JP2015537047A

JP2015537047A - 鉱物成核剤を利用した凍結方法

Info

Publication number: JP2015537047A
Application number: JP2015546097A
Authority: JP
Inventors: ジョンマリー，ベンジャミン; フランシスホエール，トーマス; アトキンソン，ジェームス; ジョンモリス，ジョージ
Original assignee: University of Leeds; Asymptote Ltd
Current assignee: University of Leeds; Asymptote Ltd
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2015-12-24
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: CA2893102C; BR112015013502A2; CN104918487B; EP2931033B1; JP6212130B2; CN104918487A; US10015958B2; GB201222241D0; WO2014091216A1; CA2893102A1; BR112015013502B1; US20150327538A1; GB201308402D0; EP2931033A1

Abstract

【解決手段】本発明は、鉱物成核剤を活用して容器内で生物体または処方体の含水分を凍結させる方法と、鉱物の成核剤としての利用と、鉱物が容器内またはその一部内、あるいはその表面全体上または一部上に存在する容器に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、鉱物成核剤（ｍｉｎｅｒａｌｎｕｃｌｅａｔｏｒ）を利用して容器内での生物体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｎｔｉｔｙ）または処方体（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の含水分を凍結させる方法に関する。さらに、成核剤（核形成剤、ｎｕｃｌｅａｔｏｒ）としての鉱物の利用、及び、容器内またはその一部内、あるいは容器の表面全体上または表面の一部上に鉱物を含んだ容器に関する。

生体材料の保存のためには２つの関連したプロセスが存在する。凍結保存においては、生体材料は凍結され、凍結状態で保存される。フリーズドライ（凍結乾燥）処理においては、凍結された生体サンプル（試料）から水分が除去され、その後に乾燥状態で保存される。フリーズドライ処理はまた（例えば）薬剤の保存および溶質のパターニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）に利用される。

凍結保存は、医療、バイオ技術および獣医学における利用に供するよう、生体サンプルの長期生存を維持するため幅広く活用されている。解凍時の高い生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を確保するためには、保護化合物（凍結防止添加剤あるいは凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ））を加え、制御された冷却速度でサンプルを冷却することが必要である。多くの細胞タイプでは、冷却中に自然発生的に氷成核（氷の核形成、ｉｃｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）をさせるのではなく、核形成（核生成）を制御することによって氷の形成を促すことが望ましい。

凍結保存用のサンプルは一般的に以下のごとき特殊な凍結容器内に入れられる。
・直径が２ｍｍ〜４ｍｍ、長さが１４０ｍｍまでで、容量が０．２ｍＬ〜０．５ｍＬの薄壁管である細管（ｓｔｒａｗ）
・直径が約１２．５ｍｍ、容量が０．５ｍＬ〜５．０ｍＬの広径短管である凍結バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）
・比較的に多い量の凍結保存用の５ｍＬ〜１０００ｍＬの容量のフレキシブルバッグ
・ロボット工学および高処理量スクリーニング処理で利用されるマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅｐｌａｔｅ）、マトリックス管、および他のＳＢＳ規格の容器

細管と凍結バイアルを制御された速度で凍結するために一連の装置が利用できる。それら装置は液体窒素を寒剤として活用でき、あるいは物理的冷凍によって冷却できる。追加的に、いくつかの受動的冷却装置が存在する。それらの装置の一部では、サンプル内で氷の核形成を制御することが許容されるが、当該制御は手動的であってもよく、自動的であってもよい。

制御された速度での凍結処理に続いて、サンプルは低温（典型的には液体窒素の温度（−１９６℃））で凍結状態に保たれる。もし細胞が冷却処理で生き続けるなら、この温度での細胞の生存性又は生存率は保存期間には関係しない。利用が必要になったときに、サンプルは急解凍され（一般的には３７℃に維持された水槽内）、凍結防止剤が取り除かれる。

