JP2016020341A - 抗肥満剤 - Google Patents

Abstract

【課題】有効に肥満を抑制できる化合物を見出し、これを利用する肥満の治療・予防方法の提供。【解決手段】次の式（Ｉ）【化１】（式中、Ｒ１は、メチル基または水素原子を、Ｒ２は水酸基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）で表されるデヒドロカワイン系化合物を有効成分とする抗肥満剤および前記化合物を含有するゲットウの根茎抽出物を有効成分とする抗肥満剤。【選択図】図６

Description

本発明は、抗肥満剤に関し、更に詳細には、ゲットウから得られるカワイン系化合物を有効成分とする抗肥満剤に関する。

現在、肥満は、代謝病の原因とされており、密接に冠状動脈性心臓病、高血圧、２型糖尿病、癌、呼吸系合併症および骨関節炎に関連づけられている。そして、世界保健機関は、少なくとも１０億人の大人が体重過剰で、このうち３億人が肥満体であるとし、そしてこれらの数は、医療介入なしでは更に上昇すると予想されることを報告している。昨今では、肥満の蔓延は子供にも影響しており、小児肥満の普及は過去３０年間で３倍になり、この影響されやすい人口における健康上の問題を引き起こすことが予想される。

そのうえ、疫学と生命保険の保険計理人のデータからの証拠は、肥満が短命化を強く予言していることを示している。したがって、肥満の防止と処理は我々のクオリティ・オブ・ライフを改良するために、臨界的な緊急性と重要性を有する。

ところで現在、肥満症の治療方法には、食事療法、運動療法、行動療法、薬物療法等があるが、基本となるのは食事療法と運動療法で、これを同時に進めることが一般的である（非特許文献１）。この食事療法と運動療法の実施には、行動療法という食事と運動の生活指導が具体的に行なわれるが、一般に肥満患者では、強い意志をもってこれに堪えられる人が少なく、結局失敗に終わることが多いとされている。

この行動療法では、まれに薬物療法が補助的に使われることがあるとされており、これらの方法で効果がない場合にだけ、胃を小さくする外科療法(手術が)行われることがある。

このように、現在の肥満症の治療においては、薬物療法は限られた範囲でしか使用されていないが、現在の肥満の蔓延を抑制するには、患者の意志に関わらず肥満を有効に抑制する医薬の開発が強く求められていることは明らかである。

厚生労働省ホームページ「肥満の治療」http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/kenkou/seikatu/himan/treatment.html）

本発明は上記実情においてなされたものであり、有効に肥満を抑制できる化合物を見出し、これを利用する肥満の治療・予防方法の提供をその課題とするものである。

本発明者らは、従来から、沖縄に自生する植物であるゲットウ（月桃）に着目し、この植物の薬理活性について研究を行っていたが、今回、ゲットウの根茎からの抽出物中に、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）の細胞内濃度に影響を与え、グリセロール遊離の刺激、脂質蓄積の抑制、トリグリセリド含有量の減少、グリセロール−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）および膵リパーゼの抑制等の作用を有する成分が含有されていることを知った。そして更に、研究を進めた結果、上記薬理活性の活性成分を特定し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の式（Ｉ）
（式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）
で表されるデヒドロカワイン系化合物を有効成分とする抗肥満剤である。

また本発明は、ゲットウの根茎抽出物を有効成分とする抗肥満剤である。

本発明の式（Ｉ）で示されるデヒドロカワイン系化合物は、肥満に関連するｃＡＭＰの細胞内濃度に影響を与え、グリセロール遊離の刺激、脂質蓄積の抑制、トリグリセリド含有量の減少、ＧＰＤＨおよび膵リパーゼの抑制等の作用が極めて優れたものであり、さらに脂肪細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）の生成抑制作用にも優れるものであるため、肥満症の治療や予防に有効に利用できるものである。

また、ゲットウの根茎抽出物は、上記デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）を含有するものであるため、これも肥満症の治療、予防に利用できるものである。

