JP2015522290A - 赤血球の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
含む幹細胞(hESC)の赤血球系細胞への分化誘導方法を提供する。
(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iii)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(iv)アクチビンA、
(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vi)幹細胞因子(SCF)、及び
(vii)β‐エストラジオール。
(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iii)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(iv)幹細胞因子(SCF)、
(v)β‐エストラジオール、
(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vii)トロンボポエチン(TPO)、
(viii)ヘパリン、
(ix)ヒドロコルチゾン、
(x)Flt3リガンド、
(xi)インターロイキン3(IL3)、
(xii)IL11、
(xii)エリスロポエチン(EPO)、
(xiv)インスリン成長因子1(IGF1)、
(xv)StemRegenin1(SR1)、及び
(xvi)プルリポチン(SC1)。
(i)GSK3阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)Wnt3A及び/またはWnt5a、及び
(v)アクチビンA。
(i)GSK3阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(v)アクチビンA、
(vi)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vii)幹細胞因子(SCF)、及び
(viii)β‐エストラジオール。
(i)BMP4、
(ii)VEGF、
(iii)FGFα、
(iv)SCF、
(v)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vi)トロンボポエチン(TPO)、
(vii)ヘパリン、
(viii)ホスホジエステラーゼ阻害剤(例えば、IBMX)、及び
(ix)β‐エストラジオール。
(i)BMP4、
(ii)VEGF、
(iii)FGFα、
(iv)SCF、
(v)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vi)トロンボポエチン(TPO)、
(vii)ヘパリン、
(viii)ホスホジエステラーゼ阻害剤(例えば、IBMX)、及び
(ix)β−エストラジオール
(i)ヒドロコルチゾン、
(ii)SCF、
(iii)Flt3リガンド、
(iv)BMP4、
(v)インターロイキン3(IL3)、
(vi)IL11、
(vii)ホスホジエステラーゼ阻害剤(例えば、IBMX)、及び
(viii)エリスロポエチン(EPO)。
(i)ヒドロコルチゾン、
(ii)SCF、
(iii)インスリン様成長因子1(IGF1)、
(iv)IL3、
(v)IL11、及び
(vi)EPO。
(a)幹細胞を保持し胚様体の形成を誘導する
(b)胚様体にサブフェーズ1aを行う;
(c)サブフェーズ1aの生成物にサブフェーズ1bを行う;
(d)サブフェーズ1bの生成物にサブフェーズ2aを行う;
(e)サブフェーズ2aの生成物にサブフェーズ2bを行う;
(f)サブフェーズ2bの生成物にサブフェーズ2cを行う;
(g)サブフェーズ2cの生成物にサブフェーズ2dを行う;
(h)サブフェーズ2eの生成物にサブフェーズ2fを行う;及び
(i)サブフェーズ2fの生成物にサブフェーズ2gを行う;
(i)Stemline(登録商標)I&II(シグマ・アドリッチ社製)、
(ii)Stemspan(登録商標)(ステムセル・テクノロジーズ社製)、
(iii)X−vivo 10、15または20(バイオウィッタカー/ロンザ社製)、
(iv)StemPro(登録商標)34(ライフ・テクノロジーズ社製)、
(v)Poietics HPGM (ロンザ社製)、
(vi)APEL(ステムセル・テクノロジーズ社製)、
(vii)IMDMまたはDMEM+因子(BITと同類の因子)をベースにした他のオーダーメードまたはホームメードの培地。
(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iii)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(iv)アクチビンA、
(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vi)幹細胞因子(SCF)、
(vii)β−エストラジオール、
(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vii)トロンボポエチン(TPO)、
(viii)ヘパリン、
(ix)ヒドロコルチゾン、
(x)Flt3リガンド、
(xi)インターロイキン3(IL3)、
(xii)IL11、
(xii)エリスロポエチン(EPO)、
(xiv)インスリン成長因子1(IGF1)、
(xv)StemRegenin1(SR1)、及び
(xvi)プルリポチン(SC1)。
(i)Stemline(登録商標)I&II(シグマ・アドリッチ社製)、
(ii)Stemspan(登録商標)(ステムセル・テクノロジーズ社製)、
(iii)X−vivo 10、15または20(バイオウィッタカー/ロンザ社製)、
