JP2015501802A - 眼への薬物送達を向上させるための方法および組成物、ならびに徐放性送達製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬物送達を向上させるための化合物およびその組成物を含む。眼に送達するための、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤（NSAID）、およびルボキシスタウリンのプロドラッグならびに二重プロドラッグ誘導体が提供される。これらの化合物および組成物は、後眼部に罹患する眼疾患を含む、様々な眼疾患を治療するのに有用である。また、本発明は、治療薬の徐放性放出のための粒子内粒子担体製剤に関する。

Description

＜国家により支援を受けた研究または開発についての言及＞
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって認められた許可番号EY018940による政府支援によって達成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。

＜技術分野＞
本発明は概して、薬物送達を向上させるための化合物およびその組成物に関し、より詳細には、後眼部への送達に適合する、コルチコステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤（NSAID）およびルボキシスタウリンのプロドラッグ誘導体に関する。さらに、本発明は、治療薬を徐放性放出させるための担体製剤に関する。

本発明は、網膜への送達および有効性を向上させた化合物、ならびに網膜眼疾患の治療へのその使用に関する。さらに、本発明は、所望の徐放性効果を提供しつつ治療薬の安定性を維持する不活性条件下で作製される、徐放性製剤に関する。

一態様において、本発明は、コルチコステロイドのプロドラッグに関する。１つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドは、１つ以上の末端親水性酸官能基を含むように修飾された、親油性コルチコステロイドである。１つの例示的な実施形態において、末端の親水性酸官能基は、ステロイド骨格の炭素番号２１におけるRに結合する。例示的な親水性官能基には、硫酸、リン酸、コハク酸、またはその塩が含まれるが、これらに限定されない。１つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドはブデソニドである。別の例示的な実施形態において、親水性酸官能基は硫酸基である。適切な硫酸基の塩の例は、トリエチルアンモニウム硫酸塩である。さらに別の例示的な実施形態において、親水性酸官能基はコハク酸である。

別の態様において、本発明は、NSAIDの単一プロドラッグおよび二重プロドラッグに関する。本発明のNSAIDは、１つ以上の多官能性の酸官能基を用いて塩基性または弱塩基性の末端官能基を遮蔽するように修飾することができる。例示的な多官能性の酸官能基には、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、およびコハク酸が含まれるが、これらに限定されない。１つの例示的な実施形態において、多官能性の酸官能基はコハク酸である。ある例示的な実施形態において、NSAIDは、タウリンを含むようにさらに修飾されてよい。タウリンは、多官能性の酸官能基に結合するか、あるいは親分子に直接結合し得る。１つの例示的な実施形態において、NSAIDはコキシブである。別の例示的な実施形態において、コキシブはセレコキシブである。

さらに別の態様において、本発明は、ルボキシスタウリンの単一プロドラッグおよび二重プロドラッグに関する。１つの例示的な実施形態において、プロドラッグは、スクシンアミド酸ルボキシスタウリン（ruboxistaurin succinamidic acid）である。ある例示的な実施形態において、ルボキシスタウリンは、タウリンを含むようにさらに修飾されてよい。

別の態様において、本発明は、上述のプロドラッグ化合物を用いる網膜眼疾患の治療方法に関する。本発明の組成物を用いて治療され得る眼疾患には、変性性眼疾患、血管性眼疾患、感染性眼疾患、および炎症性眼疾患が含まれる。１つの例示的な実施形態において、眼疾患は糖尿病性網膜症である。ある例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜送達用に製剤化される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与されるように製剤化される。

別の態様において、本発明は、粒子内粒子（particle-in-particle (PinP)）持続性放出組成物に関する。このPinP組成物は、外部粒子内に注入される内部粒子を含む。１つの例示的な実施形態において、この内部粒子は、超臨界流体（SCF、例えば超臨界二酸化炭素）への暴露の際に膨張しない材料から作製され、外部粒子は、SCFへの暴露の際に膨張する材料から作製される。治療薬は、内部粒子または外部粒子の表面に装填されてもよく、内部粒子または外部粒子の中に含まれてもよく、外部粒子の細孔内に含まれてもよく、あるいはこれらの組み合わせであってよい。１つの例示的な実施形態において、治療薬は、小分子系治療薬、核酸系治療薬、ウイルスベクター、またはペプチド系物質である。別の例示的な実施形態において、治療薬はペプチド系物質である。

図１は、本発明の例示的な実施形態に従って、ａ）ブデソニド 21-トリエチルアンモニウム硫酸塩、およびｂ）コハク酸ブデソニドを生成するための合成経路の概略を示す。

図２Ａは、摘出された新鮮なウシ強膜-脈絡膜-RPEにわたる、ブデソニド、硫酸ブデソニド、およびコハク酸ブデソニドの輸送を示すグラフである。「ＡからＢへ」は、強膜からRPEへの方向を意味する。

図２Ｂは、摘出された新鮮なウシ強膜-脈絡膜-RPEにわたる、ＡからＢへの方向およびＢからＡへの方向へのコハク酸ブデソニドの輸送を示すグラフである。「ＢからＡへ」は、RPEから強膜への方向を意味する。このプロドラッグの輸送はまた、p-アミノ馬尿酸（モノカルボキシラート輸送阻害剤）の存在かで、ＡからＢへの方向で実施された。

図２Ｃは、パネルＢに示される輸送実験について、時間ゼロ時および実験終了時（６ｈ）において形成されるコハク酸ブデソニドおよびブデソニドのドナー量を示すグラフである。データは平均値± sd (n=4)を示す。

図３Ａは、ウシ強膜-脈絡膜-RPEにわたる、ＡからＢへの方向へのコハク酸ブデソニドの輸送についてのＰＫモデルを概略的に示す。ＡからＢへの方向へのBSA輸送について、左側の２つの円(1 BSA; 2 B)はドナーチャンバーであり、右側の２つの円(3 BSA; 4 B)はレシーバーチャンバーである。2 Bおよび4 Bが含まれており、これらは、輸送実験進行中に形成／輸送されるブデソニドを示す。組織への吸収によるプロドラッグ／親薬物の損失について説明するために、別個のコンパートメントが含まれる。K1>0は、組織中への薬物損失についての速度定数を示し、K1>2およびK3>4は、ドナー側およびレシーバー側それぞれにおける親薬物へのプロドラッグ変換についての速度定数を示す。K1>3およびK2>4は、ドナーからレシーバー側への、コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。K3>1およびK4>2は、レシーバーからドナー側への（存在する場合に、逆向きの移動）コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。

図３Ｂは、輸送実験進行中の、ドナーチャンバーおよびレシーバーチャンバーにおけるプロドラッグおよび親薬物の実測量およびモデル予測量を示すグラフである。

図４Ａは、阻害剤の存在下において、ウシ強膜-脈絡膜-RPEにわたる、ＡからＢへの方向へのコハク酸ブデソニドの輸送についてのＰＫモデルを概略的に示す。ＡからＢへの方向へのBSA輸送について、左側の２つの円(5 BSA; 6 B)はドナーチャンバーであり、右側の２つの円(7 BSA; 8 B)はレシーバーチャンバーである。6 Bおよび8 Bが含まれており、これらは、輸送実験進行中に形成／輸送されるブデソニドを示す。組織への吸収によるプロドラッグ／親薬物の損失について説明するために、別個のコンパートメントが含まれる。K5>0は、組織中への薬物損失についての速度定数を示し、K5>6およびK7>8は、ドナー側およびレシーバー側それぞれにおける親薬物へのプロドラッグ変換についての速度定数を示す。K5>7およびK6>8は、ドナーからレシーバーへの、コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。K5>7 Actは、能動輸送速度定数を示し、BSA輸送における能動拡散の寄与(0.5 %)を示す。K7>5およびK8>6は、レシーバーからドナー側への（存在する場合に、逆向きの移動）コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。

図４Ｂは、輸送実験進行中の、ドナーチャンバーおよびレシーバーチャンバーにおけるプロドラッグおよび親薬物の実測量およびモデル予測量を示すグラフである。

図５Ａは、ウシ強膜-脈絡膜-RPEにわたる、ＢからＡへの方向へのコハク酸ブデソニドの輸送についてのＰＫモデルを概略的に示す。ＢからＡへの方向へのBSA輸送について、左側の２つの円(9 BSA; 10 B)はレシーバーチャンバーであり、右側の２つの円(11 BSA; 12 B)はドナーチャンバーである。12 Bおよび10 Bが含まれており、これらは、輸送実験進行中に形成／輸送されるブデソニドを示す。組織への吸収によるプロドラッグ／親薬物の損失について説明するために、別個のコンパートメントが含まれる。K11>0は、組織中への薬物損失についての速度定数を示し、K11>12およびK9>10は、ドナー側およびレシーバー側それぞれにおける親薬物へのプロドラッグ変換についての速度定数を示す。K11>9およびK12>10は、ドナーからレシーバー側への、コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。K9>11およびK10>12は、レシーバーからドナー側への（存在する場合に、逆向きの移動）コハク酸ブデソニドおよびブデソニドについての輸送速度定数を示す。

