JP2016211913A - 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 - Google Patents
膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016211913A JP2016211913A JP2015094158A JP2015094158A JP2016211913A JP 2016211913 A JP2016211913 A JP 2016211913A JP 2015094158 A JP2015094158 A JP 2015094158A JP 2015094158 A JP2015094158 A JP 2015094158A JP 2016211913 A JP2016211913 A JP 2016211913A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- bladder cancer
- polypeptide
- cisplatin
- cancer cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 title claims abstract description 130
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 title claims abstract description 130
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 127
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 127
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 127
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 77
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 19
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 18
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 10
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 114
- 101710203740 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 Proteins 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 102100035669 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 Human genes 0.000 description 33
- 101000734579 Homo sapiens Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial Proteins 0.000 description 32
- 102100034792 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial Human genes 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 7
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 4
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010079855 Peptide Aptamers Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 2
- 101150019856 pck2 gene Proteins 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091027874 Group I catalytic intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010847 SEQUEST Methods 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供する。
【解決手段】膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法：（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
【選択図】なし
【解決手段】膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法：（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
【選択図】なし
Description
本発明は、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用に関する。より具体的には、ポリペプチドの使用方法、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キットに関する。
膀胱癌の治療には、抗癌剤であるシスプラチンが使用される。しかしながら、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有する場合、あるいは、治療の進行に伴って膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を獲得してしまう場合がある（例えば、非特許文献１、２を参照。）。このような場合に、患者にシスプラチンを投与しても治療効果が得られにくく、患者にとっても、医療経済上も不利益である。そこで、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の指標となるマーカーの開発が望まれている。
Ikeda M., et al., Combination of gemcitabine and paclitaxel is a favorable option for patients with advanced or metastatic urothelial carcinoma previously treated with cisplatin-based chemotherapy, Japanese Journal of Clinical Oncology, 41(10), 1214-1220, 2011.
Matsumoto K., et al., Gemcitabine plus nedaplatin as salvage therapy is a favorable option for patients with progressive metastatic urothelial carcinoma after two lines of chemotherapy, Asian Pacfic Journal of Cancer Prevention, 16(6), 2483-2487, 2015.
本発明は、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供することを目的とする。本発明はまた、ポリペプチドの使用方法、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キットを提供することを目的とする。
本発明は以下の通りである。
（１）膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
（２）シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、被検者から得た膀胱癌細胞中に前記ポリペプチドを検出することである、（１）に記載の方法。
（３）前記ポリペプチドの検出が、前記ポリペプチドに対する特異的結合物質を用いた検出である、（２）に記載の方法。
（４）シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、膀胱癌細胞中に、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその部分配列を有するヌクレオチド断片を検出することである、（１）に記載の方法。
（５）前記検出が、配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブ及び／又はプライマーにより行われる、（４）に記載の方法。
