JP2016135140A

JP2016135140A - 細胞培養方法

Info

Publication number: JP2016135140A
Application number: JP2016087706A
Authority: JP
Inventors: 健安藤; Takeshi Ando; 敏明山内; Toshiaki Yamauchi; 徳啓柴田; Noritaka Shibata
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2016-07-28
Anticipated expiration: 2035-09-04
Also published as: JP6156544B2; US20190078048A1; EP3235900A4; WO2016098271A1; US11066635B2; EP3235900A1; US20170204359A1; EP3235900B1

Abstract

【課題】従来の継代のタイミング判定方法は、1箇所の観察画像から培養容器の様子を推定している。ただし、細胞培養時には容器内で細胞が均一になっていることは稀であり、正確な継代のタイミング判定が課題となっている。【解決手段】複数の計測箇所のコンフルエント率の平均値が小さくても、細胞が偏りやすい培養容器１２１の中心部などでコンフルエント率が大きい場合には、継代を実施するなど、細胞の偏りを考慮した継代タイミング判定を行う。【選択図】図１

Description

本発明は、継代のタイミングを自動的に判定する細胞培養方法に関する。

細胞の培養においては、細胞の増殖に伴い、培養容器全体に細胞が広がるので、数日おきに継代作業が必要になる。従来の技術では、顕微鏡などの細胞観察画像に対して画像処理を施すことで、観察画像内に細胞が占める面積の割合を算出する。そして、その割合が予め決められた閾値を越えるタイミングで継代を実施する（例えば、特許文献１参照）。

また、培養容器内の複数点で細胞を観察し、そのバラつきを考慮し、培養容器を揺動させる細胞培養装置も存在している（例えば、特許文献２参照）。

特開２００３−１１６５３０号公報特開２０１０−９９０１１号公報

しかしながら、特許文献１のような継代タイミング判定の場合には、１箇所の観察画像から培養容器全体の様子を推定しているが、細胞培養時には容器内で細胞が均一になっていることは稀であり、正確な継代タイミング判定が困難な可能性がある。

また、特許文献２のような培養容器の複数点の計測をもとに細胞培養装置の動作を決定する場合においては、培養容器内の細胞の分布しやすさが考慮されておらず、計測点の選択法により結果に差異が生じる可能性がある。

本発明は、これら従来の課題を解決するものであり、画像情報をもとに適切な継代タイミング判定が可能な細胞培養を提供するもとを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明における細胞培養方法は、培養容器内の指定された位置の観察画像内において細胞が占める面積の割合であるコンフルエント率に基づいて前記培養容器の継代のタイミングを判定して細胞を培養するに際し、前記観察画像内の全ての計測エリアの平均値に対する第１閾値と、前記観察画像内の少なくとも１つの計測エリアに対する第２閾値とに基づいて、継代タイミングを判定し、前記第２閾値は、前記第１閾値より大きい、ことを特徴とする。

以上のように、本発明によれば、適切な継代タイミング判定を実施することができる。

本発明の実施の形態にかかる細胞培養装置の概要図本発明の実施の形態にかかる細胞の観察画像を示す図本発明の実施の形態においてコンフルエント率と時間との関係を示す図本発明の実施の形態における測定箇所を示す図本発明の実施の形態における測定箇所の例を示す図本発明の実施の形態において第１偏り状態を示す図本発明の実施の形態において第２偏り状態を示す図

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同じ構成要素には同じ符号を付しており、説明を省略する場合もある。また、図面は、理解しやすくするためにそれぞれの構成要素を主体として、模式的に示している。

図１は、本発明の実施の形態における細胞培養装置１００の概要図である。細胞培養装置１００は、培養容器１２１内の複数の計測箇所においてコンフルエント率を算出することで、細胞の偏りなどを考慮した最適なタイミングで継代を実施できる。ここで、継代とは、培養容器１２１内の細胞数が過度に増えることを防ぐために、培養容器１２１内で増殖した細胞を別の培養容器に播種しなおす動作を指す。