図５Ｂは、輸送実験進行中の、ドナーチャンバーおよびレシーバーチャンバーにおけるプロドラッグおよび親薬物の実測量およびモデル予測量を示すグラフである。

図６は、ブラウンノルウェー(BN)ラットにおける、1時間終了時のＡ）ブデソニドおよびＢ）コハク酸ブデソニドのex vivo経強膜送達を示すグラフである。２５マイクロリットルの1 mg/ml懸濁液を、安楽死させた（ex vivo実験）ラットの後眼部の結膜下の空間に注入した。パネルＢは、BSA とBSAから形成されるブデソニドとの眼組織におけるレベルを示す。データは、平均値± SD (n ≧ 3)として表される。

図７は、ブラウンノルウェー(BN)ラットにおいて、1時間終了時に、ブデソニドおよびコハク酸ブデソニドの1 mg/ml懸濁液２５マイクロリットルを後眼部の結膜下に注入した後の、異なる眼組織におけるex vivoブデソニド送達の比較を示すグラフである。データは、平均値± SD (n ≧ 3)として表される。

図８は、セレコキシブの単一プロドラッグ（セレコキシブ-スクシンアミド酸、C-SA）および二重プロドラッグ（セレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリン、C-SA-T）の合成経路を概略的に示す。

図９Ａ〜Ｃは、累積パーセントで示すセレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリン（C-SA-T）二重プロドラッグの輸送が、Ａ）角膜、Ｂ）結膜、ならびにＣ）強膜-脈絡膜-RPEにわたって、C-SAおよびセレコキシブよりも高いことを示すグラフである。二重プロドラッグの輸送は、角膜および強膜-脈絡膜-RPEにわたって、阻害剤（タウリン）の存在下において著しく減少した。データは、平均値±s.d.で表される。

図１０Ａ〜Ｃは、メラニンの1 mg/ml PBS懸濁液(pH 7.4)と、Ａ）セレコキシブ(2 μg/ml)、Ｂ）C-SA（単一プロドラッグ、250 μg/ml)、およびＣ）C-SA-T（二重プロドラッグ、250 μg/ml)との結合を示す等温滴定型熱量測定(ITC)サーモグラムを示すグラフである。メラニンとC-SA-T (K = 7.93 E3 M^-1)およびC-SA (K = 8.89 E3 M^-1)との結合は、メラニンとセレコキシブとの結合(K = 1.01 E6 M^-1)よりも約１３０〜１１０倍低かった。

図１１Ａ〜Ｄは、ＢＮラットにおいてＡ）セレコキシブ (2 mg/ml)、Ｂ）C-SA (2 mg/ml)、Ｃ）C-SA-T (2 mg/ml)、およびＤ）C-SA-T (10 mg/ml)を10 μl 滴下により投与した後１時間終了時の、眼における体内分布を示すグラフである。データは、平均値± sd (n = 6〜8（眼の個数）、動物は3〜4匹)を示す。パネルＢ、Ｃ、Ｄは、プロドラッグならびに形成される親薬物のレベルを表す。

図１２は、ＢＮラットにおいてセレコキシブ (2 mg/ml)、C-SA (2 mg/ml)、C-SA-T (2 mg/ml)、およびC-SA-T (10 mg/ml)を10 μl 滴下により投与した後１時間終了時の、眼における体内分布を示すグラフである。データは、平均値± sd (n = 6〜8（眼の個数）、動物は3〜4匹)を示す。

図１３Ａ〜Ｃは、Ａ）FITC-デキストラン(4 Kda)漏出アッセイ、Ｂ）硝子体と血漿とのタンパク質比、およびＣ）白血球停滞により評価されるように、1 % w/vセレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリン点眼剤の能力が、STZ誘導型糖尿病動物において２ヶ月間の処置の終了時に、血液網膜関門での漏出を減少させるのに有効であったことを示すグラフである。データは、平均値± sd (n = 6-8（眼の個数）、動物は3〜4匹。* は、糖尿病＋ベヒクル群とは著しく異なっていることを表す。スチューデントt-検定、 p < 0.05)を示す。

図１４は、SCF処理PLGAマイクロ粒子にベバシズマブを装填する工程、およびこのマイクロ粒子から放出されるベバシズマブの累積放出割合を概略的に示す。

図１５は、SCFを用いてPLGAマイクロ粒子にベバシズマブを装填する代替的な工程、およびこのマイクロ粒子から放出されるベバシズマブの対応する放出割合を概略的に示す。

図１６は、本発明の例示的な実施形態に従って、PLAナノ粒子にベバシズマブを最初に装填した後、SCFを用いてPLGAマイクロ粒子にナノ粒子を注入し、PLGAマイクロ粒子を膨張させること、ならびに、その結果としてこの粒子から放出されるベバシズマブの持続性放出プロファイルを概略的に示す。

図１７は、SCFによる処理前および処理後のPLGAマイクロ粒子の表面領域を示す、分解能を増加させた共焦点顕微鏡による一連の画像である。

図１８は、SCFへの暴露後にPLGAマイクロ粒子にPLAナノ粒子を注入することを示す、共焦点顕微鏡による一連の画像である。

図１９は、例示的な粒子内粒子(PinP)組成物からのベバシズマブの累積in vitro放出割合を示すグラフである。

図２０は、未処理（native）ベバシズマブ、超臨界処理CO₂ベバシズマブ、およびin vitro放出サンプルからのベバシズマブ（１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、および４ヶ月後）についての円偏光二色性(CD)スペクトルを示すグラフである。

図２１は、例示的なPinP組成物からの、未処理ベバシズマブ、超臨界処理CO₂ベバシズマブ、および例示的なPinP組成物からの in vitro放出ベバシズマブについての、サイズ排除クロマトグラムである。

図２２は、多孔性PLGAマイクロ粒子に注入されたPLAナノ粒子(NPinPMP)を示す、走査型電子顕微鏡の写真である。

図２３は、未処理ベバシズマブ、超臨界処理CO₂ベバシズマブ、およびin vitro放出サンプルからのベバシズマブ（１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、および４ヶ月後）についての安定性評価の結果を示す、SGS PAGEゲルの写真である。パネルＡは還元ゲルである。パネルＢは非還元ゲルである。

図２４は、Ａ）Alexa-ベバシズマブ溶液、およびＢ）例示的なPinP 組成物中に装填されたAlexa-ベバシズマブを硝子体内注入した後におけるラットの眼の非侵襲的な眼球蛍光測定検査の結果を示すグラフである。パネルＣは、送達後最長６０日間における、Alexa-ベバシズマブ単独、およびPinP中のAlexa-ベバシズマブについての蛍光レベルを示す。

図２５は、例示的なPinP組成物からのHis-LEDGF_1-326の累積放出を示すグラフである。

図２６Ａ〜Ｃは、Ａ）Alexa- His-LEDGF_1-326溶液、およびＢ）PinP中に装填されたAlexa- His-LEDGF_1-326を硝子体内注入した後におけるラットの眼の非侵襲的な眼球蛍光測定検査の結果を示すグラフである。パネルＣは、PinP注入群および溶液注入群について、His-LEDGF_1-326の濃度を示す。

本明細書で使用される場合、「網膜（retina）」および「網膜の（retinal）」とは両方とも、網膜ならびに網膜に隣接する後眼部全体を意味する。

本明細書で使用される場合、「治療すること（treating）」および「治療（treatment）」とは、内在する疾患の完全な逆転または排除、疾患の進行の一時的または継続的な防止、疾患の一時的または継続的な退縮、および疾患に関連する１つ以上の症状の緩和を意味する。

網膜を含む後眼部を冒す多くの眼疾患が存在する。後眼部を冒す疾患の治療には、一般的に、治療薬の局所投与、全身投与、および硝子体内投与が含まれる。局所投与される治療薬は、網膜に到達するために、角膜、レンズ、小柱網、および血液房水関門を横切らなくてはならず、最終的な結果として、後眼部に到達する治療薬は一般的に非常に少ない。全身投与では、血液網膜関門を横切る必要があり、これはしばしば高用量を必要とするため、望まない副作用に繋がる可能性がある。硝子体内投与は、非常に侵襲的であり、網膜剥離、眼内炎、および白内障の危険を伴う。したがって、理想的な治療薬は、所望される薬理効果を発揮するだけでなく、眼特有の関門を横切って疾患部位で局所的効果を発揮するものである。

