BR112015013502B1 - Método para congelar uma quantidade contendo-água, uso de um mineral como um nucleador, recipiente com um nucleador mineral e solução aquosa - Google Patents
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Abstract
método de congelamento fazendo uso de um nucleador mineral. a presente invenção se refere a um método para congelar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação em um recipiente usando um nucleador mineral, ao uso do mineral como um nucleador e a um recipiente com o mineral em ou no todo ou em parte de uma superfície do mesmo.
Description
[0001] A presente invenção se refere a um método para congelar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação em um recipiente usando um nucleador mineral, ao uso do mineral como um nucleador e a um recipiente com o mineral em ou no todo ou em parte da superfície do mesmo.
[0002] Existem dois processos relacionados para a preservação de material biológico. Em criopreservação, o material biológico é congelado e armazenado no estado congelado. Em secagem por congelamento (liofilização), a água é removida da amostra biológica congelada que é então armazenada no estado seco. A liofilização é também usada em (por exemplo) armazenagem de medicamentos e padronização de solutos.
[0003] A criopreservação é amplamente empregada para manter a viabilidade a longo prazo de amostras biológicas para uso em medicina, biotecnologia e ciência veterinária. De modo a obter alta viabilidade no descongelamento é necessário acrescentar compostos protetores (conhecidos como aditivos crioprotetores ou crioprotetores) e resfriar amostras a um índice controlado. Com muitos tipos de células, é desejável induzir a formação de gelo através de nucleação controlada ao invés de permitir a nucleação espontânea de gelo durante o resfriamento.
[0004] Amostras para criopreservação são geralmente colocadas em criocontainers especializados como os seguintes:- Canudos que são tubos de parede fina de 2 a 4 mm de diâmetro e comprimento de até 140 mm com uma capacidade de 0,2ml a 0,5ml.- Criofrascos que são tubos pequenos e largos de aproximadamente 12,5 cm de diâmetro e uma capacidade de 0,5ml a 5,0ml.- Bolsas flexíveis com uma capacidade de 5ml a 1000ml para a criopreservação de volumes maiores; e - Placas de microtítulo, tubos matriz e outros formatos SBS empregados em robótica e rastreamento de alto rendimento
[0005] Uma gama de equipamentos está disponível para congelar canudos e criofrascos em um índice controlado. Esses podem usar nitrogênio líquido como um criogênio ou serem resfriados por refrigeração mecânica. Adicionalmente existe uma quantidade de dispositivos de refrigeração passiva. Alguns desses dispositivos permitem a nucleação controlada de gelo dentro de amostras que pode ser realizada manualmente ou automaticamente.
[0006] Após o congelamento em um índice controlado, amostras são mantidas congeladas em baixa temperatura (tipicamente a temperatura do nitrogênio líquido (-196°C)). Nessa temperatura, a viabilidade de uma célula é independente do período de armazenamento se ela sobreviveu ao resfriamento. Quando requeridas para uso, as amostras são descongeladas rapidamente (geralmente em um banho de água mantido a 37°C) e o crioprotetor é removido.
[0007] A secagem por congelamento (liofilização) é usada extensamente em biotecnologia, ciência médica e veterinária para a estabilização a longo prazo de células, vacinas, proteínas e outros compostos bioativos. A secagem por congelamento também é usada para gerar materiais estruturados tais como andaimes e matrizes para aplicação em medicina regenerativa (Massie I et al (2011), Tissue Eng Part C Methods. 17:765-774) e na produção de novas cerâmicas. No processo de secagem por congelamento, amostras aquosas são colocadas em containers especializados (tipicamente frascos de vidro) e congeladas em uma prateleira resfriada em um secador por congelamento. Após o congelamento, a pressão de gás local é reduzida e o gelo no interior da amostra congelada é sublimado. Após a remoção de água da amostra, o frasco é aquecido sob vácuo e vedado. A amostra pode ser distribuída em temperatura ambiente e é reconstituída pela adição de água.
