JP2016127838A - イヌにおける肝臓の銅蓄積についての遺伝子検査およびペット用低銅食餌 - Google Patents

イヌにおける肝臓の銅蓄積についての遺伝子検査およびペット用低銅食餌 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を決定する方法及び肝臓の銅蓄積を予防する食材の提供。
【解決手段】試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６の一塩基多型（ＳＮＰ）及び（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つ又は複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。イヌのゲノムにおける（ｃ）肝臓の銅蓄積に対して感受性を示すＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７Ａ又はＵＢＬ５遺伝子における多型及び／又は（ｄ）前記多型（ｃ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することをさらに含む、方法。４．５〜１０ｍｇ／ｋｇ又は４．５〜８ｍｇの濃度の銅を含み、及び／又は１２０〜２５０ｍｇ／ｋｇ又は１５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度の亜鉛を含む、肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法に用いるための食材。
【選択図】なし

Description

本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患から保護されている可能性を決定す
る方法に関する。本発明は、イヌにおける肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患の予防に使用
するためのイヌ用の食材、ならびに該食材を作製する方法にも関する。
肝疾患はイヌには普通見られないが、その最も普通の形態の１つは慢性肝炎（ＣＨ）で
ある。ＣＨは組織学的診断により、線維症、炎症、ならびに肝細胞アポトーシスおよび壊
死の存在を特徴とする。肝硬変は、疾患の最終段階として生じ得る。ＣＨの原因の１つは
、肝臓の銅蓄積である。肝臓の銅蓄積は、銅取込みの増大、肝臓の銅代謝における原発性
の代謝欠陥、または銅の胆汁排泄の変化の結果として生じ得る。後者の場合、これがどの
程度までイヌで生じるか明らかではないが、銅毒性は肝臓の炎症、線維症および胆汁鬱滞
に続発する。続発性の銅蓄積症において、銅蓄積は主として門脈周囲の実質に限定され、
肝銅濃度は家族性の蓄積症における蓄積よりも低い。誘発因子（単数または複数）および
感作抗原の性質は知られていないが、原発性の胆汁性肝硬変において観察される免疫学的
異常および形態学的特徴は、免疫介在性の機序と同時に発生する。
小腸は、哺乳類における食餌性の銅吸収の主要部位として認識されている。腸管腔から
腸管粘膜への輸送は、飽和輸送成分に関与する担体介在性の過程である。粘膜細胞に入れ
ば、新たに吸収された銅の約８０％はサイトゾルに存在し、主としてメタロチオネイン（
ＭＴ）と結合する。これは、金属のホメオスタシス、貯蔵、輸送および解毒等、多くの機
能を備える低分子量の誘導タンパク質である。腸細胞を通過した後、銅は門脈循環へと進
み、そこで担体タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸と結合して肝臓へと輸送され、より
少量が腎臓へと進む。多くの哺乳類において銅は容易に排泄され、銅排泄の主要経路は胆
汁である。
肝臓の銅蓄積の遺伝的な根拠は未知である。これは、銅は多くの異なった生物学的経路
に関与しており、その各々には非常に複雑で多数の遺伝子が関与しているという事実によ
り難しくなっている。過剰な肝臓の銅蓄積を有するイヌは、強力な銅キレート化剤である
Ｄ−ペニシラミンを用いて通常は治療される。しかし最終的には、ＣＨのイヌに適用でき
る最も有効な治療法は肝移植である。
国際公開第２００９／０４４１５２（Ａ２）号パンフレットは、肝臓の銅蓄積に対する
イヌの感受性を決定する方法であって、（ａ）銅蓄積に対する感受性を示すイヌのＧＯＬ
ＧＡ５、ＡＴＰ７ａまたはＵＢＬ５遺伝子における多型、および／または（ｂ）前記多型
（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することと、これにより肝臓の銅蓄積に対す
るイヌの感受性を決定することとを含む方法を開示する。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／
０２３５５号明細書（未発行）は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法に
用いるためのさらに別の多型を開示する。
本発明者らは、イヌにおける低レベルの肝臓銅と関連し、したがって肝臓の銅蓄積から
の保護を示す、イヌのＡＴＰ７Ａ遺伝子におけるコード領域突然変異を見出した。この突
然変異は、タンパク質のアミノ酸に変化をもたらす一塩基多型（ＳＮＰ）である。本明細
書に記載されている研究において、この多型が細胞における銅輸送に機能的影響を与える
ことが示された。ＡＴＰ７Ａ遺伝子におけるこの多型の発見は、この多型および／または
この多型と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型をスクリーニングすることによる、イ
ヌが肝臓の銅蓄積から保護されているかを予見する検査のための基盤を提供する。
本発明者らは、近年、イヌにおける高レベルの肝臓銅と関連し、したがって肝臓の銅蓄
積に対する感受性を示す、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５遺伝子におけ
るまたはそれらの領域における多型も見出した（国際公開第２００９／０４４１５２（Ａ
２）号パンフレットおよび未発行の国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／０２３５５号明細書）
。したがって、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型の検出結果と、イヌ
における肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型の検出結果を組み合わ
せた遺伝子検査は、イヌが肝臓の銅蓄積の危険性を有する可能性に関して特に情報価値が
あるであろう。
イヌの肝臓における銅の蓄積は、高い肝臓銅に起因し得る肝臓の１つまたは複数の疾患
または状態に至り得る。例えば、高い肝臓銅は、慢性肝炎、肝硬変および最終的には肝不
全に至り得る。したがって、本発明により、高銅と関連するこのような肝疾患または状態
の発症から保護されていないまたはその危険性があるイヌを同定することができる。イヌ
が肝臓の銅蓄積からの保護を示す突然変異を持たないことが確認されると、本発明の食材
を投与すること等によって、低レベルまたは正常レベルの肝臓銅レベルを維持するための
、このイヌに適した予防措置を同定することができる。さらに、肝臓の銅蓄積からの保護
と関連する変異を有すると確認されたイヌは、肝疾患または他の高銅と関連する状態を罹
患する可能性が低いイヌを作出する目的を有する繁殖プログラムに使用するのに理想的で
ある。
したがって、本発明は、イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性
を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３
＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは
複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供
する。
本発明は、
・ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれと連
鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護
との関連に関する情報を含むデータベースと、
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている多型の有無に関するデータをコ
ンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）該データを、前記多型および前記多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそ
れに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較す
ることと、
（ｃ）比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定すること
と
を含む方法と、
・コンピュータシステムにおいて実行される際に、コンピュータシステムに本発明の方
法を実施するよう指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムと、
・本発明のコンピュータプログラムおよび本発明のデータベースを含むコンピュータ記
憶媒体と、
・本発明の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている多型の有無に関するデータを受
け取るための手段と、
（ｂ）前記多型および／またはそれと連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、ならび
にそれら多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連
に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、前記比較に基づいてイヌ
が肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステムと、
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、イヌのゲノ
ムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（
ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多
型の有無を検出することを含む方法と、
・肝臓の銅蓄積からのイヌの保護を決定するための、本明細書に定義されている多型の
使用と、
・肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出するためのイヌを選択する方法
であって、
・第一のイヌ候補のゲノムが、本発明に係る肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまた
は複数の多型を含むか決定し、これによって第一のイヌ候補が、肝臓の銅蓄積から保護さ
れる可能性のある子孫の作出に適しているか決定することと、
・場合により、第一のイヌとは異なる性別の第二のイヌのゲノムが、本発明に係る肝
臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定することと、
・場合により、第一のイヌと第二のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される
可能性のある子孫を作出することと
を含む方法
も提供する。
さらに、また驚くべきことに、本発明者らは、ラブラドールレトリーバーにおける肝銅
濃度を低下させるペニシラミン薬の使用よりもさらに有効な食材を見出した。したがって
この食材は、ラブラドールレトリーバーの血統のイヌにおける肝臓の銅蓄積を予防するの
に有用であり、慢性肝炎、肝硬変および肝不全等、高い肝臓銅と関連する疾患または状態
の予防に用いることができる。
したがって、本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌにお
ける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法に用いるための、４．５〜１２ｍｇ／
ｋｇ（乾物）の濃度の銅を含む食材であって、好ましくは、イヌが肝臓の銅蓄積から保護
されている可能性が本発明の方法によって決定されている、食材も提供する。
本発明は、
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌにおける肝臓の銅蓄積に起
因し得る疾患を予防する方法であって、好ましくは、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されて
いる可能性が本発明の方法によって決定されており、イヌに本発明の食材を給餌すること
を含む方法と、
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌのための食材の製造におけ
る銅の使用であって、好ましくは、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性が本発
明の方法によって決定されており、食材が、４．５〜１２ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度の銅
を含み、イヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に用いるためのものである、
使用と、
・ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌにおける肝臓の銅蓄積に起
因し得る疾患の予防において同時に、別個にまたは連続的に用いるための、４．５〜１２
ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度の銅と、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を提供す
るための亜鉛サプリメントとを含む食材を含むパックであって、好ましくは、イヌが肝臓
の銅蓄積から保護されている可能性が本発明の方法によって決定されている、パックと、
・本発明のラベルを付けた食材または本発明のラベルを付けたパックと
をさらに提供する。
無治療における肝臓の銅蓄積の進行を例示する図である。図は、任意の治療に先立つ８．７カ月（範囲６〜１５カ月）隔てた２回の検査における１１頭のラブラドールレトリーバーの肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））を示す。この期間中、すべての動物はそれらの通常の維持食事を給餌され、それは、製造業者により、乾物を基準にして１２〜２５ｍｇ／ｋｇの間の食餌銅濃度および乾物を基準にして８０〜２７０ｍｇ／ｋｇの間の亜鉛濃度を含んだ。菱形印は外れ値を表す。 試験開始時の２４頭のラブラドールレトリーバーおよび食事管理中の２頭の対照検査における肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））を例示する図である。イヌは以下のように２群に分けた：第１群＝食餌＋グルコン酸亜鉛錠剤、第２群＝食餌＋プラセボ。ｘ軸の数字に対するキーは以下の通りである：１＋２＝治療前、３＋４＝再チェック１（８カ月（範囲５〜１３カ月）後の最初の対照検査）、５＋６＝再チェック２（１６カ月（範囲１２〜２５カ月）後の２度目の対照検査）。検査したイヌの数は以下の通りである：１：Ｎ＝第１群中の１２頭のイヌ、２：Ｎ＝第２群中の１２頭のイヌ、３：Ｎ＝第１群中の９頭のイヌ、４：Ｎ＝第２群中の１２頭のイヌ、５：Ｎ＝第１群中の６頭のイヌ、６：Ｎ＝第２群中の１０頭のイヌ。菱形印は外れ値を表す。点線は成犬に対する肝銅の正常レベルを表す。 本発明の食餌の１８頭のラブラドールレトリーバーにおける肝銅濃度（ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））に対する有効性を、ペニシラミン単独の効果と比較して例示する図である。ｘ軸の数字に対するキーは以下の通りである：１＝ペニシラミン前、２＝ペニシラミン後／食物前、３＝食物後。ｘ軸に沿って１から２へ進むとペニシラミン効果が示され、一方２から３へと進むと食物効果が示される。点線は、成犬に対する肝銅の正常レベルを表す。 本発明を実施するように調整された機能要素を図式的に例示する図である。 性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型によるラブラドールレトリーバーにおける平均銅レベル（表ＶＩＩのデータ）を図示する図である。ｙ軸は乾燥重量による肝臓銅（ｍｇ／ｋｇ）である。ｘ軸はＡＴＰ７Ａ遺伝子型である：左から右へ、最初の３つは試験した雌イヌについてであり、最後の２つは試験した雄イヌについてである。誤差バーは標準誤差である。 ラブラドールレトリーバーにおける性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型による組織学的銅スコア（表ＶＩＩのデータ）のボックスプロットを示す図である。ｙ軸は銅組織学的スコアの値である。ｘ軸はＡＴＰ７Ａ遺伝子型であり：左から右へ、最初の３つは試験した雌イヌについてであり、最後の２つは試験した雄イヌについてである。クラスカル・ワリスｐ−値は０．０００３９６である。 イヌ初代線維芽細胞における銅アイソトープの測定値を示す図である。（Ａ）１０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの６４Ｃｕと２４時間または４８時間インキュベーションした後のＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ各細胞における銅アイソトープ（６４Ｃｕ）の測定値である。タンパク質アッセイおよびＭＴＳアッセイにより、細胞培養条件に対してガンマカウントを補正した。２４時間インキュベーションのデータポイントは、２回繰り返し行った独立した２実験から得られた平均＋／−ＳＥＭを表し、全細胞タンパク質のカウント毎分（ｃｐｍ）として表す。他のデータポイントは、２回繰り返した１実験から得られた平均＋／−ＳＥＭを表す。 イヌ初代線維芽細胞における銅アイソトープの測定値を示す図である。（Ｂ）２４時間インキュベーションし、続いて十分に洗浄して銅アイソトープを含まない培地で２時間インキュベーションした後のＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ各細胞における銅アイソトープ（６４Ｃｕ）の測定値である。タンパク質アッセイおよびＭＴＳアッセイにより、細胞培養条件に対してガンマカウントを補正した。２４時間インキュベーションのデータポイントは、２回繰り返し行った独立した２実験から得られた平均＋／−ＳＥＭを表し、全細胞タンパク質のカウント毎分（ｃｐｍ）として表す。他のデータポイントは、２回繰り返した１実験から得られた平均＋／−ＳＥＭを表す。 ヒト初代線維芽細胞における銅アイソトープの測定値を示す図である。（Ｃ）１０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの６４Ｃｕと２４時間または４８時間インキュベーションした後の、メンケス病患者または非メンケス病患者（対照）由来の初代線維芽細胞における銅アイソトープ（６４Ｃｕ）の測定値である。タンパク質アッセイにより、細胞培養条件に対してガンマカウントを補正した。データポイントは（Ａ）および（Ｂ）と同様に表す。 ヒト初代線維芽細胞における銅アイソトープの測定値を示す図である。（Ｄ）２４時間インキュベーションし、続いて十分に洗浄して銅アイソトープを含まない培地で２時間インキュベーションした後の、メンケス病患者または非メンケス病患者（対照）由来の初代線維芽細胞における銅アイソトープ（６４Ｃｕ）の測定値である。タンパク質アッセイにより、細胞培養条件に対してガンマカウントを補正した。データポイントは（Ａ）および（Ｂ）と同様に表す。 イヌ初代線維芽細胞におけるＡＴＰ７Ａの遺伝子発現レベルを示す図である。（Ａ）３’（ＡＴＰ７Ａｉｉｉ）領域、５’（ＡＴＰ７Ａｉｉ）領域または突然変異と重複する領域（ＡＴＰ７Ａｉ）をｑＰＣＲ解析する前に、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ各細胞を無処理（上グラフ）または１００μＭの銅の存在下で２４時間インキュベート（下グラフ）した。データは、３回複製したウェルにおいて行われた独立した２実験から得られた平均＋／−ＳＤを図示する。（Ｂ）ＡＴＰ７Ａ発現のウエスタンブロット解析。細胞を無処理のまま（−）、あるいは１００μＭのＢＣＳまたは１００μＭの銅と２４時間インキュベートした。試料を溶解し、その後タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニワトリ抗ＡＴＰ７Ａ（１：２０００希釈）を用いて１時間イムノブロットした。次にメンブレンをＨＲＰ結合ヤギ抗ニワトリＩｇ抗体（１：１０，０００希釈）とさらに１時間インキュベートし、その後ＥＣＬ（商標）ウエスタンブロッティング検出試薬を用いて現像した。メンブレンをストリップし、β−チューブリン（１：２０，０００希釈）でリプローブして、ローディング量が等しいことを確認した。矢印は、予想される全長タンパク質を示す。 イヌ初代線維芽細胞におけるメタロチオネインの遺伝子発現レベルを提供する図である。ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ各細胞を１、１０または１００μＭの銅の存在下、あるいは無処理（ＵＴ）のまま２４時間インキュベートし、メタロチオネイン遺伝子のｑＰＣＲ解析に付した。図９（Ａ）は９５％信頼区間（ＣＩ）でＵＴ ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃと比較した倍数変化を図示し、（Ｂ）は９５％ＣＩでＵＴ ＡＴＰ７Ａ遺伝子型発現と比較した倍数変化を図示し、（Ｃ）は９５％信頼区間（ＣＩ）のｌｏｇ１０発現レベルを図示する。（Ｃ）において、グラフ内の上の線はＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ、中央の線はＡＴＰ７ＡＣ／Ｔ、下の線はＡＴＰ７ＡＣ／Ｃの遺伝子型のものである。 イヌの腸および肝臓組織におけるメタロチオネインの遺伝子発現レベルを例示する図である。ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／ＴまたはＡＴＰ７ＡＴ／ＴであるＡＴＰ７Ａを発現するイヌから（Ａ）肝臓および（Ｂ）小腸組織を摘出し、メタロチオネイン遺伝子のｑＰＣＲ解析に付した。データは、独立した５実験から得られたｌｏｇ１０発現レベルの平均および９５％ＣＩ（右パネル）、ならびに９５％ＣＩでＡＴＰ７ＡＣ／ Ｃと比較した倍数変化を図示する。 ＡＴＰ７Ａタンパク質の銅介在性輸送の特性を示す図である。ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ（左パネル）およびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ（右パネル）各細胞を、１００μＭ ＢＣＳの存在下スライドガラス上で１８時間培養し、その後洗浄し、培地中で１００μＭの銅と１、２または３時間インキュベーションした。細胞を固定し、抗ＡＴＰ７Ａ（各パネルの一番目の列）および抗５８Ｋ（各パネルの二番目の列）の各抗体で染色し、３重標識間接顕微鏡観察用に処理し、その後落射蛍光顕微鏡を用いて可視化した。ＡＴＰ７Ａおよび５８Ｋの像を重ね合わせて、重複領域の範囲を図示する（各パネルの三番目の列）。
配列の簡単な説明
配列番号１〜１４２は本発明のＳＮＰを含むポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４４〜１５９はプライマー配列である。
肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性の確認
肝臓における銅の蓄積は、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジ
ャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワ
イトテリア、ベッドリントンテリア、およびスカイテリアを含む多数のイヌの血統におけ
る肝疾患をもたらす。任意の血統の正常イヌの肝臓における平均銅濃度は、乾燥重量を基
準にして２００〜４００ｍｇ／ｋｇであるが、新生児のイヌは一般にそれより高い肝臓銅
濃度を有する。イヌの肝臓における銅の量は、生検によって測定することができる。
肝臓の銅蓄積から保護されるイヌは、肝臓銅を蓄積する危険性または可能性が低く、そ
の結果その肝臓銅濃度が乾燥重量を基準にして４００ｍｇ／ｋｇを超えるに至る可能性は
低い。肝臓の銅蓄積から保護されるイヌの肝臓銅濃度は、６００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば
５００ｍｇ／ｋｇ未満、４００ｍｇ／ｋｇ未満、または３００ｍｇ／ｋｇ未満であろう。
イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を本発明により決定することは、イヌが肝臓銅
を６００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば５００ｍｇ／ｋｇ未満、４００ｍｇ／ｋｇ未満、または
３００ｍｇ／ｋｇ未満のレベルにまで蓄積する可能性を決定することを含む。
肝臓の銅蓄積に対して感受性であるイヌは、銅を蓄積する傾向を有し、その結果その肝
臓銅濃度は、乾燥重量を基準にして４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルに達する。イヌが肝
臓の銅蓄積に対して感受性である危険性または可能性を決定することは、イヌが４００ｍ
ｇ／ｋｇ、例えば６００ｍｇ／ｋｇを超え、８００ｍｇ／ｋｇを超え、１０００ｍｇ／ｋ
ｇを超え、１５００ｍｇ／ｋｇを超え、２０００ｍｇ／ｋｇを超え、５０００ｍｇ／ｋｇ
を超え、または１００００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルにまで肝臓銅を蓄積する危険性また
は可能性を決定することを含む。
肝臓銅の蓄積は、組織化学によって評価することができる。例えば、肝銅濃度は、以前
に記載された通り、銅の分布を評価するためのルベアン酸染色技法を用いた組織化学によ
って半定量的に評価することができる（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈら、（１９８８）Ｖｅ
ｔ Ｑ１０：８４〜８９）。濃度は、次の通り０から５のスケールに段階付けすることが
できる。０＝銅の存在なし、１＝いくつかの銅陽性顆粒を含む孤立性肝細胞および／また
は細網組織球（reticulohistiocytic）（ＲＨＳ）細胞、２＝少数〜中程度の数の銅陽性
顆粒を含む小集団の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、３＝中程度の数の銅陽性顆粒を含
む大集団または広範囲の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、４＝多数の銅陽性顆粒を有す
る広範囲の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、ならびに５＝多数の銅陽性顆粒を有する肝
細胞および／またはＲＨＳ細胞が分散して存在する。この段階付けシステムによると、２
を超える銅スコアは異常である。
したがって、本発明によりイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するこ
とは、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈらに記載されている段階付けシステムを用いて、イヌが
