JP2016116533A - ムコ多糖症におけるcns病変を処置するための治療戦略 - Google Patents
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MSCPVPACCALLLVLGLCRARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNEL(配列番号8)を有するコードされたヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列である。そのような配列は、配列番号7nt配列によってコードされる。5’-ATGAGCTGCCCCGTGCCCGCCTGCTGCGCGCTGCTGCTAGTCCTGGGGCTCTGCCGGGCGCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAGCCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTGA-3'。
SEQUENCES WITH FLAG(専門家は、フラッグ配列を任意の他の好適なスペーサ配列で簡単に置換するものとする):
a)アセンブリhAATsp-SGSH-3xFlagカセット(1611)(配列番号11)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGTGA-3’
b)アセンブリhIDSsp-SGSH-3xflagカセット(1614bp)(配列番号13)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGTGA-3'
c)アセンブリhAATsp-SGSH-3xflag-ApoBカセット(1734 bp)(配列番号15)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATCTCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'
d)アセンブリhIDSsp-SGSH-3xflag-ApoBカセット(1737 bp)(配列番号17)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATCTCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3’
SEQUENCES WITHOUT FLAG:
e)アセンブリhAATsp-SGSHカセット(配列番号19)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTGA-3'
f)アセンブリhIDSsp-SGSHカセット(配列番号21)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTGA-3'
g)アセンブリhAATsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号23)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGATCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'
h)アセンブリhIDSsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号25)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGATCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'。
SEQUENCES WITH FLAG(専門家は、フラッグ配列を任意の他の好適なスペーサ配列で簡単に置換するものとする)
a)hAATsp-SGSH-3xFlagアミノ酸配列(*=終止)(配列番号12)。
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITMKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK**
b)hIDSsp-SGSH-3xflagアミノ酸配列(*=終止)(配列番号14)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK**
c)hAATsp-SGSH-3xflag-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号16)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKISVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
d)hIDSsp-SGSH-3xflag-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号18)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKISVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**、
SEQUENCES WITHOUT FLAG:
e)hAATsp-SGSHアミノ酸配列(*=終止)(配列番号20)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQ PLHNEL*
f)hIDSsp-SGSHアミノ酸配列(*=終止)(配列番号22)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNEL*
g)hAATsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号24)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKELQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
h)hIDSsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号26)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
キメラSGSHカセット、組換え核酸ベクターおよびウイルスベクターの構築