[0008] Na secagem por congelamento, amostras tendem a superesfriar extensivamente o que leva a diferentes estruturas de cristal de amostra para amostra. A nucleação do gelo a uma temperatura próxima do ponto de fusão resulta em uma amostra com grandes cristais de gelo que sublimam rapidamente. Em contraste, uma amostra na qual a nucleação do gelo ocorre a uma temperatura remota do ponto de fusão terá pequenos cristais de gelo e sublimará a um índice mais lento (Searles J A et al (2001), Journal of Pharmaceutical Sciences 90: 860-871). Ao processar um grande número de amostras, as condições do processo são usualmente selecionadas de modo a acomodar a secagem lenta da população com os menores cristais de gelo resultando em tempo de processamento estendido e uso ineficiente de equipamento e instalações. A temperatura da nucleação do gelo é reconhecida como um fator chave para determinar tanto o tempo de processamento quanto a recuperação da atividade biológica (Kasper J C, Friess W (2001) European Journal of Pharmaceutics e Biopharmaceutics 7: 248-263).
[0009] A recuperação bem sucedida de embriões mamíferos após a criopreservação convencional é dependente da nucleação do gelo controlada a uma alta temperatura sub zero (usualmente -7°C). Amostras nas quais é permitido ao gelo nuclear espontaneamente tem baixa recuperação devido à formação de gelo intracelular como resultado de extensivo superarrefecimento (Whittingham D G (1977), Ciba Foundation 52. Elsevier Amsterdam Eds K Elliot e J Whelan pp97-127). A viabilidade de muitos outros tipos de células incluindo espermatozóides mamíferos e células tronco também é aumentada pelo controle da nucleação do gelo. Isso é geralmente realizado através da refrigeração do criocontainer de modo que o conteúdo esteja abaixo do seu ponto de fusão e então manualmente tocando o exterior do criocontainer com um implemento frio ou mecanicamente agitando o criocontainer. Esse procedimento é geralmente chamado de 'semeadura’. As desvantagens da semeadura são que ela é uma etapa manual o que significa que relativamente poucas amostras podem ser processadas e é necessário acesso físico às amostras.
[0010] Outros métodos físicos têm sido propostos para induzir a nucleação. Por exemplo em um secador por congelamento, a cristalização do vapor de água (neve) que então cai dentro das amostras induz a nucleação. Recentemente a Praxair Corporation introduziu um processo de 'mudança de pressão’ no qual amostras são pressurizadas no interior de um secador por congelamento com argônio até 28 psig e então resfriadas até uma temperatura de nucleação desejada. A pressão é então reduzida para 1 psig para induzir a nucleação (Konstantinidis A K et al (2011), Journal of Pharmaceutical Sciences 100: 3453-3470). No entanto essa abordagem ainda é experimental, dispendiosa, difícil de retroajuste e não apropriada para um pequeno secador por congelamento
[0011] Uma quantidade de nucleadores químicos (algumas vezes chamados de catalisadores de nucleação) foi examinada em relação à nucleação do gelo de amostras de criopreservação. Esses nucleadores promovem um fenômeno chamado de nucleação heterogênea ou facilitada. Exemplos incluem iodeto de prata, a bactéria Pseudomonas syringeae e cristais de colesterol. Os nucleadores são adicionados à amostra que é então resfriada. Quando um nível suficiente de superarrefecimento é atingido no interior da amostra, ocorre a nucleação do gelo. Essa abordagem permite o processamento de grandes quantidades de amostras mas existem desvantagens relacionadas à sua toxicidade ou potencial toxicidade ou sua origem bacteriana ou animal. Nucleadores conhecidos são improváveis de serem empregados com células para aplicação clínica. Enquanto uma quantidade desses nucleadores induz a formação de gelo a temperaturas sub zero relativamente altas, é improvável que eles possam ser fabricados com os padrões de Good Manufacturing Practice (GMP) e eles podem ser tóxicos (Saridakis E et a/(2008), Trends in Biotechnology. 27:99-106).
