JP2016088926A - Ikaros阻害に基づく抗炎症薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】IKAROS(IKZF1)阻害剤を含む、抗炎症薬が提供される。また、本発明は、以下の(1)〜(3)の工程:(1)IKAROS遺伝子もしくは該当遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程;(2)前記細胞におけるIKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を測定する工程;および(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、IKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法をも提供する。
【選択図】なし
Description
(1)IKAROS(IKZF1)阻害剤を含む、抗炎症薬。
(2)前記IKAROS阻害剤は、PGE2、抗IKAROS siRNA、および抗IKAROS抗体からなる群より選択される、項目1に記載の抗炎症薬。
(3)前記抗炎症薬は、上皮組織を標的とするものである、項目1または2に記載の抗炎症薬。
(4)前記炎症は、IKAROSに起因する炎症である、項目1〜3のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(5)前記炎症は、IKAROSの発現亢進に起因する炎症である、項目1〜4のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(6)前記炎症は、IKAROSに起因する上皮が関与する炎症である、項目1〜5のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(7)前記炎症は、上皮においてIKAROSおよびTLR3に関与する炎症である、項目1〜6のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(8)前記炎症は、アレルギー疾患によるものである、項目1〜7のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(9)前記炎症は、スティーブンスジョンソン症候群、ぜんそく、接触性皮膚炎、急性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎およびアトピー性角結膜炎からなる群より選択される、項目1〜8のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(10)局所投与剤である、項目1〜9のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(11)前記局所投与剤は、外用剤、点眼剤、点鼻剤または吸引剤である、項目10に記載の抗炎症薬。
(12)前記抗炎症薬は、皮膚または粘膜組織における炎症の処置または予防のためのものである、項目1〜11のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(13)前記粘膜組織は、目、口腔、鼻腔、咽頭、気道、膣、尿道および/または消化管である、項目12に記載の抗炎症薬。
(14)前記抗炎症薬は目における炎症の処置または予防のためのものである、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗炎症薬。
(15)以下の(1)〜(3)の工程:
(1)IKAROS遺伝子もしくは該当遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程;
(2)前記細胞におけるIKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を測定する工程;および
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、IKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
(16)IKAROSと被検物質とを接触させ、IKAROSと結合能を有する被検物質を抗炎症性物質の候補として選択することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
(17)以下の(1)〜(3)の工程:
(1)被検物質の存在下でIKAROSを炎症性疾患の標的細胞の細胞膜画分と接触させる工程;
(2)細胞膜画分に結合したIKAROS量を測定する工程;および
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、細胞膜画分に結合するIKAROS量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
を含む、項目15または16に記載のスクリーニング方法。
(18)抗炎症性物質の候補として選択された被検物質を炎症モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することをさらに含む、項目15〜17のいずれか1項に記載の方法。
(19)以下の(1)〜(3)の工程:
(1)炎症性疾患の標的細胞を、IKAROSの存在下および非存在下で被検物質に接触させる工程;
(2)各条件下での前記細胞における炎症反応の程度を測定する工程;および
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、IKAROSの存在下で炎症反応を抑制し、IKAROSの非存在下で炎症反応を抑制しなかった被検物質を、IKAROSの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質の候補として選択する工程