ゲットウ根茎抽出物からＤＫおよびＤＤＫを得る工程を示した図面 ゲットウ根茎抽出物からのＤＫおよびＤＤＫの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図面。（Ａ）はＤＫ、（Ｂ）はＤＤＫである。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のバイアビリティに対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのグリセロール遊離に対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での細胞内ｃＡＭＰ濃度に対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での脂質蓄積に対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。（Ａ）は、オイル・レッド Ｏ染料で着色し、光学顕微鏡で評価した、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の脂質滴形成に対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を、（Ｂ）は、オイル・レッド Ｏの定量分析による測定した各試料の相対的脂質含量を示す。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での細胞内トリグリセリド含有量の阻害に対するヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。 ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのＧＰＤＨ活性阻害へのヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの効果を示す図面。 ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの膵リパーゼ活性への効果を示す図面。 ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの細胞内ＲＯＳ生成抑制作用を示す図面。 ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの細胞内ＮＯ生成抑制作用を示す図面。

本発明で使用するデヒドロカワイン系化合物（Ｉ）は、ゲットウの根茎抽出物から、あるいはこれから得られた成分の代謝物として得られるものである。このデヒドロカワイン化合物（Ｉ）には、次の式（Ｉａ）で表される５,６−デヒドロカワイン（ＤＫ）、次の式（Ｉｂ）で表されるデヒドロ−５,６−デヒドロカワイン（ＤＤＫ）および次の式（Ｉｃ）で表されるヒスピジン（ Hispidin；６−（３,４−ジヒドロキシスチリル）−４−ヒドロキシ−２−ピロン）を含む。

上記化合物のうち、ＤＫおよびＤＤＫは、ゲットウ（月桃）（学名：Alpinia zerumbet）の根茎抽出物中に含まれている化合物であり、これから単離することにより得ることができる。

このゲットウは、ジンジベラセアエ・ショウガ科植物で、世界中の亜熱帯および熱帯の領域に広く分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布している。このものは、伝統的な生薬として、その降圧剤、抗過運動症剤、抗精神病薬、酸化防止剤、血管弛緩剤、抗糖尿病剤、精神薬理剤等の性質が利用されている。

ゲットウの根茎から抽出物を得るには、まず、新鮮なゲットウの根茎を、適当な大きさ（例えば、２〜３ｍｍ程度）に細断し、これを水、エタノール等の低級アルコールまたはこれらの混液（以下、「抽出溶媒」ということがある）で抽出する。

次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、その３０ないし５０重量倍の抽出溶媒を加えた後、２４ないし４８時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒は前記の通りであり、これらは、例えば、５０ないし８０容量％程度の、任意の割合のエタノール−水混液のような混合溶媒であっても良い。この抽出に当たっての溶媒の温度は、室温ないし１００℃程度であり、８０℃以上の熱溶媒であることが好ましく、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌すればよい。

斯くして得られるゲットウ根茎からの抽出物は、必要に応じて濾過、遠心分離等により固液分離し、液状のゲットウ抽出物を得ることができる。また、更に必要により凍結乾燥などの手段で乾燥させることで粉末状のゲットウ抽出物とすることができる。

このゲットウの根茎抽出物から、ＤＫおよびＤＤＫを得るには、例えば、図１に示す手順に従って分離すればよい。

すなわち、ゲットウ抽出物にヘキサン等の非極性溶媒を加え、十分攪拌した後、非極性溶媒相を分離取得する。ついで、この非極性溶媒相から非極性溶媒を留去した後、残留した固体物に水に加えて懸濁液とし、温度が１００℃になるまで加熱する。

この加熱した懸濁液を濾過し、濾液と残渣に分け、残渣部分から分取用高速液体クロマトグラフィー等の分離手段により、ＤＫを得ることができる。一方、濾液部分を、４℃で２４時間、冷蔵庫内に放置し、析出した固体の再結晶を繰り返すことにより純粋なＤＤＫを得ることができる。

このようにして得られた、ＤＤＫやＤＫは、必要に応じてこれを精製した後、抗肥満剤の有効成分として使用することができる。

一方、式（Ｉｃ）で表されるヒスピジンは、薬用きのこであるフェリナス・リンテウス（ Phellinus linteus ）から得られるフェノールの化合物として既に報告されたものであり（Chen, W.ら、“ Chemico-Biol. Interact. ”（2012） 199, 137-142.）、市販もされている化合物である。また、本発明者らが先に報告した、５,６−デヒドロカワイン（ＤＫ）を胃で加水分解し、これを更にＣＹＰ２Ｃ９を含むウサギの肝臓マイクロソームで代謝させることで得ても良い（Upadhyay, A.ら、“ In proceedings of 16th international conference on cytochrome P450.” Shoun, H., Ohkawa, H., Eds., Nago: Okinawa, Japan. 2009, pp 31-34.)。

