JP2015519874A - 4−オキソ−2−ペンテン酸及び消化管の健康 - Google Patents
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Abstract
本発明は、健康上の利益を伴う組成物に一般に関する。特に、本発明は、消化管の炎症性障害、例えば回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患の分野に関する。本発明の主題は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物である。【選択図】なし
Description
[説明]
本発明は一般に、健康上の利益を有する組成物に関する。詳細には、本発明は、消化管の炎症性障害、例えば回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患の分野に関する。本発明の主題は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物である。
本発明は一般に、健康上の利益を有する組成物に関する。詳細には、本発明は、消化管の炎症性障害、例えば回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患の分野に関する。本発明の主題は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物である。
消化管の炎症性障害は、短期的な病気又はずっと続く不快感から一生つきあう主な身体障害及び死亡まで、幅広い範囲の結果をもたらし得る。長期的に反復する胃腸炎は、患者の生活の質に影響するだけでなく、腸管の線維症及び癌腫の危険性をも増大させる。炎症性腸疾患の発生は世界中の発展途上国で増えており、世界中で現在約5百万人が冒されている。
消化管の炎症性障害の現在の処置は、5つの主な部類の薬物:非特異的抗炎症性薬物、例えば、5−アミノサリチル酸若しくはグルココルチコイド;代謝抵抗物質、例えば、アザチオプリン若しくは6−メルカプトプリン;モノクローナル抗体、例えば、インフリキシマブ;又は抗生物質の使用に基づいている。しかしながら、状況によっては、これらの薬物は副作用を示すことがあり、そのため、従来技術で説明した薬物の欠点を有さず消化管の炎症性障害を処置又は予防する更なる組成物を利用できるようにすることが望ましいであろう。特に、天然源から有効成分を得られる有効な組成物を見出すことは、非常に望ましいであろう。
結果として、現況技術を改善すること、特に、消化管の炎症性障害を処置又は予防するために使用することができる代替的組成物を提供することが本発明の目的であった。
本発明者らは、本発明の目的が独立請求項の主題により達成され得ることを見出して驚いた。従属請求項は、本発明の着想をさらに発展させている。
したがって、本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物を提供する。組成物は、医薬として使用することができない。
本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防のための組成物の調製への4−オキソ−2−ペンテン酸の使用も提供する。
本発明の範囲内の「処置」は、低減、阻害、緩和又は回復を指す。
nuclear factor(erythroid−derived 2)−like 2はNrf2とも呼ばれ、炎症の重要な調節剤である(C.L.L.Sawら、Expert Opinion on Therapeutic Targets、15、281〜295(2011))。Nrf2はサイトゾルに存在し、阻害剤Keap1に結合している。Keap1に結合しているとき、Nrf2はまた、プロテアソーム、したがってその低い基礎濃度により迅速に分解される。ストレス要因(例えば一酸化窒素、成長因子又は重金属)による活性化の際、Nrf2はKeap1から放出される。Nrf2濃度が増大し、Nrf2は核の中に転座する。次いでNrf2は、多数の抗酸化剤酵素をコードする遺伝子のプロモーター領域に存在する、抗酸化剤応答配列(ARE)に結合する(Kensler TWら、Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007年、47:89〜116)。最近の研究は、Nrf2−ARE信号伝達が胃炎及び大腸炎等の炎症随伴病理発生を弱めるのに関与していることを実証した。おそらくは、Nrf2により標的とされる遺伝子の細胞保護機能は、炎症誘発性遺伝子の誘導を抑制することができる(J.Kimら、Mutation Research−Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis、690、12〜23(2010年))。
いくつかの化合物によるNrf2の活性化が説明されてきた。クルクミン(米国特許出願公開第2009/0042980号)、レスベラトロール(Chen CYら、Biochem Biophys Res Commun 2005年6月17日、331(4):993〜1000)、スルフォラファン(F.Elbarbryら、Journal of Medical Plants Research、5、473〜484、(2011年))及びクェルセチン(Tanigawa Sら、Free Radic Biol Med 2007年6月1日、42(11):1690〜703)等のポリフェノールは、Nrf2を活性化することが報告された。本発明者らは、4−オキソ−2−ペンテン酸もNrf2を活性化することを見出して驚いた。クルクミン、レスベラトロール、スルフォラファン及びクェルセチンの非常に低い水溶解度は、それらの生物学的利用能に影響を及ぼす。4−オキソ−2−ペンテン酸は、逆に、良好な水溶解度を有する。
転写因子核内因子κB(NF−κB)の活性化は、大腸炎及び炎症性腸疾患を含む多くの炎症性状態に関与する。(M.Pasparakis、Mucosal Immunology、1、S54〜S57(2008))。NF−κBは、Relタンパク質のホモ二量体及びヘテロ二量体から成る。優勢なトランス活性化形態のNF−κBは、p65及びp50ヘテロ二量体から成る。NF−κBの活性化は、リン酸化、及び後続する特異的IκBキナーゼによる抑制性タンパク質IκBのタンパク質分解を伴う。遊離したNF−κBは核に入り込み、炎症に関与する数多の遺伝子のプロモーター領域のκB部位に結合する。