（６）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合物質を含有する、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬。
（７）下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ：
（ｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片、
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
（８）膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドと、（７）に記載の核酸プローブとを接触させることを含む、（４）に記載の方法。
（９）膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することを含む、（４）に記載の方法。
（１０）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、又は
配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー。
（１１）（７）に記載の核酸プローブを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
（１２）（１０）に記載のプライマーを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
（１３）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなる膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
（１４）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤。
（１５）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸と、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット。
（１６）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（１７）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターと、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（１）膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
（２）シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、被検者から得た膀胱癌細胞中に前記ポリペプチドを検出することである、（１）に記載の方法。
（３）前記ポリペプチドの検出が、前記ポリペプチドに対する特異的結合物質を用いた検出である、（２）に記載の方法。
（４）シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、膀胱癌細胞中に、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその部分配列を有するヌクレオチド断片を検出することである、（１）に記載の方法。
（５）前記検出が、配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブ及び／又はプライマーにより行われる、（４）に記載の方法。
（６）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合物質を含有する、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬。
（７）下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ：
（ｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片、
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
（８）膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドと、（７）に記載の核酸プローブとを接触させることを含む、（４）に記載の方法。
（９）膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することを含む、（４）に記載の方法。
（１０）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、又は
配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー。
（１１）（７）に記載の核酸プローブを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
（１２）（１０）に記載のプライマーを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
（１３）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなる膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
（１４）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤。
（１５）配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸と、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット。
（１６）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（１７）下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターと、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
本発明によれば、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供することができる。また、ポリペプチドの使用方法、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キットを提供することができる。
［ポリペプチドの使用方法］
１実施形態において、本発明は、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法を提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法を提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
ここで、配列番号１はHeterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3（ＨＮＲＮＰＡ３）のアミノ酸配列である。ＨＮＲＮＰＡ３にはＮ末端部分のアミノ酸配列が異なるアイソフォームが存在することが知られている。配列番号２はＨＮＲＮＰＡ３のアイソフォームのアミノ酸配列である。配列番号３はPhosphoenolpyruvate carboxykinase（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＰＣＫ２）のアミノ酸配列である。ＰＣＫ２にもアイソフォームが存在することが知られている。配列番号４はＰＣＫ２のアイソフォームのアミノ酸配列である。
後述する実施例において示すように、発明者らは、シスプラチン耐性を獲得した膀胱癌細胞ではＨＮＲＮＰＡ３の発現が上昇することを見出した。また、シスプラチン耐性を獲得した膀胱癌細胞ではＰＣＫ２の発現が消失することを見出した。したがって、ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２は、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーである。
本明細書において、１若しくは複数とは、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個を意味する。
１実施形態において、上記のシスプラチン耐性マーカーとしての使用は、被検者から得た膀胱癌細胞中に上記のポリペプチドを検出することであってもよい。例えば、上記のポリペプチドに対する特異的結合物質を用いた検出が挙げられる。特異的結合物質としては、上記のポリペプチドに対する抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。
