JP2015533841A - 強靭なｔ細胞用のｐｒ１３．５プロモータ及び抗体応答 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＰｒ１３．５プロモータを含む、組換えポックスウイルス、好ましくは改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、及びその使用を包含する。本発明は、組換えＭＶＡの１又はそれ以上の免疫を哺乳動物、好ましくはヒトに投与することによって、特定の抗原（複数）に対する強力なＣＤ８ Ｔ細胞誘導及び抗体応答ための組成物、及び方法に関する。

Description

ＭＶＡは、トルコのアンカラのワクチン接種研究所で長年に渡って維持され、ヒトへのワクチン接種の主成分として使用されてきた、皮膚ワクシニア株アンカラ（漿尿膜ワクシニアアンカラ（ＣＶＡ）ウイルスから生じる。しかしながら、頻繁な重度のワクシニアウイルスに関連したワクチン接種後合併症（ＶＡＣＶ）のために、より弱毒化され、より安全な天然痘ワクチンを作製するいくつかの試みがある。

１９６０年から１９７４年の期間内に、アントン・マイヤー（Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒ）教授は、ＣＥＦ細胞での５７０超の連続継代によってＣＶＡを弱毒化することに成功した（Ｍａｙｒ等， １９７５， Ｐａｓｓａｇｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ： Ａｂｓｔａｍｍｕｎｇ， Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ｕｎｄ Ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ ｄｅｓ ａｔｔｅｎｕｉｅｒｔｅｎ Ｖａｃｃｉｎｉａ−Ｓｔａｍｍｅｓ ＭＶＡ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３： ６−１４）。前天然痘ワクチンとしてのＭＶＡの初期開発の一部として、ワクシニアからの逆反応のリスクがある対象において、Ｌｉｓｔｅｒ Ｅｌｓｔｒｅｅ（Ｓｔｉｃｋｌ， １９７４， 天然痘ワクチン接種及びその結果：高度に弱毒化された天然痘ワクチン「ＭＶＡ」を用いる最初の経験， Ｐｒｅｖ． Ｍｅｄ． ３（１）： ９７−１０１； Ｓｔｉｃｋｌ及びＨｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ， １９７１， 弱い病原ワクシニアウイルス（「ＭＶＡウイルス」）を用いる皮内天然痘ワクチン接種， Ｍｕｎｃｈ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ． １１３： １１４９−１１５３）と組み合わせた、ＭＶＡ−５１７（５１７番目の継代に相当する）を使用する臨床試験があった。１９７６年には、ＭＶＡ−５７１種ストック（５７１番目の継代に相当する）由来のＭＶＡは、２段階の非経口天然痘ワクチン接種プログラムにおける主ワクチンとしてドイツで登録された。次いで、対象の多くは慣用的なワクシニアウイルスに関連した高リスクの合併症を有する集団の一部であるとしても、ＭＶＡ−５７２は、重度の副作用が報告されていない約１２０，０００人の白人、すなわち大多数が１〜３歳の子供で使用された（Ｍａｙｒ等， １９７８， 天然痘ワクチン接種株ＭＶＡ：マーカー、遺伝子構造、非経口ワクチン接種によって得られた経験、及び弱体化防御機構を有する生物の行動（著者の翻訳）， Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （Ｂ） １６７： ３７５−３９０）。ＭＶＡ−５７２は、ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１ ２７０７として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ）， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍに寄託された。

ＭＶＡを弱毒化するために多くの継代が使用されたために、ＣＥＦ細胞の継代数によって多数の異なった株又は単離体がある。ＭＶＡ株の全ては、Ｍａｙｒ博士から得られたものであり、ほとんどは天然痘撲滅プログラムにおいてドイツで使用されたＭＶＡ−５７２に由来するか、又は動物ワクチンとして広く使用されたＭＶＡ−５７５に由来する。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日に、寄託番号Ｖ００１ ２０７０７で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。

初代ニワトリ胚線維芽細胞でＣＶＡの段階的増殖（５７０回超の継代）によって、弱毒化されたＣＶＡ−ウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）を得た。ＭＶＡは、バーバリアン・ノルディック（Ｖａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ）によって更に継代され、ＭＶＡ−ＢＮと名付けられた。ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＢＮは、祖先ＣＶＡウイルスに比べてゲノムの約１３％（６個の主欠損部位及び複数の軽微な欠損部位から２６．５ｋｂ）を欠く。欠損は、多数の病原性及び宿主域遺伝子、並びにＡ型封入タンパク質（ＡＴＩ）をコードする遺伝子の大フラグメント、及びＡ型封入体に成熟ウイルス粒子を方向付ける構造的タンパク質をコードする遺伝子に影響を与える。ＭＶＡ−ＢＮの試料は、２０００年８月３０日に、番号Ｖ０００８３００８で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託された。

ＭＶＡ−ＢＮは、ウイルスにコードされた遺伝子が非常に効率的に発現されるヒト細胞に接着し、そこに入り得る。しかしながら、子孫ウイルスの集合及び放出は起こらない。ＭＶＡ−ＢＮ及び誘導体の調製物は、多くの種類の動物、及び免疫不全個体を含む２０００超のヒト対象に投与されてきた。全てのワクチン接種は、一般的に安全であり、よく寛容されることが明らかとなった。

多くの異なった刊行物からの理解は、全てのＭＶＡ株が同一であり、高度に弱毒化され、安全な生ウイルスベクターを示すことである。しかしながら、前臨床試験は、ＭＶＡ−ＢＮが他のＭＶＡ株と比べて優れた弱毒性及び効率を示すことを明らかにしている（国際公開第０２／４２４８０号公報）。例えば番号Ｖ０００８３００８でＥＣＡＣＣに寄託されているＭＶＡ変異株ＭＶＡ−ＢＮは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）におけるインビトロで再生的複製の可能性を有しているが、ＭＶＡ５７５又はＭＶＡ５７２が再生的に複製し得るヒト細胞での再生的複製の可能性はない。例えば、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒトケラチン生成細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、及びヒト子宮腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて再生的複製の可能性を有さない。更に、ＭＶＡ−ＢＮ株は、成熟Ｂ及びＴ細胞を製造することができず、それ自体、複製するウイルスに対して重度に免疫不全であり、高い感受性を有するマウスモデルにおいて複製できない。ＭＶＡ−ＢＮ株の更なる又は別の性質は、ワクシニアウイルス初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメにおいて、ＤＮＡ−初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメと比較すると、少なくとも実質的に同一の免疫レベルを誘発する能力である。

用語「再生的複製をすることができない」とは、参照として本明細書に組み込まれる国際公開第０２／４２４８０号公報及び米国特許第６，７６１，８９３号明細書で定義されているように、本願で使用される。従って、この用語は、米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載されているアッセイ（このアッセイは参照として本明細書に組み込まれる）を用いて、１未満の、感染４日後のウイルス増幅比を有するウイルスに適用する。ウイルスの「増幅比」は、感染細胞（アウトプット）から製造されたウイルスの、最初に細胞に感染するためにもともと使用した量（インプット）の割合である。アウトプットとインプットとの「１」との比は、感染細胞から製造されたウイルス量が細胞を感染するためにもともと使用した量と同一であるという状態を定義する。

