JP2015524249A - 組換えヒトα−ガラクトシダーゼAの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.組換えヒトα-Gal Aの製造方法であって次のステップ,即ち:
(a)ヒトα-Gal A産生哺乳類細胞を無血清培地中で培養して培地中に当該組換えヒトα-Gal Aを分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られる培養物から細胞を除去することにより培養上清を集めるステップと,
(c)上記ステップ(b)で集められる 培養上清を,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー又は色素親和性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,
(d)上記ステップ(c)で集められる画分を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A画分を集めるステップと,
(e)上記ステップ(d)で集められる画分を,リン酸基に対する親和性を有する固相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,
(f)上記ステップ(e)で取集される画分を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,そして
(g)上記ステップ(f)で集められる画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと
をこの順で含むものである方法。
2.陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて用いられる陽イオン交換樹脂が,弱陽イオン交換樹脂である,上記(1)の方法。
3.該弱陽イオン交換樹脂が,疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を有するものである,上記(2)の方法。
4.該弱陽イオン交換樹脂がフェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を有するものである,上記(2)又は(3)の方法。
5.該色素親和性カラムクロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である,上記(1)〜(4)の何れかの方法。
6.リン酸基に対し親和性を有する材料がヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,上記(1)〜(5)の何れかの方法。
7.リン酸基に対する親和性を有する材料がヒドロキシアパタイトである,上記(6)の方法。
8.該哺乳類細胞がEF−1(α)プロモーターの下で組換えヒトα-Gal Aを発現するよう設計された発現ベクターで形質転換されたCHO細胞である,上記(1)〜(7)の何れかの方法。
9.オリゴ糖鎖中にマンノース−6−リン酸残基を有する組換えヒトα-Gal Aの精製方法であって,次のステップ,即ち:
(a)汚染物質を含んだ組換えヒトα-Gal Aをリン酸基に対する親和性を有する材料を固相として用いたクロマトグラフィーカラムに負荷するステップと,
(b)該カラムに第1の移動相を流して,該組換えヒトα-Gal Aを該カラムに吸着させつつカラムを洗浄するステップと,そして
(c)該カラムに,該第1の移動相より高い濃度でリン酸塩を含有するものである第2の移動相を流すことにより,該カラムからヒトα-Gal Aを流出させるステップ
とを含んでなる精製方法。
10.リン酸基に対する親和性を有する該材料がヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,上記(9)の方法。
11.リン酸基に対する親和性を有する該材料がヒドロキシアパタイトである,上記(10)の方法。
12.上記(1)〜(11)の何れかの方法によって製造される組換えヒトα-Gal A。
pEF/myc/nucベクター(Invitrogen)をKpnI及びNcoIで消化してEF-1(α)プロモーター及びその第1イントロンを含んだDNA断片を切り出し,次いでこれをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。こうして得られたDNA断片をBglII及びEcoRIで消化しT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化しておいた pC1-neoベクター(Invitrogen)に挿入した。これに上記のEF-1(α)プロモーター及びその第1イントロンを含んだ平滑末端化断片を挿入して,pE-neoベクターを得た(図1)。