多くのコルチコステロイドが、網膜疾患を治療するのに有望であることが示されてきた。しかしながら、コルチコステロイドは、後眼部全体に亘って溶解性プロファイルおよび透過性プロファイルが不十分であるために、限定的であった。よって、一態様において、本発明は、網膜への送達プロファイルが向上されたコルチコステロイドのプロドラッグ、および網膜疾患の治療におけるその使用に関する。さらに、多くのNSAIDもまた、眼疾患の治療において有用な薬理効果を有するが、コルチコステロイドの場合と同様に、低い溶解性、眼における限定的な透過性、またはこれらの組み合わせを欠点として有する。よって、別の態様において、本発明は、NSAIDの単一プロドラッグおよび二重プロドラッグ、ならびに網膜疾患の治療におけるその使用に関する。二重プロドラッグのコンセプトは、コルチコステロイドならびに多の薬物にも応用することができる。さらに、上述したものを含む治療薬を送達する際、徐放性送達あるいは持続性送達を実現することがしばしば望ましい。持続性送達のために治療薬を製剤化する際、治療薬の放出速度を制御することができる担体に依存することが、しばしば必要とされる。治療薬を担体に直接装填すると、所望されるかまたは至適な持続性放出効果を実現し損なう可能性がある。同様に、ある治療薬を担体中に封入すると、治療薬を担体中に封入するのに必要な反応条件の結果として、治療薬の安定性に悪影響を及ぼす可能性がある。よって、別の態様において、本発明は、不活性条件下で持続性送達用担体内に治療薬を装填することを可能にする持続性放出製剤に関する。

＜コルチコステロイドのプロドラッグ＞
コルチコステロイドは、視床下部 - 下垂体前葉 - 副腎(HPA)軸によって分泌されるホルモンの天然および合成アナログからなる一群のことである。コルチコステロイドには、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、および副腎皮質刺激ホルモンが含まれる。本発明の化学修飾は、コルチコステロイドの溶解性と溶解速度を改善するのに用いられ得る。本発明で使用するのに適切なコルチコステロイドは、in vivo網膜細胞モデルを用いることにより眼疾患を治療する際に、例えば、抗炎症効果ならびに他の有用な薬理効果（例えば、抗血管新生）を示すその能力によって選択することができる。本発明の例示的なコルチコステロイドには、トリアムシノロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、フルオシノロン アセトニド、トリアムシノロン アセトニド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、およびブデソニドが含まれるが、これらに限定されない。限定的でない例として、ブデソニドは、喘息、アレルギー性鼻炎、および炎症性腸疾患の治療において臨床で使用されている。ブデソニドは、コルチゾールと比較して、1000倍高い局所的抗炎症効果を有する強力な抗炎症コルチコステロイドである(1, 2)。ブデソニドは、血管内皮細胞成長因子(VEGF)の分泌、およびナノモルの濃度での糖質コルチコイド受容体媒介機構を介した網膜色素表皮細胞（ARPE19細胞）におけるmRNA の発現を減少させることができる。したがって、ブデソニドは、網膜眼疾患の治療のための本発明に関連して有用である可能性がある代表的な種類のコルチコステロイドである。

本発明のコルチコステロイドのプロドラッグは、コルチコステロイドの親水性を増加させる修飾を含む。プロドラッグは、ステロイド骨格に１つ以上の官能基を結合させることにより生成される。官能基は、親ステロイド骨格のA環、B環、C環、またはD環に結合してもよく、活性のコルチコステロイドに存在する官能基に結合してもよい。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドには、少なくとも１つの負に帯電した末端基が親化合物に導入される。下記の理論に拘泥されないが、この負に帯電した末端基は、コルチコステロイドと、メラニンおよび／または眼からコルチコステロイドを隔離（sequestration）または除去することになる他の天然の眼構成成分との結合を減少させる、と考えられている。負に帯電した末端の酸は、in vivoで加水分解可能なエステル、アミド、カルバマート、または他の許容可能なプロドラッグ結合によって親化合物に結合してよい。一つの例示的な実施形態において、官能基は、エステル結合を介してコルチコステロイドに結合する。特定の例示的な実施形態において、プロドラッグ官能基は、D環に存在する末端水酸基、または末端水酸基に結合して存在する官能基に結合する。別の例示的な実施形態において、プロドラッグ官能基は、コルチコステロイド骨格の炭素１７に結合する官能基における末端水酸基に結合する。本発明のコルチコステロイドのプロドラッグを生成するのに用いられ得る官能基には、硫酸基、スルホン基、スルホキシド基、スルホン酸基、クエン酸基、リン酸基、ホスフィン基、ホスホジエステル基、ホスホン酸基、コハク酸基、またはこれらの塩が含まれる。また、本発明において用いられ得る官能基には、下記のエステル、すなわちマレイン酸エステル、クエン酸エステル、酒石酸エステル、アジピン酸エステル、グルタル酸エステル、マロン酸エステル、およびヒドロキシコハク酸エステルが含まれる。一つの例示的な実施形態において、官能基は、硫酸エステルまたは硫酸塩である。特定の例示的な実施形態において、硫酸塩は、アンモニウム塩、例えば硫酸トリエチルアンモニウム塩である。別の例示的な実施形態において、プロドラッグの官能基は、コハク酸エステルまたはコハク酸である。

一つの例示的な実施形態において、本発明のプロドラッグは、下記の一般式を有し、式中、Ｒは下記の表１に列挙されるＲ基のうちのいずれか１つである。

＜ＮＳＡＩＤのプロドラッグ＞
NSAIDは、エイコサノイド抑制特性および抗炎症特性を有するメンバーを含む種類の薬物である。コルチコステロイドと同様に、この種類のメンバーは、眼において溶解性と透過性が低いという欠点を有し得る。NSAIDには、眼疾患の治療に有用であり得る薬理学的特性を有するメンバーが含まれる。非限定的な例として、セレコキシブは、関節リウマチおよび変形性関節症のような炎症性疾患の治療に用いられる、強力で選択的なCOX-2阻害剤である。糖尿病性網膜症において、COX-2媒介プロセスを介してプロスタグランジンのレベルが増加することが、これまでに示されてきた(3,4)。また、網膜色素表皮細胞における、血管内皮細胞成長因子(VEGF)のｍRNAレベルおよびCOX-2発現レベルは、糖尿病性網膜症の初期において増加する(5)。プロスタグランジン産生の増加はまた、網膜においてVEGFの産生を増加させ得る(6)。プロスタグランジンE2(PGE2)レベルおよびVEGFレベルの増加により、血液網膜関門が破壊され、血管漏出につながる(7-9)。したがって、例えばセレコキシブが有する特性を含むがこれに限定されない特性を有するNSAIDは、網膜眼疾患の治療のための本発明に関連して用いられるのに適したNSAIDを意味する。一つの例示的な実施形態において、コキシブはセレコキシブである。本発明において用いられ得るNSAIDには、サリチラート、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、エノール酸（オキシカム）誘導体、フェナム酸誘導体（フェナマート類）、および選択的COX-2阻害剤(コキシブ類)が含まれる。一つの例示的な実施形態において、NSAIDはコキシブである。例示的なコキシブには、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、およびフィロコキシブが含まれるが、これらに限定されない。一つの例示的な実施形態において、コキシブはセレコキシブである。別の例示的な実施形態において、NSAIDはジクロフェナク、ケトララク、ネパフェナク、またはブロムフェナクである。別の例示的な実施形態において、COX-2阻害剤はニメスリドである。