ＭＶＡ−ＢＮ又はその誘導体は、１つの実施態様によれば、ＤＮＡ−初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメと比較した時に、ワクシニアウイルス初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメにおいて、少なくとも実質的に同一の免疫レベルを誘発することによって特徴付けられる。国際公開第０２／４２４８０号公報に開示されている「アッセイ１」及び「アッセイ２」のうちの１つ、好ましくは２つのアッセイ、で測定されるＣＴＬ応答が、ＤＮＡ−初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメと比較した時に、ワクシニアウイルス初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメにおいて、少なくとも実質的に同一である場合に、ワクシニアウイルスは、ＤＮＡ−初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメと比較した時に、ワクシニアウイルス初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメにおいて、少なくとも実質的に同一の免疫レベルを誘発するとみなされる。より好ましくは、ワクシニアウイルス初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫投与後のＣＴＬ応答は、ＤＮＡ−初回刺激／ワクシニアウイルス追加免疫レジメと比較した時に、アッセイの少なくとも１つにおいてより高い。最も好ましくは。ＣＴＬ応答は２つのアッセイでより高い。

国際公開第０２／４２４８０号公報は、ＭＶＡ−ＢＮの性質を有するワクシニアウイルスがどのように得られるかを開示している。高度に弱毒化されたＭＶＡ−ＢＮウイルスは、例えば、ＭＶＡ−５７２又はＭＶＡ−５７５等の改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の更なる継代によって得ることができる。

纏めると、ＭＶＡ−ＢＮは、他のＭＶＡ株と比べて最高の弱毒化プロファイルを有することが明らかとなっており、重度に免疫不全化動物においてさえ安全である。

ＭＶＡが哺乳動物細胞中で強く弱毒化された複製を示すが、その遺伝子は効率的に転写され、ウイルス複製の遮断はウイルスアセンブリ及び放出のレベルにある（Ｓｕｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｏｓｓ， １９９２， 非複製ワクシニアベクターは組換え遺伝子を効率的に発現する， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ８９： １０８４７−１０８５１； Ｃａｒｒｏｌｌ及びＭｏｓｓ， １９９７， ワクシニアウイルスの高度に弱毒化されたＭＶＡ株の宿主域及び細胞病原性：非ヒト哺乳動物細胞株における組換えウイルスの増殖及び作製， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８： １９８−２１１）。その高い弱毒化及び減少した病原性にもかかわらず、前臨床試験では、ＭＶＡ−ＢＮは、ＶＡＣＶ及びＭＶＡゲノムにクローン化された非相同遺伝子の産物に対して体液性及び細胞性免疫応答を誘発することが明らかとなった（Ｈａｒｒｅｒ等， ２００５， 組換えＨＩＶ−１ ｎｅｆ発現ＭＶＡによるＨＡＡＲＴに対するＨＩＶ−１感染患者の治療的ワクチン接種：治療中断中のウイルスロードに対する安全性、免疫原性及び影響， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １０： ２８５−３００； Ｃｏｓｍａ等， ２００３， ＭＶＡ−ＨＩＶ−１ ｎｅｆによる治療的ワクチン接種は慢性的にＨＩＶ−１感染個体におけるＮｅｆ特異的Ｔヘルパー細胞応答を誘導する， Ｖａｃｃｉｎｅ ２２（１）： ２１−２９； Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ等， ２００３， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌ． 自系ＣＤ３４（＋）細胞による悪性黒色腫を有する患者の免疫化は、ヒトチロシナーゼ遺伝子をコードする組換え複製欠損ワクシニアベクターによるエクスビボ形質導入された樹状細胞を誘導した：第Ｉ相試験， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １４（１４）： １３４７−１ ３６０； Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ等， ２００４， ワクシニアウイルス形質導入ＣＤ３４（＋）由来樹状細胞ワクチン接種によるチロシナーゼへのＴ細胞介在免疫の追加：転移性黒色腫の第Ｉ相試験， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０（１６）： ５３８１−５３９０）。

ＭＶＡ−ＢＮ及び組換えＭＶＡ−ＢＮ−型ワクチンは、血清無しの培地で培養されたＣＥＦ細胞中で、作製、継代、産生及び製造され得る。多くの組換えＭＶＡ−ＢＮ変異体が、前臨床及び臨床開発のために特徴付けられている。ＭＶＡ−ＢＮと、ウイルスベクター骨格と、様々な組換えＭＶＡ型ワクチンとの間には、弱毒化（ヒト細胞株での複製の欠如）又は安全性（前臨床毒性又は臨床試験）の点で、何の相違も観察されなかった。

ＶＡＣＶベクターによって発現された外来遺伝子産物に対する強い体液性及び細胞性免疫応答の誘導は、外来遺伝子産物が、特定の抗体及びＴ細胞の認識及び誘導のためのＶＡＣＶベクターの１５０超の抗原の全てと競合しなければならないという事実によって妨げられる。具体的な問題は、外来遺伝子産物に対する強いＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導を抑制するベクターＣＤ８ Ｔ細胞エピトープの免疫優性である（Ｓｍｉｔｈ等， 組換え改変ワクシニアアンカラのヒト試験におけるポックスウイルス特異的ＣＴＬの免疫優性， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５： ８４３１−８４３７， ２００５）。このことは、Ｄｒｙｖａｘ等の複製型ＶＡＣＶベクター並びにＮＹＶＡＣ及びＭＶＡのような非複製型ベクターにも適用される。

ＶＡＣＶによる組換え抗原（「新生抗原」）の説明のために、ポックスウイルス特異的プロモータのみが使用され、一般的な真核細胞プロモータは使用されない。その理由は、細胞質で複製し、そして、典型的な真核細胞プロモータを認識しないそれ自身の細胞自己転写機構をポックスウイルスに有する、ポックスウイルスの特定の生物学に依る。

ウイルス複製周期は、２つの主な相に分かれ、初期の相はＤＮＡ複製前に感染後最初の２時間を含み、後期相は感染後２〜４時間でのウイルスＤＮＡ複製の兆候で開始する。

後相は、子孫ウイルスが感染細胞から放出されるまで、感染後約２〜２０時間からのウイルス複製周期の残りに及ぶ。活性な、例えば初期及び後期のプロモータであるウイルス複製周期内で時間によって識別及び命名される、多数のポックスウイルスプロモータ型がある（例えば、Ｄａｖｉｓｏｎ及びＭｏｓｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１０： ７７１−７８４， １９８９； Ｄａｖｉｓｏｎ及びＭｏｓｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１０： ７４９−７６９， １９８９； 及びＨｉｒｓｃｈｍａｎｎ等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４： ６０６３−６０６９， １９９０（それらの全ては参照によって本明細書に組み込まれる）参照）。

初期プロモータは、遅発性感染でも活性であり得るが、後期プロモータの活性は後期相に限定される。中間プロモータと称されるプロモータの第３の種類は、初期相から後期相への移行で活性であり、ウイルスＤＮＡ複製に依拠する。後者は後期プロモータにも当てはまるが、中間プロモータからの転写は、典型的な後期プロモータからよりも早く開始し、転写因子の異なった群を必要とする。

新生抗原発現のためのポックスウイルスプロモータの一次的な種類の選択が、新生抗原特異的免疫応答の強度及び質に対する著しい効果を有することがここ数年徐々に明らかになってきた。後期プロモータの制御下で発現された新生抗原に対するＴ細胞応答が、初期プロモータ下で同一抗原について得られたものよりも弱いことが明らかとなった（Ｂｒｏｎｔｅ等， 樹状細胞による抗原発現は、モデル組換えポックスウイルス腫瘍ワクチンの治療的有効性と相関する， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９４： ３１８３−３１８８， １９９７． Ｃｏｕｐａｒ等， ワクシニアウイルス組み換え体におけるインフルエンザ血球凝集素発現の一次的制御、及び免疫応答に対する効果， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６： １４７９−１４８７， １９８６）。