CHO細胞(CHO-K1: American Type Culture Collectionより入手)を,次の方法に従って,Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を使用して上記発現ベクターpE-gs/hGHpA(α-Gal A)でトランスフェクトした。即ち,トランスフェクションの2日前,2.5×105 個のCHO-K1細胞を,5%FCSを含有する3mLのD-MEM/F12培地(D-MEM/F12/5%FCS)を含んだ3.5cmの培養皿に播き,5%CO2及び95%空気よりなる加湿雰囲気中で37℃にて細胞を培養した。2日間の培養の後,細胞をPBSで洗浄し,1mLの新鮮な無血清D-MEM/F12を添加した。次いで細胞を,Opti-MEM I培地(Invitrogen)で20倍稀釈したLipofectamine 2000溶液とOpti-MEM I培地で20μg/mLに希釈したpE-gs/hGHpA(α-GalA)溶液との1:1混合溶液200μLの添加によりトランスフェクトし,5%CO2及び95%空気よりなる加湿雰囲気中で引き続き37℃にて5時間インキュベートした。トランスフェクションの後,培地をD-MEM/F12/5%FCSに置き換えて,24時間培養した。
上記種細胞を融解させ4×105個/mLの密度まで稀釈し,10mg/Lのインスリン,40mg/Lのチミジン,100mg/Lのヒポキサンチン,100μmole/LのMSX,及び10%のDISOを添加したCD-Opti CHO培地(CD培地)を用いて3〜4日間培養し,次いで,CD培地を用いて2×105個/mLの密度まで稀釈し,3〜4日間培養した。細胞を再び2×105個/mLまで稀釈し,更に3〜4日間培養した。
トリ−n−ブチルリン酸(TNBP)及びポリソルベート80を,上記の濃縮された培養上清の約75Lに,それらの終濃度がそれぞれ0.3%(v/v)及び1%(w/v)となるように加え,この混合溶液を室温にて3〜4時間穏やかに撹拌した。
次いで,上記のウイルス不活化した溶液のpHを1Mトリス緩衝液(pH8.8)の添加により7.5に調節し,続いて,その電気伝導度を,1mM塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)の添加によって,50mMの塩化ナトリウムを含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.5)のそれに合わせた。次いで,この溶液をDurapore Opticap XL10 (Millipore)を通して濾過し,次いで,50mM塩化ナトリウムを含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.5)を用いて線流速150cm/時で平衡化させておいた陰イオン交換カラムであるQ Sepharose Fast Flow カラム(カラム体積:約19.2L,ベッド高さ:約20cm,GE Healthcare)に負荷し,rh α-Gal Aをカラムに吸着させた。次いで,カラム体積の3倍の同じ緩衝液を同じ流速で供給してカラムを洗浄し,吸着されたrh α-Gal Aを,225mM塩化ナトリウムを含有するカラム体積の6倍の10mMリン酸緩衝液(pH7.5)で,続いて,カラム体積の3倍の1M塩化ナトリウムを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で溶出させ, rh α-Gal A含有画分を集めた。
96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)の各ウェルに,0.05M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)で0.25μg/mLに稀釈したマウス抗ヒトα-Gal Aモノクローナル抗体の100μLを加え,プレートを室温で少なくとも1時間又は2〜8℃で終夜放置して,抗体をウェルに吸収させた。次いで,各ウェルを,0.05%Tween20(PBS-T)を含有するリン酸緩衝生理食塩水,pH7.4(PBS)で洗浄した後,1%BSAを含有するPBS-Tの300μLを加えて,プレートを室温で少なくとも1時間放置した。次いで,各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後,ウェルに100μLの試験サンプル又は,0.5%BSA及び0.05%Tween20を含有するPBS(PBS-BT)で所望により希釈しておいたヒトα-Gal A標準品を加えて,プレートを室温にて少なくとも1時間放置した。次いで,各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後, PBS-Tで希釈した西洋ワサビペルオキダーゼ標識ウサギ抗ヒトα-Gal Aポリクローナル抗体100μLを加えて,プレートを少なくとも1時間放置した。次いで,PBS-Tで各ウェルを3回洗浄した後,0.009%の過酸化水素を含有するリン酸クエン酸緩衝液(pH5.0)を用いた100μLの0.4mg/mL o−フェニレンジアミンをウェルに添加し,プレートを10〜25分間室温で放置した。次いで0.1mLの1モル/L硫酸を各ウェルに添加して反応を停止させ,各ウェルにつき96ウェルプレートリーダーで490nmでの吸光度を測定した。
4−メチルウンベリフェロンを希釈緩衝液(26.7mMクエン酸−44.8mMリン酸緩衝液。pH4.6。0.1mg/mLのBSAを含有)に溶解させることにより,0〜200μmole/Lの濃度の標準溶液を調製した。4−メチルウンベリフェリル−α−D−ガラクトピラノシド(SIGMA)を稀釈緩衝液に終濃度5mMで溶解させることにより,基質溶液を調製した。稀釈緩衝液で希釈した標準溶液又は試験サンプルの各10μLを,96ウェルマイクロタイタープレート(FluoroNunc Plate, Nunc)の各ウェルに添加した。稀釈された試験サンプル又は何れかの標準溶液を含んだ96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに,基質溶液の75μLを添加し,プレートを37℃にて暗所に1時間放置した。このインキュベーションの後,200μLのストップ緩衝液(0.2Mグリシン−水酸化ナトリウム,pH10.6)を各ウェルに添加した。次いで,励起光波長335nm,及び蛍光波長460nmで,各ウェル内の溶液の蛍光強度を96ウェルプレートリーダーにより測定した。