を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
(20)標的細胞における炎症反応を惹起する工程をさらに含む、項目項目15〜19のいずれか1項に記載の方法。
(21)polyI:C、インターロイキン−Iα(IL−1α)、腫瘍壊死因子(TNF)αまたはH2O2刺激により炎症反応を惹起することを特徴とする、項目15〜20のいずれか1項に記載の方法。
(22)前記細胞が、上皮細胞を含むかまたは上皮に関係することを特徴とする、項目15〜21のいずれか1項に記載の方法。
(23)前記上皮細胞は、皮膚表皮細胞、食道上皮細胞、胃上皮細胞、膣上皮細胞、子宮上皮細胞、胸腺上皮細胞、膀胱上皮細胞、前立腺上皮細胞、乳腺上皮細胞、結膜上皮細胞または角膜上皮細胞ある、項目22に記載の方法。
(24)前記上皮細胞は、皮膚表皮細胞、結膜上皮細胞または角膜上皮細胞である、項目22または23に記載の方法。
(25)前記上皮細胞は、ケラチン5を発現する粘膜上皮細胞である、項目22〜24のいずれか1項に記載の方法。
(26)前記炎症は、IKAROSの発現亢進に起因する炎症である、項目15〜25のいずれか1項に記載の方法。
(27)前記炎症は、IKAROSに起因する上皮が関与する炎症である、項目15〜26のいずれか1項に記載の方法。
(28)前記炎症は、上皮においてIKAROSおよびTLR3に関与する炎症である、項目15〜27のいずれか1項に記載の方法。
(29)polyI:Cを含む、IKAROS遺伝子の発現上昇または誘導のための組成物。
(30)前記IKAROS遺伝子の発現上昇または誘導は上皮細胞におけるものである、項目29に記載の組成物。
(31)IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された、単離細胞。
(31A)前記細胞は、ケラチン陽性である、項目31に記載の単離細胞。
(32)前記IKAROS遺伝子の発現の上昇または誘導は、polyI:Cによるものである、項目31または31Aに記載の細胞。
(33)前記細胞は上皮細胞である、項目31、31Aまたは32に記載の細胞。
(34)IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された、炎症モデル動物。
(35)前記IKAROS遺伝子の発現の上昇または誘導は、polyI:Cによるものである、項目34に記載の動物。
(36)前記炎症モデルは、眼表面における炎症を含む、項目34または35に記載の動物。
(37)前記IKAROS遺伝子の発現の上昇または誘導は、遺伝子改変によるものである、項目34〜36のいずれか1項に記載の動物。
(38)前記遺伝子改変は、IKAROS遺伝子を上皮特異的に発現させるように改変されることを含む、項目34〜37のいずれか1項に記載の動物。
(39)前記動物は皮膚粘膜炎症を生じる、項目34〜38のいずれか1項に記載の動物。
(40)前記動物は、ケラチン5のプロモーターに作動可能に連結されて前記IKAROS遺伝子をコードする核酸配列を含むベクターを含む、項目34〜39のいずれか1項に記載の動物。
(41)前記動物はげっ歯類である、項目34〜40のいずれか1項に記載の動物。
(41A)前記炎症モデル動物は、皮膚組織および粘膜組織からなる群より選択される少なくとも1つに細胞浸潤がみられる、項目34〜41のいずれか1項に記載の動物。
本明細書において、「IKAROS」(イカロス)とは、「IKZF1」とも呼ばれる公知のタンパク質であり、Genbank Accession No.:NP_001207694(ヒト)<その核酸配列NM_001220765.2>、またはGenbank Accession No.:NP_001020768(マウス)<その核酸配列NM_001025597.2>として知られている、配列番号2または4で表されるヒトまたはマウスIKAROSのアミノ酸配列(その核酸配列は、それぞれ配列番号1または3)、あるいはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド表記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)で記載される。
al.,1996,J.of Immunol.,156:585−592;Sun et al.,1996,EMBO J.,15:5358−5369;Hansen et al.,1997,Eur.J.Immunol,27:3049−3058;Georgopolous et al.,1997,Ann.Rev.Immunol.,15:155−176;Brown et al.,1997,Cell,91:845−854;and Klug et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:657−662)。IKAROS遺伝子のプログラムされた発現と機能は、IKAROSのpre−mRNAの選択的スプライシングによって厳密に制御されており、これにより8種の異なるイカロスアイソフォームが生成される。8種のイカロスアイソフォーム(Ik−1、Ik−2、Ik−3、Ik−4、Ik−5、Ik−6、Ik−7、およびIk−8)は、全て共通のカルボキシ(C)末端ドメインを有しており、このC末端ドメインには転写活性化 モチーフと、IKAROSアイソフォーム同士でのホモ二量体またはヘテロ二量体の形成や他のタンパク質との相互作用に必要な2個のジンクフィンガーモチーフとが含まれる。
(a)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列;
(c)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列;
(d)配列番号1または3で示される塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列;