本発明は、NSAIDの単一プロドラッグおよび二重プロドラッグを含む。本発明のプロドラッグには、多官能性のカウンター酸がそれに結合する、弱塩基を含む末端官能基を有するNSAIDが含まれる。一つの例示的な実施形態において、親化合物に存在する弱塩基のpKa値は、約７〜約１０である。多官能性のカウンター酸は、in vivoで加水分解可能なエステル、アミド、カルバマート、または他の許容可能なプロドラッグ結合によって親化合物に結合し得る。一つの例示的な実施形態において、カウンター酸は、in vivoで加水分解可能なエステルによって結合する。下記の理論に拘泥されるわけではないが、塩基性基を含む官能基はメラニン結合を増強すると考えられる。メラニン結合は、化合物がその標的に到達することを妨げるかまたは化合物を隔離することにより、眼において化合物が有効に分配されることを妨げる主な障壁として作用する。したがって、メラニン結合を減少させることができるNSAID親化合物の修飾が、本発明によって企図される。本明細書で使用される場合、「多官能性の化合物またはカウンター酸」とは、多数の官能基を含む分子である。例えば、多官能性の官能基は、多数の官能基がそれに結合する炭素骨格を有する化合物、またはリン酸および硫酸のような単分子である。本発明での使用に適する多官能性カウンター酸には、アスパラギン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アミド、およびコハク酸が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用され得る例示的なアミドには、エチルブチルアミド、ピバロイルアミド（privaloylamide）、ブチルアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、シナパミド（sinapamide）サリチルアミド、スクシンアミド、およびグリシンアミド（gycinamide）が含まれる。一つの例示的な実施形態において、多官能性カウンターイオンは、コハク酸エステルまたはコハク酸である。

一つの例示的な実施形態において、本発明のプロドラッグは、末端スルホンアミド（予測pKa値は8.8）を無水コハク酸で遮蔽してセレコキシブスクシンアミド酸を形成するように修飾したセレコキシブである。セレコキシブ スクシンアミド酸を生成する合成経路は、図８に示され、下記の実施例においてより詳細に説明される。

別の例示的な実施形態において、本発明のプロドラッグは下記の一般式を有し、式中、Ｒは下記の表２に列挙されるＲ基のうちのいずれか１つである。

さらに別の例示的な実施形態において、本発明のプロドラッグは下記の一般式を有し、式中、Ｒは下記の表３に列挙されるＲ基のうちのいずれか１つである。

特定の例示的な実施形態において、本発明のNSAIDプロドラッグはさらに、タウリンを添加して二重プロドラッグを形成することを含む。タウリンは、光受容細胞中に、および一定程度はミュラー細胞、アマクリン細胞、および双極細胞に蓄積する(10-13)。さらに、タウリンは、血液網膜関門を網膜へと透過することが報告されている。タウリンの添加は、ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデルにおいてVEGF発現の上方制御を減少させることが文献に報告されている(14)。タウリンの両性イオン特性が、脂質膜を通るその受動拡散を妨げると考えられる。観察されるタウリンの網膜流入クリアランスは、非透過性細胞間マーカーの網膜流入クリアランスと比較して著しく高いことが発見され、これは、拡散媒介プロセスではなく担体媒介（carrier-mediated）プロセスであることを示す。

一つの例示的な実施形態において、タウリンは、多官能性カウンター酸の末端基に結合する。別の例示的な実施形態において、タウリンは、NSAID親化合物に直接結合する。さらに別の例示的な実施形態において、1つを超えるタウリンが多官能性カウンター酸、親化合物、またはこれらの組み合わせに結合し得る。同様のコンセプトが、コルチコステロイドを含む他の薬物に応用され得る。一つの例示的な実施形態において、タウリンは、本発明のセレコキシブ プロドラッグに結合する。別の例示的な実施形態において、タウリンは、セレコキシブ スクシンアミド酸のプロドラッグに結合する。タウリンをセレコキシブ スクシンアミド酸に結合させるための合成経路は、図8に示され、下記の実施例においてより詳細に説明される。

＜ルボキシスタウリンのプロドラッグ＞
本発明は、ルボキシスタウリンの単一プロドラッグおよび二重プロドラッグを含む。ルボキシスタウリンは、その過剰発現が糖尿病性網膜症の発症に関連づけられてきた、プロテインキナーゼCベータ阻害剤である。一つの例示的な実施形態において、本発明のプロドラッグは下記の一般式を有し、式中、Ｒは、アスパラギン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アミド、コハク酸、またはそのエステルもしくはアミド酸である。一つの例示的な実施形態において、Ｒは下記の表４に列挙されるＲ基のうちのいずれか１つである。

特定の例示的な実施形態において、本発明のルボキシスタウリンのプロドラッグはさらに、タウリンを添加して二重プロドラッグ化合物を形成することを含む。一つの例示的な実施形態において、タウリンはＲ基の末端官能基に結合する。別の例示的な実施形態において、タウリンは、ルボキシスタウリン親化合物に直接結合する。さらに別の例示的な実施形態において、１つを超えるタウリンが、Ｒ基、親化合物、またはこれらの組み合わせに結合し得る。

＜医薬組成物＞
本明細書に記載されるコルチコステロイドおよびNSAIDのプロドラッグ化合物は、既知の技術を用いて生理学的に許容可能な製剤として提供され、製剤は、局所投与、眼周囲投与または経強膜投与、脈絡膜上投与、網膜下投与、硝子体内投与、および全身投与を含むがこれらに限定されない標準的な経路によって投与され得る。100％純粋な異性体が本発明によって企図されるが、立体化学異性体（αもしくはβとして、またはＲもしくはＳとして表される）は、両異性体を任意の比で含む混合物であってよく、これは当業者によって化学的に可能なことである。例えばPataniおよびLavoie (“Bio-isosterism: a rational approach in drug design” Chem. Rev. (1996) p. 3147-3176) によって説明されるように、古典的および非古典的な、生物学的に等価な原子、ならびに置換基の置換もまた本発明により意図され、これらのことは当業者によく知られている。このような生物学的に等価な置換としては、例えばＳまたはＮＨによるＯの置換が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に従う製剤は、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、カシェ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、散剤、エアロゾル剤、坐剤、スプレー剤、トローチ剤（a pastille）、軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、フォーム剤、ゲル剤、タンポン剤、ペッサリー剤、顆粒剤、ボーラス剤、洗口剤、点眼剤、または経皮パッチ剤の形態で投与され得る。

製剤には、経口投与、経直腸投与、経鼻投与、吸入投与、局所投与（皮膚外用投与、経皮投与、舌下投与、点眼を含む)、経膣投与、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、眼内投与（眼周囲投与、脈絡膜上投与、網膜下投与、硝子体内投与などの局所注入を含む）、気管内、および硬膜外投与を含む）、または吸入投与に適した製剤が含まれる。一つの例示的な実施形態において、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜送達のために製剤化される。経強膜送達には、結膜下送達、テノン嚢下送達、および眼球後経強膜送達が含まれる。一つの例示的な実施形態において、NSAIDプロドラッグは、点眼剤として局所投与されるために製剤化される。製剤は、単位投与形態で簡便に提供され得、従来の製剤技術によって調製され得る。そのような技術には、活性成分と製剤担体または賦形剤とを組み合わせるステップが含まれる。一般的に、製剤は、活性成分と液体担体もしくは微細に分割された固体担体またはこれらの両方とを均一および密接に組み合わせ、必要に応じて生成物を成形することにより、調製される。

経口投与に適する本発明の製剤は、例えばカプセル剤、カシェ剤、または錠剤のようにそれぞれが所定量の活性成分を含む個別の単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水性液体中もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型液状エマルションもしくは油中水型エマルションなどとして、提供され得る。

錠剤は、任意に１つ以上の副成分と共に、圧縮または成形することににより作製され得る。圧縮錠剤は、適切な機器において、例えば散剤または顆粒剤のような自由に流れる形態での活性成分を、任意に結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤、または分散剤と共に混合して圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、適切な機器において、不活性液状希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することにより作製され得る。錠剤は、任意にコーティングされても割線を設けられてもよく、含有される活性成分が徐放性放出または制御放出されるように製剤化されてもよい。

口内への局所投与に適する製剤には、矯味付けしたベース（通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に成分を含むロゼンジ剤；不活性ベース（例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴム）中に活性成分を含むトローチ剤；および適切な液状担体中に投与されるべき成分を含む洗口剤が含まれる。

皮膚への局所投与に適する製剤は、医薬上許容可能な担体中に投与されるべき成分を含む、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、および点眼剤として提供され得る。

経直腸投与のための製剤は、適切なベース（例えば、カカオ脂またはサリチラートを含む）を含有する坐剤として提供され得る。

経鼻投与に適する製剤は、担体が固体である場合には、例えば20〜500μｍの範囲の粒径を有する粗粉末を含み、これは、鼻から吸入する方法で、すなわち、鼻先に近づけた状態で保持される粉末を含む容器から、鼻腔を通って急速に吸入することにより、投与される。担体が液体である場合には、例えば鼻スプレー剤または点鼻剤としての投与に適する製剤は、活性成分の水性または油性の溶液を含む。

経膣投与に適する製剤は、活性成分に加えて、例えば当技術分野で適切であることが知られている担体などの成分を含む、ペッサリー剤、タンポン剤、クリーム剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー剤として提供され得る。