上記デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）のうち、ＤＫとＤＤＫについては、抗潰瘍および抗血栓活性を有し、ウサギの血小板の凝集とこれからのＡＴＰ遊離を阻害することが知られている。また、ＤＫは抗真菌剤およびインテグラーゼ抑制剤としての作用も知られている。更に、ヒスピジンは、パーオキシナイトライトが介在するＤＮＡ障害とヒドロキシル・ラジカル発生に対する防衛的活性を有し、また、膵臓のβ細胞を過酸化水素障害から保護することが知られている。

しかしながら、これらの化合物の何れも、ｃＡＭＰの細胞内濃度に影響を与え、グリセロール遊離の刺激、脂質蓄積の抑制、トリグリセリド含有量の減少、ＧＰＤＨおよび膵リパーゼの抑制等の作用を有することについては未だ報告を見ない。同様に肥満では、脂肪組織において、脂肪細胞の分化に重要な役割を果たすスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル等のラジカルや過酸化水素、一重項酸素等の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生が促進されるなど酸化ストレスが深く関与するところ、上記化合物が、脂肪細胞におけるＲＯＳ及び一酸化窒素（ＮＯ）の生成を有効に抑制することについてこれまで知られていない。

上記したデヒドロカワイン系化合物（Ｉ）を有効成分とする抗肥満剤の調製は、治療有効量の当該化合物を、製薬上許容される任意成分、例えば、医薬成分として許容される公知の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等と組み合わせ、混合することにより行うことができる。

本発明の抗肥満剤は、経口でも非経口でも投与することができる。経口投与用の本発明抗肥満剤は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与用の本発明抗肥満剤は、水性又は油性懸濁注射剤、坐剤、点鼻液等として用いることができる。

抗肥満剤でのデヒドロカワイン化合物（Ｉ）の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり当該化合物として約１０〜１００ｍｇであり、好ましくは、約５〜５０ｍｇであり、必要に応じて数回に分け投与すればよい。また、非経口投与の場合は、成人１日あたり約５〜５０ｍｇ、好ましくは、約５〜１０ｍｇを投与すれば良い。

なお、本発明の抗肥満剤の有効成分として、ゲットウ根茎の抽出物を使用する場合の製剤化は、上記カワイン系化合物に準じれば良く、投与量は、通常、経口投与の場合、成人１日あたりゲットウ抽出分（乾燥固形分）として約１００〜５００ｍｇであり、好ましくは、約５０〜１００ｍｇであり、必要に応じて数回に分け投与すればよい。また、非経口投与の場合は、成人１日あたり約５０〜１００ｍｇ、好ましくは、約１０〜５０ｍｇを投与すれば良い。

さらに、ゲットウ抽出物は、医薬としてのみならず、健康食品として利用することが可能であり、肥満の軽減、予防等を目的として、日常の食事などで摂取することも可能である。

このような健康食品としてのゲットウ抽出物の利用は、これを適宜、賦形剤等の製剤原料に配合し、適宜、健康食品として許容される形態に製剤化したり、またはこれを他の食品素材と組合せ、調理することで食品とすることにより行うことができる。

次に参考例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例で使用した材料等は、次のように入手し、統計処理は下のように行った。

＜ 化学物質および測定試薬 ＞
ｐ−ニトロフェニールブチレート（ＮＰＢ）、リパーゼ（タイプII：ブタ膵臓由来)、ＭＴＴ（３−（４,５−ジメチル−２−チアゾリル））−２,５−ジフェニルテトラアゾリウムブロミド）インシュリン、フリーグリセロール検出用キット、標準グリセロール、モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＳ）、オイル・レッド・Ｏ（Oil Red O）、ｃＡＭＰ酵素免疫検出用キットおよびヒスピジンはシグマ・アルドリッチ・ケミカル社（セントルイス，ＭＯ、ＵＳＡ)から購入した。

３Ｔ３−Ｌ１細胞は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ；ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。また、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、子牛血清（ＣＳ）、牛胎児血清（ＦＢＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、デキサメサゾン、３−イソブチル−１−メトキシキサンチン（ＩＢＭＸ）および塩化カルシウムは和光純薬工業社（大阪，日本）から購入した。

２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１,３−ジオール（Ｔｒｉｓ）は、関東化学社（東京，日本）から、トリグリセリド・カラーメトリック・アッセイ・キットは、ケイマンケミカル社（アナーバー，ＭＩ ＵＳＡ）から、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）は、バイオビジョン社（１５５Ｓ．ミリピタス，ＣＡ９５０３５，ＵＳＡ）からそれぞれ入手した。なお、以上のすべての試薬は利用可能な最も高いグレードのものであった。