３未満またはそれに等しい、例えば２．５、２、１．５未満またはそれに等しい、あるい
は１未満またはそれに等しいスコアを付与される可能性の決定に関与し得る。イヌが肝臓
の銅蓄積に対して感受性である危険性または可能性を決定することは、Ｖａｎ ｄｅｎ
Ｉｎｇｈらに記載されている段階付けシステムを用いて、イヌが２を超えるまたはそれに
等しい、例えば２．５、３、３．５を超えるまたはそれに等しい、あるいは４を超えるま
たはそれに等しいスコアを付与される危険性または可能性の決定に関与し得る。
保護の可能性または感受性の危険性は、例えば危険性因子、パーセンテージまたは確率
として表すことができる。イヌが銅を上述のレベルまで蓄積するであろうか否か決定する
こともできる。例えば、肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、イヌ
が銅を４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルまで蓄積するであろうか否か決定することを含む
ことができる。
肝臓銅の４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルまでの蓄積は、肝疾患を伴い、最終的に肝不
全に至り得る。したがって、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複
数の多型を含むかを決定することは、イヌが慢性肝炎、肝硬変および肝不全等、肝臓の銅
蓄積に起因し得る疾患または状態を発症する可能性が低いことを示す。反対に、イヌのゲ
ノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかを決定すること
は、このような疾患または状態に対するイヌの感受性を示す。したがって、本発明は、慢
性肝炎、肝硬変および肝不全などの肝臓の銅蓄積と関連する疾患に対するイヌの感受性ま
たはそれからの保護の可能性を検査する方法を提供する。
銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護の多型および徴候
驚くべきことに、本発明者らは、肝臓の銅蓄積に対して感受性を示すこととは対照的に
肝臓の銅蓄積からの保護を示すＡＴＰ７Ａのタンパク質配列に影響を与える多型を発見し
た（実施例２〜５）。この多型は、ＡＴＰ７Ａ遺伝子のタンパク質配列のアミノ酸３２８
をトレオニンからイソロイシンへと変化させる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、突然変異
がタンパク質に重大な機能的効果を有することが決定された（実施例５）。この実験は、
タンパク質の変異型を発現する細胞における銅の蓄積速度がより速いことを明らかにした
。蓄積は銅曝露中により多く、放出は銅曝露後により遅くなる。さらに、銅曝露に応答し
た細胞内のＡＴＰ７Ａ移動は、突然変異を有する細胞において変化する。突然変異を有す
る細胞において、銅輸送タンパク質の発現も増加する。ＡＴＰ７Ａの発現レベルは、２種
類の型を有する細胞の間で変化しない。したがって、ＡＴＰ７Ａコード領域突然変異は、
タンパク質の機能に重要な効果がある。
したがって、本発明は、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数
の多型を含むかを決定する方法に関する。特に、本発明は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護
される可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅ
ｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２の位置１０２）から選択される１つまたは複数の
多型および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型の有無を検出すること
を含む方法を提供する。
「多型の有無を検出すること」という語句は、典型的には、多型がイヌのゲノム中に存
在するかどうかを決定することを意味する。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサ
テライト多型、挿入多型および欠失多型を含む。好ましくは、多型はＳＮＰである。ＳＮ
Ｐの有無を検出することは、ＳＮＰの遺伝子型を同定することまたはイヌのゲノムに存在
するヌクレオチド（単数または複数）をＳＮＰについてタイピングすることを意味する。
典型的には、両方の相同性の染色体上の同じ位置に存在するヌクレオチドが決定されるで
あろう。イヌは、したがって、ＳＮＰの第１の対立遺伝子に対してホモ接合性、第２の対
立遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であると決定され得る。
疾患または病態に対する個体の感受性またはそれからの個体の保護などの個体の表現型
を決定することは、疾患または病態の原因となる多型の検出に限定されない。遺伝子マッ
ピングの試験においては、個体の試料中の一連のマーカー遺伝子座における遺伝子変化が
、所与の表現型との関連について検査される。そのような関連が特定のマーカー遺伝子座
と表現型との間で見出されれば、それは、そのマーカー遺伝子座における変化が関心のあ
る表現型に影響するか、またはそのマーカー遺伝子座における変化は遺伝子型が決定され
ていない、真の表現型に関係した遺伝子座と連鎖不平衡にあるかのいずれかであることを
示唆する。互いに連鎖不平衡にある多型の群の場合には、特定の個体におけるすべてのそ
のような多型の存在の知識は一般的には余剰な情報を提供する。したがって、イヌのゲノ
ムが、肝臓の銅蓄積または銅関連肝疾患に対する感受性またはそれからの保護を示す１つ
または複数の多型を含むかどうかを決定するとき、多型のそのような群のただ１つの多型
だけを検出することが必要である。
連鎖不平衡の結果として、機能的感受性／保護的多型ではないが、機能的多型と連鎖不
平衡にある多型は、機能的多型の存在を示すマーカーとして作用し得る。本発明の多型と
連鎖不平衡にある多型は、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す。
したがって、本明細書において定義した多型の位置の任意の１つは、直接的に、換言す
れば、その位置に存在するヌクレオチドを決定することにより、または間接的に、例えば
前記多型の位置と連鎖不平衡にある他の多型の位置に存在するヌクレオチドを決定するこ
とにより、タイピングすることができる。
連鎖不平衡は、集団中の異なった遺伝子座における対立遺伝子の非ランダムの配偶子関
連性である。ランダムな組合せにより独立に遺伝されるのではなく一緒に遺伝される傾向
を有する多型は、連鎖不平衡にある。２つの多型が一緒の頻度が、２つの多型の個々の頻
度の積であれば、多型は互いにランダムに組み合わされまたは独立に遺伝される。例えば
、異なった多型部位における２つの多型が集団中の染色体の５０％に存在する場合に、２
つの対立遺伝子が集団中の染色体の２５％に一緒に存在すれば、そのとき、それらはラン
ダムに組み合わされていると言われる。より高いパーセンテージは２つの対立遺伝子が連
関していることを意味するであろう。２つの多型の頻度が、集団中で個々に、同時に２つ
の多型の頻度の積より大きければ、第１の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることにな
る。集団中において、２つの多型が一緒の頻度が、１０％を超え、例えば３０％を超え、
５０％を超え、または７０％を超え、２つの多型の個々の頻度の積を超えるならば、第１
の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることになる。
研究は、連鎖不平衡がイヌには大量にあることを示した（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ
ｂｒｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉ
ｎ Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、 Ｓｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ １４：２３８８〜２３９６）。連鎖不平衡にある多型は、物理的に近接している
ことが多く、それは、それらが共遺伝されるからである。本明細書において言及した多型
と連鎖不平衡にある多型は、同じ染色体上に位置する。イヌで連鎖不平衡にある多型は、
典型的には５ｍｂ以内、好ましくは２ｍｂ以内、１ｍｂ以内、７００ｋｂ以内、６００ｋ
ｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ
以内、１０ｋｂ以内、５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、５００ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０
ｂｐ以内または１０ｂｐ以内の多型である。
本明細書において定義した多型の位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある多型を、日常
的技法を使用して同定することは、当業者の能力の内であろう。可能性のある多型が選択
されれば、当業者は、この多型とどの多型の型または対立遺伝子とが、本明細書において
定義した多型のどれと有意に相関しているかを、容易に決定することができる。
より詳細には、多型が本明細書において定義した多型のどの１つと連鎖不平衡にあるか
どうかを決定するために、当業者は、イヌのパネルで、候補の多型および１つまたは複数
の本明細書において定義した多型の遺伝子型を決定すべきである。パネルのサイズは、統
計的に有意な結果を達成するのに十分であるべきである。典型的には、少なくとも１００
、好ましくは少なくとも１５０、または少なくとも２００頭の、異なったイヌからの試料
が遺伝子型を決定されるべきである。パネル中のイヌは任意の血統であってよいが、典型
的には同じかまたは類似の遺伝的血統背景を有するであろう。イヌのパネルで多型が遺伝
子型を決定されれば、多型の１つまたは複数の対の間の連鎖不平衡は、多数の容易に入手
できる統計用パッケージのいずれか１つを使用して測定することができる。フリーソフト
ウェアパッケージの例は、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ：ａｎａｌｙｓｉｓ
ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＤ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍ
ａｐｓ、Ｂａｒｒｅｔｔら、２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１（２）：２
６３〜２６５）であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ
／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗでダウンロードできる。
連鎖不平衡の尺度はＤ’である。Ｄ’の０．５〜１の範囲は、多型の対が連鎖不平衡に
あることを示し、１は最も有意の連鎖不平衡を示す。したがって、候補の多型と特定の本
明細書において定義した多型とについて、Ｄ’が、０．５〜１、好ましくは０．６〜１、
０．７〜１、０．８〜１、０．８５〜１、０．９〜１、０．９５〜１または最も好ましく
は１であることがわかれば、候補の多型は、本明細書において定義した多型を予測すると
いうことができ、それ故、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示すであ
ろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあ
るにある多型は、６８０ｋｂ以内でありかつ本明細書において定義した多型と同じ染色体
上にあり、多型の対間の連鎖不平衡の計算された尺度Ｄ’は、０．９以上である。
連鎖不平衡の他の尺度はＲの２乗であり、ここで、Ｒは補正係数である。「決定係数」
としても知られるＲの２乗は、第１の多型の遺伝子型における分散の第２の多型の遺伝子
型に占める分率である。したがって、候補の多型と特定の本明細書において定義した多型
とに対して０．５というＲの２乗は、候補の多型が特異的多型における分散の５０％を占
めることを意味するであろう。Ｒの２乗はＨａｐｌｏｖｉｅｗなどの標準的統計用パッケ
ージから出せる。典型的には、０．２５以上のＲの２乗（Ｒ＞０．５または＜−０．５）
は大きい相関と見なされる。したがって候補の多型と特定の本明細書において定義した多
型とについて、Ｒの２乗が０．５以上、好ましくは０．７５以上、０．８以上、０．８５
以上、０．９以上または０．９５以上であると見出されれば、候補の多型は本明細書にお
いて定義した多型を予測するということができ、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれ
からの保護を示すであろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した
多型と連鎖不平衡にあるにある多型は、６８０ｋｂ以内でかつ本明細書において定義した
多型と同じ染色体上にあり、多型の対の間の連鎖不平衡の計算された尺度、Ｒの２乗は０
．８５以上である。
多型が本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあり、したがって相関していると
確認されれば、当業者は、どの型の多型、すなわちどの対立遺伝子が、肝臓の銅蓄積に対
する感受性またはそれからの保護と関連するかを容易に決定することができる。これは、
イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析し、イヌを肝臓の銅蓄積のレベルに関し
て分類することにより達成することができる。次に、イヌのパネルは、関心のある多型に
ついて遺伝子型を決定される。次に、遺伝子型は、遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を
決定し、それによりどの対立遺伝子が肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護
と関連するかどうかを決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる。
肝臓の銅蓄積からの保護を示す本発明の多型は、表ＶＩに同定されているＳＮＰ（ＡＴ
Ｐ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２の位置１０２））および該ＳＮＰと連鎖不平
衡にある１つまたは複数の多型である。したがって、本発明の方法は、（ａ）ＡＴＰ７ａ
＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある
１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む
。好ましくは、この方法は、表ＶＩで同定されているＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ
＿６（配列番号１４２））、すなわち多型（ａ）の有無を決定することを含む。
本発明を実施するために、任意の数および任意の組合せの多型を検出することができる
。少なくとも２つの多型が検出されることが好ましい。２〜５、３〜８または５〜１０個
の多型が検出されることが好ましい。
イヌのＤＮＡは、
（ｉ）多型（ａ）；
（ｉｉ）１つまたは複数の多型（ｂ）；または
（ｉｉｉ）多型（ａ）および１つまたは複数の多型（ｂ）
のそれぞれの位置でタイピングすることができる。
好ましい方法は、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）お
よび前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型（ｂ）の有無を検出するこ
とを含む。
本発明の好ましい方法において、前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型はＳＮＰであ
る。好ましくは、多型は、肝臓の銅蓄積からの保護を示すイヌのＡＴＰ７Ａ遺伝子におけ
るまたはその領域における任意の多型である。多型（ａ）と連鎖不平衡にあるＳＮＰの一
例として、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３の位置６８）が
挙げられる。このＳＮＰは、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）
と連鎖不平衡にあり、肝臓の銅蓄積からの保護を示すことが判明した（実施例４）。した
がって、このＳＮＰは、単独で用いて、あるいは多型（ａ）と組み合わせて、イヌが肝臓
の銅蓄積から保護されている可能性を決定することができる。したがって、イヌが肝臓の
銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、イヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴ
Ｐ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）、（ｂ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６
＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）ならびに（ａ）および／または（ｂ）と連鎖不平
衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出するこ
とを含むことができる。好ましい方法は、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ
（配列番号１４２）および（ｂ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号
１４３）の有無を検出することを含む。
表ＶＩで同定されているＡＴＰ７ＡのＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番
号１４２））のＴ対立遺伝子は、本発明者らにより、銅蓄積からの保護を示すことが決定
された。このＳＮＰはＸ染色体上に位置する。Ｔ対立遺伝子がホモ接合型（雌イヌの場合
）またはヘミ接合型（雄イヌの場合）であるイヌは、銅蓄積から保護されている。Ｃ対立
遺伝子を有するイヌは、銅蓄積から保護されていないと考えられる。したがって、本発明
の好ましい方法は、表ＶＩで同定されているＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配
列番号１４２））のＴ対立遺伝子の有無を決定することを含む。したがって、本発明の好
ましい方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（ＳＮＰ１４２）におけるＴＴまたはＴＣ
遺伝子型の有無を検出し、これによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す多型
を含むかを決定することを含む。
表ＶＩで同定されているＡＴＰ７ＡのＳＮＰがＸ染色体上に位置し、保護効果が劣性で
あるという事実を考慮すると、雄イヌは保護の表現型を有する可能性がより高い。したが
って、本発明の方法は、イヌの性別を決定することを含むことができる。一般に雄イヌが
雌イヌと比べて銅の蓄積に対する感受性がより低いことを考慮すると、ＡＴＰ７ＡのＳＮ
Ｐ（（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２））は特に、血統不明または混血
（雑種）のイヌ等、あらゆる血統のイヌに対して有用である。実施例３もまた、本発明の
方法があらゆる血統のあらゆる地理的位置のイヌに適用できるという証拠を提供する。し
たがって本発明の方法は、混血もしくは交雑イヌまたは雑種もしくは非近交系のイヌのゲ
ノムが、肝臓の銅蓄積からの保護を示すＡＴＰ７Ａ遺伝子における１つまたは複数の多型
、あるいはそれと連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型を含むかを決定することを含む
ことができる。
ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）と連鎖不平衡にあることが
判明したＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）は、本発明者ら
によってＴ対立遺伝子が銅蓄積からの保護を示すことが決定された。上に説明されている
通り、ＡＴＰ７Ａ遺伝子、したがってこのＳＮＰはＸ染色体上に位置する。Ｔ対立遺伝子
がホモ接合型（雌イヌの場合）またはヘミ接合型（雄イヌの場合）であるイヌは、銅蓄積
から保護されている。Ｃ対立遺伝子を有するイヌは、銅蓄積から保護されていないと考え
られる。したがって、本発明の好ましい方法は、表Ｘで同定されているＳＮＰ（ＡＴＰ７
ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２（配列番号１４３）のＴ対立遺伝子の有無を決定することを含
む。したがって、本発明の好ましい方法は、（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２（配列
番号１４３）におけるＴＴまたはＴＣ遺伝子型の有無を検出し、これによってイヌのゲノ
ムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す多型を含むかを決定することを含む。
本発明者らは、以前、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５各遺伝子におけ
るまたはその領域おける多型が、イヌにおける肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことを
発見した（実施例１〜２）。したがって、これらの多型は、本発明の多型と組み合わせて
用いてイヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であるまたはそれから保護されている危険性ま
たは可能性を決定するための、改良された遺伝子検査を提供することができる。したがっ
て、本発明の方法は、肝臓の銅蓄積に対する感受性およびそれからの保護を示すＳＮＰの
組合せの有無を決定することを含むことができる。イヌから得られたＤＮＡは、肝臓の銅
蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数のＳＮＰにおいてタイピングし、肝臓の銅蓄積
からの保護を示す１つまたは複数のＳＮＰにおいてタイピングすることができる。１つま
たは複数の「保護」ＳＮＰの不在と組み合わせた１つまたは複数の「感受性」ＳＮＰの存
在は、イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であることを示す。１つまたは複数の「感受性
」ＳＮＰの不在と組み合わせた１つまたは複数の「保護」ＳＮＰの存在は、イヌが肝臓の
銅蓄積から保護されていることを示す。
肝臓の銅蓄積に対して感受性を示す本発明の多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７Ａまたは
ＵＢＬ５各遺伝子のいずれか１遺伝子に存在してもよく、あるいはこれらの遺伝子のいず
れの内にも存在しなくてもよいが、これらの遺伝子の内いずれか１遺伝子における多型と
連鎖不平衡にある。したがって本発明は、（ｃ）肝臓の銅蓄積に対して感受性を示すイヌ
のＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡまたはＵＢＬ５の遺伝子における多型および／または（ｄ）
前記多型（ｃ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することをさらに含むことができる
。本発明の実施のために、いかなる個数およびいかなる組合せの多型が検出されてもよい
。好ましくは、少なくとも２個の多型が検出される。好ましくは、２〜５個、３〜８個ま
たは５〜１０個の多型が検出される。
したがって、イヌのＤＮＡは、（ｉ）多型（ａ）および／または（ｉｉ）１つまたは複
数の多型（ｂ）のそれぞれの位置においてタイピングすることができる。さらに、イヌの
ＤＮＡは、
（ｉｉｉ）２個以上の多型（ｃ）、
（ｉｖ）２個以上の多型（ｄ）または
（ｖ）１つまたは複数の多型（ｃ）および１つまたは複数の多型（ｄ）
のそれぞれの位置においてタイピングすることができる。
２つの多型（ｃ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５遺
伝子の別々の１つでもあってよく、またはこれらの遺伝子のただ１つだけであってもよい
。３つ以上の多型（ｃ）、例えば３〜１０個のそのような多型があるとき、多型は、同じ
遺伝子中に、２つの遺伝子中にまたは３つのすべての遺伝子中にあってもよい。
同様に、２つの多型（ｄ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵ
ＢＬ５遺伝子の別々の１つの中に、またはこれらの遺伝子のただ１つだけの中にある多型
と連鎖不平衡にあってよい。３つ以上の、例えば３〜１０個のそのような多型（ｄ）があ
るとき、多型は、同じ遺伝子中の、２つの遺伝子中にまたは３つのすべての遺伝子中にあ
る多型と連鎖不平衡にあってよい。
好ましい方法は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７
ＡまたはＵＢＬ５遺伝子中の少なくとも１つの多型（ｃ）および前記多型（ｃ）と連鎖不
平衡にある少なくとも１つの多型（ｄ）の有無を検出することを含む。
本発明の好ましい方法において、感受性を示す多型はＳＮＰである。ＳＮＰは、肝臓の
銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子
中のまたはその領域中の任意のＳＮＰおよび／またはそれらと連鎖不平衡にあるＳＮＰで
あってよい。
前記方法が、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型
を含むかどうかを決定することを含む場合、好ましくは、ＳＮＰは表ＩＩＩ、表ＩＶおよ
び表Ｖにおいて特定されたＳＮＰから選択される。表ＩＩＩおよびＩＶにおいて、各ＳＮ
Ｐは、配列中の位置６１に位置する。第１のおよび第２の対立遺伝子は、各ＳＮＰに対し
てその遺伝子座（［第１の／第２の］）で提供される。表Ｖには、各ＳＮＰに対する第１
のおよび第２の対立遺伝子も示されている。任意の数のＳＮＰが、表ＩＩＩ、ＩＶおよび
Ｖから任意の組合せで使用することができる。ＳＮＰは異なったタイプの多型と組み合わ
せることもできる。
好ましくは、方法は、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複
数の多型を含むかどうかを決定することを含む場合、表ＩＩＩおよび表Ｖ中のＳＮＰから
選択される１つまたは複数のＳＮＰ、および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つまた
は複数のＳＮＰの有無を検出することを含む。したがって、１つまたは複数のＳＮＰが、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列
番号２の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３の位置６１）、ＢＩＣＦ
２Ｐ１３２４００８（配列番号４の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５