図１に示すように、細胞培養装置１００は、載置部１２２と、観察部１１０と、計測位置指定部１１１と、駆動部１１２と、画像計測部１１３と、画像処理部１１４と、経時記録部１１５と、継代タイミング判定部１１６とを有する。載置部１２２は、培養容器１２１を載置する。観察部１１０は、培養容器１２１内の細胞を観察する。計測位置指定部１１１は、観察部１１０が観察する１箇所以上の位置を指定する。駆動部１１２は、計測位置指定部１１１で指定された計測位置に観察部１１０を移動させる。画像計測部１１３は、計測位置指定部１１１で指定された位置の観察画像を撮影および記録する。画像処理部１１４は、画像計測部１１３で計測された画像内において細胞が占める面積の割合を算出する。経時記録部１１５は、画像処理部１１４で算出された細胞のコンフルエント率の離散的な経時変化を記録する。継代タイミング判定部１１６は、計測位置指定部１１１において指定された複数の位置における画像処理結果から継代のタイミングを判定する。

ここで、細胞のコンフルエント率とは、観察画像の全面積に対する、観察画像内の特定の細胞部分の面積の占める割合である。図２を用いて具体的に説明すると、観察画像の全面積は、斜線領域１３１ａと斜線以外の領域１３１ｂとを合わせた面積のことであり、特定の細胞部分の面積は、斜線領域１３１ａの面積のことである。

継代タイミング判定部１１６は、計測位置指定部１１１で指定された複数の計測位置で計測された細胞のコンフルエント率の平均値Ａに基づいて、継代を実施する時刻を指定する。具体的には、事前に定めた時間毎に細胞のコンフルエント率を確認し、コンフルエント率の平均値Ａが予め指定したコンフルエント率の第１閾値Ａｐを越えたときに、継代を実施する。なお、第１閾値Ａｐは、この閾値を超えると細胞増殖のスピードが低くなるコンフルエント率とし、細胞培養の効率を考慮して設定する。

継代タイミング判定部１１６では、図３に示すように、コンフルエント率の平均値Ａに加えて、観察画像における細胞増殖の偏りを考慮して、継代タイミングを判定する。つまり、コンフルエント率の平均値Ａが第１閾値Ａｐより小さい場合でも、細胞の偏りによりコンフルエント率が事前に設定した第２閾値Ａｐ´よりも局所的に大きい場合には、継代を実施する。ここで、第２閾値Ａｐ´は、第１閾値Ａｐよりも大きな値である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞を未分化状態で培養した場合には、コンフルエント率が高くなると分化することが知られており、局所的なコンフルエント率を検出して対策することで、局所的に分化することを防ぎ、細胞品質の低下を防ぐことができる。なお、第２閾値Ａｐ´は、この閾値を超えると、ヒトｉＰＳ細胞の未分化維持培養においては、分化した細胞の混在が見受けられる可能性があるために設定する。

主な細胞の偏りの生じ方は、培養容器１２１内に発生した培地の渦により播種後の細胞が培養容器１２１の中心部に偏った状態（以下、「第１偏り状態」とする）と、培養容器１２１の搬送時の加減速により発生した培地の波により播種後の細胞が培養容器１２１内で直線状に偏った状態（以下、「第２偏り状態」とする）、という２種類である。

細胞播種後には、例えば、培養容器１２１とマニピュレータ等の位置関係を変更するために培養容器１２１の移動が頻繁に発生するために、上記の第１偏り状態や第２偏り状態が生じやすくなっている。そのため、計測位置指定部１１１では、上記２種類の現象を確実に捉えられるように計測位置を設定する必要がある。具体的な設定について、図４Ａ、図４Ｂを用いて説明する。本実施の形態では、図４Ａに示すように、培養容器１２１の中心を計測エリアＰ０とし、この計測エリアＰ０から少なくとも所定距離（１０ｃｍシャーレでは２ｃｍ）だけ離れた位置に、正方形の辺に沿って等間隔に計測エリアＰ１〜Ｐ８を設定している。ここで用いている具体的な培養容器１２１は、直径１０ｃｍの円形を底面に持つ容器であり、計測エリアは、長方形（３ｍｍ×４ｍｍ）の領域で実施している。このように設定した場合、第１偏り状態の現象を捉えるためには、少なくとも培養容器１２１の中心Ｐ０を１エリア計測するように設定する。また、第２偏り状態の現象を捉えるためには、培養容器１２１の中心部のＰ０と中心部以外の任意の２エリアＰ７、Ｐ５を計測する必要がある。ただし、第２偏り状態の現象を捉えるためには、計測エリアＰ０とそれ以外の計測エリア（例えば図４Ｂでは、計測エリアＰ７）を通る直線上以外の少なくとも１エリア（例えば図４Ｂでは、計測エリアＰ５）を設定する必要がある。