[0012] Algumas cepas de bactérias são capazes de nuclear gelo a temperaturas de até -2°C (Vali G. (1995), Principles of ice nucleation. Biological Ice Nucleation and Its Applications, R E.Lee, G. Warren e L. Gusta, St. Paul, Minnesota, APS Press). Entretanto a atividade de nucleação do gelo de bactérias é altamente sensível a condições de crescimento ambiental e as proteínas resultantes são sensíveis ao calor. Essa sensibilidade a condições ambientais as torna inadequadas para essa aplicação. Existem relatos de outros materiais biológicos (não-bacterianos) nucleando gelo a altas temperaturas sub zero (Henderson-Begg S K et al (2009) Atmospheric Science Letters 10: 215-219). Entretanto os núcleos de gelo tendem a ser instáveis no aquecimento e permanecem muito pobremente caracterizados. O iodeto de prata se mostrou capaz de catalisar a formação de gelo a temperaturas muito altas (Vonnegut B et al (1984), J. Appl. Meteor. 23(3): 486-490) mas não pode ser usado com amostras para aplicação clínica.
[0013] Poeiras minerais são vistas como núcleos de gelo relativamente ineficientes. Artigos de revisão que resumem dados de nucleação de gelo para partículas sólidas imersas em gotículas de água citam a mais alta temperatura de congelamento para poeiras minerais de aproximadamente -15°C (Hoose C e O Mõhler (2012), Atmospheric Chemistry and Physics, 12: 9817-9854; e Murray B.J. et al (2012), Chemical Society Reviews 41: 6519-6554).
[0014] Permutadores de calor de superfície raspada são usados para congelar grandes volumes de uma mistura de água, açúcar, laticínios, cores, aromatizantes e outros aditivos para formar sorvete ou bebidas tipo raspadinha. O permutador de calor de superfície raspada resfria a mistura sob alta pressão e agitação constante. A nucleação geralmente ocorre espontaneamente em uma quantidade relativamente pequena de locais. Cristais de gelo crescem continuamente e são quebrados mecanicamente para minimizar o tamanho dos cristais de gelo presentes no produto final. Pequenos cristais de gelo são considerados desejáveis já que eles dão ao sorvete uma textura mais suave do que a do sorvete contendo cristais maiores de gelo. No entanto devido ao seu alto conteúdo de açúcar, o sorvete tenderá a derreter parcialmente e recongelar quando armazenado a temperaturas entre -10°C e -20°C levando ao crescimento de cristais de gelo maiores.
[0015] A presente invenção procura aprimorar o processo de congelamento de produtos contendo água através da implantação de um mineral para a nucleação de gelo controlada.
[0016] Dessa forma a partir de um primeiro aspecto a presente invenção fornece um método para congelar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação compreendendo:(A) contatar a quantidade contendo-água com um nucleador mineral em um recipiente; e,(B) resfriar a quantidade contendo-água de modo que o nucleador mineral serve para promover a formação de gelo não espontânea.
[0017] Ao promover a formação de gelo não espontânea, o nucleador mineral fornece vantajosamente um elemento em relação à nucleação de gelo que contribui para preservar a integridade da entidade biológica ou formulação. Isso pode ser útil em processos tais como (por exemplo) criopreservação, secagem por congelamento ou preparação de alimentos. Esse elemento de controle pode ser exercido na quantidade e tamanho de cristais de gelo e (por exemplo) permite um aumento na quantidade de cristais de gelo levando a cristais de gelo menores.
[0018] Tipicamente na etapa (A) o nucleador mineral está em contato com a quantidade contendo-água substancialmente de modo uniforme completamente. Isso serve para promover a formação não espontânea de gelo uniformemente por toda a quantidade contendo água e um maior número de cristais de gelo menores é formado à custa de cristais de gelo maiores apesar da sua menor estabilidade.
