CN104273317A - 用于狗肝铜积累的遗传检测和低铜宠物饮食 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于狗肝铜积累的遗传检测和低铜宠物饮食。本发明提供了检测狗以测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性方法，其包括在样品中检测在狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)SNPATP7A_Reg3_F_6(SEQIDNO:142)和(b)与(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性。
Description
本申请是申请日为2010年4月7日的中国专利申请201080025445.5“用于狗肝铜积累的遗传检测和低铜宠物饮食”的分案申请。
技术领域
本发明涉及测定狗受到免于肝铜积累和免于铜相关肝疾病的保护的可能性的方法。本发明还涉及用于预防狗肝铜积累和铜相关肝疾病的狗用食品和制造所述食品的方法。
背景技术
尽管肝疾病在狗中不常见，但其最常见的形式之一是慢性肝炎（CH）。CH是一种组织学诊断，其特征在于纤维化、炎症和肝细胞凋亡和坏死的存在。此疾病的最终阶段可导致肝硬化。CH的病因之一是肝铜积累。肝铜积累可由于提高的铜摄入、肝铜代谢的原发性代谢缺陷或改变的铜胆汁排泄导致。在后一种情况中，铜毒性对于肝脏炎症、纤维化和胆汁淤积是继发性的，尽管不清楚这在狗中发生到何种程度。在继发性铜贮积病中，铜积累主要限于门脉周实质（periportal
parenchyma），并且肝铜浓度低于家族贮积病中的积累。虽然起始因子和敏化抗原的性质未知，但是原发性胆汁性肝硬变中观察到的免疫学异常和形态学特征与免疫调节机制并发。
小肠被认为是哺乳动物中饮食铜吸收的主要部位。从肠腔向肠粘膜的运输是载体介导的过程，涉及可饱和的运输组分。一旦在粘膜细胞中大约80%的新吸收的铜在细胞质中，其主要与金属硫蛋白 (MT)结合。 这些是低分子量的可诱导的蛋白，具有许多功能，包括金属的动态平衡、储存、运输和解毒。在通过肠后，铜进入门脉循环，在那里铜结合载体蛋白肽和氨基酸并被运输至肝，较少量进入肾。在大多数哺乳动物中，铜被容易地排泄，铜主要排泄途径是胆汁。
肝铜积累的遗传基础未知。其困难之处在于在大量不同的生物学途径中涉及铜，各途径都高度复杂并涉及大量基因的事实。通常用D-青霉胺，一种有效的铜螯合剂来治疗具有过量肝铜积累的狗。但是，最终，最成功的可用于患有CH的狗的治疗是肝移植。
WO
2009/044152 A2公开了测定狗对肝铜积累的敏感性的方法，其包括检测（a）在狗的GOLGA5, ATP7A或UBL5基因中的指示对肝铜积累的敏感性的多态性和/或（b）与所述多态性（a）处于连锁不平衡的多态性的存在或缺乏，以及从而测定狗对肝铜积累的敏感性。国际申请号PCT/GB09/02355
(还未出版) 公开了另外的多态性用于测定狗对肝铜积累的敏感性的方法。
发明内容
发明者已发现犬ATP7A基因中一个编码突变，其与狗肝铜低水平相关并因此指示免于肝铜积累的保护。该突变是单核苷酸多态性 (SNP) ，其引起蛋白质中一个氨基酸的改变。在该文所述研究中，多态性已显示对细胞中的铜运输具有功能性作用。在ATP7A基因中该多态性的发现提供了通过筛选该多态性和/或与多态性处于连锁不平衡的一种或多种多态性预测狗是否受到免于肝铜积累的保护的检测的基础。
发明者最近还发现在犬GOLGA5、ATP7A和UBL5基因或其区域中的多态性与肝铜的高水平相关，并且因此指示了对肝铜积累的敏感性(WO 2009/044152 A2和未出版的国际申请号PCT/GB09/02355)。因此，将检测狗中一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性的结果与对肝铜积累的敏感性的多态性的结果组合的遗传检测应对狗处于肝铜积累的风险的可能性特别具有信息性。
在狗肝中的铜积累可导致一种或多种由高肝铜引起的肝疾病或病症。例如，高肝铜可导致慢性肝炎、肝硬化和最终的肝功能衰竭。本发明因此能够鉴定不受到免于这些与高铜相关的肝疾病或病症的保护或处于发生这些与高铜相关的肝疾病或病症的风险的狗。一旦鉴定了狗不具有免于肝铜积累的保护的突变指示，有可能对该狗确定合适的预防措施以将肝铜水平维持在低或正常水平，例如通过施用本发明的食品。此外，鉴定为具有与免于肝铜积累的保护相关的突变的狗可理想地用于育种程序，目的在于产生不太可能患与高铜相关的肝疾病或其它病症的狗。
本发明因此提供了检测狗以测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法，其包括在样品中检测在狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)
SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和(b)与（a）处于连锁不平衡的一种或多种多态性。
本发明还提供：
- 数据库，其包含与SNP
ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142) 和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性及它们与保护狗免于肝铜积累的联系相关的信息。；
- 测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法，其包括：
(a) 将与狗基因组中存在或缺乏如本文定义的多态性相关的数据输入计算机系统；
(b) 将数据与计算机数据库比较，所述数据库包含与所述多态性及它们与保护狗免于肝铜积累、或狗对肝铜积累的敏感性的联系相关的信息；和
(c) 基于所述比较测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性；
- 计算机程序，其包含这样的程序编码装置，即当在计算机系统上执行时，所述程序编码装置命令计算机系统进行本发明的方法；
- 计算机存储介质，其包含本发明的计算机程序和本发明的数据库；
- 被设置以进行本发明方法的计算机系统，其包含：
(a) 接收与狗基因组中存在或缺乏如本文定义的多态性相关的数据的装置；
(b) 数据库，其包含与所述多态性和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性及它们与保护狗免于肝铜积累、或狗对肝铜积累的敏感性的联系相关的信息；
(c) 用于将数据与数据库比较的模块；和基于所述比较测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的装置；
- 检测狗以测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法，其包括检测狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)
SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和(b)与(a) 处于连锁不平衡的一种或多种多态性；和
- 如本文定义的多态性在测定狗对肝铜积累的敏感性中的用途；和
- 选择用于产生可能受到免于肝铜积累的保护的后代的狗的方法，其包括：
- 根据本发明测定候选的第一只狗的基因组中是否包含指示保护免于肝铜积累的一种或多种多态性；和由此测定候选的第一只狗是否适合产生可能受到免于肝铜积累的保护的后代；
- 任选地，根据本发明测定与第一只狗性别相反的第二只狗的基因组中是否包含指示保护免于肝铜积累的一种或多种多态性；和
- 任选地，将第一只狗和第二只狗交配以产生可能受到免于肝铜积累的保护的后代。
此外，并且令人惊讶地，发明者发现了比使用药物青霉胺更有效地降低拉布拉多寻回犬（Labrador
Retriever）的肝铜浓度的食品。此食品因此在预防拉布拉多寻回犬品种狗的肝铜积累中有用，并可用于预防与高肝铜相关的疾病或病症，例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。
由此，本发明还提供了包含4.5至12 mg/kg干物质浓度的铜的食品，所述食品用于在具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病的方法，优选地，其中所述狗受到免于肝铜积累的保护的可能性已通过本发明的方法测定。
本发明还提供：
- 在具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病的方法，优选地，其中所述狗受到免于肝铜积累的保护的可能性已通过本发明的方法测定，所述方法包括对狗喂食本发明的食品；
- 铜在制造食品中的用途，所述食品用于具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征的狗，优选地，其中所述狗通过本发明的方法已被测定为对肝铜积累敏感，其中所述食品包含4.5至12 mg/kg干物质浓度的铜并用于预防在所述狗中由肝铜积累导致的疾病；
- 包含具有4.5至12 mg/kg干物质浓度的铜的食物和提供至少120mg/kg干物质浓度的锌的补充剂的套装，所述食物和锌补充剂用于同时、分别或相继使用以在具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病，优选地，其中所述狗受到免于肝铜积累的保护的可能性已通过本发明的方法测定；和
- 本发明的带标签的食品或本发明的带标签的套装。
附图说明
图1说明不加治疗的肝铜积累的进展。该图显示了在任何治疗以前，在相隔8.7个月（范围为6-15个月）的2次检查中11只拉布拉多寻回犬的肝铜浓度（mg/kg干重）。在此时间内对所有动物喂食它们通常的维持饮食，根据制造商其包含以干物质计12-25 mg/kg之间的饮食铜浓度和以干物质计80-270 mg/kg之间的锌浓度。菱形符号表示离群值。
图2说明24只拉布拉多寻回犬在研究开始和饮食管理中的2次控制检查中的肝铜浓度（mg/kg干重）。将狗如下分为2组：组1=饮食+葡萄糖酸锌片，组2=饮食+安慰剂。x-轴编号的解释如下：1+2=治疗前，3+4=复查1（8个月后的第一次控制检查（范围为5-13个月）），5+6=复查2（16个月后的第二次控制检查（范围为12-25个月））。检测的狗数目如下：1：在组1中N=12只狗，2：在组2中N=12只狗，3：在组1中N=9只狗，4：在组2中N=12只狗，5：在组1中N=6只狗，6：在组2中N=10只狗。菱形符号表示离群值。点线代表成年狗的肝铜正常水平。
图3说明在18只拉布拉多寻回犬中本发明的饮食与青霉胺单独作用相比对肝铜浓度（mg/kg干重）的有效性。x-轴的解释如下：1=青霉胺前，2=青霉胺后/食物前，3=食物后。沿x-轴从1至2的发展证明青霉胺的作用，而从2至3的发展证明食物的作用。点线代表成年狗的肝铜正常水平。
图4说明布置用于实施本发明的功能组分的图表实施方案。
图5描绘了在拉布拉多寻回犬中根据性别和ATP7A基因型的平均铜水平（表VII的数据）。y-轴为肝铜干重（mg/kg）。x-轴为ATP7A基因型：从左到右，前3个为研究中的雌性狗，最后2个为研究中的雄性狗。误差棒为标准误差。
图6为在拉布拉多寻回犬中根据性别和ATP7A基因型的铜组织学得分的箱形图（表VII的数据）。y-轴为铜组织学得分值。x-轴为ATP7A基因型：从左到右，前3个为研究中的雌性狗，最后2个为研究中的雄性狗。kruskal-walis p值为0.000396。
图7A和7B显示在狗原代成纤维细胞中铜同位素测量。在(A) 用10 µM、50 µM和100 µM 64Cu孵育24 h或48 小时或(B) 孵育24小时，随后在无铜同位素培养基中充分洗涤和孵育2小时之后，在ATP7AC/C、ATP7AC/T和ATP7AT/T 细胞中进行铜同位素(64Cu)
测量。借助于蛋白和MTS测定对细胞培养条件进行γ-计数校正。24小时孵育的数据点代表两份重复进行的两个独立实验的平均值+/-SEM并表示为全细胞蛋白每分钟的计数(cpm)。其他数据点代表两份重复中来自一次实验的平均值+/-SEM。
图7C和7D显示在人原代成纤维细胞中铜同位素测量。在(C) 用10 µM、50 µM和100 µM 64Cu孵育24 h或48 小时或(D) 孵育24小时，随后在无铜同位素培养基中充分洗涤和孵育2小时之后，在衍生自Menkes 患者或非Menkes 患者 (对照)的原代成纤维细胞中进行铜同位素(64Cu) 测量。借助于蛋白测定对细胞培养条件进行γ-计数校正。数据点如(A)和(B)表示。
图8 显示在狗原代成纤维细胞中ATP7A的基因表达水平。(A) ATP7AC/C、ATP7AC/T和ATP7AT/T 细胞未处理(上图)或在100 µM 铜存在下孵育24小时(下图)，然后进行 3’
(ATP7Aiii) 区域、5’ (ATP7Aii) 区域或重叠突变的区域
(ATP7Ai)的qPCR 分析。数据描述了来自在三份重复的孔中进行的两个独立实验的平均值+/-
SD。(B) ATP7A表达的蛋白质印迹分析。细胞未处理 (-)、用100 µM BCS或100
µM 铜孵育24小时。 裂解样品，随后将蛋白在12 % SDS-PAGE凝胶上分离和用鸡抗-ATP7A
(1:2000稀释)免疫印迹1小时。然后用山羊抗鸡Ig HRP-缀合的抗体
(1:10,000稀释)孵育膜另外1 小时然后使用ECLTM
蛋白质印迹检测试剂显色。将膜洗脱（stripped）并用β-微管蛋白 (1:20,000稀释)在标记以确保等量上样。箭头表示期望的全长蛋白。
图9提供在狗原代成纤维细胞中金属硫蛋白的基因表达水平。ATP7AC/C、ATP7AC/T和ATP7AT/T
细胞在1、10或100 µM 铜存在下孵育或未处理 (UT) 24小时并进行金属硫蛋白基因的qPCR 分析。图9(A) 描述了与UT ATP7AC/C相比较的倍数变化，具有95%置信区间(CI)，(B) 描述了与UT ATP7A基因型表达相比较的倍数变化 ，具有95%
CI，和(C) 描述了log10
表达水平，具有95% 置信区间(CI)。在(C)中，图中上部线是基因型ATP7AT/T，中部线是ATP7AC/T和下部线ATP7AC/C。
图10图示了在狗肠和肝组织中金属硫蛋白的基因表达水平。(A) 肝和(B) 小肠组织 从表达ATP7AC/C、ATP7AC/T或ATP7AT/T
ATP7A的狗提取并进行金属硫蛋白基因的qPCR 分析。数据描述了来自5次独立实验的log10 表达水平的平均值和95% CI（右图）和与ATP7AC/C相比较的倍数变化，具有95 % CI。
图11是铜介导的ATP7蛋白的转运的特征。ATP7AC/C (左图)和ATP7AT/T (右图) 细胞在100 μM BCS存在下在载玻片上生长18小时，然后在培养基中洗涤和用100 μM 铜孵育1、2或3小时。固定细胞并用抗-ATP7A (每幅图中的第一列)和抗-58K (每幅图中的第二列) 抗体染色，并进行三标记间接显微镜检查，然后使用表面荧光显微镜观察。ATP7A和58K的图像合并以描述 重叠区域(每幅图中的第三列)。
序列简述
SEQ ID NO: 1至143显示了包含本发明SNP的多核苷酸序列。
SEQ
ID NOs: 144至159是引物序列。
具体实施方式
鉴定免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性
在肝中的铜积累在许多狗品种中导致肝疾病，所述狗品种包括拉布拉多寻回犬、杜宾犬（Doberman Pinscher）、德国牧羊犬（German Shepherd）、荷兰狮毛犬（Keeshond）、可卡犬（Cocker Spaniel）、西部高地白梗（West
Highland White Terrier）、贝灵顿梗（Bedlington
Terrier）和斯凯梗（Skye Terrier）。任意品种的正常狗的肝内平均铜浓度为以干重计200至400
mg/kg，尽管新生狗通常具有较高的肝铜浓度。狗的肝内铜的量可通过活检测量。
受到免于肝铜积累的保护的狗具有积累肝铜的低风险或可能性，从而其肝铜浓度不太可能达到高于以干重计400mg/kg的水平。受到免于肝铜积累的保护的狗的肝铜浓度将低于600
mg/kg，例如低于500 mg/kg、400
mg/kg、或低于300 mg/kg。根据本发明测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性涉及测定下述可能性，即狗将积累肝铜至低于600mg/kg的水平，例如低于500
mg/kg、400 mg/kg、或低于300
mg/kg。
对肝铜积累敏感的狗具有积累铜的倾向，从而其肝铜浓度达到高于以干重计400
mg/kg的水平。测定狗对肝铜积累敏感的风险或可能性涉及测定下述风险或可能性，即狗将积累肝铜至高于400mg/kg的水平，例如高于600mg/kg、高于800mg/kg、高于1000mg/kg、高于1500mg/kg、高于2000mg/kg、高于5000mg/kg或高于10000mg/kg。
肝铜积累可通过组织化学评估。例如，肝铜浓度可通过组织化学半定量地评估，使用如前所述的红氨酸染料染色技术用于评估铜的分布(Van
den Ingh等人, (1988) Vet Q
10: 84–89)。浓度可如下分级为0-5的等级：0 = 没有铜存在; 1 =
含有一些铜阳性颗粒的孤立肝细胞和/或网状组织（RHS）细胞; 2 = 含有少量至中等量的铜阳性颗粒的小群肝细胞和/或RHS细胞; 3 = 含有中等量的铜阳性颗粒的较大群或面积的肝细胞和/或RHS细胞; 4 =具有许多铜阳性颗粒的大面积的肝细胞和/或RHS细胞; 和5 = 具有许多铜阳性颗粒的弥散存在的肝细胞和/或RHS细胞。根据该分级系统, 超过2的铜得分为异常的。
因此，根据本发明测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性可涉及测定下述可能性，即狗将获得小于或等于3的得分，例如小于或等于2.5、2、1.5，或小于或等于1，其使用Van den Ingh等人中所述的 分级系统进行。 测定狗对肝铜积累敏感的风险或可能性可涉及测定下述风险或可能性，即狗将获得大于或等于2的得分，例如大于或等于2.5、3、3.5，或大于或等于4，其使用Van den Ingh等人中所述的 分级系统进行。
可将保护的可能性或敏感性的风险表示为例如风险因子、百分比或概率。有可能测定狗是否会积累铜至上述水平。例如，测定受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法可包括测定狗是否会积累铜至高于 400 mg/kg的水平。
高于400mg/kg的肝铜积累水平与肝疾病相关，并可最终导致肝功能衰竭。因此测定狗基因组是否包含指示受到免于肝铜积累的保护的一种或多种多态性指示了所述狗不太可能患肝铜积累导致的疾病或病症例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。相反地，测定狗基因组是否包含指示肝铜积累敏感性的一种或多种多态性指示了所述狗对所述疾病或病症的敏感性。因此，本发明提供了检测狗对肝铜积累相关疾病例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭的敏感性或保护狗免于所述疾病的可能性的方法。
对铜积累的敏感性或免于铜积累的保护的多态性和指示
发明者已令人惊讶地发现了影响ATP7A蛋白质序列的多态性，其指示了免于肝铜积累的保护，如与指示对肝铜积累的敏感性相反（实施例2-5）。所述多态性改变了基因ATP7A在328位氨基酸处的蛋白质序列，从苏氨酸变为异亮氨酸。体外实验已测定该突变对蛋白质具有较大功能影响（实施例5）。 实验已表明表达该突变形式的蛋白的细胞中铜积累的速率更大；在铜暴露过程中积累更大，在铜暴露后释放更慢。 另外，响应于铜暴露的细胞外ATP7A 运动在携带该突变的细胞中改变。在携带该突变的细胞中还存在 铜转运蛋白的增加的表达。ATP7A的表达水平在携带两种形式的细胞之间没有改变。ATP7A
编码突变因此对蛋白质的功能具有显著作用。
本发明因此涉及测定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性的方法。具体地，本发明提供了测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法，包括在狗基因组中检测一种或多种选自下述的多态性的存在或缺乏：（a）SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142的位置102)和（b）与（a）处于连锁不平衡的一种或多种多态性。
短语“检测多态性的存在或缺乏”通常指测定多态性是否存在于狗基因组中。多态性包括单核苷酸多态性（SNP），微卫星多态性，插入多态性和缺失多态性。优选地，多态性为SNP。检测SNP的存在或缺乏指将SNP按基因型分型或将狗基因组中存在的核苷酸（一个或多个）针对SNP分型。通常会测定2条同源染色体相同位置上存在的核苷酸。因此狗可被测定为在SNP的第一个等位基因上是纯合的，在SNP的第二个等位基因上是杂合的或纯合的。
测定个体的表型，例如个体对疾病或病症的敏感性或保护个体免于疾病或病症不限于检测导致疾病或病症的多态性。在遗传作图研究中，检测个体样品中一组标记物基因座的遗传变异以获得与特定表型的联系。如果在特定标记物基因座和表型之间发现这样的联系，这表示在该标记物基因座的变异影响目的表型，或在该标记物基因座的变异与未被基因分型的真正表型相关基因座处于连锁不平衡。在一组彼此处于连锁不平衡的多态性的情况下，知道在特定个体中所有这些多态性的存在通常提供冗余信息。因此，当测定狗基因组中是否包含一种或多种多态性（其指示对肝铜积累或铜相关肝疾病的敏感性或免于肝铜积累或铜相关肝疾病的保护）时，必须检测所述多态性组中的仅一种多态性。
作为连锁不平衡的结果，不是功能敏感性/保护性多态性而是与功能多态性处于连锁不平衡的多态性可作为标记物指示功能多态性的存在。与本发明的多态性处于连锁不平衡的多态性指示对肝铜积累的敏感性，或免于肝铜积累的保护。
由此，如本文定义的任意一种多态位置可被直接分型，也就是说通过测定在该位置存在的核苷酸，或被间接分型，例如通过测定与所述多态性位置处于连锁不平衡的另一个多态位置存在的核苷酸。
连锁不平衡是种群中不同基因座上的等位基因的非随机配子联系。具有共同遗传而不是通过随机排列独立遗传倾向的多态性是处于连锁不平衡的。如果2种多态性共同存在的频率是2种多态性各自存在的频率的乘积，则多态性是随机排列的或彼此独立遗传的。例如，如果在不同多态位点的2种多态性在种群的50%染色体中存在，那么，如果这2个等位基因共同在种群的25%染色体中存在，就可以说它们是随机排列的。更高的百分比将意味着这2个等位基因是连锁的。如果在种群中2种多态性共同存在的频率高于2种多态性独立存在的频率的乘积，则第一种多态性与第二种多态性处于连锁不平衡。优选地，如果2种多态性共同存在的频率比2种多态性独立存在的频率的乘积高10%，例如高于30%，高于50%或高于70%，则第一种多态性与第二种多态性处于连锁不平衡。。
研究显示连锁不平衡在狗中是广泛的(Extensive and breed-specific linkage
disequilibrium in Canis familiaris, Sutter 等人, Genome Research 14: 2388-2396)。处于连锁不平衡的多态性经常在物理上很接近，这解释了它们为什么共遗传。与本文提及的多态性处于连锁不平衡的多态性位于相同的染色体上。在狗中处于连锁不平衡的多态性通常位于多态性的5mb以内，优选2mb以内、1mb以内、700kb以内、600kb以内、500kb以内、400kb以内、200kb以内、100kb以内、50kb以内、10kb以内、5kb以内、1kb以内、500bp以内、100bp以内、50bp以内或10bp以内，。
使用常规技术鉴定与本文定义的任意一种多肽位置处于连锁不平衡的多态性应当是技术人员能力范围内的。一旦选择了潜在的多态性，技术人员可容易地测定此多态性是否与本文定义的任意一种多态性显著相关，和所述多态性的哪种版本或等位基因与本文定义的任意一种多态性显著相关。
更详细地，为测定多态性是否与本文定义的任意一种多态性处于连锁不平衡，技术人员应当对候选多态性和一种或多种本文定义的多态性在一组狗中进行基因分型。组的大小应当足够大以得到统计上显著的结果。通常应当对来自至少100，优选至少150或至少200只不同狗的样品进行基因分型。组中的狗可为任意品种，但通常具有相同或相似的遗传品种背景。一旦在一组狗中对多态性进行了基因分型，使用多种可容易得到的统计软件包中的任意一种可测量一对或多对多态性之间的连锁不平衡。免费软件包的实例为Haploview
(Haploview: analysis and visualisation of LD and haplotype maps, Barrett 等人, 2005, Bioinformatics, 21(2): 263-265)，可在 http://www.broadinstitute.org/haploview/haploview下载。
连锁不平衡的量度为D’。0.5至1范围的D’指示一对多态性处于连锁不平衡，1指示最显著的连锁不平衡。因此如果发现候选多态性和本文定义的特定多态性的D’处于0.5至1，优选0.6至1、0.7至1、0.8至1、0.85至1、0.9至1、0.95至1或最优选为1，则可以说候选多态性预测本文定义的多态性，并且会因此指示对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护。在本发明优选的方法中，与本文定义的多态性处于连锁不平衡的多态性在680
kb以内并与本文定义的多态性处于相同的染色体上，并且多态性对之间的连锁不平衡的计算量度D’大于或等于0.9。
连锁不平衡的另一种量度是R平方，其中R为相关系数。R平方（又称“测定系数”）是第一种多态性基因型中的变异占第二种多态性基因型的变异的分数。因此对候选多态性和本文定义的特定多态性来说，0.5的R平方意味着候选多态性占特定多态性变异的50%。通过标准统计学软件包（例如Haploview）可产生R平方。通常地，认为0.25或更高（R>0.5或<-0.5）的R平方是高相关性。因此对候选多态性和本文定义的特定多态性来说，如果发现R平方为0.5或更高，优选0.75或更高、0.8或更高、0.85或更高、0.9或更高或0.95或更高，则可以说候选多态性预测本文定义的多态性，并且会因此指示对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护。在本发明优选的方法中，与本文定义的多态性处于连锁不平衡的多态性在680
kb以内并与本文定义的多态性处于相同的染色体上，并且多态性对之间的连锁不平衡的计算量度R平方大于或等于0.85。
