JP2016140336A - ヒト肝細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ミリセチンを含有する培地にて培養したヒト肝細胞である。培地中におけるミリセチンの濃度は1〜30μモル/Lである。ミリセチンを含有する培地における培養日数は5〜10日である。ヒト肝細胞は肝実質細胞である。ヒト肝細胞は移植用であり、先天代謝異常症、慢性肝不全又は急性肝不全の患者に対する移植である。
【選択図】図1
Description
Ra、Rb、Rc、Rd、Re及びRfは、それぞれ独立してH、1〜5つのRyで置換された炭素数1〜10のアルキル基、又は、炭素数2〜20のジアルキルエーテル基であり、ただし該ジアルキルエーテル基の各炭素数1〜10のアルキルは1〜5つのRyで置換されており、
Ryは、Rq、あるいは、炭素数2〜10のアルキル基、炭素数3〜10のシクロアルキル基、炭素数3〜10のシクロアルキル基アルキル基、炭素数8〜14のトリシクロアルキル基アルキル基、フェニル基、ナフチル基又は炭素数14の芳香族基であり、
R1、R2、R3及びR4は、それぞれ独立してH又は炭素数1〜10のアルキル基、炭素数2〜10のアルケニル基、炭素数2〜10のアルキニル基、炭素数3〜10のシクロアルキル基、フェニル基、ナフチル基、炭素数14の芳香族基であり、
Rqは、CN、OH又はハロゲン原子である。
正常ヒト凍結肝細胞(Lot# FLO, EJW)はCelsis、In Vitro Technologies(Baltimore, MD)から購入した。常法に従い解凍後、肝細胞1×106個を1 micro-mol/L dexamethasone, 1 micro-mol/L insulin, 2 mmol/L L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin, 10%ウシ胎児血清を含むWilliam’s E培地(Sigma、W1878)2 mLに懸濁し、6穴培養プレート(BD Biocoat、type I collagen-coated 6-well plate、Becton Dickinson、Cat code 2352227)に播種、5%CO2、37℃で培養した。20時間培養後、20mmoL/Lの濃度でdimethylsulfoxideに溶かしたミリセチン(Sigma-Aldrich、M6760)を、最終濃度で1、3、10、30micro-mol/Lとなるように培地に添加し、7日間培養した(図1A、B)。図1Aは、ミリセチン存在下で培養する前のヒト肝実質細胞の形態であり、Ctrl;対照1(ミリセチン無添加)、DMSO;対照2(ミリセチン添加時の溶媒であるDMSOのみを添加)、1μM;ミリセチン1micro-mol/L添加、3μM;ミリセチン3micro-mol/L添加、10μM;ミリセチン10micro-mol/L添加、30μM;ミリセチン30micro-mol/L添加である。図1Bは、ミリセチン存在下で7日間培養したときのヒト肝実質細胞の形態であり、Ctrl;対照1(ミリセチン無添加)、DMSO;対照2(ミリセチン添加時の溶媒であるDMSOのみを添加)、1μM;ミリセチン1micro-mol/L添加、3μM;ミリセチン3micro-mol/L添加、10μM;ミリセチン10micro-mol/L添加、30μM;ミリセチン30micro-mol/L添加である。
2−1.アンモニア除去能
上記培地に最終濃度で2mmol/LとなるようにNH4Clを加え、1時間おきに4時間まで培地中のアンモニア濃度を測定(ブロモクレゾールグリーン法)し、濃度の減少直線の傾きから細胞のアンモニア除去能(fmol/hr/cell)を求めた(図2)。
培養プレートから細胞を回収しRNAを抽出、逆転写によりcDNAを調製した。このcDNAを用い、肝関連遺伝子(アルブミン、CYP3A4、α1アンチトリプシン、チロシンアミノトランスフェラーゼ、トリプトファン2,3ジオキシゲナーゼ、HNF4a、サイトケラチン18、クレアチンリン酸合成酵素1、オルニチントランスカルバミラーゼ)および内部標準としてGAPDH遺伝子の発現を定量PCRによって調べた(図3)。
免疫不全SCIDマウス(C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid、日本エスエルシー)オスとSCIDマウス化したオルニチントランスカルバミラーゼ欠損マウス(spf-ash、熊本大学、国立成育医療研究センター)メスを交配し、産仔を得た。ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)法によってオルニチントランスカルバミラーゼ欠損を確認した後、生後4日齢の新生仔肝に、ミリセチン5 micro-mol/L存在下で10日間培養したヒト肝細胞2×105個(生理的食塩水懸濁液として20 micro-L)を直接穿針して移植した(27ゲージ注射針使用)。対照として、生理的食塩水のみ、あるいはミリセチンを加えない培地で10日間培養したヒト肝細胞を投与した。その後、マウスの生存日数を調べた。結果を表1に示す。
Claims (9)
- ミリセチンを含有する培地にて培養したヒト肝細胞。
- 培地中における前記ミリセチンの濃度は1〜30μモル/Lであることを特徴とする請求項1に記載のヒト肝細胞。
- 前記培地は、ウシ胎児血清、インスリン、デキサメタゾン、ペニシリン、及び、ストレプトマイシを含有することを特徴とする請求項1又は2に記載のヒト肝細胞。
- ミリセチンを含有しない培地でヒト肝細胞を18〜22時間培養後、その培地にミリセチンを添加して、ミリセチンを含有する培地にて培養したことを特徴とする請求項1乃至3の何れか1項に記載のヒト肝細胞。
- 前記ミリセチンを含有する培地における培養日数は、5〜10日であることを特徴とする請求項4に記載のヒト肝細胞。
- 前記ヒト肝細胞は肝実質細胞であることを特徴とする請求項1乃至5の何れかに記載のヒト肝細胞。
- 前記ヒト肝細胞は移植用であることを特徴とする請求項1乃至6の何れかに記載のヒト肝細胞。
- 前記移植は、先天代謝異常症、慢性肝不全、又は、急性肝不全の患者に対する移植であることを特徴とする請求項7に記載のヒト肝細胞。
- 前記ヒト肝細胞の移植細胞数は、4x107〜3.9x1010個であることを特徴とする請求項7又は8に記載のヒト肝細胞。
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EUR. J. NUTR., 2008, 47(8), PP.479-490, JPN6018047957, ISSN: 0004057942 * |
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