フリーズドライ（凍結乾燥）処理は、細胞、ワクチン、タンパク質、および他の生物活性化合物を長期に安定化させるために、バイオ技術、医療および獣医学において幅広く活用されている。フリーズドライ処理はまた、再生医学での利用のための骨格材およびマトリックスのごとき構造化材料の作成に利用されており（非特許文献１）、新規セラミックスの製造にも利用されている。フリーズドライプロセスにおいては、含水サンプルが特殊容器（典型的にはガラス瓶）に入れられ、フリーズドライ装置内の冷却棚上で凍結される。凍結後、局部ガス圧は低減され、凍結されたサンプル内の氷が昇華する。サンプルからの水分の排除に続いて、バイアル（ｖｉａｌ）は真空内で暖められ、密閉される。サンプルは常温に曝露され、水が加えられて元に戻される。

フリーズドライ処理においては、サンプルは過度に冷却されがちであるが、これはサンプル毎に氷晶（ｉｃｅｃｒｙｓｔａｌ）構造が変わることを意味する。融点付近の温度における氷成核（氷の核形成、ｉｃｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）では、大きな氷晶を有するサンプルが形成され、急速に昇華する。一方、氷が融点から離れた温度で発生する氷の核成では、サンプルは小さな氷晶を有し、低速で昇華するであろう（非特許文献２）。多数のサンプルを処理するときには、プロセス条件は、最小の氷晶を有するよう、サンプル群における低速乾燥の実行が選択され、結果的に長時間のプロセス時間が必要となり、装置や設備の利用が効率的ではなくなる。氷成核における温度は、プロセス時間と生物活性の回復の両方を決定する重要因子であると考えられている（非特許文献３）。

従来の凍結保存の後において、哺乳類の胚が回復した成功例は、氷点下（通常は−７℃）という高めの温度で氷成核が制御されたものによる。氷が自然発生的に核を成す（ｎｕｃｌｅａｔｅ）ことが許容されるサンプルでは、過冷却の結果として細胞内に氷が形成され、回復度合いが低くなる（非特許文献４）。哺乳動物の精子と幹細胞を含む多くの他の細胞タイプの生存率も、氷成核を制御することで増加される。この処理は一般的に、その中身がそれらの融点以下となるように冷凍容器を冷却し、さらに冷凍容器の外側に、冷却した器具を手動的に接触させ、あるいは冷凍容器を機械的に撹拌することで実行される。この手法は一般的に“植氷（ｓｅｅｄｉｎｇ）”と称される。植氷の弱点は、それが手動的であるために比較的に少ない数のサンプルが処理できるだけであり、サンプルへの物理的接近が必要なことである。

他の物理的な方法は核形成処理を含むように提案されている。例えば、フリーズドライ装置において、サンプル内に降り注ぐ水蒸気の結晶化（雪形成）が核形成を促す。近年、プラクセアコーポレーション（ＰｒａｘａｉｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、サンプルをフリーズドライ装置内でアルゴンによって２８ｐｓｉｇ（プサイグ（ゲージ圧））にまで加圧し、続いて所望の核形成温度にまで冷却する“圧力シフト”プロセスを紹介した。その後、圧力は１ｐｓｉｇにまで低下され、核形成が促される（非特許文献５）。しかし、この取り組みは未だ実験的であり、費用が嵩み、改善が困難であり、小型フリーズドライ装置には不向きである。

幾つかの化学成核剤（時に成核触媒と称す）が氷結保存サンプルの氷成核のために実験された。これら成核剤は、異質性核形成または促進性核形成と称される現象を促す。この例には、ヨウ化銀の結晶、細菌であるシュードモナス・シリンジアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇｅａｅ）、およびコレステロールの結晶が含まれる。この成核剤がサンプルに加えられ、続いて冷却される。サンプル内で十分なレベルの過冷却が達成されたときに氷成核が生じる。この方法は多数のサンプルの処理を可能にするが、それらの毒性または潜在的毒性、あるいは細菌または動物由来に関わる弱点が存在する。知られた成核剤は臨床的な適用のために細胞に採用される可能性が低い。幾つかのこれら成核剤は比較的に高い氷点下温度での氷形成を促すが、製造品質管理基準（ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅ，ＧＭＰ）に沿って製造される可能性は低く、有毒である可能性がある（非特許文献６）。