一旦鉴定了与本文定义的多态性处于连锁不平衡的（因此与其相关的）的多态性，技术人员可容易地测定多态性的那种版本，即哪个等位基因与对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护相关。这可通过测定一组狗的肝铜积累表型并根据肝铜积累的水平将狗分类而实现。然后将这组狗针对目的多态性进行基因分型。然后将基因型与肝铜水平相关联以测定基因型和肝铜水平的联系，由此测定哪个等位基因与对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护相关。
指示免于肝铜积累的保护的本发明的多态性是 表VI 中鉴定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6
(SEQ ID NO:142的位置102))和与该SNP处于连锁不平衡的 一种或多种多态性。因此，本发明的方法包括测定在狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)
SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和(b)与（a）处于连锁不平衡的一种或多种多态性。优选地，本发明包括测定表VI 中鉴定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142的位置102))即多态性 (a)的存在或缺乏。
可检测多态性的任意数目和任意组合来实施本发明。优选检测至少2种多态性。优选检测2至5、3至8或5至10种多态性。
可对狗DNA在以下各个位置进行分型：
（i）多态性(a);
（ii）一种或更多种多态性(b); 或
（iii）多态性 (a) 和一种或多种多态性 (b)。
优选的方法包括检测（a）SNP
ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和与所述多态性（a）处于连锁不平衡的至少一种多态性（b）的存在或缺乏。
在本发明优选的方法中，与所述多态性（a）处于连锁不平衡的多态性为SNP。优选地，多态性是在狗 ATP7A基因或基因区域中指示免于肝铜积累的保护的任意多态性。与多态性（a）处于连锁不平衡的SNP 的实例是SNP
ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO:143的位置68).该SNP发现与SNP
ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)处于 连锁不平衡 并指示免于肝铜积累的保护 (实施例4)。因此，该SNP 可自己使用或与多态性(a)组合使用以测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性。因此，测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性的方法可包括检测在狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)
SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)，(b)
SNP ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO:143)和与(a)处于连锁不平衡的一种或多种多态性和/或(b)。优选方法包括检测(a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和(b) SNP ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO:143)的存在或缺乏。
表VI 中鉴定的ATP7A SNP的T 等位基因(ATP7a_Reg3_F_6
(SEQ ID NO: 142)已被发明者测定以指示保护免于肝铜积累。该SNP 位于X 染色体。对于T 等位基因是纯合体(在母狗的情况下)或杂合体 (在公狗的情况下)的狗受到免于肝铜积累的保护。具有C等位基因的狗不显示受到免于肝铜积累的保护。因此，本发明的优选方法包括测定对于表VI所鉴定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))的T 等位基因 的存在或缺乏。因此，本发明的优选方法包括检测在ATP7a_Reg3_F_6
(SNP 142)处的TT或TC 基因型的存在或缺乏以及从而测定狗的基因组是否包括指示免于肝铜积累的保护的多态性。
由于表VI所鉴定的ATP7A SNP位于X染色体且保护作用是隐性的事实，公狗更可能具有保护性表型。本发明的方法可因此包括 测定狗的性别。鉴于公狗通常与母狗相比具有对铜积累的更低的敏感性，ATP7A SNP ((ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ
ID NO: 142)) 特别用于所有品种的狗，包括未知品种或杂交品种(杂种，mongrel)的狗。实施例3还提供了本发明的方法适用于所有品种和在所有地理区域中的狗的证据。本发明的方法可因此包括测定杂交或杂种犬、或杂种或远交犬的基因组是否包括ATP7A基因中指示免于肝铜积累的保护的一种或多种多态性或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性。
对于SNP ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO: 143)，其已发现与SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)处于连锁不平衡，T 等位基因已被发明者测定以指示保护免于肝铜积累。如上所解释，
ATP7A基因和因此该SNP 位于X染色体。对于T 等位基因是纯合体(在母狗的情况下)或杂合体 (在公狗的情况下)的狗受到免于肝铜积累的保护。具有C等位基因的狗不显示受到免于肝铜积累的保护。因此，本发明的优选方法包括测定对于表X所鉴定的SNP(ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO: 143)的T 等位基因的存在或缺乏。因此，本发明的优选方法包括检测在(ATP7a_Reg16_F_42
(SEQ ID NO: 143)处的TT或TC 基因型的存在或缺乏以及从而测定狗的基因组是否包括指示免于肝铜积累的保护的多态性。
发明者已发现在犬GOLGA5、ATP7A和UBL5基因或其区域中的多态性指示了对肝铜积累的敏感性(实施例1-2)。因此这些多态性可用于与本发明的多态性组合以提供测定狗对肝铜积累敏感的风险或受到免于肝铜积累的保护的可能性的增强的遗传测试。本发明的方法因此可包括测定指示对肝铜积累的敏感性和免于肝铜积累的保护的 SNP组合的存在或缺乏。来着狗的DNA可在指示对肝铜积累的敏感性的一个或多个SNP处被分型以及在指示免于肝铜积累的保护的一个或多个SNP分型。一个或多个“敏感性” SNP的存在与一个或多个“保护性” SNP的缺乏的组合表明狗对肝铜积累的敏感性。一个或多个“保护性” SNP的存在与一个或多个“敏感性” SNP的缺乏的组合表明狗受到免于肝铜积累的保护。
指示对肝铜积累的敏感性的本发明的多态性可存在于GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中的任意一个中或不存在于这些基因中的任意一个中但与这些基因中的任意一个中的多态性处于连锁不平衡。本发明因此涉及检测（c）在狗GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中指示对肝铜积累的敏感性的多态性和/或（d）与所述多态性（c）处于连锁不平衡的多态性的存在或缺乏。可检测多态性的任意数目和任意组合来实施本发明。优选检测至少2种多态性。优选检测2至5、3至8或5至10种多态性。
因此，狗的DNA可在(i)多态性 (a) 和/或(ii) 一种或多种多态性(b)的各自位置处被分型。另外，可对狗DNA在以下各个位置进行分型：
（iii）2种或更多种多态性(c);
（iv）2种或更多种多态性(d); 或
（v）一种或多种多态性 (c) 和一种或多种多态性 (d)。
当为2种多态性（c）时， 每种多态性可在单独的GOLGA5、ATP7A和UBL5基因之一中或只在这些基因之一中。当为3种或更多多态性（c）时，例如3至10种所述多态性，多态性可在同一个基因中，在2个基因中或在所有3个基因中。
类似地，当为2种多态性（d）时，每种多态性可与在单独的GOLGA5、ATP7A和UBL5基因之一中或只在这些基因之一中的多态性处于连锁不平衡。当为3种或更多多态性（d）时，例如3至10种所述多态性，多态性可与在同一个基因中，在2个基因中或在所有3个基因中的多态性处于连锁不平衡。
优选的方法包括检测（c）在狗GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中指示对肝铜积累的敏感性的至少一种多态性和与所述多态性（c）处于连锁不平衡的至少一种多态性（d）的存在或缺乏。
在本发明优选的方法中，指示敏感性的多态性为SNP。SNP可为狗GOLGA5、ATP7A或UBL5基因或基因区域中指示对肝铜积累的敏感性的任意SNP和/或与其处于连锁不平衡的SNP。
当方法包括测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的一种或多种多态性时，优选地，SNP选自表III、表IV和表V中鉴定的SNP。在表III和表IV中各SNP位于序列的第61位。提供了各SNP在该位置的第一和第二等位基因（[第一/第二]）。在表V中，也指示了各SNP的第一和第二等位基因。可使用任意数目和以任意组合的来自表III、IV和V的SNP。SNP可与多态性的不同类型组合。
优选地，当方法包括测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的一种或多种多态性时，方法包括检测选自表III和表V中SNP的一种或多种SNP和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种SNP的存在或缺乏。因此优选地，一种或多种SNP选自BICF2P506595 (SEQ ID NO:1的位置61)、BICF2P772765 (SEQ ID NO:2的位置61)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3的位置61)、BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4的位置61)、BICF2P591872 (SEQ ID NO:5的位置61)、ATP7A_Reg4_F_9 (SEQ ID NO: 131的位置164)、UBL5_Reg1F_16
(SEQ ID NO: 132的位置97)、golga5_Reg1_24 (SEQ ID NO: 133的位置70)、golga5_26 (SEQ
ID NO: 134的位置88)、golga5_27
(SEQ ID NO: 135的位置104)、golga5_28 (SEQ ID NO: 136的位置139)、golga5_29 (SEQ ID NO: 137的位置128)、golga5_30 (SEQ ID NO: 138的位置95)、golga5_31 (SEQ ID NO: 139的位置106)、ATP7Areg17_32 (SEQ ID NO: 140的位置95)、ATP7Areg17_33
(SEQ ID NO: 141的位置90)和与其处于连锁不平衡的一种或多种SNP。由此，可对这16种SNP中的任一种或与这16种SNP中的任一种处于连锁不平衡的任意SNP进行分型。优选地，对这16种SNP或与其处于连锁不平衡的SNP中的至少2种进行分型。
更优选地，当方法包括测定狗基因组中是否包含指示对肝铜积累的敏感性的一种或多种多态性时，所述方法包括检测选自表III中SNP的一种或多种SNP的存在或缺乏。由此，可对这5种SNP中的任一种或与这5种SNP中的任一种处于连锁不平衡的任意SNP进行分型。优选地，对这5种SNP或与其处于连锁不平衡的SNP中的至少2种进行分型。更优选地，对所有5个位置进行分型。因此优选地，被分型的核苷酸（一个或多个）选自与下述等同的位置：
- SEQ ID NO: 1的第61位 (BICF2P506595, SNP1)；
- SEQ ID NO: 2的第61位 (BICF2P772765, SNP 2)；
- SEQ ID NO: 3 的第61位(BICF2S2333187,
SNP 3)；
- SEQ ID NO: 4 的第61位(BICF2P1324008,
SNP 4)；
- SEQ ID NO: 5 的第61位(BICF2P591872,
SNP 5)；或与这些位置中的任一个处于连锁不平衡的任意位置。优选地，所述方法包括检测SNP
BICF2P506595 (SEQ ID NO:1)、BICF2P772765
(SEQ ID NO:2)、BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3)、BICF2P1324008 (SEQ ID NO:4)和BICF2P591872
(SEQ ID NO:5)的存在或缺乏。
SNP1位于GOLGA5基因的内含子中。SNP2、3和4位于UBL5基因区域中。SNP5位于ATP7A基因区域中。本发明的检测方法因此涉及在一个或多个这些基因的区域中（在编码区或其它区域中）存在的任意SNP，或与其处于连锁不平衡的任意其它SNP。
实施例1证明了这些SNP在建立对铜积累的敏感性的Boolean模型中的用途。表I表示在3个基因组位置上的等位基因的双值条件。二进制值指示具有指示对铜积累的敏感性的等位基因（“坏”等位基因）的狗。例如000表示不具有3种坏等位基因中的任一种。111表示具有所有3种坏等位基因。X是在该基因中未使用的等位基因。行1xx和0xx显示了仅使用GOLGA5基因中的SNP的单基因检测会得到的效力。
发明者已测定出SNP BICF2P506595 (SNP 1) 的A等位基因指示对肝铜积累的敏感性。A等位基因纯合的狗对肝铜积累敏感。因此，本发明优选的方法包括测定SNP
BICF2P506595的A等位基因的存在或缺乏，由此测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的多态性。更优选的方法包括检测SNP BICF2P506595的AA基因型的存在或缺乏。
发明者已测定出SNP BICF2P772765 (SNP 2)的G等位基因指示对肝铜积累的敏感性。G等位基因纯合的狗对肝铜积累敏感。因此，本发明优选的方法包括测定SNP
BICF2P772765的G等位基因的存在或缺乏，由此测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的多态性。更优选的方法包括检测SNP BICF2P772765的GG基因型的存在或缺乏。
发明者已测定出SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的C等位基因指示对肝铜积累的敏感性。C等位基因纯合的狗对肝铜积累敏感。因此，本发明优选的方法包括测定SNP
BICF2S2333187的C等位基因的存在或缺乏，由此测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的多态性。更优选的方法包括检测SNP
BICF2S2333187的CC基因型的存在或缺乏。
发明者已测定出SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的G等位基因指示对肝铜积累的敏感性。G等位基因纯合的狗对肝铜积累敏感。因此，本发明优选的方法包括测定SNP
BICF2P1324008的G等位基因的存在或缺乏，由此测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的多态性。更优选的方法包括检测SNP
BICF2P1324008的GG基因型的存在或缺乏。
发明者已测定出SNP BICF2P591872 (SNP 5)的A等位基因指示对肝铜积累的敏感性。A等位基因纯合的狗对肝铜积累敏感。因此，本发明优选的方法包括测定SNP SNP BICF2P591872 的A等位基因的存在或缺乏，由此测定狗基因组是否包含指示对肝铜积累的敏感性的多态性。更优选的方法包括检测SNP
SNP BICF2P591872的AA或AG基因型的存在或缺乏。
因此，本发明更优选的方法包括检测(i)在ATP7a_Reg3_F_6
(SNP 142)处的 TT或TC基因型；和/或(ii)在ATP7a_Reg16_F_42 (SNP 143)处的TT或TC基因型的存在或缺乏; 以及可进一步检测下述基因型的存在或缺乏：
(iii) SNP BICF2P506595 (SNP 1)的AA基因型；
(iv) SNP BICF2P772765 (SNP 2)的GG基因型；
(v) SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的CC基因型；
(vi) SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的GG基因型；和/或
(vii) SNP BICF2P591872 (SNP 5)的AA或AG基因型；
和由此测定狗基因组中是否包含指示免于肝铜积累的保护和/或对肝铜积累的敏感性的一种或多种多态性。更优选的方法包括检测基因型(iii)；基因型(iv)、(v) 和(vi)；或基因型(vii)的存在或缺乏。甚至更优选的方法包括检测所有5种基因型(iii)至(vii)的存在或缺乏。
可对狗DNA在以下位置分型：
(i) 一种或多种选自下述的SNP：(a)表VI中鉴定的SNP(ATP7A_Reg3_F_6
(SNP 142))和(b)与所述SNP（a）处于连锁不平衡的一种或多种SNP，例如表X中所鉴定的SNP(ATP7a_Reg16_F_42
(SNP 143))；以及
(ii) 一种或多种选自下述的SNP：(a)表III、IV和V中鉴定的SNP 和(b)与所述SNP（a）处于连锁不平衡的一种或多种SNP。
对狗基因组中在表III、IV、V、VI或X中的任一个表中鉴定的位置（一个或多个）处存在的核苷酸分型可能意味着对在与表III、IV、V、VI或X中鉴定的序列精确对应的序列中在此位置存在的核苷酸分型。然而，应当理解在表III中鉴定的SEQ ID NO: 1 至5，表IV中鉴定的SEQ ID NO:6至130，表V中鉴定的SEQ ID NO: 131至141，表VI中鉴定的SEQ ID NO: 142和表X中鉴定的SEQ ID NO: 143存在的精确序列不一定在待检测的狗中存在。因此可在表III、IV、V、VI或X中鉴定的位置或等同或对应的位置对在序列中存在的核苷酸分型。因此如本文使用的术语等同的意思是在表III、IV、V或VI中鉴定的位置或其对应位置。SNP的序列可发生变化，因此其位置可发生变化，例如由于狗基因组中核苷酸的缺失或插入。本领域技术人员能够确定与各SEQ ID
NOs: 1至143中的相关位置对应或等同的位置，例如使用计算机程序如GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN、PILEUP或BLAST。UWGCG软件包提供了可用于计算同源性或排列序列的程序，包括GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN和PILEUP（例如使用它们的默认设置）。BLAST算法也可用于比较或排列2个序列，通常使用其默认设置。用于进行2个序列的BLAST比较的软件从国家生物技术信息中心（National
Center for Biotechnology Information）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开地获得。此算法在下面进一步描述。用于序列比对和比较的类似可公开获得的工具可在欧洲生物信息研究所（European
Bioinformatics Institute）网站(http://www.ebi.ac.uk)找到，例如ALIGN和CLUSTALW程序。
有许多不同的方法可用于测定多态性是否指示对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护。通常将候选多态性与多态性及其与对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护的联系的数据库相比较。这样的数据库通过对一组狗针对肝铜积累进行表型分型，例如通过肝活组织检查，并根据铜积累的水平将狗分类而生成。所述组中的狗也针对一组多态性被基因分型。然后有可能测定各基因型和肝铜水平的联系。因此通过在数据库中定位多态性可测定多态性是否指示对肝铜的敏感性或免于肝铜的保护。
如果目的多态性不在上述数据库中，仍然有可能测定多态性是否指示对肝铜积累的敏感性或免于肝铜积累的保护。这可通过对一组狗针对肝铜积累进行表型分型和根据肝铜积累的水平将狗分类而实现。然后将所述组的狗针对目的多态性进行基因分型。然后将基因型和肝铜水平相联系以测定基因型和肝铜水平的关联。
一旦在狗基因组中检测了到一种或多种本发明的多态性的存在或缺乏，就由此测定了狗是否受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累敏感。各单独的多态性或与其它多态性组合的多态性的基因型指示狗受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累敏感。
为测定狗是否受到免于肝铜积累的保护，可使用狗的DNA样品在狗基因组中对表VI中鉴定的SNP进行基因分型。此功能突变位于ATP7A（在X染色体上）中，在纯合（TT）时显示为保护性的。这可解释慢性肝炎的雌性偏向，因为雄性仅具有一个拷贝的X染色体，因此在ATP7A基因座上为半合子。因为雄性X染色体的半合状态，伴X染色体的隐性基因效应更可能在雄性而不是雌性中见到。此处的保护性作用是隐性的，因此我们在雌性群体中观察到更多的案例（见实施例2，表VII和图5）。一旦测定了SNP的基因型，就有可能测定狗是否受到免于肝铜积累的保护。可选等位基因（T）的存在指示免于肝铜积累的保护。可选等位基因为纯合（TT）的狗最可能受到免于肝铜积累的保护。本发明优选的方法因此包括测定在狗基因中ATP7A
SNP的T等位基因的存在或缺乏。所述方法可包括测定狗对ATP7A
SNP的T等位基因是纯合的（在雌性狗的情况下）或半合的（在雄性狗的情况下）。
如果方法进一步包括检测指示对肝铜积累的敏感性的SNP的存在或缺乏，模型可用于组合结果以提供狗将对肝铜积累的敏感性火免于肝铜积累的保护的风险或可能性的整体评估。作为实例，表I列举了GOLGA5、UBL5和ATP7a基因区域中5种SNP组合的不同可能的基因型和具有这些基因型且具有高铜（肝水平高于600 mg/kg）的狗的百分比。在此实例中，为了测定狗对肝铜积累的敏感性，可使用狗的DNA样品在狗基因组中对5种SNP进行基因分型。一旦测定了SNP的基因型，可基于实施例1中提供的译码（即基于基因型和高铜关联的程度）将其转化成二进制值。然后，使用表I基于具有该基因型模式和高铜的狗的百分比将二进制值转化为风险因子。这些结果可因此与保护性多态性的结果组合。
通过本发明的方法可检测在任意年龄的狗，例如从0至12、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1岁。优选地，在尽可能小的年龄检测狗，例如在其生命的头一年，头6个月或3个月以内。优选地在铜积累发生前检测狗。可能知道或可能不知道狗的历史。例如，狗可能为已知父母的小狗，可能知道其父母关于铜积累的历史。或者，狗可能为走失的或被救援的狗，具有未知出身和历史。
通过本发明的任意方法检测的狗可为任意品种。本发明提供了测定混种或杂交狗，或杂种或远交狗的基因组是否包含指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性的一种或多种多态性的方法。
在用于测定狗基因组是否包含指示免于肝铜积累的保护的一种或多种多态性的方法中，狗可为疑为受到免于肝铜积累的保护的狗。可选地，狗可被疑为对肝铜积累敏感。在本发明的优选方法中，狗具有拉布拉多寻回犬、金毛寻回犬（Golden Retriever）或迷你贵宾犬（Miniature Poodle）的遗传品种特征。狗可为混种或杂交狗，或杂种或远交狗。狗基因组可具有至少25%、至少50%或至少100%遗传自任意纯种或更优选地遗传自选自拉布拉多寻回犬、金毛寻回犬或迷你贵宾犬的任意品种。狗可为纯种的。在本发明的一个实施方案中，待检测狗的一个或双方父母为纯种狗。在另一个实施方案中，一个或多个祖父母为纯种狗。待检测狗的1、2、3或所有4个祖父母可为纯种狗。
优选地，狗具有拉布拉多寻回犬的遗传品种特征。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。或者，狗可为混种或杂交狗，或远交狗（杂种）。狗的一个或双方父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
通过评估遗传标记物（例如SNP或微卫星）的等位基因频率可测定狗的遗传品种背景。在狗中不同SNP或微卫星的等位基因频率的组合提供了允许测定狗品种或产生混种狗的品种的识别标志。这样的遗传检测可为市售的检测。或者，不需要检测狗的特定品种遗传特征，因为例如狗主人或兽医怀疑其具有特定品种特征。这可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外观。
本发明的预测检测可与一种或多种其它预测或诊断检测（例如测定狗的遗传品种背景/特征或对一种或多种其它疾病的敏感性）共同实施。
多态性的检测
根据本发明的多态性的检测可包括将来自狗的样品中的多核苷酸或蛋白质与针对多态性的特异性结合试剂接触并测定所述试剂是否结合所述多核苷酸或蛋白质，其中试剂的结合指示多态性的存在，而不出现试剂的结合指示多态性的缺乏。
所述方法通常在来自狗的样品中体外实施，其中样品包含来自狗的DNA。样品通常包含狗的体液和/或细胞，例如使用拭子（例如口腔拭子）可获得。样品可为血液、尿、唾液、皮肤、脸颊细胞或发根样品。通常在实施方法前处理样品，例如可进行DNA提取。样品中的多核苷酸或蛋白质可被物理或化学切割，例如使用合适的酶。在一个实施方案中，在检测多态性以前样品中的多核苷酸部分被拷贝或扩增，例如通过克隆或使用基于PCR的方法。
在本发明中，任意一种或多种方法可包括测定一种或多种多态性在狗中的存在或缺乏。通常通过直接测定狗的多核苷酸或蛋白质中多态序列的存在检测多态性。这样的多核苷酸通常为基因组DNA、mRNA或cDNA。可通过任意合适的方法（例如下面提及的那些）检测多态性。