の位置６１）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１の位置１６４）、ＵＢＬ
５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２の位置９７）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（
配列番号１３３の位置７０）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４の位置８８）、ｇｏ
ｌｇａ５＿２７（配列番号１３５の位置１０４）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６
の位置１３９）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７の位置１２８）、ｇｏｌｇａ５＿
３０（配列番号１３８の位置９５）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９の位置１０６
）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０の位置９５）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７
＿３３（配列番号１４１の位置９０）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数の
ＳＮＰから選択されることが好ましい。したがって、これらの１６個のＳＮＰのいずれか
またはこれらの１６個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰはタイピング
することができる。これら１６個のＳＮＰの少なくとも２つまたは連鎖不平衡にあるＳＮ
Ｐがタイピングされることが好ましい。
より好ましくは、方法は、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまた
は複数の多型を含むかどうかを決定することを含む場合、表ＩＩＩ中のＳＮＰから選択さ
れる１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することを含む。したがって、これらの５個の
ＳＮＰのいずれかまたはこれらの５個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮ
Ｐをタイピングすることができる。好ましくは、これらの５個のＳＮＰの少なくとも２個
または連鎖不平衡にあるＳＮＰがタイピングされる。より好ましくは、すべての５個の位
置がタイピングされる。したがって、タイピングされるヌクレオチド（単数または複数）
は、
・配列番号１（ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５、ＳＮＰ１）の位置６１；
・配列番号２（ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５、ＳＮＰ２）の位置６１；
・配列番号３（ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７、ＳＮＰ３）の位置６１；
・配列番号４（ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８、ＳＮＰ４）の位置６１；
・配列番号５（ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２、ＳＮＰ５）の位置６１；または
・これらの位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある任意の位置と同等の位置から選択さ
れることが好ましい。好ましくは、該方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（配列
番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配
列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８
７２（配列番号５）の有無を検出することを含む。
ＳＮＰ１はＧＯＬＧＡ５遺伝子のイントロンの中に位置する。ＳＮＰ２、３および４は
ＵＢＬ５遺伝子の領域中に位置する。ＳＮＰ５は、ＡＴＰ７Ａ遺伝子の領域中に位置する
。したがって本発明の検出方法は、１つまたは複数のこれらの遺伝子の内部にまたは領域
中に（コード領域中にまたはそれ以外に）ある任意のＳＮＰ、または連鎖不平衡にある任
意の他のＳＮＰに関する。
実施例１は、銅蓄積に対する感受性のＢｏｏｌｅａｎモデルを確立するためのこれらの
ＳＮＰの使用を示す。表Ｉは、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を
示す。２元値は、イヌが銅蓄積に対する感受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）
を有することを示す。例えば、０００は、３種の悪い対立遺伝子のいずれも有しないこと
を表す。１１１は、３種の悪い対立遺伝子をすべて有することを表す。Ｘはその遺伝子で
使用されない対立遺伝子である。線１ｘｘおよび０ｘｘは、ＧＯＬＧＡ５遺伝子中のＳＮ
Ｐのみを使用する１回の遺伝子検査が有する検出力を示す。
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（ＳＮＰ１）に対するＡ対立遺伝子は、本発明者ら
により、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ａ対立遺伝子に対してホ
モ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい
方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰに対するＡ対立遺伝子の有無を決定すること
、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかど
うかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰに
対するＡＡ遺伝子型の有無を検出することを含む。
ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰ（ＳＮＰ２）に対するＧ対立遺伝子は、本発明者ら
により、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｇ対立遺伝子に対してホ
モ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい
方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰに対するＧ対立遺伝子の有無を決定すること
、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかど
うかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰに
対するＧＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。
ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰ（ＳＮＰ３）に対するＣ対立遺伝子は、本発明者
らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｃ対立遺伝子に対して
ホモ接合性のイヌは肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好ましい
方法は、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰに対するＣ対立遺伝子の有無を決定するこ
と、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むか
どうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮ
Ｐに対するＣＣ遺伝子型の有無を検出することを含む。
ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰ（ＳＮＰ４）に対するＧ対立遺伝子は、本発明者
らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ｇ対立遺伝子に対して
ホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって、本発明の好まし
い方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰに対するＧ対立遺伝子の有無を決定し、
それによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むかどうかを決定
することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰに対するＧ
Ｇ遺伝子型の有無を検出することを含む。
ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰ（ＳＮＰ５）に対するＡ対立遺伝子は、本発明者ら
により、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。Ａ対立遺伝子に対してホ
モ接合性またはヘテロ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積に対して感受性である。したがって
、本発明の好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰに対するＡ対立遺伝子の
有無を決定すること、およびそれにより、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を
示す多型を含むかどうかを決定することを含む。より好ましい方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５９
１８７２のＳＮＰに対するＡＡまたはＡＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。
したがって、本発明のより好ましい方法は、（ｉ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（Ｓ
ＮＰ１４２）におけるＴＴもしくはＴＣ遺伝子型および／または（ｉｉ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒ
ｅｇ１６＿Ｆ＿４２（ＳＮＰ１４３）におけるＴＴもしくはＴＣ遺伝子型の有無を検出す
ることを含み、
（ｉｉｉ）ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（ＳＮＰ１）に対するＡＡ遺伝子型；
（ｉｖ）ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＳＮＰ（ＳＮＰ２）に対するＧＧ遺伝子型；
（ｖ）ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＳＮＰ（ＳＮＰ３）に対するＣＣ遺伝子型；
（ｖｉ）ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＳＮＰ（ＳＮＰ４）に対するＧＧ遺伝子型；お
よび／または
（ｖｉｉ）ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＳＮＰ（ＳＮＰ５）に対するＡＡまたはＡＧ遺
伝子型；
の有無を検出することと、
それによりイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護および／またはそれに対する感受性を
示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することとをさらに含むことができる。
より好ましい方法は、遺伝子型（ｉｉｉｉ）；遺伝子型（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）
；または遺伝子型（ｖｉｉ）の有無を検出することを含む。さらにより好ましい方法は、
すべての５つの遺伝子型（ｉｉｉ）から（ｖｉｉ）のすべての有無を検出することを含む
。
イヌのＤＮＡは、
（ｉ）（ａ）表ＶＩにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（ＳＮ
Ｐ１４２））および（ｂ）表Ｘにおいて特定されたＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ
＿４２（ＳＮＰ１４３））などの前記ＳＮＰ（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の
ＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰ；ならびに
（ｉｉ）（ａ）表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて特定されたＳＮＰ、および（ｂ）前記
ＳＮＰ（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択される１つまたは複数
のＳＮＰ
で、タイピングすることができる。
イヌのゲノム中に存在するヌクレオチド（単数または複数）を、表ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、
ＶＩまたはＸのいずれかで特定された位置でタイピングすることは、表ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ
、ＶＩまたはＸにおいて特定された配列と厳密に対応する配列中のこの位置に存在するヌ
クレオチドがタイピングされることを意味し得る。しかしながら、表ＩＩＩにおいて特定
された配列番号１〜５、表ＩＶ中の配列番号６〜１３０、表Ｖ中の配列番号１３１〜１４
１、表ＶＩ中の配列番号１４２および表Ｘ中の配列番号１４３において提示された厳密な
配列は、検査されるイヌに必ず存在するわけではないことは理解されるであろう。したが
って、存在するヌクレオチドのタイピングは、表ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩまたはＸにおい
て特定された位置において、または該配列中の同等のまたは対応する位置においてであり
得る。したがって、ここで使用された同等という用語は、表ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩまた
はＸにおいて特定された位置においてまたは対応する位置においてを意味する。ＳＮＰの
配列およびそれに伴って位置は、例えば、イヌのゲノム中におけるヌクレオチドの欠失ま
たは付加のために変化し得る。当業者は、配列番号１〜１４３の各々における関連ある位
置に対応するまたは同等の位置を、例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、Ａ
ＬＩＧＮ、ＰＩＬＥＵＰまたはＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用して、決
定することができるであろう。ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、相同性またはラインアッ
プ配列を計算するために使用することができる（例えばそれらの初期設定で使用）ＧＡＰ
、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、ＡＬＩＧＮ、およびＰＩＬＥＵＰを含むプログラム
を提供する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムも、通常はその初期設定で、２つの配列を比較また
はラインアップするために使用することができる。２つの配列のＢＬＡＳＴ比較を実施す
るためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、下でさらに説明する。配列
のアラインメントおよび比較のための同様に公的に入手できるツールは、Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）で見出すことができ、例えばＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳ
ＴＡＬＷプログラムがある。
多型が肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護を示すかどうかを決定するために使用す
ることができる種々の異なった方法がある。典型的には、候補の多型を多型のデータベー
スおよび肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護とのそれらの関連と比較する。そのよう
なデータベースは、イヌのパネルを、肝臓の銅蓄積について、例えば肝生検材料により表
現型解析することにより発生させて、イヌを銅蓄積のレベルに関して分類する。パネル中
のイヌは、多型のパネルに対して遺伝子型も決定する。そのようにして、各遺伝子型と肝
臓銅のレベルとの関連を決定することが可能である。したがって、多型が、肝臓銅に対す
る感受性またはそれからの保護のどちらを示すかを決定することは、データベース中にお
ける多型の位置を突き止めることにより達成される。
対象の多型の位置が、上記のようにしてデータベース中で突き止められなくても、それ
でもなお、多型が、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護のどちらを示すか
を決定することは可能である。これは、イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析
して、イヌを肝臓の銅蓄積レベルに関して分類することにより達成することができる。次
に、イヌのパネルは、関心のある多型について遺伝子型を決定する。次に、遺伝子型は、
遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる
。
本発明の１つまたは複数の多型の有無がイヌのゲノム中で検出されると、イヌが肝臓の
銅蓄積から保護されるかそれに対して感受性であるかがそれにより決定される。各多型は
、単独でまたは他の多型との組合せで、イヌの肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対す
る感受性を示す。
イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定するために、イヌからのＤＮＡ試料
を使用して、表ＶＩにおいて特定されたイヌのゲノム中のＳＮＰの遺伝子型を決定するこ
とができる。この機能的変異はＡＴＰ７Ａ（Ｘ染色体上の）中に位置して、ホモ接合性（
ＴＴ）であるとき、保護的であるように思われる。これで、雌の慢性肝炎のバイアスを説
明することができる。なぜなら、雄のみが１コピーのＸ染色体を有し、そのためＡＴＰ７
Ａ遺伝子座においてヘミ接合性であるからである。Ｘ連関劣性遺伝子効果は、雄のＸ染色
体のヘミ接合性状態のために、雌より雄で見られる可能性が高い。この場合、保護効果は
劣性であり、そのため雌集団において、より多くの症例が見られる（実施例２、表ＶＩＩ
および図５を参照されたい）。ＳＮＰの遺伝子型が決定されれば、イヌが肝臓の銅蓄積か
ら保護されるかどうかを決定することは可能である。別の対立遺伝子（Ｔ）の存在は肝臓
の銅蓄積からの保護を示す。別の対立遺伝子（ＴＴ）に対してホモ接合性のイヌは、肝臓
の銅蓄積から保護される可能性が最も高い。したがって、本発明の好ましい方法は、イヌ
のゲノム中におけるＡＴＰ７Ａ ＳＮＰのＴ対立遺伝子の有無を決定することを含む。該
方法は、イヌがＡＴＰ７Ａ ＳＮＰのＴ対立遺伝子に対してホモ接合性（雌イヌの場合）
であるかまたはヘミ接合性（雄イヌの場合）であるかを決定することを含むことができる
。
方法が、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すＳＮＰの有無に関する検査をさらに含む場
合、結果を組み合わせて、イヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であるまたはそれから保護
される危険性または可能性の総合的な評価を提供するモデルを用いることができる。一例
として、表Ｉは、ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７Ａ各遺伝子の領域における５個
のＳＮＰの組合せの異なる遺伝子型候補と、高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える肝臓レベル
）を有しこれらの遺伝子型を有するイヌのパーセンテージを提示する。この例において、
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するために、イヌから得られたＤＮＡ試料を用
いてイヌのゲノムにおける５個のＳＮＰを遺伝子型同定することができる。ＳＮＰの遺伝
子型が決定されると、これらは実施例１に提供されているキーに基づき、すなわち遺伝子
型と高銅との関連の程度に基づき、２進値に変換することができる。次に、表Ｉを用いて
、その遺伝子型パターンと高銅を有するイヌのパーセンテージに基づき、２進値を危険性
因子へと変換する。したがって、これらの結果は、保護多型（単数または複数）の結果と
組み合わせてもよい。
イヌは、本発明の方法により、任意の年齢、例えば０〜１２歳、０〜６歳、０〜５歳、
０〜４歳、０〜３歳、０〜２歳または０〜１歳で検査することができる。好ましくは、イ
ヌはできるだけ若い年齢で、例えば生後１年、生後６カ月または生後３カ月以内に検査さ
れる。イヌは、好ましくは、銅蓄積が起こる前に検査される。イヌの履歴はわかってもわ
からなくてもよい。例えば、イヌは、知られた両親の子であってもよく、および銅蓄積に
関する両親の履歴が知られていてもよい。あるいは、イヌは、親子関係および履歴の知ら
れていない迷子または救助されたイヌであってもよい。
本発明の任意の方法により検査されるイヌは、いかなる血統のものでもよい。本発明は
、混血または交雑種のイヌ、または雑種のまたは異系交配されたイヌのゲノムが、肝臓の
銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうか
を決定する方法を提供する。
イヌのゲノムが本発明の肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか
どうかを決定する方法において、イヌは、肝臓の銅蓄積から保護されていると疑われるも
のであってよい。あるいは、イヌは肝臓の銅蓄積に対して感受性であることが疑われ得る
。本発明の好ましい方法において、イヌは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレト
リーバーまたはトイプードルの遺伝的な血統を継承する。イヌは、混血のもしくは交雑種
のイヌ、または雑種のもしくは異系交配されたイヌであってよい。イヌは、そのゲノムの
少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％が、いずれかの純粋な
血統またはより好ましくは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたは
トイプードルから選択される任意の血統から継承されていてよい。イヌは、純粋種であっ
てよい。本発明の一実施形態において、検査されるイヌの一方または両方の親が純粋種の
イヌでありまたはあった。他の実施形態において、１頭または複数の祖父母が純粋種のイ
ヌでありまたはあった。検査されるイヌの祖父母の１、２、３または４頭全部が純粋種の
イヌであってよく、またはあったとしてもよい。
イヌはラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌ
は、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは
交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または
両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌの祖父母の１、２、３ま
たは４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌは、その遺伝的背景
においてラブラドールレトリーバーの血統の少なくとも５０％または少なくとも７５％を
有していてよい。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％
は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
イヌの遺伝的血統背景は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライト
の対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なった
ＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血
血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺
伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、例えばイヌの飼い主また
は獣医によりそれが特定の血統を継承すると推定されるという理由で、特定の血統の遺伝
的継承について検査する必要がないこともある。これは、例えば、イヌの祖先の知識のた
め、またはその外観のためであり得る。
本発明の予測検査は、イヌの遺伝的血統の背景／継承または１種または複数種の他の疾
患に対する感受性の決定などの１つまたは複数の他の予測または診断検査と併せて実施し
てもよい。
多型の検出
本発明による多型の検出は、イヌからの試料中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と
多型に対して特異的な結合剤とを接触させて、該結合剤がポリヌクレオチドまたはタンパ
ク質に結合するどうかを決定することを含むことができ、この場合、結合剤の結合は多型
の存在を示し、結合剤の結合の欠如は、多型の存在しないことを示す。
該方法は、試料がイヌのＤＮＡを含有する場合に、イヌからの試料について、一般にイ
ンビトロで実施される。試料は、典型的には、イヌの体液および／または細胞を含み、例
えば、口腔スワブなどのスワブを使用して得ることができる。試料は、血液、尿、唾液、
皮膚、頬細胞または毛根試料であってよい。試料は、通常、方法が実施される前に処理さ
れ、例えばＤＮＡ抽出を実施することができる。試料中のポリヌクレオチドまたはタンパ
ク質は、物理的または化学的のいずれかで、例えば適当な酵素を使用して、切断すること
ができる。一実施形態においては、多型の検出に先立って、試料中のポリヌクレオチドの
一部が、例えば、クローニングにより、またはＰＣＲに基づく方法を使用して、コピーさ
れまたは増幅される。
本発明において、任意の１つまたは複数の方法は、イヌにおける１つまたは複数の多型
の有無を決定することを含むことができる。多型は、典型的には、イヌのポリヌクレオチ
ドまたはタンパク質中における多型の配列の存在を直接決定することにより検出される。
そのようなポリヌクレオチドは、典型的には、ゲノムのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