吸入に適する製剤は、活性成分に加えて、例えば当技術分野で適切であることが知られている担体などの成分を含む、ミスト剤、ダスト剤、粉末製剤、またはスプレー剤として提供され得る。

非経口投与に適する製剤は、水性または非水性の滅菌注入用溶液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象となる受容者の血液と等張にする溶質を含み得る）；ならびに水性または非水性の滅菌懸濁剤（これは、懸濁化剤および粘稠化剤を含み得る）を含む。非経口投与に適する製剤はまた、米国特許出願第10/392,403号(公開番号US 2004/0033267)、米国特許出願第10/412,669号(公開番号US 2003/0219490)、米国特許第5,494,683号、米国特許出願第10/878,623号(公開番号US 2005/0008707)、米国特許第5,510,118号、米国特許第5,524,270号、米国特許第5,145,684号、米国特許第5,399,363号、米国特許第5,518,187号、米国特許第5,862,999号、米国特許第5,718,388号、および米国特許第6,267,989号（これらのすべては、参照することによりその全体が本明細書に取り込まれる）に開示されたような多くの方法によって作製されるナノ粒子製剤を含むが、これに限定されない。医薬品製剤技術に関する概説は、Rong Liu編「Water Insoluble Drug Formulation」（2000年、 CRC Press LLC）の1〜633ページに記載されており、これは、参照することによりその全体が本明細書に取り込まれる。

上記において具体的に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類に関連する従来の他の物質を含み得ることを理解すべきである。例えば、経口投与に適する製剤は矯味剤を含んでよく、ナノ粒子製剤（例えば、平均断面積当たり2000 nm未満、好ましくは1000 nm未満、最も好ましくは500 nm未満）は、粒子の凝集を防ぐために選択される１つ以上の賦形剤を含み得る。

＜網膜眼疾患と使用方法＞
本発明の、コルチコステロイド、NSAID、およびルボキシスタウリンの単一プロドラッグ製剤および二重プロドラッグ製剤は、後眼部に罹患する疾患の治療に用いられ得る。言及する用語を簡単にするために、本発明の単一プロドラッグ製剤および二重プロドラッグ製剤は、下記において纏めて、プロドラッグ製剤と称する。本発明のコルチコステロイドおよびNSAIDのプロドラッグ化合物を用いて治療されうる、後眼部に罹患する疾患には、後眼部に罹患する変性性、血管性、炎症性、および感染性の疾患が含まれる。変性性疾患の例には、ARMDおよび網膜色素変性症が含まれるが、これらに限定されない。血管性疾患の例には、糖尿病性網膜症および脈絡膜血管新生が含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患の例には、ブドウ膜炎が含まれるが、これに限定されない。感染性疾患の例には、CMV網膜炎が含まれるが、これに限定されない。また、本発明のコルチコステロイドおよびNSAIDのプロドラッグ化合物は、緑内障および視神経炎を治療するのに用いられ得る。

一つの例示的な実施形態において、本発明は、後眼部に罹患する疾患を有する患者に、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、本発明のNSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせを含む組成物を投与することを含む。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜で送達される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与される。別の例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせは、持続性放出製剤の形態で埋め込み投与または全身投与される。一つの例示的な実施形態において、この持続性放出製剤は、本発明に従う多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)製剤であり、下記により詳細に説明される。

別の例示的な実施形態において、本発明は、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、血液網膜関門漏出を減少させる方法を含む。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜で送達される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与される。別の例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせは、持続性放出製剤の形態で埋め込み投与または全身投与される。一つの例示的な実施形態において、この持続性放出製剤は、本発明に従う多孔性マイクロ粒子中にナノ粒子を含有する製剤であり、下記により詳細に説明される。

別の例示的な実施形態において、本発明は、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、白血球の網膜血管内への接着を減少させる方法を含む。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜で送達される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与される。別の例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせは、持続性放出製剤の形態で埋め込み投与または全身投与される。一つの例示的な実施形態において、この持続性放出製剤は、本発明に従う多孔性マイクロ粒子中にナノ粒子を含有する製剤であり、下記により詳細に説明される。

別の例示的な実施形態において、本発明は、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、後眼部におけるPGE2レベルを減少させる方法を含む。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜で送達される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与される。別の例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせは、持続性放出製剤の形態で埋め込み投与または全身投与される。一つの例示的な実施形態において、この持続性放出製剤は、本発明に従う多孔性マイクロ粒子中にナノ粒子を含有する製剤であり、下記により詳細に説明される。本明細書で使用される場合、PGE2レベルの減少には、PGE2の生合成に関与する調節成分の減少、ならびに物理的なPGE2レベルそのものの減少が含まれる。PGE2レベルの減少は、比較可能な健常組織において観察されるレベルを下回るレベルに基づく。一つの例示的な実施形態において、本発明の方法は、比較可能な健常組織において観察されるPGE2レベルを少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%下回るPGE2レベルの減少をもたらす。

別の例示的な実施形態において、本発明は、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、後眼部におけるVEGFレベルを減少させる方法を含む。一つの例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグは、経強膜で送達される。別の例示的な実施形態において、NSAIDのプロドラッグは、点眼剤の形態で眼に局所投与される。別の例示的な実施形態において、コルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせは、持続性放出製剤の形態で埋め込み投与または全身投与される。一つの例示的な実施形態において、この持続性放出製剤は、本発明に従う多孔性マイクロ粒子中にナノ粒子を含有する製剤であり、下記により詳細に説明される。本明細書で使用される場合、VEGFレベルの減少には、VEGFのmRNAレベルおよび／またはタンパク質レベルの減少、ならびにVEGFの転写および翻訳に関与する調節成分の減少が含まれる。VEGFレベルの減少は、比較可能な健常組織において観察されるレベルを下回るレベルに基づく。一つの例示的な実施形態において、本発明の方法は、比較可能な健常組織において観察されるVEGFレベルを少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%下回るVEGFレベルの減少をもたらす。

＜粒子内粒子 持続性放出製剤＞
別の態様では、本発明は、粒子内粒子(PinP)持続性放出組成物に関する。本発明の持続性放出組成物は、より大きい多孔性外部粒子内に含まれる内部粒子を含み、例えば、多孔性マイクロ粒子内ナノ粒子(NPinPMP)、多孔性大ナノ粒子内小ナノ粒子（small nanoparticle in porous large nanoparticle (SNPinPLNP)）および多孔性大マイクロ粒子内小マイクロ粒子（small microparticle in porous large microparticle (SMPinPLMP)）などの様々な構成を含む。内部粒子は、より小さく、より大きい外部粒子と比較して、加工処理中に比較的膨張しない。外部粒子は、膨張可能であり、加工処理中に顕著に多孔性の構造を形成し、これによって、外部粒子の多孔性構造内に内部粒子を埋め込むことが可能になる。

本発明との関連で用いられる場合、粒子は、粒子の初期表面積が約1.25〜約100倍の範囲内に増加すれば、超臨界流体の存在下で膨張する、と考えられる。特定の例示的な実施形態において、粒子は、粒子の初期表面積が約1.25〜約5倍、約5〜約25倍、約25〜約50倍、約50〜約75倍、または約75〜100倍の範囲内に増加すれば、膨張する、と考えられる。あるいは、粒子は、粒子の初期サイズが少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%増加すれば、膨張する、と考えられる。

本発明の内部粒子は、超臨界流体の存在下で膨張しない、ポリマー材料または非ポリマー材料を用いて作製される。特定の例示的な実施形態において、ナノ粒子材料は、超臨界流体の存在下で膨張しない、ポリマー材料である。特定の例示的な実施形態において、ポリマー材料は、超臨界二酸化炭素の存在下で膨張しない、材料である。本発明において用いられ得る適切なポリマー材料および非ポリマー材料の例には、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸)、乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)、セルロース誘導体、キトサン、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン、ポリ(テトラフルオロエチレン)、ポリ(エチレン テレフタラート)、酸化鉄、酸化セリウム、酸化亜鉛、金、銀、その他の生体適合性の金属および結晶、ならびにシリカが含まれる。結晶性材料、または結晶領域が大部分を占める材料は、超臨界加工処理中に、より膨張しないようである。ポリマー材料の内部粒子は、従来のエマルション溶媒蒸発法または他の同様に適切な合成方法を用いて調製され得る。治療薬は、内部粒子の形成中に内部粒子内に封入されてもよく、内部粒子の形成後に表面に搭載されてもよい。