(e)配列番号1または3で示される塩基配列の相補鎖配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列。
(f)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(g)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(h)配列番号2または4で示されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(i)配列番号1または3で示される塩基配列、
(j)配列番号1または3で示される塩基配列の相補鎖配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ炎症反応を促進する活性を付与するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
を有する核酸が挙げられる。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。また、任意の実施形態が組み合わせ得ることも理解されるべきである。
1つの局面において、本発明は、IKAROS(IKZF1)阻害剤を含む、抗炎症薬を提供する。本発明が開示される前は、IKAROSが炎症と関与していることは知られておらず、本発明者らが初めてその関与を見出し、IKAROS阻害薬が炎症を抑制乃至消失することを見出したことによって確認したものである。
本発明において「IKAROSの発現を阻害する物質」とは、IKAROSをコードする核酸(IKAROS遺伝子)の転写レベル、転写後調節のレベル、IKAROSタンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、IKAROSの発現を阻害する物質としては、例えば、IKAROS遺伝子の転写を阻害する物質(例、アンチジーン)、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからIKAROSの翻訳を阻害するか(例、アンチセンス核酸、miRNA)あるいはmRNAを分解する物質(例、siRNA、リボザイム)、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、より好ましくは、以下の(1)〜(3)からなる群より選択される物質が例示される。
(1)IKAROS遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
(2)IKAROS遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、
(3)IKAROS遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。
(k)配列番号1で表される塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列;
(l)配列番号1で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ炎症反応を促進する活性を有するタンパク質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列;
が挙げられる。ストリンジェントな条件は、前述のとおりである。
(1)IKAROS遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸、
(2)IKAROS遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸、
(3)IKAROS遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。
本発明における「IKAROS遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
IKAROS遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度)をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。IKAROS遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(10):5572−5577(2001)]。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res.,29(13):2780−2788(2001)]。
本明細書においては、IKAROS遺伝子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、IKAROS遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来[Nature,411(6836):494−498(2001)]、上記のアンチセンス核酸やリボザイムの代替技術として汎用されている。
本発明において「IKAROSの機能を阻害する物質」とは、いったん機能的に産生されたIKAROSがその機能を発揮するのを阻害する限りいかなるものでもよい。
IKAROS遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができる本発明のアンチセンス核酸や、IKAROS遺伝子の転写産物(mRNA)と相同な(もしくは相補的な)塩基配列を有し、当該転写産物を標的として該転写産物を切断し得るsiRNA(もしくはリボザイム)、さらに該siRNAの前駆体であるshRNAなど(以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある)は、生体内におけるIKAROSの発現を抑制し、炎症反応を抑制するので、抗炎症剤として使用することができる。