更に驚くことに、ＶＡＣＶ及び反復欠損ＶＡＣＶベクターＭＶＡによる反復自家免疫において、専ら後期プロモータ下での抗原に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答が完全に失敗し得ることが最近明らかになっている。この失敗は、第２免疫後にほとんど検出不可能な抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答をもたらした（Ｋａｓｔｅｎｍｕｌｌｅｒ等， ＣＤ８＋ Ｔ細胞の交差競合は追加ワクチン接種中の免疫優性組織（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）を形作る， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２０４： ２１８７−２１９８， ２００７）。

従って、ＶＡＣＶベクターによる新生抗原の初期発現は、効率的な新生抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答には重要であるようである。初期発現ＶＡＣＶベクター抗原は後期発現抗原と競合するのみならず、ＣＤ８ Ｔ細胞応答における免疫優性のための他の初期抗原と競合することも明らかとなっている（Ｋａｓｔｅｎｍｕｌｌｅｒ等， ２００７）。従って、ポックスウイルスプロモータの初期部分の特定の性質は、新生特異的Ｔ細胞応答の誘導のために非常に重要であろう。更に、より高量の抗原がより強力な抗原特異的免疫応答の誘導のために有利であることは、一般的に受け入れられている見解であり一般的規則である（ポックスウイルス分野については、例えば、Ｗｙａｔｔ等， 免疫原性と、組換え改変ワクシニアウイルスアンカラＨＩＶワクチンのインビトロでの発現レベルとの相関関係， Ｖａｃｃｉｎｅ ２６： ４８６−４９３， ２００８を参照）。

４つの初期プロモータ要素及びＡＴＩ遺伝子由来の後期プロモータ要素を組み合わせたプロモータは、既に記載されており（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ等， 組換えワクシニアウイルスにおけるＡ型封入体ハイブリッドプロモータによって指向された外来遺伝子のインビボ及びインビトロでの増加した発現， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５： ５５８４−５５８８， １９９１； Ｗｙａｔｔ等， 組換え改変ワクシニアウイルスアンカラＨＩＶワクチンの免疫原性とインビトロ発現レベルとの相関関係， Ｖａｃｃｉｎｅ ２６： ４８６−４９３， ２００８）、抗原の増加した初期発現に指向することが明らかとなった。しかしながら、このようなプロモータによって駆動される抗原によって誘導されるＴ細胞応答は、単一免疫後に分析されているにすぎず、この条件下では、古典的なＰｒ７．５Ｋプロモータで得られた結果と明らかには異ならなかった（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ等， 組換えワクシニアウイルスにおけるＡ型封入体ハイブリッドプロモータによって指向された外来遺伝子のインビボ及びインビトロでの増加した発現， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５： ５５８４−５５８８， １９９１）。

Ｊｉｎ等 Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １３８： ３１５−３３０， １９９４は、ＣＡＴ遺伝子に作動可能に連結された変異型Ｐｒ７．５プロモータのタンデム反復（２〜３８コピー）と組み合わせたＶＡＣＶ ＡＴＩプロモータから成る組換えＶＡＣＶプロモータの構築を報告した。変異型Ｐｒ７．５プロモータの最大１０の反復は、初期遺伝子発現を増加させる点で効果的であった。更なる反復は、阻害するようである。全てのコンストラクトを用いて、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下（すなわち、ウイルス複製周期が初期相で制止された時）で産生されたＣＡＴタンパク質の量は、ＡｒａＣの非存在下で産生された量の１０分の１未満であった（Ｊｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １３８： ３１５−３３０， １９９４）。

最近、強力な初期要素の５コピーを含むハイブリッド初期−後期プロモータ（ｐＨｙｂ）の制御下でＯＶＡを発現する組換えＭＶＡによるマウスの反復免疫は、Ｐｒ７．５−及びＰｒＳ−駆動ＯＶＡに対する応答よりも、優れた急性かつメモリーＣＤ８ Ｔ細胞応答をもたらす、ことが明らかとなった。Ｂａｕｒ等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ８４ （１７）： ８７４３−８７５２ （２０１０）。更に、ｐＨｙｂの制御下で発現されたＯＶＡは、ＭＶＡ由来Ｂ８Ｒタンパク質を、３又はそれ以上の免疫化後に免疫優性ＣＤ８ Ｔ細胞抗原と置き換えた。前掲。

Ａｓｓａｒｓｓｏｎ等， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． １０５： ２１４０−４５， ２００８は、感染中の２２３注釈付きワクシニアウイルス遺伝子の発現レベルを同時に測定し、ゲノムタイリングアレイ・アプローチを用いてその速度論を決定した。彼らは、ワクシニアウイルスのＷＲ株における多くの遺伝子が高転写率を有することを見出した。Ａｓｓａｒｓｓｏｎ等は、高度に発現された遺伝子のいくつかの例を示した：ごく初期のＶＡＣＷＲ−０５９（二重鎖ＲＮＡ結合タンパク質）及びＶＡＣＷＲ−１８４（未知）；初期のＶＡＣＷＲ−０１８（未知）；初期／後期のＶＡＣＷＲ−１３１（コアタンパク質）；並びに後期のＶＡＣＷＲ−１６９（未知）。Ａｓｓａｒｓｓｏｎ等は、その例外的に高発現レベルのために、それらの遺伝子が将来の研究の特別な対象になり得るが、これらの遺伝子の転写を開始するプロモータを同定しなかった、ことを指摘した。

Ｙａｎｇ等， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． １０７： １１５１３−１１５１８， ２０１０は、感染後の経過した時間にワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）トランスクリプトームを分析するためにデープＲＮＡ配列を使用した。ウイルスＤＮＡ複製前に、１１８ ＶＡＣＶ ＯＲＦからの転写物を検出した；複製後、９３の追加のＯＲＦからの転写物を特徴付けた。高解像度、読み過し転写物を含む多くのｍＲＮＡの正確な境界、及びｍＲＮＡ開始部位及び隣接プロモータの位置を決定させた。

Ｏｒｕｂｕ等， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（６）：ｅ４０１６７， ２０１２は、非機能性又は非必須ＭＶＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を駆動する可能な初期プロモータが組換え抗原の免疫原性発現のために利用され得ることを明らかにした。Ｃ１１Ｒ、Ｆ１１Ｌ、Ａ４４Ｌ及びＢ８ＲのＭＶＡオルソログの、同一の翻訳開始コドンを用いるために位置付けられたモデル抗原との正確な置換は、共通して使用されたｐ７．５又はより短い合成プロモータによって達成されたものと類似の又は僅かに大きい初期転移遺伝子発現を可能にした。単発の又はアデノウイルスプライムのｒＭＶＡ追加免疫ワクチン接種によってマウスで誘発された抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度は、典型的なコンストラクトに比べて、その真正なゲノム遺伝子座で内因性プロモータを使用することによって同様に等しく又は僅かに亢進された。ｐ７．５と比べてＣ１１Ｒ又はＦ１１Ｌプロモータを用いて観察された免疫原性の亢進は、ｐ７．５と比べてｍＨ５プロモータで得られた亢進と同様であった。

組換えポックスウイルスによってコードされる抗原に対する強力なＴ細胞及び抗体応答は、ワクチン効率を改善し得る。結果として、当該分野では、ＭＶＡ等の組換えポックスウイルスによってコードされる抗原に対する強力なＴ細胞及び抗体応答を達成することができる組成物及び方法についての要求が存在する。本発明はこの要求を満足する。