抗体は、例えば、上記のポリペプチドを抗原としてマウス等の動物を免疫することによって作製することができる。また、例えば、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
アプタマーとは、対象物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。上記のポリペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、上記のポリペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば、酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
例えば、被検者から得た膀胱癌細胞を試料として、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法等により、上記のポリペプチドの発現量を測定し、被検者の膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有しているか否かを判断することができる。
より具体的には、対照の膀胱癌細胞と比較して、ＨＮＲＮＰＡ３の発現量が上昇していた場合には、被検者の膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有していると判断することができる。また、ＰＣＫ２の発現が消失していた場合には、被検者の膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有していると判断することができる。
ここで、対照の膀胱癌細胞としては、シスプラチンに対する耐性を有していないことが明らかにされている膀胱癌細胞を用いることができる。例えば、膀胱癌細胞株であるＴ２４等を用いることができる。
１実施形態において、上記のシスプラチン耐性マーカーとしての使用は、被検者から得た膀胱癌細胞中に、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその部分配列を有するヌクレオチド断片を検出することであってもよい。例えば、配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブ及び／又はプライマーにより行う検出が挙げられる。
ここで、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列であり、配列番号７及び８はＰＣＫ２のヌクレオチド配列である。配列番号５のヌクレオチド配列は、上述した配列番号１のアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号６のヌクレオチド配列は、上述した配列番号２のアミノ酸配列をコードするものである。また、配列番号７のヌクレオチド配列は、上述した配列番号３のアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号８のヌクレオチド配列は、上述した配列番号４のアミノ酸配列をコードするものである。
上記のシスプラチン耐性マーカーとしての使用は、例えば、膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドと、上記の核酸プローブとを接触させることを含んでいてもよい。膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドとしてはｍＲＮＡが好ましい。
具体的には、被検者から得た膀胱癌細胞から抽出したＲＮＡを試料として、上記のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブを用いたノーザンブロッティングにより、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量を測定してもよい。ＲＮＡは全ＲＮＡであってもよく、ｍＲＮＡであってもよく、以下同様である。
あるいは、上記のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブが固定された担体に上記のＲＮＡをハイブリダイズさせることにより、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量を測定してもよい。上記の担体としては、例えばマイクロアレイ、ビーズ等が挙げられる。
上記のシスプラチン耐性マーカーとしての使用は、例えば、膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することを含んでいてもよい。
具体的には、例えば、被検者から得た膀胱癌細胞から抽出したＲＮＡを試料として、上記のヌクレオチド配列に基づいて作製したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（逆転写反応−ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、ＨＮＲＮＰＡ３遺伝子又はＰＣＫ２遺伝子の増幅量に基づいてこれらの遺伝子の発現量を測定してもよい。
［シスプラチン耐性判定薬］
１実施形態において、本発明は、配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合物質を含有する、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬を提供する。上述したように、配列番号１及び２はＨＮＲＮＰＡ３のアミノ酸配列であり、配列番号３及び４はＰＣＫ２のアミノ酸配列である。また、特異的結合物質については上述した通りである。
１実施形態において、本発明は、配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合物質を含有する、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬を提供する。上述したように、配列番号１及び２はＨＮＲＮＰＡ３のアミノ酸配列であり、配列番号３及び４はＰＣＫ２のアミノ酸配列である。また、特異的結合物質については上述した通りである。
本実施形態のシスプラチン耐性判定薬によれば、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有しているか否かを判定することができる。その結果、膀胱癌患者の治療方法を適切に選択することが可能になる。具体的には、例えば、膀胱癌患者の癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有している場合には、シスプラチン以外の治療薬を選択することができる。
［シスプラチン耐性判定用核酸プローブ及びキット］
１実施形態において、本発明は、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブを提供する。
（ｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片、
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
１実施形態において、本発明は、下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブを提供する。
（ｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片、
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。
上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列であり、配列番号７及び８はＰＣＫ２のヌクレオチド配列である。
また、本発明は、上記の核酸プローブを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キットを提供する。
本明細書において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、一般に知られたものを選択することができ、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム−１５ｍＭクエン酸三ナトリウムである。）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸及び２０μｇ／ｍＬのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で１次洗浄し、次いで約６５℃において０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２次洗浄する条件が挙げられる。例えば、対象とするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列としては、対象とする塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。