IKAROSに対する抗体や、IKAROSの発現もしくは機能を阻害する低分子化合物は、IKAROSの産生または機能を阻害することができる。したがって、これらの物質は、生体内におけるIKAROSの発現もしくは機能を阻害するので、炎症性疾患の予防および/または治療剤として使用することができる。
上述の通り、IKAROSの発現および/または機能を阻害すると、炎症反応が抑制される。従って、IKAROSの発現および/または機能を阻害する化合物は、炎症性疾患の予防および/または治療剤(抗炎症剤)として使用することができる。
本発明は、IKAROSを産生する能力を有する細胞における該タンパク質(遺伝子)の発現を、被検物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被検物質の種類、被検物質と細胞との接触の態様などは、上記と同様である。
(a)IKAROSを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするmRNAの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法、および(b)IKAROSを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、本発明の検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法を提供する。
(i)正常あるいは疾患モデル(例えば、DSSもしくはTNBS誘起大腸炎モデルなど)非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して被検物質を投与し、一定時間経過した後(30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後)に、血液、あるいは特定の臓器(例えば、脳等)、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
(ii)IKAROS遺伝子を発現する細胞(例えば、IKAROSを導入した形質転換体)を上記の方法に従って作製し、常法に従って培養する際に被検物質を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後(1日後〜7日後、好ましくは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後)、該細胞培養物中に含まれるIKAROSあるいはそれをコードするmRNAを、上記(i)と同様にして定量、解析することができる。
(i)本発明の検出用抗体と、試料液および標識化されたIKAROSとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより試料液中のIKAROSを定量する方法や、
(ii)試料液と、担体上に不溶化した本発明の検出用抗体および標識化された別の本発明の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量(活性)を測定することにより、試料液中のIKAROSを定量する方法等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がIKAROSの機能を阻害するか否かを指標として行うこともできる。
1つの局面において、本発明は、polyI:Cを含む、IKAROS遺伝子の発現上昇または誘導のための組成物を提供する。polyI:C(「ポリI:C」、「polyI:Cポリヌクレオチド」とも表示される)は、polyI:Cポリヌクレオチドは、イノシン酸残基(I)およびシチジル酸残基(C)を含有する二重鎖ポリヌクレオチド分子(RNAまたはDNAまたはDNAとRNAの組合せのいずれか)であり、炎症性サイトカイン、例えばインターフェロンなどの産生を誘導するものであり、合成二本鎖RNAアナログである。一般に、完全にシトシン含有ヌクレオチドからなる1本のストランドおよび完全にイノシン含有ヌクレオチドからなる1本のストランドで構成されるが、その他の構成も可能である。例として、各々のストランドは、シトシン含有ヌクレオチドとイノシン含有ヌクレオチドの両方を含んでもよい。場合によっては、ストランドのいずれかまたは両方は、1またはそれ以上の非シトシンまたは非イノシンヌクレオチドをさらに含んでもよい。polyI:Cについては、例えば、非特許文献9等を参照されたい。
1つの局面において、IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された細胞を提供する。ここで「IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された」とは、通常の状態で存在する細胞におけるIKAROS遺伝子の発現のレベルよりも上昇または誘導がなされていることをいう。そのようなレベルは細胞のタイプによって変動し得ることが考えられるが、本発明でいう「IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された」は、各々の細胞のタイプに応じてその通常の状態に比べて発現が上昇または誘導されていることをいうことに留意されたい。
1つの局面において、IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された動物を提供する。ここで「IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された」とは、通常の状態で存在する動物におけるIKAROS遺伝子の発現のレベルよりも上昇または誘導がなされていることをいう。そのようなレベルは動物のタイプによって変動し得ることが考えられるが、本発明でいう「IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された」は、各々の動物のタイプに応じてその通常の状態に比べて発現が上昇または誘導されていることをいうことに留意されたい。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