[0019] O nucleador mineral pode ser obtido através do processamento (ex., refinamento ou concentração) de uma fonte mineral (ex., rocha, gema ou minério) através de (por exemplo) um ou mais processos físicos (ex., mecânico) tais como esmagamento e separação gravitacional, magnética ou elétrica ou através de processos químicos. O nucleador mineral pode ser um concentrado que tem grau comercial ou grau industrial. O nucleador mineral pode ser rico em minerais. No nucleador mineral podem existir traços de outro material presentes (ex., traços de minerais como argila ou calcita ou traços não minerais) que podem ser endógenos à fonte mineral ou acrescentados como um aditivo.
[0020] O tamanho médio de partícula do nucleador mineral pode ser submicron ou no limite de 1 a 5μm. Alternativamente o nucleador mineral pode tomar a forma de grânulos tipicamente com uma dimensão milimétrica.
[0021] Preferivelmente o nucleador mineral é selecionado do grupo consistindo de Feldspar, Sílica (ex., Quartz ou Calcedônia como Jasper), Nefelina. Petalita, Leucita, Sodalita, Cancrinite (ex., Cancrinite-Vishnevite), Escapolita, Analcite e Zeólito.
[0022] Em uma representação preferível, o nucleador mineral é um enquadramento de sílica. Particularmente preferivelmente o nucleador mineral é um enquadramento de sílica de alumínio.
[0023] Em uma representação preferível, o nucleador mineral é um Feldspar ou feldspatóide. Em uma representação preferível em particular, o nucleador mineral é um Feldspar.
[0024] O Feldspar é um excelente nucleador mineral e geralmente apresenta atividade mais duradoura do que outros minerais. Sem desejar se prender à teoria, as vantagens do Feldspar podem ser atribuídas à mínima incompatibilidade da treliça com gelo, baixa carga de superfície, baixa hidrofobicidade e/ou locais de nucleação especiais (ex., anomalias ou fissuras).
[0025] O Feldspar pode ser uma solução sólida ternária de CaAI2Si2O8 (anortita), NaAISi3O8 (albita) e KAISÍ3O8 (ortoclase ou microcline).
[0026] Em uma representação particularmente preferida, o mineral é um Feldspar com uma predominância de NaAISiaOs e KAISiaOeGe uma predominância de cátions Na e K - um álcali Feldspar). O álcali Feldspar pode ser selecionado do grupo consistindo de ortoclase, sanidina, microline e anortoclase.
[0027] Em uma representação mais preferida, o mineral é um Feldspar com uma predominância de KAISiaOs (íe uma predominância de cátions K - potássio Feldspar ou K-spar).
[0028] Em uma representação particularmente preferida, o mineral é um Feldspar com uma predominância de CaAI2SÍ20e e NaAISiaOe (íe uma predominância de cátions Ca e Na - um plagioclase Feldspar). O plagioclase Feldspar pode ser selecionado do grupo consistindo de albita, oligoclase, andesina, labradorite, bytownita e anortita.
[0029] Em uma representação mais preferida, o mineral é um Feldspar com uma predominância de NaAISiaOs (íe uma predominância de cátions Na).
[0030] A quantidade contendo-água pode ser uma solução, suspensão, dispersão, emulsão ou coloide da entidade biológica ou formulação.
[0031] Preferivelmente a quantidade contendo-água é uma quantidade contendo água de uma formulação.
[0032] A formulação pode ser uma formulação não-medicinal.
[0033] Preferivelmente a formulação é uma formulação medicinal (ex., uma formulação farmacêutica ou uma formulação veterinária).
[0034] A formulação pode ser um agente farmacêutico (ex., droga), cosmético, agente diagnóstico, revestimento, corante, pigmento, liga, cerâmica, agente de limpeza, produto alimentar formulado, lubrificante, combustível, fertilizante ou biocida.
[0035] O biocida pode ser um pesticida (ex., um herbicida, inseticida, fungicida, rodenticida ou pediculicida).
[0036] A quantidade contendo-água de uma formulação pode ser uma pasta contendo-metal. A pasta contendo-metal pode ser uma pasta contendo- metal mista. Nesse caso, a formulação pode ser uma liga ou cerâmica.