＜ 統計的な処理 ＞
すべての分析評価は、３重で行なわれた。細胞バイアビリティ、グリセロール遊離、細胞内ｃＡＭＰ、トリグリセリド含有量、ＧＰＤＨおよび膵リパーゼのためのデータは、引き続いてダンカンのテストが行われる分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、評価された。データは平均±標準偏差として提示され、ｐ値＜０.０５は有意とした。

参 考 例 １
ゲットウ抽出物の取得：
琉球大学（沖縄県中城郡西原町千原１）のキャンパスからゲットウ（Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. (Family Zingiberaceae) ）を採取した。このゲットウの根茎を、２〜３ｍｍ程度に細断した後、その２０ｇを、６００ｍｌのエタノール溶液（濃度８０％）中に入れ、室温で４８時間抽出した。得られた抽出物を、減圧下で乾燥するまで濃縮し、ゲットウ根茎のエタノール抽出物を得た。

一方、同じゲットウのサンプル各２０ｇを、沸騰状態の１Ｌの水中に３０分浸漬し、その後放冷させ、抽出物をろ過し、真空下、４０℃で乾燥させ、ゲットウ根茎の熱水抽出物を得た。

これらの抽出物それぞれについて、残留物を定量後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（濃度５０％）に溶解し、抽出物が１ｍｇ／ｍＬ濃度であるゲットウ抽出物の各サンプルを得た。

参 考 例 ２
ＤＫおよびＤＤＫの取得：
ゲットウ根茎の熱水抽出物を出発原料とし、図１に示す工程によりＤＫおよびＤＤＫを抽出した。

まず、ゲットウ根茎２ｋｇの熱水抽出物（乾燥前）１０Ｌを、１Lになるまで濃縮後、その５００ｍLのヘキサンで３回、分液ロートで分液操作を行い、ヘキサン相を分離取得した。

ついで、このヘキサン相から、４０℃の温度でヘキサンを減圧下で留去し、固体物を得た。この固形物に、１００ｍＬの水に加え、温度が１００℃になるまで加熱した後、濾過した。

上記の濾過工程で得られる残渣部分を更に下記条件の分取用の高速液体クロマトを用いて精製し、ＤＫを１００ｇ当たり１８.８ｍｇ得た。

カラム：
ＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｚ（１５.０×０.４６ｃｍ ｉ.ｄ.：
５μｍ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ）
移動相Ａ： 水（０.１％酢酸）
移動相Ｂ： メタノール（０.１％酢酸）
流 速： ０.８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長： ２８０ｎｍ
移動相の濃度勾配：
０から１０分までは、移動相Ａと移動相Ｂの５０：５０混液から、１００％移動相Ｂ まで変化する濃度勾配
１０から２０分までは、１００％移動相Ｂで変化なし
２０から２１分までは、１００％移動相Ｂから、移動相Ａと移動相Ｂが５０：５０混 液まで変化する濃度勾配

一方、上記の濾過工程で得られる濾液部分は、４℃で２４時間冷蔵庫内に放置し、析出した固体を濾取し、ＤＤＫを原料１００ｇ当たり２４.１ｍｇ得た。上記ＤＫとＤＤＫの分析ＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。

得られたＤＤＫおよびＤＫについて、そのＣＤＣｌ_３中の、^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）スペクトルを、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＡ６００（ＪＥＯＬ、日本）で測定したところ、下記の通りであった。化学シフトは、ＴＭＳに対するｐｐｍ（δ）で示した。２ＤＮＭＲ（Ｈ，Ｃ−ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ）試験は、標準パルスシーケンスを用いて行った。

ＤＤＫ：
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ；
２.７３−２.７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、２.９６−２.９７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２）、
３.７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３）、５.４２（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、５.７２（ｓ，１Ｈ，
ＣＨ）、７.１８−７.２９（ｍ，５Ｈ、aromatic）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ；
３２.８０（ＣＨ_２）、５５.８０（ＯＣＨ_３）、１００.２５（ＣＨ）、１２６.４１
、１２８.５７、１２８.５７、１２８.２７、１２８.２７、１３９.８２（aroma-
tic）、１６４.３２（ＣＨ）、１６４.９３（ＣＨ）、１７０.０（Ｃ）