グルココルチコイド(Adcockら、American Journal of Physiology−Cell Physiology、268、C331〜C338(1995年))等、NF−κBの阻害剤が同定されてきたが、グルココルチコイドは、全身的に与えられた場合にエンドクリン及び代謝性副作用をもたらす。ヘパリンもNF−κBを阻害することが報告されたが(国際公開第200119376号パンフレット)、ヘパリン誘導血小板減少症を引き起こす、潜在的な副作用を有する。
本発明者らは、4−オキソ−2−ペンテン酸がNF−κB活性化を阻害するかを調査した。ヒト結腸細胞及びヒト単球/マクロファージを用いたとき、本発明者らは、4−オキソ−2−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス(LPS及びrhTNF−α)下でNF−κB活性化を阻害することを見出した。
本発明者らは、4−オキソ−2−ペンテン酸を天然源、例えばいくつかの熱処理された細菌菌株から得ることができることを見出して驚いた。例えば、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ(Bifidobacterium breve)CNCM I−3865及びビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)の細菌調製物は両方とも、6時間90℃で加熱されたときに4−オキソ−2−ペンテン酸を産生した。4−オキソ−2−ペンテン酸は、熱処理された細菌調製物を遠心分離及びろ過した後、可溶性画分の中にあることが見出された。
ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865を、COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)、INSTITUT PASTEUR、25 rue du Docteur Roux、F−75724 PARIS Cedex 15、France、2007年11月15日によって沈着した。
ビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)は、例えば、American type Culture Collection(ATCC)、Manassas、Virginia、USAから商標ATCC15700の下で購入することができる。
結果として、本発明は、回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない組成物に部分的に関する。医薬は、薬局で調製又は調剤されて医療処置に使用される、薬物又は薬剤である(<URL:www.thefreedictionary.com/pharmaceutical/>[2012年7月17日に検索済み])。本発明は、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む食品組成物であってよい。消化管は、反芻動物の口、咽喉、食道、前胃(細網、第一胃、葉胃)、すべての種のしわ胃、小腸、大腸、並びに、それらを有するヒト等の種の直腸及び肛門を含む。
回腸炎及び大腸炎は、それぞれ回腸及び大腸の炎症である。咽頭炎は、咽喉又は咽頭の炎症である。
腸管壁浸漏症候群は、腸管透過性の増大とも呼ばれ、統合診療医(integrative doctor)の団体の中ではよく認識されており、一般的な診断である(B.Brom、South African Family Practice、52、314〜316(2010年))。この症候群を診断する医療関係者は、腸炎症が腸管内膜の細胞間の接合部を拡張すると説明している。増大した透過性は、食品と正常な腸管内菌叢の成分とへの古典的過敏症応答を刺激する。細菌内毒素、細胞壁ポリマー及び食物グルテンは、炎症性経路の「非特異的」活性化を引き起こし得る(L.Galland、(1995)、2011年10月26日視察済み、http://www.mdheal.org/leakygut.htm)。微熱、一過性消化管痛及び栄養素吸収能力の喪失感は、別法で診断されていない患者において報告されたいくつかの症状である。
過敏性腸症候群は、検出可能な器質的原因が全く存在しない慢性腹痛、不快感、膨張症及び排便習慣の変調を特徴とする、機能性腸障害である。研究は、過敏性腸症候群患者の粘膜炎症、及び腸内感染との疾患相関を説明した(G.Barbaraら、Gut、51(SUPPL.1)、i41〜i44(2002年))。
炎症性腸疾患は、慢性及び周期性炎症と特徴とする、胃腸疾患の群である。炎症性腸疾患の主要な形態は、クローン病及び潰瘍性大腸炎であるが、その他の形態の炎症性腸疾患には、膠原性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病及び不確定の大腸炎が挙げられる。したがって、世界中でのこのような障害の規模及び重症度により、回腸炎、大腸炎、直腸炎症、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群及び/又は炎症性腸疾患等の消化管の炎症性障害を処置又は予防するための組成物を提供するのに有利である。
本発明では、4−オキソ−2−ペンテン酸を得ることができ、例えば天然源から得ることができる。多数の人々が、化学原料から工業的に合成される材料の安全性について懸念しており、これらの材料が摂取されることになる場合はとりわけであり、天然源から得られた材料を好んでいる。
驚くべきことに、本発明者らは、いくつかの系統の細菌が4−オキソ−2−ペンテン酸の天然源をもたらすことを見出した。特に、本発明者らは、4−オキソ−2−ペンテン酸をビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865又はビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)(ビフィドバクテリウム・ブレヴェの基準系統)から得ることができることを見出した。大量の4−オキソ−2−ペンテン酸の生成が生物反応器を用いて実現可能であるとき、4−オキソ−2−ペンテン酸の供給源として細菌を使用することは、特に有利である。したがって、本発明では、4−オキソ−2−ペンテン酸が入手可能になり得、例えばビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865又はビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)から得られる。