(iv)StemPro(登録商標)34(ライフ・テクノロジーズ社製)、
(v)Poietics HPGM (ロンザ社製)、
(vi)APEL(ステムセル・テクノロジーズ社製)、
(vii)IMDMまたはDMEM+因子)(BITと同類の因子)をベースにした他のオーダーメードまたはホームメード培地。
(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iii)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(iv)アクチビンA、
(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vi)幹細胞因子(SCF)、
(vii)β‐エストラジオール、
(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vii)トロンボポエチン(TPO)、
(viii)ヘパリン、
(ix)ヒドロコルチゾン、
(x)Flt3リガンド、
(xi)インターロイキン3(IL3)、
(xii)IL11、
(xii)エリスロポエチン(EPO)、及び
(xiv)インスリン成長因子1(IGF1)。
(i)GSK3阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(v)アクチビンA、
(vi)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vii)幹細胞因子(SCF)、及び
(viii)β−エストラジオール。
(i)GSK3阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)Wnt3A及び/またはWnt5a、及び
(v)アクチビンA。
(i)GSK3阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(v)アクチビンA、
(vi)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vii)幹細胞因子(SCF)、及び
(viii)β−エストラジオール。
(i)ホスホジエステラーゼ阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(v)幹細胞因子(SCF)、
(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vii)トロンボポエチン(TPO)、
(viii)ヘパリン、
(ix)β−エストラジオール、
(x)ヒドロコルチゾン、
(xi)Flt3リガンド、
(xii)インターロイキン3(IL3)、
(xiii)IL11、
(xiv)エリスロポエチン(EPO)、
(xv)StemRegenin1(SR1)、及び
(xvi)プルリポチン(SC1)。
(i)ホスホジエステラーゼ阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iv)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(v)幹細胞因子(SCF)、
(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(vii)トロンボポエチン(TPO)、
(viii)ヘパリン、及び
(ix)β‐エストラジオール。
(i)ホスホジエステラーゼ阻害剤、
(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(iii)ヒドロコルチゾン、
(iv)Flt3リガンド、
(v)インターロイキン3(IL3)、
(vi)IL11、
(vii)エリスロポエチン(EPO)、
(viii)β−エストラジオール、
(ix)StemRegenin1(SR1)、及び
(ix)プルリポチン(SC1)。
(i)幹細胞因子(SCF)、
(ii)ヒドロコルチゾン、
(iii)インターロイキン3(IL3)、
(iv)IL11、
(v)エリスロポエチン(EPO)、及び
(vi)インスリン成長因子1(IGF1)。
(a)本明細書に記載の1以上の培地;
(b)以下の(i)〜(xviii)からなる群から選択される1以上の化合物:
(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、
(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、
(iii)Wnt3A及び/またはWnt5a、
(iv)アクチビンA、
(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、
(vi)幹細胞因子(SCF)、
(vii)β−エストラジオール、
(viii)インスリン様成長因子2(IGF2)、
(ix)トロンボポエチン(TPO)、
(x)ヘパリン、
(xi)ヒドロコルチゾン、
(xii)Flt3リガンド、
(xiii)インターロイキン3(IL3)、
(xiv)IL11、
(xv)エリスロポエチン(EPO)、
(xvi)インスリン成長因子1(IGF1)、
(xvii)StemRegenin1(SR1)、及び
(xviii)プルリポチン(SC1);
(c) 幹細胞、胚様体及び/または胚細胞の培養及び/または保持のための、オプションで用いる無菌容器;
(d)培地にサプリメントを添加するツール及び/または道具(ピペット及び/またはシリンジなど);及び
(e)使用説明書。
以下に図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、Cellstart(ライフ・テクノロジーズ社製)のStempro培地(ライフ・テクノロジーズ社製)中で未分化の状態で保持され、EZパッセージ(EZpassage)ツール(ライフ・テクノロジーズ社製)を用い、それら細胞の状態に応じて略7日毎に継代する。