幾つかの細菌の菌株は−２℃のごとき高い温度で氷を成核することができる（非特許文献７）。しかし、細菌の氷成核活動は環境的成長条件に非常に敏感であり、結果としてタンパク質は熱に敏感である。この環境条件に対する過敏性はそれらをこの適用には不向きにする。高い氷点下温度で氷を成核させる他の（非細菌）生物材料の研究報告が存在する（非特許文献８）。しかし、氷晶核は加熱に対して不安定であり、非常に特性が劣る傾向がある。ヨウ化銀は非常に高い温度で氷形成を触媒することが証明されているが（非特許文献９）、臨床的適用のためのサンプルでは利用できない。

鉱物ダストは比較的に非効率な氷晶核であると考えられている。水滴内に浸された固形粒子のための氷成核データを要約している研究記事は、約−１５℃の鉱物ダストにおける最高凍結温度に言及する（非特許文献１０、１１）。

アイスクリームまたはシャーベット飲料を製造するために削取り面式熱交換器が、水、砂糖、乳製品、着色剤、風味剤および他の添加剤の混合物を大量に凍結するのに使用される。高圧および常時撹拌状態にてこの削取り面熱交換器は混合物を冷却する。一般的に成核は比較的に小数の位置で不作為的に発生する。氷結晶は継続的に成長し、物理的に破壊されて、最終製品内に存在する氷結晶のサイズを小さくする。小さな氷結晶はアイスクリームに大きな氷結晶を含んだアイスクリームよりもスムーズな舌触りを提供するので望ましいと考えられている。しかし、その高い砂糖の含有量のために、−１０℃から−２０℃で保存されたときに大きな氷結晶が成長し、アイスクリームは部分的に溶解して凍結する傾向がある。

ＭａｓｓｉｅＩｅｔａｌ（２０１１），ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＣＭｅｔｈｏｄｓ．１７：７６５−７７４ＳｅａｒｌｅｓＪＡｅｔａｌ（２００１），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ９０：８６０−８７１ＫａｓｐｅｒＪＣ, ＦｒｉｅｓｓＷ（２０１１），ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ７８：２４８−２６３ＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍＤＧ（１９７７），ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ５２．ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｍｓｔｅｒｄａｍＥｄｓＫＥｌｌｉｏｔａｎｄＪＷｈｅｌａｎｐｐ９７− １２７ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓＡＫｅｔａｌ（２０１１），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１００：３４５３−３４７０ＳａｒｉｄａｋｉｓＥｅｔａｌ（２００８），ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２７：９９−１０６ＶａｌｉＧ．（１９９５）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｉｃｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｃｅＮｕｃｌｅａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｒ. Ｅ. Ｌｅｅ, Ｇ. ＷａｒｒｅｎａｎｄＬ. Ｇｕｓｔａ. Ｓｔ. Ｐａｕｌ, Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＡＰＳｐｒｅｓｓＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−ＢｅｇｇＳＫ．ｅｔａｌ（２００９）．ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＳｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ１０：２１５−２１９ＶｏｎｎｅｇｕｔＢｅｔａｌ（１９８４），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｅｔｅｏｒ．２３（３）：４８６−４９０ＨｏｏｓｅＣａｎｄＯＭＯｈｌｅｒ (２０１２), ＡｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｃｓ．１２：９８１７−９８５４ＭｕｒｒａｙＢ. Ｊｅｔａｌ (２０１２), ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＲｅｖｉｅｗｓ．４１：６５１９−６５５４

本発明は、制御した氷の成核のために鉱物を活用することによる含水製品の凍結プロセスの改良を提供する。

よって、本発明の第１の特徴においては、本発明は生物体または処方体の含水分を凍結する以下のステップを含んだ方法を提供する。
（Ａ）容器内で含水分を鉱物成核剤と接触させるステップ、および
（Ｂ）鉱物成核剤によって氷が非自然発生的に形成されることを促進させるべく、含水分を冷却するステップ。