本発明の外部粒子は、超臨界流体の存在下で膨張する材料を用いて作製される。特定の例示的な実施形態において、マイクロ粒子材料は、超臨界流体の存在下で膨張するポリマー材料である。特定の例示的な実施形態において、ポリマー材料は、超臨界二酸化炭素の存在下で膨張する材料である。本発明において用いられ得る適切なポリマー材料の例には、ラクチド-コ-グリコリド、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン グリコール、ポリアルキレン オキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、およびこれらの共重合体が含まれる。さらに、適切なポリマー材料にはまた、アルキル セルロース、ヒドロキシアルキル セルロース、セルロース エーテル、セルロース エステル、ニトロ セルロース、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの重合体、メチル セルロース、エチル セルロース、ヒドロキシプロピル セルロース、ヒドロキシプロピル メチル セルロース、ヒドロキシブチル メチル セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチル セルロース、セルロース ポリ（メチル メタクリラート）、ポリ（エチル メタクリラート）、ポリ（ブチルメタクリラート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニル酢酸）、およびポリビニルピロリドンが含まれる。一般的に、非晶質材料、または非晶質領域が大部分を占める材料は、超臨界流体存在下での加工処理中における膨張に適している。ポリマー材料の外部粒子は、従来のエマルション溶媒蒸発法または他の同様に適切な合成方法を用いて調製され得る。特定の例示的な実施形態において、治療薬は、外部粒子の形成中に外部粒子内に封入されてもよく、外部粒子の形成後に表面に搭載されてもよい。

持続性放出組成物は、持続性放出プロファイルが所望される場合に、広範な治療薬を送達するのに用いられ得る。様々な粒子構成を生成する方法は、超臨界流体流動技術を用いて達成される。結果として得られる有機溶媒を含まない装填は、例えばペプチド系薬物およびヌクレオチド系薬物ならびにウイルスベクターなどの、凝集または分解に感受性である薬物に特に良く適合する。治療薬は、内部粒子、外部粒子、またはその両方の表面上に搭載されてもよく；内部粒子、外部粒子、またはその両方のマトリックス内に装填されてもよく；外部粒子の細孔内に存在してもよく；あるいはこれらの組み合わせであってもよい。特定の例示的な実施形態において、治療薬は、内部粒子の表面に存在し得る。別の例示的な実施形態において、治療薬は、内部粒子および外部粒子の表面に存在し得る。さらに別の例示的な実施形態において、治療薬は、内部粒子のマトリックス内に存在し得る。別の例示的な実施形態において、治療薬は、内部粒子および外部粒子の両方のマトリックス内に存在し得る。別の例示的な実施形態において、治療薬は、外部粒子の細孔構造内にもさらに存在し得る。

ナノ粒子上に搭載され得る治療薬には、小分子治療薬、核酸系治療薬、ウイルスベクター、およびペプチド系治療薬が含まれる。一つの例示的な実施形態において、治療薬はペプチド系治療薬である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に用いられる。他の説明がなければ、これらの用語は、ペプチド結合によって結合する少なくとも２つのアミノ酸を有するポリマーを意味する。したがって、この用語には、オリゴペプチド、タンパク質の断片、類似体、誘導体、グリコシル化誘導体、PEG化誘導体、融合タンパク質などが含まれる。別の例示的な実施形態において、治療薬は、本発明のコルチコステロイドのプロドラッグ、NSAIDのプロドラッグ、ルボキシスタウリンのプロドラッグ、またはこれらの組み合わせである。特定の例示的な実施形態において、内部粒子または外部粒子に装填される治療薬は、凍結乾燥される。

内部粒子および外部粒子は共に混合され、高圧下において超臨界流体に暴露される。特定の例示的な実施形態において、超臨界流体は二酸化炭素である。超臨界流体への暴露の後、外部粒子は膨張して、外部粒子に多孔性構造を形成する。超臨界流体はその後、内部粒子を外部粒子内に導入して、粒子内粒子持続性放出製剤を形成する。一つの例示的な実施形態において、粒子内粒子持続性放出製剤は、約1 nm〜約900 nmの直径を有する内部ナノ粒子を、約1 μm〜約100 μmの直径を有する外部マイクロ粒子中に組み込むことを含む。別の例示的な実施形態において、粒子内粒子持続性放出製剤は、約1 nm〜約300 nmの直径を有する内部ナノ粒子を、約10 nm〜約999 nmの直径を有する外部ナノ粒子中に組み込むことを含む。さらに別の例示的な実施形態において、粒子内粒子持続性放出製剤は、約1 μm〜約100 μmの直径を有する内部マイクロ粒子を、約2 μm〜約500 μmの直径を有する外部マイクロ粒子中に組み込むことを含む。適切なサイズの内部粒子および外部粒子の選択は、粒子を含む材料の種類、用いられる超臨界流体における外部粒子の膨張能力、および外部粒子内に組み込まれる内部粒子のサイズに左右されるものである。これらのことはすべて、当技術分野における通常の技術者によって容易に選択することができる要素である。一般的に、内部粒子および外部粒子のサイズ比は、約1:2〜約1:100の範囲で変化し得る。一つの例示的な実施形態において、サイズ比は、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、または1:100であり得る。

NPinPMPの形成は、ナノ粒子およびマイクロ粒子を約1000 psi〜約1400 psiで暴露することにより達成され得る。暴露時間は、約5分〜約2時間の範囲で変化し得る。温度は30^oC〜45 ^oCの範囲であり得る。適切な圧力および温度の範囲の選択は主として、所定の超臨界流体の超臨界点付近の温度および圧力の範囲によって決定される。したがって、当業者は、用いられる超臨界流体、所望される外部粒子の膨張のサイズまたは量、および所望される外部粒子内の多孔性の程度に基づいて、適切な時間、温度、および圧力の範囲を選択することができるものである。例えば、長時間および／または高圧下での暴露後に圧力を下げると、短時間および／または低圧下での暴露の場合と比較して、より膨張し細孔性がより向上される結果となる。

一つの例示的な実施形態において、内部粒子および外部粒子は、約1:3の比で混合される。一つの例示的な実施形態において、用いられる内部粒子と外部粒子との比は、約1:9である。これらの比は、ナノ粒子の取り込みの程度および薬物の徐放性に影響を及ぼすものである。一般的に、外部粒子に対する内部粒子の量が多ければ多いほど、外部粒子内に取り込まれる内部粒子の量は多くなり、これにより、薬物放出速度および用量が増加する。外部粒子に対する内部粒子の量が少なければ少ないほど、一度に放出する量は少なくなる。

本発明の組成物および方法は、下記の非限定的な実施例によってさらに説明されるが、これは、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。一方、本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神から逸脱することなく当業者に示唆され得る、様々な他の実施形態、変更、および等価物を実施するための手段があり得ることは、明確に理解されるべきである。

実施例１．１
＜材料＞
ブデソニドは、Spectrum Chemical and Laboratory Products, a division of Spectrum Chemical Mfg. Corp. (New Brunswick, NJ, USA)から購入した。ベンゼン、ピリジン、トリエチルアミン、スルファトリオキシド トリエチルアミン錯体、および無水コハク酸はSigma-Aldrich (St. Louis. MO, USA)から購入した。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等級のアセトニトリルとメタノールは、Fisher Scientific (Philadelphia, PA, USA)から購入した。摘出されたばかりのウシの眼は、G & C Meat Company, Colorado Springs, CO, USAから購入した。

＜硫酸ブデソニドの合成＞
1 mlの無水ベンゼンおよびピリジン(1:1)中のブデソニド(50 mg; 0.116 mmol)の溶液に、スルファトリオキシド トリエチルアミン錯体(STT; 53.2 mg; 0.29 mmol)を少しずつ、55〜60℃で60分間攪拌しながら加えた（図１）。生成物の形成は、10分毎にTLC（移動相としてクロロホルム-メタノール(80-20)を用いる）によってモニターした。1時間後、反応混合物は、減圧下で2時間溶媒蒸発させて溶媒（ベンゼン, B.P. 80℃; ピリジン, B.P. 116℃）を除去し、ブデソニド、ブデソニド21-スルファート トリエチルアンモニウム塩、およびSTTの混合物を油状残渣として得た。混合物をシリカゲル オープンカラム クロマトグラフィーにかけ、分取薄層クロマトグラフィーによってさらに精製した。クロマトグラフィーによる生成物の分離には、クロロホルム：メタノールを移動相として用いた。生成物の形成は、LC-MS/MS分析およびNMR分析によって確認した。