本実施形態の核酸プローブを、例えば、上述したノーザンブロッティングに使用することにより、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量の測定を行うことができる。あるいは、上述したように、本実施形態の核酸プローブが固定された担体に、被検者から得た膀胱癌細胞から抽出したＲＮＡをハイブリダイズさせることにより、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量の測定を行うことができる。また、上述したように、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量に基づいて、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性を判定することができる。
［シスプラチン耐性判定用プライマー及びキット］
１実施形態において、本発明は、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、又は配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマーを提供する。上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列であり、配列番号７及び８はＰＣＫ２のヌクレオチド配列である。
１実施形態において、本発明は、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、又は配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマーを提供する。上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列であり、配列番号７及び８はＰＣＫ２のヌクレオチド配列である。
また、本発明は、上記のプライマーを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キットを提供する。
本実施形態のプライマーは、例えば、被検者から得た膀胱癌細胞から抽出したＲＮＡを試料としたＲＴ−ＰＣＲ等に用いることにより、ＨＮＲＮＰＡ３遺伝子又はＰＣＫ２遺伝子の発現量の測定を行うことができる。また、上述したように、ＨＮＲＮＰＡ３又はＰＣＫ２の発現量に基づいて、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性を判定することができる。
［シスプラチン耐性マーカー］
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなる膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなる膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
上述したように、配列番号１及び２はＨＮＲＮＰＡ３のアミノ酸配列であり、配列番号３及び４はＰＣＫ２のアミノ酸配列である。
［シスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キット１］
１実施形態において、本発明は、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤を提供する。上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列である。
１実施形態において、本発明は、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤を提供する。上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列である。
後述する実施例において示すように、ＨＮＲＮＰＡ３の発現量は膀胱癌細胞のシスプラチン耐性が高くなるにつれて増加する。そこで、シスプラチンに対する耐性を有する膀胱癌細胞のＨＮＲＮＰＡ３の発現を阻害することにより、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性を向上させることができる。
本実施形態のシスプラチン感受性向上剤によれば、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有している場合においても、シスプラチンによる膀胱癌の治療効果を高めることができる。
阻害性核酸とは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）に結合し、これを切断、分解し、あるいは標的遺伝子の発現調節部位に結合すること等により、標的遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量や機能を減少させる核酸をいう。阻害性核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等が挙げられる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。
また、本発明は、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸と、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キットを提供する。上述したように、配列番号５及び６はＨＮＲＮＰＡ３のヌクレオチド配列である。
本実施形態の膀胱癌治療用キットによれば、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有している場合においても、シスプラチンによる膀胱癌の治療効果を高めることができる。
［シスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キット２］
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤を提供する。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤を提供する。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
上述したように、配列番号３及び４はＰＣＫ２のアミノ酸配列である。後述する実施例において示すように、膀胱癌細胞がシスプラチン耐性を獲得するとＰＣＫ２の発現が消失する。そこで、膀胱癌細胞におけるＰＣＫ２の発現を増強することにより、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性を向上させることができる。
本実施形態のシスプラチン感受性向上剤によれば、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有している場合においても、シスプラチンによる治療効果を高めることができる。
発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス等のウィルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
上記の発現ベクターにおいて、ポリペプチド発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞を宿主とした発現用のプロモーターを使用することができる。
上記の発現ベクターは、さらに、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
また、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターと、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キットを提供する。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
上述したように、配列番号２はＰＣＫ２のアミノ酸配列である。本実施形態の膀胱癌治療用キットによれば、膀胱癌細胞がシスプラチンに対する耐性を有している場合においても、シスプラチンによる治療効果を高めることができる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用する工程を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定方法を提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用する工程を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定方法を提供する。