上記第１偏り状態と第２偏り状態は同時に生じないので、少なくとも図４Ｂに示す３エリアを計測箇所として計測位置指定部１１１で指定すれば、局所的にコンフルエント率が高くなっている現象を見つけることができる。

ここで第１偏り状態の現象と第２偏り状態の現象を具体的に図示して説明する。図５Ａは、本実施の形態において第１偏り状態を示した図であり、図５Ｂは、本実施の形態において第２偏り状態を示した図である。第１偏り状態では、培養容器１２１の搬送の過程において、培養容器１２１中の培養液が渦巻き状に流れることから培養容器１２１の中心の計測エリアＰ０に細胞が溜まり易くなる。一方、第２偏り状態では、培養容器１２１の搬送の過程において、培養容器１２１中の培養液が横波状に流れることから培養容器１２１で直線状（ここでは、計測エリアＰ２、Ｐ０、Ｐ６）に細胞が溜まり易くなる。

判定して継代を実施する条件に付いて、さらに詳しく説明する。前述の９エリア（Ｐ０〜Ｐ８）を計測位置として指定した場合、以下の３条件のいずれかを満たす場合に継代を開始する。
（１）計測エリアＰ０〜Ｐ８の全ての計測エリアにおけるコンフルエント率の平均値Ａが第１閾値Ａｐを超えた場合、
（２）計測エリアＰ０〜Ｐ８の全ての計測エリアにおけるコンフルエント率の平均値Ａは第１閾値Ａｐより小さいが、中心Ｐ０のコンフルエント率が第２閾値Ａｐ´を超えた場合、
（３）計測エリアＰ０〜Ｐ８の全ての計測エリアにおけるコンフルエント率の平均値Ａは第１閾値Ａｐより小さいが、計測エリアＰ０〜Ｐ８の中で一直線状に存在する２エリア以上のエリア（例えば、計測エリアＰ１およびＰ０およびＰ５や計測エリアＰ１およびＰ８およびＰ７など）のコンフルエント率が第２閾値Ａｐ´を超えた場合。ここで、上記（２）は、前述の第１偏り状態を判定する条件であり、上記（３）は、前述の第２偏り状態を判定する条件である。それぞれの条件を満たすか否かを判定することにより、第１偏り状態および第２偏り状態を判定することも可能である。具体的には、上記（１）を満たさずに上記（２）を満たす場合を第１偏り状態と判定し、上記（１）を満たさずに上記（３）を満たす場合を第２偏り状態と判定することも可能である。なお、上記（１）〜（３）の条件を満たさない場合、例えば計測エリアＰ１〜Ｐ８の直線上にない２エリアのみ（例えば、計測エリアＰ５およびＰ７）が第２閾値Ａｐ´の値を越えている場合などは、細胞増殖に偏りが生じているのではなく、計測エリアの選び方によるバラつきと判断し、継代を実施しない。ヒトｉＰＳ細胞をコロニー培養した場合に、第１閾値Ａｐを４５％以上、７０％以下、第２閾値Ａｐ´を７５％以上、９０％以下とした場合に安定した細胞品質を維持したままでの細胞培養が可能であった。さらに好ましくは、第１閾値Ａｐを６０％、第２閾値Ａｐ´を８０％とした場合に、より安定した細胞品質を維持したままでの細胞培養が可能であった。

なお、閾値Ａｐ、Ａｐ´の値を低く設定すると、細胞の品質を高く維持できるが、細胞の増殖が少なく株分け枚数が少なくなる。一方、閾値Ａｐ、Ａｐ´の値を高く設定すると、細胞の品質は低下しやすくなるが、細胞数は増えて株分け枚数を増やすことができる。すなわち、培養における細胞の品質重視のモードと細胞の数重視のモードを設定し、品質重視のモードが選択された場合には閾値Ａｐ、Ａｐ´の値を通常よりも小さくし、数重視のモードが選択された場合には閾値Ａｐ、Ａｐ´の値を通常よりも大きくすることで、細胞の品質または数を重視した継代を行うことも可能である。

なお、継代時間の推定は、予め指定された細胞種類に応じて設定された細胞増殖モデルと経時記録部１１５に記録されたコンフルエント率の推移から、図３に示す近似細胞増殖曲線を算出し、予め指定したコンフルエント率の第１閾値Ａｐに到達する時刻Ｔｐを推定することで可能であると考えられる。これにより、より適切なタイミングで継代を実施することができ、細胞品質の安定化を実現することができる。