好適には、氷の非自然発生的な形成を促進することで、鉱物成核剤は、生物体または処方体の正常性を保つのに貢献する氷成核に対する制御要素を提供する。このことは（例えば）氷結保存、フリーズドライ処理、または食品調製のごとき処理において有用であり得る。この制御要素は氷晶の数とサイズに対して影響を及ぼすことができ、（例えば）氷晶の数を増加させてさらに小さな氷晶を形成させる。

典型的にはステップ（Ａ）において、鉱物成核剤は全体を通して含水分と実質的に均等に接触状態にある。これで、含水分を通して氷の均質で非自然発生的な形成の促進に寄与し、安定性が劣るにも拘わらず、さらに多数の小氷晶サイズのものが、さらに大きな氷晶に代わって形成される。

鉱物成核剤は、粉砕および重力的、磁力的または電気的分離のごとき（例えば）１以上の物理的（例：機械的）プロセスによる、あるいは化学処理による鉱物源（例：岩石、宝玉または鉱石）の処理（例：精製または濃縮）によって入手できる。鉱物成核剤は商業品質または産業品質の濃縮物でよい。鉱物成核剤は富鉱物性（ｍｉｎｅｒａｌ−ｒｉｃｈ）である。鉱物成核剤においては、鉱物源に内在するか、あるいは添加物として加えることができる少量の他の物質（例：粘土または方解石のごとき少量の鉱物（ｍｉｎｅｒａｌ）または少量の非鉱物（ｎｏｎ−ｍｉｎｅｒａｌ））が存在できる。

鉱物成核促剤の平均粒径（粒子サイズ）はサブミクロンまたは１μｍから５μｍの範囲でよい。あるいは鉱物成核剤は典型的にはミリ寸法のビーズ形態物でよい。

好適には、鉱物成核剤は、長石、シリカ（例：水晶または碧玉等の玉髄）、霞石、葉長石、白榴石、方ソーダ石、灰霞石（ｃａｎｃｒｉｎｉｔｅ）（例：灰霞石−ビシネフ石（Ｃａｎｃｒｉｎｉｔｅ−Ｖｉｓｈｎｅｖｉｔｅ））、柱石、方沸石、および沸石で成る群から選択される。

好適な実施例としては、鉱物成核剤は立体網状ケイ酸塩（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓｉｌｉｃａｔｅ）である。特に好適には、鉱物成核剤は立体網状アルミノケイ酸塩（ｆｒａｍｅｗｏｒｋａｌｕｍｉｎｏｓｉｌｉｃａｔｅ）である。

好適な実施例としては、鉱物成核剤は長石または準長石である。特に好適な実施例では、鉱物成核剤は長石である。

長石は優れた鉱物成核剤であり、一般的に他の鉱物よりも長く効果が保たれる活性を示す。理論に拘束されることは望まないが、長石の利点として、氷を伴った格子の不整合が最小であること、表面電荷が低いこと、疎水性が低いこと、及び／又は、特殊な核形成部位（例：欠陥または亀裂）を有すること、が考えられる。

長石はＣａＡｌ_２Ｓｉ_２Ｏ_８（灰長石）、ＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８（曹長石）およびＫＡｌＳｉ_３Ｏ_８（正長石または微斜長石）の三成分固溶体でよい。

特に好適な実施例では、鉱物はＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８とＫＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石（すなわち、Ｎａ（ナトリウム）カチオンとＫ（カリウム）カチオンが支配的に含まれる、アルカリ長石。）である。アルカリ長石は正長石（ｏｒｔｈｏｃｌａｓｅ）、サニディン（ｓａｎｉｄｉｎｅ）、微斜長石（ｍｉｃｒｏｃｌｉｎｅ）およびアノーソクレース（ａｎｏｒｔｈｏｃｌａｓｅ）からなる群から選択できる。

さらに好適な実施態様では、鉱物はＫＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石（すなわち、Ｋ（カリウム）カチオンが支配的に含まれる、カリウム長石（ｐｏｔａｓｓｉｕｍＦｅｌｄｓｐａｒ）またはカリウムスパー（Ｋ−ｓｐａｒ））である。