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、膀胱癌細胞に、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を投与する工程を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性を向上させる方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、膀胱癌患者に、配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を投与する工程と、シスプラチンを投与する工程と、を含む、膀胱癌の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、膀胱癌細胞に、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを導入する工程を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性を向上させる方法を提供する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
１実施形態において、本発明は、膀胱癌患者に、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを導入する工程と、シスプラチンを投与する工程と、を含む、膀胱癌の治療方法を提供する。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（シスプラチン耐性膀胱癌細胞株の樹立）
ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４の培地に低濃度のシスプラチンを添加して馴化させた。この手順を繰り返し、Ｔ２４の培地に添加するシスプラチン濃度を次第に上昇させ、シスプラチン耐性膀胱癌細胞株Ｔ２４ＣＤＤＰＲを得た。最終的には、４０μＭのシスプラチンの存在下でも生存できるシスプラチン耐性膀胱癌細胞株が得られた。
（シスプラチン耐性膀胱癌細胞株の樹立）
ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４の培地に低濃度のシスプラチンを添加して馴化させた。この手順を繰り返し、Ｔ２４の培地に添加するシスプラチン濃度を次第に上昇させ、シスプラチン耐性膀胱癌細胞株Ｔ２４ＣＤＤＰＲを得た。最終的には、４０μＭのシスプラチンの存在下でも生存できるシスプラチン耐性膀胱癌細胞株が得られた。
［実験例２］
（シスプラチン耐性マーカーの同定）
《膀胱癌細胞》
実験例１で作製したシスプラチン耐性膀胱癌細胞株Ｔ２４ＣＤＤＰＲ及びその親株であるＴ２４を実験に用いた。
（シスプラチン耐性マーカーの同定）
《膀胱癌細胞》
実験例１で作製したシスプラチン耐性膀胱癌細胞株Ｔ２４ＣＤＤＰＲ及びその親株であるＴ２４を実験に用いた。
《試料の調製》
テフロン（登録商標）ガラスホモジナイザーを用いて各細胞約２０ｍｇを、質量の３０倍量のタンパク抽出液で処理してタンパク質を抽出した。ホモジナイズ後、直径０．３５−０．５０ｍｍのガラスビーズ（アズワン社製）の存在下ですばやく攪拌した。このホモジェネートを１１２，０００×ｇ、２０分間の超遠心に供して脂質、膜成分を分離し、上清をタンパク質抽出液として使用した。
テフロン（登録商標）ガラスホモジナイザーを用いて各細胞約２０ｍｇを、質量の３０倍量のタンパク抽出液で処理してタンパク質を抽出した。ホモジナイズ後、直径０．３５−０．５０ｍｍのガラスビーズ（アズワン社製）の存在下ですばやく攪拌した。このホモジェネートを１１２，０００×ｇ、２０分間の超遠心に供して脂質、膜成分を分離し、上清をタンパク質抽出液として使用した。
《アガロース二次元電気泳動》
一次元目の等電点電気泳動（ＩＥＦ）のゲルは、長さ１８０ｍｍ、直径３．４ｍｍのガラス管を用いて作製した。また、二次元目のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲルは、１９５×１２０×１．５ｍｍの大きさのものを作製した。アガロース二次元電気泳動（アガロース２−ＤＥ）の特性を活かすために、２種類の濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを目的に応じて作成した。すなわち、低分子量（ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ、ＬＭＭ）タンパク質の分離を目的とした１２％均一ゲルと高分子量（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ、ＨＭＭ）タンパク質の分離を目的とした６−１０％濃度勾配ゲルである。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法によって行った。
一次元目の等電点電気泳動（ＩＥＦ）のゲルは、長さ１８０ｍｍ、直径３．４ｍｍのガラス管を用いて作製した。また、二次元目のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲルは、１９５×１２０×１．５ｍｍの大きさのものを作製した。アガロース二次元電気泳動（アガロース２−ＤＥ）の特性を活かすために、２種類の濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを目的に応じて作成した。すなわち、低分子量（ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ、ＬＭＭ）タンパク質の分離を目的とした１２％均一ゲルと高分子量（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ、ＨＭＭ）タンパク質の分離を目的とした６−１０％濃度勾配ゲルである。二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法によって行った。
１００μＬ、タンパク質１．０ｍｇ相当のタンパク質抽出液をＩＥＦゲルのアルカリ側に入れ、４Ｍ尿素、１Ｍチオ尿素溶液をその上から注入した。
一次元目ＩＥＦは４℃下で７００Ｖ、２０時間の泳動で行った。一次元目の泳動後、長さ３００ｍｍ、直径５ｍｍのガラス管にゲルを移し、１０％ＴＣＡ、５％スルホサリチル酸溶液で１時間還流してタンパク質を固定し、１時間蒸留水で洗浄した。固定したＩＥＦゲルは二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上端に設置し１％アガーで隙間を埋めた。
ＳＤＳ泳動バッファー（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−メルカプロエタノール、０．０２％ブロモフェノールブルー、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．５）をＩＥＦゲル上に注入し、４０ｍＡで１時間、その後８０ｍＡで二次元目の泳動を行った。
泳動が終了したゲルはＣＢＢ Ｒ−３５０（ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒ，ＧＥヘルスケア社）で染色した。
《質量分析解析》
２−ＤＥゲルから切り出したタンパクスポットを、５０％ｖ／ｖアセトニトリルで脱色した後に１００％アセトニトリルで脱水、乾燥させた。０．５ｎｇ／μＬトリプシン（ロシュ社）、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ バッファー（ｐＨ８．０）で３７℃２４時間タンパク質のゲル内消化を行った。この消化産物ペプチドを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）と７０％アセトニトリル溶液で溶出させた。ゲル内消化後のペプチド混合物を液体クロマトグラフィー質量分析計［液体クロマトグラフィー：Ｎａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２（資生堂ファインケミカル社）、質量分析計：ＬＣＱ−ＤＥＣＡ（サーモフィニガン社）］により分析した。
２−ＤＥゲルから切り出したタンパクスポットを、５０％ｖ／ｖアセトニトリルで脱色した後に１００％アセトニトリルで脱水、乾燥させた。０．５ｎｇ／μＬトリプシン（ロシュ社）、５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ バッファー（ｐＨ８．０）で３７℃２４時間タンパク質のゲル内消化を行った。この消化産物ペプチドを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）と７０％アセトニトリル溶液で溶出させた。ゲル内消化後のペプチド混合物を液体クロマトグラフィー質量分析計［液体クロマトグラフィー：Ｎａｎｏｓｐａｃｅ ＳＩ−２（資生堂ファインケミカル社）、質量分析計：ＬＣＱ−ＤＥＣＡ（サーモフィニガン社）］により分析した。