本発明は、新生抗原をコードするヌクレオチド配列に連結されたＰｒ１３．５プロモータを含む組換え改善ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、及びその使用を包含する。
１つの実施態様では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける新生抗原に対する強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、ヒトを含む哺乳動物にＭＶＡウイルスの１又はそれ以上の免疫を投与することを含む、方法を包含する。

様々な実施態様では、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９５％、９８％又は１００％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む。

様々な実施態様では、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９５％、９８％又は１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む。

様々な実施態様では、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と１００％の同一性を有する少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列の２コピーを含む。

様々な実施態様では、Ｐｒ１３．５プロモータは配列番号２を含む。

図１は、ＭＶＡ０１３．５Ｌ遺伝子の上流配列（配列番号３）を示す。Ｐｒ１３．５−短（鎖）及びＰｒ１３．５−長（鎖）プロモータの配列を示す。破線：Ｐｒ１３．５−長（鎖）（位置１５８７８−１５７５５）。実線：Ｐｒ１３．５−短（鎖）（位置１５８０８−１５７５５）。下線：ＭＶＡ０１３．５（位置１５７０３−１５７０１）のＡＴＧ開始コドン。ＭＶＡ０１４Ｌ（位置１５８７８−１５８５６）のＴＡＡ停止コドン。下から黒矢印：ＲＡＣＥ ＰＣＲ（位置１５７６７及び１５７４７）によって定義された転写開始部位。上からグレー矢印：Ｙａｎｇ等， ２０１０， ｓｕｐｐｌ． ｄａｔａによって定義された転写開始部位。四角：Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ｓｕｐｐｌ． ｄａｔａ（位置１５９１３−１５８９９）によって定義されたコアプロモータ。ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ９８３２３８．１による位置。 図２は、ＭＶＡゲノム中のＰｒ１３．５−長（鎖）及びＰｒ１３．５−短（鎖）プロモータの配列及び位置（配列番号３）を示す。ＭＶＡ０１３．５遺伝子の上流配列には４４ｂｐ配列反復（直接的反復）がある。囲み：囲みは、３６ｂｐスペーサーによって分離されている１３．５の上流配列中の４４ｂｐ反復配列である。破線：Ｐｒ１３．５−長（鎖）（位置１５８７８〜１５７５５）。実線：Ｐｒ１３．５−短（鎖）（位置１５８０８〜１５７５５）。下線：ＭＶＡ０１３．５（位置１５７０３〜１５７０１）のＡＴＧ開始コドン。ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ９８３２３８．１による位置。 図３は、示された感染後時点で指示されたコンストラクトによって感染されたＨｅＬａ細胞由来の卵アルブミン−ｍＲＮＡを測定するＲＴ−ｑＰＣＲを示す。 図４は、示された感染後時点で指示されたコンストラクトによって感染されたＨｅＬａ細胞由来の平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてのＦＡＣＳによって測定されたＯｖａタンパク質発現を示す。３９９ＭＦＩでのｗｔ（Ｏｖａ遺伝子が含まれていない）の平均は、アッセイのバックグラウンドを反映する。 図５は、第１、第２及び第３免疫後に指示されたコンストラクトでワクチン接種されたマウス由来のＯｖａ＋／Ｂ８Ｒ＋細胞の平均比を示す。 図６は、指示されたコンストラクトでの第３免疫後１０週におけるマウスのＯｖａ＋／Ｂ８Ｒ＋Ｔ細胞応答の平均比を示す。 図７Ａは、第１、第２及び第３免疫後に指示されたコンストラクトからの抗体産生を示す。Ａは抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＢはＰｒＳプロモータと比べたＧＭＴの比。プロモータＭＶＡ５０Ｌ＋ＰｒＳＳＬ及びＭＶＡ１７０Ｒ＋ＰｒＳＳＬは、卵アルブミン遺伝子のＡＴＧの直接的に上流の、合成Ｓｈｏｒｔ Ｓｔｒｏｎｇ ＬａｔｅプロモータであるＰｒＳＳＬプロモータの５’側に融合した各々の遺伝子のＭＶＡプロモータである（ＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡ；配列番号７；国際公開第２０１０／０６０６３２号公報）。 図７Ｂは、第１、第２及び第３免疫後に指示されたコンストラクトからの抗体産生を示す。Ａは抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）、ＢはＰｒＳプロモータと比べたＧＭＴの比。プロモータＭＶＡ５０Ｌ＋ＰｒＳＳＬ及びＭＶＡ１７０Ｒ＋ＰｒＳＳＬは、卵アルブミン遺伝子のＡＴＧの直接的に上流の、合成Ｓｈｏｒｔ Ｓｔｒｏｎｇ ＬａｔｅプロモータであるＰｒＳＳＬプロモータの５’側に融合した各々の遺伝子のＭＶＡプロモータである（ＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＡＡ；配列番号７；国際公開第２０１０／０６０６３２号公報）。 図８Ａは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図８Ｂは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図８Ｃは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図８Ｄは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図８Ｅは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図８Ｆは、配列番号１を有する様々なポックスウイルスＰｒ１３．５プロモータのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。同一のヌクレオチドは点で示し、欠落しているヌクレオチドはダッシュで示し、変化は文字で示す。 図９Ａは、図８Ａ〜８Ｆのアラインメントの配列のアクセション番号及び名称を記載する。 図９Ｂは、図８Ａ〜８Ｆのアラインメントの配列のアクセション番号及び名称を記載する。 図９Ｃは、図８Ａ〜８Ｆのアラインメントの配列のアクセション番号及び名称を記載する。 図９Ｄは、図８Ａ〜８Ｆのアラインメントの配列のアクセション番号及び名称を記載する。

ＨｅＬａ細胞をＭＶＡ−ＢＮで感染させ、ＲＮＡを調製した。様々なＭＶＡ ＯＲＦに特異的なプライマーを作製し、これらのＯＲＦをコードするＭＶＡ ＲＮＡの代表的なＰＣＲ産物を作製するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ）（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲＬＭ−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ， ライフテクノロジーズ， ダルムシュタット， ドイツ）を使用した。転写開始部位を同定するためにＰＣＲ産物を配列決定した。この情報に基づいて、これらのＯＲＦをコードするｍＲＮＡの転写物について、プロモータを同定した。卵アルブミン（ＯＶＡ）遺伝子の発現を駆動するために、以下のＯＲＦ用のＭＶＡプロモータ：ＭＶＡ１３．５（ＣＶＡ０２２；ＷＲ０１８）、ＭＶＡ０５０Ｌ（Ｅ３Ｌ；ＷＲ０５９）、ＭＶＡ０２２Ｌ（Ｋ１Ｌ；ＷＲ０３２）、及びＭＶＡ１７０Ｒ（Ｂ３Ｒ；ＷＲ１８５）をＭＶＡコンストラクトに挿入した。

ＨｅＬａ細胞を、インビトロで組換えＭＶＡウイルスで感染させ、ＦＡＣＳ分析によって卵アルブミンタンパク質発現を試験した。感染後２時間又は４時間でさえも、ＭＶＡ０５０Ｌ（Ｅ３Ｌ；ＷＲ０５９）、ＭＶＡ０２２Ｌ（Ｋ１Ｌ；ＷＲ０３２）、及びＭＶＡ１７０Ｒ（Ｂ３Ｒ；ＷＲ１８５）プロモータを含むコンストラクトについては、ＦＡＣＳ分析によって卵アルブミンタンパク質発現は検出されなかった。反対に、ＭＶＡ１３．５（ＣＶＡ０２２；ＷＲ０１８）プロモータでは、２時間後に高レベルの卵アルブミン発現が既に検出された。

