項目１５３に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１５９．所望の生物活性を有する第２の部分は、ヒト内因性酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカイン、サイトカインおよびリンホカインからなる群から選択される、項目１５２、１５３および１５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６０．細胞傷害剤をさらに含む、項目１〜１５９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６１．前記細胞傷害剤はオーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、エクテイナスシジン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、メトトレキサート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ボウガニン、ゲロニン、シュードモナス外毒素３８（ＰＥ３８）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、およびその類似体、ならびにその誘導体およびその組合せからなる群から選択される、項目１６０に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６２．標識をさらに含む、項目１〜１６１のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６３．前記標識は蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される、項目１６２に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６４．システイン残基のチオール基またはリシン残基のアミン基を介してＣＡＩＸ結合ポリペプチドにコンジュゲートされたポリアミノポリカルボキシレートキレーターにより提供されるキレート化環境を含む、項目１〜１６３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６５．ポリアミノポリカルボキシレートキレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸またはその誘導体である、項目１６４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６６．１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸誘導体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである、項目１６５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６７．ポリアミノポリカルボキシレートキレーターは、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸またはその誘導体である、項目１６４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６８．ポリアミノポリカルボキシレートキレーターは、ジエチレントリアミン五酢酸またはその誘導体である、項目１６４に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
１６９．項目１〜１５９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１７０．項目１６９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１７１．項目１７０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
１７２．項目１〜１５９のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
− 前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項目１７１に記載の宿主細胞を培養すること、および
− 前記ポリペプチドを単離すること
を含む、前記方法。
１７３．項目１〜１６８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む組成物。
１７４．少なくとも１つのさらなる活性薬剤をさらに含む、項目１６５に記載の組成物。
１７５．医薬、診断剤または予後診断剤としての使用のための、項目１〜１６８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目１７３〜１７４のいずれか１項に記載の組成物。
１７６．ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＩＸ機能をモジュレートする、項目１７５に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
１７７．ＣＡＩＸ関連状態の処置、診断または予後診断における、項目１７５または１７６に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
１７８．前記ＣＡＩＸ関連状態はがんである、項目１７７に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
１７９．前記がんは、腎臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、脳のがん、頭頸部がん、軟部組織肉腫、星状細胞腫、口腔がんならびに低酸素状態およびＣＡＩＸ発現を示す固形腫瘍を呈する任意のがんからなる群から選択される、項目１７８に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
１８０．ＣＡＩＸを含有すると疑われる試料を用意すること、前記試料を、項目１〜１６８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目１７３〜１７４のいずれか１項に記載の組成物と接触させること、およびＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、試料中のＣＡＩＸの存在を示すことを含む、ＣＡＩＸを検出する方法。
１８１．対象におけるＣＡＩＸの存在を決定するための方法であって、
− 対象、または対象から単離された試料を、項目１〜１６８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目１７３〜１７４のいずれか１項に記載の組成物と接触させる工程、および
− 前記対象中で、または前記試料に結合したＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に対応する値を取得する工程
を含む、前記方法。
１８２．前記値を参照と比較する工程をさらに含む、項目１８１に記載の方法。
１８３．前記対象は、ヒト対象のような哺乳動物対象である、項目１８１または１８２に記載の方法。
１８４．ｉｎ ｖｉｖｏで実行される、項目１８０〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
１８５．ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される、項目１８０〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
１８６．項目１〜１６８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目１７３〜１７４のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＣＡＩＸ関連状態の処置方法。