《タンパク質の同定》
上記に記した質量分析計によって得られた各トリプシン消化ペプチドのＭＳスペクトルとタンデムＭＳスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を質量分析計に装備されているタンパク質同定用プログラム（ＳＥＱＵＥＳＴ Ｓｅａｒｃｈ Ｖｅｒ２．０、http://fields.scripps.edu/sequest/index.html）を用いて、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ法によりデータベース検索を行った。このプログラムは、測定で得たＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルと、データベース上の各タンパク質を理論的に酵素消化して得られるＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較する。その結果として一致度合いの高いタンパク質を選び出し、可能性に応じて一致度合いの評点（Ｓｃｏｒｅ）を付ける。本研究では、タンパク質のＳｃｏｒｅが７０以上のものを同定されたタンパク質とした。また、Ｓｃｏｒｅが７０未満の場合は、信憑性の高いＭＳ／ＭＳスペクトルが２つ以上観測されていることを確認し、同定されていると判断した。この基準は一般的な質量分析計の同定基準以上のものであり、十分に信頼できるものである。
上記に記した質量分析計によって得られた各トリプシン消化ペプチドのＭＳスペクトルとタンデムＭＳスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を質量分析計に装備されているタンパク質同定用プログラム（ＳＥＱＵＥＳＴ Ｓｅａｒｃｈ Ｖｅｒ２．０、http://fields.scripps.edu/sequest/index.html）を用いて、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ法によりデータベース検索を行った。このプログラムは、測定で得たＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルと、データベース上の各タンパク質を理論的に酵素消化して得られるＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較する。その結果として一致度合いの高いタンパク質を選び出し、可能性に応じて一致度合いの評点（Ｓｃｏｒｅ）を付ける。本研究では、タンパク質のＳｃｏｒｅが７０以上のものを同定されたタンパク質とした。また、Ｓｃｏｒｅが７０未満の場合は、信憑性の高いＭＳ／ＭＳスペクトルが２つ以上観測されていることを確認し、同定されていると判断した。この基準は一般的な質量分析計の同定基準以上のものであり、十分に信頼できるものである。
《結果》
その結果、Ｔ２４細胞株とＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量に違いのあるポリペプチドが２６種類同定された。図１（ａ）及び（ｂ）は、１２％均一ゲルを用いたアガロース二次元電気泳動の結果を示す写真である。図１（ａ）はＴ２４細胞株の結果であり、図１（ｂ）はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株の結果である。図中のスポット番号のうち、０７番がＰＣＫ２であり、１５番がＨＮＲＮＰＡ３である。ＰＣＫ２はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量が減少していた。また、ＨＮＲＮＰＡ３はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量が増加していた。
その結果、Ｔ２４細胞株とＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量に違いのあるポリペプチドが２６種類同定された。図１（ａ）及び（ｂ）は、１２％均一ゲルを用いたアガロース二次元電気泳動の結果を示す写真である。図１（ａ）はＴ２４細胞株の結果であり、図１（ｂ）はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株の結果である。図中のスポット番号のうち、０７番がＰＣＫ２であり、１５番がＨＮＲＮＰＡ３である。ＰＣＫ２はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量が減少していた。また、ＨＮＲＮＰＡ３はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で発現量が増加していた。
［実験例３］
（ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量の確認１）
Ｔ２４細胞株及びＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量を確認した。Ｔ２４ＣＤＤＰＲ細胞株としては、シスプラチン濃度２６．６μＭに対する耐性を有するものを使用した。ＭＴＴアッセイにより、このＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株は、シスプラチンによる５０％抑制濃度（ＩＣ５０）が５５ｍＭ（Ｔ２４の４１倍）であることを確認した。
（ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量の確認１）
Ｔ２４細胞株及びＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量を確認した。Ｔ２４ＣＤＤＰＲ細胞株としては、シスプラチン濃度２６．６μＭに対する耐性を有するものを使用した。ＭＴＴアッセイにより、このＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株は、シスプラチンによる５０％抑制濃度（ＩＣ５０）が５５ｍＭ（Ｔ２４の４１倍）であることを確認した。
ＨＮＲＮＰＡ３の検出には抗ヒトＨＮＲＮＰＡ３抗体（Ａｂｃａｍ社製）を使用した。ＰＣＫ２の検出には抗ヒトＰＣＫ２抗体（Ａｂｇｅｎｔ社製）を使用した。
図２（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＨＮＲＮＰＡ３の発現量はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で増加することが確認された。また、ＰＣＫ２の発現量はＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株で減少することが確認された。
［実験例４］
（ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量の確認２）
Ｔ２４細胞株及びＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量を確認した。Ｔ２４ＣＤＤＰＲ細胞株としては、シスプラチン濃度１３．３μＭ、２６．６μＭ、４０μＭに対する耐性を有するものを使用した。ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の検出は実験例３と同様に行った。
（ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量の確認２）
Ｔ２４細胞株及びＴ２４ＣＤＤＰＲ細胞株を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の発現量を確認した。Ｔ２４ＣＤＤＰＲ細胞株としては、シスプラチン濃度１３．３μＭ、２６．６μＭ、４０μＭに対する耐性を有するものを使用した。ＨＮＲＮＰＡ３及びＰＣＫ２の検出は実験例３と同様に行った。
図３（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＨＮＲＮＰＡ３の発現量はＴ２４細胞のシスプラチン耐性が高くなるにつれて増加することが明らかとなった。また、Ｔ２４がシスプラチン耐性を獲得すると、シスプラチン耐性の高さとは関係なくＰＣＫ２の発現が消失することが明らかとなった。
本発明によれば、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカーを提供することができる。また、ポリペプチドの使用方法、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤及び膀胱癌治療用キットを提供することができる。
Claims (17)