である。多型は、下記の方法など任意の適当な方法により検出することができる。
特異的な結合剤は、優先的なまたは高い親和性をもって多型を有するタンパク質または
ポリペプチドに結合するが、他のポリペプチドまたはタンパク質には結合しないかまたは
低い親和性でのみ結合する作用剤である。特異的な結合剤は、プローブまたはプライマー
であってよい。プローブは、タンパク質（抗体など）またはオリゴヌクレオチドであり得
る。プローブは標識することができ、または間接的に標識することが可能であってもよい
。プローブのポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する結合は、プローブまたはポリヌ
クレオチドもしくはタンパク質のいずれかを不動化するために使用することができる。
該方法においては一般に、多型は、イヌの多型のポリヌクレオチドまたはタンパク質に
対する作用剤の結合を決定することにより検出することができる。しかしながら、一実施
形態において、作用剤は、例えば、変異位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結
合することにより、対応する野生型配列に結合することもできるとはいえ、野生型配列に
対する結合様式は、多型を含むポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合とは検出可能な
程度に異なるであろう。
該方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブが使用される、オリゴヌクレオチド連結
アッセイに基づくことができる。これらのプローブは、多型を含むポリヌクレオチドの隣
接する領域に結合し、結合後に適当なリガーゼ酵素により２つのプローブが連結されて一
緒になることが可能になる。しかしながら、プローブの一方の中に単一のミスマッチが存
在すると、結合および連結が妨げられ得る。したがって連結したプローブは、多型を含む
ポリヌクレオチドでのみ生じ、したがって連結された生成物の検出は、多型の存在を決定
するために使用することができる。
一実施形態において、プローブは、ヘテロ二重鎖分析に基づくシステムにおいて使用さ
れる。そのようなシステムでは、プローブが多型を含むポリヌクレオチド配列に結合した
とき、それは多型が生じる部位でヘテロデュプレックスを形成し、それ故、二本鎖構造を
形成しない。そのようなヘテロデュプレックス構造は、一本鎖または二本鎖特異的酵素の
使用により検出することができる。典型的には、プローブはＲＮＡプローブであり、ヘテ
ロ二重鎖領域はリボヌクレアーゼＨを使用して切断され、多型は切断生成物を検出するこ
とにより検出される。
方法は、例えば、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３、
２６８〜７１（１９９４）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、４３９
７〜４４０１（１９９８）に記載されている蛍光性化学的切断ミスマッチ分析に基づくこ
とができる。
一実施形態においては、それが多型を含むポリヌクレオチドに結合する場合にのみ、Ｐ
ＣＲ反応を開始させるＰＣＲプライマー、例えば配列特異的ＰＣＲシステムが使用され、
多型の存在はＰＣＲ生成物を検出することにより決定することができる。好ましくは、プ
ライマーの多型に相補性の領域はプライマーの３’末端にまたはその付近にある。多型の
存在は、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ検出システムなどの、蛍光性染料および消光剤に基づくＰ
ＣＲアッセイを使用して決定することができる。
特異的な結合剤は、多型の配列によりコードされたアミノ酸配列に特異的に結合するこ
とができる。例えば、作用剤は、抗体または抗体のフラグメントであってもよい。検出方
法は、ＥＬＩＳＡシステムに基づくことができる。方法は、ＲＦＬＰに基づくシステムで
あってよい。これは、ポリヌクレオチド中における多型の存在が、制限酵素により認識さ
れる制限部位を作り出すかまたは破壊する場合に使用することができる。
多型の存在は、多型の存在がゲル電気泳動中のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移
動度に生じさせる変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合には、
一本鎖配座の遺伝子座の多型（ＳＳＣＰ）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＤＧ
Ｅ）分析を使用することができる。多型を検出する他の方法においては、多型領域を含む
ポリヌクレオチドを、多型を含む領域を通して配列を決定して多型の存在を決定する。
多型の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出することもできる。
特に、多型は、二重ハイブリッド形成プローブシステムによって検出することができる。
この方法は、互いに近接に位置し、かつ関心のある標的ポリヌクレオチドの内部セグメン
トに相補性の２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含み、この場合２つのプローブ
の各々は蛍光団で標識されている。任意の適当な蛍光性標識または染料を、蛍光団として
使用することができ、その結果１つのプローブ（供与体）の蛍光団の発光波長が第２のプ
ローブ（受容体）の蛍光団の励起波長と重なる。代表的供与体蛍光団はフルオレセイン（
ＦＡＭ）であり、および代表的受容体蛍光団は、テキサスレッド、ローダミン、ＬＣ−６
４０、ＬＣ−７０５およびシアニン５（Ｃｙ５）を含む。
蛍光共鳴エネルギー移動が起こるためには、２つの蛍光団は、両プローブの標的に対す
るハイブリッド形成時に、密接して近づくことが必要である。供与体蛍光団が適当な波長
の光で励起されたとき、発光スペクトルのエネルギーが受容体プローブの蛍光団に移動し
てその蛍光を生じる。したがって、供与体蛍光団にとって適当な波長における励起中の、
この波長の光の検出はハイブリッド形成、および２つのプローブの蛍光団の密接な関連を
示す。各プローブは、蛍光団を用いて１つの末端で標識することができ、その結果上流（
５’）に位置するプローブはその３’末端で標識され、下流（３’）に位置するプローブ
はその５’末端で標識される。標的配列に結合したときの２つのプローブの間の間隔は、
１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜１７ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌク
レオチド、例えば１、２、４、６、８または１０ヌクレオチドの間隔であることができる
。
２つのプローブの第１のものは、多型に隣接する遺伝子の保存配列に結合するようにデ
ザインすることができ、第２のプローブは、１つまたは複数の多型を含む領域に結合する
ようにデザインすることができる。第２のプローブにより標的とされる遺伝子の配列内の
多型は、生じる塩基ミスマッチが原因の溶融温度変化を測定することにより検出すること
ができる。溶融温度における変化の程度は、ヌクレオチド多型に関与する数および塩基の
タイプに依存するであろう。
多型タイピングも、プライマー伸張技法を使用して実施することができる。この技法で
は、多型の部位周囲の標的領域がコピーされ、または例えばＰＣＲを使用して増幅される
。次に単一塩基シークエンシング反応を、多型の部位から１塩基離れてアニールするプラ
イマーを使用して実施する（対立遺伝子特異的ヌクレオチド組み込み）。次に、プライマ
ー伸張生成物を検出して、多型の部位に存在するヌクレオチドを決定する。伸張生成物を
検出することができる数通りの方法がある。１検出方法においては、例えば、蛍光標識さ
れたジデオキシヌクレオチドターミネーターが、伸張反応を多型の部位で停止するために
使用される。あるいは、質量改変されたジデオキシヌクレオチドターミネーターが使用さ
れて、プライマー伸張生成物が質量分析法を使用して検出される。１種または複数種のタ
ーミネーターを特異的に標識することにより、伸張されたプライマーの配列を、およびそ
れ故に、多型の部位に存在するヌクレオチドを推測することができる。２種以上の反応生
成物を反応ごとに分析することができて、その結果、２つ以上のターミネーターが特異的
に標識されていれば、両方の相同性染色体に存在するヌクレオチドを決定することができ
る。
本発明は、銅蓄積に対する感受性の予測に使用するための、本明細書において定義した
ＳＮＰの任意のもの検出に使用できるプライマーまたはプローブをさらに提供する。本発
明のポリヌクレオチドは、本明細書において定義したＳＮＰを検出するためのプライマー
伸張反応のためのプライマーとしても使用することができる。
そのようなプライマー、プローブおよび他のポリヌクレオチドフラグメントの長さは、
好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば
少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチドであろう。それらの
長さは、典型的には４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチドまでであ
ろう。プローブおよびフラグメントの長さは、本発明の全長のポリヌクレオチド配列を除
いて、１５０ヌクレオチドを超えてもよく、例えば２００、３００、４００、５００、６
００、７００ヌクレオチドまで、またはさらに５または１０ヌクレオチドなど数ヌクレオ
チドまでであってよい。
本発明のＳＮＰの遺伝子型同定のためのプライマーおよびプローブは、表ＩＩＩ、ＩＶ
、Ｖ、ＶＩまたはＸ中のＳＮＰ配列を使用し、当技術分野において知られる任意の適当な
デザインソフトウェアを使用して、デザインすることができる。これらのポリヌクレオチ
ド配列の相同体は、プライマーおよびプローブをデザインするのにも適しているであろう
。そのような相同体は、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも
８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を、例えば少なくとも１５、２０
、３０、１００またはそれを超える隣接したヌクレオチドの領域にわたって有する。相同
性は、ヌクレオチドの同一性（「硬い相同性」と称されることもある）に基づいて計算す
ることができる。
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥ
ＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばその初期設定で使用）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、
（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２、ｐ３８７〜３９
５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．
Ｆ．（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３〜１０に記載されたよう
に、相同性またはラインアップ配列（相等のまたは対応する配列の同定など）を計算する
のに使用することができる（典型的にはそれらの初期設定で）。
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手できる。このアルゴリズムは
、データベース配列中の同じ長さのワードで整列化したとき、ある正の値の閾値スコアＴ
とマッチするか、またはそれを充足するかのいずれかである、検索配列における長さＷの
短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定する
ことを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）と呼ばれる
。これらの最初の近隣ワードのヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰの検索を開始
するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加す
ることができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向での
ワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘだ
け低下したとき；累積スコアが１つまたは複数の負のスコアリング残基のアラインメント
の累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に達
したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメ
ントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワー
ド長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆおよび
Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：
１０９１５〜１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０
、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する；例えば、
ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提
供される類似性の１つ尺度は、２つのポリヌクレオチド配列の間でマッチが偶然に起こる
であろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列
と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より
好ましくは約０．０１未満であるとき、および最も好ましくは約０．００１未満であるな
ら、配列は他の配列と類似であると考えられる。
相同性配列は、典型的には、少なくとも１、２、５、１０、２０以上の変異により相違
し、変異はヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってよい。
プライマーまたはプローブなどの本発明のポリヌクレオチドは、単離されたまたは実質
的に精製された形態で存在し得る。本発明のポリヌクレオチドは、その使用目的に干渉し
ない担体または希釈剤と混合し、それでもなお実質的に単離されたと見なすことができる
。それらは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般に、製剤のポリヌ
クレオチドの少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％または９９％を占める
ことになる。
検出抗体
検出抗体は、１つの多型に対して特異的であるが、本明細書において記載した任意の他
の多型には結合しない抗体である。検出抗体は、例えば、免疫沈殿技法を含む精製、単離
またはスクリーニングの方法において有用である。
抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対するものであってもよい。抗体
、または他の化合物は、それが特異的であるタンパク質に対して優先的なまたは高い親和
性をもって結合するが、他のポリペプチドには実質的に結合しないかまたは低い親和性で
しか結合しないとき、ポリペプチドに「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能力を決
定するための競争的結合または放射免疫アッセイに対する種々のプロトコルが当技術分野
において周知である（例えばＭａｄｄｏｘら、Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８、１２１１
〜１２２６、１９９３を参照されたい）。そのような免疫測定は、典型的には、特異的タ
ンパク質とその抗体との間のコンプレックスの形成およびコンプレックス形成の測定を包
含する。
この発明の目的のために、用語「抗体」は、特に断らない限り、本発明のポリペプチド
に結合するフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに一本鎖抗体を含む。さらに、抗体およびそれらの
フラグメントは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体またはヒト化抗体であってもよい。
抗体は、生物学的試料（本明細書において言及した任意のそのような試料など）中の本
発明のポリペプチドを検出するための方法において使用することができ、その方法は
Ｉ．本発明の抗体を提供することと、
ＩＩ．抗体抗原コンプレックスの形成が可能な条件下で、生物学的試料を前記抗体と共に
インキュベートすることと、
ＩＩＩ．前記抗体を含む抗体抗原コンプレックスが形成されているかどうかを決定するこ
とと
を含む。
本発明の抗体は、任意の適当な方法により生成させることができる。抗体を調製し特徴
づけるための手段は当技術分野において周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎ
ｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．を参照されたい。例えば、抗体は、宿主動物中で
全ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、例えばそれらの抗原性エピトープ、（今後
「免疫原」と称する）に対して抗体を生じさせることにより生成させることができる。フ
ラグメントは、本明細書において言及したフラグメント（典型的には少なくとも１０個ま
たは少なくとも１５個のアミノ酸の長さ）の任意のものであってよい。
ポリクローナル抗体を生成させる方法は、適当な宿主動物、例えば実験動物を免疫原で
免役して、イムノグロブリンを動物の血清から単離することを含む。したがって、動物に
免疫原を接種し、続いて動物から血液を取り出して、ＩｇＧ分画を精製することができる
。モノクローナル抗体を生成させるための方法は、所望の抗体を生成する細胞を不死化す
ることを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾臓細胞と腫瘍細胞と
を融合することにより生成させることができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（
１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５〜４９７）。
所望の抗体を生成する不死化された細胞は、従来の手順により選択することができる。
ハイブリドーマは、培養で増殖させるかまたは腹水の形成のために腹腔内に注入するかま
たは同種異系の宿主または免疫不全の宿主の血液ストリーム中に注入することができる。
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続く、エプスタインバールウイルス
を用いるリンパ球の形質転換により調製することができる。
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の生成のために、実験動物は、ヤギ、
ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマであることが適当で
ある。所望であれば、免疫原は、免疫原が、例えばアミノ酸残基の１つの側鎖を通して、
適当な担体に結合された複合体として投与することができる。担体分子は、通常、生理学
的に許容される担体である。得られた抗体は単離して、所望であれば精製することができ
る。
検出キット
本発明は、本明細書において定義した１つまたは複数の多型をタイピングするための手
段を含むキットも提供する。特に、そのような手段は、本明細書において定義した多型を
検出するかまたは検出に役立つことができる、本明細書において定義した特異的な結合剤
、プローブ、プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または、抗体フラグメントを
含む抗体を含むことができる。プライマーまたはペアまたはプライマーの組合せは、本明
細書において論じた検出されるべき多型を含むポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを
起こす配列特異的プライマーであることができる。プライマーまたはプライマーのペアは
、多型のヌクレオチドに対して二者択一的に特異的ではなくてもよいが、上流（５’）お
よび／または下流（３’）領域に対して特異的であり得る。これらのプライマーは、領域
がコピーされるべき多型のヌクレオチドを包含することを可能にする。プライマー伸張技
法で使用するのに適したキットは、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮ
ＴＰ）を特異的に含むことができる。これらは、伸張生成物の検出およびそれに続く多型
の位置に存在するヌクレオチドの決定を可能にするために、例えば蛍光標識または質量改
変され得る。
キットは、多型が存在しないことを検出することができる特異的な結合剤、プローブ、
プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または抗体を含むこともできる。キットは
、緩衝剤または水溶液を含むことができる。
キットは、上記の方法の実施形態の任意のものが実施されることを可能にする１種また
は複数種の他の試薬または器具を追加して含むことができる。そのような試薬または器具
は、以下の１つまたは複数を含むことができる：作用剤の多型に対する結合を検出する手
段、蛍光性標識などの検出可能な標識、ポリヌクレオチドに作用し得る酵素、典型的には
ポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、リボヌクレアーゼＨもしくは標識をポリヌクレオチ
ドに付けることができる酵素、酵素試薬のための適当な緩衝剤（単数または複数）もしく
は水溶液、本明細書において論じた多型に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、陽
性および／もしくは陰性対照、ゲル電気泳動装置、試料からＤＮＡを単離する手段、個体
から試料を得る手段例えばスワブもしくは針を含む器具など、または検出反応をその上で
実施することができるウェルを含む指示具。キットは、本発明の特異的な結合剤、好まし
くはプローブを含むポリヌクレオチドアレイなどのアレイであることができ、またはそれ
を含むことができる。キットは、通常、キットを使用するための説明書のセットを含む。
生物情報科学
多型の配列は、電子書式で、例えばコンピュータデータベースで貯蔵することができる
。したがって、本発明は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）お
よび／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに肝臓の銅蓄積
からのイヌの保護とのそれらの関連に関する情報を含むデータベースを提供する。データ
ベースは、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡまたはＵＢＬ５各遺伝子における１もしくは複数の
多型および／またはそれと連鎖不平衡にある１もしくは複数の多型、ならびにそれらと肝
臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むこともできる。データベー
スは、多型についての情報、例えば多型と、肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する
感受性との関連性をさらに含むことができる。
本明細書に記載したデータベースは、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護またはそ
れに対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するために使用する
ことができる。そのような決定は、電子的手段により、例えばコンピュータシステム（Ｐ
Ｃなど）を使用することにより実施することができる。
典型的には、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含
むかどうかの決定は、コンピュータシステムにイヌからの遺伝的データをコンピュータシ
ステムに入力することと、遺伝的データを、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配
列番号１４２）および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型ならび
に肝臓の銅蓄積からのイヌの保護とのそれらの関連に関する情報を含み、場合により、Ｇ
ＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子における１つもしくは複数の多型および
／またはそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに肝臓の銅蓄積に対
するイヌの感受性とのそれらの関連に関する情報を含むデータベースと比較することと、
この比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多
型を含むかどうかを決定することとにより実施されるであろう。この情報は、次に、イヌ
の肝臓の銅レベルの管理の指針として使用することができる。
本発明は、前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法のすべての
ステップを実施するためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムも提供す
る。前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法を実施するための、
コンピュータで可読の媒体上に貯蔵したプログラムコード手段を含むコンピュータプログ
ラム製品も提供される。コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシ
ステムに本発明の方法を実施するように指示する搬送波上のプログラムコード手段を含む
コンピュータプログラム製品も、追加で提供される。
図４に例示したように、本発明は、本発明による方法を実施するために整えられた装置
も提供する。装置は、典型的には、ＰＣなどのコンピュータシステムを含む。一実施形態
において、該コンピュータシステムは、イヌの遺伝的データを受け取る手段２０；データ
を多型に関する情報を含むデータベース１０と比較するためのモジュール３０；および前
記比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイ
ヌの感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するための手段４０を備え
る。
品種改良手段
育種価は個体の親としての価値と定義され、農業において家畜の望ましい特色を改良す
るために普通に使用される。イヌの全体的銅処理能力を改良して慢性肝炎などの銅関連疾
患の発生を減少させるためには、肝臓の銅蓄積から保護される血統についてイヌを選択す
るのが有利であろう。この問題は、血統を知らせるために、イヌが肝臓の銅蓄積から保護
されるかどうかを決定するために使用することができる多型を使用することにより解決さ
れる。
例えば、２頭のイヌの子孫の銅処理能力は、ＡＴＰ７Ａ遺伝子座における両親の遺伝子
型により影響され得る。この遺伝子座における特定の変異の移動は、子孫にとって利益で
