JP2016019502A - 新規糀菌、その糀菌を用いた糀調味料・糀飲料、及び、糀調味料・糀飲料の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)染色体DNAの取得
サブロー培地(グルコース4.0%、ポリペプトン1.0%、pH5.6)100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アスペルギルス・オリーゼBA−10230又はアスペルギルス・オリーゼBA−11400を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、DNA抽出用緩衝液(5.0%SDS、0.1M、NaCl、50mM Tris−HCl、pH8.0)15mlを加えゆっくり振盪して溶解した。遠心分離(5,000rpm、6min、rt.)により上清を得、フェノール/クロロホルム抽出を3回、エーテル抽出を2回行い、エーテルを蒸発させた後、3M酢酸ナトリウム1ml、エタノール25mlを加え、−30℃で30分放置した。遠心分離(12,000rpm、10min、4℃)により染色体DNAを回収し、70%エタノールにて洗浄した後、TE400μlに溶解した。次に、得られたDNA溶液にRNase10μl(0.132U)を加え、37℃で1時間RNase処理した後、プロテイナーゼKを5μl(0.6U)加え、50℃で1時間処理した。フェノール/クロロホルム抽出(2回)、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出(1回)を行った後、エタノール沈殿にてDNAを回収した。70%エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、TE200μlに溶解した。
(2)18SrDNA遺伝子断片の増幅
P1 5‘−ATCTGGTTGATCCTGCCAGT−3’(配列番号:1)
P2 5‘−AATGATCCTTCCGCAGGTTC−3’(配列番号:2)
前述の方法で得られた染色体DNA を鋳型DNA としてP1プライマーとP2プライマーの組み合わせでPCR反応を25サイクル行った。得られたDNA断片の塩基配列「配列番号:3」(配列番号:BA−10230の18SrDNA塩基配列)、及び「配列番号:4」(配列番号:BA−11400の18SrDNA塩基配列)を決定した。
「配列番号:3」、「配列番号:4」に示した塩基配列を既知の塩基配列データーベースと比較したところ、いずれもアスペルギルス・オリーゼの18SrDNA塩基配列と99%以上の相同性を示したため、本菌株をアスペルギルス・オリーゼと同定した。
市販種糀及びイチビキ分離株(土壌、米等自然界より分離)約200株をPDA平板培地に塗沫し、生育した糀菌を90%精米の米を用いた固体培養(30〜35℃で2日間)に供した。得られた米糀10gを水50mlで室温3時間抽出濾過後、その上清0.4ml相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生株を選択した。
上記スクリーニングで得られたセリンプロテアーゼ高生産株の胞子懸濁液を調製し、常法に従ってUV照射(15W殺菌灯下、7分、致死率95%)を行い、変異を誘発させた。UV処理した胞子懸濁液をPDA平板培地に塗沫し、生育した候補株をPDA斜面培地に釣菌して30℃、3日間培養した。得られた変異株を90%精米の米を用いた固体培養(30〜35℃で2日間)に供した。得られた米糀10gを水50mlで室温3時間抽出濾過後、その上清0.4ml相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生変異株を選択した。
以上のスクリーニングまたは突然変異法により得られたセリンプロテアーゼ高産生株の米糀における酵素活性の評価は以下の手順で行った。
上記で得られた粗酵素液0.4mlに対して、各種阻害剤溶液0.1mlを終濃度0.1mMになるように加え、室温で10分間放置した。10分後、予め、30℃に保温しておいたpH6.0に調整した2%ミルクカゼイン溶液1.0mlを加え、30℃で20分反応させた。0.4Mトリクロロ酢酸溶液2.5mlを加えて反応を停止させ、室温で10分間放置した。10分後、No.6ろ紙でろ過してろ液を得、ろ液0.5mlに対して0.4M炭酸ナトリウム溶液2.5mlとFolin試薬(1N)0.5mlを加えてよく混和し、室温で10分間放置した後、マイクロプレートリーダー(テカン社製サンライズレインボー)を用いて660nmの吸光度を測定した。
(1)総プロテアーゼ活性:阻害剤溶液に水を用い、上記操作を行い、1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(2)酸性プロテアーゼ活性:阻害剤溶液にペプスタチンAを用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、ペプスタチンAにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(3)セリンプロテアーゼ活性:阻害剤溶液にフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、PMSFにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(4)セリンプロテアーゼ活性の酸性プロテアーゼ活性に対する相対活性は、上記セリンプロテアーゼ活性÷酸性プロテアーゼ活性×100(%)で算出した。
精米歩合90%で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に20時間浸漬し、1時間水切りした後、30分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米200gに予め用意しておいた市販の種糀を接種し、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養し、得られた米糀150gに上記と同様に蒸煮した掛米410g、お湯320g、アミラーゼ製剤0.5g、市販のセリンプロテアーゼ(商品名:オリエンターゼ22BF、HBI社製)0.4gを添加して50〜60℃で一晩糖化させた。得られた糖化物をみそスリ機(スクリュー押出式、通し孔径0.4mm)にかけ、その後85℃で加熱処理を施すことで甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
予め製造しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−10230(NITE P−01871)を含む種糀を接種したほかは実施例1と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は55.1%であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。同様に、アスペルギルス・オリーゼ変異株BA−11400(NITE P−01872)を含む種糀を接種した他は実施例1と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は54.8%であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