[0037] Preferivelmente a formulação é um produto alimentício formulado. O uso de um nucleador mineral leva vantajosamente a um maior número de cristais de gelo menores o que dá ao produto alimentício uma textura desejável.
[0038] O produto alimentício formulado pode ser um alimento ou bebida.
[0039] Os produtos alimentícios preferidos são sorvete, iogurte e bebidas tipo raspadinha. Um produto alimentício formulado particularmente preferido é o sorvete.
[0040] Preferivelmente a quantidade contendo-água é uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica.
[0041] A entidade biológica é tipicamente uma que tenha a tendência a perder integridade com o tempo e/ou na presença de estímulos ambientais (ex., um estímulo físico como o calor ou um estímulo químico como uma enzima).
[0042] A entidade biológica pode derivar de uma planta ou animal (ex., de um mamífero como um humano).
[0043] A entidade biológica pode ser um alimento como uma fruta, nozes, ervas ou sementes (ex., café).
[0044] Preferivelmente a entidade biológica é uma célula ou agregado de células (ex., um micro-organismo, micróbio, organismo unicelular, tecido, órgão ou organismo multicelular).
[0045] A título de exemplo, a célula pode ser uma célula tronco, célula oócita, célula espermática ou célula embrionária.
[0046] A título de exemplo, o tecido pode ser pele, tumor, embrionário, testicular ou ovariano.
[0047] A entidade biológica pode ser uma proteína, enzima, vacina, bactéria, vírus, protista, protozoário, parasita, esporo, semente ou fungo.
[0048] Em uma primeira representação preferida, a etapa (A) é:(A’) adicionar a quantidade contendo-água ao recipiente; e(A”) adicionar o nucleador mineral em uma forma discreta ao recipiente.
[0049] A forma discreta pode ser uma pelota, grânulo, fragmento ou pó.
[0050] A forma discreta pode ser um corpo auto-sustentável do nucleador mineral conectado ao recipiente ou uma parte do mesmo (ex., uma tampa ou vedação). Essa representação permite a remoção do nucleador mineral da amostra no descongelamento.
[0051] A forma discreta pode ser granulada na etapa (A”) em uma solução, suspensão, dispersão, emulsão ou coloide. Tipicamente o nucleador mineral está presente em solução, suspensão, dispersão, emulsão ou coloide em uma quantidade superior a 0,03wt%.
[0052] O nucleador mineral pode ser adicionado na etapa (A”) juntamente com um crioprotetor.
[0053] Um crioprotetor preferido contem uma pluralidade de grupos hidroxil (ex., um açúcar ou poliálcool).
[0054] O crioprotetor pode ser selecionado do grupo consistindo de etileno glicol, propileno glicol, glicerol, sacarose e DMSO.
[0055] Em uma segunda representação preferida, o nucleador mineral está em ou no todo ou parte de uma superfície do recipiente ou parte do mesmo de modo que locais de nucleação ativa do nucleador mineral são expostos efetivamente à quantidade contendo-água e a etapa (A) é a de adicionar a quantidade contendo-água ao recipiente.
[0056] Nessa representação, o nucleador mineral pode ser um constituinte da composição do recipiente (ex., impregnado no recipiente). Por exemplo, o nucleador mineral pode ser um constituinte introduzido durante a fabricação do recipiente.
[0057] O nucleador mineral pode ser revestido em uma superfície interna do recipiente. Técnicas para revestir um mineral são conhecidas e incluem técnicas de revestimento plasma-baseadas e adesão por impactação.
[0058] O recipiente pode ser um simples container ou um container de congelamento como (por exemplo) um canudo, criofrasco, bolsa, placa microtítulo ou câmara de mixagem.
[0059] Durante a etapa (B), o recipiente pode ser flutuado sobre ou imerso em um criogênio (tipicamente nitrogênio líquido). Alternativamente a etapa (B) é realizada por refrigeração mecânica (ex., em um secador por congelamento ou permutador de calor) ou por um congelador de índice controlado que pode ser líquido baseado em nitrogênio.