あり得る。遺伝子座における遺伝子型を決定することにより、将来の親の育種価を評価し
て、それにより所与の血統対が適当であるかどうかに関する決定をすることが可能であろ
う。
したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出することについてイヌ
を選択する方法であって、本発明の方法により、候補の第１のイヌで、イヌのゲノムが肝
臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより
候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出するのに適するかどうかを決
定することを含む方法を提供する。該方法は、本発明の方法により、第１のイヌと性が反
対の第２のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型
を含むかどうかを決定することをさらに含むことができる。結果が第１のおよび／または
第２のイヌが肝臓の銅蓄積からの保護を示す遺伝子型を有するということであれば、その
場合、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するために、第１のイヌを第２のイヌと交配
させることができる。
例えば、該方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）から選
択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型
の有無を、候補の第１のイヌのゲノムで決定することを含むことができる。より好ましく
は、該方法はＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／または
ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）の有無を決定することを
含む。本発明の方法は、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（配列番号１４２）のＴ対立遺伝
子および／またはＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）のＴ対
立遺伝子の有無を決定することを含むことができる。さらにより好ましくは、方法は、イ
ヌが、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰおよび／またはＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿
Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）のＴ対立遺伝子に対してホモ接合性か（雌イヌの場
合）またはヘミ接合性か（雄イヌの場合）を決定することを含むことができる。該ＳＮＰ
の存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護されており、したがって第２のイヌと交配
させるのによい候補であることを示す。第１のおよび第２のイヌは、該ＳＮＰのＴ対立遺
伝子についてホモ接合性またはヘミ接合性であることが好ましい。第１のおよび／または
第２のイヌのいずれかにおけるホモ接合は、このことにより子孫がホモ接合性であり、そ
れにより肝臓の銅蓄積から選択される可能性が増大するので、最も好ましい。
本発明は、銅蓄積に対する感受性を示す本発明の多型を使用することにより、肝臓の銅
蓄積から保護される子孫を産するためのイヌを選択する方法も提供する。イヌのゲノム中
のそのような多型が存在しないことは、そのイヌが交配のためのよい候補であることを示
す。したがって、本発明の方法は、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感
受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定すること；およびそれにより候補
の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するのに適するかどうかを決定する
ことをさらに含むことができる。
方法は、第一のイヌ候補のゲノムにおける、（ｃ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す
ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａまたはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｄ）前記
多型（ｃ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含むことができる。方法は、
第一のイヌとは異なる性別の第二のイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す
１つまたは複数の多型を含むかを決定することをさらに含むことができる。したがって、
方法は、第二のイヌのゲノムにおける、（ｃ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すＧＯＬ
ＧＡ５、ＡＴＰ７ａまたはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｄ）前記多型（
ｃ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することを含むことができる。結果が、第一お
よび／または第二のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す遺伝子型を持たな
いものであれば、肝臓の銅蓄積に対して感受性ではない子孫を作出するために第一のイヌ
を第二のイヌと交配することができる。
方法は、候補の第１のイヌのゲノムで、表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて特定されたＳ
ＮＰから選択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは
複数の多型の有無を決定することを含むことができる。これらの多型の１つまたは複数の
存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であり、したがって肝臓の銅蓄積から
保護される子孫を産するために第２のイヌと交配させるべきよい候補ではないことを示す
。
候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、任意の血統のものであってよい。候補
の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレト
リーバーまたはトイプードルから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい
。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺
伝的に継承していることがより好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーで
あってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑
種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー
犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリ
ーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において、少なくとも５０％または少
なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、
イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバー
の血統に由来してよい。
イヌの遺伝的血統の継承は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライ
トの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なっ
たＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混
血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような
遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、それがラブラドールレ
トリーバーの血統を継承すると、例えばイヌの飼い主または獣医により推定されるという
理由で、ラブラドールレトリーバーの血統継承について検査される必要がないこともある
。これは、例えばイヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。
オールブリードクラブ登録により認められた血統の最も純粋種のイヌは「非公開の血統
台帳」により管理される。血統台帳は、典型的には、例えば、血統協会またはケンネルク
ラブにより保持される、与えられた血統の承認されたイヌの公式登録である。それは、イ
ヌがそれらの両親の両方とも登録されている場合にのみ追加され得るなら、一般に「非公
開」血統台帳と称される。大部分の血統は非公開の血統台帳を有し、その結果、遺伝的多
様性は既存集団の外側から導入され得ないので近親交配が生じる。ケンネルクラブにより
認められた多くの血統において、これは、遺伝的疾患または障害ならびに同腹子の数の減
少、短命および自然受胎不能などの他の問題の高い発生率を生じている。
近親交配に関連する問題を回避するためには、血縁的により密接なイヌに比較して血縁
的に互いにより隔たった特定の血統の中で、血統についてイヌを選択するのが有利であろ
う。したがって本発明の一態様において、候補の第１のイヌおよび候補の第２のイヌの遺
伝的血統の継承が、２頭のイヌの縁続きの程度を決定するために決定される。本発明のこ
の態様において、用語「遺伝的血統の継承」は、特定の血統内のイヌの遺伝的祖先の系統
に関する。イヌの遺伝的血統の継承は本明細書に記載したようにして決定することができ
る。イヌの遺伝的継承を決定することにより、彼らがいかに密接に関係しているかを決定
するために、単一血統内でイヌの間を区別することは可能である。
したがって、本発明の一態様において、候補の第１のイヌと候補の第２のイヌとの縁続
きの程度が決定され、それは候補の第１のイヌの遺伝的血統の継承を同じ血統の候補の第
２のイヌと比較することを含む。好ましくは、イヌは純粋種のイヌである。各イヌの遺伝
的血統の継承は、例えば、前記イヌにおいて、１つまたは複数の血統特異的多型の有無を
確認することにより決定することができる。
縁続きの程度は、イヌが共通して有する血統特異的多型の数から決定することができる
。例えば、同じ血統の２頭のイヌは、０〜１００％の、例えば１０〜９０％、２０〜８０
％、３０〜７０％または４０〜６０％の検査済み血統特異的多型を共通して有することが
できる。したがって２頭のイヌは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％または９０％の検査済み血統特異的多型を共通して有すること
ができる。２頭のイヌの間に共通の検査済み血統特異的多型のパーセンテージは、それら
の縁続きの程度の尺度として使用することができる。本発明のこの態様において、２頭の
イヌは、彼らが遺伝的に十分無関係である場合にのみ、一緒に交配させるであろう。例え
ば、彼らは、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満の検査済み血統特異的多
型を共通して有する場合にのみ、一緒に交配させることができる。
本発明は、被験対象のイヌと交配させることについて１頭または複数のイヌを選択する
方法であって、
（ａ）被験対象のイヌおよび被験対象のイヌと性が反対の２頭以上のイヌの検査群中の
各イヌについて、ゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型、および
場合により肝臓の銅蓄積に対して感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決
定することと、
（ｂ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選
択することと
を含む方法も提供する。
検査群は、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、
１００または２００頭の異なったイヌ、例えば２〜１００、５〜７０または１０〜５０頭
のイヌからなってよい。イヌは、通常、肝臓の銅蓄積から保護されるという根拠で検査群
から選択される。検査群から選択される１頭または複数のイヌは、被験対象のイヌと同じ
かまたは類似の血統を遺伝的に継承していてよい。
被験対象のイヌおよび検査群中の各イヌの血統は任意でよい。被験対象のイヌおよび／
または検査群中の各イヌは、ラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたは
トイプードルから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは、ラブ
ラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることがより好ましい。イヌは純粋種
のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種の
イヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が、
純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または
４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景に
おいて、少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を
有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７
５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。本発明の一実施形態において
は、肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性に関する多型の有無に基づいて、
検査群内の肝臓の銅蓄積から保護される可能性が最も高いイヌが、被験対象のイヌと交配
させるために選択される。他の実施形態においては、検査群内の肝臓の銅蓄積から保護さ
れる可能性が高い多数のイヌが、被験対象のイヌと交配させるために選択される。例えば
、検査群中の少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０頭のイヌを選択すること
ができる。その上、他の因子、例えば地理的位置、年齢、品種改良状態、既往歴、疾患感
受性または身体的特性に基づいて選択されたイヌの群から、さらに選択することもできる
。
上で説明したように、遺伝的に最も無関係の同じ血統内でイヌを交配させることが好ま
しい。これは、遺伝的多様性を血統内で増加または維持し、かつ子孫に生じる近親交配に
関係する問題の可能性を減少させるためである。したがって、検査群からのイヌのさらな
る選択は、被験対象のイヌとの遺伝的関係に基づくことができる。したがって、本発明の
一態様において、方法は、
（ａ）被験対象のイヌの遺伝的血統の継承を、同じ血統のかつ被験対象のイヌと性が反
対の２頭以上のイヌの検査群中の各イヌの遺伝的血統の継承と比較することと、
（ｂ）この比較から、被験対象のイヌと検査群中の各イヌとの間の縁続きの程度を決定
することと、
（ｃ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選
択することと、
を含むことができる。
イヌは、被験対象のイヌ（すなわち、精液をとるべきイヌ）とのそれらの関係に基づい
て検査群から選択することができる。検査群から選択された１頭または複数のイヌは、イ
ヌの検査群内で最も隔たった関係にある（すなわち最低の縁続きの程度を有する）ことが
好ましい。被験対象のイヌおよび検査群中のイヌの遺伝的血統の継承は、すでに知られて
いてよく、または例えば市販の血統検査により決定してもよい。
したがって、本発明は、１頭または複数の適当なイヌを被験対象のイヌと交配させるた
めに推薦する方法を提供する。推薦は、被験対象のイヌの飼い主または世話人、獣医、イ
ヌ飼育者、ケンネルクラブまたは血統登録に対して行うことができる。
本発明は、肝臓の銅蓄積からの、性が反対の少なくとも２頭のイヌの保護またはそれに
対する感受性が、場合により同じ血統内で、彼らを一緒に交配させる前に決定される、イ
ヌを交配させる方法にも関する。
肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対する感受性は、電子書式中、例えばコン
ピュータデータベース中に貯蔵することができる。したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積
に対する感受性またはそれからの保護、および１頭または複数のイヌの性に関する情報を
含むデータベースを提供する。データベースは、イヌについてのさらなる情報、例えば、
イヌの血統を遺伝的に継承している品種改良状態、年齢、地理的位置、既往歴、疾患感受
性または身体的特性を含むことができる。データベースは、通常、各イヌについての固有
の識別名、例えばイヌの登録名をさらに含む。データベースは、遠隔で、例えばインター
ネットを使用して評価することができる。
本発明の食材
本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌのための食材
に関する。本発明者らは、市販の食餌中に見出される銅のレベルがラブラドールレトリー
バーにおける肝臓の銅蓄積と関連していること、および食餌中の銅のレベルを減少させる
ことが、驚くべきことに、薬剤のペニシラミンより効果的に、肝臓の銅レベルが正常レベ
ルにもたらされることを可能にすることを発見した。本発明の食材は、低い銅濃度、具体
的には２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の銅濃度を有する。食材は、ラブラドールレトリーバ
ーの肝臓における銅の蓄積を予防するために使用される。したがって、それは、肝臓の銅
蓄積に起因し得る疾患または病態を予防するために有用である。したがって、本発明の食
材は、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むと
本発明の方法により決定されているイヌに与えることができる。本明細書において使用さ
れる「食材」という用語は、食材、食餌、食料品またはサプリメントを包含する。これら
の形態のいずれも、固体、半固体または液体であってよい。
より詳細には、本発明の食材は、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で含む。好ま
しくは、銅濃度は、２０ｍｇ／ｋｇ未満、１７ｍｇ／ｋｇ未満、１５ｍｇ／ｋｇ未満、１
２ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ未満または８ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満である。好まし
くは、銅濃度は、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも４．５、
少なくとも４．７５、少なくとも５または少なくとも８ｍｇ／ｋｇ（乾物）である。典型
的には、銅濃度は、３〜２１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、４〜１２ｍｇ／ｋｇ、４．５〜１
２ｍｇ／ｋｇ、４〜１１ｍｇ／ｋｇ、４．５〜１１ｍｇ／ｋｇ、４〜１０ｍｇ／ｋｇ、４
．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、４〜９ｍｇ／ｋｇ、４．５〜９ｍｇ／ｋｇ、４〜８ｍｇ／ｋｇま
たは４．５〜８ｍｇ／ｋｇ（乾物）の範囲内である。銅は、任意の生理学的に許容される
形態で食材中に存在してよい。したがって、銅は、硫酸銅などの任意の生理学的に許容さ
れる塩で提供することができる。
食材は、亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度でさらに含むことができる
。好ましくは、亜鉛濃度は、少なくとも１５０、少なくとも１８０または少なくとも２０
０ｍｇ／ｋｇ（乾物）である。亜鉛濃度は、食品規制当局により許容される最大値を超え
ないことが好ましい。典型的には、亜鉛濃度は２５０ｍｇ／ｋｇ未満、２４０ｍｇ／ｋｇ
未満、２３０ｍｇ／ｋｇ未満または２２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満である。通常、亜鉛濃
度は、１２０〜２５０、１５０〜２５０または２００〜２５０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の範囲
内であろう。
食材中の亜鉛の量は銅の量を超えることが好ましい。イヌにより摂取される食材中の亜
鉛および／または銅の効果的な濃度は、非消化性物質の有無により影響されることは理解
されるであろう。好ましくは、食材中における亜鉛の銅に対する比は、食材の質量により
５以上、例えば６、７、８、９、１０以上である。
亜鉛は、本発明の銅のレベルを提供する同じ食材中で提供することができる。あるいは
、亜鉛は、本発明の食材に添加することができるサプリメントの形態で提供することもで
きる。サプリメントは、錠剤、粉末または液剤の形態であることができる。亜鉛は、食材
中に存在するかまたは任意の生理学的に許容される形態にあるサプリメントとして提供す
ることができる。したがって、亜鉛は、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、炭酸亜鉛
、塩化亜鉛または酸化亜鉛などの任意の生理学的に許容される塩の中であってよい。
食材中の銅または亜鉛の濃度は、本明細書に記載した乾物を基準にする。すなわち、異
なった含水率を有し得る異なった食材間での直接比較を可能にするために、水を除いた食
材を基準にする。湿潤したまたは半湿潤の食材中の銅または亜鉛の濃度を測定するために
、食材の試料は、例えばオーブンを使用して最初に乾燥して水を除去する。その後、任意
の適当な技法を使用して乾燥食材試料中の銅または亜鉛の濃度を測定することができる。
当技術分野において周知のそのような技法の例は炎光原子吸収分光法である。
本発明の食材は、例えば、湿潤ペットフード、半湿潤ペットフードまたは乾燥ペットフ
ードの形態であることができる。湿潤ペットフードは、一般に６５重量％を超える含水率
を有する。半湿潤ペットフードは、通常、２０〜６５重量％の間の含水率を有しており、
および微生物の増殖を防止するために吸湿剤および他の成分を含むことができる。キブル
とも呼ばれる乾燥ペットフードは、一般に２０重量％未満の含水率を有し、その加工は典
型的には、押し出し、乾燥および／または加熱ベーキングを含む。
食材は、湿潤および乾燥食物の混合物として提供することができる。そのような組合せ
は、予め混合して提供することができ、または別々に、同時にまたは順番に提供される２
つ以上の別の食材としてイヌに与えることもできる。
食材は、イヌがその食餌中で消費する任意の製品を包含する。本発明は、標準的食品な
らびにペットフードスナックを含む。食材は、好ましくは調理された製品である。それは
食肉または動物由来の材料（牛肉、鶏肉、七面鳥、ラム、魚その他など）を組み込むこと
ができる。あるいは、製品は食肉を含まなくてもよい（好ましくは、タンパク質供給源を
提供するための食肉代替物、例えば、ダイズ、トウモロコシ、グルテンまたはダイズ製品
などを含む）。製品は１種または複数種の穀物（例えば、トウモロコシ、米、燕麦、大麦
その他）などのデンプン供給源を含有してもよく、またはデンプンを含まなくてもよい。
乾燥ペットフードの成分は、シリアル、穀物、食肉、家禽、脂肪、ビタミンおよびミネ
ラルから選択することができる。成分は、通常、混合されて押し出し機／調理器を通して
整えられる。次に、製品は、典型的には成形されて乾燥され、乾燥後、乾燥製品上に着香
剤および脂肪がコートまたはスプレーされることもある。
すべてのペットフードは、一定レベルの栄養分を提供することを求められている。例え
ば、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏ
ｆｆｉｃｉａｌｓ（ＡＡＦＣＯ）およびＰＥＴ Ｆｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは共通し
て使用される成分に基づいて、ドッグフードのための栄養分プロファイルを制定した。こ
れらの制定されたプロファイルは、「ＡＡＦＣＯドッグフード栄養分プロファイル」と呼
ばれる。これらの規制の下で、ドッグフードは、ＡＡＦＣＯにより決定されたように最低
レベルを満たしかつ最高レベルを超えない栄養分の濃度を含有するように作られなければ
ならない。
ドッグフード調合物は、イヌのカロリー、タンパク質、脂肪、炭水化物、繊維、ビタミ
ンまたはミネラルの必要性に従って作ることができる。例えば、ドッグフード調合物は、
ω−６およびω−３脂肪酸などの必須脂肪酸の正しい量または比を提供するように特注生
産することができる。ω−６脂肪酸の主要な供給源は、ヒマワリ、ダイズ油、ベニバナお
よびオオマツヨイグサ油などの植物であるが、それに対してω−３脂肪酸はアマニおよび
海洋性供給源中に主として見出される。銅分が高くかつ食材の製造中に避けることができ
る食物成分には、貝、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、ナッツ、キノコ、シリアル、ココア、莢
果および軟水（銅管）が含まれる。亜鉛に富みかつ調合時に含めることができる食物成分
には、ミルク、ゼラチン、卵黄、米および馬鈴薯が含まれる。
食材は好ましくは梱包される。梱包は、金属（通常、スズまたは柔軟なフォイルの形態
で）、プラスチック（通常、小袋または瓶の形態で）、紙または厚紙であってよい。どの
ような製品中の水分量も、使用することができるまたは要求される梱包のタイプに影響し
得る。
本発明の食材は、亜鉛の供給源と一緒に梱包することができる。亜鉛は、任意の形態で
提供することができる。亜鉛は、１種または複数種の食材中でまたは本発明の最高の銅の
レベルを含む食材と共に梱包される別のサプリメントの形態で提供することができる。亜
鉛が食材中で提供されるときには、それは、本発明の特定の銅のレベルを含有する同じ食
材中で提供することができ、またはそれは、１つもしくは複数の別の食材もしくは両方の
食材中で提供することができる。したがって本発明は、銅を２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満
の濃度で有する食材および亜鉛サプリメントを含むパックを提供する。亜鉛サプリメント
は、食材に添加されるときは、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を提供する。
食材および亜鉛サプリメントは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承してい
るイヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患の予防に、同時に、別々にまたは順次に使
用するためのものである。
本発明は、本明細書において論じたラベルを付けた食材も提供する。ラベルは、例えば