特に好適な実施態様では、鉱物はＣａＡｌ_２Ｓｉ_２Ｏ_８とＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石（すなわち、Ｃａ（カルシウム）カチオンとＫ（カリウム）カチオンが支配的に含まれる斜長石）である。斜長石は、曹長石、灰曹長石、中性長石（ａｎｄｅｓｉｎｅ）、曹灰長石、亜灰長石、および灰長石からなる群から選択できる。

さらに好適な実施態様では、鉱物はＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石（すなわち、Ｎａ（ナトリウム）カチオンが支配的に含まれる長石）である。

含水分は、生物体または処方体の溶液、縣濁液、分散液、エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはコロイドでよい。

好適には、含水分は処方体の含水分である。

処方体は非医療用処方体でよい。

好適には、処方体は医療用処方体（例：薬剤処方物または獣医用処方物）である。

処方体は薬剤（例：薬）、化粧品、診断剤、コーティング、染料、顔料、合金、セラミック、洗浄剤、調合食材、潤滑剤、燃料、肥料または殺生剤でよい。

殺生剤は殺虫剤（例：除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺鼠剤、または殺虱剤）でよい。

処方体の含水分は金属含有スラリーでもよい。金属含有スラリーは混合金属含有スラリーでもよい。この場合、処方体は合金またはセラミックでよい。

好適には、処方体は処方された食材（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄｆｏｏｄｓｔｕｆｆ）でよい。鉱物成核剤の使用は、食材に望ましい舌触りを提供する多数の小さな氷晶の形成に有利に作用する。

処方された食材は食品または飲料でよい。

好適な処方された食材はアイスクリーム、ヨーグルト、およびシャーベット状飲料である。特に好適な処方食材はアイスクリームである。

好適には、含水分は生物体の含水分である。

典型的には、生物体は、経時的に完全性を喪失する傾向にあり、及び／又は、環境的刺激（例：熱的刺激のごとき物理的刺激あるいは酵素のごとき化学的刺激）の存在で完全性を喪失する傾向にある物体である。

生物体は植物由来または動物由来（例：人間のごとき哺乳類由来）でよい。

生物体は、果物類、ナッツ類、ハーブ類または種子類（例：コーヒー）のごとき天然食材でよい。

好適には、生物体は細胞または細胞の凝集体（例：微生物、病原菌、単細胞有機体、組織体、臓器、または多細胞有機体）である。

例示として、細胞は幹細胞、卵母細胞、精子細胞、または胚細胞でよい。

例示として、組織（ｔｉｓｓｕｅ）は皮膚、腫瘍、胚、睾丸、または卵巣でよい。

生物体は、タンパク質、酵素、ワクチン、細菌、ウィルス、原生生物、原生動物、寄生生物、胞子、種子、真菌でよい。

第１の好適実施態様では、ステップ（Ａ）は、
（Ａ’）含水分を容器に加えるステップと、
（Ａ”）離散形態で鉱物成核剤を容器に加えるステップと、
である。

離散形態はペレット、ビーズ、破片または粉末でよい。

離散形態は容器またはその一部に取り付けられた（例：キャップまたは封止体）鉱物成核剤の自己支持体でよい。この実施態様は、解凍時にサンプルから鉱物成核剤を取り出させる。

離散形態はステップ（Ａ”）で溶液、縣濁液、分散液、エマルジョン、またはコロイドに加えられる。典型的には、鉱物成核剤は溶液、縣濁液、分散液、エマルジョン、またはコロイド内に０．０３重量％を超えて存在する。

鉱物成核剤はステップ（Ａ”）で凍結防止剤と共に添加される。

好適な凍結防止剤は複数のヒドロキシル基（例：砂糖または多価アルコール）を含む。

凍結防止剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、スクロース、およびＤＭＳＯからなる群から選択できる。

第２の好適実施態様では、鉱物成核剤は容器内、容器の全表面上またはその一部上に存在し、鉱物成核剤の活性核形成部位（ａｃｔｉｖｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎｓｉｔｅ）は含水分に効果的に曝露され、ステップ（Ａ）では容器に含水分が加えられる。