[0060] Em uma representação preferida, o método faz com que a quantidade contendo-água congele em um superarrefecimento de menos de 8°C, preferivelmente menos de 6°C, mais preferivelmente menos de 5°C.
[0061] Superarrefecimento (também chamado de sub-refrigeração) é a temperatura de um líquido abaixo do ponto de fusão da solução. Por exemplo, a -5°C, a água seria superarrefecida por 5°C, enquanto que uma solução de glicerol a 10% (ponto de fusão -2°C) seria superarrefecida por 3°C.
[0062] A etapa (B) pode proceder até uma temperatura abaixo de -30°C, preferivelmente até uma temperatura abaixo de -150°C, particularmente preferivelmente até uma temperatura de aproximadamente -196°C.
[0063] A etapa (B) pode ser realizada incrementalmente (passo a passo ou continuamente). Tipicamente a etapa (B) é realizada continuamente a uma velocidade no limite de 1 a 2°C/min.
[0064] O método pode ainda compreender:(C) desidratar a quantidade contendo água da entidade biológica ouformulação.
[0065] A etapa (C) pode ser realizada por sublimação. A sublimação pode ser induzida aplicando-se uma redução de pressão (ex., um vácuo parcial) ao recipiente.
[0066] Vista a partir de um outro aspecto a presente invenção proporciona o uso de um material como um nucleador no congelamento de uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação em um recipiente.
[0067] Preferivelmente no uso de acordo com a invenção o mineral está em uma forma discreta.
[0068] Preferivelmente no uso de acordo com a invenção o mineral está em ou no todo ou parte de uma superfície do recipiente ou uma parte do mesmo.
[0069] Vista a partir de ainda outro aspecto a presente invenção fornece um recipiente com um nucleador mineral em ou no todo ou parte de uma superfície do mesmo ou uma parte do mesmo.
[0070] O recipiente pode ser conforme anteriormente definido.
[0071] Vista a partir de ainda outro aspecto a presente invenção fornece uma solução aquosa, suspensão, dispersão, emulsão ou coloide compreendendo um nucleador mineral conforme anteriormente definido e um crioprotetor.
[0072] O crioprotetor pode ser conforme anteriormente definido.
[0073] Várias representações da invenção serão agora descritas em um sentido não limitativo apenas com referência aos seguintes Exemplos e Figuras nos quais:
[0074] A Figura 1 mostra a fração de canudos cheios com água pura congelada como uma função da temperatura com e sem o nucleador BCS- CRM 376/1 Potash Feldspar durante uma rampa de resfriamento de 1°C/min (diamantes são canudos com Feldspar e quadrados são aqueles sem).
[0075] A Figura 2 mostra a fração de canudos cheios com 10% de etileno glicol congelado como uma função da temperatura com e sem o nucleador BCS-CRM 376/1 Potash Feldspar durante uma rampa de resfriamento de 1°C/min (diamantes são canudos com Feldspar e quadrados são aqueles sem. A linha preta indica a temperatura de fusão do líquido congelado).
[0076] A Figura 3 mostra dados de viabilidade para esferoides de fígado multicelular encapsulados em alginato após a criopreservação ter sido realizada usando um método de refrigeração lenta (a) sem nucleador, (b) com colesterol como um nucleador padrão, (c) com Feldspar como uma poeira (1μm a 5 μm de diâmetro) e (d) com Feldspar como um grânulo (6mm de diâmetro); e,
[0077] A Figura 4 mostra (a) sorvete tratado com SnoMax®, b) sorvete não tratado, c) sorvete tratado com K-Feldspar e d) um micrômetro na mesma magnificação que as trés amostras. As pequenas graduações são 10 μm à parte.Exemplo 1 - Experimentos de Nucleação em Criofrascos
[0078] Foram realizados experimentos em criofrascos (Thermo Fischer) colocados em um congelador de índice controlado acionado eletricamente protótipo MF2000 (Asymptote Ltd, Cambridge, UK). Os frascos foram refrigerados a partir da temperatura ambiente até 4°C a uma velocidade de 2°C por minuto, então mantidos a 4°C por 5 minutos e então refrigerados a 1°C por minuto até ocorrer a nucleação. A nucleação foi registrada por um termopar tipo-T em cada frasco e anotando-se a temperatura na qual o calor de fusão foi liberado. A Tabela 1 mostra as temperaturas médias de nucleação de uma gama de materiais Feldspar colocados em diferentes soluções de água.