、食材がラブラドールレトリーバーの血統のイヌに適することを示すことができる。他の
指示書または使用説明書も提供することができる。例えば、食餌または食材が、他の成分
に加えて含有する銅および／または亜鉛の量を示すことができる。さらに、給餌説明書を
提供することができる。
ラブラドールレトリーバー
本発明の食材は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおけ
る肝臓の銅蓄積を予防するのに適する。イヌは、典型的には伴侶犬またはペットである。
イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のも
しくは交雑種のイヌ、または異系交配されたイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の
一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の
１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、
その遺伝的背景において少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリ
ーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％また
は少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。
イヌの遺伝的血統背景は、遺伝マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの
対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳ
ＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血
統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝
子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、それがラブラドールレトリ
ーバーの血統を継承すると、例えばイヌの飼い主または獣医により推定されるという理由
で、ラブラドールレトリーバーの血統継承について検査される必要がないこともある。こ
れは、例えば、イヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。
該食物は、任意の年齢のイヌに適する。食物は、０〜１２歳、例えば１〜５歳、２〜７
歳または３〜９歳の年齢を有するイヌに適し得る。
一般的に、該食材は、健康なイヌに適する。それは、検出し得る肝銅の蓄積を有しない
イヌに適する。食材は、予防的使用、すなわちイヌの肝臓における銅の蓄積を予防するこ
とを意図される。食材は、銅蓄積の危険性を最小化して、それによりイヌが慢性肝炎、肝
硬変または肝不全などの肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患または病態を発生する確率を減少
させるために意図されている。典型的には、食材は、異常な肝銅濃度を有せず、したがっ
て銅関連肝炎に罹る危険性の低いイヌにおける銅蓄積の予防に使用するためのものである
。イヌは、銅を蓄積する履歴を有しなくてもよい。したがって、イヌは、好ましくは、約
４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の範囲内の肝銅の正常レベルを有する。しかしな
がら、新生のイヌにおいて、肝銅の正常レベルは約６００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未
満であると考えることができる。食材をイヌに与える目的は、肝銅濃度を正常レベルより
有意に高いレベルに達することから予防することである。イヌの肝臓における銅の濃度を
決定するために使用することができる方法は、当技術分野において周知である。適当な方
法は実施例４で記載される。
食材は、銅関連慢性肝炎を予防するために使用することができる。食材は、好ましくは
、上記の肝疾患を予防する目的で、検出可能な肝疾患を有しないイヌにおける銅蓄積の予
防に使用するためのものである。食材は、慢性肝炎、肝硬変または肝不全などの肝臓の銅
蓄積に起因し得る疾患または病態を治療するために使用することもできる。肝疾患の証拠
または症状には、嗜眠、下痢および黄疸などの臨床的指標が含まれる。肝疾患の生化学的
指標には、血清ビリルビンおよびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およ
びガンマグルタミルトランスペプチダーゼなどの血清肝臓酵素活性の異常な上昇が含まれ
る。そのような肝疾患指標の生化学的測定は、当技術分野において周知である。
食物が意図されるイヌは、いかなる臨床的問題も有しないことが好ましい。
食物の製造
本発明の食材は、適当な成分を一緒にして混合することにより作製することができる。
製造は、食材が要求される銅濃度を有するように制御される。銅の濃度は、食材製造工程
中にモニターすることができる。したがって本発明は、本発明の食材を作製する方法であ
って、食材が２１ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の銅濃度を有するように、食材用の成分を一緒
にして混合することを含む方法を提供する。食材中に組み込まれるべき１種または複数種
の構成要素は、銅の供給源を提供し得る。しかしながら、銅に富みそうな構成要素の使用
を避けることは重要である。銅分が高くかつ食材の製造中に避けることができる食物成分
には、貝、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、ナッツ、キノコ、シリアル、ココア、莢果および軟
水（銅管）が含まれる。場合により、構成要素の１種または複数種は本発明の食材のため
に亜鉛の供給源を提供するであろう。亜鉛に富みかつ調合時に含めることができる食物成
分には、ミルク、ゼラチン、卵黄、米および馬鈴薯が含まれる。構成要素／成分は、食材
の製造／加工中の任意の時に添加することができる。
食材中に存在する銅の濃度を、それが本発明による限界未満であるかどうかを決定する
ために、測定することは重要である。亜鉛の濃度も、本発明により好ましい最小レベルを
超えていることを確認するために測定することができる。食材の製造方法におけるステッ
プの１つは、食材の試料中の銅濃度の測定を含むことができる。銅濃度の少なくとも１回
の測定は、食材が調製された後で食材の試料から行うことができる。測定は、さらなる成
分の添加により蓄積される銅および／または亜鉛のレベルをモニターするために、食材の
調製中にも行うことができる。例えば、測定は、１種または複数種の成分の添加後に試料
について行うことができる。銅、亜鉛および他の元素の測定は、炎光原子吸収分光法など
の当技術分野において知られる任意の適当な方法を使用して、試料について行うことがで
きる。
典型的には、本発明の食材を作製する方法は、成分を一緒にして、場合により任意の原
料成分の調理と共に混合することと、食材の試料中の銅、および場合により亜鉛の濃度を
測定することと、食材を梱包することとを含む。食材を作製する方法は、イヌの飼い主、
イヌの給餌の担当者または獣医に食材を提供することおよび／または食材をイヌに与える
ことをさらに含み得る。
食材が銅を少しも含まないということは普通ではないが、銅は、イヌの食餌における銅
の毎日の最低必要量を達成するために、食材にサプリメントとして添加することができる
（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌ（ＡＡＦＣＯ
））により推奨されるように）が、一方それでも銅濃度を本発明によりその下と要求され
るレベルに保つ。したがって本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承
しているイヌのための食材の製造における銅の使用も提供し、この場合、食材は銅を２１
ｍｇ／ｋｇ未満の濃度で含み、前記イヌにおける銅蓄積の予防に使用するためのものであ
る。銅は、任意の適当な形態で食材に添加することができる。銅サプリメントの例として
、塩化銅および硫酸銅５水和物が挙げられる。本発明において使用される食品製造装置は
、典型的には、以下の構成要素の１つまたは複数を備える：乾燥ペットフード成分のため
の容器；液体のための容器；混合機；成形具および／または押し出し機；切断デバイス；
調理器（例えばオーブン）；クーラー；梱包手段；およびラベルを付ける手段。乾燥成分
容器は、典型的には、底部に開口部を有する。この開口部は、ロータリー・ロックなどの
容量調節要素により覆うことができる。容量調節要素は、乾燥成分のペットフードへの添
加を調節するために、電子製造指示により開閉することができる。ペットフードの製造に
おいて通常使用される乾燥成分には、トウモロコシ、小麦、食肉および／または家禽の肉
が含まれる。ペットフードにおいて通常使用される液体成分には、脂肪、獣脂、および水
が含まれる。液体容器は、例えば電子製造指示により、測定された量の液体をペットフー
ドに添加するように制御され得るポンプを含むことができる。
一実施形態において、乾燥成分容器（単数または複数）および液体容器（単数または複
数）は混合機に接続され、特定された量の乾燥成分および液体を混合機に送達する。混合
機は、電子製造指示により制御することができる。例えば、混合の持続時間または速度を
制御することができる。次に、混合された成分は、典型的には成形具または押し出し機に
送達される。成形具／押し出し機は、混合された成分を要求される形状に成形するために
使用することができる、当技術分野において知られた任意の成形具または押し出し機であ
ってもよい。典型的には、混合された成分は加圧下で限定された開口部を通して押し出さ
れ連続した紐の形状になる。紐が押し出されると、それは、ナイフなどの切断デバイスに
より断片（キブル）に切ることができる。キブルは、通常、例えばオーブン中で調理され
る。調理時間および温度は、電子製造指示により制御することができる。調理時間は、食
物を所望の含水率にするように変更することができる。次に、調理されたキブルは、クー
ラー、例えば１つまたは複数のファンを備えたチェンバーに移すことができる。
ペットフード製造装置は、梱包装置を備えることができる。梱包装置は、通常、ペット
フードをプラスチックまたは紙の袋または箱などの容器中に梱包する。装置は、ペットフ
ードにラベルを、通常は、食物が梱包された後で付ける手段も備えることができる。ラベ
ルは、食材が適するイヌの種類（すなわちラブラドールレトリーバー）、および／または
食物の成分を表示することができる。
食材の使用
本発明の食材は、イヌにおける肝臓の銅蓄積を予防する方法において使用することがで
きる。したがって、銅関連慢性肝炎、肝硬変または肝不全などの高い肝臓銅と関連する疾
患または病態を予防するために使用することができる。したがって、本発明は、ラブラド
ールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積および肝臓の
銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法であって、イヌに本明細書に記載した食材を給餌
することを含む方法を提供する。本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に
継承しているイヌにおける銅関連慢性肝炎を予防する方法であって、本発明の食材をイヌ
に与えることを含む方法も提供する。本発明の食材は、典型的には、ラブラドールレトリ
ーバーにおける銅の蓄積の予防における、予防的使用のためのものである。それはまた、
典型的には、ラブラドールレトリーバーにおける銅関連慢性肝炎を予防するためのもので
ある。
本発明の食材は、好ましくは、本明細書に記載されている遺伝子検査によって、そのゲ
ノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含まないことが決定され、
場合により肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むことが決定さ
れたイヌにおける、肝臓銅の蓄積を予防する方法に用いるためのものである。
したがって、本発明は、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌにお
ける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法であって、（ｉ）イヌのゲノムにおけ
る、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ）（ａ
）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無
の検出を含む、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定することと、（ｉｉ
）少なくとも４．５から１２ｍｇ／ｋｇ（乾物）未満の濃度の銅を含む食材をイヌに処方
、提供または給餌することとを含む方法を提供する。食材は、イヌの飼い主、世話人また
は獣医に提供されてもよい。本発明は、前記方法に用いるための食材も提供する。
本発明の食材の使用は、亜鉛の供給源をイヌに与えることを含むことができる。本明細
書に記載したように、亜鉛は、イヌに適した任意の形態で提供することができる。本発明
の低レベルの銅を含有する食材は、亜鉛を、例えば、少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物
）の濃度でさらに含むことができる。あるいは、亜鉛は、１つまたは複数の別々の食材ま
たはサプリメントの形態で提供することもできる。本発明の食材の使用は、亜鉛サプリメ
ントをイヌに与えることを含むことができる。亜鉛サプリメントは、任意の時に、すなわ
ち、別々に、同時にまたは順次に本発明の食材に提供することができる。亜鉛サプリメン
トは、例えば、それがイヌに与えられるかまたはそれをイヌの飲用水中に入れることがで
きる前に、本発明の食材と混合することができる。
本発明の食材は、イヌに１日当たり１回または複数回与えることができる。食材は、好
ましくは、イヌの従来の食物の代わりに与えられる。銅蓄積を予防するまたは慢性肝炎を
予防する方法は、無期限で、すなわちイヌの一生を通して使用することができる。
本発明を以下の実施例により例示する。
銅蓄積に対する感受性と関連するＳＮＰの解明
１２０頭のラブラドールのＤＮＡ試料を、２２０００を超えるＳＮＰにわたって遺伝子
型決定した。高銅のイヌ（肝臓銅のレベルが６００ｍｇ／ｋｇを超える）から７２頭のイ
ヌの試料および正常銅肝臓レベル（４００ｍｇ／ｋｇ未満）から４８頭のイヌの試料があ
った。データは、可能なイヌの対すべての間の相互比較を使用して分析した。データは、
疾患を支持する情報を与える遺伝子座により配列した。高銅レベルに連関する最良のフィ
ッティングマーカーを見出すために、Ｂｏｏｌｅａｎオペレータを使用して、最良の３つ
のゲノムの遺伝子座からのデータを使用した。３つの遺伝子座を使用する簡単なＢｏｏｌ
ｅａｎモデルの結果を下に示す：
表Ｉの２進値に対するキーは以下の通りである。
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ８（ＧＯＬＧＡ５遺伝子）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰにＡＡ遺伝子型がある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰの任意の他の遺伝子型がある場合
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ３２（ＵＢＬ５遺伝子領域）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５にＧＧ、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７にＣＣおよびＢＩＣ
Ｆ２Ｐ１３２４００８にＧＧがある場合
０＝これらのＳＮＰのいずれかが異なった遺伝子型を示す場合
ゲノムの遺伝子座ＣＦＡＸ（ＡＴＰ７Ａ遺伝子領域）
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＡＡまたはＡＧがある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＧＧがある場合
すべての遺伝子座において、Ｘ＝使用されない対立遺伝子。
表Ｉは、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を表す。ゲノムの遺伝
子座ＣＦＡ８において、１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ１）。ゲノムの遺伝子座ＣＦ
Ａ３２において３つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ２、３および４）。ゲノムの遺伝子座
ＣＦＡＸにおいて１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ５）。２元値は、銅蓄積に対する感
受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）を有するイヌを示す。例えば０００は、３
つの悪い対立遺伝子のいずれも有しないことを表す。１１１は、３つの悪い対立遺伝子の
すべてを有することを表す。Ｘはその遺伝子における使用されない対立遺伝子である。１
ｘｘのおよび０ｘｘのラインは、ＧＯＬＧＡ５遺伝子中のＳＮＰのみを使用する１つの遺
伝子検査が有する力を示す。
表ＩＩは、より多くの標示対立遺伝子を有するイヌほど、平均でより高い銅濃度を有す
ることを示す。各パターンを有するイヌの数を見ることもできる。
表ＩＩＩは、表ＩおよびＩＩ中の結果のために使用されたＳＮＰの位置および配列を示
す。
結果は、３つのゲノムの遺伝子座（ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７Ａ遺伝子の
中および周辺にある）は銅蓄積に対する感受性と関連することを示す。さらに、銅蓄積に
対する感受性を示すこれらの領域中のＳＮＰを表ＩＶに示す。
肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさらに別のＳＮＰおよび保護ＳＮＰの同定
実施例１で同定された３つの遺伝子を調べて肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさ
らなるＳＮＰを同定した。３つの同定された遺伝子のエクソンを残らず網羅する３３個の
単位複製配列を選んだ。これらは、ラブラドールレトリーバーの血統のイヌからのゲノム
のＤＮＡの７２個の試料中で増幅されていた。試料は、高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える
肝臓銅のレベル）または正常銅肝臓レベル（４００ｍｇ／ｋｇ未満）のいずれかのイヌか
ら採取した。増幅された生成物は、サンガー法により両方向で配列を決定した。ＤＮＡＳ
ＴＡＲにより供給されるソフトウェア「Ｓｅｑｍａｎ４．０」を各単位複製配列中の配列
のアセンブルに使用した。次にアセンブリーを検査して一塩基変異（ＳＮＰ）を見出した
。次に、これらの変異は、両方向からの配列におけるＳＮＰで、基準強度（ｂａｓｅ−ｉ
ｎｔｅｎｓｉｔｙ）を検査することにより遺伝子型を決定される。２つの方向からのＳＮ
Ｐの遺伝子型が１０個を超える試料中で不一致であれば、ＳＮＰはアーチファクトと分類
されておよび無視される。同定された感受性ＳＮＰを表Ｖに提示する。
驚くべきことに、保護ＳＮＰも発見された。これは表ＶＩに示す。このＳＮＰは、ＡＴ
Ｐ７Ａ遺伝子（Ｘ染色体連関遺伝子）のコード領域中にあり、コード配列中に変化を生じ
させる。性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型による肝臓銅の平均レベルの試験を実施した（表
ＶＩＩ）。図５は、表ＶＩＩのデータをグラフで図示する。図６は、同じデータを銅の組
織学的スコアとして図示する。ｐ値（０．０００３９６）は、群として、組織学的なスコ
アと性別遺伝子型とに対するクラスカル・ワリス検定により決定した。Ｔ対立遺伝子の存
在はイヌが高い肝臓銅から保護されることを示すことがデータから明らかである。
結果は、慢性肝炎の雌のバイアスを説明することができる。雄イヌは、１コピーのＸ染
色体を有するだけなので、ＡＴＰ７Ａ遺伝子座でヘミ接合性である。Ｘ連関劣性遺伝子の
効果は、雄のＸ染色体のヘミ接合性状態のために、雌よりも雄において見られる可能性が
高い。この場合、保護効果は劣性であるので、雌集団における方が多くの症例が見られる
。
保護ＳＮＰは、ＡＴＰ７Ａのアミノ酸３２８位におけるトレオニンのイソロイシンへの
変化を生じさせ、可能な水素結合の数の３から０への減少および疎水性の増大、可能性と
してタンパク質の形状の変化をもたらす。この位置におけるトレオニンは、ウマ、ヒト、
チンパンジーおよびイルカを含む多くの哺乳動物を通じて保存され、タンパク質の機能に
おけるこのアミノ酸の重要性を示す。
ＡＴＰ７Ａの保護ＳＮＰの血統および地理的多様性に関する調査
表ＶＩ中のＡＴＰ７ＡのＳＮＰは、該ＳＮＰが他の血統においても存在するかどうかを
決定するために、ラブラドールレトリーバーに加えて他の血統のイヌからのＤＮＡ試料に
おいても遺伝子型を決定された。表ＶＩＩＩは、各遺伝子型のイヌの数について、結果を
示す。「Ｔ」の縦欄はホモ接合体の雌（ＴＴ）およびヘミ接合体の雄（Ｔ）を示す。結果
は、ＳＮＰは多様なイヌの血統に存在し、したがって種々の異なった血統、混血のイヌお
よび雑種における銅蓄積からの保護の指標として使用することができることを示す。該Ｓ
ＮＰのＴ対立遺伝子は、米国および日本のラブラドール集団にも見出され、イヌの地理的
位置はＳＮＰの効用の障害ではないことを示す。
さらに別の保護性だが非コード領域にあるＳＮＰの発見
ＡＴＰ７Ａ遺伝子の配列決定により、コード領域のＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳ
ＮＰとほとんど完全な連鎖不平衡にあるイントロンのＳＮＰが明らかになった。コード領
域のＳＮＰと同様に、イントロンのＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ４２）は、肝臓
の銅蓄積からの保護と有意に関連する（表ＩＸ）。遺伝子型と疾患状態の独立性における
２種類の自由度によるカイ２乗検定を用いて両者の有意性を測定した。疾患状態は、銅定
量化が＞６００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）かつ組織学スコアが＞＝２．５に対して陽性
であり、銅定量化が＜４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）かつ組織学スコアが＜２．５に
対して陰性であった。予想の表は、２個の変数の独立性を予見する試料内における遺伝子
型頻度および疾患頻度のベイズ法による予測に基づいていた。
非コード領域のＳＮＰとコード領域のＳＮＰとの間の連鎖不平衡の計算された尺度は、
Ｄ’＝０．９３、Ｒの２乗＝０．８６である。したがって、このＳＮＰ同士はほぼ完全に
不平衡にある。
ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ４２の前後の配列を表Ｘに示す。
コード領域突然変異（「ＡＴＰ７ＡのＳＮＰ」）の機能的効果を決定するために行われた
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
材料と方法
細胞系
安楽死させた雌のラブラドールから、イヌ皮膚線維芽細胞ＣＤＦＩＢ４４、ＣＤＦＩＢ
６２およびＣＤＦＩＢ１１１を単離した。安楽死させる前に採取した血液試料を本発明の
遺伝子検査に付し、疾患に対する危険性の増加を確認した。ＣＤＦＩＢ１１１はＡＴＰ７
ＡのＳＮＰがホモ接合型であり、ＣＤＦＩＢ６２はヘテロ接合型であった。ＣＤＦＩＢ４
２は対照として用いた。これらの細胞は、ＡＴＰ７Ａの野生型、ヘテロ接合型または変異
型を発現するイヌ皮膚線維芽細胞に対応して、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｔまた
はＡＴＰ７ＡＴ／Ｔと言う。臨床的メンケス病患者（ＡＴＡＣ）からヒト皮膚線維芽細胞
ＨＢ１５６を得た。対照として、Ｈ８８８１細胞を用いた。現在のところＡＴＰ７Ａは、
これらの細胞では配列決定されていない。ＡＴＰ７Ａ配列に関する情報は、これらの細胞
に関しては利用できない。
線維芽細胞の培養物を、Ｌグルタミン（２ｍＭ）、１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ
酸（１００μＭ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イー
グル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でルー
チンに維持した。低血清培地は、２％ＦＢＳと同じ成分を含んだ。実験のため、継代４か
ら９の間のイヌ細胞を用いた。小腸および肝臓から得られた組織を単離し、後に２０℃で
ＲＮＡの状態で必要とされるまで保存した。
免疫蛍光法
免疫蛍光法のため、カバーガラス上で培養した顕微鏡観察用の細胞を、２００ｍＭバソ
クプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；Ｓｉｇｍａ）を含む低血清培地中で２４時間インキュ
ベートした。細胞を新しく調製した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで２０分間固定し
、洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／ＰＢＳで透過処理した。非特異的シグナル
を０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングし、
続いてニワトリ抗ＡＴＰ７Ａ（１：５０；ａｂ１３９９５（Ａｂｃａｍ）、アミノ酸１４
０７〜１５００に対して作製）＋マウス抗５８ｋ（１：５０；Ａｂｃａｍ）を含む同ブロ
ッキング培地中で２時間インキュベーションした。Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ結合ヤギ抗ニワト
リ（１：１００）およびＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス（１：１００）抗体（Ａｂｃａｍ）を
用いて一次抗体を検出した（１時間）。その後、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ結合ウサギ抗ヤギ抗
体（１：１０００；Ａｂｃａｍ）を用いて、ヤギ抗ニワトリ二次抗体由来のシグナルを増
幅した（１時間）。最後に、カバーガラスでＰｒｏｌｏｎｇ Ａｎｔｉ−ｆａｄｅ ｇｏ
ｌｄ（Ｓｉｇｍａ）中にマウントし、落射蛍光によって観察した。
ラジオアイソトープ実験
約１７０ＭＢｑ．ｍｇ．−１の誘導放射能を与えるリアクタ内で一晩放射線照射された
金属銅線（３．３ｍｇ）を用いて、６４銅アイソトープを作製した。到着したら、照射の
約４時間後かつ実験開始３０分前に、５０μｌの濃ＨＮＯ３（１０．３Ｍ）に銅線を溶解
し、１．３ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨで中和した。銅が最終濃度４．７ｍＭになるようＤ
ＭＥＭ培地を添加した。６ウェルプレート中の添加剤入り５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に
、線維芽細胞を２回複製して蒔いた。
銅処理のため、細胞を１０、５０および１００μＭの銅において２４または４８時間イ