細菌は、商業的な生成プロセスにより約60〜180℃、好ましくは約80〜160℃、例えば約110〜150℃で熱処理することができる。本発明者らは、これらの温度での熱処理が、許容される時間内で満足な収率の4−オキソ−2−ペンテン酸をもたらしたことを見出した。理論に拘束されることを望むわけではないが、熱処理の温度を増大させると、4−オキソ−2−ペンテン酸の形成の速度が増大するが、分解の速度も増大すると理解されている。したがって、これらの温度は、4−オキソ−2−ペンテン酸の形成の速度と分解との間に良好なバランスを与える。
4−オキソ−2−ペンテン酸を含む一般的な組成物は、少なくとも1mg/組成物1kgの量で4−オキソ−2−ペンテン酸を含み得る。一般に、組成物が少なくとも10mg/組成物1kgの量で、例えば組成物1kg当たり50mg〜50gの量で4−オキソ−2−ペンテン酸を含むならば好ましい。
投与しようとする4−オキソ−2−ペンテン酸の最適量は、熟練技術者ならば容易に決定することができる。
治療用途では、組成物は、障害及び/又はその合併症の症状を少なくとも部分的に治癒又は停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」と規定されている。この目的に有効な量は、障害の重症度並びに患者の重量及び全身状態等、当業者に知られたいくつかの因子に依存する。予防用途では、本発明による組成物は、障害を進行させる危険性を少なくとも部分的に低減するのに十分な量で、特定の障害の危険性に影響されやすい又は危険性がある患者に投与される。このような量は、「予防有効用量」であると規定されている。さらに、正確な量は、患者の健康状態及び重量等のいくつかの患者特異的因子に依存する。
4−オキソ−2−ペンテン酸は、本発明の枠組みにおいて、治療有効用量及び/又は予防有効用量で投与することができる。本発明の組成物は、体重1kg当たり2μg〜20mgの4−オキソ−2−ペンテン酸、好ましくは体重1kg当たり20μg〜2mgの4−オキソ−2−ペンテン酸、例えば体重1kg当たり40μg〜1mgの4−オキソ−2−ペンテン酸に対応する一日量で投与することができる。
消化管の炎症性障害は、動物並びにヒトに影響を及ぼす。炎症性腸疾患は、イヌの慢性嘔吐及び下痢の最も一般的な原因である。(E.de Papp、「Inflammatory Bowel Disease in dogs」、2011年10月26日に視察済み、http://www.petplace.com)。慢性下痢の病歴があるイヌの約3分の1は大腸炎を有するとも見積もられている。(the Merck Veterinary Manual、第9版)。ウマの慢性下痢は、腸に関係する炎症性状態により引き起こされ得る。ウマの結腸及び盲腸の大きな体積のため、大量の流体喪失が短時間で起きることがある。したがって、成体ウマの下痢は、その他の動物及びヒトの下痢性疾患に伴うものを超える罹患率及び死亡率を有する、爆発的事象であり得る(The Merck Veterinary Manual、第9版)。したがって、ヒト又は動物に投与される消化管の炎症性障害の処置又は予防のための組成物を提供することは利点である。伴侶動物の場合、このような療法は、動物の総合的な生活の質を改善し、所有者の満足を向上する。本発明は、ヒト、ペット又は家畜に投与される組成物を提供する。
4−オキソ−2−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、ストレスを感じている対象、特に成体に投与することができる。消化管炎症の症状はしばしばストレスによりトリガーされかつストレスは消化管への炎症性刺激の応答を増加させる可能性がある(S.M.Collins、American Journal of Physiology−Gastrointestinal and Liver Physiology、280、G315〜G318(2001年))ので、これは有利である。人々が加齢するにつれて、ストレスの多い出来事の後にくつろぐことがより困難になる。対象は、相対的に成熟した年齢ならば、成体だと考えられる。一般的に、対象は、性的に成熟しており繁殖できる場合、成体だと考えられる。
4−オキソ−2−ペンテン酸及び本発明で説明した組成物は、小児又は青年に投与することができる。「小児」という用語は、ここで、誕生から性成熟の初めの間(思春期)のものを指すが、「青年」は、思春期から成人期の間である。胃腸炎は、小児から青年の間で最も一般的な消化器障害である。約10億の発病が世界中で毎年、最も一般的には発展途上国の5歳未満の小児の間で起きている。クローン病を進行させる大抵の人々は、35歳までに進行させ、通常15歳〜25歳で進行させる。潰瘍性大腸炎はいかなる年齢でも始まり得るが、通常15歳〜30歳で始まる(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy−第19版)。したがって、小児又は青年に投与することができる、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための組成物をもたらすことは、有利である。
小児は、少なくとも5歳、少なくとも7歳、少なくとも10歳又は少なくとも12歳の人々であり得る。
青年は、少なくとも13歳又は少なくとも14歳の人々であり得る。
成人は、少なくとも16歳、少なくとも18歳又は少なくとも21歳の人々であり得る。
組成物の性質は特に限定されない。組成物は、経口投与又は経腸投与用の組成物であってよい。組成物は、例えば、食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成すべき粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択することができる。本発明の範囲内では、機能性食品という用語は、健康上の利益をもたらす、強化食品又は栄養補助食品のような食品を指す。