この実施態様では、鉱物成核剤は容器自体の組成の構成成分（容器に含浸）でよい。例えば、鉱物成核剤は容器の製造中に導入される構成成分でよい。

鉱物成核促剤は容器の内面にコーティング処理できる。鉱物をコーティングする技術は知られており、プラズマベースのコーティング技術と接着固着が含まれる。

容器はサンプル容器または（例えば）細管、凍結バイアル、バッグ、マイクロタイタープレートまたは混合チャンバのごとき凍結容器でよい。

ステップ（Ｂ）の最中に、容器は凍結剤（典型的には液体窒素）上に浮遊または凍結剤（ｃｒｙｏｇｅｎ）内に含浸できる。あるいはステップ（Ｂ）は機械的冷凍（例：フリーズドライ装置内または熱交換器内）によって実行でき、あるいは、液体窒素を利用したコントロールレートフリーザ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｒａｔｅｆｒｅｅｚｅｒ）によって実行できる。

好適な実施態様の一つとして、本発明方法は８℃未満、好適には６℃未満、さらに好適には５℃未満の過冷却により含水分を凍結させる。

過冷却（過冷とも称する）は溶液の融点未満の液体の温度である。例えば、−５℃で、水は５℃で過冷却されるが、１０％グリセロール溶液（融点−２℃）は３℃で過冷却されるであろう。

ステップ（Ｂ）は−１３０℃未満、好適には−１５０℃未満、特に好適には約−１９６℃にまで進行できる。

ステップ（Ｂ）は徐々（例：段階的または連続的）に実行できる。典型的にはステップ（Ｂ）は１℃／分から２℃／分の冷却速度で連続的に実行される。

本発明方法はさらに、
（Ｃ）生物体または処方体の含水分を脱水するステップ、
を含む。

ステップ（Ｃ）は昇華によって実行できる。昇華は容器の圧力の減少（例：部分的真空）によって促すことができる。

本発明の別実施態様では、本発明は、容器内での生物体または処方体の含水分の凍結に成核剤として鉱物を活用する。

好適には、本発明による使用において鉱物は離散形態である。

好適には、本発明の使用において鉱物は容器内または容器の表面全体またはその一部に存在する。

本発明のさらに別な実施態様では、本発明は、容器内またはその一部内、あるいは容器の表面全体上またはその一部上に鉱物成核剤を備えた容器を提供する。

容器は以下で定義するものでよい。

本発明のさらに別な実施態様では、本発明は、前述のような鉱物成核剤と凍結防止剤とを含んだ水溶液、縣濁液、分散液、エマルジョン、またはコロイドを提供する。

凍結防止剤は前述のものでよい。

本発明の様々な実施態様を、以下の実施例および図面を活用して非限定的に説明する。

図１は、純水が充填された細管に成核剤であるＢＣＳ−ＣＲＭ３７６／１カリ長石を含ませたものと、純水が充填された細管に該カリ長石を含ませないものについて、１℃／分という勾配で冷却した際の、各細管の凍結フラクションを、温度の関数として示したものである（菱形は長石を含んだ細管で、矩形は長石を含まない細管）。図２は、１０％ｖ／ｖのエチレングリコールが充填された細管に成核剤であるＢＣＳ−ＣＲＭ３７６／１カリ長石を含ませたものと、１０％ｖ／ｖのエチレングリコールが充填された細管に該カリ長石を含ませないものについて、１℃／分という勾配で冷却した際の、各細管の凍結フラクションを、温度の関数として示したものである（菱形は長石を含んだ細管で、矩形は長石を含まない細管）。黒線は凍結された液体の融点を示す。図３は、（ａ）成核剤を利用しないサンプルと、（ｂ）標準的な成核剤としてコレステロールを利用したサンプルと、（ｃ）ダスト（１μｍ〜５μｍの直径）として長石を利用したサンプルと、(ｄ)ビーズ（６ｍｍの直径）として長石を利用したサンプルについて、減速冷却法（ｓｌｏｗ−ｃｏｏｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）によって凍結保存が実行された後における、アルギン酸塩に封入された多細胞肝臓スフェロイド（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｌｉｖｅｒｓｐｈｅｒｏｉｄ）の生存率データを示す。図４は、（ａ）スノマックス（ＳｎｏＭａｘ）（登録商標）で処理されたアイスクリーム、（ｂ）未処理アイスクリーム、（ｃ）カリ長石（Ｋ−Ｆｅｌｄｓｐａｒ）で処理されたアイスクリーム、および（ｄ）それら３サンプルと同一拡大率でのマイクロメータを示す。小さな目盛りは１０μｍ単位である。