本実施例では、ヒト上皮細胞および表皮細胞におけるIKAROSの発現誘導を実証した。以下に実験手法および結果を示す。
・培養ヒト結膜上皮細胞
取得方法:手術時に摘出される不要な結膜組織からDsipaseにより結膜上皮層を分離して取得した。
・培養ヒト表皮細胞
取得方法:Thermoから購入したものを使用した(製品番号C0055C;Human Epidermal Keratinocytes, adult (HEKa))
培養方法:HKGS (GIBCO #S0015)添加のEpiLife(GIBCO)にて培養を行った。
・polyI:C(ポリI:C)(Invivogenから入手した(Poly(I:C) High Molecular Weight Synthetic analog of dsRNA-TLR3 ligand、Catalog # tlrl-pic))。・polyI:C刺激は、最終濃度が表示濃度となるように、ストック溶液を細胞培養液に加えることによって行った。
・mRNAの測定は以下のように行った。手短に述べると、Qiagenから入手したRNeasy Mini Kitと用いて細胞からのRNA抽出を行い、TOYOBOから入手したReverTra Ace, random primer、dNTP、RNase inhibitorを用いてRNAからcDNA転写を行った。このcDNAサンプルを用いた、定量PCRを行った。定量PCRは、Applied BiosystemのStepOne plusを用いて、IKAROSのTaqMan probe (Hs00958474)とTaqMan(登録商標)Fast Advanced Master Mixを用いて行った。
結果を図1に示す。図1aに示すように、培養ヒト結膜上皮細胞に10μg/ml polyI:C(ポリI:C)刺激を加えると経時的にIKAROS mRNAが上昇した(グラフ中の数値は以下のとおりである:0時間後 1、1時間後 0.9、3時間後 2.5、6時間後 10.6、10時間後 121.2)。図1bに示すように、培養ヒト結膜上皮細胞において、10μg/ml polyI:C(ポリI:C)刺激10時間後に、IKAROS mRNA発現が数倍以上に上昇した(グラフ中の数値は以下のとおりである:Medium 1, polyIC 8.8)。図1cに示すように、培養ヒト表皮細胞において、10μg/ml polyI:C(ポリI:C)刺激10時間後に、IKAROS mRNA発現が10数倍以上(グラフ中の数値は以下のとおりである:Medium 1, polyIC 11.4)に上昇した。
本実施例では、粘膜上皮および表皮細胞にIKAROSを強発現させると皮膚粘膜炎症を生じることを確認した。また、本発明では、IKAROSトランスジェニックマウスを作製し、皮膚粘膜炎症モデルとして使用できることを実証した。以下に実験手法および結果を示す。
(トランスジェニック動物作製)
・トランスジェニックマウスの作製:表皮細胞または粘膜上皮に特異的に発現しているケラチン−5のプロモーターにIKAROSのIk1アイソフォーム(すべてのExon1−7を含むアイソフォーム)をつけた遺伝子をマウス胚に導入し、皮膚粘膜にIKAROSのIk1アイソフォームが強発現するトランスジェニックマウスを作製した。以下に詳述する。
作製した発現ベクター(pK5−Ikzfl−2A−EGFP)の構造および構築手順を、図4に示す。Ikzfl遺伝子のタンパク質コード領域(isoform 1;1545bp)、pocine teschovirus−1 2A(P2A;57bp)、EGFP遺伝子のタンパク質コード領域(720bp)、bGHpolyA signal(bovine growth hormone polyadenylation signal;299bp)を含んだ配列(2663bp)を遺伝子合成により作製した(配列番号5、図5にベクターの模式図を示す)。これを、発明者が作製したpBSK5(human keratin 5 promoter in pBluescript II KS+)のプロモーター下流に位置する、Spe1およびNotI部位に挿入することで、発現ベクター(pK5−lkzfl−2A−EGFP)を作製した(図4)。
トランスジェニックマウス作製におけるトランスジーン(K5−Ikzfl−2A−EGFP)の導入を確認するためのPCRプライマーを設計し、PCR条件検討を行った。
受精卵インジェクションに用いる発現カセット(K5−Ikzfl−2A−EGFP)を調製するため、発現ベクター(pK5−lkzfl−2A−EGFP)を制限酔素で消化し、DNA断片を精製した。
発現ベクターを制限酵素SalIおよびNatlで消化した。これにより、プラスミドベクター配列を分離、発現カセット部分(約17.1kbp)を、精製した(図8)。これらの作業により得た直鎖状DNA断片をトランスジーンとし、受精卵インジェクションに必要な量を調製した。
調製したトランスジーン(4.0〜6.0ng/μl)1〜2 plを、前核期受精卵(BALB/c系統)302個にインジェクションした。トランスジーン注入妊のうち、状態が良好な217個を受容雌マウス9匹に移植した(表1)。
・作製したトランスジェニックマウスを肉眼にて観察して炎症状態を観察し、適宜写真を撮影した。
結果を図2に示す。作製されたトランスジェニックマウスを観察したところ、同マウスでは、皮膚粘膜に炎症を自然発症することが肉眼で確認された。具体的には、皮膚粘膜にIKAROSのIK1アイソフォームが強発現するトランスジェニックマウスでは皮膚および眼部において炎症を生じていることが示された。このように、本実施例では、粘膜上皮ならびに表皮細胞にIKAROSを強発現させると皮膚粘膜炎症を生じることが実証された。
本実施例では、培養ヒト結膜上皮細胞および培養ヒト表皮細胞におけるpolyI:C刺激によって誘導されたIKAROS mRNAの抑制する薬物を探索した。
・培養ヒト結膜上皮細胞:実施例1と同様に入手した。