- 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性の判定において、下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをシスプラチン耐性マーカーとして使用することを特徴とする、該ポリペプチドの使用方法：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。 - シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、被検者から得た膀胱癌細胞中に前記ポリペプチドを検出することである、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの検出が、前記ポリペプチドに対する特異的結合物質を用いた検出である、請求項２に記載の方法。
- シスプラチン耐性マーカーとしての使用が、膀胱癌細胞中に、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその部分配列を有するヌクレオチド断片を検出することである、請求項１に記載の方法。
- 前記検出が、配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列に基づいて作製したプローブ及び／又はプライマーにより行われる、請求項４に記載の方法。
- 配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合物質を含有する、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定薬。
- 下記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用核酸プローブ：
（ｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片、
（ｉｉｉ）配列番号５若しくは６又は７若しくは８に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断片。 - 膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドと、請求項７に記載の核酸プローブとを接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
- 膀胱癌細胞に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することを含む、請求項４に記載の方法。
- 配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、又は
配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、及び配列番号７又は８に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列の部分配列からなるヌクレオチド断片、を含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用プライマー。 - 請求項７に記載の核酸プローブを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
- 請求項１０に記載のプライマーを含む、膀胱癌細胞のシスプラチン耐性判定用キット。
- 下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなる膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー：
（ａ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１若しくは２又は３若しくは４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）と同等の抗体産生能を有するか又は（ａ）に対する特異的抗体と反応しうるポリペプチド。 - 配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸を有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤。
- 配列番号５又は６に記載のヌクレオチド配列を有する核酸に対する阻害性核酸と、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット。
- 下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターを有効成分とする、膀胱癌細胞のシスプラチン感受性向上剤：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。 - 下記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの発現ベクターと、シスプラチンとを備える、膀胱癌治療用キット：
（ａ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015094158A JP6508716B2 (ja) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015094158A JP6508716B2 (ja) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2016211913A true JP2016211913A (ja) | 2016-12-15 |
| JP6508716B2 JP6508716B2 (ja) | 2019-05-08 |
Family
ID=57551667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015094158A Active JP6508716B2 (ja) | 2015-05-01 | 2015-05-01 | 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6508716B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110846413A (zh) * | 2019-11-23 | 2020-02-28 | 中南大学湘雅三医院 | Mafg/mafg-as1/mafg正反馈环作为靶位点检测试剂的应用 |
| CN114164176A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-03-11 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 人膀胱癌顺铂耐药细胞株及其用途 |
| WO2022260166A1 (ja) * | 2021-06-10 | 2022-12-15 | 学校法人北里研究所 | 癌診断用キット及びその使用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501335A (ja) * | 2004-06-03 | 2008-01-24 | アイシス ファーマシューティカルズ、インク． | キメラギャップ化オリゴマー組成物 |
| JP2012519282A (ja) * | 2009-02-27 | 2012-08-23 | オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー | 間葉様腫瘍細胞またはその生成を阻害する薬剤を同定するための方法 |
-
2015
- 2015-05-01 JP JP2015094158A patent/JP6508716B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008501335A (ja) * | 2004-06-03 | 2008-01-24 | アイシス ファーマシューティカルズ、インク． | キメラギャップ化オリゴマー組成物 |
| JP2012519282A (ja) * | 2009-02-27 | 2012-08-23 | オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー | 間葉様腫瘍細胞またはその生成を阻害する薬剤を同定するための方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NORIYOSHI MIURA ET AL.: "Adseverin: A novel cisplatin-resistant marker in the human bladder cancer cell line HT1376 identifie", MOLECULAR ONCOLOGY, vol. 6, no. 3, JPN6018032597, 2012, pages 311 - 322, XP028508747, ISSN: 0003863562, DOI: 10.1016/j.molonc.2011.12.002 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110846413A (zh) * | 2019-11-23 | 2020-02-28 | 中南大学湘雅三医院 | Mafg/mafg-as1/mafg正反馈环作为靶位点检测试剂的应用 |