17乃至21日目から24乃至28日目では、上記のサイトカイン類の全投与量は2日毎に更新し、0.5mlのStemlineIIに新鮮なサイトカインの最終濃度が17乃至21日目と同濃度になるように添加する。
10日目、17乃至21日目、及び24乃至28日目では、細胞の造血及び赤血球特性を評価するため、細胞をフローサイトメトリーで分析した。CD31、CD34、CD36、CD41a、CD43、CD45、CD71及びCD235a(グリコホリンAとして知られる)(BDバイオサイエンス社製及びeバイオサイエンス社製)に対する抗体を使用し、細胞をBD FACSCaliburフローサイトメーター(eバイオサイエンス社製)で分析した。
hPSCの分化の程度を評価するために、遺伝子パネルは赤血球形成の種々の段階で発現することが知られている遺伝子を含むよう選択される。
本明細書に記載したhPSCからのRBC(Red Blood Cell)の産生は、生体内赤血球の発育の模倣を目的とする連続的分化プロセスであり、生体内で誘導されるRBCの生物学的機能に類似し、また一致する最終製品を得るためのものである。
さらに、造血性の同定は、CD43抗体の分析によって確認でき(Vodyanik MA, Thomson JA, Slukvin II, Blood, 2006 15;108(6):2095-105)、図2に示すように10日目のフローサイトメトリー分析で、細胞の50〜100%がこの重要なマーカーを発現することを示している。d10の細胞で検出された抗原のパネル及び特にCD31、CD41a、CD43及びCD235aが同時に存在することから、細胞の大部分は血管芽腫の(hemangioblastic)段階または血管芽腫後(post hemangioblastic)の段階であると思われる(図2)(Salvagiotto G et al, Exp Hematol.2008 36(10):1377-89)。これらの細胞は、d10でのCFU分析において、全ての骨髄性系統を含むコロニーをも形成することができる。
本発明者らは、混濁液ベースの液体培地を使用し、スケールアップが可能であり、精製工程を必要としないほど効率の高い(d10でHPCが80%を超え、d24で赤血球系が90%超える)分化プロトコルを提供する。本方法は赤血球に分化する細胞数のかなりの量の増幅をサポートする(d0〜24で最大35万フォールド)。これは以前に報告された量を超え、HoxB4を増幅剤として使用した場合も超えている[REFS]。本方法は、ヒト多能性幹細胞(hESC)と呼ばれるヒト人工多能性幹細胞(iPSC)、またはヒト胚性幹細胞(hESC)(これは完全にGMPに準拠したライセンス条件下で誘導されるESC株をも含む。)に適している。さらに、細胞は正染性正赤芽球の段階に達しており、最終的な造血特性を示す(胚性グロビンのシャットオフとΑγグロビンの発現を含む)。プロセスのスケールアップに向けた新たな一歩として、本発明者らはこのプロトコルがhPSCからスタートすることを保証する。このhPSCは、GMP準拠の試薬を用いた大規模な装置での生産に適している無フィーダー培養により、多くの継代に渡り保持されてきたものである。
・この分化方法は、hiPSCとhESCを含むヒト多能性SCの効率的な分化に使用できる。
・アクチビンAはiPSCの効率的な分化に必要である。
・アクチビンAの投与を増やすことには有益な効果がない(データは示さない)。
・inhibitorVIIIのパルスの延長(d0〜5)は分化した細胞(iPSCまたはhESC)の収率を増加させる。
・inhibitorVIII、またはCHIR99021とIBMXの組み合わせは相乗効果を示すが、BiO、特異性の少ないGSK3阻害剤は効果がない
・サイトカインミックスAでの長期培養(d10〜21)が、分化した細胞の収率を増加させる。
・検査パラメータの組み合わせにより、hPSCあたり350×103赤血球系細胞を達成し、赤血球細胞の収率を最大化できた。この増殖は6ウェルプレートの2以下のウェルから採取できたiPSC 6×106あたりRBCの1単位濃度(2×1012細胞)に相当する。
・このプロトコルは、GMPグレードの無血清培地(CellStart、ライフ・テクノロジーズ社製)中のGMPグレードの無細胞基質で前もって保持したPSC(StemPro、ライフ・テクノロジーズ社製)を使用して最適化されており、PSCを保持するためにフィーダーを使用する他の多くのプロトコルとは異なり、GMPグレードの製造と完全な互換性がある。
Claims (14)
- 人口多能性幹細胞(iPS)及び/またはヒト胚を破壊することなく得られた幹細胞をGSK3阻害剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤と接触させる工程を含む、幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法。
- 幹細胞の接触工程が、GSK3阻害剤と接触する第1フェーズと、第1フェーズで産生または発生した細胞がホスホジエステラーゼ阻害剤と接触する第2フェーズからなる請求項1に記載の方法。
- GSK3阻害剤が、(i)特定のGSK3阻害剤、(ii)特定のGSK3β阻害剤、(iii)インヒビターVIII(inhibitorVIII)、または(iv)CHIR99021である請求項1または2に記載の分化誘導方法。
- ホスホジエステラーゼ阻害剤が3−イソブチル−1−メチルキサンチン(イソブチルメチルキサンチン(IBMX))である先行するいずれかの請求項に記載の方法。
- 赤血球細胞が、CD31、CD34、CD36、CD41a、CD43、CD45、CD71、及びCD235aからなる群から選択される1以上の造血/赤血球系マーカーの発現によって特徴づけられる先行いずれかの請求項に記載の方法。