組成物は食品組成物であってよい。本発明による食品組成物は特徴が多様であり、例えば、牛乳、ヨーグルト、チーズ、発酵乳、牛乳を主体とする発酵製品、アイスクリーム、穀類を主体とする製品又は発酵した穀類を主体とする製品、牛乳を主体とする粉末、チルドした飲物又は常温保存可能な飲物、菓子類、動物飼料、特に飼育動物用の動物飼料である。
食品組成物は、タンパク質源、炭水化物源、脂質源、ミネラル源及び/又はビタミン源をさらに含んでいてもよい。タンパク質、炭水化物、脂質、ミネラル及び/又はビタミンの存在は、いくつかの利点を有することがある。これらの化合物は、最終製品の味及び口触りに一般に寄与する。これらの化合物は、身体が消化管障害に冒されたとき、緊急に必要になることがある栄養素を身体に供給することもする。これらの化合物は、完全栄養処方としての本発明の組成物の配合も可能にし、その結果、更なる栄養が必要にならない。
水溶性の化合物には、液剤として又はカプセル若しくは錠剤で経口投与することを含めて、いくつかの方法により好都合に投与されるという利点がある。4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物は、水を主体とすることができ、例えば組成物は、水に溶解した4−オキソ−2−ペンテン酸を含んでいてよい。
当業者ならば、明細書で開示されている本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることは理解されよう。特に、本発明の異なる実施形態について説明した特徴は、組み合わせることができる。本発明の更なる利点及び特徴は、下記の図及び非限定的な例から明らかである。
実施例1:4−オキソ−2−ペンテン酸及び細菌画分によるNrf2活性化
Nrf2レポーターアッセイ
Nrf2の活性化を、Nrf2レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイは、AREの制御下のルシフェラーゼ遺伝子構築体を含む安定にトランスフェクションしたMCF7(乳腺癌)細胞株である、CRX biosciences(Dundee、Scotland)製のAREc32細胞株に基づいている。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として作用して蛍光を生成する酵素である。Tert−ブチルヒドロキノン(TBHQ)等の抗酸化性分子は、AREに結合しているNrf2の活性化によりルシフェラーゼ転写を誘導する。ルシフェラーゼ活性は、Promega(Madison、WI)製のルシフェラーゼキットを用いて測定する。ルシフェラーゼ活性は、Nrf2の活性化に比例する。
Nrf2レポーターアッセイ
Nrf2の活性化を、Nrf2レポーターアッセイを用いて測定した。このアッセイは、AREの制御下のルシフェラーゼ遺伝子構築体を含む安定にトランスフェクションしたMCF7(乳腺癌)細胞株である、CRX biosciences(Dundee、Scotland)製のAREc32細胞株に基づいている。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として作用して蛍光を生成する酵素である。Tert−ブチルヒドロキノン(TBHQ)等の抗酸化性分子は、AREに結合しているNrf2の活性化によりルシフェラーゼ転写を誘導する。ルシフェラーゼ活性は、Promega(Madison、WI)製のルシフェラーゼキットを用いて測定する。ルシフェラーゼ活性は、Nrf2の活性化に比例する。
細菌画分によるNrf2活性化
3つの細菌菌株を使用して、微生物:ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865(NCC2950)、ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3914(NCC466)及びビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)(NCC2791)によるNrf2の活性化を調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3914を、COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)、INSTITUT PASTEUR、25 rue du Docteur Roux、F−75724 PARIS Cedex 15、France、2008年2月5日によって沈着した。
3つの細菌菌株を使用して、微生物:ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865(NCC2950)、ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3914(NCC466)及びビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700(商標)(NCC2791)によるNrf2の活性化を調査した。ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3914を、COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)、INSTITUT PASTEUR、25 rue du Docteur Roux、F−75724 PARIS Cedex 15、France、2008年2月5日によって沈着した。
各系統において、0.05%システインを有する10mlのMRS寒天に20μlのグリセロールストックを播種し、嫌気性条件下37℃で一晩インキュベートして、前培養物を形成した。次いで更なる培養物を、10mlのMRSに0.05%システインを前培養物と一緒に播種することにより作製した(0.1において最終的OD600を調節した)。培養物を嫌気性条件下16時間37℃でインキュベートして、P2培養物を形成した。0.05%システインを有する200mlのMRSにP2培養物(0.1において最終的OD600を調節した)を播種し、ボトルを嫌気性条件下16時間37℃でインキュベートした。