ＭＶＡ１３．５Ｌ ＯＲＦ用の推定プロモータコア要素は、１５ｎｔコア配列及び１７７ｎｔの非翻訳リーダーを含むとして、２０１０年にＹａｎｇ等によって既に同定された。しかしながら、現在の研究は、ＭＶＡ１３．５Ｌ ＯＲＦによって使用された転写開始部位がＹａｎｇ等によって同定された開始部位の１００超のヌクレオチド、下流であったことを指摘した。結果的に、本発明者らによって同定されたＭＶＡ１３．５プロモータは、Ｙａｎｇ等によって同定されたプロモータコア要素とは異なる。

本発明者らによって同定されたＭＶＡ１３．５プロモータは、４０超のヌクレオチド：ＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＡＧＴＡ（配列番号１）の反復を含む。反復配列はまた、多くの他のポックスウイルス、例えばウマポックスウイルス、サルポックスウイルス、ウシポックスウイルス、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ラクダ痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、エクトメリア痘ウイルス、及びアレチネズミ痘ウイルス（図８及び９）で見出される。

２つのＭＶＡコンストラクトは、卵アルブミン（ＯＶＡ）遺伝子の反復駆動発現の１コピーを含むプロモータ（ＭＶＡ１３．５短（鎖）；配列番号１）又は２コピーを含むプロモータ（ＭＶＡ１３．５長（鎖）；配列番号２）で作製した。高レベルの卵アルブミン発現は、このコンストラクトの両方を用いるインビトロでのＨｅＬａ細胞の感染後に検出された（図４）。

インビトロで感染ＨｅＬａ細胞において様々なプロモータによって指向される卵アルブミンＲＮＡ発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲにより様々な時点で測定された。ＭＶＡ１３．５短（鎖）及びＭＶＡ１３．５長（鎖）の両方は、高レベルの初期ＲＮＡ発現を示した（図３）。ＭＶＡ１３．５長（鎖）は、最高レベルの初期タンパク質発現を示した。

ＰｒＳ、Ｐｒ７．５ ｏｐｔ＋スペーサー、Ｐｒ１３．５短（鎖）及びＰｒ１３．５長（鎖）のプロモータの制御下での組換えで発現されたＯＶＡに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答は、組換えＭＶＡの１、２又は３回／マウスの免疫後にマウスで決定された（図５〜６）。ＯＶＡ特異的及びＢ８Ｒ（ウイルス）−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、ＭＨＣクラスＩヘキサマーに特異的に結合するＣＤ８ Ｔ細胞の数を評価することによって決定した。ＭＨＣクラスＩデキストラマーは、その各々のＨ−２Ｋｂ結合ペプチド、すなわちＯＶＡについてはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）又はウイルスＢ８ＲペプチドについてはＴＳＹＫＦＥＳＶ（配列番号５）と複合化された。

ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の、Ｂ８Ｒ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する平均比は、３回の免疫後にＭＶＡ１３．５長（鎖）について約２．５であった。他の３つのコンストラクトは、１未満の平均比を示した。従って、免疫優性ヒエラルキーの逆転は、新生抗原の発現についてはＰｒ１３．５長プロモータを用いることにより達成されたが、他のプロモータを用いると達成できなかった。

様々なプロモータの制御下で組換えで発現されたＯＶＡに対する抗体応答は、組換えＭＶＡの１、２又は３回の免疫／マウス後に、マウスで決定された（図７Ａ〜７Ｂ）。ＭＶＡ１３．５長（鎖）に対する抗体応答は、ＰｒＳプロモータによる組換えＭＶＡを用いる応答よりも、実質的に高かった。従って、ＭＶＡから新生抗原を駆動するためのＰｒ１３．５長（鎖）プロモータの使用は、予測できない優れた結果を与える。

Ｐｒ１３．５プロモータ
本発明は、Ｐｒ１３．５プロモータを含む又はそれから成る単離核酸を包含する。本発明の文脈内で、「Ｐｒ１３．５プロモータ」は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む。従って、「Ｐｒ１３．５プロモータ」は、様々な実施態様において、ＭＶＡヌクレオチド配列、合成配列、又はＭＶＡ以外のポックスウイルス由来の類似のポックスウイルス配列を言い得る。好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む。核酸配列は、好ましくは、４０、４１、４２、４３、４４又は４５塩基長である。

同一性のパーセンテージは、目視検査及び数学的計算によって決定され得る。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセンテージは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）によって記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューター
グループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能な、ＧＡＰコンピュータープログラム・バージョン６．０を用いて配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータは以下を含む：（１）ヌクレオチドの（同一性について１の値、非同一性について０の値を含む）単一の比較マトリックス、及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３−３５８， １９７９によって記載された、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５， １９８６の重み付け比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティ、各ギャップ中の各シンボルについて追加の０．１０のペナルティ；そして、（３）エンド・ギャップについてはペナルティ無し。当業者によって使用される、配列比較についての他のプログラムを使用できる。

好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、非相同の核酸配列に作動可能に連結される。本発明の文脈において、「非相同の核酸配列」とは、プロモータが本来連結されない核酸配列を意味する。本発明の文脈において、「作動可能に連結される」とは、プロモータがポックスウイルス感染細胞において非相同核酸配列の発現を促進することができることを意味する。非相同の核酸配列は、好ましくは、新生抗原をコードする。本発明の文脈において、新生抗原は、ポックスウイルスベクターによって自然には発現されない抗原を言う。

Ｐｒ１３．５プロモータは、組換えＤＮＡ技術によって非相同の核酸配列に作動可能に連結され得る。様々な実施態様において、非相同の核酸配列は、ポックスウイルスの１３．５ ＯＲＦに導入される。

好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、天然のポックスウイルスプロモータである。例えば、Ｐｒ１３．５プロモータは、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、サル痘ウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ラクダ痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、又はアレチネズミ痘ウイルスのＰｒ１３．５プロモータ由来でよい。好ましいＰｒ１３．５プロモータは、図９で示されるウイルス、及び図８で示される配列から選択され得る。

様々な実施態様では、Ｐｒ１３．５プロモータは合成Ｐｒ１３．５プロモータである。

Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４又は４５ヌクレオチドの配列の１、２、３、４、５、６又はそれ以上のコピーを含み得る。

好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１のヌクレオチド配列の１コピーを含む。

実施態様によっては、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１のヌクレオチド配列の１コピーを含み、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、少なくとも４０、４１、４２、４３又は４４ヌクレオチドの配列の１、２、３、４、５、６又はそれ以上のコピーを含む。

好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも４０塩基のヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む。

実施態様によっては、Ｐｒ１３．５プロモータは、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、少なくとも４０のヌクレオチド配列の１コピーを含み、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の１、２、３、４、５、６又はそれ以上のコピーを含む。好ましくは、第２のヌクレオチド配列は、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５塩基である。

好ましくは、反復された配列は２０〜８０ヌクレオチド、より好ましくは３０〜４０ヌクレオチド、及び最も好ましくは３３、３５、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドによって隔てられている。

好ましくは、Ｐｒ１３．５プロモータは、以下の配列の少なくとも１コピーを含む：
ＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＴＴＡＧＧＴＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＡＧＴＡ （配列番号２）。