- 第1フェーズが、幹細胞が胚様体を形成するように誘導される第1の工程を含む請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 第1フェーズが、幹細胞に、さらに(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iii)Wnt3A、(viii)アクチビンA、(ix)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(x)幹細胞因子(SCF)、及び(xi)β−エストラジオールからなる群から選択される1以上の補助的化合物と接触させることを含む請求項2〜6のいずれかに記載の方法。
- 第2フェーズが、第1フェーズで産生または発生した細胞をさらに、(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iii)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(iv)幹細胞因子(SCF)、(v)β−エストラジオール、(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、(vii)トロンボポエチン(TPO)、(viii)ヘパリン、(ix)ヒドロコルチゾン、(x)Flt3リガンド、(xi)インターロイキン3(IL3)、(xii)IL11、(xii)エリスロポエチン(EPO)、(xiv)インスリン成長因子1(IGF1)、(xv)StemRegenin1(SR1)、及び(xvi)プルリポチン(SC1)からなる群から選択される1以上の補助的化合物と接触させることを含む請求項2〜7のいずれかに記載の方法。
- 幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法であって、幹細胞をGSK3阻害剤及び(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iii)Wnt3A、(iv)アクチビンA、(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(vi)幹細胞因子(SCF)、及び(vii)β−エストラジオールからなる群から選択される1以上の補助的化合物と接触させる工程を含む第1フェーズの方法、及び第1フェーズの方法で産生または発生した細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤及び(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iii)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(iv)幹細胞因子(SCF)、(v)β−エストラジオール、(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、(vii)トロンボポエチン(TPO)、(viii)ヘパリン、(ix)ヒドロコルチゾン、(x)Flt3リガンド、(xi)StemRegenin1(SR1)、及び(xii)プルリポチン(SC1)からなる群から選択される1以上の補助的化合物と接触させることを含む第2フェーズの方法を含み、前記幹細胞が人口多能性幹細胞(iPS)及び/またはヒト胚を破壊することなく得られた幹細胞であることを特徴とする(分化誘導)方法。
- 第1フェーズの方法が、幹細胞が胚様体を形成するように誘導される第1の工程を含む請求項9に記載の方法。
- フィーダー細胞を使用しない先行するいずれかの請求項に記載の方法。
- GSK3阻害剤及び/またはホスホジエステラーゼ阻害剤、及び(i)骨形成タンパク質4(BMP4)、(ii)管内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iii)Wnt3A、(iv)アクチビンA、(v)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(vi)幹細胞因子(SCF)、(vii)β−エストラジオール、(viii)インスリン様成長因子2(IGF2)、(ix)トロンボポエチン(TPO)、(x)ヘパリン、(xi)ヒドロコルチゾン、(xii)Flt3リガンド、(xiii)インターロイキン3(IL3)、(xiv)IL11、(xv)エリスロポエチン(EPO)、(xvi)インスリン成長因子1(IGF1)、(xvii)StemRegenin1(SR1)及び(xvii)プルリポチン(SC1)からなる群から選択される1以上の補助的化合物を含む、幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する細胞培養培地。
- (i)GSK3阻害剤、(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iv)Wnt3A、(v)アクチビンA、(vi)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(vii)幹細胞因子(SCF)、及び(viii)β−エストラジオールを含む請求項12に記載の細胞培養培地。
- (i)ホスホジエステラーゼ阻害剤、(ii)骨形成タンパク質4(BMP4)、(iii)内皮(細胞)増殖因子165(VEGF)、(iv)線維芽細胞増殖因子α(FGFα)、(v)幹細胞因子(SCF)、(vi)インスリン様成長因子2(IGF2)、(vii)トロンボポエチン(TPO)、(viii)ヘパリン、及び(ix)β−エストラジオールを含む請求項12に記載の細胞培養培地。
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