特异性结合试剂是优先或以高亲和力与具有多态性的蛋白质或多肽结合但不与或仅以低亲和力与其它多肽或蛋白质结合的试剂。特异性结合试剂可为探针或引物。探针可为蛋白质（例如抗体）或寡核苷酸。探针可被间接标记或能够被间接标记。探针与多核苷酸或蛋白质的结合可用于固定探针或多核苷酸或蛋白质。
通常在方法中，可通过测定试剂与狗的多态多核苷酸或蛋白质的结合检测多态性。然而在一个实施方案中，试剂也能够结合对应的野生型序列，例如结合在变异位置两侧的核苷酸或氨基酸，然而可以检测到与野生型序列的结合和与含有多态性的多核苷酸或蛋白质的结合的方式不同。
方法可基于寡核苷酸连接测定，其中使用2种寡核苷酸探针。这些探针结合至含有多态性的多核苷酸的相邻区域，在结合后允许2种探针通过合适的连接酶连接在一起。然而在一种探针中的单个错配的存在将破坏结合和连接。因此仅在含有多态性的多核苷酸中出现连接的探针，因此连接产物的检测可用于测定多态性的存在。
在一个实施方案中，探针用于基于异源双链体分析的系统。在所述系统中当探针与含有多态性的多核苷酸序列结合时，其在存在多态性的位点形成异源双链体，因此不形成双链结构。这样的异源双链体结构可通过使用单链或双链特异酶检测。探针通常为RNA探针，使用RNA酶H切割异源双链体，通过检测切割产物检测多态性。
所述方法可基于荧光化学切割错配分析，其在例如PCR Methods and Applications 3, 268-71
(1994) and Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4397-4401 (1998)中描述。
在一个实施方案中使用PCR引物，只有当其与含有多态性的多核苷酸结合时引发PCR反应，例如序列特异性PCR系统，通过检测PCR产物可测定多态性的存在。优选地与多态性互补的引物区域在引物的3’端或靠近引物的3’端。使用基于荧光染料和猝灭剂的PCR测定例如Taqman
PCR检测系统可测定多态性的存在。
特异性结合试剂可能能够特异性结合由多态序列编码的氨基酸序列。例如，试剂可为抗体或抗体片段。检测方法可基于ELISA系统。方法可为基于RFLP的系统。如果多核苷酸中的多态性的存在产生或破坏了被限制性内切酶识别的限制性内切位点，则可使用此系统。
可基于多态性的存在导致多核苷酸或蛋白质在凝胶电泳中迁移率的改变测定多态性的存在。在多核苷酸的情况下，可使用单链构象多态性（SSCP）或变性梯度凝胶电泳（DDGE）分析。在另一个检测多态性的方法中，对含有多态区域的多核苷酸在含有多态性的区域测序以测定多态性的存在。
可通过荧光共振能量转移（FRET）检测多态性的存在。具体来说，可通过双杂交探针系统检测多态性。此方法包括使用2种彼此位置接近且与靶目的多核苷酸的内部区段互补的寡核苷酸探针，其中2种探针分别用荧光团标记。任意合适的荧光标记物或染料可用作荧光团，使一种探针（供体）上的荧光团的发射波长与第二种探针（接受体）上的荧光团的激发波长部分重叠。通常的供体荧光团为荧光素（FAM），通常的接受体荧光团包括德克萨斯红、罗丹明、LC-640、LC-705和青色素5 (Cy5)。
为了使荧光共振能量转移能够发生，2种探针与靶杂交后2种荧光团需要相距很近。当供体荧光团被合适波长的光激发时，发射谱能量被转移至接受体探针上的荧光团，得到其荧光。因此，在合适波长下激发供体荧光团时检测此波长的光指示杂交和2种探针上荧光团的紧密联系。可在一端用荧光团标记每种探针，使位于上游（5’）的探针在其3’端被标记，位于下游（3’）的探针在其5’端被标记。当与靶序列结合时2种探针之间的间隔可为1至20个核苷酸，优选1至17个核苷酸，更优选1至10个核苷酸，例如1、2、4、6、8或10个核苷酸的间隔。
可将2种探针中的第一种设计为与多态性相邻基因的保守序列结合，将第二种探针设计为与包括一种或多种多态性的区域结合。在第二种探针靶向的基因序列中的多态性可通过测量由产生的碱基错配导致的解链温度的改变而检测。解链温度改变的程度将取决于核苷酸多态性涉及的数目和碱基类型。
使用引物延伸技术也可进行多态性分型。在此技术中，多态性位点周围的靶区域被拷贝或扩增，例如通过使用PCR。之后进行单碱基测序反应，其使用在远离多态性位点一个碱基的位置退火的引物（等位基因特异性核苷酸并入）。然后检测引物延伸产物以测定在多态位点存在的核苷酸。有几种方法可检测延伸产物。例如在一种检测方法中，使用荧光标记的双脱氧核苷酸终止子在多态位点处终止延伸反应。或者，使用质量修饰的双脱氧核苷酸终止子，并使用质谱检测引物延伸产物。通过特异性标记一种或多种终止子，可推断出延伸的引物的序列和因此推断出在多态位点存在的核苷酸。每次反应可分析多于一种反应产物，因此如果特异性标记多于一种的终止子，可测定在2条同源染色体上存在的核苷酸。
本发明还提供了可用于检测本文定义的任意SNP的引物或探针以用于预测对铜积累的敏感性。本发明的多核苷酸还可作为引物用于引物延伸反应以检测本文定义的SNP。
这些引物、探针和其它多核苷酸片段的长度优选地可为至少10个，优选地至少15或至少20个，例如至少25个，至少30个或至少40个核苷酸。它们的长度通常多达40、50、60、70、100或150个核苷酸。探针和片段的长度可超过150个核苷酸，例如多达200、300、400、500、600、700个核苷酸的长度，或甚至比本发明的全长多核苷酸序列短至几个核苷酸，例如5或10个氨基酸。
可使用本领域已知的任意合适的设计软件使用表III、IV、V、VI或X中的SNP序列设计对本发明的SNP进行基因分型的引物和探针。这些多核苷酸序列的同源物也适于设计引物和探针。这些同源物通常具有至少70% 的同源性，优选至少80、90%、95%、97%或99%的同源性，例如覆盖至少15、20、30、100或更多连续核苷酸的区域。可基于核苷酸同一性（有时被称为“硬同源性（hard
homology）”）计算同源性。
例如UWGCG软件包提供了可用于计算同源性的BESTFIT程序（例如在其默认设置上使用）(Devereux 等人
(1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395)。可使用PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列（例如鉴定等同或对应序列（通常使用其默认设置），例如在Altschul S. F.
(1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F 等人(1990) J Mol Biol 215:403-10中所描述的。
进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开地获得。此算法涉及通过鉴定当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足一定正值阈值得分T的查询序列中的长度为W的短字串而首先鉴定高得分序列对（HSP）。T被称为邻近字串得分阈值(Altschul 等人, 见上文)。这些最初的相邻字串击中作为种子用于起始检索以寻找含有它们的HSP。字串击中在每条序列的2个方向上延伸，只要可增加累积的比对得分。当累积比对得分从其最大获得值下降X的量；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分到达0或更低；或达到任一序列的末端时，在各自方向上的字串击中延伸终止。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLAST程序使用11的字串长度（W）、BLOSUM62得分矩阵（见Henikoff和Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10915-10919）、50的比对（B）、10的期望（E）、M=5、N=4和2条链的比较作为默认设置。
BLAST算法对2条序列之间的相似性进行统计学分析；见例如Karlin
and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性的测量为最小和概率(P(N))，其提供了2条多核苷酸序列间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一条序列与第二条序列的比较的最小和概率低于约1，优选地低于约0.1，更优选地低于约0.01，和最优选地低于约0.001，则认为一条序列与另一条序列相似。
同源序列通常具有至少1、2、5、10、20或更多个突变的差异，其可为核苷酸的取代、缺失或插入。
本发明的多核苷酸例如引物或探针可以分离的或基本上纯化的形式存在。它们可与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合并仍被视为是基本上分离的。它们也可为基本上纯化的形式，在这种情况下它们将通常包含至少90%，例如至少95%、98%或99%的制品的多核苷酸。
检测抗体
检测抗体为一种抗体，其特异针对一种多态性但不与如本文描述的任意其它多态性结合。检测抗体在例如涉及免疫沉淀技术的纯化、分离或筛选方法中有用。
抗体可针对本发明多肽的特定表位产生。当抗体或其它化合物与其特异性针对的蛋白质优先或高亲和力结合但与其它多肽基本上不结合或仅以低亲和力结合时，抗体或其它化合物“特异性结合”多肽。多种测定抗体的特异性结合能力的竞争性结合或免疫放射测定法的实验方案是本领域所熟知的（见例如Maddox 等人, J.
Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993）。这些免疫测定通常涉及特定蛋白质和其抗体间的复合物的形成以及复合物形成的测量。
用于本发明的目的，除非另外规定，术语“抗体”包括结合本发明多肽的片段。这些片段包括Fv, F(ab’)和F(ab’)2片段，以及单链抗体。此外，抗体和其片段可为嵌合抗体、CDR-移植的抗体或人源化抗体。
抗体可用于在生物样品中（例如任意本文提及的这些样品）检测本发明多肽的方法，所述方法包括：
I 提供本发明的抗体；
II 将生物样品与所述抗体在允许形成抗体-抗原复合物的条件下孵育；和
III 测定包含所述抗体的抗体-抗原复合物是否形成。
本发明的抗体可通过任意合适方法产生。制备和表征抗体的方法是本领域所熟知的，见例如Harlow
and Lane (1988) “Antibody: A
Laboratory Manual”, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。例如，可通过在宿主动物中产生针对完整多肽或其片段（例如其抗原表位，下文中的“免疫原”）的抗体而产生抗体。片段可为本文提及的任意片段（通常至少10或至少15个氨基酸长）。
产生多克隆抗体的方法包括用免疫原免疫合适的宿主动物，例如实验动物，并从动物的血清中分离免疫球蛋白。因此，可用免疫原接种动物，之后从动物中取出血液并纯化IgG部分。产生单克隆抗体的方法包括永生化产生期望抗体的细胞。通过融合接种的实验动物的脾细胞和肿瘤细胞可产生杂交瘤细胞(Kohler
and Milstein (1975) Nature 256, 495-497)。
可通过传统程序选择产生期望抗体的永生细胞。杂交瘤细胞可经培养生长或经腹腔注射以形成腹水或注射至同种异体宿主或免疫系统受损的宿主的血流中。人抗体可通过人淋巴细胞的体外免疫和之后使用埃-巴二氏病毒转化淋巴细胞制备。
为产生单克隆和多克隆抗体二者，实验动物合适地为山羊、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、鸡、绵羊或马。如果需要，免疫原可以偶联物的形式施用，其中免疫原（例如通过氨基酸残基之一的侧链）与合适的载体偶联。载体分子通常为生理上可接受的载体。得到的抗体可为分离的和纯化的（如果需要）。
检测试剂盒
本发明也提供试剂盒，其包含对本文定义的一种或多种多态性分型的装置。具体来说，这些装置可包括特定的结合剂、探针、引物、引物对或引物组合、或如本文定义的抗体（包括抗体片段），其能够检测或辅助检测本文定义的多态性。引物或引物对或引物组合可为序列特异性引物，其只引起包含如本文讨论的待检测的多态性的多核苷酸序列的PCR扩增。可选地，引物或引物对可能不特异针对多态核苷酸，而可能特异针对上游(5’)区和/或下游(3’)区。这些引物允许包含多态核苷酸的区域被拷贝。适用于引物延伸技术的试剂盒可特别地包括标记的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）。它们可为例如荧光标记的或质量修饰的从而能够检测延伸产物和因此测定在多态位置存在的核苷酸。
试剂盒还可包含特异性结合试剂、探针、引物、引物对或引物组合或能够检测多态性缺乏的抗体。所述试剂盒还可包含缓冲液或水溶液。
试剂盒可另外地包含一种或多种其它能够实施上述方法的任意实施方案的试剂或设备。这些试剂或设备可包括一种或多种以下试剂或设备：检测试剂与多态性结合的装置，可检测的标记物例如荧光标记物，能够作用于多核苷酸的酶，通常为聚合酶，限制性酶，连接酶，RNA酶H或可将标记物连接至多核苷酸的酶，用于酶试剂的合适缓冲液（一种或导致）或水溶液，与本文讨论的多态性两侧的区域结合的PCR引物，阳性和/或阴性对照，凝胶电泳设备，从样品中分离DNA的装置，从个体中取得样品的装置，例如拭子或包含针的设备，或包含孔的支持物，在上面可进行检测反应。试剂盒可为或包含阵列例如多核苷酸阵列，其包含本发明的特异性结合试剂，优选探针。试剂盒通常包含一套使用试剂盒的说明书。
生物信息学
多态性序列可以电子格式储存，例如在计算机的数据库中。由此，本发明提供了数据库，其包含与SNP
ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性和它们与狗受到免于肝铜积累的保护的联系相关的信息。本发明还提供了数据库，其包含与GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中的一种或多种多态性和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性和它们与狗对肝铜积累的敏感性的联系相关的信息。数据库可包括有关多态性的其它信息，例如多态性与免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性的联系的程度。
本文描述的数据库可用于测定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性的多态性。这样的测定可通过电子装置实施，例如通过使用计算机系统（例如PC）。
通常地，测定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性将通过下述进行：将来自狗的遗传数据输入计算机系统；比较遗传数据和数据库，所述数据库包含与SNP
ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性和它们与狗受到免于肝铜积累的保护的联系相关的信息，以及任选地，包含与GOLGA5、ATP7A或UBL5基因中的一种或多种多态性和/或与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性和它们与狗对肝铜积累的敏感性的联系相关的信息；以及基于此比较测定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性。该信息然后可用于指导狗肝铜水平的管理。
本发明还提供了计算机程序，当所述程序在计算机上运行时，其包含进行所有本发明方法的所有步骤的程序编码装置。还提供了包含在计算机可读介质上储存的程序编码装置的计算机程序产品，当所述程序在计算机上运行时用于进行本发明的方法。另外提供了包含在载波上的程序编码装置的计算机程序产品，当在计算机上运行时其命令计算机系统进行本发明的方法。
如图4中所示，本发明还提供了布置进行根据本发明的方法的设备。设备通常包含计算机系统，例如PC。在一个实施方案中，计算机系统包含：装置20，用于接收来自狗的遗传数据；模块30，用于比较数据和包含多态性相关信息的数据库10；和装置40，用于基于所述比较测定狗基因组是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性的多态性。
育种工具
定义育种值为个体作为亲本的值，其通常在农业生产中用于改善牲畜（life-stock）的期望性状。为了改善狗的总体铜操纵能力和降低铜相关疾病例如慢性肝炎的发生率，选择受到免于肝铜积累的保护的狗用于育种是有利的。此问题通过使用可用于测定狗是否受到免于肝铜积累的保护的多态性为育种提供资料而解决。
例如，父母在ATP7A基因座的基因型可影响2只狗的后代的铜操纵能力。在此基因座的特定变体的转移对后代将是有益的。通过测定在此基因座的基因型，有可能评估预期亲本的育种值并因此作出特定育种对是否合适的决定。
由此，本发明提供了选择用于产生受到免于肝铜积累的保护的后代的狗的方法，其包括通过本发明的方法在候选第一只狗中测定狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性；由此测定候选第一只狗是否适于产生免于肝铜积累的保护的后代。所述方法可还包括通过本发明的方法在第二只与第一只狗性别相反的狗中测定狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性。如果结果是第一只和/或第二只狗具有指示免于肝铜积累的保护的基因型，之后可将第一只狗和第二只狗交配以产生受到免于肝铜积累的保护的后代。
例如，方法可包括测定选自SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142) 和与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性的一种或多种多态性在候选第一只狗的基因组中的存在或缺乏。更优选地，所述方法包括测定ATP7A_Reg3_F_6
SNP (SEQ ID NO:142)和/或ATP7a_Reg16_F_42 SNP (SEQ ID NO:143)的存在或缺乏。本发明的方法可包括测定ATP7A_Reg3_F_6 SNP (SEQ ID NO:142)的T等位基因和/或ATP7a_Reg16_F_42 SNP (SEQ ID NO:143)的T等位基因的存在或缺乏。仍更优选地，所述方法可包括测定狗对SNP
ATP7A_Reg3_F_6和/或SNP
ATP7a_Reg16_F_42 (SEQ ID NO:143)的T等位基因是纯合的（在雌性狗的情况下）或半合的（在雄性狗的情况下）。所述SNP的存在指示第一只狗受到免于肝铜积累的保护，因此是与第二只狗交配的良好候选者。优选地，第一只和第二只狗对所述SNP的T等位基因为纯合或半合的。在第一只和/或第二只狗中的纯合性是最优选的，因为这增加了后代是纯合的和因此受到免于肝铜积累的保护的可能性。
本发明还提供了通过使用本发明的指示对铜积累的敏感性的多态性而选择用于产生受到免于肝铜积累的保护的后代的狗的方法。在狗基因组中缺乏这些多态性指示所述狗是用于交配的良好候选者。本发明的方法可因此进一步包括测定候选第一只狗的基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累的敏感性的多态性；由此测定候选第一只狗是否适于产生免于肝铜积累的保护的后代。
所述方法可包括测定候选第一只狗的基因组中（c）在GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中指示对肝铜积累的敏感性的多态性和/或（d）与所述多态性（c）处于连锁不平衡的多态性的存在或缺乏。所述方法可还包括测定与第一只狗性别相反的第二只狗的基因组是否包含一种或多种指示对肝铜积累的敏感性的多态性。所述方法可因此包括检测在第二只狗的基因组中（c）在GOLGA5、ATP7a或UBL5基因中指示对肝铜积累的敏感性的多态性和/或（d）与所述多态性（c）处于连锁不平衡的多态性的存在或缺乏。如果结果是第一只和/或第二只狗的基因组中没有指示对肝铜积累的敏感性的基因型，之后可将第一只狗和第二只狗交配以产生对肝铜积累不敏感的后代。
所述方法可包括测定选自表III、IV和V中鉴定的SNP的一种或多种多态性和与其处于连锁不平衡的一种或多种多态性在候选第一只狗的基因组中的存在或缺乏。一种或多种这些多态性的存在指示第一只狗对肝铜积累敏感，因此不是与第二只狗交配以产生受到免于肝铜积累的保护的后代的好候选者。
候选第一只狗和/或第二只狗可为任意品种。优选地，候选第一只狗和/或第二只狗具有选自拉布拉多寻回犬、金毛寻回犬或迷你贵宾犬的品种的遗传品种特征。更优选地，候选第一只狗和/或第二只狗具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。可选地，狗可为混种或杂交狗，或远交狗（杂种）。狗的一方或双方父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
通过评估遗传标记物（例如SNP或微卫星）的等位基因频率可测定狗的遗传品种背景。在狗中不同SNP或微卫星的等位基因频率的组合提供了允许测定狗品种或产生混种狗的品种的识别标志。这样的遗传检测可为市售的检测。或者，不需要检测狗的特定品种遗传特征，因为例如狗主人或兽医怀疑其具有特定品种遗传特征。这可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外观。
通过“封闭的（closed）血统证书”控制由所有品种的俱乐部登记验证的大多数品种纯种狗。血统证书通常是由例如品种协会或养犬俱乐部保存的被认可的特定品种狗的官方登记。如果只有其父母均为登记的情况下狗才可加入的话，通常称为“封闭的”血统证书。大多数品种具有封闭的血统证书，这导致近交，因为不能从现有种群以外引入遗传多样性。在多个由养犬俱乐部认可的品种中这已导致遗传疾病或病的高发率和其它问题例如降低的产仔数，降低的寿命和不能自然怀孕。
为了避免与近交相关的问题，在特定品种中选择彼此关系较远的狗比起关系较近的狗进行育种是有利的。因此在本发明的一个方面，测定候选第一只狗和候选第二只狗的遗传品种特征以测定2只狗的相关度。在本发明的此方面，术语“遗传品种特征”涉及在特定品种中狗的遗传祖先。可通过本文描述的方法测定狗的遗传品种特征。通过测定狗的遗传特征，有可能在单一品种中辨别2只狗以测定它们的关系有多近。
因此，在本发明的一个方面测定候选第一只狗和候选第二只狗的相关度，其包括比较候选第一只狗和相同品种的候选第二只狗的遗传品种特征。优选地，所述狗为纯种狗。每只狗的遗传品种特征可通过例如鉴定在所述狗中的一种或多种品种特异多态性的存在或缺乏而测定。
可通过狗共有的品种特异性多态性的数目测定狗的相关度。例如，相同品种的2只狗可共有从0至100%的检测的品种特异多态性，例如从10至90%，从20至80%，从30至70%或从40至60%。因此，2只狗可共有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%检测的品种特异多态性。可使用2只狗共有的检测的品种特异多态性的比例作为相关度的衡量。在本发明的此方面，只有当2只狗在遗传上足够地不相关时才可将其交配在一起。例如，只有当它们共有的检测的品种特异多态性低于60%、50%、40%、30%或低于20%时才可将其交配在一起。
本发明还提供了选择用于与受试狗育种的一只或多只狗的方法，所述方法包括：
（a）测定在受试狗和与受试狗性别相反的2只或多只狗组成的实验组中的每只狗的基因组中是否包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性以及任选地一种或多种指示对肝铜积累的敏感性的多态性；和
（b）从实验组中选择1只或多只狗用于与受试狗育种。
实验组可由至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、75、100或200只不同的狗组成，例如从2至100，从5至70或从10至50只狗。通常基于受到免于肝铜积累的保护从实验组中选择狗。从实验组中选择的一只或多只狗可与受试狗具有相同或相似的遗传品种特征。
受试狗和实验组中的每只狗可为任意品种。优选地，受试狗和/或实验组中的每只狗具有选自拉布拉多寻回犬、金毛寻回犬或迷你贵宾犬的品种的遗传品种特征。更优选地，狗具有拉布拉多寻回犬品种的遗传品种特征。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。可选地，狗可为混种或杂交狗，或远交狗（杂种）。狗的一方或双方父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。在本发明的一个实施方案中，选择基于免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性的相关多态性的存在或缺乏的、实验组中最可能受到免于肝铜积累的保护的狗与受试狗育种。在另一个实施方案中，选择实验组中可能受到免于肝铜积累的保护的几只狗与受试狗育种。例如，可选择实验组中的至少2、3、4、5、10、15或20只狗。可基于其它因素例如地理位置、年龄、育种状态、病史、疾病敏感性或身体特征从选择的狗的组中进行进一步的选择。
如上面解释的，交配相同品种中遗传最不相关的狗是理想的。这是为了提高或维持品种中的遗传多样性和降低在子代中发生近交相关问题的可能性。因此，从实验组中进一步选择狗可基于狗与受试狗的遗传相关性。由此，在本发明的一个方面，所述方法可进一步包括：
（a）比较受试狗的遗传品种特征和与受试狗品种相同且性别相反的2只或多只狗组成的实验组中的每只狗的遗传品种特征；
（b）根据受试者和实验组中每只狗的相关度的比较测定；和
（c）从实验组中选择用于与受试狗育种的1只或多只狗。
可基于其与受试狗（即待育种的狗）的相关性从实验组中选择狗。优选地，从实验组中选择的一只或多只狗是在狗实验组中相关性最远的（即具有最低的相关度）。受试狗和实验组中的狗的遗传品种特征可为已知的或可通过例如市售的品种检测法测定。
本发明因此提供了推荐用于与受试狗育种的1只或多只合适的狗的方法。所述推荐可对受试狗的主人或照顾者、兽医、狗育种家、养犬俱乐部或品种登记进行。
本发明还涉及育种狗的方法，其中测定性别相反的至少2只狗受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性，任选地在相同的品种中，在它们在一起育种以前测定。
可以电子格式存储狗受到免于肝铜积累的保护或对肝铜积累的敏感性，例如在计算机的数据库中。由此，本发明提供了包含涉及1只或多只狗对肝铜积累的敏感性或受到免于肝铜积累的保护和性别的信息的数据库。所述数据库可包括有关狗的进一步信息，例如狗的遗传品种特征、育种状态、年龄、地理位置、病史、疾病敏感性或身体特征。数据库通常还包含每只狗的唯一标识符，例如狗的登记名。数据库可通过远程访问，例如使用互联网。
本发明的食品