ＤＫ
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ；
３.７９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）、５.５１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、５.９７（ｓ，１Ｈ，
ＣＨ）、６.８１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、７.３１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、７.３２（ｍ，
５Ｈ、aromatic）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ；
１６３.２８（ｃ）、８８.６５（ＣＨ）、１７１.２１（ｃ）、１００.９５（ＣＨ）
、１６０.３（ｃ）、１１８.５３（ＣＨ）、１３５.３６（ｃ）、１３１.８８、
１２８.２７、１２９.７５、１２９.２７、１２７.９８（aromatic）、５６.２４
（ＯＣＨ３）

また、得られたＤＤＫおよびＤＫの量は、生の根茎から、それぞれ２４.１ｍｇ／１００ｇおよび１８.８ｍｇ／１００ｇであった。

参 考 例 ３
肥満細胞の培養と分化：
細胞として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を用い、これを、２％のグルタミンと、１０（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清（ＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、密集状態（confluency）で育てた。密集状態に達した２日後に、細胞は、追加の２日間、１０％ＦＢＳ、０.５ｍＭ ＩＢＭＸ、１μＭデキサメサゾンおよび１０μＭインシュリンを含むＤＭＥＭ培地中で育てることによって脂肪細胞に分化するように刺激された。細胞は、それから更に、２日間、１０％ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬインシュリンを含むＤＭＥＭ中で維持され、更に４日間、１０％ＦＢＳのみを含むＤＭＥＭで培養された。

この結果、細胞の９０％以上は、脂質滴が蓄積された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に分化していた。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、異なった濃度の試験化合物で処理され、試験中を通して５％のＣＯ_２を含む加湿されたインキュベーター中で、３７℃に維持した。

実 施 例 １
細胞生存性試験：
ヒスピジンと、ゲットウ根茎からの化合物であるＤＫおよびＤＫＫが肥満細胞の生存性に与える影響をＭＴＴ分析評価で調べた。すなわち、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、１００から２５０μｇ／ｍＬの濃度の各試験化合物の存在中、５％ＣＯ_２の条件下、３７℃で７２時間培養した。５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）８０μＬを各ウエルに加え、次いで３７℃で４時間インキュベートした。

インキュベートの後、培地を取り去り、生成したホルマザンの結晶を、０.０４Ｍ ＨＣｌを含むイソプロパノール２００μＬに溶解した。３７℃、３０分間のインキュベーションの後、緩やかに撹拌し、混合物を１３,０００ｇで２分間遠心し、上清を吸引した。

この上清を、マルチ−ウエルプレートリーダーを用い、５７０ｎｍの吸収を測定した。各処理において、細胞バイアビリティは、下記式を使用し、パーセント（％）として計算した。

細胞バイアビリティ（％）＝（処理試料の吸収／非処理試料の吸収）×１００

この結果、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫは、２５０μｇ／ｍＬでそれぞれコントロールと比較し、僅か３.８３±０.３１％、２.５８±０.２６％、１.１１±０.５６％の細胞バイアビリティの減少を示し、試験された化合物のいずれも、３Ｔ３−Ｌ１の生存性に対して有意な影響を与えなかった（図３）。

実 施 例 ２
グリセロール遊離の測定：
グリセロール遊離量の測定は、文献（ Kim, Y. S.ら、”J. Ethopharm. ”（2010） 130, 621-624）に記載された方法により行われた。すなわち、まず、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１００〜２５０μｇ／ｍＬの濃度範囲の試験化合物の存在下、７２時間培養し、試験サンプルとした。

次に、この試験サンプル５０μＬを、遊離グリセロール測定試薬２００μＬと混合した。この混合物を、１５分間、３７℃で培養し、そして、マイクロプレートリーダーを使用し、溶液の吸収を５４０ｎｍで測定した。ブランクとしては上記試験サンプルと同量の蒸留水を、標準としても、同量のグリセロール標品を用いた。グリセロール濃度は公式によって計算された。

グリセロール濃度＝［（試料の吸収−ブランクの吸収）／
（標準の吸収）−（ブランクの吸収）］×標準の濃度

この結果、２５０μｇ／ｍＬでは、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫはグリセロール遊離を、それぞれ、２７６.４±０.８％、２２５.１±０.６％、１３７.３±０.５％に増加させた。また、１００μｇ／ｍＬでさえ、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫはグリセロール遊離を、１４０.５±０.９％、１３９.９±０.４％、１０９.２±０.６％に増加させた。

このように、非処理コントロールと比べ、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫはグリセロール遊離を明らかに増加させた（図４）。