実施態様によっては、Ｐｒ１３．５プロモータは、図８に示されるヌクレオチド変化の１又はそれ以上を含む。

本発明は、非相同性核酸配列にＰｒ１３．５プロモータを作動可能に連結することを含む、新生抗原を発現する方法を包含する。

Ｐｒ１３．５プロモータを含む組換えポックスウイルス
本発明は、非相同性核酸配列に作動可能に連結されたＰｒ１３．５プロモータを含む組換えポックスウイルスベクターであって、内因性ウイルスＰｒ１３．５プロモータに非相同性核酸配列を作動可能に連結するように非相同性核酸配列がポックスウイルスの１３．５ＯＲＦに挿入される組換えポックスウイルスベクターを包含する。別の実施態様では、非相同性核酸配列は、Ｐｒ１３．５プロモータに連結され、１３．５ ＯＲＦ以外のゲノムの部位に挿入される。

好ましくは、ポックスウイルスベクターは、コードポックスウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）亜科に属するポックスウイルスから得られる。ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、パラポックスウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、アビポックスウイルス（Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、カプリポックスウイルス（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、レプリポックスウイルス（Ｌｅｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スイポックスウイルス（Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、モルシポックスウイルス（Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）属、及びヤタポックスウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属に属するものを含む。オルソポックスウイルス属及びアビポックスウイルス属に属するポックスウイルスが最も好ましい。

ラクーンポックス及びマウスポックス等の他のポックスウイルスは、例えば野生型ワクチンの製造のために、本発明において採用され得る。カプリポックスウイルス及びレポリポックスウイルスのメンバーも、それぞれ、ウシ及びウサギ用のベクターとして有用であるかもしれないので、本発明に含まれる。

他の実施態様では、ポックスウイルスはアビポックスウイルスから得られる。本発明で使用するために好適なアビポックスウイルスの例は、任意のアビポックスウイルス、例えば、鶏痘ウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カナリア痘ウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ジュンコ痘ウイルス（Ｕｎｃｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、マイナ痘ウイルス（ｍｙｎａｈｐｏｘｖｉｒｕｓ）、鳩痘ウイルス（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、オウム痘ウイルス（ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ウズラ痘ウイルス（ｑｕａｉｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ペンギン痘ウイルス（ｐｅｎｇｕｉｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、クジャク痘ウイルス（ｐｅａｃｏｃｋｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スズメ痘ウイルス（ｓｐａｒｒｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ムクドリ痘ウイルス（ｓｔａｒｌｉｎｇｐｏｘｖｉｒｕｓ）及び七面鳥痘ウイルス（ｔｕｒｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）を含む。好ましいアビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスである、

好ましくは、ポックスウイルスはワクシニアウイルス、最も好ましくはＭＶＡである。本発明は、任意の及び全てのＭＶＡウイルスを用いて作製された組換えＭＶＡウイルスを包含する。好ましいＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ変異株、例えば、番号Ｖ０００８３００８でＥＣＡＣＣに寄託されているＭＶＡ−ＢＮ；２０００年１２月７日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ） に番号Ｖ００１ ２０７０７で寄託されているＭＶＡ−５７５；及びＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１ ２７０７としてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されているＭＶＡ−５７２である。寄託株の誘導体も好ましい。

好ましくは、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又は他の鳥類細胞株においてインビトロで、あるいは発育鶏卵においてインビボで再生的複製の可能性を有するが、ＭＶＡ５７５又はＭＶＡ５７２が再生的に複製できるヒト細胞での再生的複製の可能性を有さない。最も好ましくは、ＭＶＡは、ヒトケラチン生成細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、及びヒト子宮腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて、再生的複製の可能性を有さない。

好ましい実施態様では、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）においてインビトロで再生的複製の可能性を有し、そして、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト子宮腺癌細胞株ＨｅＣａＴ、及びヒト子宮腺癌細胞株ＨｅＬａにおいてＭＶＡ−５７５よりも弱毒化されていることによって特徴付けられる。好ましくは、ＭＶＡウイルスは、ＣＥＦ細胞において５００超の複製増幅率が可能である。

Ｔ細胞応答を誘導する抗原を含む任意の抗原は、本発明の組換えＭＶＡによって発現され得る。ウイルス、細菌、真菌及び癌抗原が好ましい。ＨＩＶ−１抗原、デング熱ウイルス抗原、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ抗原、炭疽菌抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス、コロナウイルス及び呼吸合包体ウイルス抗原は、特に好ましい抗原である。好ましくは、抗原は外来抗原又は新生抗原である。

本発明は、組換えポックスウイルス、好ましくはＭＶＡの製造法であって、相同性核酸配列がＰｒ１３．５プロモータに作動可能に連結するように、非相同核酸配列をポックスウイルスに挿入することを含む、製造法を包含する。

本発明は、特に、ヒトを含む哺乳動物の感染症及び疾患の治療又は予防のための医薬又はワクチンの製造における、本発明の組換えポックスウイルスの使用を包含する。

本発明は、特に、ヒトを含む哺乳動物の感染症及び疾患の治療又は予防のための、本発明の組換えポックスウイルスの使用を包含する。

本発明は、特に、ヒトを含む哺乳動物の感染症及び疾患の治療又は予防のためのワクチンとしての、本発明の組換えポックスウイルスの使用を包含する。

組換えＭＶＡを含むキット
本発明は、本発明に従う組換えポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡウイルスを含むキットを提供する。本キットは、ヒトを含む哺乳動物にウイルスを投与するための教示と共に、組換えポックスウイルスベクター、好ましくはＭＶＡウイルスの少なくとも１、２、３、４もしくはそれ以上の容器又はバイアルを含み得る。教示は、組換えウイルスが、特定の時点（すなわち、先の投与後の少なくとも４週、少なくとも６週、少なくとも８週）に１又は複数（すなわち、２、３、４、５、６等）投薬量で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されることを示し得る。好ましくは、教示は、組換えウイルスが、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は少なくとも４投薬量で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与されることを示す。

ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は抗体応答を誘導する方法
本発明は、宿主においてＣＤ８ Ｔ細胞及び／又は抗体応答を誘導する方法を包含する。好ましい実施態様では、本方法は、Ｐｒ１３．５プロモータを含む組換えポックスウイルス、好ましくはＭＶＡの少なくとも１、２、３、４又は５回免疫を、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む。

宿主への投与
本発明に従う組換えポックスウイルス、好ましくは、ＭＶＡは、ヒトを含みそして免疫不全ヒトさえ含む幅広い範囲の哺乳動物の治療のために使用され得る。従って、本発明はまた、医薬組成物、及びヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘導するためのワクチンを提供する。

ワクチンは、好ましくは、１０^４〜１０^９ＴＣＩＤ（組織培養感染量）_５０／ｍｌの濃度範囲で、好ましくは１０^５〜５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で、より好ましくは１０^６〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で、及び最も好ましくは１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で、特に１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌで、組換えポックスウイルス、好ましくはＭＶＡを含む。

哺乳動物、好ましくはヒトのための好ましいワクチン接種量は、１０^６〜１０^９ＴＣＩＤ_５０、最も好ましくは１０^７ＴＣＩＤ_５０又は１０^８ＴＣＩＤ_５０の量、特に１０^８ＴＣＩＤ_５０を含む。

医薬組成物は、一般的に、１又はそれ以上のその薬学的に許容される及び／又は承認された担体、添加物、抗生物質、保存料、アジュバント、希釈剤及び／又は安定剤を含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、油、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等でよい。好適な担体は、典型的には、大きく、ゆっくりと代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸及びアミノ酸コポリマー、脂質集合体等である。