本发明涉及用于具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗的食品。发明者发现在商业饮食中发现的铜水平与拉布拉多寻回犬中的肝铜积累相关，降低饮食中的铜水平令人惊讶地使肝铜水平回到正常水平，比药物青霉胺更有效。本发明的食品具有低铜浓度，具体地低于21mg/kg干物质的铜浓度。食品被用于预防在拉布拉多寻回犬的肝中的铜积累。因此其对预防由肝铜积累引起的疾病或病症有用。因此，本发明的食品可提供给狗，其中所述狗的基因组已通过本发明的方法被测定为包含一种或多种指示对肝铜积累的敏感性的多态性。本文中使用的术语“食品”包含食品、饮食、食物或补充剂。这些形式中的任一种可为固体、半固体或液体。
更具体地，本发明的食品包含低于21 mg/kg干物质浓度的铜。优选地，铜浓度低于20，低于17，低于15，低于12，低于10或低于8mg/kg干物质。优选地，铜浓度为至少3，至少3.5，至少4，至少4.5，至少4.75，至少5或至少8mg/kg干物质。通常地，铜浓度在3至21 mg/kg, 优选4至12mg/kg，4.5至12mg/kg，4至11mg/kg，4.5至11mg/kg，4至10mg/kg，4.5至10mg/kg，4至9mg/kg，4.5至9mg/kg，4至8 mg/kg 或4.5至8 mg/kg干物质的范围内。铜可以任意生理上可接受的形式存在于食品中。因此可以任意生理上可接受的盐例如硫酸铜提供铜。
食品可进一步包含至少120 mg/kg干物质浓度的锌。优选地，锌浓度为至少150，至少180或至少200 mg/kg干物质。优选地，锌浓度不超过食物监管机构允许的最大值。锌浓度通常低于250，低于240，低于230或低于220 mg/kg干物质。锌浓度通常在120至250, 150至250或200至250 mg/kg干物质的范围内。
优选地，食品中的锌量超过铜量。应当理解，狗吸收的食品中的锌和/或铜的有效浓度受到不可消化物质的存在或缺乏的影响。优选地，食品中的锌与铜的比例为5或更多，例如6、7、8、9、10或更多，按食品的质量计算。
可在本发明的提供铜水平的相同食品中提供锌。可选地，可以补充剂的形式提供锌，所述补充剂可加入本发明的食品。补充剂可为片剂、粉末或液体制剂的形式。锌可以任意生理上可接受的形式存在于食品中或作为补充剂提供。因此锌可为任意生理上可接受的盐，例如醋酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌、碳酸锌、氯化锌或氧化锌。
本文中描述的食品中的铜或锌浓度是以干物质计，即以不含水的食品计，从而能够直接比较可能具有不同含水量的不同食品。为测量在湿的或半湿的食品中的铜或锌浓度，首先干燥食品样品，例如使用烤箱以去除水。之后，可使用任意合适的技术测量干燥食品样品中的铜或锌浓度。这些技术的一个实例是本领域熟知的火焰原子吸收光谱法。
本发明的食品可为例如湿宠物食品、半湿宠物食品或干宠物食品的形式。湿宠物食品通常具有高于以重量计65%的含水量。半湿宠物食品通常具有以重量计20-65%之间的含水量并可包含保湿剂和其它配料以防止微生物生长。干宠物食品（又称粗磨粉）通常具有低于以重量计20%的含水量，其加工过程通常包括挤压、干燥和/或高温烘焙。
食品可以湿和干食物的混合物提供。这样的组合物可预先混合提供，或以2种或多种单独的食品提供，其单独、同时或相继提供给狗。
食品包含任意狗在其饮食中消耗的产品。本发明包含标准食物产品和宠物食品点心。优选地，食品为煮熟的食品。其可包括肉或动物来源的材料（例如牛肉、鸡肉、火鸡肉、羊肉、鱼肉等等）。可选地，产品可为不含肉的（优选地包含肉替代物例如大豆、玉米蛋白或大豆产品以提供蛋白质来源）。产物可还包含淀粉来源，例如一种或多种谷物（例如玉米、大米、燕麦、大麦等等），或可为不含淀粉的。
干宠物食品的配料可选自谷类、谷物、肉、家禽、脂肪、维生素和矿物质。配料通常为混合的并经挤压机/炊具处理。然后产品通常经定型和干燥，干燥后，可在干的产品上涂或喷洒调料和脂肪。
所有宠物食品都需要提供一定水平的营养素。例如，美国饲料品管协会（Association of American Feed
Control Officials）(AAFCO)和宠物食品协会（Pet Food Institute）已基于通常使用的配料建立了狗食品的营养素组成（profile）。这些建立的组成被称为“AAFCO狗食品营养素组成”。在这些监管下，狗食品必须被配制为包含达到AAFCO测定的所有最低水平和不超过AAFCO测定的最高水平浓度的营养素。
狗食品制剂可根据狗的热量、蛋白质、脂肪、碳水化合物、纤维、维生素或矿物质需求定制。例如，狗食品制剂可定制为提供准确量或比例的必需脂肪酸例如ω-6和ω-3脂肪酸。ω-6脂肪酸的主要来源为植物，例如向日葵、大豆油、红花和月见草油，而ω-3脂肪酸主要在亚麻籽和海产来源中发现。铜含量高的和可在食品生产中避免的食物配料包括贝类、肝、肾、心、肉、坚果、蘑菇、谷类、可可、豆科植物和软水（铜管道）。富含锌和可在制剂中包括的食物配料包括奶、明胶、蛋黄、大米和马铃薯。
食品优选为包装的。包装材料可为金属（通常以锡或flexifoil的形式）、塑料（通常以小袋或瓶子的形式）、纸或卡片。在任意产品中的含水量可影响可使用的或需要的包装的种类。
本发明的食品可与锌来源一起包装。锌可以任意形式提供。锌可在一种或多种食品中提供，或以单独的补充剂的形式与包含本发明的最高水平的铜的食品一起包装。当在食品中提供锌时，可在包含本发明的特定水平的铜的相同食品中提供锌，或可在一种或多种单独的食品中提供锌，或二者都提供锌。本发明因此提供了包含具有低于21
mg/kg干物质浓度的铜的食品和锌补充剂的包装。当加入食品中时，锌补充剂提供至少120mg/kg干物质的浓度。食品和锌补充剂用于同时、单独或相继使用以在具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病。
本发明还提供如本文讨论的带标签的食品。标签可例如指示所述食品适用于拉布拉多寻回犬品种的狗。可提供其它指示或说明。例如，可陈述除了其它配料以外，饮食或食品包含的铜和/或锌的量。此外，可提供喂食说明。
拉布拉多寻回犬
本发明的食品适用于在具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗中预防肝铜积累。狗通常为伴侣狗或宠物。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。狗可为纯种拉布拉多寻回犬。可选地，狗可为混种或杂交狗，或远交狗（杂种）。狗的一方或双方父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗的1、2、3或4个祖父母可为纯种拉布拉多寻回犬。狗在其遗传背景中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多寻回犬品种。因此，狗基因组的至少50%或至少75%可来源于拉布拉多寻回犬品种。
通过评估遗传标记物（例如SNP或微卫星）的等位基因频率可测定狗的遗传品种背景。在狗中不同SNP或微卫星的等位基因频率的组合提供了允许测定狗品种或产生混种狗的品种的识别标志。这样的遗传检测可为市售的检测。或者，可不需要检测狗的拉布拉多寻回犬品种特征，因为例如狗主人或兽医怀疑其具有拉布拉多寻回犬品种特征。这可能是由于例如知道狗的祖先或由于其外观。
食品适用于任意年龄的狗。食品可适用于具有从0至12岁大，例如从1至5岁大，从2至7岁大或从3至9岁大的年龄的狗。
食品通常适用于健康的狗。其适用于没有可检测出的肝铜积累的狗。食品计划用于预防用途，即预防在狗肝中的铜积累。食品旨在使狗的铜积累风险最小从而降低狗产生由肝铜积累导致的疾病或病症例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭的可能性。食品通常用于在没有异常肝铜浓度和因此不太可能具有患铜相关肝炎的风险的狗中预防铜积累。狗也可不具有积累铜的历史。因此狗优选地具有正常水平的在低于约400
mg/kg干肝重范围内的肝铜。然而，在新生的狗中，肝铜的正常水平可被认为是低于约600
mg/kg干肝重。为狗提供食品的目的是预防肝铜浓度达到显著高于正常水平的水平。可用于测定狗肝中的铜浓度的方法是本领域熟知的。在实施例4中描述了一个合适的方法。
食品可用于预防铜相关慢性肝炎。食品优选地用于在没有可检测出的肝疾病的狗中预防铜积累，目的是预防这些肝疾病。食品也可用于治疗由肝铜积累导致的疾病或病症，例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。肝疾病的证据或症状包括临床指征例如嗜睡、腹泻和黄疸。肝疾病的生化指征包括异常提高的血清胆红素和血清肝酶活性例如碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶（AST）和γ谷氨酰转肽酶。这些肝疾病指征的生化测量是本领域熟知的。
优选地，食品计划用于的狗没有任何临床问题。
食品的制造
可通过将合适的配料混合在一起制造本发明的食品。制造是受控的以使食品具有所需要的铜浓度。可在食品生产过程中监控铜浓度。本发明因此提供了制造本发明的食品的方法，其包括将用于食品的配料混合在一起以使食品具有低于21
mg/kg干物质的铜浓度。待掺入食品的一种或多种成分可提供铜来源。然而避免使用可能富含铜的成分是重要的。富含铜的和在食品生产中可能避免的食品配料包括贝类、肝、肾、心、肉、坚果、蘑菇、谷类、可可、豆科植物和软水（铜管道）。任选地，一种或多种成分将提供用于本发明的食品的锌来源。富含锌的和在制剂中可能包括的食品配料包括奶、明胶、蛋黄、大米和马铃薯。可在食品的制造/加工过程中的任意时间加入成分/配料。
测量在食品中存在的铜浓度以确定浓度低于根据本发明的限度是重要的。也可测量锌浓度以检查其高于根据本发明的优选的最低水平。在食品制造方法的一个步骤中可包括测量食品样品中的铜浓度。在已制备好食品后对食品样品至少进行一次铜浓度的测量。也可在食品的制备过程中进行测量以监控由于更多配料的加入而积累的铜和/或锌的水平。例如，在加入一种或多种配料后可对样品进行测量。可使用本领域已知的任意合适方法例如火焰原子吸收光谱法对样品进行铜、锌和其它元素的测量。
本发明的制造食品的方法通常包括以下步骤：将配料混合在一起并任选地烹调任意原配料；在食品样品中测量铜浓度和任选地测量锌浓度；和包装食品。制造食品的方法可进一步包括将食品提供给狗主人、负责喂养狗的人或兽医和/或将食品提供给狗。
虽然食品不含有任何铜是罕见的，可将铜作为补充剂加入食品以获得在狗饮食中的铜的最低每日需求（例如美国饲料品管协会（AAFCO）推荐的）同时将铜浓度仍保持在低于本发明所需的量。本发明因此也提供了铜在制造用于具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗的食品中的用途，其中所述食品包含低于21
mg/kg浓度的铜并用于预防在所述狗中的铜积累。铜可以任意合适的形式加入食品。铜补充剂的实例包括氯化铜和五水合硫酸铜。在本发明中使用的制造食物产品的设备通常包含一种或多种以下组成部分：用于干宠物食品配料的容器；用于液体的容器；混合器；成型机头和/或挤压机；切断装置；烹饪装置（例如烤箱）；冷却器；包装装置；和贴标签装置。干配料容器通常在底部具有开口。此开口可被体积调节元件例如回转式塞（rotary
lock）覆盖。体积调节元件可根据电子制造指令开和关以调节干配料加入宠物食品。在制造宠物食品中通常使用的干配料包括玉米、小麦、肉和/或家禽肉。在制造宠物食品中通常使用的液体配料包括脂肪、动物脂和水。液体容器可含有可控的泵，例如通过电子制造指令在宠物食品中加入测量过的量的液体。
在一个实施方案中，干配料容器（一个或多个）和液体容器（一个或多个）与混合器连接并传递特定量的干配料和液体至混合器。混合器可受电子制造指令控制。例如，可控制混合的持续时间或速度。之后通常将混合的配料传递至成型机头或挤压机。成型机头/挤压机可为本领域已知的可用于将混合的配料成型为需要的形状的任意成型机头或挤压机。通常混合的配料在压力下强制通过受限的开口以形成连续的带（strand）。当带被挤压后，可通过切断装置例如刀将其切成小块（ 粗磨粉）。通常对粗磨粉进行烹饪，例如在烤箱中。可通过电子制造指令控制烹饪的时间和温度。烹饪的时间可以变化以产生食品的预期含水量。之后可将烹饪后的粗磨粉转移至冷却器，例如含有一个或多个风扇的室。
宠物食品制造设备可包含包装设备。包装设备通常将宠物食品包装进例如塑料或纸袋或盒的容器。设备可还包含在宠物食品上贴标签的装置，通常在已包装好食品之后。标签可指示食品适用的狗的种类（即拉布拉多寻回犬）和/或食品的配料。
食品的用途
本发明的食品可用于预防狗的肝铜积累的方法。因此，其可用于预防与高肝铜相关的疾病或病症，例如铜相关慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。由此，本发明提供了在具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗中预防肝铜积累和由肝铜积累导致的疾病的方法，其包括对狗喂食本文中描述的食品。本发明还提供了在具有拉布拉多寻回犬品种的遗传特征的狗中预防铜相关慢性肝炎的方法，其包括对狗提供本发明的食品。本发明的食品通常用于在拉布拉多寻回犬中预防铜积累的预防用途。其也通常用于在拉布拉多寻回犬中预防铜相关慢性肝炎。
本发明的食品优选地用于预防狗的肝铜积累的方法，通过本文描述的遗传检测已测定所述狗的基因组中不包含一种或多种指示免于肝铜积累的保护的多态性，以及任选地已测定包含一种或多种指示对肝铜积累的敏感性的多态性。
因此，本发明提供在狗中预防由肝铜积累导致的疾病的方法，所述狗具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征，所述方法包括（i）测定狗受到免于肝铜积累的保护的可能性，其包括测定在狗基因组中选自下述的一种或多种多态性的存在或缺乏：(a)
SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142)和(b)与（a）处于连锁不平衡的一种或多种多态性；以及（ii）向狗开出、提供或喂食含至少4.5至小于12mg/kg干物质浓度的铜的食物。食物可以提供给狗主人、照顾者或兽医。本发明还提供用于所述方法的食物。
本发明的食品的用途可包括对狗提供锌来源。如本文中描述的，可以任意合适的形式将锌提供给狗。包含低水平的本发明的铜的食品可进一步包含锌，例如以至少120 mg/kg干物质的浓度。可选地，可以一种或多种单独的食品或补充剂的形式提供锌。本发明的食品的用途可包括对狗提供锌补充剂。可在任意时间提供锌补充剂，即与本发明的食品单独、同时或相继提供。锌补充剂可在例如将其提供给狗之前与本发明的食品混合，或可将其置于狗的饮用水中。
本发明的食品可每天一次或多次提供给狗。优选地，提供食品代替狗的传统食品。可在无限期的时间内（即在狗的一生中）使用预防铜积累或预防慢性肝炎的方法。
通过以下实施例说明本发明：
实施例1
与对铜积累的敏感性相关的SNP的说明
对120只拉布拉多犬的DNA样品在超过22000个SNP上进行基因分型。72个狗样品来自高铜狗（高于600 mg/kg的肝铜水平），48个狗样品来自正常肝铜水平（低于400 mg/kg）。使用成对比较在每对可能的狗之间分析数据。根据疾病信息基因座的支持整理数据。使用最佳的3个基因组位置的数据使用布尔算子寻找与高铜水平相联系的最佳匹配标记。使用3个位置的简单布尔模型的结果显示如下：
表1 使用基因组位置CFA8、CFA32和CFAX的简单布尔模型的结果
表I中二进制值的译码如下：
基因组位置CFA8 (GOLGA5基因)
1 = 如果在SNP BICF2P506595处有AA基因型
0 = 如果在SNP BICF2P506595处有任意其它基因型
基因组位置CFA32 (UBL5基因区)
1 = 如果在BICF2P772765处有GG, 在BICF2S2333187处有CC和在BICF2P1324008处有GG
0 = 如果这些SNP中的任一种显示了不同的基因型
基因组位置CFAX (ATP7A基因区)
1 = 如果在BICF2P591872处有AA或AG
0 = 如果在BICF2P591872处有GG
在所有位置中, X = 未使用的等位基因。
表I显示了在3个基因组位置上的等位基因的双值条件。在基因组位置CFA8处使用了1种SNP(SNP 1)。在基因组位置CFA32处使用了3种SNP（SNP 2、3和4）。在基因组位置CFAX使用了1种SNP(SNP 5)。二进制值指示了具有指示对铜积累的敏感性的等位基因（“坏”等位基因）的狗。例如000代表没有3种坏等位基因中的任一种。111代表具有所有3种坏等位基因。X是在该基因中未使用的等位基因。行1xx和0xx显示了仅使用GOLGA5基因中的SNP的单基因检测可具有的效力。
表II显示了具有多个指示性等位基因的狗具有平均更高的铜浓度。我们也可以看到具有每种模式的狗数目。
表II
| 基因组合 | Cu2 的平均量(mg/kg) | 具有高铜的具有此等位基因模式的狗的% | 具有此模式的狗数目 |
| 111 | 1253.09 | 81.5% | 27 |
| 110 | 733.40 | 60.0% | 20 |
| 101 | 1138.90 | 77.8% | 9 |
| 100 | 737.84 | 60.7% | 28 |
| 011 | 502.27 | 42.9% | 7 |
| 010 | 670.83 | 63.6% | 11 |
| 001 | 450.00 | 50.0% | 4 |
| 000 | 332.47 | 7.1% | 14 |
表III显示了在表I和II的结果中使用的SNP的位置和序列。
结果表明3个基因组位置（在GOLGA5、UBL5和ATP7A基因中和周围）与对铜积累的敏感性有联系。表IV提供了在这些区域中指示对铜积累的敏感性的其它SNP。
实施例2
鉴定与对肝铜积累的敏感性相关的另外的SNP和保护性SNP
研究了在实施例1中鉴定的3个基因以进一步鉴定与对肝铜积累的敏感性相关的SNP。选择了覆盖这3个鉴定的基因的每个外显子的33个扩增子。在来自拉布拉多寻回犬品种的狗的基因组DNA的72个样品中扩增这些扩增子。从具有高铜（高于600 mg/kg的肝铜水平）或正常肝铜水平（低于400
mg/kg）的狗中取样品。通过Sanger法在双向测序扩增产物。使用DNASTAR提供的“Seqman 4.0”软件组装在各个扩增子中的序列。之后检查组装的序列以寻找单碱基突变（SNP）。之后通过双向检查序列中SNP的碱基强度对这些突变进行基因分型。如果双向的SNP基因型在多于10个样品中不一致，则将此SNP划分为人为的（artefact）和忽略的。鉴定的敏感性SNP列于表V。
令人惊讶地也发现了一个保护性SNP。在表VI中提供了此SNP。此SNP在ATP7A基因（一个X染色体连锁的基因）的编码区并导致编码序列的改变。进行了根据性别和ATP7A基因型的平均肝铜水平的研究（表VII）。图5通过图表说明了表VII的数据。图6以铜-组织学得分的形式说明了相同的数据。通过Kruskal-Wallis检测对以性别-基因型为分组的组织学得分测定了p-值(0.000396)。数据明显地说明T等位基因的存在指示了狗受到免于高肝铜的保护。
结果可能解释了慢性肝炎在雌性中的偏向。雄性狗仅具有一个拷贝的X染色体，因此在ATP7A基因座上为半合子。因为雄性X染色体的半合状态，伴X染色体的隐性基因效应更可能在雄性而不是雌性中可见。此处的保护性作用是隐性的，因此我们在雌性群体中观察到更多的案例。
保护性SNP导致在ATPa的第328位氨基酸的苏氨酸至异亮氨酸的改变，导致潜在的氢键数从3降低至0和疏水性的增加，潜在地改变了蛋白质的形状。在此位置的苏氨酸在许多哺乳动物中（包括马、人、黑猩猩和海豚）是保守的，指示此氨基酸在蛋白质功能中的重要性。
实施例3
研究ATP7A保护性SNP的品种和地理多样性
在拉布拉多寻回犬以外的其它品种的狗的DNA样品中对表VI中的ATP7A SNP进行基因分型以测定此SNP是否在其它品种中存在。表VIII显示了结果，以及每种基因型的狗数目。“T”列指纯合子雌性（TT）和半合子雄性（T）。结果证明此SNP在多种狗品种中存在，因此可在多种不同品种、混种狗和杂种中用作免于铜积累的保护的指示物。在美国和日本拉布拉多犬种群中也发现了此SNP的T等位基因，证明狗的地理位置不妨碍此SNP的使用。
表VII
表VII
| 品种 | C | CT | T (与低铜水平相关的突变) |
| 拉布拉多寻回犬 | 31 | 13 | 28 |
| 迷你贵宾犬 | 3 | 2 | 8 |
| 金毛寻回犬 | 0 | 0 | 1 |
实施例4
发现另一个保护性但非编码SNP
测序ATP7A基因表明内含子型SNP，其几乎与编码SNP ATP7a_Reg3_F_6处于完全连锁不平衡。类似编码SNP，内含子型SNP (ATP7a_Reg 16_F42)与免于肝铜积累的保护显著相关(表IX)。用在基因型和疾病状态的自变量上两个自由度使用卡方测量二者的显著性。疾病状态对于>600 mg/kg干肝重铜定量和>=2.5组织学得分为阳性；对于<400 mg/kg干肝重铜定量和<2.5组织学得分为阴性。期待的表基于基因型频率和疾病频率在假定两个变量独立的样品中进行的Bayesian 概算。
非编码SNP和编码SNP之间连锁不平衡的计算值是：D’ =
0.93和R-平方 =
0.86。SNP因此几乎处于完全不平衡。
ATP7a_Reg
16_F42周围的序列显示于表X。
实施例
5
进行体外实验以测定编码突变 (“ATP7A
SNP”)的功能作用
材料和方法
细胞系
犬真皮成纤维细胞CDFIB44、CDFIB62和CDFIB111从麻醉的母拉布拉多犬分离。在麻醉前取的血样进行本发明的遗传检测以确定疾病增加的风险。CDFIB111对于ATP7A SNP是纯合的，CDFIB62为杂合子。CDFIB42 用作对照。这些细胞称为ATP7AC/C、ATP7AC/T或ATP7AT/T，对应于表达ATP7A野生型、杂合子或变体形式的犬真皮成纤维细胞。人真皮成纤维细胞HB156获自临床Menkes患者 (ATAC)。H8881 细胞用作对照。ATP7A在这些细胞中目前未被测序。关于这些细胞没有可用的ATP7A 序列信息。
成纤维细胞培养物在添加L谷氨酰胺(2mM)、10% FBS、MEM 非必需氨基酸 (100 µM)和青霉素/ 链霉素的Dulbecco’s修改的Eagle’s培养基(Invitrogen)中在37℃在空气中具有5% CO2的湿润气氛下常规维持。低血清培养基含有相同成分，具有2%
FBS。用于实验，使用第4至9代之间的犬细胞。分离来自小肠和肝的组织并随后储存RNA在20℃直到需要。
免疫荧光
用于免疫荧光，将在盖玻片上生长的显微镜观察用细胞在含有200 mM浴铜灵二磺酸 (BCS; Sigma)的低血清培养基中孵育24小时。细胞在新鲜制备的4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，洗涤和在0.2% Triton-X100的PBS溶液中透化。非特异信号用含有0.2% Triton-X100的PBS中的3% BSA封闭1小时，随后在含有鸡抗ATP7A (1:50;
ab13995 (Abcam), 针对氨基酸1407–1500) + 小鼠抗58k (1:50;
Abcam)的相同封闭培养基中孵育2小时。Texas红-缀合的山羊抗-鸡(1:100)和FITC-缀合的驴抗-小鼠(1:100)抗体(Abcam)用于检测一级抗体(1小时)。Texas红缀合的兔抗-山羊抗体(1:1000; Abcam)随后用于扩增来自山羊抗-鸡二级抗体的信号(1小时)。盖片最终在Prolong
Anti-fade gold (Sigma)中处理并通过表面荧光观察。
放射性同位素实验
64铜同位素使用金属性铜线(3.3 mg)制成，所述金属性铜线在提供约170
MBq.mg.-1的感应放射性的反应器中照射过夜。达到后，在照射约四小时和开始研究前30分钟，铜线溶解在50 µl浓HNO3 (10.3 M)中和用1.3
ml 0.5 M NaOH中和。DMEM培养基添加至终浓度为4.7
mM 铜。成纤维细胞以两份重复在6孔板中在添加5 %
FBS+添加物的DMEM培养基中铺板培养。
用于铜处理，细胞在10、50和100 µM 铜中孵育24或48 h。处理后，去除培养基和用添加等量的冷CuCl2的Hanks洗涤细胞四次。洗涤后，添加325 µl的0.2% SDS以裂解细胞并将细胞裂解液吸至计数管。在Packard
B5003γ计数器(Packard BioScience Benelux, Groningen,
the Netherlands) 中在450和800 keV之间2分钟测定含有培养基、洗涤步骤，或裂解液的各个管中的发射。用于流出物研究，在铜处理24小时后，用Hanks洗涤细胞四次，然后在未含有添加铜的新鲜温培养基中孵育2 h。然后对细胞进行铜的分析，如上所述。铜积累归一化为细胞裂解液的蛋白浓度(使用Bio Rad 蛋白测定试剂盒定量, Bio Rad)，并平行进行MTS 比色测定(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羧基甲氧基苯基]-2-[4-磺苯基]-2H-四唑) (Promega)。该定量测定检测活细胞不检测死细胞。使用酶联免疫吸收测定微孔板阅读器(Bio-Rad)测量在490 nm的吸收值 (测试波长)和在650 nm (参考波长)的吸收值；含有培养基但不含细胞的孔用作空白。在该实验中，将在100
µL培养基中的104 个细胞接种至96-孔板的每个孔。获得70%汇合后，用10、50或100 µM 铜处理细胞。孵育24和48小时后，洗涤孔，并将100 µL的培养基和20 µL的MTS 添加到每个孔。在37℃孵育2小时后，测量在490 nm的吸收值。
RNA 分离
使用酚氯仿提取然后根据制造商说明书使用Qiagen
RNeasy组织试剂盒(Qiagen)处理（clean-up），以三份重复从组织成纤维细胞分离总RNA。简言之，分离约75 mg的组织并添加至1ml 的Tri试剂和5 mm Qiagen钢球轴承（steel
ball bearing）。组织通过组织Lyser (Qiagen) 在20 30 Hz匀浆3次2分钟。添加100 µl的1溴3氯丙烷，短暂涡旋并使其在室温静置5分钟，然后在台式离心机中在4℃离心15分钟。去除澄清的水相，并加入0.5 ml 的异丙醇，使其静置并在4℃再离心10分钟。在 70 % 乙醇中洗涤沉淀，在室温空气干燥并重悬于300 µl的水。RNA进一步用gDNA消除柱清洁并用使用Qiagen RNeasy
plus 试剂盒纯化。使用Qiagen RNeasy plus试剂盒从细胞分离总RNA。
使用高效RNA至cDNA (ABI)试剂盒根据制造商说明书在20 µl 反应体积中逆转录总计2 µg的RNA。源自组织的cDNA稀释1：20 ，之后通过qPCR检测。源自细胞的cDNA 稀释1：100 用于ATP7A分析或稀释1：10用于MT1A分析。
用DNA酶I (Qiagen 无RNA酶的DNA酶试剂盒) 处理RNA样品。在60 µl 反应体积中，使用Promega的逆转录系统 (Promega Benelux, Leiden, The Netherlands)，将总计3 µg的RNA 与多聚(dT) 引物在42℃孵育 45分钟。