実 施 例 ３
細胞内ｃＡＭＰの測定：
まず、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、試験化合物の存在あるいは存在下で７２時間培養した。次いでこの分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、ホスホジエステラーゼ活性を抑制するために０.１Ｍ ＨＣｌで溶解した。更に、上清を集め、中和し、希釈した後、細胞融解物由来ｃＡＭＰと競合させるため、混合物中に所定量のコンジュゲートを加え、９６ウエルプレートに固定されたウサギポリクローナル抗体と結合させた。

過剰なコンジュゲートと結合しなかったｃＡＭＰを取り除くためにプレートを洗浄した後、各ウエルに、結合した酵素の活性を調べるため、基質溶液を加えた。ｃＡＭＰ濃度は、ｃＡＭＰ免疫学的検定法キット（ Lee, Y. S.ら、”BMB reports. ”（2010）461-467.27）を使用することで測定された。発色が頂点に達した後に、吸収を４１５ｎｍで読んだ。なお、吸収の強度は、細胞溶解物中のｃＡＭＰの濃度に逆比例している。

この結果、２５０μｇ／ｍＬのヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫの各化合物は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を、それぞれ、８１.２±０.０６％、６７.０±１.２６％、５６.９±０.１９％に増加させた。また、１００μｇ／ｍＬでも、ｃＡＭＰは、５８.８±０.８９％、４４.４±４.２％、４３.１±４２２％と有意に増加させており、非処理試料と比べ、全ての化合物において、細胞内ｃＡＭＰが顕著に増加したこと（ｐ＜０.０５）が示された（図５）。

一般に、脂肪細胞における脂肪分解のレートは、臨界的にｃＡＭＰの細胞内濃度に依存していることが知られているので、これらの結果は、脂肪分解率の増加の原因が、ヒスピジンとゲットウ根茎からの化合物が細胞内ｃＡＭＰの顕著な増加（ｐ＜０.０５）に関連があるだろうということを示している。

実 施 例 ４
オイル・レッドＯ染色による脂質蓄積の評価：
細胞内脂質蓄積を、オイル・レッド Ｏ（Oil Red O）を使用して調べた。まず、分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１００から２５０μｇ／ｍＬの濃度範囲の試験化合物の存在下で７２時間インキュベートした。インキュベートされた細胞は、ＰＢＳで二回洗い、次いで、室温下で１時間かけ、ホルマリンにより固定された。

固定された細胞は、水で２回、６０％イソプロパノール水溶液で１回洗浄され、次いでオイル・レッド・作用溶液と共に３時間インキュベートし、染色した。染色された３Ｔ３−Ｌ１肥満細胞は、 蒸留水で４回洗浄した。

このように染色処理された細胞の代表的なイメージを、オリンパス顕微鏡(ヤシマ・オプティカル社; 東京(日本))で観察した（図６中、Ａ）。この写真に示されるように、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫは用量依存的に脂質蓄積を抑制した。

一方、定量化は着色した細胞をイソプロパノールで溶かし、マルチ−ウエル プレート リーダーにより、５００ｎｍの吸収を測定し、オイル・レッド Ｏの強度を以下の式を使用することで未処理試料と関連づけることにより行われた。

％強度 ＝ (Abs.treatment / Abs.control）×１００
ここで、Abs.controlは、未処理サンプルの吸収であり、Abs.treatmentは処理
サンプルの吸収である。

２５０μｇ／ｍＬの処理では、脂質蓄積はヒスピジンとＤＫとの処理で、それぞれ４７.８±０.１６％および４８.０±０.２％阻害された。これはＤＤＫに関して観測された阻害（３６.８±１.２％）よりかなり顕著な阻害であった（ｐ＜０.０５）。従って、ヒスピジンとＤＫは、ＤＤＫより効果的に脂質蓄積を抑制する。同様に、１００μｇ／ｍＬの処理では、ヒスピジン、ＤＫおよびＤＤＫは、コントロールに比べ、３２.３±０.０６％、２７.４±０.００５％および２８.０±０.０５％と有意に脂質蓄積を阻害した（図６中、Ｂ）。