［Ｉ．凍結バイアル内での成核剤実験］
ＭＦ２０００プロトタイプの電気作動式コントロールレートフリーザ（アシンプトートリミテッド（ＡｓｙｍｐｔｏｔｅＬｔｄ．）社製、ケンブリッジ市、英国）内に設置された凍結バイアル（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）社製）において実験が実施された。バイアルは２℃／分の冷却速度にて室温から４℃にまで５分間で冷却され、続いて、１℃／分の冷却速度で成核が発生するまで冷却された。成核は各バイアル内のＴ型熱電対（Ｔ−ｔｙｐｅｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ）によって検知され、融解熱が放出される温度が記録された。表１は、異なる水溶液内に置かれた長石材料における、平均核形成温度（核形成の平均温度）を示す。

［ＩＩ．細管内での成核剤実験］
精子細胞の凍結防止のために細管内で実験が実施された。細管は２つの綿製“プラグ”間で封入された１端にＰＶＡ（ポリ酢酸ビニル）を含む。ＰＶＡは細管から空にされ、粉末形態の鉱物成核剤で置換された。細管はＥＦ６００の電気作動式コントロールレートフリーザ（アシンプトートリミテッド（ＡｓｙｍｐｔｏｔｅＬｔｄ．）社製、ケンブリッジ市、英国）内に配置され、２℃／分の冷却速度にて室温から４℃にまで冷却され、続いて、５分間４℃に保持され、１℃／分の速度で核形成が生じるまで冷却された。成核状況は各細管内で成核剤に反対側のＴ型熱電対によって検知され、融解熱が放出される温度が記録された。

図１は、純水が充填された細管に成核剤であるＢＣＳ−ＣＲＭ３７６／１カリ長石を含ませたものと、純水が充填された細管に該カリ長石を含ませないものについて、１℃／分という勾配で冷却した際の、各細管の凍結フラクションを、温度の関数として示したものである（青い菱形は長石を含んだ細管で、赤い矩形は長石を含まない細管）。この場合、凍結温度は、細管の内部温度と、ＥＦ６００フリーザの表示温度との間の関係を較正し、氷点で示された温度を記録することで決定された。表２は上述の成核剤を用いた場合と、それ（上述の成核剤）を用いない場合の平均核形成温度（核形成の平均温度）を示す。

実験は純水の代わりにエチレングリコールを使用して反復された。図２は、１０％ｖ／ｖのエチレングリコールが充填された細管に成核剤であるＢＣＳ−ＣＲＭ３７６／１カリ長石を含ませたものと、１０％ｖ／ｖのエチレングリコールが充填された細管に該カリ長石を含ませないものについて、１℃／分という勾配で冷却した際の、各細管の凍結フラクションを、温度の関数として示したものである（青い菱形は長石を含んだ細管で、赤い矩形は長石を含まない細管）。黒線は凍結された液体の融点を示す。凍結温度は上述のごとく決定された。

［ＩＩＩ．溶液内での安定性］
長石の異なる調合物が調製されて実施例１で試験され、消費者品質の冷凍庫に２週間保管され、同一の実験プロトコルを利用して最終的に再び試験された。表３は、異なる長石溶液の１回目の試験、および２回目の試験における、平均核形成温度（核形成の平均温度）を示す。

［ＩＶ．生存率データ］
アルギン酸塩内に封入された多細胞肝臓スフェロイドの回復を判定するために解凍７２時間後に実験が実施された。メタボリック（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）な生体染色色素（二酢酸フルオレセインとヨウ化プロピジウム）を使用して生存細胞数が測定された。凍結防止剤として１２％のＤＭＳＯを用い、減速冷却法を利用して凍結保存が実施された。サンプルとして、（ａ）成核剤を利用しないサンプルと、（ｂ）標準的な成核剤としてコレステロールを利用したサンプルと、（ｃ）ダスト（１μｍ〜５μｍの直径）として長石を利用したサンプルと、（ｄ）ビーズ（６ｍｍの直径）として長石を利用したサンプルが冷却された。結果を図３に示す。