・培養ヒト表皮細胞:実施例1と同様に入手した。
・polyI:C:実施例1と同様に入手した。
・プロスタグランジン(PG)E2(PGE2Cayman Chemical #14010)を使用した。)
・実施例1と同様の方法を用いて培養ヒト結膜上皮細胞において、polyI:C誘導性
(10時間刺激)IKAROS mRNA発現上昇を誘導した。そして、polyI:Cのみと、100μg/ml PGE2を添加した群とでIKAROSmRNAの発現を比較した。また、培養ヒト表皮細胞においても、polyI:Cのみと、100μg/ml PGE2を添加した群とでIKAROSmRNAの発現を比較した。
結果を図3に示す。図3に示すように、100μg/ml PGE2により、培養ヒト結膜上皮細胞におけるIKAROS mRNA発現上昇が抑制された(図3a)(グラフ中の数値は以下のとおりである:medium 1、polyI:C 8.8、polyI:C+PGE2 1.9、polyI:C+rebamipide 2.7)。同様に、100μg/ml PGE2により、培養ヒト結膜表皮細胞におけるIKAROS mRNA発現上昇が抑制された(図3b)(グラフ中の数値は以下のとおりである:medium 1、polyI:C 11.4、polyI:C+PGE2 2.7、polyI:C+rebamipide 2.8)。このように、本実施例では、培養ヒト結膜上皮細胞ならびに培養ヒト表皮細胞において、polyI:C刺激によって誘導されたIKAROS mRNAを抑制する薬物があることが実証された。
本実施例では、生体内の結膜組織においてIKAROSが発現し得るかどうかを確認する実験を行った。
手術時に不要になった結膜組織からDispaseを用いて結膜上皮を分離し、QIAGEN
から入手したRNeasy mini kitにてRNA抽出した。またTOYOBOから入手した ReverTra Ace、random primer、dNTP、RNase inhibitorを用いてRNAからcDNA転写を行った。cDNAは、以下の方法および条件にてPCRを実施した。
試薬:TaKaRa Taq CAT#R001B
機器:ABI GeneAmp PCR system9700
・PCR反応液組成
TaKaRaTaq(5units/μl) 0.25μl
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μl
20μM F-Primer 1.5μl (Final 0.6μM)
20μM R-Primer 1.5μl (Final 0.6μM)
Template 2μl
蒸留水 35.75μl
Total 50μl
・使用したプライマー
GAPDH F 784435 K6148E12(5’- CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’;配列番号10)
R 784435 K6148F01(5’- CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’;配列番号11)
(以上の情報は、NM_002046 Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), mRNA)から作成し、Fは320−339であり、Rは895−876である。精製物のサイズは575bpである。)
Ikaros F Primer A 768773 K5949A11(GCTGATGAGGGTCAAGACAT;配列番号12)
R Primer C 768773 K5949B01(AGCTTCGGCCACAATATCCA;配列番号13)。
(IKAROSの情報は、FがExon2の情報であり、RはExon6の情報である。これらを使用した場合Ik1は622bpであり、Ik2は361bpの生成物が生じる。)
・PCR条件
95℃ 5min→ 95℃ 30sec →72℃ 7min →10℃∞
57℃ 30sec
72℃ 30sec ×28(GAPDH) or 40(Ikaros) cycle
・電気泳動
1.2%アガロースゲル
Sample 5μ
Marker 100 base ladder。
単核球および結膜上皮を用いてIKAROSのRT-PCRを行った結果を図9に示す。示されるように、単核球および結膜上皮のいずれでも、IKAROS mRNA(本実施例のバンドは、IK1およびIK2を示す)の発現が観察された。この結果は、ヒト結膜上皮において、IKAROSが発現しうることを示している。
本実施例では、実施例2で作製したIKZF1のトランスジェニック(Tg)マウスについてさらに解析を進め、その組織解析を行った。以下のその手順および結果を示す。
5週齢の野生型マウス(同じ親から生まれたIKZF1遺伝子が過剰発現していないマウス)1匹、実施例2で作製したIKZF1Tgマウス1匹から各種臓器(皮膚組織(耳介、背部表皮を含む。)、粘膜組織(眼瞼、舌を含む。)を含む。)を摘出し、常法に従いパラフィン包埋後切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)組織を行った後、顕微鏡にて病理学的変化を観察した。以上の実験は、株式会社新薬リサーチセンター 研究本部 非臨床研究部(北海道恵庭市)に委託して行われた。
IKZF1Tgマウスの病理組織解析を行ったところ下記所見を認めた(5週齢の野生型マウス1匹、IKZF1Tgマウス1匹のHE組織染色解析結果)。
(1)皮膚組織1(耳介)
IKZF1Tgマウスにおいて軽微な限局性真皮内細胞浸潤を認めた(図10)。
(2)皮膚組織2(背部表皮)
IKZF1Tgマウスにおいて軽微な限局性表皮肥厚ならびに軽微な限局性真皮内細胞浸潤を認めた(図11)。
(3)粘膜組織1(眼瞼)
IKZF1Tgマウスにおいて軽微な限局性眼瞼炎粘膜下細胞浸潤を認めた(図12)。
(4)粘膜組織2(舌)
IKZF1Tgマウスにおいて軽微な限局性糸状乳頭棘細胞層肥厚ならびに軽微な限局性乳頭下細胞浸潤を認めた(図13)。