| WO2022260166A1 (ja) * | 2021-06-10 | 2022-12-15 | 学校法人北里研究所 | 癌診断用キット及びその使用 |
| CN114164176A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-03-11 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 人膀胱癌顺铂耐药细胞株及其用途 |
| CN114164176B (zh) * | 2021-12-13 | 2023-10-13 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 人膀胱癌顺铂耐药细胞株及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6508716B2 (ja) | 2019-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dong et al. | The RNA-binding protein RBM3 promotes cell proliferation in hepatocellular carcinoma by regulating circular RNA SCD-circRNA 2 production | |
| Yap et al. | A short tandem repeat-enriched RNA assembles a nuclear compartment to control alternative splicing and promote cell survival | |
| Chen et al. | Recoding RNA editing of AZIN1 predisposes to hepatocellular carcinoma | |
| Chen et al. | The role of cytochrome c oxidase subunit Va in non-small cell lung carcinoma cells: association with migration, invasion and prediction of distant metastasis | |
| Al‐Ahmadi et al. | miR‐29a inhibition normalizes HuR over‐expression and aberrant AU‐rich mRNA stability in invasive cancer | |
| Szczyrba et al. | Identification of ZNF217, hnRNP‐K, VEGF‐A and IPO7 as targets for microRNAs that are downregulated in prostate carcinoma | |
| Fang et al. | CircRNAs and its relationship with gastric cancer | |
| Yin et al. | miR‑7‑5p inhibits cell migration and invasion in glioblastoma through targeting SATB1 | |
| Hu et al. | MEGF6 promotes the epithelial-to-mesenchymal transition via the TGFβ/SMAD signaling pathway in colorectal cancer metastasis | |
| JP2017518764A (ja) | 癌の処置のための多標的指向ＲＮＡｉ | |
| Qin et al. | ATF2-induced lncRNA GAS8-AS1 promotes autophagy of thyroid cancer cells by targeting the miR-187-3p/ATG5 and miR-1343-3p/ATG7 axes | |
| Hotta et al. | Clinical significance and therapeutic potential of prostate cancer antigen-1/ALKBH3 in human renal cell carcinoma | |
| TWI816712B (zh) | 癌促進因子表現抑制劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌促進因子表現抑制劑及癌之預防或治療劑 | |
| Liu et al. | LncRNA MNX1-AS1 sustains inactivation of Hippo pathway through a positive feedback loop with USP16/IGF2BP3 axis in gallbladder cancer | |
| JP6508716B2 (ja) | 膀胱癌細胞のシスプラチン耐性マーカー及びその使用 | |
| Li et al. | Let-7b-3p inhibits tumor growth and metastasis by targeting the BRF2-mediated MAPK/ERK pathway in human lung adenocarcinoma | |
| WO2016152352A1 (ja) | メラノーマ特異的バイオマーカー及びその利用 | |
| Zhou et al. | TARBP2 promotes tumor angiogenesis and metastasis by destabilizing antiangiogenic factor mRNAs | |
| De Bock et al. | Inhibition of urokinase receptor gene expression and cell invasion by anti‐uPAR DNAzymes in osteosarcoma cells | |
| CA2805548A1 (en) | The role of fragile x mental retardation gene and protein in cancer metastasis | |
| JP7177439B2 (ja) | 炎症促進因子発現抑制剤、その有効成分のスクリーニング方法、該方法に有用な発現カセット、診断薬、及び診断方法 | |
| AU2017285726B2 (en) | Methods for diagnosing and treating metastatic cancer | |
| Li et al. | Micro ribonucleic acid‐93 promotes proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by targeting disabled 2 | |
| CN112462072B (zh) | 一种tmub1蛋白在制备肿瘤免疫抑制分子检测剂中的应用 | |
| Shi et al. | Bioinformatics identification of miR‐514b‐5p promotes NSCLC progression and induces PI3K/AKT and p38 pathways by targeting small glutamine‐rich tetratricopeptide repeat‐containing protein beta |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171219 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180718 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180828 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181012 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190319 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190328 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6508716 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |