JP2015514058A - 放出制御が可能な薬物伝達複合体、及びその利用 - Google Patents

放出制御が可能な薬物伝達複合体、及びその利用 Download PDF

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Abstract

本発明はシクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ポリ（無水マレイン酸）（Ｐｏｌｙ（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ））、及び疎水性薬物が結合された、疎水性薬物伝達複合体及びこれを有効成分として含む薬学的組成物に関するもので、本発明による疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）、及び疎水性薬物の物理的／化学的結合及び／または組成を調節することにより、疎水性薬物の放出及び伝達速度を効果的に制御できるだけでなく、疎水性薬物の溶解度を顕著に増加させて薬物の効能を増加させることができる。また、疎水性薬物の種類を多様に変更させることができるだけでなく複合体の表面に標的指向性を有するペプチドを自由自在に導入できるので、がんの治療のみならず多様な疾病の治療に応用できる。

Description

本発明は放出制御が可能な薬物伝達複合体及びこれを含む薬学的組成物に関するものである。
腫瘍（Ｔｕｍｏｒ）は非正常的な細胞の過剰により発生する非正常的で、非制御的であり、無秩序な細胞増殖の産物であり、このような腫瘍が破壊的な増殖性、浸潤及び転移性を持つようになれば悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）に分類されるようになる。特に、分子生物学的な観点で見れば、遺伝子の変異により発生する遺伝的な疾患ということができる。それぞれの腫瘍は正常細胞には存在しない突然変異遺伝子を平均的に５０ないし８０個保有していることが知られている。また、がんの発生率は高齢化社会ができるほど増加される。変異された遺伝子が蓄積されて老化された細胞ががん細胞に変異される確率が高いためである。国内でも１９９９年新規のがん患者は１０万人だったが、２００８年には１８万人以上に増加した（２０１０年保健福祉部の発表）。従って、効果的な抗がん剤を開発するための多様な研究が活発に進められている。
代表的な抗がん剤として、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）製剤がある。パクリタキセルはタイヘイヨウイチイ（ｐａｃｉｆｉｃ ｙｅｗ）の皮から分離された以降、広く利用されている代表的な天然薬物であって、細胞に流入すれば細胞分裂過程で正常的な微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の成長を促進して、細胞をＧ２−Ｍ ｐｈａｓｅに留まるようにして細胞分裂を抑制して、最終的には細胞の死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するものと知られている。また、多様ながんに作用し、乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がんなどの多様ながんの治療剤で利用されている。しかし、パクリタキセルは疎水性薬物で、水溶液上で低い溶解度、つまり難溶性により応用が制限的なので、パクリタキセルの可溶化のために有機溶媒であるクレモホールｅｌ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）などを使用するが、有機溶媒の使用による副作用により限界を有している。
これに関連して、従来パクリタキセルの溶解度を増加させるための溶媒には、クレモホールｅｌ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ ＥＬ）が使用された。クレモホールｅｌはｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌであって、パクリタキセルが水に溶解できることを助けるが、激しい過敏性類似反応（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、過敏反応、高脂血症、非正常リポタンパク質形態形成、赤血球凝集、非可逆的な感覚性神経病症などの副作用を起こす可能性があり（Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，Ｈ．，Ｖｅｒｗｅｉｊ，Ｊ．，Ｎｏｏｔｅｒ， Ｋ．，ａｎｄ Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍ，Ａ．（２００１）Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ： ｔｈｅ ｄｒａｗｂａｃｋｓ ａｎｄ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｖｅｈｉｃｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３７，１５９０−１５９８．，Ｗｅｉｓｓ， Ｒ． Ｂ．， Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ， Ｒ． Ｃ．， Ｗｉｅｒｎｉｋ， Ｐ． Ｈ．，Ｏｈｎｕｍａ，Ｔ．Ｇｒａｌｌａ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒｕｍｐ，Ｄ．Ｌ．，ＢａｋｅｒＪｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｖａｎ Ｅｃｈｏ，Ｄ．Ａ．，Ｖｏｎ Ｈｏｆｆ，Ｄ．Ｄ．ａｎｄ Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．（１９９０）Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔａｘｏｌ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．，８，１２６３−１２６８．，Ｌｏｒｅｎｚ， Ｗ．，Ｒｉｅｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓｃｈｍａｌ， Ａ． （１９９７）Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｄｏｇｓ ｂｙ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ： ｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅ ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ． Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ７， ６３−６７）、パクリタキセル製剤の新しい溶解度増加方法が開発される必要性がある。
このようにパクリタキセルのような疎水性薬物を利用してがんを効果的に治療するためには、溶媒による各種副作用が随伴されなく、がん細胞標的指向性を持ちながら、疎水性薬物の溶解度を増加させることができる薬物伝達体の開発が要求されることが実状である。
本発明は前記のような従来の技術上の問題点を解決するために案出されたもので、疎水性薬物の溶解度を向上させるために、生体適合性高分子であるシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）、及び疎水性薬物を結合させた薬物伝達複合体、及びこれを有効成分として含む薬学的組成物を提供することをその目的とする。
しかし、本発明が成し遂げようとする技術的な課題は以上で言及した課題に制限されなく、言及されていない他の課題は以下の記載から同業者に明確に理解されるだろう。
本発明はシクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ポリ（無水マレイン酸）（Ｐｏｌｙ（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ））、及び疎水性薬物が結合された疎水性薬物伝達複合体を提供する。
本発明の一具現例で、前記疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン及びポリ（無水マレイン酸）がエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）により結合されたことを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記疎水性薬物伝達複合体は疎水性薬物及びポリ（無水マレイン酸）がエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）により結合されたことを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン内に疎水性薬物が内包（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）されていることを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記疎水性薬物伝達複合体はナノサイズの粒子の形態であることを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記疎水性薬物伝達複合体はがん細胞標的指向性を持つペプチドを結合させたことを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記ペプチドはＮ−末端にシステインが導入されたペプチドであることを特徴とする。
本発明の別の具現例に、前記疎水性薬物はパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）であることを特徴とする。
また、本発明は、前記疎水性薬物伝達複合体を有効成分として含むがん治療用の薬学的組成物を提供する。
本発明の一具現例に、前記がんは乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、及び大腸がんよりなる群から選択されることを特徴とする。
本発明の疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）、及び疎水性薬物の物理的／化学的結合及び／または組成を調節することで、疎水性薬物の放出及び伝達速度を効果的に制御できるだけでなく、疎水性薬物の溶解度を顕著に増加させて薬物の効能を増加させることができる。また、疎水性薬物の種類を多様に変更させることができるだけでなく複合体の表面に標的指向性を持つペプチドを自由自在に導入できるので、がんの治療のみならず多様な疾病の治療に応用できる源泉技術として期待される。
図１は薬物伝達複合体の概念を簡略に表わす模式図である。 図２は薬物伝達複合体の製造方法を簡略に表わす模式図である。 図３は薬物伝達複合体の構造を簡略に表わす模式図である。 図４は薬物伝達重合体を１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで観察した結果を表わす図面である。 図５は薬物伝達重合体を１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで観察した結果を表わす図面である。 図６は薬物伝達複合体をＤＬＳで確認した結果を表わす図面である。 図７は薬物伝達複合体をｆｒｅｅシクロデキストリンによる崩壊現象を確認した結果を表わす図面である。 図８はパクリタキセルの溶解度を測定した結果を表わした図面である。 図９は薬物伝達複合体のパクリタキセルの放出能を確認した結果を表わす図面である。 図１０は薬物伝達複合体の抗がん効果を、子宮頸がん細胞を利用して確認した結果を表わす図面である。 図１１は薬物伝達複合体の抗がん効果を、肺がん細胞を利用して確認した結果を表わす図面である。 図１２は薬物伝達複合体の抗がん効果を、乳がん細胞を利用して確認した結果を表わす図面である。 図１３は薬物伝達複合体の抗がん効果を、大腸がん細胞を利用して確認した結果を表わす図面である。 図１４は薬物伝達複合体にがん標的指向性を持つペプチドの結合方法を簡略に表わす模式図である。 図１５はｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１複合体の合成を表わした模式図と１Ｈ−ＮＭＲ結果を表わす図面である。 図１６はＡＰ−１ペプチドをコンジュゲーション反応させながら、放出される２−ｐｙｄｉｄｉｎｅｔｈｉｏｎｅの吸光度を３７０ｎｍで観察して、ＡＰ−１の反応程度をモニタリングした結果を表わす図面である。
本発明者はがん細胞標的指向性を持ち、疎水性薬物の溶解度を増加させることができる薬物伝達体について研究した結果、本発明を完成するようになった。
本発明はシクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＣＤ）、ポリ（無水マレイン酸）及び疎水性薬物を結合させた薬物伝達複合体を提供する。
本発明者は細胞に毒性を誘発しない薬物伝達体を開発しようとして、生体適合性高分子であるシクロデキストリン及び生体適合性分子であるポリ（無水マレイン酸）を利用した。ポリ（無水マレイン酸）（Ｐｏｌｙ（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ＰｏｌｙＭＡＬＥＩＣ）は無水マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）が別の単分子と一緒に重合された共重合体として、ポリ（無水マレイン酸）の無水物（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）グループはアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）またはヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）と反応性が優れるので、アミン基またはヒドロキシ基を官能基で持っている単分子を容易に高分子の主鎖に導入することができる。また、このような接合過程の中、無水物グループの環（ｒｉｎｇ）がカルボン酸基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）で転換されながら高分子の水溶液上での溶解度を増加させることができる。本発明ではこの特性を利用してポリ（無水マレイン酸）に疎水性薬物またはシクロデキストリンを分解が可能なエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄｉｎｇ）で結合させて重合体を製造した。ポリ（無水マレイン酸）に結合させることができる疎水性薬物の種類には制限がない。望ましくはパクリタキセルである。
一方、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）は６ないし８個の単糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）が円形で連結された分子として円錐形の構造を持っていて、そのサイズによりａ、ｂ、ｒで分類される。シクロデキストリンは単糖類で形成されているので毒性がなくて生体に安定的に使用できる。また、外部にＯＨグループに露出されていて親水性の性質を持っていて、内部は空いた空間で疎水性性質を持っていると知られている。このような疎水性を有する内部空間により疎水性の物質を担持できるだけでなく、疎水性薬物との相好作用により薬物の溶解度を増加させることができる。本発明ではこの特性を利用して疎水性薬物をシクロデキストリンの内部に内包させて包接体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成させてシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）、及び疎水性薬物が結合された薬物伝達複合体を製造した。このような複合体は局所的に二つの高分子の動きを制限して、これでジェルと類似な、または架橋結合された性質のナノゲル（ｎａｎｏｇｅｌ）形態を見せることができる。前記の複合体はシクロデキストリンの内部に内包できる疎水性薬物の種類には制限がない。望ましくはパクリタキセルなどである。
前記の内包により製造されたナノゲルの形態の薬物伝達複合体は複合体が分解されていない状態で疎水性薬物だけ解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）させることもできるし、エステル結合を分解させてシクロデキストリン−疎水性薬物重合体で放出することもできる。この際に、薬物放出挙動を制御する主要なｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒの中で包接体の結合−解離（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ） 定数を調節することにより、薬物放出を調節することができる。疎水性薬物がシクロデキストリンに強く結合されていれば薬物の放出速度を減少させることができて、これと反対に結合が弱いならば薬物の放出速度を増加させることができる。従って、本発明の薬物伝達複合体は剤形の組成変化を通じてポリ（無水マレイン酸）とシクロデキストリン及び／または疎水性薬物の間のエステル結合の加水分解速度と包接体の解離速度を調節して薬物の放出及び伝達速度を調節できる。
本発明の一実施例では本発明の薬物伝達複合体にペプチドを結合させることができることを確認した（実施例２−６）。これで、本発明の薬物伝達複合体にはＮ−末端にシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が導入されたがん細胞標的指向性を有するペプチドを結合させて製造できる。結合方法に関する概略的な模式図は図１４に表わした。前記のペプチドの種類には制限がない。望ましくはＩＬ−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）に結合することによって、乳がん細胞に特異的に結合するＡＰ−１ペプチド、前立腺がん細胞の中で前立腺特異的膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＰＳＭＡ）がない細胞（ＰＣ−３）に特異的に結合するＤＵＰ−１ペプチド、がん細胞に過発現されたｉｎｔｅｇｒｉｎに結合するＲＧＤペプチド、がん細胞の周辺の新生血管に存在するＣＤ１３レセプターに結合したＮＧＲペプチドなどである。
また、本発明の別の実施例では薬物伝達複合体が効果的に疎水性薬物であるパクリタキセルの溶解度を４倍以上増加させることを確認して、パクリタキセルのＩＣ５０の濃度をがんの種類により最小４倍から最大１５０倍まで濃度を低くすることができるということを確認した（実施例２参照）。
前記の結果から、本発明の薬物伝達複合体は含まれている疎水性薬物の溶解度を増加させて多様な疾病の治療に適用されることができることが期待される。これにより本発明は前記の薬物伝達複合体を有効量含む薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物は薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。前記の薬剤学的に許容可能な担体は生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル、及びイソプロピルミリステートなどを含むことができるし、これに限定されない。
本発明の別の側面は、薬物伝達複合体を有効成分として含む薬学的組成物の薬剤学的な有効量を個体に投与して疾病を治療する方法を提供する。本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要にする対象を意味して、より具体的には人間、または非人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬、及び牛などの哺乳類を意味する。また、本発明で「薬剤学的有効量」は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度などにより、その範囲を多様に調節できることは同業者に明白である。
本発明の薬学的組成物の望ましい投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路、及び期間により違うが、当業者により適切に選択できる。しかし、望ましくは、１日０．００１ないし１００ｍｇ／体重ｋｇで、より望ましくは０．０１ないし３０ｍｇ／体重ｋｇで投与する。投与は一日に一回投与できるし、数回に分けて投与することもできる。本発明の薬物伝達複合体は全体組成物の総重量に対して０．０００１ないし１０重量％、望ましくは０．００１ないし１重量％の量で存在できる。
本発明の薬学的組成物はマウス、ラット、家畜、人などの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与方法には制限がなく、例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜、または脳血管（ｉｎｔｒａ ｃｅｒｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射により投与できる。
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されるものだけであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．薬物伝達の複合体の製造方法
シクロデキストリンとポリ（無水マレイン酸）が結合された重合体を製造するために、７個の単糖類で構成されたｂ−シクロデキストリン（１ｇ）のＯＨグループをＬｉＨ（ｌｉｔｈｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）（７．０ｍｇ）で１２時間の間、活性化させた後（無水物Ｎ２条件、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（２０ｍＬ））、ポリ（無水マレイン酸）（ｐｏｌｙ（ＩＢ−ａｌｔ−ＭＡｎｈ））溶液（９０ｍｇ／１０ｍＬ ＤＭＦ）に添加して１２時間の間、反応させて、透析（ＭＷＣＯ ３，５００）を通じて精製して凍結乾燥してシクロデキストリンとポリ（無水マレイン酸）が結合されたｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ 重合体（ｐｏｌｙ（ＩＢ−ａｌｔ−Ｍａｎｈ）−ｇ−ＣＤｂ）を収得した。シクロデキストリンとポリ（無水マレイン酸）の結合比率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）はシクロデキストリンの量を調節（１ｇ、０．５ｇ）して多様に製造した。
パクリタキセルとポリ（無水マレイン酸）が結合された重合体を製造するために、パクリタキセル（３３．３ｍｇ）のＯＨグループをＬｉＨ（ｌｉｔｈｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ）（１ｍｇ）で１２時間の間活性化させた後（無水物Ｎ２条件、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（５ｍＬ））、ポリ（無水マレイン酸）（ｐｏｌｙ（ＭＶＥ−ａｌｔ−ＭＡｎｈ））溶液に添加して１２時間反応させて、透析（ＭＷＣＯ ３，５００）を通じて精製して、凍結乾燥してパクリタキセルとポリ（無水マレイン酸）が結合されたｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体（ｐｏｌｙ（ＭＶＥ−ａｌｔ−Ｍａｎｈ）−ｇ−ＰＴＸｄ）を収得した。パクリタキセルとポリ（無水マレイン酸）の結合比率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）はＰＴＸの量を調節（３３．３ｍｇ、８３．２ｍｇ）して多様に製造した。
前記の反応を図１に図示した。左側はｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤにＦｒｅｅ ＰＴＸを結合したものであり、右側はｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤにｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸを結合させた模式図である。
前記のｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ重合体及びｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体の分子量及び結合比率は表１に表わした。
ａ．ＣＤ ｏｒ ＰＴＸ／Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ
ｂ．ＣＤ ｏｒ ＰＴＸ／Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ １Ｈ−ＮＭＲ
ｃ．Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ
ｄ．（ｍｏｌｅｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｅｄ ＭＡｎｈ ｇｒｏｕｐｓ／ｍｏｌｅｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＭＡｎｈ ｇｒｏｕｐｓ ｐｅｒ ｏｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｈａｉｎ） × １００ （％）
ｅ．（ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＣＤ（ｏｒ ＰＴＸ）／ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ（ｏｒ ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ）） × １００ （％）
＊ ｐｏｌｙ（ＩＢ−ａｌｔ−ＭＡｎｈ）＝ 〜 ６Ｋ ； ｐｏｌｙ（ＭＶＥ−ａｌｔ−ＭＡｎｈ）＝ 〜 ８０Ｋ
薬物伝達複合体を製造するために、パクリタキセルまたはｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体をエタノールに溶解させてｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ重合体を蒸留水に溶解させた後、前記の二つの溶液をＣＤ：ＰＴＸのモル数比を１：１で混合して１２時間攪拌させて結合させた後に凍結乾燥してｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ＰＴＸ複合体（対照群）またはｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ＰＴＸ−ｘ−ｐｏｌｙ複合体（薬物伝達複合体）を収得した。そして、以後蒸留水に溶かして保管した。
前記の実験に関する概略的な模式図は図２及び図３に表して、製造された重合体及び複合体は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを利用して観察した。その結果は図４及び図５に表した。
実施例２．薬物伝達複合体の特性分析
２−１．薬物伝達複合体の大きさの測定
実施例１の方法で製造された薬物伝達複合体のサイズ及び表面電荷を測定するために、表面電荷測定機器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｚ）及びサイズ測定機器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）を利用して水溶液上での薬物伝達複合体の表面電荷及びそのサイズを測定した。その結果は表２に表した。
表２に表したように、ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ複合体（＃４）の平均直径は約５５ｎｍとして単独で存在するパクリタキセル（＃１）及びｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ重合体（＃５）に比べて小さい直径とサイズの分布を有することを確認して、効果的にナノ粒子が形成されたことを立証することができた。また、ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体の場合にも約１８３ｎｍの直径を有する高分子ミセルを形成することを確認した。これに反してｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ＰＴＸ複合体は平均直径が約４２０ｎｍであり、そのサイズの分布も非常に大きい結果を通じて低い溶解度により凝集現象を表したことが分かった。
前記の結果を通じて、ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ（＃４）薬物伝達複合体はパクリタキセル、シクロデキストリン、及びポリ（無水マレイン酸）が結合されているが、そのサイズが約５０ｎｍであって、その分布が狭いことを通じて安定的にナノ粒子を形成して結合されていることを確認した。
同一な試料をカーボングリッド（ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ）で乾燥させた後ＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で形態及びサイズを観察した。その結果は図６に表した。
図６に表したように、水溶液上で粒子のサイズを測定した前記の結果と同一にｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ＰＴＸ−ｘ−ｐｏｌｙ複合体（＃４）が一番小さなサイズを有していることが確認できた。また、ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ＰＴＸ複合体（＃２）、ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体（＃３）、及びｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：： ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ 複合体（＃４）試料で２００ｎｍ以下の球形粒子が観察された。前記の結果を通じて、薬物伝達複合体は２００ｎｍ程度の直径を有するナノ構造体であることを確認して、高い密度を有するナノ粒子であることが予想できた。
２−２．薬物伝達複合体の結合特性の確認
実施例１の方法で製造された薬物伝達複合体（＃４）がシクロデキストリンとパクリタキセルの間の特異的な構造により包接体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成したものであるかを確認するために、薬物伝達複合体（＃４）溶液にシクロデキストリンを添加した後、１、３、及び１２時間に粒子のサイズ及び数字をサイズ測定機器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）で測定した。その結果は図７に表した。
図７に表したように、シクロデキストリンを添加しない場合には複合体のサイズが時間を経ても変わらない反面、シクロデキストリンを添加した場合にはサイズがだんだん増加されるだけでなく分布が広くなることを確認した。前記の結果は添加したシクロデキストリンの交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）反応によりナノゲルの形態が崩壊されることを意味して、また複合体がシクロデキストリンの内にパクリタキセルが内包（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）されて生じる化合物であることを意味する。
２−３．パクリタキセルの溶解度の比較
パクリタキセル（ＰＴＸ）の溶解度を比較するために、実施例１の方法で製造された重合体及び複合体の濃度による透過度（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ）をｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ（ＵＶ）−ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＵＶ ２５５０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）で測定した。ＰＴＸの濃度を０ｕＭから１００ｕＭまで変化させながら、５００ｎｍでの吸光度を測定して透過度を計算した。その結果は図８に表した。