［Ｖ．アイスクリーム結晶サイズ］
液体食品製品内の結晶サイズを減少させる鉱物粉末の効果を実証するため、家庭用アイスクリームメーカと商業的に入手できるハーゲンダッツ（登録商標）のバニラを使用して実験が実施された。実験は、５００ｍＬの純粋溶解アイスクリームと、３粒の溶解スノマックス（登録商標）と混合された５００ｍＬの溶解アイスクリームと、１０ｍＬの水に分散された１．２ｇの粉末カリ長石（ｐｏｗｄｅｒｅｄＫ−Ｆｅｌｄｓｐａｒ）と混合された５００ｍＬの溶解アイスクリームとで実施された。これら３種の全てのサンプルは、約１５℃の開始温度のアイスクリームメーカ内に置かれ、アイスクリームメーカのスイッチが入れられた。アイスクリームメーカは継続的に撹拌しながらアイスクリームを約−２０℃に冷却した。アイスクリームは直ちにプラスチック容器に移され、−１８℃のフリーザ内に置かれ、３６時間放置された。アイスクリームサンプル間の相互汚染を防止するために常に細心の注意が払われた。

この３６時間後に、アイスクリームはフリーザから取り出され、２枚の顕微鏡スライドの間に入れられた少量が−３５℃に予備冷却された。その後、液体窒素で冷却されるコールドステージを備えた透過型顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）に、該スライドが配置された。図４は、それぞれのアイスクリームサンプルの氷の結晶の典型的な図を示す。未処理アイスクリーム内に形成された氷結晶の平均サイズは２７±１１μｍであることが確認された。スノマックス（Ｓｎｏｍａｘ、登録商標）で処理されたアイスクリーム内では、平均サイズは１２±３μｍであり、カリ長石（Ｋ−Ｆｅｌｄｓｐａｒ）で処理されたアイスクリーム内では、平均サイズは１４±５μｍであった。

Claims

生物体または処方体の含水分を凍結させる方法であって、
（Ａ）前記含水分を容器内で鉱物成核剤と接触させるステップと、
（Ｂ）前記鉱物成核剤によって氷が非自然発生的に形成されることを促進させるべく、前記含水分を冷却するステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
前記成核剤は、長石、シリカ、霞石、葉長石、白榴石、方ソーダ石、灰霞石、柱石、方沸石および沸石で成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記鉱物成核剤は立体網状ケイ酸塩である、請求項１または２に記載の方法。
前記鉱物成核剤は立体網状アルミノケイ酸塩である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は長石または準長石である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は長石である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は、ＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８とＫＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は、ＫＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は、ＣａＡｌ_２Ｓｉ_２Ｏ_８とＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤は、ＮａＡｌＳｉ_３Ｏ_８が支配的に含まれる長石である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記含水分は医療用処方剤の含水分である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記含水分は処方された食材の含水分である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記含水分は生物体の含水分である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記生物体は、細胞または細胞の凝集体である、請求項１３に記載の方法。
前記ステップ（Ａ）は、
（Ａ’）前記含水分を前記容器に加えるステップと、
（Ａ”）離散形態で前記鉱物成核剤を前記容器に加えるステップと、
である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
前記鉱物成核剤が、前記容器内あるいはその一部内、またはその表面の全体上あるいはその一部上に存在するものであり、
前記鉱物成核剤の活性核形成部位が前記含水分に効果的に曝露されるものであり、
前記ステップ（Ａ）は、前記含水分を前記容器に加えることにより行われる、
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
容器内での生物体または処方体の含水分の凍結における、成核剤としての鉱物の利用。
鉱物成核剤が、容器内またはその一部内あるいは容器の表面の全体上またはその一部上に存在することを特徴とする容器。
請求項１〜１８のいずれかに定義された鉱物成核剤と凍結防止剤とを含んだ水溶液、縣濁液、分散液、エマルジョン、またはコロイド。