＜コハク酸ブデソニドの合成＞
1 mlの無水ピリジン中に100 mg のブデソニド(0.2322 mmol)を溶解させた。この溶液に、116 mgの無水コハク酸(1.16 mmol)を加えた（図１）。反応混合物は、室温で18時間攪拌した。TLCにより、生成物が少量形成されていることが示された。その後、反応物の温度を50 ℃まで上げ、さらに6時間攪拌した。TLCおよびLC-MS/MSによって、生成物の形成が示された。反応混合物は、氷浴中に置かれたビーカー内の2g の氷 + 2 ml の水 + 1ml の HClの中に滴下して加えた。沈殿した生成物を吸引濾過によって回収した。得られた固体は、デシケーター中減圧下で一晩乾燥させた。生成物の形成は、LC-MS/MS分析およびNMR分析によって確認した。

＜プロドラッグの溶解度の測定＞
コハク酸ブデソニドの溶解度は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS; pH 7.4)中25 ℃で、プロドラッグを1 mg/mlの濃度で添加した後、測定した。24時間経った後、懸濁液は、accuSpin Micro17 (Fisher Scientific, USA)を用いて、15,000 rpmで15 分間、4 ℃にて遠心分離した。0.2 μmのフィルターを用いた濾過の後、上清中のプロドラッグの濃度は、LC-MS/MSを用いて測定した。

コハク酸ブデソニドの溶解度は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS; pH 7.4)中25 ℃で、プロドラッグを1 mg/mlの濃度で添加した後、測定した。24時間経った後、懸濁液は、accuSpin Micro17 (Fisher Scientific, USA)を用いて、15,000 rpmで15 分間、4 ℃にて遠心分離した。0.2 μmのフィルターを用いた濾過の後、上清中のプロドラッグの濃度は、LC-MS/MSを用いて測定した。

＜ウシの眼からの組織の分離＞
すべての実験において、摘出されたばかりのウシの眼が用いられた。強膜および脈絡膜-RPE (CRPE)の分離のために(28)、前眼部は、角膜縁の下で縁を切り取ることにより除去した。眼は、幾何学的軸（前軸（角膜中心）と後軸（強膜カーブの中心）とを結ぶ線）に沿って２つに切り分け、硝子体を除去した。網膜神経は、アイカップ（eyecup）を等張アッセイバッファー（pH 7.4）に暴露することによって除去した。残った強膜-脈絡膜-RPE (CRPE)の水平方向領域（Equatorial region）は、SCRPE輸送実験に用いた。

＜ブデソニド／ブデソニドのプロドラッグのin vitro経強膜輸送＞
ウシの強膜および強膜-脈絡膜-RPE輸送の実験は、前述したようにして実施された(28-30)。組織単離手順および輸送実験の全体を通して、下記の組成：NaCl (122 mM)、NaHCO₃ (25mM)、MgSO₄ (1.2 mM)、K₂HPO₄(0.4 mM)、CaCl₂(1.4 mM)、HEPES (10mM)、およびグルコース(10 mM)を有する等張アッセイバッファー（pH 7.4）を用いた。AからBへの輸送実験について、および逆にBからAへの輸送実験について、変更して用いるチャンバーに組織を載せた後、上強膜側に面するチャンバーは、ドナー溶液(1.5 ml の 0.05 mM 薬物/プロドラッグ)で満たし、レシーバー チャンバーは、アッセイバッファー(pH 7.4)で満たした。AからBへのコハク酸ブデソニドの輸送実験において、 p-アミノ馬尿酸(0.5 mM)を加えた。輸送実験は、6時間、37 ℃で、95% の空気と5% のCO₂ とを通気しながら実施した。特定の時間間隔で、レシーバー側から、200マイクロリットルのサンプルが回収され、新しいバッファーが補充された。レシーバー サンプルおよびドナー サンプル中の薬物／プロドラッグの含量は、LC-MS/MS法を用いて分析した。

＜薬物動態モデルの開発＞
薬物動態モデルは、コハク酸ブデソニドの輸送実験について３セット：AからBへ (強膜からRPEへ, 図3A)、AからBへ + MCT 阻害剤 (強膜からRPEへ, 図4A)、およびBからAへ (RPEから強膜へ, 図5A)が開発された。モデルは、そのモデルが、ドナー側からレシーバー側へのプロドラッグの輸送；輸送実験期間に亘る、ドナー チャンバーにおいて形成された親薬物のレシーバー側への輸送；プロドラッグ／薬物の組織中への損失；およびレシーバー側からドナー側への任意の逆輸送を説明するように開発された。親薬物およびプロドラッグについての輸送速度定数は、累積％輸送の値から算出された。プロドラッグから親薬物への変換についての速度定数は、形成されるプロドラッグと親薬物との割合から算出された。6時間の輸送実験の後ドナー側とレシーバー側とで観測される薬物量を用いて、モデルを実行した。最終的な最適モデルは、DAMPING-GAUSS/SIMPLEX適合アルゴリズム、Fehlberg RFK 45数値積分法、ならびにプロドラッグおよび親薬物の輸送についての重み付けのための等加重（equal weights for weighting of prodrug as well as parent drug transport）によって実行された。

＜結果＞
精製した生成物の最終収率は、〜 50 %であった（図１）。硫酸ブデソニドの形成は、LC-MS/MS (-Q1: m/z = 509)、および¹HNMR（D₂O, 硫酸基の導入後、C 21に結合する２つのプロトンが0.5 ppm低磁場シフト）によってチェックした。同様に、コハク酸ブデソニドの形成もまた、LC-MS/MS (-Q1: m/z = 429)、および¹HNMR（CDCl₃, 化学シフト値 (δ, ppm)は下記の通り: 0.960 (s, 3H), 1.5 (s, 3H), 2.9 (t, 4H, コハク酸のプロトン), 6.0 (s, 1H), 6.31 (d, 1H), 7.1 (d, 1H)）によって確認した。

コハク酸ブデソニドの溶解度は、25 ℃でリン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)中51 ± 3 μg/mlであることが分かった。

硫酸ブデソニド(1%)およびコハク酸ブデソニド(1.5%)のin vitro経強膜輸送は、著しくは異なっていなかった（図２）。しかしながら、ウシの強膜-脈絡膜-RPEにおいて強膜からRPEへの方向へのコハク酸ブデソニドの輸送は、ブデソニド(0.2 %)の輸送よりも著しく(p < 0.05)高かった。コハク酸ブデソニドについて観測される、より高い累積％輸送に基づいて、本発明者らは、このプロドラッグを本発明者らのさらなる研究のために選択した。著しい差異は観測されなかったものの、強膜からRPEへの方向へのこのプロドラッグの輸送は、モノカルボン酸輸送阻害剤の存在下で1%に減少した。別の重要な観測事項は、コハク酸ブデソニドの輸送が、RPEから強膜への方向(0.5 %)と比較して、強膜からRPEへの方向において著しく高かった(1.5 %)ことである。

図３、図４、および図５では、一連の実験中のドナー チャンバーおよびレシーバー チャンバーにおいて、予測されるモデルと、実測されるコハク酸ブデソニドおよびブデソニドの薬物量とが比較される。結果は、AからBへの方向、AからBへの方向 + MCT 阻害剤、およびBからAへの方向における輸送実験から観測されるプロドラッグならびに親薬物の薬物量を含む、同時モデル実行から得られる３つの別個の図において、示されている。20回実行した後の最適モデルでは、AIC 値が-33.65、R²が0.999、%CVが≦25 %であった。

実施例１．２
＜方法＞
すべての動物は、眼科と視覚に関する研究における動物の使用に関するARVO指針に従って取り扱われた。ブデソニドおよびコハク酸ブデソニド(BSA, ブデソニドの単一プロドラッグ)の懸濁液をex vivo実験に用いた。懸濁化剤として濃度0.5 % w/vのカルボキシメチル セルロース ナトリウム塩(低粘度, 50-200 cP; Sigma-Aldrich, Cat# C5678)の存在下で、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)中1 mg/mlの懸濁液を作製した。薬物懸濁液は振盪した後、後眼部の結膜下へとそれぞれ注入した。ラットは２つの群に分けた。
群１-ブデソニド：動物は、350 μlのペントバルビタール(250 mg/Kg)を腹腔内注入することにより安楽死させた。25マイクロリットルのブデソニド懸濁液は、それぞれの動物の一方の眼において後眼部の結膜下空間に、30 G針を用いて注入し、もう一方の眼は処置しなかった。1時間経った後、眼を摘出し、ドライアイス／イソペンタン浴にてすぐに凍らせた。すべてのサンプルは、LCMS/MS分析をするまで-80 ℃で保管した。
群２-コハク酸ブデソニド(BSA)：動物は、上述したようにして安楽死させた。安楽死させた直後、30 G針を用いて後眼部の結膜下に注入することにより、動物の一方の眼に25マイクロリットルのコハク酸ブデソニド懸濁液(1 mg/ml)を投与し、もう一方の眼は処置しなかった。1時間経った後、眼を摘出し、分析するまで、上述したのと同様の方法で凍らせた。眼周囲組織サンプルもまた、実験の最後に両方の群から採取した。強膜、脈絡膜-RPE、網膜、および硝子体を含む異なる眼組織を分離し、薬物レベルを分析した。