１８７．前記ＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＩＸ機能をモジュレートする、項目１８６に記載の方法。
１８８．前記ＣＡＩＸ関連状態はがんである、項目１８６または１８７に記載の方法。
１８９．前記がんは、腎臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、脳のがん、頭頸部がん、軟部組織肉腫、星状細胞腫、口腔がんならびに低酸素状態およびＣＡＩＸ発現を示す固形腫瘍を呈する任意のがんからなる群から選択される、項目１８８に記載の方法。

Claims (15)

  1. ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０ Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０ Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＷＤ
    （式中、互いに独立に、
    Ｘ２は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＷから選択され；
    Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
    Ｘ４は、Ａ、Ｆ、Ｎ、ＷおよびＹから選択され；
    Ｘ６は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＷから選択され；
    Ｘ７は、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
    Ｘ１０は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
    Ｘ１１は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され；
    Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
    Ｘ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；
    Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
    Ｘ２０は、Ｋ、ＱおよびＲから選択され；
    Ｘ２１は、Ｄ、Ｈ、ＮおよびＱから選択され；
    Ｘ２５は、ＦおよびＹから選択され；
    Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択される）；
    ならびに
    ｉｉ）ｉ）に定義された配列に対して少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるＣＡＩＸ結合モチーフＢＭを含む、ＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  2. 配列ｉ）は、１２の条件Ｉ〜ＸＩＩ：
    Ｉ．Ｘ２がＮである；
    ＩＩ．Ｘ３がＩおよびＬから選択される；
    ＩＩＩ．Ｘ４がＦである；
    ＩＶ．Ｘ６がＧである；
    Ｖ．Ｘ７がＷである；
    ＶＩ．Ｘ１０がＤおよびＳから選択される；
    ＶＩＩ．Ｘ１１がＤである；
    ＶＩＩＩ．Ｘ１６がＴである；
    ＩＸ．Ｘ１７がＥおよびＤから選択される；
    Ｘ．Ｘ１８がＤ、Ｙ、ＥおよびＳから選択される；
    ＸＩ．Ｘ２１がＮである；ならびに
    ＸＩＩ．Ｘ２６がＫである
    のうちの少なくとも７つを満たす、請求項１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  3. 配列ｉ）は、配列番号１〜１１３および配列番号３４０〜３４４から選択される、例えば、配列番号１〜１４から選択される、例えば、配列番号１〜４から選択される、請求項１に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  4. 前記ＣＡＩＸ結合モチーフは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  5. ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸａＸｂＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸｄＱ；
    （式中、
    ［ＢＭ］は請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合モチーフであり；
    ＸａはＡおよびＳから選択され；
    ＸｂはＮおよびＥから選択され；
    ＸｃはＡ、ＳおよびＣから選択され；
    ＸｄはＡおよびＳから選択される）；ならびに
    ｉｖ）ｉｉｉ）により定義された配列に対して少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  6. 配列ｉｉｉ）は、配列番号１１４〜２２６および配列番号３４５〜３４９のいずれか１つから選択される、例えば、配列番号１１４〜１２７から選択される、例えば、配列番号１１４〜１１７から選択される、請求項５に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  7. ｖ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
    （式中、［ＢＭ］は請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合モチーフである）；および
    ｖｉ）ｖ）に定義された配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  8. 配列ｖ）は、配列番号２２７〜３３９および配列番号３５０〜３５４から選択される、例えば、配列番号２２７〜２４０から選択される、例えば、配列番号２２７〜２３０から選択される、請求項７に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド。
  9. − 請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチドからなる第１の部分；および
    − 所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第２の部分
    を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む組成物。
  12. 医薬、診断剤または予後診断剤としての使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項１１に記載の組成物。
  13. ＣＡＩＸ関連状態の処置、診断または予後診断における、請求項１２に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
  14. 前記ＣＡＩＸ関連状態はがんである、請求項１３に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
  15. 前記がんは、腎臓がん、肺がん、結腸がん、乳がん、子宮頸がん、膀胱がん、卵巣がん、外陰がん、脳のがん、頭頸部がん、軟部組織肉腫、星状細胞腫、口腔がんならびに低酸素状態およびＣＡＩＸ発現を示す固形腫瘍を呈する任意のがんからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のためのＣＡＩＸ結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
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