以上から、本実施例で使用されたマウスは、ケラチン5のプロモーターにIKZF1遺伝子を結合させていることから、ケラチン5陽性細胞の特異的にIKZF1を過剰発現させたマウスでは、皮膚粘膜炎症が認められる傾向であったといえる。
本実施例では、ヒト結膜組織におけるIKZF1タンパク質の発現解析を行った。以下にその説明を記す。
実験用に使用されることに同意してもらったヒト患者から手術時に切除廃棄された眼表面結膜組織を凍結包埋し、切片を作製した。その後、この切片について、HE染色ならびに蛍光免疫染色を行った。蛍光免疫染色では、抗IKZF1抗体としてabcamのGoat polyclonal ab106787を100倍希釈して用い、isotype controlとしてDAKOのGoatIgGを同じ濃度によるように使用した。二次抗体は、Alexa488標識抗Goat IgG抗体を用いた。
SJSの結膜組織ならびにコントロール結膜組織(結膜弛緩症)ともに、浸潤細胞に加えて結膜上皮の核が抗IKZF1抗体で染色された。
SJS角膜上瘢痕化結膜組織1(図14)
SJS結膜組織2(図15)
コントロール結膜組織1(図16)
コントロール結膜組織2(図17)
(結論)
ヒトin vivo結膜組織において、ヒト結膜上皮細胞にIKZF1蛋白質の発現が免疫染色にて確認できた。
本発明者らは、TLR3が、皮膚炎症ならびに眼表面粘膜炎症を促進することを報告している(Nakamura N, Tamagawa-Mineoka R, Ueta M, Kinoshita S, Katoh N. Toll-Like Receptor 3 Increases Allergic and Irritant Contact Dermatitis. J Invest Dermatol. 2014 Sep 17. doi: 10.1038/jid.2014.402.;およびUeta M, Uematsu S, Akira S, Kinoshita S: Toll-like receptor 3 enhances late-phase reaction of experimental allergic conjunctivitis. J Allergy Clin Immunol. 2009; 123(5): 1187-1189.)。また、上皮細胞においてpolyI:CならびにTLR3によりIFN−beta、TSLP、RANTES、MCP1、IP−1、IL−6、IL−8などの炎症関連物質の発現が上昇することも報告している(Ueta M, Hamuro J, Kiyono H, Kinoshita S: Triggering of TLR3 by polyI:C in human corneal epithelial cells to induce inflammatory cytokines. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 331(1): 285-294;Ueta M, Kinoshita S: Innate immunity of the ocular surface. Brain Res Bull. 2010; 81(2-3): 219-228;およびUeta M, Mizushima K, Yokoi N, Naito Y, Kinoshita S: Gene-expression analysis of polyI:C-stimulated primary human conjunctival epithelial cells. Br J Ophthalmol. 2010; 94(11): 1528-1532)。
培養上皮細胞を用いたpolyI:C誘導性IKAROS発現の抑制作用を示す薬剤の選択を行う。具体的には、polyI:CでIKAROS発現が誘導されるヒト表皮細胞を用いて、polyI:C誘導性のIKAROS発現を抑制する薬剤の選択を行う。IKAROS発現の抑制作用については、定量PCRで検証する。
上皮特異的IKAROSトランスジェニックマウスを用いて、本マウスの皮膚粘膜炎症を抑制する薬剤を選択する。具体的には、上皮特異的IKAROSトランスジェニックマウスの耳介に、候補薬剤を一定期間塗布し、耳の厚みの減少、ならびに、炎症細胞数を解析し、炎症の抑制作用の有無を検討する。そして、炎症抑制作用のある薬剤を選択する。また、薬剤投与後の耳介におけるIKAROS発現を解析し、IKAROS発現を抑制している薬剤を選択する。
方法1〜2のいずれでも、IKAROS発現を調節する薬剤および/または抗炎症剤のスクリーニングすることができることが理解される。
本実施例では、tetOnsystem IKZF1 shRNA発現HaCaT細胞を作成し、polyI:CでIKAROSの発現を誘導した状態で、テトラマイシン投与により、IKAROSの発現をノックダウンし、炎症関連物質の変化を解析する。以下にその実験条件を示す。
・PolyI:C(ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジン酸)
・Knockout Single Vector Inducible RNAi System(Clontech 630933)
・tetOnsystem IKZF1 shRNA発現HaCaT細胞については以下のようにトランスフェクションによる導入により作製する。
・発現の確認については、トランスフェクションした細胞をPolyI:Cで処理し、IKZ1発現を誘導し、PolyI:C処理した細胞より、total RNAを抽出し、qPCRによりIKZF1およびコントロール遺伝子の発現を定量する。
・tetON systemによる誘導型発現ベクターの構築と活性確認は以下のように行う。
・発現ベクター作製は以下のように行う。
・発現の確認については、トランスフェクションした細胞をPolyI:Cで処理し、IKZ1発現を誘導し、PolyI:C処理した細胞より、total RNAを抽出し、qPCRによりIKZF1遺伝子発現のノックダウンを一過性発現により検討する。