OD600を測定し、培養物を3300gにおいて10分遠心分離し、細菌ペレットを冷たい1× PBS(リン酸緩衝食塩水)で2回洗浄して、1× PBSによってOD50に正規化した。
各細菌菌株について2つの方法により細菌画分:「粗調製物」及び「純粋調製物」を得た。
細菌「粗調製物」を次のようにして得た。5mlのOD50細菌調製物を、加熱ブロック(Techne、Staffordshire、United Kingdom製のDri−Block DB−3加熱ブロック)中で、6時間90℃で加熱した。加熱した細菌調製物を、3300gにおいて10分+4℃で遠心分離し、上澄みを、0.22μmシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで+4℃で貯蔵した。
細菌「純粋調製物」を次のようにして得た。5mlのOD50細菌調製物を、3300gにおいて10分+4℃で遠心分離し、細菌ペレットを、5mlの水によって再懸濁した。細菌細胞を、冷蔵室内でmini bead beat(MBB)装置を用いて粉砕した(最大速度における90秒の6サイクル、各サイクル間には10分の中断)。粉砕した細胞を、1時間3300gにおいて+4℃で遠心分離し、ペレットを、5mlの1× PBSによって再懸濁し、加熱ブロック中で、6時間90℃で加熱した。加熱した調製物を10分3300gにおいて+4℃で遠心分離した。上澄みを、0.22μmシリンジフィルターを用いてろ過し、更なる分析まで+4℃で貯蔵した。
「OD50懸濁液」の生存細菌数を、スポット法を用いた平板培養により測定し、乾燥重量を、下記の設定にしたハロゲン水分分析器(Metler−Toledo、Greifensee、Switzerland)を用いて測定した:乾燥温度160℃、段階乾燥は作動する。
Nrf2活性化を測定するために、試料は、10個の独立した希釈物(1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40及び1/50)を用いてAREc32細胞(96ウェルプレートに蒔いた)において試験し、5%CO2/空気インキュベーター中で、24時間37℃でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性及び細胞生存率(ATP測定)を、ルシフェラーゼ及びPromega製のCell Titer−Gloキットを用いて測定した。
各試行において、相対発光単位(RLU)により測定したすべてのウェルのルシフェラーゼ活性を、すべてのプレートの細胞のみのルシフェラーゼ活性の平均によって正規化した。とりわけ、正規化手順により試験された試料は、データに影響しないことが見出されており、この観察は、異なる試行において測定した試料の比較を可能にしている。
各試料において、Nrf2活性化を次のようにして計算した。
Nrf2誘導倍率は、選別目的に非常に有用である。しかしながら、Nrf2誘導倍率は、試料希釈物を考慮に入れていないため定性的測定のみである。
「試料当たりルシフェラーゼ含量」は、Nrf2活性化も反映するが、この計算が試料希釈物を考慮に入れているため、類似したNrf2誘導倍率でNrf2を活性化する2つの試料を区別することができる。試料当たりルシフェラーゼ含量は、Nrf2を活性化する分子の量を反映することにより、Nrf2活性化の半定量化を可能にする。
表A及び表Bに示したように、B.ブレヴェ ATCC15700(商標)とB.ブレヴェ CNCM I−3865の粗調製物は両方とも、最大Nrf2誘導(Nrf2 induction)は類似しているが、ルシフェラーゼ含量/試料値は異なる。試料当たりルシフェラーゼ含量値の差異は、それらの対応するNrf2活性化パターン(図1及び図2を参照されたい)を反映している。
ビフィドバクテリウム・ブレヴェとは著しく異なり、CNCM I−3914は、Nrf2を顕著に活性化しておらず、比較表Cを参照されたい。
4−オキソ−2−ペンテン酸によるNrf2活性化
4−オキソ−2−ペンテン酸(Alfa Aesar−照合番号L02185)を、Nrf2レポーターアッセイにより試験した。異なる用量の4−オキソ−2−ペンテン酸を、24時間かけてAREc32細胞に施用し、次いでルシフェラーゼ活性を上述したようにして定量化した。細胞生存率も、細胞Titer−Gloキット(ATP定量化)を用いて測定した。
4−オキソ−2−ペンテン酸(Alfa Aesar−照合番号L02185)を、Nrf2レポーターアッセイにより試験した。異なる用量の4−オキソ−2−ペンテン酸を、24時間かけてAREc32細胞に施用し、次いでルシフェラーゼ活性を上述したようにして定量化した。細胞生存率も、細胞Titer−Gloキット(ATP定量化)を用いて測定した。
図3に示したように、4−オキソ−2−ペンテン酸分子は、用量に依存した方法でNrf2を強く活性化することが見出された。AREc32細胞の生存性は、70μM未満の用量の4−オキソ−2−ペンテン酸による影響を受けなかった。Nrf2活性化の最適な用量は、約40〜50μMであった。比較用に、図4は、ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865の細菌画分が類似した方法でNrf2を活性化することを示している。
実施例2:4−オキソ−2−ペンテン酸(抗炎症性効果)によるNF−κB活性化の阻害
本発明者らは、炎症誘発性ストレス(LPS及びrhTNF−α)下でNF−κB活性化を阻害する、4−オキソ−2−ペンテン酸の能力を見積もった。2つのインビトロ系:ヒト結腸細胞(HT−29クローン34)及びヒト単球/マクロファージ(THP−1青色細胞)を使用した。
本発明者らは、炎症誘発性ストレス(LPS及びrhTNF−α)下でNF−κB活性化を阻害する、4−オキソ−2−ペンテン酸の能力を見積もった。2つのインビトロ系:ヒト結腸細胞(HT−29クローン34)及びヒト単球/マクロファージ(THP−1青色細胞)を使用した。
HT−29クローン34