図８に表したように、パクリタキセル単独で存在する場合（＃１）よりｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体（＃３）、及びｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ複合体（＃４）でパクリタキセルの溶解度が４倍以上増加されたことを確認した。前記の結果を通じて本発明の薬物伝達複合体（＃４）はパクリタキセルの溶解度を増加させることができることを確認した。
２−４．パクリタキセルの放出の確認
パクリタキセルの放出を確認するために、実施例１の方法で製造された重合体及び複合体を透析膜（ＭＷＣＯ ３，５００）に入れて、これをｐＨ７．４及びｐＨ５．５のＰＢＳ緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、５０ｍＬ）が入っているバイアル（ｖｉａｌ）に入れて３７℃で５０時間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。一定時間の間隔で２５ｍＬの緩衝溶液を取って、新しい２５ｍＬの溶液を添加した。この時取った緩衝溶液を２ｍＬのＤＣＭで抽出して放出されたパクリタキセルを濃縮して、これを５００ｕＬのａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−ｗａｔｅｒ（５０：５０、ｖ／ｖ）に再び溶かした後ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ ｓｉｌｉｃａ ｃｏｌｕｍｎ（Ｘ−Ｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、２．５μｍ）；ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−ｗａｔｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｐｕｍｐｅｄ（ＬＣ−２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ １．０ｍＬ／ｍｉｎ）を利用してＰＴＸの濃度を分析した。
試料の２００μＬを注入したところ、カラム溶出液が２２７ｎｍで検出された（ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＰＤ−２０Ａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ））。この時、パクリタキセルのカリブレーションカーブ（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）は０．００２５ｍｇ／ｍＬないし０．０５ｍｇ／ｍＬで線形に表された。その結果は図９に表した。
図９に表したように、二つのｐＨですべて、ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ重合体（＃３）、及びｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：： ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ 複合体（＃４）で高い放出速度及び放出量を確認した。前記の結果を通じて、本発明の薬物伝達複合体はパクリタキセルを効果的に放出できることを確認した。
２−５．抗がん効果の測定
薬物伝達複合体の抗がん効果を測定するために、ＭＴＴ分析法を利用した。子宮頸がん細胞であるＨｅＬａ細胞株、肺がん細胞であるＡ５４９細胞株、乳がん細胞であるＭＣＦ−７細胞株、及び大腸がん細胞であるＨＣＴ−８細胞株を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たり５×１０３の細胞を入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２条件で２４時間培養した。その後、前記の細胞に実施例１の方法で製造された重合体及び複合体をそれぞれ処理して、３７℃、５％ ＣＯ２条件で４８時間培養した。その後に新しい培地にＭＴＴ溶液（２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を処理して細胞を４時間培養した。その後、ＤＭＳＯ（１５０μＬ）を処理して５７０ｎｍで吸光度を測定した。生存率は試料を処理していない細胞に対する活性を１００％にして相対的に算出した。その結果は図１０ないし図１３に表した。
図１０ないし図１３に表したように、薬物伝達複合体（＃４）がすべての細胞株で一番低い濃度のＩＣ５０（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０％）を表すことを確認して、最小４倍から最大１５０倍まで濃度を低くすることができることを確認した。
前記の結果を通じて、本発明の薬物伝達複合体はパクリタキセルの水溶液上での溶解度を低くするだけでなく、薬物伝達効率を増加させて効果的なパクリタキセル伝達システムとして使用できることを確認した。
２−６．ペプチドが導入されたｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１複合体の合成（スキーム）
ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１複合体は図１５Ａにより合成された。
［１］ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＰＤＥＡの合成
９ｍｇの２−（２−ｐｙｄｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ（ＰＤＥＡ）と１．９ｍｇのＦＣＲ−６７５Ａｍｉｎｅを２ｍＬのＤＭＦに溶かした後、１０ｕＬのＴＥＡで処理された１６０ｍｇのｐｏｌｙ（ＭＶＥ−ａｌｔ−ＭＡｎｈ）が溶かされた８ｍＬのＤＭＦ溶液に徐々に添加した後、１２時間反応させる。この溶液に５ｍｇのＬｉＨでａｃｔｉｖａｔｉｏｎされた３３．６ｍｇのＰＴＸを添加して１２時間さらに反応をさせる。その後、ＤＭＦを飛ばして、これを水に透析（ＭＷＣＯ ３，５００）して精製した後、凍結乾燥してｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＰＤＥＡを獲得した。１Ｈ−ＮＭＲを通じて各高分子の一つのチェーン当たり１６個のＰＴＸ、１個のＦＣＲ、１６個のＰＤＥＡがコンジュゲーションされたことを確認した（ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ１６／ＦＣＲ１／ＰＤＥＡ１８）（図１５ Ｂ−１、Ｂ−２）。