上記実施例1で得られた米糀をさらに培養を継続し、4日間培養した。その結果得られた米糀は緑色の胞子が着生し、甘酒としての商品価値はなくなってしまったが、その酸性プロテアーゼとセリンプロテアーゼの相対活性はBA−10230で195%、BA−11400で186%とセリンプロテアーゼの相対活性が大幅に増大した。得られた米糀を使用して作成した甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。上記麹菌変異株にさらに変異を導入し、胞子着生し難くする、胞子の色を白色化する、又は、生育速度を早くすることで、相対活性にして200%近い変異株を実用に供し得ることが示唆された。
市販のセリンプロテアーゼに代えて酸性プロテアーゼ(商品名:オリエンターゼAY、HBI社製)を添加したほかは実施例1と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
市販のセリンプロテアーゼに代えてメタルプロテアーゼ(商品名:ヌクレイシン、HBI社製)を添加したほかは実施例1と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
市販のセリンプロテアーゼを加えなかったほかは実施例1と同様にして甘酒を得た。得られた甘酒をマスコロイダー(機種:スーパーマスコロイダーMKCA6−2Jα、砥石:MK E)(クリアランス:軽接より−100μm、回転砥石の回転速度:1,800rpm)で破砕処理した。この手法によって70メッシュでもメッシュ上に残らない甘酒ペーストを得るための破砕処理速度は、118kg/hであり、実施例1の手法で同水準のものを生産するための処理速度は296kg/hであり、本発明を用いることで摩砕処理速度は、およそ3倍に向上した。
精米歩合90%で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に20時間浸漬し、1時間水切りした後、30分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米4kgに予め用意しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−10230(NITE P−01871)又はアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−11400(NITE P−01872)を含む種糀をそれぞれ接種し、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養し、得られた米糀450gに、お湯550gと食塩111gを添加して30℃で1週間熟成させた。得られた塩糀は、色、味、香りとも通常の塩糀と遜色なかった。得られた塩糀中のプロテアーゼ活性を分別定量したところ、酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性はそれぞれ54.1%、50.2%であった。
比較として、市販の塩糀(H社製、M社製)を同様に測定したが、セリンプロテアーゼ活性は認められなかった(相対活性10%未満)。
結着材にでんぷんを使用しないスライスハム(伊藤ハム社製)4つ切りにし、5枚1組(25g)として、これに実施例3で得た塩糀5gを加えて5℃で2日間漬け込んだ。比較として市販の塩糀(H社製、M社製)を用いて、同様にスライスハムの漬け込みを行った。
その結果、写真に示すように、実施例3で得たセリンプロテアーゼを含む塩糀で漬け込んだスライスハムはボロボロになるまで分解されていたが、酸性プロテアーゼ活性は同程度のH社製の塩糀も酸性プロテアーゼが半量程度のM社製塩糀のいずれも、スライスハムの顕著な分解は起こらなかった。
厚さ1cmにカットした豚ロース肉(約100g)に対して実施例3で得られた塩糀又は市販の塩糀20gを袋に入れ、よく混ぜて肉と馴染ませた後、密封して5℃で3時間漬け込みを行った。3時間後、布巾で豚肉をはさんで軽く押して水気と塩糀を軽く拭い取った。その後、肉を袋に入れ替え、密封後、75℃の水槽中で30分間加熱した。加熱したロース肉を巾1.5cmにカットし、柔らかさを比較した。その結果、下記の通り、実施例3で得られた塩糀で漬けた豚ロース肉は明らかに市販の塩糀で漬けたものよりも柔らかいと評価された。やわらかさの評価は、すべての試料を盲検化した後、パネラー10名による官能評価により行い、柔らかさの基準を7段階で評価し、各パネラーの点数の平均値で比較した。なお、評価点数は7点に近いほど、柔らかいことを示す。
Claims (9)
- ニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae)に属し、米糀において、セリンプロテアーゼを産生する糀菌。
- 米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定(30℃、pH6.0)において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した、酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が20%以上200%以下である請求項1に記載の糀菌。
- コウジカビがAspergillus oryzae NITE P−01871又はAspergillus oryzae NITE P−01872である請求項1又は請求項2に記載の糀菌。
- 糀菌を用いた糀調味料・糀飲料の製造方法であって、仕込み原料に含まれる穀物の糖化工程において、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む糀調味料・糀飲料の製造方法。
- セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、請求項1乃至請求項3のいずれかに記載の糀菌を仕込み原料に含まれる穀物に接種することを含む請求項4に記載の糀調味料・糀飲料の製造方法。
- セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、セリンプロテアーゼを酵素剤として添加することを含む請求項4又は請求項5に記載の糀調味料・糀飲料の製造方法。
- 仕込み原料に含まれる酒粕の処理工程において、セリンプロテアーゼの濃度を増加させる操作を含む糀調味料・糀飲料の製造方法。
- 請求項4乃至請求項7のいずれかに記載の糀調味料・糀飲料の製造方法によって得られる糀もしくは糀調味料・糀飲料。
- 酵素活性を有する若しくは失活したセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片を含む糀調味料・糀飲料。
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