上で精製されたrh α-Gal Aを,還元性且つ加熱(70℃10分)条件下に,SDS-PAGE電気泳動に付した。クマジーブリリアントブルーによるゲルの染色は,Superdex 200 pg画分において,分子量約55kDの位置に単一のバンドを明らかにした(図4,レーン7)。
配列番号2:hGH-r1,合成配列
配列番号3:hGH-f2,合成配列
配列番号4:hGH-r2,合成配列
配列番号5:プライマーGS-1,合成配列
配列番号6:プライマーGS-3,合成配列
配列番号7:プライマーGS-2,合成配列
配列番号8:プライマーGS-4,合成配列
配列番号9:プライマーGAL-Mlu,合成配列
配列番号10:プライマーGAL-Sca2,合成配列
配列番号11:プライマーGAL-Sca1,合成配列
配列番号12:プライマーGAL-Xba,合成配列
Claims (12)
- 組換えヒトα-Gal Aの製造方法であって次のステップ,即ち:
(a)ヒトα-Gal A産生哺乳類細胞を無血清培地中で培養して培地中に当該組換えヒトα-Gal Aを分泌させるステップと,
(b)上記ステップ(a)で得られる培養物から細胞を除去することにより培養上清を集めるステップと,
(c)上記ステップ(b)で集められる 培養上清を,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー又は色素親和性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,
(d)上記ステップ(c)で集められる画分を疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A画分を集めるステップと,
(e)上記ステップ(d)で集められる画分を,リン酸基に対する親和性を有する固相材料を用いたカラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,
(f)上記ステップ(e)で取集される画分を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと,そして
(g)上記ステップ(f)で集められる画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付して組換えヒトα-Gal A活性画分を集めるステップと
をこの順で含むものである方法。 - 陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて用いられる陽イオン交換樹脂が,弱陽イオン交換樹脂である,請求項1の方法。
- 該弱陽イオン交換樹脂が,疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を有するものである,請求項2の方法。
- 該弱陽イオン交換樹脂がフェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を有するものである,請求項2又は3の方法。
- 該色素親和性カラムクロマトグラフィーにおいて用いられる色素がブルートリアジン色素である,請求項1〜4の何れかの方法。
- リン酸基に対し親和性を有する材料がヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,請求項1〜5の何れかの方法。
- リン酸基に対する親和性を有する材料がヒドロキシアパタイトである,請求項6の方法。
- 該哺乳類細胞がEF−1(α)プロモーターの下で組換えヒトα-Gal Aを発現するよう設計された発現ベクターで形質転換されたCHO細胞である,請求項1〜7の何れかの方法。
- オリゴ糖鎖中にマンノース−6−リン酸残基を有する組換えヒトα-Gal Aの精製方法であって,次のステップ,即ち:
(a)汚染物質を含んだ組換えヒトα-Gal Aをリン酸基に対する親和性を有する材料を固相として用いたクロマトグラフィーカラムに負荷するステップと,
(b)該カラムに第1の移動相を流して,該組換えヒトα-Gal Aを該カラムに吸着させつつカラムを洗浄するステップと,そして
(c)該カラムに,該第1の移動相より高い濃度でリン酸塩を含有するものである第2の移動相を流すことにより,該カラムからヒトα-Gal Aを流出させるステップ
とを含んでなる精製方法。 - リン酸基に対する親和性を有する該材料がヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選ばれるものである,請求項9の方法。
- リン酸基に対する親和性を有する該材料がヒドロキシアパタイトである,請求項10の方法。
- 請求項1〜11の何れかの方法によって製造される組換えヒトα-Gal A。
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