［２］ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１の合成
ここで、Ｎ−末端にＣｙｓが導入されたＡＰ−１ペプチドをコンジュゲーションする実験を遂行した。１３０ｍｇのｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ１６／ＦＣＲ１／ＰＤＥＡ１８を１５ｍＬのＤＭＳＯに溶かして、ここに１５ｍｇのＡＰ−１の溶液（５ｍＬ ＤＭＳＯ）を徐々に添加して２４時間反応させた。この時、反応が進行されることにより放出される２−ｐｙｄｉｄｉｎｅｔｈｉｏｎｅの吸光度を３７０ｎｍで観察して、ＡＰ−１の反応程度をモニタリングした（図１６）。その結果８個のＡＰ−１が高分子にコンジュゲーションされてｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ１６／ＦＣＲ１／ＡＰ−１８が合成されたことを確認した。反応後、これを水で透析（ＭＷＣＯ ３，５００）し、精製し、凍結乾燥して最終産物を青色の固体として得た。
［３］ｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴｘ／ＦＣＲ／ＡＰ−１の合成
２２．０ｍｇのＰｏｌｙ−ｘ−ＣＤ２０（ＭＷ ２９Ｋ）と１００ｍｇのｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１（ＭＷ １０５Ｋ）をそれぞれ５ｍＬの水に溶かした溶液を混合して１２時間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、凍結乾燥してｐｏｌｙ−ｘ−ＣＤ：：ｐｏｌｙ−ｘ−ＰＴＸ／ＦＣＲ／ＡＰ−１の複合体を合成した。
前記の結果を通じて、本発明の薬物伝達複合体はＮ−末端にシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が導入されたがん細胞標的指向性を有するペプチドを結合することができることを確認した。
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を持つ者は本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくて、他の具体的な形態に容易に変形できることを理解できるだろう。従って、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことと理解すべきである。
本発明の疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）、及び疎水性薬物の物理的／化学的結合及び／または組成を調節する方法で疎水性薬物の放出及び伝達速度を効果的に制御できるだけでなく、多様な疎水性薬物の溶解度を顕著に増加させて薬物の効能を増加させる効果がある。また、複合体の表面に標的指向性を有するペプチドを自由自在に導入できるので、標的抗がん治療だけでなく、多様な疾病の治療に利用できる。

Claims (10)

  1. シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、ポリ（無水マレイン酸）（Ｐｏｌｙ（ｍａｌｅｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ））、及び疎水性薬物が結合された、疎水性薬物伝達複合体。
  2. 前記疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン、ポリ（無水マレイン酸）がエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）により結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  3. 前記疎水性薬物伝達複合体は疎水性薬物及びポリ（無水マレイン酸）がエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）により結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  4. 前記疎水性薬物伝達複合体はシクロデキストリン内に疎水性薬物が内包（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）されていることを特徴とする、請求項１に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  5. 前記疎水性薬物伝達複合体はナノサイズの粒子の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  6. 前記疎水性薬物伝達複合体はがん細胞標的指向性を有するペプチドを結合させたことを特徴とする、請求項１に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  7. 前記ペプチドはＮ−末端にシステインが導入されたペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  8. 前記疎水性薬物はパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）であることを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれかの一つの項に記載の疎水性薬物伝達複合体。
  9. 請求項１ないし請求項７のいずれかの一つの項に記載の疎水性薬物伝達複合体を有効成分として含む、がん治療用の薬学的組成物。
  10. 前記がんは乳がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、及び大腸がんよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のがん治療用の薬学的組成物。
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