ワクチンの調製のためには、本発明の組換えポックスウイルス、好ましくは、ＭＶＡは、生理学的に許容される形態に変換され得る。このことは、（Ｓｔｉｃｋｌ ｅｔ ａｌ． １９７４に記載されているように）天然痘に対するワクチン接種のための使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいて行われ得る。

例えば、精製されたウイルスは、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４に調製された５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの力価で、−８０℃で保存され得る。ワクチン注射、例えば１０^２〜１０^８のウイルス粒子、の調製のために、アンプル、好ましくはガラスアンプル中で、２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下で、１００μｌ〜１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥され得る。あるいは、ワクチン注射は、製剤中のウイルスを徐々に凍結乾燥することによって製造され得る。この製剤は、追加の添加物、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、又はポリビニルピロリドン、又は他の酸、例えば抗酸化剤、又は不活性ガス、安定剤又はインビボ投与で好適な組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含み得る。次いで、ガラスアンプルは、４℃〜室温で数ヶ月間保存され得る。しかしながら、必要がない限り、アンプルは好ましくは−２０℃未満の温度で保存される。

ワクチン接種又は治療のために、凍結乾燥物は、水溶液、好ましくは生理食塩水又はＴｒｉｓ緩衝液に溶解され得、全身的に又は局所的に、すなわち、非経口、皮下、静脈、筋肉内、鼻腔内、又は当業者に知られた任意の他の投与経路のいずれかで投与され得る。投与形式、投与量及び投与数は、公知の方法で当業者によって最適化され得る。しかしながら、最も一般的な哺乳動物、好ましくはヒトは、最初のワクチン投与から約２週〜６週後に第２のワクチン投与がなされる。第３、第４、及び次の投与は、前の投与後、約２週〜６週が最も一般的であろう。

本発明は、ヒトを含む哺乳動物を免疫する方法を提供する。１つの実施態様では、ラット、マウス及びヒトを含む対象の哺乳動物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの組換えＭＶＡの投薬量を投与することを含んで免疫される。１つの実施態様では、第１の投薬量は、組換えＭＶＡウイルスの１０^８ＴＣＩＤ_５０を含み、第２及び更なる投薬量（すなわち、第３、第４、第５等）は、このウイルスの１０^８ＴＣＩＤ_５０を含む。投与は、第１（プライミング）量及び第２量、又は更なる（追加）量（複数）でよい。

免疫は、全身的又は局所的のいずれかで、すなわち、非経口的に、皮下的に、静脈内で、筋肉内で、鼻腔内で、又は当業者に公知の任意の他の投与経路によって投与され得る。

ＣＤ８ Ｔ細胞応答及び抗体応答
本発明の組換えＭＶＡによる免疫は、強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導し得る。好ましい実施態様では、第１、第２、第３、第４、第５等の免疫後に、組換えＭＶＡは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、コードされた抗原に対して強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導し、それは、ＭＶＡベクターによってコードされた免疫優性ウイルスＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ、例えばＴＳＹＫＦＥＳＶ（配列番号５）に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答よりも高い。好ましくは、第２、第３、第４、第５等の免疫後に、免疫優性Ｔ細胞応答は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、コードされた抗原に対して誘導される。好ましくは、第２、第３、第４、第５等の免疫後に、組換えＭＶＡは、コードされた抗原に対する哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導し、それは、総ＣＤ８ Ｔ細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又は３５％である。好ましくは、第２、第３、第４、第５等の免疫後に、組換えＭＶＡは、コードされた抗原に対する哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答を、単回投与後にコードされた抗原に対する応答と比較して、少なくとも２、３、４、５又は１０倍（すなわち、総ＣＤ８ Ｔ細胞の少なくとも１％〜２％、３％、４％、５％又は１０％）増加させるか、あるいは、コードされた抗原に対する哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＴ細胞応答を、ウイルス抗原（例えば、Ｂ８Ｒ）のＴ細胞応答と比較して、少なくとも２、３、４、５又は１０倍増加させる。好ましくは、組換えＭＶＡは、コードされた抗原に対する哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答を、単回投与後にウイルス抗原（例えば、Ｂ８Ｒ）に対するＴ細胞応答と比較して、少なくとも２、３、４、５又は１０倍生じる。最も好ましくは、コードされた抗原に対する哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＣＤ８ Ｔ細胞応答は、２、３、４又は５回等の免疫により、ウイルス後期抗原（例えば、Ｂ８Ｒ）に対する応答よりも高度に増加する。

例えば、ＦＡＣＳ／ヘパリン緩衝液に約１００〜１２０μｌの血液を回収することによって、ＣＤ８ Ｔ細胞応答レベルを決定し得る。ＰＢＭＣは、ＲＢＣ溶解緩衝液で赤血球を溶解することによって調製し得る。次いで、ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８α−ＦＩＴＣ、ＣＤ４４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、及びＭＨＣクラスＩデキストラマーの各々のＨ−２Ｋｂ結合ペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）又はＴＳＹＫＦＥＳＶ（配列番号５）と複合化されたＭＨＣクラスＩデキストラマーを用いて、ＯＶＡ−及びＢ８Ｒ−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のための単一反応中で同時染色され得る。ＭＨＣクラスＩ ＳＩＩＮＦＥＫＬ−デキストラマー（配列番号４）はＰＥで標識され、ＴＳＹＫＦＥＳＶ−デキストラマー（配列番号５）はＡＰＣで標識され得る。染色された細胞は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ装置でフローサイトメトリによって分析され得る。１万個のＣＤ８＋ Ｔ細胞が１試料につき取得され得る。

あるいは、ＣＤ８ Ｔ細胞応答レベルは、免疫された哺乳動物、好ましくはヒトから血液を回収し、そして、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を分離することによって決定され得る。これらは、１μＭの免疫優性ＭＶＡエピトープ（すなわち、ＴＳＹＫＦＥＳＶ；配列番号５）（「Ｂ８Ｒ」）及び発現された新生抗原由来のペプチドを含む試験ペプチドと共に５μｇ／ｍｌ ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ，「ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ」， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）成長培地に再懸濁され得る。次いで、ＰＢＭＣは、５％ＣＯ２中で、３７℃で５時間インキュベートし、採取し、３ｍｌ冷ＰＢＳ／１０％ ＦＣＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、４℃で終夜保存され得る。翌日、ＰＢＭＣは、抗体、すなわち、抗ＣＤ８ａ−Ｐａｃ−Ｂｌｕｅ（クローン５３−６．７）、抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ−Ｃｙ７、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ７５０、及び抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（全ての抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で染色され得る。ＰＢＭＣは、暗中で４℃で３０分間、好適な希釈率の指示された抗体でインキュベートされ得る。洗浄後、細胞は、製造者の指示に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｐｌｕｓキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、固定、透過処理され得る。洗浄後、ＰＢＭＣは、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で希釈されたＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＦＮ−ｙ抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞内インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）について染色され得る。染色された細胞はフローサイトメトリで分析され得る。

本発明の組換えＭＶＡによる免疫は、強靭な抗体応答を誘発し得る。抗体応答はＥＬＩＳＡによって測定され得る。

本発明の文脈内では、「強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答」は、単回の免疫後に、ＰｒＳプロモータ（５’ＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡ ３’；配列番号６）を含む同一のＭＶＡコンストラクトで作製された割合よりも、新生抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の高い割合を意味する。実施態様によっては、ＣＤ８ Ｔ細胞応答は、単回の免疫後に、ＰｒＳプロモータ（配列番号６）を含む同一のＭＶＡコンストラクトで作製された割合よりも、新生抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の少なくとも１．５倍又は２倍高い割合を実証する。