この結果、ヒスピジンとＤＫは非処理細胞と比べ、脂質滴サイズを有意に減少させることがわかった。

実 施 例 ５
トリグリセリド含有量の測定：
分化の開始９日目の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、濃度が１００から２５０μｇ／ｍＬの範囲の試験化合物の存在、５％ＣＯ_２の雰囲気下、加湿されたインキュベーター中で、７２時間、３７℃で培養した。培養された細胞を、溶解バッファ（１％トリトンＸのＰＢＳ）中で集め、溶解した。そして、細胞の中の総トリグリセリド含有量を、市販のトリグリセリドアッセイキット（DiaSys Diagnostic Systems GmbH、Holzheim、ドイツ)を使用することで測定した。

この結果、２５０μｇ／ｍＬで、ヒスピジンとＤＤＫは、それぞれトリグリセリド含有量を７９.５±１.３７および７０.２±１.４％に減少させたが、これは非処理コントロールとは明らかに異なっていた（ｐ＜０.０５）。それほどではないにせよ、２５０μｇ／ｍＬ ＤＫでもトリグリセライド含量を６３.４±１.７％に低下させた。１００μｇ／ｍＬで、ヒスピジン、ＤＤＫおよびＤＫは、それぞれトリグリセライド含量を、７０.３±１.５４％、５９.１±１.１２％、５１.８±０.０５％に低下させた。このように、試験化合物のすべてで、用量依存的に細胞内トリグリセリドを顕著に減少させることが示された（図７）。

実 施 例 ６
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素分析：
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性は、ワイズとグリーンの手順（Wiseら、”J. Biology. Biochemistry.”（1979） 254, 273-275）により測定した。まず、分化開始９日後の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、濃度が１００から２５０μｇ／ｍＬの範囲の試験化合物の存在、５％ＣＯ_２の雰囲気下、加湿されたインキュベーター中で、７２時間、３７℃で培養した。

培養された細胞は、氷冷されたＰＢＳで注意深く２回洗浄され、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）特異的活性を測定するため、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.５）に溶解された。グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）特異的活性は、マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍでＮＡＤＨ産物の量を測ることで測定した。

この結果、２５０μｇ／ｍＬのヒスピジン、ＤＤＫまたはＤＫは、それぞれ、９７.８％、９４.２％、９０.５％と、顕著にＧＰＤＨを阻害することが示された。その上、１００μｇ／ｍＬという低濃度でも、ヒスピジン、ＤＤＫおよびＤＫは、コントロールと比べ、８４.７％、８１.１％および７４.６％でＧＤＰＨを阻害した（図８参照）。

ＧＰＤＨは、トリグリセリド合成の中心である脂質代謝のための重要な酵素であるから、ＧＤＰＨの阻害は、トリグリセリドを低下させるための1つの可能なメカニズムであると考えられる。この意味で、上記結果は、ヒスピジン、ＤＫ、ＤＤＫの肥満防止作用メカニズムを示すと言える。

実 施 例 ７
膵リパーゼ分析評価
膵リパーゼ活性は、キムらによって報告された手順（Kim, J.ら、”Arch. Pharm. Res.”（2009） 32, 983-987.）を若干変更した方法により測定された。簡単に言うと、１７０μＬのトリス緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ_２，ｐＨ７.０）に、ブタ膵リパーゼ２.５ｍｇ／ｍＬを含む、１０ｍＭ ＭＯＰＳおよび１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ６.８の溶液を１０μＬ加えることにより酵素バッファー溶液を調製した。この酵素溶液２０μＬに、その濃度が、１０、１００または２５０μＬとなるよう、各試験化合物（２０μＬ）を加え、混合し、次いで３７℃で１５分間培養した。

この培養物に、基質として１０ｍＭの ｐ−ニトロフェノール ブチレート（ｐ−ＮＰＢ）を含むジメチルホルムアミド溶液５μＬを加え、３７℃で３０分間培養された。リパーゼ活性は、培養後にマイクロプレートリーダーによる４０５ｎｍのＵＶ吸光を検出し、ｐ−ＮＰＢのｐ−ニトロフェノールへの加水分解をモニターすることによって、測定した。

リパーゼ活性の阻害（阻害％）は、未処理サンプルと試験化合物を含むサンプルを比較した場合の光学密度の減少のパーセンテージで表現した。阻害％は、以下のように計算された。

阻害％＝１００−（Ｂ−ｂ／Ａ−ａ）×１００
ここで、Ａは阻害剤なしの活性、ａは阻害剤なしの負のコントロールの活性
、Ｂは阻害剤ありの活性、ｂは阻害剤ありの負のコントロールの活性である
。