なお、第二閾値を超えた培養容器では、局所的にコンフルエント率が高くなっており、低い品質の細胞が混在している可能性がある。このため、細胞培養装置に培養容器の撮像画像・撮像日時・撮像計測エリアなどの情報を管理する培養容器情報管理部をさらに設け、第二閾値を超えた培養容器に対しては、その培養容器に関連付けられるデータとして第二閾値を超えたことが分かるフラグを追加する。これによりユーザがその培養容器を操作する場合には、第二閾値を超えたことがある旨を細胞培養装置に設置している表示部に表示し、ユーザに伝達することができる。

なお、ヒトｉＰＳ細胞のように、シングルセル状態ではなくコロニーとして細胞が増殖する場合においては、画像処理部１１４は、細胞のコンフルエント率を算出するだけでなく、コロニー径も算出することができる。ヒトｉＰＳ細胞の場合には、コロニー径が大き過ぎる場合には、細胞が分化してしまうことが知られており、継代タイミング判定部１１６においては、複数の計測箇所におけるコンフルエント率とコロニー径の分布から継代タイミングを判定することが好ましい。これにより、品質を維持しながらの培養を高精度に実施することができる。

本発明の細胞培養方法は、再生医療や創薬分野で有用である。

１００細胞培養装置
１１０観察部
１１１計測位置指定部
１１２駆動部
１１３画像計測部
１１４画像処理部
１１５経時記録部
１１６継代タイミング判定部
１２１培養容器
１２２載置部
１３１ａ斜線領域
１３１ｂ斜線以外の領域

Claims

培養容器内の指定された位置の観察画像内において細胞が占める面積の割合であるコンフルエント率に基づいて前記培養容器の継代のタイミングを判定して細胞を培養するに際し、
前記観察画像内の全ての計測エリアの平均値に対する第１閾値と、前記観察画像内の少なくとも１つの計測エリアに対する第２閾値とに基づいて、継代タイミングを判定し、
前記第２閾値は、前記第１閾値より大きい、
細胞培養方法。
前記培養容器の中心を計測エリアＰ０とした場合、前記計測エリアＰ０に対して、前記第２閾値で継代タイミングを判定する、
請求項１に記載の細胞培養方法。
前記計測エリアの平均値が前記第１閾値より小さく、かつ、前記計測エリアＰ０が前記第２閾値より大きい場合、前記継代タイミング判定部は、前記培養容器の中心部に細胞が偏っている第１偏り状態であると判定する、
請求項２に記載の細胞培養方法。
前記培養容器の中心を計測エリアＰ０とし、前記計測エリアＰ０から少なくとも所定距離だけ離れた位置に正方形の辺に沿って等間隔に計測エリアＰ１〜Ｐ８を設定した場合、前記計測位置指定部は、前記計測エリアＰ０と前記計測エリアＰ１〜Ｐ８のいずれかとを通る直線上以外に、少なくとも１つの計測エリアを設定する、
請求項１に記載の細胞培養方法。
前記培養容器の中心を計測エリアＰ０とし、前記計測エリアＰ０から少なくとも所定距離だけ離れた位置に正方形の辺に沿って等間隔に計測エリアＰ１〜Ｐ８を設定した場合、前記継代タイミング判定部は、前記計測エリアＰ０と前記計測エリアＰ１〜Ｐ８のいずれかとを通る直線上の２点エリアに対して、前記第２閾値で継代タイミングを判定する、
請求項４に記載の細胞培養方法。
前記計測エリアの平均値が前記第１閾値より小さく、かつ、前記計測エリアＰ０と前記計測エリアＰ１〜Ｐ８のいずれかとを通る直線上の２点エリアが前記第２閾値より大きい場合、前記継代タイミング判定部は、前記培養容器内において直線状に細胞が偏っている第２偏り状態であると判定する、
請求項５に記載の細胞培養方法。
前記第１閾値はコンフルエント率４５％以上、７０％以下であり、前記第２閾値はコンフルエント率７５％以上、９０％以下である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
前記第１閾値はコンフルエント率６０％であり、前記第２閾値はコンフルエント率８０％である、
請求項７に記載の細胞培養方法。