Exemplo 2 - Experimentos de Nucleação em Canudos
[0079] Foram realizados experimentos em canudos para criopreservação de células espermáticas. Os canudos continham PVA (acetato de polivinila) em uma extremidade fechado entre dois ‘tampões’ de algodão. O PVA foi retirado do canudo e substituído por uma forma de em pó de nucleatorin mineral. Os canudos foram colocados em um congelador de índice controlado acionado eletricamente EF600 (Asymptote Ltd, Cambridge, UK) e refrigerados da temperatura ambiente até 4°C a uma velocidade de 2°C por minuto, e então mantidos a 4°C por 5 minutos e então refrigerados a 1 °C por um minuto até que ocorresse a nucleação. A nucleação foi registrada por um termopar tipo-T em cada canudo na extremidade oposta ao nucleador e anotando-se a temperatura na qual o calor de fusão foi liberado.
[0080] A Figura 1 mostra a fração de canudos preenchida com água pura congelada como uma função de temperatura com e sem o nucleador BCS-CRM 376/1 Potash Feldspar durante a rampa de refrigeração a 1°C/min (diamantes azuis são canudos com feldspar e quadrados vermelhos são aqueles sem). Nesse caso a temperatura de congelamento foi determinada calibrando-se a relação entre a temperatura interna dos canudos e a temperatura indicada do congelador EF600 e registrando a temperatura indicada no ponto de congelamento. A Tabela 2 mostra as temperaturas médias de nucleação com e sem os nucleadores afirmados.
[0081] O experimento foi repetido com etileno glicol no lugar de águapura. A Figura 2 mostra a fração de canudos preenchidos com 10% v/v de etileno glicol congelado como uma função de temperatura com e sem o nucleador BCS-CRM 376/1 Potash Feldspar durante a rampa de resfriamento a 1°C/min (diamantes azuis são canudos com feldspar e quadrados vermelhos são aqueles sem). A linha preta indica a temperatura de fusão do congelado líquido. A temperatura de congelamento foi determinada conforme descrito abaixo.Exemplo 3 - Estabilidade em Solução
[0082] Diferentes preparações de Feldspar foram preparadas e testadas como no Exemplo 1 e então deixadas em um refrigerador padrão de consumo por duas semanas e finalmente testadas novamente usando o mesmo protocolo experimental. A Tabela 3 mostra as temperaturas médias de nucleação para a primeira e segunda série das diferentes soluções Feldspar.
Exemplo 4 - Dados de Viabilidade
[0083] Um experimento foi realizado 72 horas após o descongelamento para determinar a recuperação de esferoides de fígado multicelulares encapsulados em alginato. Números de células viáveis foram medidos usando corantes vitais metabólicos (diacetato de fluoresceína e iodeto de propídio). A criopreservação foi realizada usando um método de refrigeração lenta com 12% de DMSO como crioprotetor. Amostras foram resfriadas (a) sem nucleador, (b) com colesterol como um nucleador padrão, (c) com Feldspar como uma poeira (1μm a 5μm de diâmetro) e (d) com feldspar como um grânulo (6mm de diâmetro). Os resultados são mostrados na Figura 3.Exemplo 5 - Tamanhos de Cristais de Sorvete
[0084] Para demonstrar a eficácia de um pó mineral para reduzir o tamanho dos cristais em produtos alimentícios líquidos, foram realizados experimentos usando uma máquina de sorvete caseira e o sorvete de baunilha Haagen-Daz® comercialmente disponível. Foram conduzidos experimentos usando 500ml de sorvete puro derretido, 500ml de sorvete derretido misturado com 3 grãos de Snomax® dissolvido e 500ml de sorvete derretido misturado com 1,2 g de K-Feldspar em pó dispersado em 10 ml de água. Todas as três amostras foram colocadas na máquina de sorvete a uma temperatura inicial de aproximadamente 15°C e a máquina de sorvete foi ligada. A máquina de sorvete esfriou o sorvete até aproximadamente -20°C sob agitação constante. O sorvete foi então rapidamente transferido para um recipiente plástico em um congelador a -18°C onde foi deixado por 36 horas. Em todos os momentos foi tomado grande cuidado para evitar a contaminação cruzada das amostras de sorvete.