ヒト結腸腺癌腫HT−29クローン34細胞株(継代42〜50)は、NF−κB/SEAPレポータープラスミドを安定にトランスフェクションした、粘着細胞である。この粘着細胞を、1%の安定なL−グルタミンを含むDMEM高グルコース(4.5g/L)(Invitrogen)中で培養し、10%の熱不活性化した(1時間56℃)Foetal Calf Serum(FCS)(Bioconcept、Allschwil、Switzerland)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び500μg/mlのGeneticin(PAA、Pasching、Austria)を5%CO2/空気インキュベーター中で、37℃で追加した。培地は、細胞単層が約90%集密に到達するまで、2日毎に新しくした。細胞は、1× Trypsin/EDTA(Sigma)を用いて継代培養した。
ヒト結腸腺癌腫HT−29クローン34細胞株(継代42〜50)は、NF−κB/SEAPレポータープラスミドを安定にトランスフェクションした、粘着細胞である。この粘着細胞を、1%の安定なL−グルタミンを含むDMEM高グルコース(4.5g/L)(Invitrogen)中で培養し、10%の熱不活性化した(1時間56℃)Foetal Calf Serum(FCS)(Bioconcept、Allschwil、Switzerland)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び500μg/mlのGeneticin(PAA、Pasching、Austria)を5%CO2/空気インキュベーター中で、37℃で追加した。培地は、細胞単層が約90%集密に到達するまで、2日毎に新しくした。細胞は、1× Trypsin/EDTA(Sigma)を用いて継代培養した。
10000細胞/ウェルを、平底で縁無しの96ウェルプレート(Greiner Bio One、Kremsmuenster、Austria)中の200μlの培地に蒔いた。培養の3〜4日後(すなわち、細胞が約70〜80%集密に到達した後)、培地を除去し、用量範囲の4−オキソ−2−ペンテン酸(3〜400μM)を含む(又は含んでいない)180μlの実験媒体(LPS刺激のみのためのsCD14及びLPS結合タンパク質(LBP)の供給源として50mMのHEPES及び5%の人乳(HM)を追加したDMEM高グルコース)を細胞に加え、プレートを5%CO2/空気インキュベーター中で、4時間37℃で予備インキュベートした。LPS055:B5又はrhTNF−α(それぞれ最終100ng/ml及び10ng/ml)を含む(又は含んでいない)20μlの実験媒体を加え、プレートを5%CO2/空気インキュベーター中で、24時間37℃でインキュベートした。
次いで細胞培養上澄みを、Phosphalight(Applied Biosystems)及びIL−8シングルプレックス(Meso Scale、Gaithersburg、Maryland)キットをそれぞれ用いて、NF−κB活性の測定(分泌型アルカリホスファターゼ及びIL−8生成の測定)のために収集した。
細胞生存率を、Cell Titer−Gloキット(Promega)を用いてATPを測定することにより決定した。簡単に言うと、残留しているHT−29クローン34粘着細胞を、120μlのCell Titer−Glo試薬(1× PBS中に2回予備希釈済み)と一緒に、水平方向に振とうしながら(250rpm)10分室温でインキュベートし、発光を、ゲイン値を3500に設定してPolarstarマイクロプレートリーダー(BMG、Offenburg、Germany)を用いて1000ミリ秒測定した。
LPSが存在しないとき、NF−κB活性は、試験した用量の4−オキソ−2−ペンテン酸と一緒にインキュベートしたHT−29クローン34細胞の細胞培養上澄み中には観察されなかった(SEAP又はIL−8検出に基づいている)。
HT−29クローン34細胞の細胞生存率の測定は、約50μMより高い4−オキソ−2−ペンテン酸の用量における、細胞生存率の減少を示した(図5)。
炎症応答がLPSによりトリガーされる場合、4−オキソ−2−ペンテン酸は、用量に依存した方法でNF−κB活性を阻害する(図5)。4−オキソ−2−ペンテン酸は、SEAPとIL−8の分泌の両方に影響し、最良の阻害は、50μM 4−オキソ−2−ペンテン酸)の場合であった。類似した結果は、それほど顕著ではないが、rhTNF−αによって刺激した細胞にも観察された。
THP−1青色
ヒト単球/マクロファージTHP−1青色細胞(継代16〜20)(Invivogen、Toulouse、France)を、5%CO2/空気インキュベーター中で37℃において、10%の熱不活性化FCS(Bioconcept)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び500μg/mlのZeocin(Invivogen)を追加した、1mMのピルビン酸ナトリウム、2mMのL−グルタミン、4.5g/Lのグルコース及び10mMのHEPESを含む改変RPMI培地(ATCC、Manassas、VA)中で培養した。
ヒト単球/マクロファージTHP−1青色細胞(継代16〜20)(Invivogen、Toulouse、France)を、5%CO2/空気インキュベーター中で37℃において、10%の熱不活性化FCS(Bioconcept)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma)及び500μg/mlのZeocin(Invivogen)を追加した、1mMのピルビン酸ナトリウム、2mMのL−グルタミン、4.5g/Lのグルコース及び10mMのHEPESを含む改変RPMI培地(ATCC、Manassas、VA)中で培養した。
200000細胞/ウェルを、96ウェル平底透明プレート中の100μlの培地に蒔いた。5%CO2/空気インキュベーター中の37℃でのインキュベーションの24時間後、用量範囲の4−オキソ−2−ペンテン酸(5〜200μM)を含む(又は含んでいない)80μlの培地を細胞に加え、5時間37℃で予備インキュベートした。LPS055:B5(Sigma)(最終100ng/ml)を含む(又は含んでいない)20μlの培地を加え、プレートを5%CO2/空気インキュベーター中で、16時間37℃でインキュベートした。
細胞培養上澄みを、分泌型アルカリホスファターゼのレベルに比例するNF−κB活性測定のために、96ウェルプレートに慎重に移した。簡単に言うと、100μlの上澄みを、96ウェルプレート中で150μlのQuantiBlue(Invivogen)と混合し、37℃で3時間インキュベートしてから、Sunriseマイクロプレートリーダー(Tecan、Mannedorf、Switzerland)を用いて620nmでODを測定した。細胞生存率を、上述したようにしてCell Titer−Gloキットを用いて測定した。