ンキュベートした。処理後、培地を除去し、等量の非アイソトープ（cold）ＣｕＣｌ２を
添加したハンクス液で細胞を４回洗浄した。洗浄後、３２５μｌの０．２％ＳＤＳを添加
して細胞を溶解し、細胞ライセートをピペットで採取してカウントチューブに入れた。Ｐ
ａｃｋａｒｄ Ｂ５００３ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ
Ｂｅｎｅｌｕｘ、フローニンゲン、オランダ）において４５０から８００ｋｅＶの間で２
分間、培地、洗浄ステップまたはライセートを含む各チューブにおける放射線を測定した
。流出試験のため、２４時間の銅処理の後、細胞をハンクス液で４回洗浄し、その後追加
的な銅を含まない新鮮な暖かい培地で２時間インキュベーションした。次に、上述の通り
細胞の銅を分析した。細胞ライセートのタンパク質濃度（Ｂｉｏ Ｒａｄタンパク質アッ
セイキット、Ｂｉｏ Ｒａｄを用いて定量化する）に対して銅蓄積を正規化し、並行して
ＭＴＳ比色アッセイ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−５−［３−カル
ボキシメトキシフェニル］−２−［４−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム）（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を行った。この定量分析は、死細胞ではなく生細胞を検出する。酵素結合
による免疫吸着剤アッセイマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、４９
０ｎｍ（検査波長）および６５０ｎｍ（参照波長）の吸光度を測定した。培地を含むが細
胞を含まないウェルはブランク用となる。この実験において、１００μＬの培地中の１０
４細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。７０％コンフルエンスに達した後、
細胞を１０、５０または１００μＭの銅で処理した。２４および４８時間インキュベーシ
ョンの後、ウェルを洗浄し、各ウェルに１００μＬの培地および２０μＬのＭＴＳを添加
した。３７℃で２時間インキュベーションした後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ＲＮＡの単離
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカ
ーの取扱説明書に従って浄化する前に、フェノールクロロホルム抽出法を用いて組織の線
維芽細胞から全ＲＮＡを３回繰り返して単離した。すなわち、約７５ｍｇの組織を単離し
、１ｍｌのＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔおよび５ｍｍのＱｉａｇｅｎ製スチールボールベアリ
ングに加えた。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）により、２０ ３０Ｈｚ、２分
間を３回行って組織をホモジナイズした。１００μｌの１ブロモ３クロロプロパンを添加
し、短時間ボルテックス攪拌し、室温で５分間静置し、その後卓上遠心分離機によって１
５分間４℃で遠心分離した。透明な水相を取り分け、０．５ｍｌのイソプロパノールに加
えて静置し、１０分間、４℃で再度スピンした。７０％エタノール中でペレットを洗浄し
、室温で風乾し、３００μｌの水に再懸濁した。ｇＤＮＡ除去カラムを用いてＲＮＡの純
度をさらに上げ、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓキットを用いて精製した。Ｑｉ
ａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓキットを用いて細胞から全ＲＮＡを単離した。
Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ（ＡＢＩ）キットをメーカーの
取扱説明書に従って用いて、２０μｌの反応容量で合計２μｇのＲＮＡを逆転写した。ｑ
ＰＣＲによる検査の前に、組織由来のｃＤＮＡを１：２０希釈した。細胞由来のｃＤＮＡ
は、ＡＴＰ７Ａ解析のために１：１００希釈、またはＭＴ１Ａ解析のために１：１０希釈
した。
ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅキット）で処
理した。Ｐｒｏｍｅｇａ製Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ、ライデン、オランダ）を用いて、６０μｌの反応容
量で合計３μｇのＲＮＡをポリ（ｄＴ）プライマーと共に４２℃で４５分間インキュベー
トした。
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
Ｓｐｅｅらによって記載されている通りにＱ−ＰＣＲを行った（Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅ
ｒｎ Ｍｅｄ ２００６：２０：１０８５〜１０９２）。リアルタイムＰＣＲは、高親和
性の二本鎖ＤＮＡ結合染色試薬であるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉに基づき、分光蛍光分析
サーマルサイクラーにおいて３回繰り返して行った。ＰＣＲ反応毎に、３８４ウェルプレ
ートにおいて、１×Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅ
ｒ Ｍｉｘおよび４０ｐｍｏｌの両方のプライマーを含む２０μｌの反応容量において、
８．７μｌの（希釈ストックの）ｃＤＮＡを用いた。表ＸＩに図示されているプライマー
対（ＡＴＰ７Ａのプライマー対を除く）は、Ｓｐｅｅらを参照した。全ＰＣＲプロトコー
ルは、５分間のポリメラーゼ活性化ステップと、それに続く４０サイクルの（変性）９５
℃２０秒間、アニーリング３０秒間および伸長７２℃３０秒間、ならびに最後の伸長５分
間７２℃を含んでいた。アニーリング温度は５０℃から６７℃までの範囲であった（表Ｘ
Ｉ）。解離曲線、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ２１００）および配列決定（
ＭＷＧ）を用いて、各試料の純度および特異性を試験した。ｃＤＮＡの段階的１０倍希釈
を行い、相対的な出発量対閾値サイクル数のプロットによって構築された効率曲線を作成
した。各検量線の増幅効率Ｅ（％）＝（１０（１／ｓ）１）・１００（ｓ＝勾配）を決定
し、これは広ダイナミックレンジで＞９５％かつ＜１０５％であると考えられる。各実験
試料は、適切な誤差伝搬により、内在性参照であるヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ＲＰＬ８、ＲＰＳ５およびＲＰＳ１９に対して正規化した。
ウエスタンブロッティング
ラバーポリスマンを用いて細胞をこすり取り、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌ
の新しく調製した煮沸用溶解バッファー（１％ＳＤＳを含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）
）に溶解した。２５ゲージの注射針に数回通過させることにより試料をホモジナイズし、
続いて７０℃で５分間加熱し、その後解析されるまで−２０℃で保存した。細胞ライセー
トを解凍し、ローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％
ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール、４０ｍＭ ＤＴＴ）中
で５分間煮沸し、予め組み立てられたＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。メンブレンを５％
ミルク／ＰＢＳ−Ｔで１〜２時間ブロッキングし、その後１時間ＲＴで一次抗体とインキ
ュベーションした。メンブレンをブロッキングバッファーで１０分間、３回洗浄し、その
後ブロッキングバッファーで１：１０，０００希釈したウサギ抗ニワトリＩｇ抗体ＨＲＰ
と１時間室温でインキュベーションした。メンブレンをブロッキングバッファーで１０分
間３回洗浄し、続いてＰＢＳ−Ｔで１回洗浄した。メンブレンをＰＢＳで短時間洗浄して
洗剤を除去し、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬システムを用いてメーカーの取
扱説明書に従って現像した。その後メンブレンをＳｕｐｅｒＲＸ Ｆｕｊｉ Ｘ線フィル
ム（東京、日本）に露光し、Ｋｏｄａｋ自動プロセッサ（イーストマン・コダック社、日
本）において現像した。
等量のタンパク質がロードされたことを示すため、メンブレンをストリップしてリプロ
ーブした。マウス抗チューブリン（１０，０００倍希釈、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ／Ｔ、
１時間ＲＴ、その後、ヤギ抗マウスＨＲＰ（１：１０，０００）１％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ
／Ｔ、１時間ＲＴ）を用いてメンブレンをウエスタンブロットし、前述の通りＥＣＬウエ
スタンブロッティング検出試薬により可視化した。
メンブレンのストリッピング
リプローブの前に、結合した抗体をメンブレンからストリップした。さらに別のウエス
タンブロッティングを行う前に、メンブレンをストリッピングバッファー（１００ｍＭ
２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７
）中で、５５℃で３０分間インキュベートし、次にＰＢＳで十分に洗浄した。
統計
解析前にｑＰＣＲデータをｌｏｇ１０変換し、分散の均一性を確実にした（パラメトリ
ック解析の仮説）。次にｌｏｇ１０（発現）値をＡＮＯＶＡにより解析し、発現値の標準
誤差に対して加重した。ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ遺伝子型に対してペアワイズ比較を行い、９５
％信頼区間で倍数変化を算出した。
結果
イヌ皮膚の変異型線維芽細胞は、野生型またはヘテロ接合型細胞と比べてより多くの銅６
４を取り込み、より遅い速度で流出させる
以後、野生型、ヘテロ接合型および変異型細胞は、それぞれＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ
７ＡＣ／ＴまたはＡＴＰ７ＡＴ／Ｔとする。線維芽細胞を超生理学的濃度のアイソトープ
銅６４（Ｃｕ６４）（１００μＭ）とインキュベーションすると、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ細胞
と比べてＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞およびＡＴＰ７ＡＣ／Ｔ細胞において、２４時間および４
８時間後に約２倍の銅取込み増加が示される（図７Ａ）。より低濃度（５０μＭ）では、
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞は、他の遺伝子型細胞と比べてより多量の銅を取り込んだ。生理学
的濃度におけるインキュベーションは、取込みの細胞型間の差異を示さない。ＡＴＰ７Ａ
Ｔ／Ｔ細胞におけるＣｕ６４レベルの増加が流出抑制によるものであったかを決定するた
めに、次に本出願人らは、洗い流し法によって細胞からの流出レベルを測定した（図７Ｂ
）。多量のＣｕ６４（１００μＭ）を添加して２時間洗い流した後、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ細
胞はアイソトープの約４５％を保持し、一方ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞は９０％近くを保持し
た。ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞と同様の量の銅を取り込んだＡＴＰ７ＡＣ／Ｔ細胞は、ＡＴＰ
７ＡＣ／Ｃ細胞と同様の流出速度を示した。より多量の銅取込みに伴い、高い銅負荷下の
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞において細胞生存率が低くなることが判明した（データなし）。
対照として、ヒトの野生型細胞およびメンケス病患者に由来する細胞を用いた実験を並
行して行った。予想されたように、メンケス病細胞は、使用したＣｕ６４全濃度において
より多くの取込みを示し（図７Ｃ）、野生型細胞と比べてより遅い速度でＣｕ６４を流出
させた（図７Ｄ）。興味深いことに、２４および４８時間におけるＣｕ６４の取込みは、
野生型とメンケス病細胞両者共にイヌ細胞と比べてより多かった。ヒトおよびイヌ各細胞
における基本条件下の銅の定常状態レベルとはいかなるものであるか、依然として不明で
ある。
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞におけるＡＴＰ７Ａ遺伝子発現は変化しない
流出低下がＡＴＰ７Ａの発現レベルに起因するものであるか証明するため、本出願人ら
は、ｑＰＣＲによりＡＴＰ７Ａ転写レベルを解析した。イヌではＡＴＰ７Ａのイソ型が説
明されていなかったため、３種のプライマーセットを次の通り設計した。スプライスバリ
アントを明らかにできるよう、ＡＴＰ７Ａｉは突然変異と重複する領域を増幅し、ＡＴＰ
７ＡｉｉｉおよびＡＴＰ７Ａｉｉは転写産物の３’および５’末端における領域を増幅す
るよう設計した。基本条件下または銅とのインキュベーションにおいて、遺伝子型の間で
ＡＴＰ７Ａ発現レベルの変化は見られなかった（図８Ａ）。しかし、ＡＴＰ７Ａのタンパ
ク質レベルを測定すると、ＡＴＰ７Ａの発現はイヌ細胞系全３種類において銅依存的であ
り、ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞における発現が最も高く（図８Ｂ）、これは測定された時点で
は銅キレート剤ＢＣＳの添加により回復できなかったことが判明した。興味深いことに、
基本条件下では、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ細胞と比べてＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞においてより高レ
ベルのＡＴＰ７Ａ発現が見られた。メンブレン上に多くのバンドが示されたが、これらは
異なるイソ型に相当すると思われる。しかし、これらのバンドは変化せず、単純ではなか
った。ＡＴＰ７Ａ特異的バンドを同定するために、ｓｉＲＮＡおよび過剰発現コンストラ
クトを用いたさらなる実験が行われるであろう。
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞はＭＴ１Ａ遺伝子発現が増加する
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞におけるより高レベルの銅の取込みによってより高レベルの銅応
答遺伝子発現がもたらされるか決定するため、本出願人らは、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ、ＡＴＰ
７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ各細胞におけるメタロチオネイン１Ａ（ＭＴ１Ａ）発
現のｑＰＣＲ解析を行った（図９）。無処理細胞におけるＭＴ１Ａの発現解析は、ＡＴＰ
７ＡＣ／ＴとＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞の両方が、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ細胞と比べてＭＴ１Ａを
有意により高レベルに発現することを示す（図９Ａ）。ＡＴＰ７ＡＣ／ＴおよびＡＴＰ７
ＡＴ／Ｔは、１〜１００μＭの銅に応答して有意に制御されないＭＴ１Ａ発現を行い、一
方、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃは、１０μＭを超える銅の添加で有意となった（図９Ｂ）。さらに
、遺伝子型内における銅に応答したＭＴ１Ａ発現の上方制御の比較は、１μＭの銅に応答
させたＡＴＰ７ＡＴ／Ｔを除く遺伝子型の間で比較した場合、有意ではなかった。ＡＴＰ
７ＡＣ／Ｃ ＵＴ対Ｃｕ１対ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ ＵＴ対Ｃｕ１；（ｐ＝０．０１４）。したが
って、ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞は銅に対してより感受性である（図９Ｃ）。
銅依存的メタロチオネイン遺伝子発現はＡＴＰ７ＡＣ／Ｃと比べてＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞
においてより高い
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ線維芽細胞における銅保持の増加および対応する銅依存的ＭＴ１Ａ発
現の増加から、本出願人らは、対応するメンケス病の表現型が腸および肝臓生検において
観察されるか調査した。したがって、そこから線維芽細胞が外移植された３個体から生検
された肝臓および小腸組織の凍結試料においてＭＴ１Ａ発現のｑＰＣＲ解析を行った（図
１０）。ＭＴ１Ａの発現は、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃと比べてＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ肝臓組織におい
て有意により低く、小腸組織において有意により高い。
イヌ皮膚ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ線維芽細胞はＡＴＰ７Ａ輸送が低下する
ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞における銅の増加がＡＴＰ７Ａ輸送の低下によるものであったか
決定するため、本出願人らは、免疫細胞化学を用いて異なる細胞型におけるＡＴＰ７Ａを
銅に応答させて局在化した。本出願人らは、ＢＣＳを用いて細胞外の銅をキレート化し、
ＴＧＮにおけるＡＴＰ７Ａを「分類」した（上パネル）。予想された通り、ＡＴＰ７ＡＣ
／ＣとＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞の両方において、ＡＴＰ７Ａは主としてＴＧＮにあることが
判明した（抗５８Ｋによって示されている、中央パネル）。洗い流しを行い、続いて１０
０μＭの銅と１〜３時間インキュベーションした後、ＡＴＰ７ＡＣ／Ｃ細胞におけるＡＴ
Ｐ７Ａは、銅を細胞から排出するためにＴＧＮから細胞周縁へと移動した。ＡＴＰ７Ａは
銅曝露後に主としてＴＧＮに見られたため、ＡＴＰ７ＡＴ／Ｔ細胞はＡＴＰ７Ａの移動の
顕著な抑制を示した。パネルに示されている細胞密度は、成長速度を示すものではない。
両方の細胞型は、同様の形態と密度で成長することが判明した。
結論
本研究により、銅の蓄積率はタンパク質の変異型を発現する細胞においてより大きく、
蓄積は銅曝露中により多く、放出は銅曝露後により遅いことが示された。さらに、銅曝露
に応答した細胞内のＡＴＰ７Ａ移動は、突然変異を有する細胞で変化する。突然変異を有
する細胞において、銅輸送タンパク質の発現も増加する。ＡＴＰ７Ａの発現レベルは、２
種類の型を有する細胞の間で変化しない。
本研究から得られた結果は、ＡＴＰ７Ａの正常型と変異型を有する細胞の間で銅の輸送
および取扱いの有意差があることを示唆する。これらの差異から、ラブラドールの銅蓄積
に対する見かけ上の差次的感受性の基礎をなす機序のＣＡＣＨにおける因子としての説明
を始めることができる。
まとめ
試験の目的は、食事管理がペニシラミンによる治療後のラブラドールにおいて肝銅濃度
に影響するのに有効であるかどうか、および亜鉛による追加の治療が役に立つかどうかを
調べることであった。
試験は、１２頭の雌および１２頭の雄の純粋種ラブラドールからなる２４頭のイヌの群
に対して実施した。イヌは、以前の銅関連慢性肝炎患者犬の家族の構成員であった。食餌
試行の開始時に、イヌは、臨床的には健康であったが、２０頭のイヌの肝銅濃度は、４０
０ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）という基準範囲を超えていた（平均値：８９４、範囲：７０〜
２８１０ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量））。これらの濃度はペニシラミンによる治療の完了後に
測定した。
すべてのイヌは同じ食餌を給餌された。追加の治療は、グルコン酸亜鉛（７．５ｍｇ／
ｋｇＰＯ ＢＩＤ、第１群）またはプラセボ（第２群）からなった。試験完了まで、薬剤
師が群の割り付けを知る唯一の人物であった。平均８カ月（範囲５〜１３カ月）、および
１６カ月（範囲１２〜２５カ月）間の治療前および後に、臨床検査および血液検査と併行
して肝銅濃度および組織病理学を評価した。血漿亜鉛濃度を治療中の追加時点で測定した
。
２１頭のラブラドール犬が試験を完了した。試験開始時に、第１群におけるイヌの平均
年齢は４．１歳（範囲２．７〜８．３歳）であった。６頭のイヌは雌（５頭は卵巣を除去
、１頭は除去せず）であり、および６頭は雄（２頭は去勢、４頭は去勢せず）であった。
第２群におけるイヌの平均年齢は４．８歳（範囲３．６〜１１．２歳）であった。６頭の
イヌは雌（４頭は卵巣を除去、２頭は除去せず）であり、および６頭のイヌは雄（２頭は
去勢、４頭は去勢せず）であった。嘔吐、食欲不振、および下痢が、グルコン酸亜鉛サプ
リメントを与えた群の３頭のイヌに副作用として観察された。
食事管理をした両群における肝銅濃度は経時的に有意の差があった（８カ月：第１群ｐ
＜０．００１、第２群ｐ＝０．００１、および１６カ月：第１群ｐ＝０．０３、第２群ｐ
＝０．０４）。しかしながら、治療前（ｐ＝０．６５）、１度目の再チェック（ｐ＝０．
５２）、および２度目の再チェック（ｐ＝０．７９）で、群間に肝銅濃度の差はなく、さ
らなる亜鉛補給の肝臓の銅蓄積に対する利益はないことを示唆した。
この試験の結果は、食事管理は、ラブラドールにおいて肝銅濃度を減少させることに有
効であり得ることを示す。亜鉛を用いる補助的治療は脱銅効果を増幅しなかった。
ここで、試験をより詳細に説明する。
材料および方法
ラブラドールレトリーバー
試験集団は、以前にＣＡＣＨと記述されたイヌの家族構成員であった２４頭の純粋種の
ラブラドールレトリーバーからなる。すべてのイヌは、オランダのラブラドールレトリー
バーの血統クラブで登録された。
すべてのイヌは、この試験の開始前にペニシラミンによるそれらの治療を完了していた
。既往歴をすべてのイヌから得て、身体検査を実施した。クエン酸Ｎａ添加血液試料を、
プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびフ
ィブリノーゲンを含む凝血プロファイルの分析のために採取した。ヘパリン−およびＥＤ
ＴＡ−血液を肝胆道酵素、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランス
フェラーゼ（ＡＬＴ）、胆汁酸（ＢＡ）の分析、ならびに血小板数、および血漿亜鉛濃度
の測定のためにサンプリングした。肝生検材料はＲｏｔｈｕｉｚｅｎ（Ｒｏｔｈｕｉｚｅ
ｎ Ｊ，Ｉ．Ｔ．（１９９８） Ｔｉｊｄｓｃｈｒ Ｄｉｅｒｇｅｎｅｅｓｋｄ １２３
：２４６〜２５２）により与えられたＭｅｎｇｈｉｎｉ技法に従って採取した。少なくと
も３個の肝生検材料を各イヌから採取した。２個の生検材料は１０パーセントの中性緩衝
ホルマリンで固定し、１個の生検材料は銅を含まない容器中に銅定量のために貯蔵した。
すべての生検材料は組織学的に評価した。肝組織は、銅の分布および半定量評価のため
に、以前に記載されたようにして（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈ Ｔ．Ｓ．Ｇ．Ａ．Ｍ．Ｒ
．Ｊ．、Ｃｕｐｅｒｙ Ｒ．（１９８８） Ｖｅｔ Ｑ１０：８４〜８９）、ルベアン酸
染色で染色した。適用された等級づけシステムに従って、２を超える銅スコアは異常であ
る（０：銅なし、１：若干の銅陽性顆粒を含む孤立性肝細胞および／または細網組織球系
（ＲＨＳ）細胞、２：少量から中程度の量の銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨ
Ｓ細胞の小群、３：中程度の量の銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の比
較的大きい群または領域、４：多くの銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞
の大きい領域、５：多くの銅陽性顆粒を含む肝細胞および／またはＲＨＳ細胞の散在性存
在）。
肝臓組織中の銅の定量的アッセイは、中性子活性化分析により、Ｔｅｓｋｅらにより記
載されたプロトコルに従って、Ｂｏｄｅにより記載された施設を使用して（Ｂｏｄｅ，Ｐ
．（１９９０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｃｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８ １３９；Ｔｅｓｋら（１９９２） Ｖｅｔ Ｒｅｃ １３１
：３０〜３２）実施した。定量的銅濃度は、凍結乾燥された肝生検材料で測定してｍｇ／
ｋｇ（乾燥肝臓重量）で報告した。
銅含有率とは別に、さらに組織学的な変化を、統計的検定を可能にするために０と５の
間の尺度で等級づけした（０＝炎症の組織学的徴候なし、１＝反応性肝炎、２＝軽症の慢
性肝炎、３＝中程度の慢性肝炎、４＝重症の慢性肝炎、５＝肝硬変）。
試験はＵｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。飼い主のイ
ンフォームドコンセントをすべてのイヌについて得た。
無治療における肝臓の銅蓄積の進行
１１頭のイヌで、何らかの治療に先立って、肝銅濃度の測定を、平均８．７カ月（範囲
６〜１５カ月）をおいて繰り返した。この期間中、すべての動物は、食物由来の１２〜２
５ｍｇ／ｋｇ（乾物）の間の銅濃度および８０〜２７０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の間の亜鉛濃
度を含有する、それらの通常の維持食餌を製造業者により給餌された。
食餌
すべてのイヌの飼い主は、同じ特製の食餌を提供された。給餌された食餌の近似分析：
水分５７．９％、粗タンパク質６．１％、粗脂肪５．９％、ミネラル１．７％。給餌され
た代謝性エネルギー（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓのプロトコルに従って測定した）：１６５０ｋｃａｌ
／ｋｇ）。食餌は、銅を４．７５ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度で、および亜鉛を１０２ｍｇ
／ｋｇ（乾物）の濃度で含有した。イヌは、さらなる栄養補助食品およびご馳走はなしに
食餌を給餌された。この試験のラブラドールは、４２０ｇ食餌／日と８４０ｇ食餌／日と
の間を与えられた。
薬物動態試験
２頭の縁続きでない９歳の健康なラブラドールレトリーバー（１頭は雌および１頭は雄
）を薬物動態試験で使用した。食物は、亜鉛の経口投与前の１２時間の間、および検査期
間初期の６時間の間許さなかった。水は自由に利用できた。経口グルコン酸亜鉛は、第１
のイヌには１０ｍｇ／ｋｇの用量で、および第２のイヌには５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し
た。ヘパリン化血液試料（４ｍｌ）を頚静脈から服用前（０時間）および薬剤適用後１５
、３０、４５、６０、９０、１２０分、および４、８、１２および２４時間に捕集した。