实时定量PCR (qPCR)
如Spee等人(J
Vet Intern Med 2006: 20:1085-1092)所述进行Q-PCR。实时PCR基于高亲和性双链DNA-结合染料SYBR绿I，并在光谱荧光测量热循环仪中以三次重复进行。对于每个PCR反应，在384 孔板上，将8.7 µl (稀释的储液) cDNA用于20 µl反应体积，其含有1× Power SYBR® Green PCR Master Mix, 40 pmol的两种引物。引物对 (除了用于ATP7A的那些)，如表XI所述，获自Spee等人。所有PCR方法包括5分钟聚合酶激活步骤并继续进行(变性) 95℃ 20秒、退火30秒并在72℃延伸30秒的40个循环，最后在72℃延伸5分钟。退火温度范围为从50℃到67℃ (表XI)。解离曲线、生物分析仪(Agilent 2100)和测序(MWG)用于检测每种样品 的纯度和特异性。使用连续10倍稀释的cDNA生成通过相对起始量对阈值循环作图进行的效率曲线。测定每个标准曲线的扩增效率E (%) =
(10(1/s)1)·100 (s = 斜率)并且显示为在宽动力学范围上的> 95 %和<
105 %。每种实验样品被归一化为内源参考次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、RPL8、RPS5和RPS19，其具有误差的适当传递（appropriate
propagation of error）。
蛋白质印迹
细胞用PBS洗涤 3次并在200 µl 新鲜制备的煮沸裂解缓冲液(含有1% SDS的Tris-缓冲盐水(TBS) )裂解，使用橡皮擦子刮掉细胞。通过将样品在25号针头中通过几次来匀浆样品，然后加热至70 ℃ 5分钟，之后在-20 ℃储存待分析用。解冻细胞裂解液，在上样缓冲液 (50
mM Tris.HCl, pH6.8, 2 % SDS, 0.1 % 溴酚蓝, 10
% 甘油, 40mM DTT)中煮沸5分钟并上样至预装的SDS-PAGE。将膜在5% 牛奶/PBS-T中封闭1-2小时，然后用一级抗体在RT孵育1小时。将膜用封闭缓冲液洗涤3次10分钟，然后在室温用在封闭缓冲液中1:10,000稀释的兔抗-鸡 Ig HRP 抗体孵育1小时。将膜用封闭缓冲液洗涤 3次10分钟随后用PBS-T洗涤1次。膜在PBS中短暂洗涤以去除去垢剂并根据制造商说明书使用ECL蛋白质印迹检测试剂系统显色。随后膜暴露于SuperRX Fuji X-射线膜(Tokyo, Japan)和在Kodak自动处理器 (Eastman Kodak Company, Japan)中显影。
为了显示等量蛋白上样，洗脱膜并再标记探针。膜用小鼠抗-微管蛋白
(10,000 稀释, 5 % BSA/TBS-T/T, 在RT 1小时，随后山羊抗小鼠HRP (1:10,000)
1% BSA/PBS-T/T, 在RT 1小时) 进行蛋白质印迹和如前所述用ECL蛋白质印迹检测试剂显现。
洗脱膜
在再标记前，将膜洗脱掉结合的抗体。将膜在55 ℃在洗脱缓冲液(100 mM 2 -巯基乙醇, 2 %
SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7)中孵育30分钟，然后在进一步蛋白质印迹前，在PBS中充分洗涤。
统计学
qPCR数据是在分析前进行log10变换，以确保变异的一致性 (参数分析的假设)。然后通过ANOVA分析log10(表达)值，对于表达值的标准误加权。对ATP7AC/C 基因型进行成对比较并计算具有95%置信区间的倍数变化。
表XI
用于定量实时PCR的狗特异性引物的核苷酸序列
结果
犬真皮突变体成纤维细胞比野生型或杂合子细胞并入更多的铜64和以更慢速率的流出物
此后， 野生型、杂合子和突变体细胞分别称为ATP7AC/C、ATP7AC/T或ATP7AT/T。成纤维细胞与超生理学浓度的同位素铜-64 (Cu64) (100 µM)孵育显示：与ATP7AC/C 细胞相比，在ATP7AT/T
细胞和ATP7AC/T 细胞中在24 小时和48小时后增加到约两倍(图7A)。在较低浓度(50 µM)，与其他基因型细胞相比，ATP7AT/T细胞并入更高量的铜。 在生理学浓度的孵育显示在细胞类型之间没有并入差异。为了测定在ATP7AT/T
细胞中Cu64水平的增加是否归因于终止的流出物（abrogated
efflux），我们下一步通过洗出方法测量了来自细胞的流出物水平(图7B)。在添加高量的Cu64 (100 µM)和2小时洗出后，ATP7AC/C细胞已保留约45%的同位素，而ATP7AT/T
细胞已保留几乎90%。已并入与ATP7AT/T
细胞类似铜量的ATP7AC/T细胞显示与ATP7AC/C 细胞类似的流出速率。伴随更高量的铜并入，发现在ATP7AT/T
细胞中细胞存活力在高铜负荷下较低(数据未显示)。
作为对照，使用人野生型细胞和源自Menkes患者的细胞平行进行实验。。如期望的，与野生型细胞相比，Menkes细胞显示在所有使用的Cu64 浓度显示更高并入 (图7C)，以及以降低的速率流出的Cu64(图7D)。感兴趣地是，与犬细胞相比，在24和48小时Cu64的并入在野生型和Menkes细胞中更高。仍需研究的是在基本条件下，在人和犬细胞中铜的稳态水平。
ATP7A基因表达在ATP7AT/T 细胞中未改变
为了确定流出物的降低是否归因于ATP7A的表达水平，我们使用qPCR分析了ATP7A 转录物水平。对于狗未有ATP7A同种型的描述，因此如下设计3组引物：ATP7Ai扩增重叠突变的区域，以及ATP7Aiii和ATP7Aii设计为扩增在转录物 3’和5’ 端的区域，以用于证明剪切变体。在基本条件或用铜孵育下，在基因型之间没有发现ATP7A
表达水平的变化 (图8A)。但是当测量ATP7A 蛋白水平时，发现所有3种犬细胞系中ATP7A 表达是铜依赖性的， 在ATP7AT/T
细胞中具有最高表达(图8B)，其在测量的时间点中添加铜螯合剂 BCS不是可逆的。感兴趣地是，在基本条件下，与ATP7AC/C
细胞相比，在ATP7AT/T 细胞中存在更高的ATP7A表达。大量条带存在于膜上，推测对应于不同同种型。但是，这些条带没有变化，为简要起见未显示。使用siRNA和过表达构建体的进一步工作将用于鉴定ATP7A
特定条带。
ATP7AT/T细胞具有增加的MT1A基因表达
为了测定在ATP7AT/T 细胞中更高水平的铜并入是否导致铜响应基因的更高表达，我们进行了ATP7AC/C。ATP7AC/T和ATP7AT/T
细胞金属硫蛋白 1A (MT1A) 表达的 qPCR分析(图9)。在未处理细胞中MT1A表达的分析显示与ATP7AC/C 细胞相比，ATP7AC/T和ATP7AT/T 细胞具有显著更高的MT1A表达(图9A)。响应于1-100 μM 铜，ATP7AC/T和ATP7AT/T
具有显著地未调节的MT1A 表达，而在高于10 μM 铜添加时，ATP7AC/C是显著的(图9B)。另外，当在基因型之间比较时，在基因型中响应于铜的MT1A表达的上调比较是不显著的，除了响应与1 μM铜的ATP7AT/T，ATP7AC/C UT 相对于 Cu1相对于ATP7AT/T
UT 相对于 Cu1; (p=0.014)。因此，ATP7AT/T细胞对铜更敏感(图9C)。
与ATP7AC/C相比，铜依赖性金属硫蛋白基因表达在ATP7AT/T
细胞中更高
在ATP7AT/T 成纤维细胞中铜增加的保留和相应的增加的铜依赖性MT1A表达引导我们研究相应的Menkes表型是否可在肠和肝组织活检中观察到。因此，对于从3 个个体活检的肝和小肠组织的冷冻样品进行MT1A 表达的qPCR分析，其中成纤维细胞从所述3 个个体移植(图10)。与ATP7AC/C相比，MT1A 表达在ATP7AT/T
肝组织中显著更低且在小肠组织中显著更高。
犬真皮ATP7AT/T成纤维细胞具有降低的ATP7A运输
为了测定ATP7AT/T 细胞中铜的增加是否归因于ATP7A 运输的降低，我们使用免疫细胞化学法在不同细胞类型中定位响应于铜的ATP7A。我们使用BCS 螯合细胞外铜以使ATP7A‘位于’ TGN中(上图)。如期望的，在ATP7AC/C和ATP7AT/T 细胞中发现ATP7A主要在TGN中 (用抗-58K标记, 中图)。在洗涤以及随后用100 µM铜孵育1-3 小时后， 在ATP7AC/C
细胞中ATP7A从TGN转移至细胞周质，以从细胞输出铜。ATP7AT/T细胞显示显著地缺乏ATP7A 转移，如在暴露于铜后发现ATP7A主要在TGN中。图中显示的细胞密度未指示生长速率。发现两种细胞类型以类似的形态学和密度生长。
结论
研究已显示铜积累的速率在表达突变形式的蛋白的细胞中更高；在铜暴露过程中积累更多且在铜暴露后释放更慢。另外，在携带该突变的细胞中，响应于铜暴露的细胞内ATP7A运动改变。在携带该突变的细胞中，还存在铜转运蛋白的增加的表达。ATP7A表达水平在携带两种形式ATP7A的细胞之间没有改变。
该研究的结果表明，铜转运和处理在携带正常和突变形式的ATP7A的细胞之间存在显著差异。这些差异可启动解释拉布拉多犬对铜积累的差异敏感性作为CACH中一个因素的机制。
实施例6
概述
本研究的目的是为了调查在用青霉胺治疗后，饮食管理对影响拉布拉多犬的肝铜浓度是否有效，和用锌的进一步治疗是否有效。
研究在由12只雌性和12只雄性纯种拉布拉多犬组成的24只狗的组中进行。这些狗是以前患有铜相关慢性肝炎的患者的家族成员。在饮食测试开始时，狗在临床上是健康的，但是20只狗的肝铜浓度超过400mg/kg干物质的参考范围（平均：894，范围：70-2810 mg/kg干物质）。这些浓度是在用青霉胺治疗完成后测量的。
对所有狗喂食相同的饮食。另外的治疗包含葡萄糖酸锌（7.5mg/kg PO BID，组1）或安慰剂（组2）。直至研究完成，药剂师是唯一知道组分配的人。在平均8个月（范围5-13）和16个月（范围12-25）的治疗前和治疗后在临床检查和血液检查（blood-work）时评估肝铜浓度和组织病理学。在治疗中的另外的时间点测量血浆锌浓度。
21只拉布拉多犬完成了研究。在研究开始时，组1中狗的平均年龄为4.1岁（范围2.7-8.3）。6只狗为雌性（5只绝育的，1只为完整的），6只狗为雄性（2只为阉割的，4只为完整的）。组2中狗的平均年龄为4.8岁（范围3.6-11.2）。6只狗为雌性（4只绝育的，2只为完整的），6只狗为雄性（2只为阉割的，4只为完整的）。在补充葡萄糖酸锌的组的3只狗中观察到呕吐、厌食和腹泻的副作用。
随着时间的推移，在进行饮食管理的2个组中肝铜浓度都具有显著差异（8个月：组1
p<0.001，组2 p= 0.001，和16个月：组1 p= 0.03, 组2 p=
0.04）。然而，在治疗前(p= 0.65)，复查-1(p
= 0.52)和复查-2(p = 0.79)时组之间的肝铜浓度没有差异，提示进一步的锌补充对肝铜积累没有益处。
此研究的结果显示饮食管理可在拉布拉多犬中有效降低肝铜浓度。使用锌的辅助治疗不扩大去除铜的作用。
现在将更详细描述此研究。
材料和方法
拉布拉多寻回犬
研究群体由24只纯种拉布拉多寻回犬组成，这些狗是以前被描述为CACH的狗的家族成员。所有狗都在荷兰拉布拉多寻回犬品种俱乐部中登记。
所有狗都在此研究开始前完成了它们的青霉胺治疗。从所有狗处得到了病史并进行了身体检查。采集柠檬酸钠化血液样品用于血凝状况的分析，包括凝血酶原时间（PT），活化部分凝血活酶时间（aPTT）和纤维蛋白原。采集肝素-血液和EDTA-血液用于肝胆酶碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、胆汁酸（BA）的分析和用于血小板计数和血浆锌浓度的测量。根据Rothuizen
(Rothuizen J, I. T. (1998) Tijdschr Diergeneeskd 123: 246–252)提供的Menghini技术取出肝活组织。从每只狗中取出至少3块肝活组织。2块活组织在10%的中性缓冲的福尔马林中固定，1块活组织在不含铜的容器中贮存用于定量铜测定。
组织学评估所有活组织。肝组织用红氨酸染料染色以用于评估铜的分布和半定量，如前述(Van den Ingh
T.S.G.A.M., R. J., Cupery R. (1988) Vet Q 10: 84–89)。根据应用的等级系统，超过2的铜得分为异常的（0：没有铜，1：含有一些铜阳性颗粒的孤立肝细胞和/或网状组织（RHS）细胞，2：含有少量至中等量的铜阳性颗粒的小群肝细胞和/或RHS细胞，3：含有中等量的铜阳性颗粒的较大群或面积的肝细胞和/或RHS细胞，4：具有许多铜阳性颗粒的大面积的肝细胞和/或RHS细胞，5：具有许多铜阳性颗粒的弥散存在的肝细胞和/或RHS细胞）。
通过中子活化分析进行肝组织中的铜定量测定，其根据Teske等人描述的方案，使用Bode
(Bode, P. (1990) Journal of Trace and Microprobe Techniques 8: 139 ; Teske 等人 (1992) Vet Rec 131: 30-32) 描述的设备进行。在冻干的肝活组织中测量定量的铜浓度并以mg/kg干肝重报告。
除了铜含量以外，在0至5之间的范围内对进一步的组织学改变分级以允许统计检测（0=无炎症的组织学症状，1=反应性肝炎，2=轻微慢性肝炎，3=中度慢性肝炎，4=严重慢性肝炎，5=肝硬化）。
研究经乌得勒支大学实验动物管理与使用委员会（Utrecht University Institutional Animal
Care and Use Committee）认可。所有狗的使用都获得了已了解情况的主人的准许。
不加治疗的肝铜积累的进展
在任何治疗以前，在平均8.7个月（范围6-15个月）之后在11只狗中重复测量了肝铜浓度。在这段时间中，对所有动物喂食其通常的维持饮食，根据制造商，其包含在12-25
mg/kg干物质之间的饮食铜浓度和在80-270 mg/kg干物质之间的锌浓度。
饮食
对所有狗的主人提供相同的特别制造的饮食。喂食状态（as fed）的饮食的粗略分析为：水分57.9%，粗蛋白质6.1%,
粗脂肪5.9%, 矿物质1.7%。可代谢能量（根据美国饲料品管协会的方案测量）：1650 kcal/kg（喂食状态）。饮食包含浓度为4.75 mg/kg干物质的铜和浓度为102
mg/kg干物质的锌。对狗喂食所述饮食，没有进一步的饮食补充和治疗。此研究中的拉布拉多犬接受每天420至840g之间的饮食。
药物代谢动力学研究
在药物代谢动力学研究中使用2只无关的9岁健康拉布拉多寻回犬（1雌1雄）。在口服施用锌之前的12小时时间内和最开始的6小时检测期内禁食。可自由地获取水。在狗1中以10 mg/kg的剂量施用口服葡萄糖酸锌，在狗2中以5mg/kg的剂量施用口服葡萄糖酸锌。在给药前（时间0）和应用药物后15、30、45、60、90、120 分钟和4、8、12和24小时从颈静脉收集肝素化血液样品（4 ml）。在使用原子吸收光谱法分析锌之前将血浆贮存于-20℃。
药物的准备、随机化和盲法（blinding）
选择葡萄糖酸锌是基于我们的下列临床观察决定的，与其它盐例如醋酸或硫酸盐相比，此药物具有较少的副作用。药片由乌得勒支大学兽医学院的兽医药房（Veterinary
Pharmacy of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Utrecht）提供。锌药片包含25mg的以葡萄糖酸锌盐形式的元素锌(Toppharm Zink 25 gluconaat, Parmalux BV, Uitgeest,
NL)。安慰剂药片包含160 mg乳糖(Albochin,
Pharmachemie BV, Haarlem, NL)。2组药片具有相同的外观。
药剂师通过扔硬币对每组6只狗的组预先随机化组分配。3只狗接受安慰剂，3只狗用锌治疗。在临床医生的处方中，根据随机化表分配药片（安慰剂或锌）。
处方的剂量根据下列方案：
体重：
<28 kg
(<61.6lbs):
8片BID
(200mg BID)
28 – 35kg (61.6- 77lbs): 9片BID
(225mg BID)
超过35 (>77lbs):
10片BID
(250mg BID)。
要求主人在喂食前30分钟在少量狗饮食中混合药片。主人和临床医生都不知道每只狗接受的是哪种治疗。在试验中由药剂师一直持有随机化的药片，并仅在试验完成后公开。
统计分析
药物代谢动力学参数(WinNonlin 4.0.1. (Pharsight
Corporation, 800 West El Camino Real, Mountain View, CA, USA)和统计分析(SPSS 11.0 for windows, 2001, SPSS Inc., Chicago, IL,
USA)通过使用市售的软件包计算。由于小组规模使用非参数统计检验在组之间比较。使用Mann-Whitney检验检测用饮食和葡萄糖酸锌（组-1）治疗前和治疗后在2次控制检查（复查1-和复查-2）时，和用饮食和安慰剂（组-2）治疗后在2次控制检查时的肝铜浓度之间的差异。此外使用此检验检测在研究前、复查-1和复查-2时组-1和组-2之间的差异（显著水平p ≤ 0.05）。
结果
不加治疗的肝铜积累的进展
在11只拉布拉多犬中在进行任何治疗以前重复测量了肝铜浓度，在这期间对狗喂食它们的通常维持饮食。在除了一只狗以外的所有狗中肝铜浓度在2次测量之间的8.7个月的时间间隔中都增加了，从平均1000
mg/kg干重(范围290-2370)至平均1626 mg/kg 干重(范围630-3610)。与患者的体重（平均：33.9, 范围25-39.5）联系起来，这相当于在8.7个月中每公斤体重18 mg铜的提高。结果显示于图1。
药物代谢动力学研究
从口服应用10 mg/kg (狗1) 和5 mg/kg (狗2)元素锌的2只狗中测量的血浆锌浓度中计算的药物代谢动力学参数为：
狗1 (10 mg/kg): V_F: 分布体积 = 2937.872 ml/kg体重,
K01: 吸收速度常数= 0.567212 1/小时, K10: 消除速度常数 = 0.053728 1/小时, AUC: 曲线下面积 = 63.35272
hr*µg/ml, Cl_F: 生物利用率相关的清除率 = 157.8464
ml/hr/kg, Tmax: 达到最大浓度的时间= 4.589813 小时, Cmax: 最大清除率= 2.659924
µg/ml)
狗2 (5 mg/kg): V_F: 分布体积 = 2538.689 ml/kg体重,
K01: 吸收速度常数 = 1.160647 1/小时，K10: 消除速度常数= 0.037886 1/小时, AUC: 曲线下面积 = 51.98513
hr*µg/ml, Cl_F: 生物利用率相关的清除率 = 96.18135
ml/hr/kg, Tmax: 达到最大浓度的时间 = 3.047974 小时, Cmax: 最大清除率 = 1.754728
µg/ml)。
计算的锌的半衰期为 t½= 15.1 小时。
计算的积累速度R为1.52，通过R=1/(1-exp(-k10*24)计算。将剂量间隔选为12小时。剂量估计为127.0139 ml/hr/kg，从2只狗的平均CL_F中计算。
基于5 µg/ml的预期最大锌血浆浓度估计合适的剂量。剂量=
Cl_F x 预期的血液浓度 x 剂量间隔 =
7.62 mg/kg q 12 小时。
饮食试验和随机化的以安慰剂为对照的锌应用
在饮食试验开始时，20只狗的肝铜浓度高于400 mg/kg干重的参考范围（平均894，范围：70-2810 mg/kg干重）。铜的半定量评估结果的范围在0至4.5。对17只狗的肝活组织组织病理学检查揭示了升高的肝铜含量（高于2），其被定位在小叶中心部分的肝细胞。铜的染色在5只狗中是正常的，通过定量分析发现的在具有升高的肝铜的2只狗的活组织中得到高度正常的染色结果。在7只狗中存在慢性肝炎。通过肝细胞凋亡和坏死、单核细胞炎症、再生和纤维化的不同程度表征CH。通过炎症的量和肝细胞凋亡和坏死的程度测定肝炎的活性。通过纤维化的程度和模式和肝硬化的存在确定疾病的阶段。肝炎在4位患者中为轻微的，在2只狗中为中度的，在1只狗中诊断出肝硬化。在13只狗的肝中不存在炎症的组织学症状，在4只狗的活组织中组织病理学揭示了反应性改变。
在研究开始时，组1中狗的平均年龄为4.1岁（范围2.7-8.3）。6只狗为绝育的雌性，6只狗为雄性（2只阉割的，4只完整的）。平均体重为33 kg (范围26.2-37.5)。组1中狗的平均肝铜浓度为961 mg/kg干重(范围340-2810)。通过组织学染色的铜的平均半定量评估为2-3+ (范围0-4.5)。
组2中狗的平均年龄为4.8岁（范围3.6-11.2）。6只为雌性（4只绝育的，2只完整的），6只为雄性（2只阉割的，4只完整的）。平均体重为32.3 kg (范围25-41.9)。组2中狗的平均肝铜浓度为861 mg/kg干重(范围70-1680 )。在治疗前2组之间的肝铜浓度没有差异(p =
0.73)。通过组织学染色的铜的平均半定量评估为2-3+ (范围0.5-3)。
组-1中的3只狗没有完成研究。中止的原因与在所有3只狗中的治疗无关（1位主人觉得他的狗变得太老了，1位主人有个人原因，1只狗患上肥大细胞瘤）。21只狗完成了研究，进行了至少一次控制检查（复查-1）。在另外的较晚的时间点（复查-2）在16只狗中获得了肝活组织。
在组1中的3只狗中观察到呕吐和厌食的副作用。这3只狗中的一只还具有短暂的小肠腹泻。在应用药片后立刻出现副作用，当药片与饮食混合后副作用消失。
血液检查
胆汁酸的浓度从平均14 μmol/l
(范围: 3-101)降低至复查-1时的平均7.8 (范围: 1-39)和复查-2时的7.1(范围: 0-21)。碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸转氨酶（ALT）的平均浓度在所有检查中保持在正常范围内。在治疗前的平均ALP浓度为41 U/l (范围: 8-111), 在复查-1时: 平均ALP = 37 U/l (范围12-143),
在复查-2时: 平均ALP = 37 U/l (范围:19-152)。在治疗前的平均ALT浓度为28 U/l (范围: 10-234), 在复查-1时: 平均ALT = 47 U/l (范围: 11-78), 在复查-2时: 平均ALT = 51 U/l
(26-68)。
在研究开始时锌的平均血浆浓度在组-1和组-2中分别为95 μg/dl和96 μg/dl。在复查-1和复查-2时2个组的血浆锌浓度都没有差异（p值在0.11和0.79之间）。在3次检查的任一次中都没有发现组1和组2之间的血浆锌浓度的差异（p值在0.34和0.5之间）。可发现血浆锌浓度有差异的唯一时间点是在组1用锌治疗的第一个月后的血液检查中。在锌应用后2-6小时进行血液样品的采集。在此控制检查中平均血浆锌浓度提高至165 μg/dl (范围117-249, p=0.02)。
肝铜测量
在2组的治疗中肝铜的定量测量有改善。在复查-1和复查-2时，与开始点相比，肝铜浓度在2组狗中均显著降低（组-1在复查-1时：平均286 mg/kg, 范围84-700,
p<0.001; 组-1在复查-2时: 平均421 mg/kg, 范围220-790, p=0.03, 组-2在复查-1时: 平均277 mg/kg, 范围
80-450, p= 0.001, 组-2在复查-2时: 平均401 mg/kg, 范围118-850,
p=0.04)。在复查-1时2组之间在肝铜浓度上没有差异（p=0.52），在复查-2时组之间也没有差异（p=0.79）。此外，在复查-1和复查-2之间肝铜浓度没有进一步的降低（组-1p=0.44,
组-2 p=0.25）。结果显示于图2。
组织学
治疗后铜的组织学染色有改善。与开始点相比，组1和组2中的铜的半定量评估的组织学得分在复查-1和复查-2时降低（组1在复查-1时: p= 0.031, 组1在复查-2时: p= 0.01, 组2在复查-1时: p = 0.01, 组2在复查-2时: p=0.001）。在任意时间点2组之间没有差异（p=0.16-0.75）。
肝的炎症严重度组织学得分在2组狗的所有检查中保持不变（p=0.25-0.45）。
结论
为了给患有CACH的患者提供对肝铜浓度的更平衡的长期控制，本研究的目的是调查在用青霉胺治疗后，饮食管理对影响拉布拉多犬的肝铜浓度是否有效，和用锌的进一步治疗是否有效。本研究的结果显示饮食管理可有效降低肝铜浓度。使用锌的辅助治疗不扩大去除铜的作用。
实施例7
在研究锌对肝铜浓度的影响的调查中，在18只纯种拉布拉多寻回犬中测量了肝铜浓度。对一半的狗提供锌补充，对另一半提供安慰剂。对所有狗喂食实施例2的饮食。使用实施例2的方法在3个时间点测量肝铜浓度：（1）用青霉胺治疗前；（2）用青霉胺治疗后但在用实施例2的饮食治疗前；和（3）饮食治疗后。如实施例2中所示，在用锌和用安慰剂治疗的狗中的铜水平没有显著差异（数据未显示）。然而，饮食的使用的确对铜水平具有显著影响。用锌和用安慰剂治疗的狗的组合结果显示于图3，结果证明低铜饮食比单独的青霉胺对降低肝铜水平具有更显著的作用。
实施例8
本发明的食品的实例列举如下：
| 配料 (%) | 100 |
| 水 | 47.4 |
| 谷类 | 28.5 |
| 植物副产品 | 1.7 |
| 蛋和蛋副产品 | 1.5 |
| 肉和动物副产品 | 17 |
| 油和脂肪 | 2 |
| 矿物质和维生素 | 1.9 |
下面提供在此食品中的矿物质和微量元素的量的典型分析以及使用的方法：
| 分析 | 结果 (喂食状态的重量%或mg/kg 干物质) | 注释 |
| 水分 | 63 % | 通过在105 ℃干燥5小时丢失 |
| 蛋白质 | 6.5 % | 通过Kjeldahl法测定蛋白质，使用6.25的氮因子 |
| 脂肪 | 4.2 % | 酸水解和石油醚提取 |
| 灰分 | 2.2 % | 16小时上升温度的程序, 在550℃处理5小时得到最终的灰分 |
| 粗纤维 | 1.4 % | EC方法OJ L344 26/11/92 P35, 官方指示92/89 |
| 铜 | 5.4 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 锌 | 229 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 铁 | 62 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 钙 | 9 460 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 磷 | 5 405 mg/kg | 通过比色反应 |
实施例9
本发明的食品的另一个实例如下：
| 配料(%) | 100 |
| 谷类 | 39.7 |
| 植物副产品 | 8.0 |
| 植物蛋白提取物 | 5.0 |
| 肉和动物副产品 | 35.6 |
| 油和脂肪 | 7.5 |
| 矿物质和维生素 | 4.2 |
下面提供在此食品中的矿物质和微量元素的量的典型分析以及使用的方法：