[0085] Após esse período de 36 horas o sorvete foi recuperado do congelador e uma pequena quantidade colocada entre dois slides de microscópio pré-resfriados a -35°C. Os slides foram então colocados em um microscópio de transmissão equipado com fase fria resfriada com um nitrogênio líquido. A Figura 4 mostra desenhos típicos dos cristais de gelo em cada amostra de sorvete. O tamanho médio dos cristais de gelo formados em sorvete não tratado foi determinado como sendo de 27±11μm. No sorvete tratado com Sonomax® o tamanho médio foi de 12±3μm e no sorvete tratado com K-Feldspar o tamanho médio foi de 14±5μm.
Claims (16)
1. Método para congelar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação, caracterizado por compreender:(a) contatar a quantidade contendo-água com um nucleador mineral em um frasco; e(b) resfriar a quantidade contendo-água de modo que o nucleador mineral serve para promover a formação de gelo não-espontânea, em que o nucleador mineral é uma poeira ou grânulo de silicato possuindo um tamanho de partícula maior que 300 Angstrons.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser selecionado do grupo consistindo em Feldspar, Feldspatóide, Nefelina. Petalita, Leucita, Sodalita, Cancrinite, Escapolita, Analcite e Zeólito.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser um tectossilicato de alumínio.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser um Feldspar com uma predominância de NaAlSi308 e KAlSi308.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser um Feldspar com uma predominância de KAlSi308.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser um Feldspar com uma predominância de CaA12Si208 e NaAlSi308.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do nucleador mineral ser um Feldspar com uma predominância de NaAlSi308.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato da quantidade contendo-água ser uma quantidade contendo-água de uma formulação medicinal.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato da quantidade contendo água ser uma quantidade contendo-água de um produto alimentar formulado.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato da quantidade contendo-água ser uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato da entidade biológica ser uma célula ou agregado de células.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato da etapa (A) ser:(A') adicionar a quantidade contendo-água ao recipiente; e(A") adicionar o nucleador mineral em uma forma discreta ao recipiente.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato do nucleador mineral estar em ou no todo ou em parte de uma superfície do recipiente ou parte do mesmo de modo que os locais de nucleação ativa do nucleador mineral são expostos efetivamente à quantidade contendo-água e a etapa (A) é de adicionar a quantidade contendo- água ao recipiente.
14. Uso de um mineral como um nucleador, caracterizado pelo fato de ser para congelar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 em um recipiente, em que o mineral é uma poeira ou grânulo de silicato possuindo um tamanho de partícula maior que 300 Angstrons.
15. Recipiente com um nucleador mineral em ou no todo ou em parte de uma superfície do recipiente, caracterizado pelo fato de ser para contatar uma quantidade contendo-água de uma entidade biológica ou uma formulação de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 no recipiente, em que o nucleador mineral é uma poeira ou grânulo de silicato possuindo um tamanho de partícula maior que 300 Angstroms servindo para promover a formação de gelo não-espontânea.
16. Solução aquosa, suspensão, dispersão, emulsão ou coloide, caracterizado pelo fato de compreender um nucleador mineral e um crioprotetor, em que o nucleador mineral é uma poeira ou grânulo de silicato possuindo um tamanho de partícula maior que 300 Angstroms.
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