血漿は、原子吸収分光法を使用する亜鉛の分析まで−２０℃で貯蔵した。
薬剤調製、無作為化、および盲検化
グルコン酸亜鉛の選択は、該薬剤が、酢酸塩または硫酸塩のような他の塩より副作用が
少ないという臨床的観察に基づいてなされた。錠剤が、ユトレヒト大学獣医学部の獣医学
薬剤部により提供された。亜鉛錠剤は２５ｍｇの元素亜鉛をグルコン酸亜鉛塩として（Ｔ
ｏｐｐｈａｒｍ Ｚｉｎｋ ２５ ｇｌｕｃｏｎａａｔ、Ｐａｒｍａｌｕｘ ＢＶ、Ｕｉ
ｔｇｅｅｓｔ、ＮＬ）含有した。プラセボ錠剤は、１６０ｍｇのラクトース（Ａｌｂｏｃ
ｈｉｎ、Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ ＢＶ、Ｈａａｒｌｅｍ、ＮＬ）を含有した。両群の
錠剤の外見は同一であった。
薬剤師は、コインを弾くことによりプロスペクティブに（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
）に６頭のイヌの組の群割り付けを無作為化した。３頭のイヌは、プラセボを与えられ、
および３頭のイヌは亜鉛で治療された。臨床医の処方に当たって、錠剤（プラセボまたは
亜鉛）は無作為化表に従って分配された。
処方の用量は以下のスキームによった：
飼い主は、給餌の３０分前に、彼らの少量の食餌と混合された錠剤を与えるように指示
された。飼い主も臨床医も、どの治療が各イヌに与えられるかについて知らされなかった
。無作為化表は試行の間薬剤部が保持し続けて、試行が完了したときにのみ明かされた。
統計分析
薬物動態学的パラメーター（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ４．０．１．（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、８００ Ｗｅｓｔ Ｅｌ Ｃａｍｉｎｏ Ｒｅａｌ、Ｍｏｕ
ｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）および統計分析（ｗｉｎｄｏｗｓ用のＳＰＳＳ１
１．０、２００１、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）は市販のソフ
トウェアパッケージの使用により計算した。小さい群サイズのため、ノンパラメトリック
統計検定を群間の比較のために使用した。食餌およびグルコン酸亜鉛（第１群）を用いる
治療の前および後の２回の対照検査時（１度目の再チェックおよび２度目の再チェック）
、ならびに食餌およびプラセボ（第２群）を用いる治療後の両検査時の肝銅濃度の間の差
を検出するために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用した。それに加えて該検定を、
試験前、１度目の再チェック時、および２度目の再チェック時における第１群と第２群と
の間の差を検出するために使用した（有意性レベルｐ≦０．０５）。
結果
無治療における肝臓の銅蓄積の進行
１１頭のラブラドール犬で、何らかの治療が与えられる前、イヌがそれらの通常の維持
食餌を与えられていた間に、肝銅濃度の測定を繰り返した。１頭を除くすべてのイヌで、
肝銅濃度は、８．７カ月の間隔の期間中に、両方の測定の間で、平均１０００ｍｇ／ｋｇ
（乾燥重量）（範囲２９０〜２３７０）から平均１６２６ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲
６３０〜３６１０）にまで上昇した。患者犬の体重（平均：３３．９ｋｇ、範囲２５〜３
９．５ｋｇ）に関して、これは、８．７カ月の間に体重１ｋｇ当たり銅１８ｍｇの上昇で
あった。結果を図１に示す。
薬物動態学的試験
２頭のイヌで１０ｍｇ／ｋｇ（イヌ１）および５ｍｇ／ｋｇ（イヌ２）の元素亜鉛の経
口適用後に測定された血漿亜鉛濃度から計算された薬物動態学的パラメーターは：
イヌ１（１０ｍｇ／ｋｇ）：Ｖ＿Ｆ：分布容積＝２９３７．８７２ｍｌ／ｋｇ体重、Ｋ０
１：吸収速度定数＝０．５６７２１２ １／時間、Ｋ１０：脱離速度定数＝０．０５３７
２８ １／時間、ＡＵＣ：曲線下面積＝６３．３５２７２ｈｒ＊μｇ／ｍｌ、Ｃｌ＿Ｆ：
バイオアベイラビリティに関するクレアランス＝１５７．８４６４ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ、Ｔ
ｍａｘ：最大濃度時間＝４．５８９８１３時間、Ｃｍａｘ：最大クレアランス＝２．６５
９９２４μｇ／ｍｌ）
イヌ２（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｖ＿Ｆ：分布容積＝２５３８．６８９ｍｌ／ｋｇ体重、Ｋ０１
：吸収速度定数＝１．１６０６４７ １／時間、Ｋ１０：脱離速度定数＝０．０３７８８
６ １／時間、ＡＵＣ：曲線下面積＝５１．９８５１３ｈｒ＊μｇ／ｍｌ、Ｃｌ＿Ｆ：バ
イオアベイラビリティに関するクレアランス＝９６．１８１３５ｍｌ／ｈｒ／ｋｇ、Ｔｍ
ａｘ：最大濃度時間＝３．０４７９７４時間、Ｃｍａｘ：最大クレアランス＝１．７５４
７２８μｇ／ｍｌ）。
亜鉛の計算された半減期は、ｔ１／２＝１５．１時間であった。
Ｒ＝１／（１−ｅｘｐ（−ｋ１０＊２４）から計算された蓄積速度Ｒは１．５２であっ
た。投与間隔は１２時間であるように選ばれた。両方のイヌのＣＬ＿Ｆの平均から計算さ
れた推定用量は１２７．０１３９ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであった。
適当な用量の推定値は、意図された５μｇ／ｍｌという最大亜鉛血漿濃度に基づいた。
用量＝Ｃｌ＿Ｆ×意図する血液濃度×投与間隔＝７．６２ｍｇ／ｋｇ／１２時間
食餌試行および無作為化されたプラセボを対照とする亜鉛適用
食餌試行の開始時に、２０頭のイヌの肝銅濃度は、４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）とい
う基準範囲を超えていた（平均：８９４、範囲：７０〜２８１０）。銅の半定量的評価の
結果は、０〜４．５の範囲であった。１７頭のイヌの肝生検材料の組織学的検査は上昇し
た肝銅含有率を示し（２を超えた）、それは小葉中心の肝細胞に局在化した。銅に対する
染色は５頭のイヌで正常であり、高い正常染色結果が、定量的分析から上昇した肝銅を有
する２頭のイヌの生検材料から得られた。７頭のイヌに慢性肝炎が存在した。ＣＨは、肝
細胞のアポトーシスおよび壊死、単核性炎症、再生および線維症の変化する程度により特
徴づけた。肝炎症の活性は炎症の程度ならびに肝細胞アポトーシスおよび壊死の程度によ
り決定した。疾患のステージは線維症の程度およびパターンならびに肝硬変の存在により
決定した。肝炎は４頭の患者犬で軽症、２頭のイヌで中程度であり、１頭のイヌにおいて
は肝硬変が診断された。１３頭のイヌにおいて、肝臓に存在する炎症の組織学的な徴候は
なく、４頭のイヌの生検材料で病理組織検査は反応性変化を示した。
試験開始時に、第１群におけるイヌの平均年齢は、４．１歳（範囲２．７〜８．３）で
あった。６頭のイヌは卵巣を除去された雌であり、６頭は雄（２頭は去勢され、４頭は去
勢せず）であった。平均体重は３３ｋｇ（範囲２６．２〜３７．５）であった。第１群中
のイヌの平均肝銅濃度は、９６１ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲３４０〜２８１０）であ
った。組織染色による銅の半定量的評価の平均は２〜３＋（範囲０〜４．５）であった。
第２群におけるイヌの平均年齢は、４．８歳（範囲３．６〜１１．２）であった。６頭
のイヌは雌（４頭は卵巣を除去、２頭は除去せず）であり、および６頭のイヌは雄（２頭
は去勢、４頭は去勢せず）であった。平均体重は３２．３ｋｇ（範囲２５〜４１．９）で
あった。第２群におけるイヌの平均肝銅濃度は８６１ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）（範囲７０
〜１６８０）であった。治療前の両群間の肝銅濃度に差はなかった（ｐ＝０．７３）。組
織染色による銅の平均の半定量的評価は２〜３＋（範囲０．５〜３）であった。
第１群の３頭のイヌは試験を完了しなかった。中断の理由は３頭すべてのイヌにおいて
治療に無関係であった（１名の飼い主は彼のイヌが老いすぎつつあると感じ、１名の飼い
主には個人的理由があり、および１頭のイヌは肥満細胞腫瘍を発症した）。２１頭のイヌ
は、少なくとも１回の対照検査（１度目の再チェック）と共に試験を完了した。１６頭の
イヌにおいて、肝生検材料はそれより後の追加時点（２度目の再チェック）で得た。
嘔吐および食欲不振が、第１群の３頭のイヌにおいて観察された副作用であった。これ
らのイヌの１頭には一過性の小腸下痢もあった。副作用は錠剤適用後に中程度で起こり、
錠剤が食餌と混合されたときに解決した。
血液検査
胆汁酸の濃度は、平均１４μｍｏｌ／ｌ（範囲：３〜１０１）から、１度目の再チェッ
クで平均７．８μｍｏｌ／ｌ（範囲：１〜３９）に、および２度目の再チェックで７．１
μｍｏｌ／ｌ（範囲：０〜２１）に低下した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、およ
びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の平均濃度は、すべての検査で正常範囲
内にとどまった。治療前の平均ＡＬＰ濃度は、４１Ｕ／ｌ（範囲：８〜１１１）であり、
１度目の再チェックで平均ＡＬＰ＝３７Ｕ／ｌ（範囲１２〜１４３）、２度目の再チェッ
クで平均ＡＬＰ＝３７Ｕ／ｌ（範囲：１９〜１５２）であった。治療前の平均ＡＬＴ濃度
は２８Ｕ／ｌ（範囲：１０〜２３４）であり、１度目の再チェックで平均ＡＬＴ＝４７Ｕ
／ｌ（範囲：１１〜７８）、２度目の再チェックで平均ＡＬＴ＝５１Ｕ／ｌ（２６〜６８
）であった。
試験開始時に、平均の血漿亜鉛濃度は、第１群および第２群においてそれぞれ９５μｇ
／ｄｌおよび９６μｇ／ｄｌであった。１度目の再チェックおよび２度目の再チェックで
、いずれの群の血漿亜鉛濃度にも差はなかった（ｐ値は０．１１と０．７９との間）。３
回の検査のいずれにおいても第１群と第２群との間で血漿亜鉛濃度に差は見出されなかっ
た（ｐ値は０．３４と０．５との間）。血漿亜鉛濃度における差を見出し得た唯一の時点
は、第１群における亜鉛を用いる治療の最初の１カ月後の血液検査であった。血液サンプ
リングは亜鉛適用の２〜６時間に実施された。この対照検査で平均血漿亜鉛濃度は１６５
μｇ／ｄｌ（範囲１１７〜２４９、ｐ＝０．０２）に上昇していた。
肝銅測定
肝銅の定量的測定は両群において治療中に改善された。１度目の再チェック、および２
度目の再チェックで、肝銅濃度は、両群のイヌにおいて開始時点に比較して有意に低下し
ていた（第１群の１度目の再チェック：平均２８６ｍｇ／ｋｇ、範囲８４〜７００、ｐ＜
０．００１；第１群の２度目の再チェック：平均４２１ｍｇ／ｋｇ、範囲２２０〜７９０
、ｐ＝０．０３、第２群の１度目の再チェック：平均２７７ｍｇ／ｋｇ、範囲８０〜４５
０、ｐ＝０．００１、第２群の２度目の再チェック：平均４０１ｍｇ／ｋｇ、範囲１１８
〜８５０、ｐ＝０．０４）。１度目の再チェックで両群における肝銅濃度に差はなく（ｐ
＝０．５２）、２度目の再チェックでも群間の差はなかった（ｐ＝０．７９）。それに加
えて、１度目の再チェックと２度目の再チェックとの間で肝銅濃度のさらなる低下はなか
った（第１群ｐ＝０．４４、第２群ｐ＝０．２５）。結果は図２に示す。
組織検査
銅についての組織染色は治療で改善された。銅の半定量的評価の組織検査スコアは、第
１群および第２群において１度目の再チェックおよび２度目の再チェックで開始時点に比
較して減少した（第１群 １度目の再チェックで：ｐ＝０．０３１、第１群 ２度目の再
チェックで：ｐ＝０．０１、第２群 １度目の再チェックで：ｐ＝０．０１、第２群 ２
度目の再チェックで：ｐ＝０．００１）。どの時点においても両群間に差はなかった（ｐ
＝０．１６〜０．７５）。
肝臓の炎症の重症度に対する組織検査スコアは、両群のイヌのすべての検査を通じて不
変のままであった（ｐ＝０．２５〜０．４５）。
結論
ＣＡＣＨを有する患者犬に肝銅濃度のよりバランスのとれた長期の制御を提供するため
に、この試験の目的は、食事管理がペニシラミンを用いる治療後のラブラドールにおける
肝銅濃度に影響するのに有効かどうか、および亜鉛を用いる追加治療が有用かどうかを調
べることであった。この試験の結果は、食事管理は肝銅濃度を低下させるのに有効であり
得ることを示す。亜鉛を用いる補助的治療は脱銅効果を増幅しなかった。
肝銅濃度に対する亜鉛の効果の検討中に、肝銅濃度を１８頭の純粋種のラブラドールレ
トリーバーで測定した。イヌの半分は亜鉛のサプリメントを与えられ、他の半分はプラセ
ボを与えられた。すべてのイヌは実施例２の食餌を給餌された。肝銅濃度は、実施例２の
方法を使用して３つの時点で測定した：（１）ペニシラミンによる治療前、（２）ペニシ
ラミンによる治療後であるが実施例２の食餌による治療前、および（３）食餌治療後。実
施例２におけるように、亜鉛で治療されたイヌとプラセボで治療されたイヌの銅レベルの
間に有意の差はなかった（データ掲載せず）。しかしながら、食餌の使用は銅レベルに対
して有意の効果を有した。亜鉛で治療されたイヌとプラセボで治療されたイヌの組み合わ
された結果は、図３に示され、低銅食餌は、肝臓の銅レベルを低下させることに対してペ
ニシラミン単独よりも大きい有意の効果を有することを示す。
本発明の食材の例を下で述べる：
この食材中のミネラルおよび微量元素の量の典型的分析を、使用された方法と一緒にし
て下に示す：
本発明の食材のさらなる例は以下の通りである：
この食材中のミネラルおよび微量元素の量の典型的分析を、使用された方法と一緒にし
て下に示す：
１０ 多型に関する情報を含むデータベース
２０ イヌの遺伝的データを受け取る手段
３０ データを多型に関する情報を含むデータベース１０と比較するためのモジュール
４０ 比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはそれ
からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するための手段

Claims (30)

  1. イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって
    、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列
    番号１４２）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択され
    る１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
  2. （ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）または（ｂ）ＡＴＰ
    ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２のＳＮＰ（配列番号１４３）の有無を検出することを含む、
    請求項１に記載の方法。
  3. イヌが生後１年以内である、請求項１または２に記載の方法。
  4. イヌがラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルの血統
    を遺伝的に継承している、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項４に記載の方
    法。
  6. イヌのゲノムにおける（ｃ）肝臓の銅蓄積に対して感受性を示すＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ
    ７ＡまたはＵＢＬ５遺伝子における多型および／または（ｄ）前記多型（ｃ）と連鎖不平
    衡にある多型の有無を検出することをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載
    の方法。
  7. ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）
    、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号
    ４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列
    番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ
    １＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿
    ２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９
    （配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配
    列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１
    ７＿３３（配列番号１４１）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰか
    ら選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することを含む、請求項６に記載の方
    法。
  8. ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）
    、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号
    ４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを
    含む、請求項７に記載の方法。
  9. 多型（ａ）または（ｃ）と連鎖不平衡にある多型が、多型（ａ）または（ｃ）の６８０
    ｋｂ以内にあり多型（ａ）または（ｃ）と同一の染色体上に存在し、多型対間の連鎖不平
    衡の計算された尺度Ｄ’が０．９を超えるまたはそれに等しい、請求項１から８のいずれ
    か一項に記載の方法。
  10. ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および／またはそれらと連
    鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型、ならびに肝臓の銅蓄積からのイヌの保護とのそ
    れらの関連に関する情報を含むデータベース。
  11. イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、
    （ａ）コンピュータシステムに、請求項１または２および場合により請求項６から８ま
    でのいずれか一項に記載の多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを入力するこ
    とと、
    （ｂ）前記データを、前記多型、および肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対
    するイヌの感受性とのそれらの関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較
    することと、
    （ｃ）前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するこ
    とと
    を含む方法。
  12. コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに請求項１１に
    記載のすべてのステップを実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュ
    ータプログラム。
  13. 請求項１２に記載のコンピュータプログラムおよび請求項１０に記載のデータベースを
    含むコンピュータ記憶媒体。
  14. 請求項１１に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであっ
    て、
    （ａ）請求項１または２および場合により請求項６から８までのいずれか一項に記載の
    多型のイヌのゲノムにおける有無に関するデータを受け取る手段と、
    （ｂ）前記多型、および肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受
    性とのそれらの関連に関する情報を含むデータベースと、
    （ｃ）前記データを前記データベースと比較するためのモジュールと、
    （ｄ）前記比較に基づいてイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するた
    めの手段と
    を含むコンピュータシステム。
  15. イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、イヌのゲノム
    における、（ａ）ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６のＳＮＰ（配列番号１４２）および（ｂ
    ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型
    の有無を検出することを含む方法。
  16. イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための、請求項１または２お
    よび場合により請求項６から８のいずれか一項に記載の多型の使用。
  17. 肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する
    方法であって、
    ・請求項１から８、１１および１５のいずれか一項に記載の方法に従って、候補の第１
    のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを
    決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を
    作出するのに適するかどうかを決定することと、
    ・場合により、請求項１から８、１１および１５のいずれか一項に従って、第１のイヌ
    と反対の性の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型
    を含むかどうかを決定することと、
    ・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可
    能性が高い子孫を作出することと
    を含む方法。
  18. イヌがラブラドールレトリーバー、ゴールデンレトリーバーまたはトイプードルの血統
    を遺伝的に継承している、請求項１７に記載の方法。
  19. イヌがラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項１８に記載の
    方法。
  20. ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積に
    起因し得る疾患を予防する方法に用いるための、４．５〜１２ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度
    の銅を含む食材であって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性が、請求項１か
    ら８、１１および１５のいずれか一項に記載の方法によって決定されている、食材。
  21. 亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度でさらに含む、請求項２０に記載の
    食材。
  22. ４．５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは４．５〜８ｍｇの濃度の銅を含み、および／または１２
    ０〜２５０ｍｇ／ｋｇまたは１５０〜２５０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度の亜鉛を含む、請
    求項２０または２１に記載の食材。
  23. （ｉ）少なくとも一方の親が純血種のラブラドールレトリーバーであり、
    （ｉｉ）肝臓の銅蓄積と関連する臨床症状がなく、
    （ｉｉｉ）４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の肝銅濃度を有し、および／または
    （ｉｖ）検出可能な肝疾患にかかっていない
    イヌにおける肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防する方法に用いるための、請求項２０
    から２２のいずれか一項に記載の食材。
  24. 銅関連慢性肝炎を予防する方法において使用するための、請求項２０から２３までのい
    ずれか一項に記載の食材。
  25. ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承しているイヌにおける肝臓の銅蓄積に
    起因し得る疾患を予防する方法であって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性
    が、請求項１から８、１１および１５のいずれか一項に記載の方法によって決定されてお
    り、イヌに請求項２０から２４のいずれか一項に記載の食材を給餌することを含む方法。
  26. 亜鉛を少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇの濃度で含む食材またはサプリメントをイヌに給餌
    することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. ４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）未満の肝臓銅濃度を有し、かつ／または検出可能な
    肝疾患を有しないイヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患を予防するための、請求項
    ２５または２６に記載の方法。
  28. ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌ用の食材の製造における銅の
    使用であって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性が、請求項１から８、１１
    および１５のいずれか一項に記載の方法により決定されており、前記食材が、銅を４．５
    〜１２ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度で含み、前記イヌにおいて肝臓の銅蓄積に起因し得る疾
    患の予防に使用するためのものである使用。
  29. ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承するイヌにおける肝臓の銅蓄積に起因
    し得る疾患の予防に同時に、別々にまたは順次に使用するための、銅を４．５〜１２ｍｇ
    ／ｋｇ（乾物）未満の濃度で有する食材と少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ（乾物）の濃度を
    提供するための亜鉛サプリメントとを含むパックであって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護
    されている可能性が、請求項１から８、１１および１５のいずれか一項に記載の方法によ
    り決定されているパック。
  30. 請求項２０から２４までのいずれか一項に記載のラベルを付けた食材または請求項２９
    に記載のラベルを付けたパック。
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