| 分析 | 结果 (喂食状态的重量%或mg/kg 干物质) | 注释 |
| 水分 | 8.0 % | 通过在105℃干燥5小时丢失水分 |
| 蛋白质 | 30.0 % | 通过Dumas法测定蛋白质，使用6.25的氮因子 |
| 脂肪 | 13.0 % | 酸水解和石油醚提取 |
| 灰分 | 6.3 % | 16小时上升温度的程序, 在550℃处理5小时得到最终的灰分 |
| 粗纤维 | 4.1 % | EC方法OJ L344 26/11/92 P35, 官方指示92/89 |
| 铜 | 10.9 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 锌 | 245 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 铁 | 217 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 钙 | 1 087 mg/kg | 通过火焰原子吸收光谱法 |
| 磷 | 760 mg/kg | 通过比色反应 |
序列表
<110> Mars, Incorporated
<120> 用于狗肝铜积累的遗传检测和低铜宠物饮食
<130> N.110507
<150> GB 0906162.3
<151> 2009-04-08
<150> GB 0913309.1
<151> 2009-07-30
<150> PCT/GB2009/02355
<151> 2009-10-05
<160> 159
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗（Canis familiaris）
<400> 1
ctcagaacta gataggctaa taagtgatag gccttgtgtt ttcctagagt
gtgctttaaa 60
rgtttcttaa gctaaaaaat tacattcgtg agaaaattga aataaaagga
aaacagtcat 120
g
121
<210> 2
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 2
tctcagatac ttgatagcca gcatttcccc ccattttctt ccaagagcac
gaaagcatag 60
raatgatatt acatctcgta tggtgaatgt gacacagccg tcagttgcgt tagctctgct
120
t
121
<210> 3
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 3
tattaccctg ctctccagcc actcctttac cttccattag cccacacctg
ctctacacac 60
yattgctcat ggaagccttg ccacgtccag tcgccactct gaaatgccag
catccctccc 120
a
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<210> 4
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 4
gacctgacag attatgtaga ctttgttttc aaagggagca cctgctggat
atacaacatg 60
rcactaaatt gtgctccaca tccttggcag aggtgggggg cggggcacaa
aggaagaaac 120
c
121
<210> 5
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 5
gggcccagca agtggcagaa ctgggaagac cccctcttct tccgcctgga gcagtggtgt
60
rgcagcacac cacaggagtc tgaaagggtg gggagtccaa acgggaacat
atacctgaga 120
t
121
<210> 6
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 6
ggcaacaggg acaggctgct gggccacaca ctcacccaca ctaggagaca
agatcctcca 60
yatcctgggt ctctatcagt caatcaccta gaccagtggg ccagaggaca
gggtccagct 120
g
121
<210> 7
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 7
gttgagagag atcatacaga ttcatgtggc aggtgcacac tttttctacc
tcttacaacg 60
yattctctct ggccattcct tctcctgggt cccaaagtcg gagagcttag
cgggagccta 120
g
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 8
ataagttcac attttggtgt ttcaagtgga catgaatgga ggggagggcc
ctgttcaatc 60
yactaaagtg ttttttcatc ttgtttttgt ggaaatcaaa tcaagaagca
gagttttatg 120
t
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 9
actctcccga tgtgggcacc atatggtgga ccactttctg tgtgagatgc
ctgctcttat 60
ygccatgtcc tgtgaagaca ccatgctggt ggaagcattt gcctttgccc
tgggtgttgc 120
c
121
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<212> DNA
<213> 狗
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aatctaagta gactgagtgg tcaccttcag cgctcagacc tgagcataca
aagcatggaa 60
rgttactgtg attcagctga tgtaatggaa tgaaataaat ataagagttt
ggtaacctaa 120
t
121
<210> 11
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 11
tggagagtgc tggcaggcag gggcaggcaa acaacaatag caaagatctc
ttccacgctt 60
ytacttcctc aaaagtccaa gccctcttaa gatcgcattt tcttagtgac
cttcactcta 120
a
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 12
ttctttgcta ggccaagggc agagaatgca tgccccccct tacctcccag
ggcccaagag 60
scatcctgag ctgagtctat ggctcctggt ggggggcggc tgtgggttgg
gggggcacag 120
a
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 狗
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ggtgtcacca atgccagcga gcaccagctg gagggaacag gacacaggtc
ctccgtcctg 60
ygacactcgg atctggggct ttgcctccaa aacggagacc atgcctgtcc
atggttctac 120
g
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 14
ctctagaacc cttcaggtag actacattca ctttctacta caacttcatc accacaacca
60
wctcccagta accccctttt tttcttctcc tttttttatt ttttccttct ttttgctcgt
120
c
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 15
tcccatgggt tgaaggatat ctggcagacg gctccaactc cagtaaagcc
tcaggcctca 60
rccaggagtt ccccggggct tcattcccat cccagacttt gcccagggct
gatttgaaag 120
t
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 16
tcttccttgc agattggatg gctgtagcct cacctcacac tgttgctggg
atctgtccac 60
rcttctgacc tccagcaaga gcctccggga gctaagcctg ggcagcaatg
acctgggaga 120
t
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 17
tattgctagt aaagccaaac tttctattcc acaattataa actcatggag
atggtaatta 60
yagtgcatta tttgtcaaat tttattattt tttcaaatcc caaagaaaat
gtgatattct 120
a
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 18
aagaacaagg atacaatcta agtgataatc atccagcatg tacttgtcct
gttttcagat 60
katcagctta agtcaagagg aatttttagt gcttacaaat atttcaagtg
atttttccag 120
a
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<212> DNA
<213> 狗
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tgaaggggtg ctactcaggg ctcttcattt aaccttccag gatgttttcc
tatgtactca 60
ytcttccttt tggttgctcc ttcttcttgc atttctttat ctctttacag
aatcatccag 120
g
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<212> DNA
<213> 狗
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acaaccctaa aatttcagtg attcagtaca acaaaggttt attataacca
ttcagggatc 60
saagttggta gaaacttcac tacaatacct gcttccagtc aacaagacag
aaaaagaaaa 120
a
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<213> 狗
<400> 21
gcagggttga tatataacta gtatgcatta ggtagacacc tattttgatt
actcactatt 60
ktaatatcag cctggtagta agaaccaaat ctattatgta aagtgcatag
agaattgaaa 120
g
121
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<212> DNA
<213> 狗
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ctagctagcc acccaactcc ccacatgccc agagtcatcg tttatctttt
cacatcagca 60
ytacattttg gcttgcattc aaacattagc ccattttttt tccttttgtt
ttatttatag 120
a
121
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<213> 狗
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ttttctcttt ttccataaat gctctgggct tattttcatt atctagtatt tctcttctga
60
rgctaactcc caaagagttt tgtgcatcct tatttccatc acaaggtcaa
tgtacgagtt 120
a
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 24
gggcccaagg gctgaggatc tctgtacctt ctgcttcttg gcagcccagg
ctgggtagca 60
kttcttggaa gaggatttcc catgagttgt taacagaagg gcgggcttcc
aggcgctgct 120
t
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 25
catctttgct tggggcctgg ggtttttatt gaggattgtg atctggtgta
tgtgtctcct 60
yaggcatcca gaaaccattc agaacaagaa caagcgtcca ggtatcctct gtaagtcact
120
t
121
<210> 26
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 26
acaaaccctc agacccagat acacagtatc atgtggacac agacatgtaa
caccaaaatg 60
mccaacatca tgtgactaca ggccctaagc aactaggtgt aacatcactt
gggtatgggc 120
c
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 27
aatgcagtaa tacatgtagc taaacctaac catcagagtc tgttctatcc
ttctacaaaa 60
rtagggttgg agctgagcac ataggtagca tacatctagc aaaagttttt
gccttcagat 120
t
121
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 28
ttgtggggtc aggtgagtta tggacccctc cctactcttc tgctatcttg
ccccctacag 60
kggttgctat tttgatgtaa tcacaaaacg acctggcaat aaaacctttt
tctaattagg 120
g
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 29
gatgcaagct gggacagaat aaggtactgg gctgtgtcaa gccccagtaa
gagaggagca 60
ytgtagggta gttaggatgg acttaatgga gatgagtcct agggagccac
actcagagtt 120
a
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<213> 狗
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taaacacccc caatcactac catcctcaca cctaaggata cacaatgtgt
ctactttatg 60
rtatgtcttt actattcgtt gcttatgaaa ttttattcat tawctaaaac
agggaaaaaa 120
g
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<213> 狗
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tatagytggs caattaaatc tcctattctt ttgtctcaaa ggatatttga
aattacatag 60
ytcttttctc atataaaacc taccatacaa tcattagatg atccttctta
gttaattttt 120
t
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<212> DNA
<213> 狗
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gatgctgtgg gccagtccag aacccacctg agagaaacaa acaggcctct ttgccagcag
60
rgcagcgtca gtgtcacccc tgtgacatgt cagaacctcc ctgaaagttc
atctaacctc 120
t
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<212> DNA
<213> 狗
<400> 33
ggctcagaag aaaaatcagc ccagttcaca tccaatgttt ccacacatct
aatcgtcttg 60
rgttcagagg tagatgtggt atcacttaya tggacacata taacagctgg
cccccacctc 120
t
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<213> 狗
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gtttcagtta attatagtcc ttactggatc cgattgctgt ggcgctaaaa
tgaaagaagg 60
yagggtacct gggtggctca ggggttgaga atctgctttt gactcaggtc
atgatcccag 120
g
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<212> DNA
<213> 狗
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cagagtagca ttattttctg ctgtatgagg acacttttgt tatatccaca
gtggacagaa 60
ractgggttt tagaacatgc tcaattgaaa caagactgag ggctcacaaa
ttcctgctcc 120
a
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<213> 狗
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ttacttattc atctgagacc aaggccactg tggtgaacct acaaagcctt
acaaagcagg 60
rccagaaggg cacataaatc acttgactaa catttggtca aaatagctct tgggctcttt
120
t
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<213> 狗
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ataaaaataa aagagctatt aataagaact cataaaatct acataaatat
agtaacaggt 60
yaatattccc agcatatttt tacaaatcat ctataaagag catgagagca
tatagggatt 120
a
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<213> 狗
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gcaacaacct ggtttgtgtg tgggaagcta atgcctcccc aaatgcagca
aactctcctc 60
ytgattttag aaaagcagtt tagttacagg caaatgcata catgcatgat
aaatactact 120
c
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<213> 狗
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gattttataa aacatgatga ccttggcatt tatatagtag atattactac
tctgaaattc 60
saggaagtat gatcataaac tcacacttaa tctggtagaa gtatggacaa
tgtatcaaag 120
g
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<213> 狗
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cttggttgag ttaaaacatt tgcccatgca atttaatgca tgtccctgtg
gggttggaac 60
ygacgtacac ccgagccaac agcctttcat ggcagacgcc atcaggcagg
tgacccccac 120
c
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<213> 狗
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ccttccacac gctcaggttg gcacggaggg ggtgtccttg cctgaggggt cctggcacag
60
ycatcagggc acacagctga taacccaagg gagcagtagg caagacctca
tgggcgccgg 120
g
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attctctttg ctgtctcctg tatacagaga taaaagcaag agttttcccc
ttcaggtttc 60
ygaaacccag cttcctttag attttaaggg gtattctgtg tacccatttc
ccaccttctg 120
c
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gcgggttggg accccccctt ctgctgctcc cacttcagag ttgtggcgtc
actaagatga 60
sacctcatgt cgggaacctg agagtccctc gggagttgtg cagggactgt
agccgaccta 120
t
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acatatgcac agtgaatcgt ggattgttgt gtttgatttc ttacatgata
caataaaagg 60
raagtagttg aagcaaaact ttagtttaaa ggaaacaatt tctctatcat
aatgttcagt 120
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<213> 狗
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cccacagacc ccaggtgctg accacagcag ccacttgggc ccccaatgca
ggagacacct 60
ygggaatgaa ggggacaagg ccagctcagg cacatcgtca gtgcacctga
tgggaaggcc 120
g
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<213> 狗
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atctgatcct agccaatgga aagcaatttg agataggaat catatcttgt
tttggtttat 60
rtgctttctt tggagttttg cacatcatag ataactgtaa atttgtagaa
taaatgtttg 120
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<213> 狗
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gtcaatgcca ttaacctggc gaagctgctc gagcatccac tgcgatctcc
gcacgaacga 60
ygtggagcct tcaaactgtt tgaccttcgt gatggatgct tgtgtgggtt tcttgtttgt
120
c
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<213> 狗
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actggttaat aagacttcac agattttatc catcatgttg attatctgta
tatgtatttt 60
ytaccactta ggataaagtt ctgttatctg taattgattc caaccagcat
gtttgctcca 120
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<213> 狗