LPSによって刺激したとき、強いNF−κB阻害が、約40〜75μMの用量の4−オキソ−2−ペンテン酸に応答して得られた。4−オキソ−2−ペンテン酸は、75μMより高い用量では細胞に有毒である(図6)。
HT−29クローン34細胞及びTHP−1青色細胞によって生じたデータは、4−オキソ−2−ペンテン酸が炎症誘発性ストレス下でNF−κB活性化を阻害することを指し示している。
実施例3:HPLC−MS/MSによる4−オキソ−2−ペンテン酸の定量化
4−オキソ−2−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(HPLC−ESI−MS/MS)と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
4−オキソ−2−ペンテン酸を定量化するために、高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法(HPLC−ESI−MS/MS)と結びつけるものである、高い処理能力の分析法を開発した。
4−オキソ−2−ペンテン酸標準物質は、Alfa Aesar(Ward Hill、USA)から購入した。4−オキソ−2−ペンテン酸は、少なくとも20mg/mlまで水に可溶であることが見出された。4−オキソ−2−ペンテン酸標準物質化合物を水に可溶化して10mg/mlの最終的なストック溶液にし、水にさらに希釈して校正曲線を作成した。
HPLC−ESI−MS/MS分析を、3200Q TRAP質量分析計(Applied Biosystems)に連結した乱流クロマトグラフィー(TFC)システム(Thermo Fisher、Waltham、MA)により実施した。使用した分析カラムは、室温において600μl/分の一定の流量で運転する、Thermo Fisher(Waltham、MA)から購入したHypersil Gold AQ(3×50mm、5μm)であった。移動相は、0.05%酢酸を含む水である溶媒Aと、0.05%酢酸を含むメタノールである溶媒Bとによって構成されていた。グラジエントプログラムは、0分では0%Bで、40秒(0〜0.67分)間0%Bに保持し、180秒(0.67〜3.67分)で50%Bに増大させ、10秒(3.67〜3.83分)で50〜90%Bに増大させ、120秒(5.83分)間90%Bに保持し、0%Bに戻していく前に、さらに300秒(5.83〜10.83分)間保持するというものであった。注入体積は5μlであった。
MSデータ取得は、エレクトロスプレー陰イオン化モードにより実現した。MS調節は、溶媒A及び溶媒B(80/20のv:v、0.6ml/分)から構成されるHPLCフローと混合した4−オキソ−2−ペンテン酸標準物質の溶液(5μg/mlの水溶液)を、T型連結器を用いて10μl/分の流量で注入することにより実施した。窒素を、噴霧器及びカーテンガス(curtain gas)のために、それぞれ70psi、30psi及び20psiの圧力で使用した。界面加熱器(interface heater)を作動させてブロックソース温度を700℃に維持し、キャピラリー電圧を−4.5kVに設定した。窒素は、媒体圧力選択における衝突気体としても使用した。MS/MS検出を、選択した反応監視(SRM)取得モードを用いて実現した。2つの最も強烈なフラグメントイオンを、50msの一定の滞留時間(110msの合計走査時間)を用いて、m/z 113→69(11eVの衝突エネルギー)及びm/z 113→41(26eVの衝突エネルギー)を走査することにより選択した。脱クラスター化電圧を−29Vに設定した。定量的分析は、最も強烈なSRM信号を用いて実施したが、2回目の遷移は、標準溶液から計算した適当な面積比に基づいた分析物確認のために使用した。データ処理は、Analyst 1.5.1ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて実施した。
HPLC−MS/MSによるPBS及び水中の4−オキソ−2−ペンテン酸の検出
4−オキソ−2−ペンテン酸を1× PBS又は水に可溶化し、HPLC−MS/MSによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。m/z 113→69の遷移反応に伴うSRMは、1.25分の保持時間における遷移m/z 113→41に伴うSRMに比較して、より強烈な信号を明らかにした。両方のSRMに関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された(図7)。分子4−オキソ−2−ペンテン酸を、1× PBS(データは図示せず)と水の両方で検出することに成功した(図7)。
4−オキソ−2−ペンテン酸を1× PBS又は水に可溶化し、HPLC−MS/MSによる検出を、上記の部分で説明したようにして実施した。m/z 113→69の遷移反応に伴うSRMは、1.25分の保持時間における遷移m/z 113→41に伴うSRMに比較して、より強烈な信号を明らかにした。両方のSRMに関して類似した保持時間が、分析の妥当性を確認したときに観察された(図7)。分子4−オキソ−2−ペンテン酸を、1× PBS(データは図示せず)と水の両方で検出することに成功した(図7)。
4−オキソ−2−ペンテン酸標準曲線の確立
細菌画分中の4−オキソ−2−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、1× PBS又はHPLCグレード水等の簡便な媒体中の4−オキソ−2−ペンテン酸に関して確立した。商業的な4−オキソ−2−ペンテン酸を、異なる用量で1× PBS及び水に懸濁した。次いでHPLC−ESI−MS/MS法を使用して、見積もった用量の4−オキソ−2−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、4−オキソ−2−ペンテン酸(0.1〜25μg/ml)の量と、1× PBSとHPLCグレード水の両方で得られた強度(cpsで表している)との間に観察された。