この結果、ＤＤＫは、５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）が８.４±２.８μｇ／ｍＬと最も強力な阻害剤であり、ヒスピジン（ＩＣ_５０＝１８.８±０.８μｇ／ｍＬ）とＤＫ（ＩＣ_５０＝７４.４±３.１μｇ／ｍＬ）がこれに続いた。一方、比較のために、公知のリパーゼ抑制剤であるケルセチンについての結果を挙げるが、このもののＩＣ_５０は、３８.５±１.４μｇ／ｍＬであり、ＤＫＫとヒスピジンは、試験管内試験での膵リパーゼに対して、ケルセチンより優れた阻害剤であることが示された（図９）。

遊離脂肪酸の吸収を減少させるための最近提案された戦略は、膵リパーゼを阻害することでトリグリセリド消化を遅らせることであるが、ＤＫＫとヒスピジンは、膵リパーゼに対して、ケルセチンより優れており、これらは膵リパーゼ阻害剤として最適なものとなる能力を有することが示唆される。

実 施 例 ８
活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）生成阻害試験：
（１）細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）測定
３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ウェルプレートに２×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種し、参考例３と同様にしてコンフルエントまで培養し、分化させた。ＲＯＳ生成は、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）アッセイによって検出した（Oliveira, H.R.; Verlengia, R.; Carvalho, C.R.; Britto L.R.; Curi, R.; Carpinelli, A.R. Pancreatic β-cells express phagocyte-like NAD(P)H oxidase. J. Diabetes. 2003, 52, 1457-1463.）。ＮＢＴは、ＲＯＳにより還元され、ホルマザンと呼ばれる暗青色で不溶性形態になる。分化後、細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を０．２％ＮＢＴ含有ＰＢＳ１００μＬ中で９０分間インキュベートした。暗青色のホルマザンを５０％酢酸に溶解し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１０に示す。

（２）細胞内一酸化窒素（ＮＯ）生成測定
（１）と同様にして、細胞を９６ウェルプレートに播種し、分化させた。亜硝酸塩生成（ＮＯ_２）アッセイを用いて測定した( Fang, X.K.; Gao, J.; Zhu, D.N. Kaempferol and quercetin isolated from Euonymus alatus improve glucose uptake of 3T3-L1 cells without adipogenesis activity. J. Life Sci. 2008, 82, 615-622.)。細胞を１０又は２０μｇ／ｍＬの濃度の試験化合物で２４時間インキュベートした。上清（１００μＬ）及びグリース試薬（１００μＬ、１％スルファニルアミドと０．１％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩含有５％リン酸の１：１混合物（ｖ／ｖ））を、９６ウェルプレート中で混合し、室温で１０分間インキュベートした。マイクロプレート分光光度計を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線により亜硝酸塩濃度を推定した。結果を図１１に示す。

結果：
ヒスピジン、ＤＫ、ＤＤＫはいずれも脂肪細胞におけるＲＯＳ生成を有意に阻害した。濃度２０μｇ／ｍＬにおける阻害率は、ヒスピジンが４５．８±１．１９％，ＤＫは４３．８±０．７０％、ＤＤＫは４２．４±３．２４％であった。またＮＯ生成も有意に抑制し、ＮＯ生成量は、ヒスピジンにより７２．０±０．２６％、ＤＫにより５６．８±１．０６％、ＤＤＫにより５２．３±２．７６％に減少した。

本発明のデヒドロカワイン系化合物（Ｉ）は、肥満に関連する機序に作用し、これを低減化させる活性を有するものである。従って、このものは肥満に対してこれを治療、抑制する効果を有するものであり、医薬品や、健康食品等の配合成分として利用しうる物である。また、デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）を含むゲットウ根茎の抽出物も、同様、抗肥満成分として、医薬品や、健康食品等の配合成分として利用しうる。

Claims (5)

1. 次の式（Ｉ）
   （式中、Ｒ^１は、メチル基または水素原子を、Ｒ^２は水酸基または水素原子を示し、点線は結合の存在または不存在を示す）
   で表されるデヒドロカワイン系化合物を有効成分とする抗肥満剤。
2. デヒドロカワイン系化合物（Ｉ）が、次の式（Ｉａ）〜（Ｉｃ）
   の何れかである請求項１記載の抗肥満剤。
3. ゲットウの根茎抽出物を有効成分とする抗肥満剤。
4. 経口投与用の剤型である請求項１ないし３の何れかの項記載の抗肥満剤。
5. 健康食品または食品の形態である請求項１ないし４の何れかの項記載の抗肥満剤。