2つの断片、ヒトSGSH cDNA(断片I)とシグナルペプチド配列(断片II)からの配列のライゲーションによって、別のシグナルペプチドを生成した。断片Iを、hSGSH発現プラスミドから増幅し、(SGSH配列上位置61中のヌクレオチドに相当する)hSGSHシグナルペプチド配列の3’末端で開始し、固有のXBaI部位まで伸張し、全SGSH cDNAを含有した(使用したオリゴ: SGSHFOR 5’-CGT CCC CGG AAC GCA CTG CTG CTC CT-3’(配列番号28)およびSGSHREV 5’-GCG GCC TCT AGA TGA CAG CTC ATT GTG GAG GGG CTG-3’(配列番号29))。断片IIは、各発現カセットに関して固有であった。hAATsp-SGSH-cFlagに関して、断片IIは、ヒトα1-アンチトリプシンシグナルペプチド配列[ヒトa1-アンチトリプシンcDNA: 72bp]を含有する2つの特定のオリゴヌクレオチド配列(hAATspFOR 5’-GGC CGC ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT 3’(配列番号30)およびhAATspREV 5’-AGC CAG GGA GAC AGG GAC CAG GCA GCA CAG GCC TGC CAG CAG GAG GAT GCC CCACGA GAC AGA AGA CGG CAT GC-3’(配列番号31))をアニールすることによって合成した。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCT-3’(配列番号1)であった。
5’-ATGCCGCCACCCCGGACCGGCCGAGGCCTTCTCTGGCTGGGTCTGGTTCTGAGCTCCGTCTGCGTCGCCCTCGGA-3’(配列番号3)または最適化配列
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGC-3’(配列番号5)であった。上記の2つの配列は、コドン利用に関してのみ異なり、同一のシグナルペプチドaa.配列(配列番号4または6)をコードする。断片IIのオリゴヌクレオチド配列は、5’NotI部位と3’平滑末端部位を有する。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を、100℃にて3分間インキュベートした。RTに冷却した後に、本発明者らは、37℃にて30分間、オリゴにPNKを加えた。断片I(5’NotI-3’平滑)および断片II(5’平滑-3’XBa)を、p3xFlag-CMV14ベクタープラスミド(5’Not-3’XBa)とライゲートした。DH5αコンピテント細胞を、得られたライゲーション混合物で形質転換した。
HelaおよびMPSIIIA MEF細胞を、10%FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDMEM(正常培養培地)中で維持した。製造業者のプロトコールに従って、サブコンフルエント細胞をLipofectamineTM 2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培地をDMEM 0.5%FBSで置換した。トランスフェクションの2日後、本発明者らは、酵素アッセイとウエスタンブロット解析のために、馴化培地とペレットを回収した。
3×Flag Lysis緩衝液1×(50mM Tris-HCl、pH8、200mM NaCl、1%Triton X100、1mM EDTA、50mM HEPES)を細胞ペレットに加えた。溶解物を、細胞ペレットを氷中にて1時間、溶解緩衝液とともにインキュベートすることによって得た。タンパク質濃度を、Bio-Rad(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)比色アッセイを用いて決定した。馴化培地を、13,000rpmにて7分間、培地の遠心によって、vivaspin500(Sartorius)中で濃縮した。フラッグ化したスルファミダーゼタンパク質が、5%ミルク中1:1000で希釈した、抗FLAG M2モノクローナルペルオキシダーゼ-共役抗体(A8592 Sigma-Aldrich)を用いるウエスタンブロット解析によって明らかになった。
細胞を冷PBS中で3回洗浄し、15分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定した。固定した細胞を、冷PBS中で4回洗浄し、ブロッキング溶液(PBS中0.1%サポニンおよび10%FBS)で30分間透過処理し、適切な一次抗体、ウサギ抗h-スルファミダーゼ(1:300、Sigma)で免疫標識した。PBS中で4回の洗浄した後、本発明者らは、二次抗体抗ウサギAlexa fluor-488共役物(1:1000)とともに細胞をインキュベートした。次いで、細胞を冷PBS中で4回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地中にマウントした。
スルファミダーゼ酵素の分解速度を決定するために、異なるキメラ構築体でトランスフェクトしたMPSIIIA MEFを、1%ウシ胎児血清を補ったメチオニン:システインフリー培地(Sigma)中で30分間、30μCi/106細胞[35S]メチオニン:システイン混合物(EasyTag(商標)EXPRE35S35S Protein Labeling Mix、[3S];PerkinElmer)で放射標識した。十分に洗浄した後、細胞を、5%ウシ胎児血清の存在下で維持し、メチオニンとシステインを補った。細胞を、異なる時点で回収し、3×flag Lysis緩衝液を用いて溶解した。溶解物を、遠心によって清澄化し、上清を、flagに対するアガロース共役抗体(抗flag M2親和性ゲル、A2220 Sigma-Aldrich)を用いることによって免疫沈降させた。溶解緩衝液で十分に洗浄した後、免疫沈降物を、SDS-PAGEにかけた。乾燥させたゲルをPhosphorImagerスクリーンに曝露し、PhosphorImagerシステムで定量した。
ホモ接合変異体(MPS-IIIA、-/-)とヘテロ接合(表現型的に正常、+/-)C57BL/6マウスを使用した。したがって、用語「正常マウス」は、マウス表現型を表すために使用する。実験は、イタリア健康省により許可された、ナポリのカルダレリ病院の動物ケアおよび利用委員会のガイドラインに従って実施された。
生後0〜1日の新生仔のMPS-IIIAおよび正常マウスを低温麻酔した。ベクターを、側頭静脈を介した全身経路中に送達した(100μl中2×1011粒子)。成体MPSIIIAマウス(1カ月)に、尾静脈を介して注射した(100μl中2×1011粒子)。酵素アッセイのために、動物の血清、注射後異なる時点で回収した。肝臓および脳形質での形質導入を評価するために、動物を異なる時点で屠殺した。これらの一部を、PBS中4%(w/v)パラホルムアルデヒドで灌流/固定し、次いでGFP染色のために肝臓を取り出した。残りマウスを屠殺し、肝臓および脳を取り出して、SGSH活性を測定した。