・IKZF1shRNA発現HaCaT細胞の樹立は以下のようにして行う。
・前工程で得た誘導型shRNA発現ベクターをトランスフェクション用に調製し、HaCaT細胞にトランスフェクションし、限界希釈、薬剤選択培養によりクローンを単離する。
・発現確認については、得られた20クローンについて、PolyI:C処理した細胞におけるIKF1遺伝子の発現をqPCRを用いて検討し、ノックダウンが見られた細胞クローンについて拡大培養および凍結保存を行う。
以上から、本実施例の上記実験系により、IKAROS特異的なノックダウンによる炎症抑制機序が明らかとなる。
本実施例では、実施例4等の本発明で同定されるようなIKAROS阻害剤を用いて、上皮細胞のIKAROSを標的とした新規抗炎症治療法が実証され得る。以下に炎症効果の確認手法を示す。
培養上皮細胞を用いたpolyI:C誘導性IKAROS発現の抑制作用を示す薬剤の選択を行う。具体的には、polyI:CでIKAROS発現が誘導されるヒト表皮細胞を用いて、polyI:C誘導性のIKAROS発現を抑制する薬剤の選択を行う。IKAROS発現の抑制作用については、定量PCRで検証する。
上皮特異的IKAROSトランスジェニックマウスを用いて、本マウスの皮膚粘膜炎症を抑制する薬剤を選択する。具体的には、上皮特異的IKAROSトランスジェニックマウスの耳介に、候補薬剤を一定期間塗布し、耳の厚みの減少、ならびに、炎症細胞数を解析し、炎症の抑制作用の有無を検討する。
方法1〜3のいずれでも、本発明の抗炎症剤の炎症効果を確認することができる。
配列番号2:IKAROS ヒトアミノ酸配列(NP_001207694)
配列番号3:IKAROS マウス核酸配列(NM_001025597.2)
配列番号4:IKAROS マウスアミノ酸配列(NP_001020768)
配列番号5:実施例で作製した発現ベクター(pK5−Ikzfl−2A−EGFP)(図5)
配列番号6:K5p−Flプライマー
配列番号7:BGH−R3プライマー
配列番号8:K5p−F6プライマー
配列番号9:K5p−R2プライマー
配列番号10:GAPDH F 784435K6148E12プライマー
配列番号11:GAPDH R 784435K6148F01プライマー
配列番号12:Ikaros F PrimerA 768773 K5949A11プライマー
配列番号13:Ikaros R Primer C 768773 K5949B01プライマー
Claims (16)
- IKAROS(IKZF1)阻害剤を含む、抗炎症薬。
- 前記IKAROS阻害剤は、PGE2、抗IKAROS siRNA、および抗IKAROS抗体からなる群より選択される、請求項1に記載の抗炎症薬。
- 前記抗炎症薬は、上皮組織を標的とするものである、請求項1に記載の抗炎症薬。
- 前記炎症は、IKAROSに起因する上皮が関与する炎症である、請求項1に記載の抗炎症薬。
- 局所投与剤である、請求項1に記載の抗炎症薬。
- 前記抗炎症薬は、皮膚または粘膜組織における炎症の処置または予防のためのものである、請求項1に記載の抗炎症薬。
- 以下の(1)〜(3)の工程:
(1)IKAROS遺伝子もしくは該当遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程;
(2)前記細胞におけるIKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を測定する工程;および
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、IKAROS遺伝子もしくはIKAROSタンパク質またはレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、抗炎症性物質の候補として選択する工程
を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - IKAROSと被検物質とを接触させ、IKAROSと結合能を有する被検物質を抗炎症性物質の候補として選択することを特徴とする、抗炎症性物質のスクリーニング方法。
- 以下の(1)〜(3)の工程:
(1)炎症性疾患の標的細胞を、IKAROSの存在下および非存在下で被検物質に接触させる工程;
(2)各条件下での前記細胞における炎症反応の程度を測定する工程;および
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、IKAROSの存在下で炎症反応を抑制し、IKAROSの非存在下で炎症反応を抑制しなかった被検物質を、IKAROSの機能を阻害して抗炎症作用を示す物質の候補として選択する工程
を含む、抗炎症性物質のスクリーニング方法。 - polyI:C、インターロイキン−Iα(IL−1α)、腫瘍壊死因子(TNF)αまたはH2O2刺激により炎症反応を惹起することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞が、上皮細胞を含む、請求項7、9または10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炎症は、IKAROSに起因する上皮が関与する炎症である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- polyI:Cを含む、IKAROS遺伝子の発現上昇または誘導のための組成物。
- IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された、単離細胞。
- IKAROS遺伝子の発現が上昇または誘導された、炎症モデル動物。
- 前記炎症モデル動物は、皮膚組織および粘膜組織からなる群より選択される少なくとも1つに細胞浸潤がみられる、請求項15に記載の炎症モデル動物。
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