本発明の文脈内では、「強靭な抗体応答」は、単回の免疫後に、ＰｒＳプロモータ（配列番号６）を含む同一のＭＶＡコンストラクトで得られた抗体力価よりも高い抗体力価を意味する。実施態様によっては、抗体力価は、単回の免疫後に、ＰｒＳプロモータ（配列番号６）を含む同一のＭＶＡコンストラクトで得られた抗体力価よりも、少なくとも１．５倍又は２倍高い。

組換えＭＶＡが新生抗原に対して「強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答」又は「強靭な抗体応答」を誘導するか否かは、本明細書に記載の実施例に記載されたように決定され得る。例えば、ＭＶＡ１３．５短（鎖）及びＭＶＡ１３．５長（鎖）の両方は、本明細書で定義される「強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答」を誘導する。ＭＶＡ１３．５長（鎖）は、本明細書で定義される「強靭な抗体応答」を誘導する。

本方法は好ましくはベクターの単一投与を含むが、実施態様によっては、組換えＭＶＡの２、３、４、５、６、７又はそれ以上の免疫は哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る。

好ましい実施態様では、コードされた抗原は、細菌、ウイルス、又は腫瘍抗原である。好ましくは、抗原は、ヒトを含む哺乳動物に対して外来抗原である。

実施例１ ＭＶＡ組換え体の作製
１０のＭＯＩ（ＴＣＩＤ_５０／細胞）で、ＭＶＡ−ＢＮによってＨｅＬａ細胞を感染させ、感染後２及び８時間に総ＲＮＡを調製した。様々なＭＶＡ ＯＲＦに特異的なプライマーを作製し、これらのＯＲＦをコードするＭＶＡ ＲＮＡの代表的なＰＣＲ産物を作製するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲＬＭ−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ダルムシュタット， ドイツ）を使用した。転写開始部位を同定するために、ＰＣＲ産物をシークエンスした。この情報に基づいて、これらのＯＲＦをコードするＲＮＡについてプロモータを同定した。卵アルブミン（ＯＶＡ）遺伝子：ＭＶＡ１３．５（ＣＶＡ０２２；ＷＲ０１８）、ＭＶＡ０５０Ｌ（Ｅ３Ｌ；ＷＲ０５９）、ＭＶＡ０２２Ｌ（Ｋ１Ｌ；ＷＲ０３２）、及びＭＶＡ１７０Ｒ（Ｂ３Ｒ；ＷＲ１８５）の発現を駆動するために、ＭＶＡコンストラクト（Ｂａｕｒ等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ８４ （１７）： ８７４３−８７５２ （２０１０））に、以下のＯＲＦ用のＭＶＡプロモータを挿入した。

実施例２ インビトロでのプロモータ依存的ＲＮＡ発現レベル
ＭＯＩ １０でのＭＶＡ組換えウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染は、氷上で１時間、風邪ウイルス付着を用いて行った。付着後、細胞を洗浄し、ゼロ時間（０時間）時点で収集するか、あるいは、他の時点のための収集のために３７℃でインキュベートした。０．５、１、２、４及び８時間ｐ．ｉ．（感染後）に試料を収集した。細胞をホモジナイズし、総ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡは消化されたＤＮアーゼであり、ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）プライミングを用いて合成した。得られたｃＤＮＡ調製物は、ＯＶＡ及びアクチンｃＤＮＡの同時増幅のためのＴａｑｍａｎ型ｑＰＣＲ反応における鋳型として使用した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ製のＡＢ７５００サイクラーでランした。結果を図３に示す。

実施例３ インビトロでのプロモータ依存的タンパク質発現レベル
１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭでＨｅＬａ細胞を培養した。組換えＭＶＡウイルスの１０のＭＯＩ（１０ＴＣＩＤ_５０／細胞）でＨｅＬａ細胞を感染した１、２、４、６、８及び２４時間ｐ．ｉ．（感染後）に感染された細胞を収集し、固定し、透過処理を行った。各試料について、細胞の半分は、ウサギ抗ニワトリＯＶＡ抗体を用いてＯＶＡタンパク質について染色し、細胞の残り半分は、ウサギ抗ＶＡＣＶポリクローナル抗体を用いてＭＶＡ抗原について染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリアナライザ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、試料を分析した。結果を図４に示す。

実施例４ マウス免疫及び出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）
試験にはマウス群（Ｃ５７／Ｂｌ６）を使用した。各群は、計３回の免疫を受けた。ＰＢＳ−注射群は、免疫応答のコントロールとして機能した。試験中、免疫応答の分析のために、血液は尾の血管から採取した。

０、４及び８週でＰＢＳ（総体積３００μＬ）に希釈した各々のＭＶＡウイルスの１０^８ＴＣＩＤ_５０で、マウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫した。Ｔ細胞分析のための出血は、各免疫後１週に行い、抗体分析のための出血は各免疫後３週に行った。

実施例５ Ｔ細胞染色及び抗体検出
約１００〜１２０μｌの血液／マウスをＦＡＣＳ／ヘパリン緩衝液に集めた。ＰＢＭＣはＲＢＣ溶解緩衝液で赤血球を溶解することによって調製した。ＰＢＭＣは、次いで、抗ＣＤ８α−ＦＩＴＣ、ＣＤ４４−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、及びＭＨＣクラスＩデキストラマーの各々のＨ−２Ｋｂ結合ペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）又はＴＳＹＫＦＥＳＶ（配列番号５）と複合化されたＭＨＣクラスＩデキストラマーを用いて、ＯＶＡ−及びＢ８Ｒ−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のための単一反応で同時染色した。ＭＨＣクラスＩ ＳＩＩＮＦＥＫＬ−デキストラマー（配列番号４）はＰＥで標識し、ＴＳＹＫＦＥＳＶ−デキストラマー（配列番号５）はＡＰＣで標識した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ装置上でフローサイトメトリによって、染色した細胞を分析した。１試料当たり１万個のＣＤ８＋ Ｔ細胞を取得した。結果を図５〜６に示す。

全血からの血清を調製した。特異的抗体を検出するために卵アルブミンＥＬＩＳＡ及びＭＶＡ ＥＬＩＳＡを行った（Ｓｅｒａｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ， ハイデセ， ドイツのＳｅｒａｚｙｍキット）。結果を図７に示す。

Claims (25)

1. ヒトにおける新生抗原に対する強靭なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスの１又はそれ以上の投与をヒトに投与することを含み、
   組換えＭＶＡが新生抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＰｒ１３．５プロモータを含み、
   Ｐｒ１３．５プロモータが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、方法。
2. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項２に記載の方法。
10. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項３に記載の方法。
11. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列の２コピーを含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号２を含む、請求項１に記載の方法。
13. 新生抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＰｒ１３．５プロモータを含む組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、
    Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、組換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス。
14. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
15. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
16. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
17. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１４に記載の組換えＭＶＡ。
18. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１５に記載の組換えＭＶＡ。
19. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９８％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
20. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
21. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１４に記載の組換えＭＶＡ。
22. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも３１ヌクレオチドの第２ヌクレオチド配列の少なくとも１コピーを含む、請求項１５に記載の組換えＭＶＡ。
23. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する少なくとも４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列の２コピーを含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
24. 前記Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号２を含む、請求項１３に記載の組換えＭＶＡ。
25. 新生抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したＰｒ１３．５プロモータを含む組換えポックスウイルスであって、
    Ｐｒ１３．５プロモータが配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも４０塩基の核酸配列の少なくとも１コピーを含む、組換えポックスウイルス。

Images