SGSH活性は、Fraldiら、Hum Mol Gen 2007年に記載の以下のプロトコールで測定した。
肝臓組織を、ショ糖勾配(10%〜30%)にかけ、4℃にて30%ショ糖中でO/Nでインキュベートした。最後に、組織を、OCT埋込マトリックス(KaItek)中に埋込み、ドライアイスおよびエタノールの浴中でスナップ凍結した。組織凍結切片は10μmの厚さで切り、PBSにて10分間洗浄し、Vectashieldマウント培地中でマウントし、GFP解析のために処理した。
本プロジェクトの目的は、AAV血清型8の静脈内注射に基づく低侵襲性の全身的遺伝子治療戦略を開発することであった。本血清型は、高い肝臓向性を示し(18〜20)、(i)肝臓から多く分泌され、したがって血流中の循環酵素の高いレベルに至るように最適化されたキメラ改変スルファミダーゼをコードする遺伝子工学的に改変した遺伝子を送達するために使用可能である。スルファミダーゼは、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)など他のスルファターゼ酵素に比して、分泌が少ない。(ii)BBBを効率的に通過するように、スルファミダーゼシグナルペプチドを、IDSまたは多く分泌される酵素であるヒトα-アンチトリプシン(AAT)のいずれかのものと置き換えた。キメラスルファミダーゼを特異的脳標的化タンパク質ドメインであるアポリポタンパク質Bの(LDLR)結合ドメイン(ApoB LDLR-BD)でさらに遺伝子工学的に改変した。
新規処置の効果は、トランスジーンによる形質導入を受けやすい肝臓の能力に強く依存し、その結果、スルファミダーゼが血流中に効果的に分泌され、次いで、BBBを通過し、その脳標的配列の手段によって脳を形質導入する。したがって、治療酵素の血清レベルは、治療の効果を決定する重要な要素を表すことができる。MPS-IIIAマウスに外来SGSHを全身的な遺伝子送達したときの、SGSHの肝臓での形質導入と全身レベルを解析することについては、先行する研究では実施されてきていない。したがって、本発明者らは、効果的な治療戦略を設計するための有用な予備データを得るために、この問題を研究することを決定した。
肝臓からのスルファミダーゼ分泌と、したがって脳を特異的に標的化するために利用可能な血流中の酵素の量を増加させるために、本発明者らは、スルファミダーゼの固有のシグナルペプチド(SP)を他のもので置き換えることによって、スルファミダーゼを遺伝子工学的に改変した。2つのシグナルペプチド、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)シグナルペプチドおよびヒトα-アンチトリプシン(AAT)シグナルペプチドを試験した(図5)。これらの2つのシグナルペプチドの使用の背後にある論拠は、IDSは、肝臓から高いレベルで分泌されることが示された[21]リポソーム酵素であり、一方でAATは多く分泌される酵素であることである。本発明者らのプロジェクトの最終ゴールは、BBBを通過し、受容体仲介トランスシトーシスを介してCNSを標的とすることが可能な改変されたスルファミダーゼを生成することである(図6)。このため、本発明者らは、SGSH中のSPシグナルを置換することの治療効果の評価を目的とする実験を開始する前に、特定の脳標的化タンパク質ドメインである、アポリポタンパク質Bの低密度リポタンパク質(Low Density Lipoprotein)受容体(LDLR)結合ドメイン(ApoB LDLR-BDで改変SGSHをさらに遺伝子工学的に改変した。ApoBのこの結合ドメインは、BBBの内皮細胞上に豊富に存在するLDL受容体に結合することによって、スルファミダーゼが脳細胞に到達することを可能にするであろう(図6)。この2つの最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ構築体は、C末端にApoB LDLR-BDを含み、N末端にIDSまたはhAATシグナルペプチド(IDSsp-SGSHflag-ApoBおよびhAATsp-SGSHflag-ApoB)のいずれかを含む(図5)。
本発明者らは、肝臓特異的プロモータTBG下、最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ(hAATsp-SGSHflag-ApoB)の1つを含有するAAV2/8ベクターを生成した。本発明者らは、本ウイルスベクターで注射したMPS-IIIAにて、非常に予備的ではあるが、極めて有望な結果を得た。成体MPS-IIIAマウスに、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflag-ApoBを全身注射した。一群のMPS-IIIA群に、対照として(改変していないスルファミダーゼを含有する)AAV2/8-TBG-SGSHも注射した。注射の1カ月後にマウスを屠殺した。本発明者らは、キメラスルファミダーゼを注射したマウスでは、対照マウスに比して、より高い肝臓スルファミダーゼ活性と、スルファミダーゼ分泌における非常に強力な増加を観察した(図9)。さらに、本発明者らは、キメラスルファミダーゼを注射したマウスの脳内でのSGSH活性における有意な増加を検出した(図9)。
本発明者らは、すべての遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質(部分的および最終的)を含有するAAV2/8ベクターの生成を完了した。とりわけ、本発明者らは、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflag-ApoBに加えて、ここでAAV2/8-TBG-hIDSsp-SGSHflag-ApoB、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflagおよびAAV2/8-TBG-hIDSsp-SGSHflagを生成した。
Claims (32)
- キメラスルファターゼをコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラスルファターゼが、N-末端-C-末端配列順に、a)ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメインから本質的になる、ヌクレオチド配列。