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cttcttcttt cccattggat tctttcatca atcgtaggta gttcttaatg
aagatctgtg 60
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ataaccttta 120
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gggacacatt tctggacaga cctctgatca cactcacagg acagcaagag gaagctctgg
60
rtacaagtac agggaaaaaa gaaagaaatg gtcacaggga agctgccgca
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gggcagatcc tcagtgagta ttggctcatg ttctccgagg gaagtagagt
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<213> 狗
<400> 52
tcatctccat ttgtaataga aaccacatat atagagagat tggattatta
accactaaaa 60
ygtagccact caaggggagg gggggaatgc atttggttta tttcccatgt
caaaacagaa 120
t
121
<210> 53
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 53
aacactgcta ataaatattt ataatggttt gaggaaaata tcaggtgtga
gatgtcttca 60
yatcatataa tatatcataa tatcctctaa aaaagctcta agcataggtc
tatggaactc 120
a
121
<210> 54
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 54
aagcaatcca ggagtctttc tccgggtagc aggctcgctt tacaggttaa
ggctggatga 60
raaggaagaa cctgagcttc aaattatcat ctgagtagag ctgataccca
tggttacatt 120
a
121
<210> 55
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 55
gattttattc tttactttga ttttttttaa gttttactat gatattcaat
atgattgtgg 60
ytcatgagat tcctcttttt agctgtatca ttaactacag agcgttctca
aatatttttc 120
t
121
<210> 56
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 56
gtggccggag ggggtgggcc ctactgtggc ccagcttcac gtcccactgg
ccaaacatca 60
rgatgcagac acccaggtcc cttgtgctgc ctgctgaggc taggagcagc
gactggaaat 120
g
121
<210> 57
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 57
gatgggagac ctcatacaca tgcaaagatc actattaaag actctcgagc
aaagatcgaa 60
yggactgtgg caagctgccg cgcatgccaa tcaacaaatg cctccgacca
tggatctaac 120
c
121
<210> 58
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 58
caacaaggtt tttaaggttc ttttcactac cttcttcttt ttgtacttgc
ttaggacacc 60
ygtatgtctt cacaatatca cctgaaagtc ctttaggaga tatactcaaa aaataaataa
120
a
121
<210> 59
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 59
caacctgagc tgaaggcaga cactcaactg ttgagctacc caggtgtacc aaacacatct
60
rctcttaacc aagcttattc tttgctatat ttggcaaatt gtggcatgtc
tacagtactc 120
a
121
<210> 60
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 60
attccccatg tttgaggaaa tcacaggagc cactaggaaa tcaaccattt
cccaaccaac 60
ytgatgattt cctgatccaa aggttctccc aggacaaata tgaggtagcc
tttcacactc 120
t
121
<210> 61
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 61
cagtcttgta ggagagtaga ttgactcaca gaactggcaa gattgggaat
ctgagcattg 60
ycacttgagt cttaaaacgt ttacgatttt atttctagta tttcaataag
aaacacattc 120
t
121
<210> 62
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 62
gaatacattg ccagaataat ttcaagttct caaatctcaa ctaataagat
tttcgttaaa 60
kaaggcattc aatcatcact tactgacaac ccacaaaatt aggcactgat
gaaaaattag 120
c
121
<210> 63
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 63
aagttaagat attcaagaaa gagaagagag tgactgagct aaaaagaaaa
tcagatctct 60
yccaggcttt aaaataatct ccacaatact gggcaatcca tgtagtctcc
ccagttccat 120
t
121
<210> 64
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 64
ctcaaaagga aaagcctgtg gaaaggcaaa gaggtatgtg aaagaggtaa
gttcaaaatg 60
stgacatgac cagtgtacat agattacagg gtacttggag gagcagtgag
aaaggagtcc 120
a
121
<210> 65
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 65
ttctatgaaa tagctaccat tctggttggt atcttctgtt gatttagatg
atgaaggaag 60
yataagaagt aaggcttatg agtttataaa gctttagtta aagctttgat
tgtgacaaag 120
c
121
<210> 66
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 66
agaggagaaa acacagctaa aaactttttt acagactgga caaaggtgct
tacacttttc 60
rtattgggca gaatgagggg atgaaaacac cagtggtctt tttgaagcca
cacaaattca 120
g
121
<210> 67
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 67
aggatgaata tttattaaca gtaaatatac atttttattg ttctatatac
tctaaagaca 60
rttgtagaca gtaagatata tcaattttag aaacagaaat aatgttaatt
gtataatatg 120
g
121
<210> 68
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 68
cagggattcc taaagggtga catggtatgg tctaacactt cctcactgtc cttttcccag
60
mtgatataag aggaggacca gagagacaca taaactgtct gagtctttag
cattgtgata 120
a
121
<210> 69
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 69
acactaatgg gtagagaata cacgtccatc agtcatcaat gtaatctact
aacagcctca 60
sagtctggca gttttcagtg aaaagaggag tcatctccat ttattcgatc aatcagttga
120
c
121
<210> 70
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 70
tattaccctg ctctccagcc actcctttac cttccattag cccacacctg
ctctacacac 60
yattgctcat ggaagccttg ccacgtccag tcgccactct gaaatgccag
catccctccc 120
a
121
<210> 71
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 71
tctcagatac ttgatagcca gcatttcccc ccattttctt ccaagagcac
gaaagcatag 60
raatgatatt acatctcgta tggtgaatgt gacacagccg tcagttgcgt
tagctctgct 120
t
121
<210> 72
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 72
acaggaagga gaactgagca tcaagagagt tcagaacatg atcattgggt
cagtttgtgg 60
stgcattaac ttttccccaa aacagaaagc aacagagact tctgtaggtc
agtcaacagt 120
g
121
<210> 73
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 73
ttaccattac tataacccaa gttatagtat actataacca agtccttaat
tgacttgatg 60
yttgtgcagc tgattttaaa tctatttaga ataatagttt acttgtgaca
attcatatta 120
a
121
<210> 74
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 74
ttggtcgact gactgattgg ttttactgtg gaggaaagaa aagggaattt
tcccaaagag 60
racagagaga aaacatggaa ttgagcaaag ggagaataga gagacagggc
agccactgaa 120
g
121
<210> 75
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 75
tgccttatcc tccagctcct ccctcaccat cttggaaact agctcaaatg
tcactggtac 60
ktgtctttct tttgatcttt ctgaaagaca aacatgatcc catcacctct
gcctttagaa 120
c
121
<210> 76
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 76
actcctaagt aaaagttaaa ttaacagatt tgccatcaag taccttgccc
atttttccta 60
yagatcgact ttttactgga tgatcccctt gataataatc ttgatctatg
ttttaattcc 120
a
121
<210> 77
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 77
ctggtgggct tgtcaggggc aggatgttgt gtggtgagca cagaattaaa actaggagct
60
ygaagcgcct ggggggctca gttggttgac ggactgcctt catctcaggt
catgatccct 120
g
121
<210> 78
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 78
catacagcga agagataaaa acacaggatg ctgggctcac gaccatgacc
ggaaaaggac 60
rgcgaggaaa agcaagtatg agcagcccaa agtccttttt ccagcactgg
ccataggagg 120
a
121
<210> 79
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 79
cagagatgag gaatcagact cctcgtcctc tgcttctcta caatggctca
tgttctcctt 60
ycccctcagc tgttgcatta acagaggtca acccattctt ctaaatttaa
atctcccaga 120
a
121
<210> 80
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 80
aatcaaacaa gtgctagaac atagaacaag tggctcatct tttccccaaa
tgtctggata 60
rgaaaaaaaa aatctaaaca aatgctagat gttaagtatc tgaaatgatc agcccatgaa
120
a
121
<210> 81
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 81
tccataccag tccttgttgt ctaccccgaa cttcacctct ctaggcacag
acagctctaa 60
mtttcactca taggtatctt atgctgacct ggcctgcctc ctgttttgtt
ttgttttgtt 120
t
121
<210> 82
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 82
caaaaaattc cctgagccca gcatcaaggt acctggtttg gagtgggtgg
gtcctcagaa 60
mgaatgggtg tggtgtacat ttagcaagtt atgtagcatg tgtctgtgta
gtctcacctc 120
t
121
<210> 83
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 83
gggcccagca agtggcagaa ctgggaagac cccctcttct tccgcctgga
gcagtggtgt 60
rgcagcacac cacaggagtc tgaaagggtg gggagtccaa acgggaacat
atacctgaga 120
t
121
<210> 84
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 84
atataatata acttatttaa aatatttgaa gatatttcta tagttatgct
ctaccatttg 60
ytattataag atttccaaca gcttacttct tgtatgaaat taatttacca
gcccctcacc 120
t
121
<210> 85
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 85
ccctattcta taaacattcc ctctctggcc atcctgtcaa gtgggccctg
acagtgtgcc 60
scagaagctc cctagccttt gcccattcca gctatggcta gcctgccacc
agccatacac 120
a
121
<210> 86
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 86
cactgtgagg tctgaatgga gacattcatg atagactcca ggattttccc agctattaag
60
ycatgggcca taaactggaa cacttggaaa cagtccatag gttcatatta
aagaatatgt 120
t
121
<210> 87
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 87
gcaaaaggaa catgagttct gatcttctgt aaaggaggct aatttactaa
tggtcataac 60
ygtggcctga gggtcaagtt tctaattaaa cgtgcatctt ggggyggact
agaatacttt 120
c
121
<210> 88
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 88
caaggsccag gtaccctgaa ggagtccgct tcacccaggc atgatgtgtt
tgacagtctt 60
ygtaattgat acagccattg gcatcctctt gcggccaaya tcagctccac
ttcaacctcg 120
g
121
<210> 89
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 89
tgcaatgggt tttgaaatta gaggacatca cagcagagta gaatggtttg
gaacagggga 60
rtatgattag gattaatgag atgaaagaaa attctggcta gagggctaga
agagccatgg 120
a
121
<210> 90
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 90
ctcagaacta gataggctaa taagtgatag gccttgtgtt ttcctagagt
gtgctttaaa 60
rgtttcttaa gctaaaaaat tacattcgtg agaaaattga aataaaagga
aaacagtcat 120
g
121
<210> 91
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 91
gatactttgg gctctgggtg ggagccagca gtggtggggc agggcaggag
tccagcaagg 60
ygtctgggca tacatgtctg agagtaggaa aaccacacca ttgcaccttg
cctttgactt 120
c
121
<210> 92
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 92
tcaaggatca gaaaaataaa agcaaagaaa gaggcaaaga aagaagaaat
gaaataccta 60
rtggcagaag taggcagaga aataaaggct aaaagaaaat ggcagaggat tgtttgaaag
120
g
121
<210> 93
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 93
tatgttatac tattttagta tcttaataaa tatgattagc caaaatagtt
ttatcatcct 60
saaaagtgca gcatatatta ttttctatta aattcagaat aggtataaac
tagaaagcat 120
t
121
<210> 94
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 94
acagcagttc tgaggatgga ctcgcagagg ctcctgacaa gcagaatgac
caggccgagc 60
rgaaaggtca gtgctgccag tctagccaga agtgggggag agaggatgta
ggagcagtac 120
t
121
<210> 95
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 95
actgtactca aaaaagttct gtttgcctaa atgggatcag cctctaatgg
atgccagtga 60
ygggaggctg ttcatcatcc cttcgggata attcagagcc taggcagagg
cccagcgttc 120
a
121
<210> 96
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 96
tacaggcccc aggaaggagc caccagatgc ccaggactgg gcccaggaat
gatggaggct 60
rtacagctgg ctgcctgcac tggctgccgc ccctgtcatc cagtgtcaca
gagcagcacc 120
t
121
<210> 97
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 97
agacattgcc aagaagtatc cacaatgaac agtttgaagg ggatccagaa
aagcacaggg 60
yctacttccg ctggatgagc agcagtgaga accacagtca ggtaggtctt
aaagcaaagt 120
t
121
<210> 98
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 98
gctttgaaaa ccaacaggaa atacatccag gaaagctata caactgtggt
gaaaggaaag 60
raaaatctgc tcttaaaagg ttgtgtgcag actcacttgc cccagaaacc
agtgcgaaaa 120
c
121
<210> 99
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 99
gagatgtgta aaatttaata gaaatgaaac ttgccaaaac agacctctgt
actcgtcagc 60
rttctaagtc catctttctg tagcatgtaa gtagaataat gttctattaa
tttcctctat 120
g
121
<210> 100
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 100
gttctttcta ttctatcaca cataccaccc ccctgcccac agtacccctt
tctgccatgt 60
ytcagactcc tacacaagag gttctctctc ctggcttcca gttagacagg
caggtaaagc 120
t
121
<210> 101
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 101
taaaaaaata caacagtagc attagaagac atgctaagcg gctgtattag
agaaggttag 60
ygctggcctg aagtttagaa accttccctt ctcttttttt ttttccttcc
cttctcttta 120
a
121
<210> 102
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 102
tcaagagtac tagagcatct ataatcaatg gtaaattggg gaactagtga
aacaagttta 60
yaggacaaat aacataaata aggatttttt tttaaatttg gaaaattgtg
gaataatgat 120
a
121
<210> 103
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 103
agaattcaat tttggggagc caggaaacca gattagtttt ccaaagggaa gtgccatttg
60
yatctatccc ggtggggctg ccaagaattc cctggggtgg gagacggcgc
ttctgtggat 120
t
121
<210> 104
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 104
caccagagag ccccgcaaga tcatactgca caagggctcc actggcctgg
gcttcaacat 60
ygtaggagga gaggatggag aaggcatttt tgtttccttc atcctggcag
gaggcccagc 120
t
121
<210> 105