細菌画分中の4−オキソ−2−ペンテン酸の量を正確に定量化するために、標準曲線を、1× PBS又はHPLCグレード水等の簡便な媒体中の4−オキソ−2−ペンテン酸に関して確立した。商業的な4−オキソ−2−ペンテン酸を、異なる用量で1× PBS及び水に懸濁した。次いでHPLC−ESI−MS/MS法を使用して、見積もった用量の4−オキソ−2−ペンテン酸を定量化した。良好な線形性が、4−オキソ−2−ペンテン酸(0.1〜25μg/ml)の量と、1× PBSとHPLCグレード水の両方で得られた強度(cpsで表している)との間に観察された。
細菌画分中の4−オキソ−2−ペンテン酸の定量化
4−オキソ−2−ペンテン酸を、実施例1の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、HPLC−ESI−MS/MS分析前にHPLCグレード水に希釈した(3希釈物/試料)。結果は表Eに要約している。
4−オキソ−2−ペンテン酸を、実施例1の熱処理した細菌調製物中で定量化した。すべての試料を、HPLC−ESI−MS/MS分析前にHPLCグレード水に希釈した(3希釈物/試料)。結果は表Eに要約している。
実施例4:ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865からの4−オキソ−2−ペンテン酸の生成への加熱温度及び時間の影響
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865からの4−オキソ−2−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のpH調整した条件下で、37℃の生物反応器中でMRS培地によって生成した。増殖培養(16時間)の後、培地を除去し、細胞を1× PBSで2回洗浄し、10%グリセロールを有する1× PBS中でOD134(1.5E+10cfu/ml)まで濃縮し、次いで50mlの一定分量にして−80℃で貯蔵した。
熱処理の際のビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865からの4−オキソ−2−ペンテン酸の生成を特性決定するために、様々な温度を用いて速度実験を実施した。この実験に使用したバイオマスの「マスターストック」は、嫌気性のpH調整した条件下で、37℃の生物反応器中でMRS培地によって生成した。増殖培養(16時間)の後、培地を除去し、細胞を1× PBSで2回洗浄し、10%グリセロールを有する1× PBS中でOD134(1.5E+10cfu/ml)まで濃縮し、次いで50mlの一定分量にして−80℃で貯蔵した。
次いでビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865の「実用バイオマス(working biomass)」を、次のようにしてバイオマスマスターストックから調製した。バイオマスを1× PBSで2回洗浄し、1× PBS中でOD40に調節した。
昇温装置(temperature heating apparatus)(THA)を使用して、異なる加熱時間及び温度の効果を調査した。このシステムは、生成環境中に見出される一般的な装置の小型版である。蒸気を使用して、バイオマスのカートリッジを含む保持管を加熱する。90℃、120℃及び140℃の試料温度を、最大60分の期間をかけて施用した。次いで、熱処理した5mlの各バイオマスを10分5000gで遠心分離し、上澄みをろ過し(0.2μm)、4−オキソ−2−ペンテン酸含量をHPLC−ESI−MS/MSにより定量化した。生じた4−オキソ−2−ペンテン酸の量は、図8に示している。
Claims (11)
- 回腸炎、大腸炎、咽頭炎、腸管壁浸漏症候群、過敏性腸症候群、直腸炎症、炎症性腸疾患及びこれらの組合せから成る群より選択される、消化管の炎症性障害の処置又は予防に使用するための4−オキソ−2−ペンテン酸を含む組成物であって、医薬として使用されない、組成物。
- 4−オキソ−2−ペンテン酸が天然源から得られた、請求項1に記載の使用のための組成物。
- 4−オキソ−2−ペンテン酸が、ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865又はビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700から得ることができる、請求項1又は2に記載の使用のための組成物。
- ビフィドバクテリウム・ブレヴェCNCM I−3865又はビフィドバクテリウム・ブレヴェATCC15700が、約60〜180℃、好ましくは約80〜160℃で熱処理されたものである、請求項3に記載の使用のための組成物。
- 組成物1kg当たり少なくとも1mg、好ましくは組成物1kg当たり少なくとも10mg、例えば組成物1kg当たり50mg〜50gの量で4−オキソ−2−ペンテン酸を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 体重1kg当たり2μg〜20mgの4−オキソ−2−ペンテン酸、好ましくは体重1kg当たり20μg〜2mgの4−オキソ−2−ペンテン酸、例えば体重1kg当たり40μg〜1mgの4−オキソ−2−ペンテン酸に相当する一日量で投与される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 経口投与又は経腸投与される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- ヒト、ペット又は家畜に投与される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- ストレスを感じている対象、特に成体に投与される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 小児又は青年に投与される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 食品組成物、食品添加剤、機能性食品、飲料、栄養製剤、経管製剤、牛乳又は水中で再構成される粉末状組成物、及びペット食品組成物から成る群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
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