- コードされる前記シグナルペプチドが、配列番号2または配列番号4の群に属する配列を有する、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 前記ヒトスルファターゼが、ヒトスルファミダーゼである、請求項1または2に記載のヌクレオチド配列。
- コードされる前記ヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列が、本質的に配列番号8の配列を有する、請求項3に記載のヌクレオチド配列。
- コードされる前記ApoB LDLR結合ドメインが、本質的に配列番号10の配列を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
- 本質的に、以下の群
a)アセンブリhAATsp-SGSH-3×flagカセット(配列番号11)、
b)アセンブリhIDSsp-SGSH-3×flagカセット(配列番号13)、
c)アセンブリhAATsp-SGSH-3×flag-ApoBカセット(配列番号15)、
d)アセンブリhIDSsp-SGSH-3×flag-ApoBカセット(配列番号17)、
e)アセンブリhAATsp-SGSHカセット(配列番号19)、
f)アセンブリhIDSsp-SGSHカセット(配列番号21)、
g)アセンブリhAATsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号23)、
h)アセンブリhIDSsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号25)、
に属する配列を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。 - 肝臓特異的プロモータの制御下、請求項1から6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、MPSの遺伝子治療のために好適な組換えプラスミド。
- 前記肝臓特異的プロモータが、ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータである、請求項7に記載の組換えプラスミド。
- 前記ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータが、本質的に配列番号27の配列を有する、請求項8に記載の組換えプラスミド。
- レンチウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルスベクターまたはAAVベクターの群に属する、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクター中にアセンブルされることが可能な、請求項7から9のいずれか一項に記載の組換えプラスミド。
- 組換えプラスミドAAV2.1である、請求項10に記載の組換えプラスミド。
- 請求項7から11のいずれか一項に記載の組換えプラスミドを含む、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクター。
- 前記リソソーム障害が、MPSである、請求項12に記載のウイルスベクター。
- 前記MPSが、IIIA型MPSである、請求項13に記載のウイルスベクター。
- AAVウイルスベクターの群に属する、請求項12から14のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- AAV血清型8ベクターである、請求項15に記載のウイルスベクター。
- 請求項12から16のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
- 全身投与のための請求項17に記載の医薬組成物。
- N末端-C末端配列順に、a)ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメインから本質的になる、キメラスルファターゼ。
- 前記シグナルペプチドが、配列番号2または配列番号4の群に属する配列を有する、請求項19に記載のキメラスルファターゼ。
- 前記ヒトスルファターゼが、ヒトスルファミダーゼである、請求項19または20に記載のキメラスルファターゼ。
- 前記ヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列が、本質的に配列番号8の配列を有する、請求項21に記載のキメラスルファターゼ。
- コードされる前記ApoB LDLR結合ドメインが、本質的に配列番号10の配列を有する、請求項19から22のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ。
- 本質的に、以下の群
a)hAATsp-SGSH-3×flagアミノ酸配列(配列番号12)、
b)hIDSsp-SGSH-3×flagアミノ酸配列(配列番号14)、
c)hAATsp-SGSH-3×flag-ApoBアミノ酸配列(配列番号16)、
d)hIDSsp-SGSH-3×flag-ApoBアミノ酸配列(配列番号18)、
e)hAATsp-SGSHアミノ酸配列(配列番号20)、
f)hIDSsp-SGSHアミノ酸配列(配列番号22)、
g)hAATsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(配列番号24)、
h)hIDSsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(配列番号26)、
に属する配列を有する、請求項19から23のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ。 - 医学的利用のための、請求項19から24のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ。
- MPSの処置のための、請求項25に記載のキメラスルファターゼ。
- 前記MPSがIIIA型MPSである、請求項26に記載のキメラスルファターゼ。
- 請求項19から24のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ、ならびに好適な希釈剤および/または賦形剤および/または担体を含む、医薬組成物。
- 請求項17に記載の遺伝子治療のためのウイルスベクターを含む、MPS病変の処置のための医薬組成物。
- 前記MPS病変が、IIIA型MPSである、請求項29に記載の医薬組成物。
- MPS病変の処置のための、請求項28に記載の医薬組成物。
- 前記MPS病変が、IIIA型MPSである、請求項31に記載の医薬組成物。
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