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 105
tggtgatgat ttatccccca tgttcaagat ttatcctccc tgtctcaaga
aatcatgtca 60
ytacaggcat ccttaaagtc acaagactgg gaagtaaata ctgatgaggt
ccaagacctg 120
g
121
<210> 106
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 106
agcatagtgt acccacatat aaggtcacat ctgaggccag ggagtcgggg
tcttgaagat 60
katgactgat catgtgcttg aggatgatga tgatcatgtg cttttcctgg
ctgtgcagtt 120
g
121
<210> 107
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 107
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtttaatt ctttgtgaga agcccctcat
tttgacctaa 60
rtttggtaga ggccccaggg gatctgagag gagaacaaaa ggataaacca
tttgctgttc 120
a
121
<210> 108
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 108
ccaactttca ctagcatcac agcccctatc aatctctgtt cttttttctg
tcagtaccat 60
rtttgctcct actacatcya atctgtgagc tcacaggatg aggaccaaca
gctgccctga 120
g
121
<210> 109
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 109
tgtcttacct ctctctattc ccttgtccat agtagtatta aatatatctt
cctgaacaca 60
ratctgatcc agtctctttt tgtaattaaa agcctttgct agctttggtg
atcacctcca 120
g
121
<210> 110
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 110
gacctgacag attatgtaga ctttgttttc aaagggagca cctgctggat
atacaacatg 60
rcactaaatt gtgctccaca tccttggcag aggtgggggg cggggcacaa
aggaagaaac 120
c
121
<210> 111
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 111
cagaggaaaa ggagaaggtc ccacttaggg gactggagag gagtggggga acatcaccag
60
mgccttcctg agccaggccc cctgtgggga gaagctctcc ccaggactgg
gtgcctttga 120
a
121
<210> 112
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 112
tcctccctct ccccatcccc attctcatgc aagtgtgctc tctctctaaa
acaccccccc 60
mcacacacac acacagacac aaccaaattt gggtctcaat gtcttgacca
aggaaaaggc 120
a
121
<210> 113
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 113
gagaagaagg aggagaaaga ggaaaagtat atttgatgga atgaaaaaca
agagttcaat 60
ytcactctgg tctggggtga ccactattag tccttcaaca tcttccttga
aggaatttta 120
a
121
<210> 114
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 114
ctggaattct gtcagatcaa cattcagagc tccatcaaat ctgagggaag
cagtgataga 60
rgatacaatt tgacctttca gtctattcag gttcatgtag gttaggcatt
caatatcaaa 120
g
121
<210> 115
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 115
ccacatgtgg ttacaccact gtgttatcct tccacctgtc ccatcaaccc
acccgcacat 60
rtcacagtgc ctctgtcctc aaagaacact gtatccaaca cctccacatc
ctctcagcat 120
g
121
<210> 116
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 116
attcctatgg tgggcgctgc acatttcctc ccaggggaag ggcaagggtc
ctgcatttct 60
rtgctttcca gggcctccgc accaagagca attgctaggt cacgcatgcc
cctgcacttc 120
c
121
<210> 117
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 117
catgtcatca ctaactaatt tattaacaag agttttattc tttgaaaaac
aaaatcactc 60
rcattactca gttgcttatt ccttgattca tatacaaatg actgataaca
tgagataaaa 120
a
121
<210> 118
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 118
gatgatttag ttgtttgaat gatctggcat ataaatcttc caaatctgtg
tccattggat 60
ygcttacagt ttaatctttt tatttcttcc cagaatcaca ttttttcatt
atttatcttt 120
g
121
<210> 119
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 119
agttaaattc tgtgaataac tagaatccgt tatacttttt ctgaaatgaa gtctgtaggc
60
wtttcaacag caaaaggaat tctgwtttty aaaactatac ataatgcttc
ttaaaagccc 120
t
121
<210> 120
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 120
aatgccaact ttaaaaacgc attcaaggtt ttcctctgta aatgcattcc
tcattttgga 60
ygtgatgtaa aatcttattc agtgttttgt ttttttttcc ccccacaggt
ctcaacaatt 120
a
121
<210> 121
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 121
ggtgggaccg gccatcagca ggcgggccag cgccccacag atgttgtcac
ggacccgatc 60
rtggcgctcc cgtgccagga ggggcaacag aagccccagc agcttgggga
agtatctggt 120
t
121
<210> 122
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 122
aggggacttg tgctaatcac tgggcaaatt ttatgaactt ctgaatttta
aagcaaaaga 60
raaggtgaaa gaatggaaag aaggtgtgag tgtttgagga aaacttcttc
tttggggttg 120
a
121
<210> 123
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 123
tacacaagca aggcagtatg ccctgtctcc ttcccttggg ccacctgcac
ttagacatgg 60
yaggttccag tgatgtgtct agtctctagc aagcagggct tgcttctgct
ctatccatcc 120
a
121
<210> 124
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 124
ctgtccttgg tctggacctg ctgtgaagac caagtgcttc ctgagatctc
tctgagtcta 60
rtttccagag cagtgagtga gaaatgaaat gagccgagga ttgccctccc
tcctatggac 120
t
121
<210> 125
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 125
taagccatca gcatgggctc ctaggggtct gttcaactcc cttgtggtgt
cttactgctc 60
ragcaaagga acagtctggt acagtgggag caagagctga ggttggagag
tggggacaca 120
g
121
<210> 126
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 126
gaggaggtgg aagtgattaa gtttaaaatt tctggggtgg tttctggcga
catgaagctg 60
mgagctagaa tgcctttcaa tctcataatt tctttaattt ggtgattata
ccagagccac 120
a
121
<210> 127
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 127
cctgacaaac actacctctg ctcttcaaaa gcaataagca tttattctgt gacacattta
60
ratacaaagt caattacaat agagtataag tacaatacta gggaaagtac
aaagtcatay 120
g
121
<210> 128
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 128
gcatgatgaa atcagaaaaa gtatgtaagt ttctagaaga agctagatat
atggtaactt 60
wggtcaaata gaaccatgta gtgaaaagaa tatgagtttt caagttcaat
aaaaaacaaa 120
a
121
<210> 129
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 129
atgcataagt ttccaaaaga gttcaggatt ccaaaataaa agcttcacta
aaagattcat 60
mgcaaaagag taatgaacaa ttaaagtcat aggatatcta aaatgaaaaa
ctgttagact 120
g
121
<210> 130
<211> 121
<212> DNA
<213> 狗
<400> 130
agatggctta gttgtttctc tttcctcctg aagtccacag cttagttact
tggactctcc 60
raaataggat cgttggacat ttgaggaaag ctctagcatg aaagccatag
actaaaaaac 120
a
121
<210> 131
<211> 283
<212> DNA
<213> 狗
<400> 131
ctctcatttt gtgtattgat ttgaggactc tgtccttttt gttctcttag
gtgttttgta 60
accatttttg tggttcttgc cacaaaaggc cttatgaagt cctgcatatg
agtgatgtgc 120
aggacaactt tgactttctg acagccagtt tttgtgtttt gttmccttag
ttcccaagtt 180
cctatcttgt ttacctcatg atcacatttt aatatcaatg aaatttgtag
gaaaacagca 240
gaaggaaaga tataaggtta ctattctcta tggaccttgg
ttg
283
<210> 132
<211> 223
<212> DNA
<213> 狗
<400> 132
ttgcagatta tatgataaat atagttgtag cttcaaaaat gactataacg
aacagaaaaa 60
aattaactta tcaaaaactt ttcaaatttc cccatayact taactaggta
ggccacagag 120
tatgatagta tgcaagttat taaaatctgt tagcaaggca taacacatat
atttctactt 180
aatgaggttt ctataatcaa ggcttgtcaa gtccattatg
ttc
223
<210> 133
<211> 157
<212> DNA
<213> 狗
<400> 133
tcagactgaa tctaaagcca catatatttc ctcagcagct gataacatta
gaaatcagaa 60
agccactaty ttagctggca ccgcaaatgt aaaagtaggc tctaggacgc
cagtggaggc 120
ttcccatcct attgaaaatg catctgttcc
taggcca
157
<210> 134
<211> 179
<212> DNA
<213> 狗
<400> 134
tcttgtgctt gttctttatc accattcatt cagtacatcc aaattttgaa
atccttagag 60
ctctatagcc tctatgtagg agaatgarat ttcatcaaaa ggaaatattt
tgagaattta 120
agtgattttt ttatgatatt ttagctatag cagtcacctt gagccaaaag
acattctac 179
<210> 135
<211> 191
<212> DNA
<213> 狗
<400> 135
aaaaatatac tctctttctt acagaaacct ctaataattc agattctggc
catgaagttc 60
aggaggattc ttcaaaggaa aatgtatcat caagtgctgc ctcyactgac
cacaacccaa 120
cacctactca tgatggcaaa tcmcmtraac tgtytawtyt csgattggrr
awtmaaykgt 180
traggaatga
a
191
<210> 136
<211> 244
<212> DNA
<213> 狗
<400> 136
tttgcccaag aaaaatgaag acctatgacc atggaaagac ttgatacata
atgctggagt 60
actagtagtc agacccaccc aagtcttttc acgtgttcat tcagtataga
tgcggcacac 120
gttggctgag tccctccgkt gtgtcaggaa ctgttttagg tattggggat
gaagtaggga 180
acactgattt agsttctgtt tattcatgtc tcactttgta ggaattycmh
tamatagaar 240
aada
244
<210> 137
<211> 251
<212> DNA
<213> 狗
<400> 137
tctcagtact cacaggtact tacaaataca acactaagag gtttcacaaa
acagtactct 60
tacatagcac atgctgtact ctctgttcca ttctatttta ttactatttt
aaaatatgga 120
ttgtgatytg ccaakttgat tctctggccc attaatagtt tgaaaatctc
ttctgtagga 180
gtataggaat taccacagag ttttgagaaa ttgatgaatg ccacgcttta
cctgtgggaa 240
cgtagattct
a
251
<210> 138
<211> 191
<212> DNA
<213> 狗
<400> 138
cagatgatga gtctggagct ggtgatctgg gctggagata atgaacctgg
gagtcatcag 60
ctttggagaa agggtgtctg gcctcactct tgctwgcaca gaaagaaagt
gctcattagt 120
gtcaactctc agcaacactt ggtatttgta aactttaatt tttgctgact
tcatggagaa 180
ataatgtttt
t
191
<210> 139
<211> 206
<212> DNA
<213> 狗
<400> 139
taatgataca gaaatgaatt tggcaggaat gtatggaaaa gtccgaaaag
ctgctagttc 60
aattgaccag tttaggtaag caagtgcagt actggtgagg aatggkgcat
cggctccttc 120
tgtgctattt tccggtggct ccagtcacag ccccatcaag cagagctgat
acctaaagtg 180
acatttaccc tacttcctct ctcaat
206
<210> 140
<211> 186
<212> DNA
<213> 狗
<400> 140
catcacttaa aatcatctca gcaagtgttg ttgaagatga ttttttataa
agtatattcc 60
aatcttattc tatacttcag aagcttggaa ttctyatttg ctttgctgga
ttgaaaaagt 120
ctggaagtaa ttagaatgac ttctcatact cccaccttga attctcctaa
tatcaaaggc 180
tgggag
186
<210> 141
<211> 171
<212> DNA
<213> 狗
<220>
<221> misc_feature
<222> (169)..(169)
<223> n是a, c, g或t
<400> 141
atatggagaa atgagctctt atacactttc agtggacatg taaactgtta
ttgtcttttt 60
ggagagcatt tggcaggatc tatcaaagtr cacacatcat ttgattgagc
aattccactt 120
ccagccatat tctggacata atttacaagt ataaaaagat gcatgtttng
a
171
<210> 142
<211> 213
<212> DNA
<213> 狗
<400> 142
aaatattgaa agtgctttat ctacactcca atatgtaagc agcatagtag
tttctttaga 60
gaatagatct gccatagtaa agtacaatgc aagcttagtc aytccagaaa
ccctgagaaa 120
agcaatagag gccatatcac caggacaata cagagttagt attgctagtg
aagttgagag 180
tacctcaaac tctccctcca gctcacctct
tca
213
<210> 143
<211> 125
<212> DNA
<213> 狗
<400> 143
ttaaaataac tacttgcagt gatttctttc ccccagtata aaatgtcagt
tttgtctcaa 60
tccacccyct tcaccttaaa aagaaaaaga aagtattagt tttcagtgtc
atttgcctta 120
aaatg
125
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)正向引物
<400> 144
agcttgctgg tgaaaaggac
20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)反向引物
<400> 145
ttatagtcaa
gggcatatcc
20
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 金属硫蛋白(MT1A)正向引物
<400> 146
agctgctgtg
cctgatgtg
19
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 金属硫蛋白(MT1A)反向引物
<400> 147
tatacaaacg ggaatgtaga
aaac
24
<210> 148
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白S5 (RPS5)正向引物
<400> 148
tcactggtga
gaaccccct
19
<210> 149
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白S5 (RPS5)反向引物
<400> 149
cctgattcac
acggcgtag
19
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白S19 (RPS19)正向引物
<400> 150
ccttcctcaa aaagtctggg
20
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白S19 (RPS19)反向引物
<400> 151
gttctcatcg tagggagcaa
g
21
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白L8 (RPL8)正向引物
<400> 152
ccatgaatcc
tgtggagc
18
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体蛋白L8 (RPL8)反向引物
<400> 153
gtagagggtt tgccgatg
18
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Ai)正向
引物
<400> 154
ctacactcca atatgtaagc
agc
23
<210> 155
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Ai)反向
引物
<400> 155
aggtactctc aacttcacta
gc
22
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Aii)正向
引物
<400> 156
aaacatcaaa ggctcctatc
c
21
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Aii)反向
引物
<400> 157
ggaaagcaaa gcgtattatc
g
21
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Aiii)正向
引物
<400> 158
agtatgagtg
tggattcggt
20
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP酶, Cu++转运、α多肽(ATP7Aiii)反向
引物
<400> 159
tttggagtct gtagtttagg
gt
22
Claims (10)
1.一种包含4.5至12 mg/kg干物质浓度的铜的食品，其用于制备一种套装，所述套装用于在具有拉布拉多寻回犬品种遗传特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病。
2.根据权利要求1的食品，其中预防所述狗中由肝铜积累导致的疾病包括向所述狗提供所述食品，每天一次或多次。
3.根据权利要求1的食品，其中预防所述狗中由肝铜积累导致的疾病包括在所述狗的一生中持续给所述狗喂食所述食品。
4.根据权利要求1的食品，其进一步包含至少120 mg/kg干物质浓度的锌。
5.根据权利要求1的食品，其包含4.5至10 mg/kg或4.5至8 mg/kg干物质浓度的铜。
6.根据权利要求1的食品，其包含120至250 mg/kg或150至250 mg/kg干物质浓度的锌。
7.根据权利要求1的食品，其用于制备一种套装，所述套装用于在具有下述特征的狗中预防由肝铜积累导致的疾病：
(i) 具有至少一个亲本是纯种拉布拉多寻回犬；
(ii) 没有与肝铜积累相关的临床症状；
(iii) 具有低于400 mg/kg干肝重的肝铜浓度；和/或
(iv) 没有可检测到的肝疾病。
8.根据权利要求1的食品，其用于制备一种套装，所述套装用于预防铜相关慢性肝炎。
9.根据权利要求1的食品，其中已通过以下方法测定所述狗受到免于肝铜积累的保护或易患肝铜积累的可能性，所述方法包括对来自所述狗的DNA样品进行由SEQ ID
NO:42的102位置表示的SNP ATP7a_Reg3_F_6的直接或间接分型。
10.带标签的根据权利要求1的食品或套装。
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