＜結果＞
ブデソニド（群１）について、強膜、CRPE、網膜、および硝子体におけるex vivo薬物レベルは、2.4、3.0、1.0、および0.3 μg/g 組織であった。コハク酸ブデソニド（群２）について、強膜、CRPE、網膜、および硝子体におけるex vivo薬物レベルは、1.9、0.6、0.2、および0.05 μg/g 組織であった。コハク酸ブデソニド（群２）から放出されるブデソニドについて、上記の組織におけるex vivo薬物レベルは、11.0、7.2、2.2、および0.5 μg/g 組織であった。全般的に見て、強膜、脈絡膜-RPE、および網膜におけるブデソニドの送達は、純粋な薬物ブデソニド（群１）と比較して、プロドラッグのコハク酸ブデソニド（群２）を用いた場合に2〜5倍多かった。結果は、図６および図７に示されている。

実施例２
＜材料および方法＞
セレコキシブは、Spectrum chemical and laboratory products (New Brunswick, NJ, USA)から購入した。セレコキシブ スクシンアミド酸（C-SA、セレコキシブの単一プロドラッグ）およびセレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリン（C-SA-T、セレコキシブの二重プロドラッグ）は、実験室で合成された。無水コハク酸、ジメチルアミノ ピリジン、トリエチルアミン、カルボニル ジイミダゾール、N,N-ジメチルホルムアミド(無水)、テトラヒドロフラン(無水)、タウリン、天然メラニン(Sepia officinalisから単離)、トリトン-X、およびEDTAは、Sigma Aldrich (St. Louis. MO, USA)から購入した。クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、メタノール、およびアセトンなどの試薬等級の有機溶媒はすべて、ACROS ORGANICS (New Jersey, USA)から購入した。PBS（pH 7.4）は、すべての力価検定およびin vitro/in vivo実験についてベヒクルとして用いた。摘出されたばかりのウシの眼は、G & C Meat Company, Colorado Springs, CO, USAから購入した。オスのBrown-Norway(BN; 着色(pigmented))ラット（体重150〜200g）は、Charles River Laboratories, Wilmington, DE, USAから購入した。

＜セレコキシブ スクシンアミド酸のプロドラッグ（C-SA）の合成＞
セレコキシブ(2.62 mmol)は、アルゴン雰囲気下において無水THFに溶解させた。DMAP および TEA (それぞれ3.15 mmol)は、攪拌しながら加えた。5〜10分後、無水コハク酸(3.15 mmol)を加え、反応混合物を室温で一晩(16-18 h)攪拌し、その後5〜6時間還流させた（図８）。24時間経った後、生成物についてTLCスポットの強度のさらなる増加は見られず、反応を停止させた。有機層を回収し、回転式エバポレーターで濃縮して粘性物質を得た。この粘性物質は、最小量のジクロロメタンに溶解させ、等量の水を用いて１回洗浄した。有機層中の最終生成物は、カラムクロマトグラフィーによって精製した。シリカゲル60 (Geduran, 粒径 40〜63 μm, EMD Chemicals)を固定相として、ジクロロメタン/メタノールを移動相として、それぞれ用いた。

＜セレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリンのプロドラッグ（C-SA-T）の合成＞
この合成は、図８に示されるように、C-SAプロドラッグから出発して２つの工程である。セレコキシブ スクシンアミド酸(1 mmol)の末端カルボン酸官能基はまず、カルボニルジイミダゾール(CDI)を用いて活性化され、その後、触媒としてのトリエチルアミンの存在下でタウリンと反応させた。1 mmolのC-SAを無水ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させ、無水DMF中に溶解させたCDI (1.5 mmol)を0 ℃で1時間に亘って滴下により加えた。反応混合物は、0 ℃でさらに1時間攪拌した。最小量の水に懸濁させたタウリン(2 mmol)は、トリエチルアミン(2 mmol)と共に、上記の反応混合物に滴下により加え、室温で24時間攪拌した。反応混合物は、高減圧下で濃縮した。得られた固体の混合物は、ジクロロメタン-アセトニトリル-水(90:5:5)に溶解させ、CSAについて上記において実施したようにカラムクロマトグラフィーを行って、精製された生成物を得た。

＜ウシの角膜、結膜、および強膜-脈絡膜-RPEにおけるin vitro輸送＞
地元の屠畜場から入手した、摘出されたばかりのウシの眼が、すべてのin vitro輸送実験に用いられた。まず、眼の周囲一帯にある脂肪組織および接着組織を除去した。その後、角膜および結膜を除去した。胸膜および脈絡膜-RPE(CRPE)の分離のために、前眼部は、角膜縁の下で縁を切り取ることにより除去した。眼は、幾何学的軸（前軸（角膜中心）と後軸（強膜カーブの中心）とを結ぶ線）に沿って２つに切り分け、硝子体を除去した。網膜神経は、アイカップを等張アッセイバッファー（pH 7.4）に暴露することによって除去した。残った強膜-脈絡膜-RPE (CRPE)の水平方向領域（Equatorial region）は、SCRPE輸送実験に用いた。セレコキシブについてのすべての輸送実験は、5 % HP-β-CDの存在下で実施した。C-SA-Tの輸送もまた、SCRPEにおいてBからAへの方向にて実施した。薬物溶液は下記の方法で調製した。セレコキシブをHP-β-CDと共に乳棒／乳鉢にて粉砕し、アッセイバッファーを加えることにより、5 % HP-β-CD存在下のセレコキシブ(100 μg/ml)が作製された。この混合物を24時間攪拌した。使用する前に、清澄な溶液は、0.2 μフィルターを用いて濾過した。C-SAおよびC-SA-T (100 μg/ml)のプロドラッグ溶液は、実験開始の直前に作製され、その後0.2 μフィルターを用いて濾過した。すべての輸送実験は、37 ℃で6時間実施した。サンプルは、一定の時間間隔でレシーバー側から回収し、新しいアッセイバッファー(pH 7.4)で置換した。すべての溶質を用いた輸送実験は、外側から内側へ（例えば、強膜から脈絡膜-RPEへ）の溶質の移動が測定されることを意味するAからBへの方向で実施された。C-SA-Tの輸送は、内側から外側へ（例えば、脈絡膜-RPEから強膜へ）のこの溶質の移動が測定されることを意味するBからAへの方向でもまた実施された。すべての輸送実験から得られたサンプルは、LC-MS/MSで分析した。

＜メラニン結合を推定するための等温滴定熱量測定＞
下記のパラメーターが、ITC滴定においてセレコキシブ/C-SAのメラニン結合を算出するために用いられた。
メラニン = 1 mg/ml 懸濁液（PBS (pH 7.4)中）、
セレコキシブ= 2 μg/ml（PBS (pH 7.4)中）、および
CSA = 250 μg/ml（PBS (pH 7.4)中）、
60回注入（1回あたり5 μl）、
注入時間= 10.3 sec、
２つの連続する注入の間隔= 300 sec、
攪拌速度 = 595 rpm、
温度 = 37℃。
すべてのサンプルは、ITC注入の前にガス抜きした。希釈熱を算出するために、celecoxib/C-SAは、同じ注入パラメーターを用いてPBSに対して滴定した。

＜オスBrown Norway (BN)ラットにおけるセレコキシブ/C-SA/C-SA-T点眼剤のin vivo送達の評価＞
セレコキシブの2 mg/ml 懸濁液、C-SAおよびC-SA-Tの2 mg/ml溶液、C-SA-Tの10 mg/ml 溶液をPBS（pH 7.4）にて作製した。セレコキシブ (眼の個数n = 6; 動物3匹)、C-SAおよびC-SA-T (眼の個数n = 8; 動物4匹)の点眼剤10 μlを、それぞれのBNラットの両眼に投与した。1時間経過後、動物は安楽死させ、眼を摘出した。眼周囲組織および血漿のサンプルを採取した。

サンプルの加工処理：アセトニトリル沈殿法が、組織からの薬物抽出に用いられた。簡潔に言うと、各点眼実験から得られる眼は、組織単離のために切り取った。組織は、内部標準として500 ng/mlの濃度で(1000 ng/ml のストック溶液を作製した)インドプロフェンを含む250 μlの水(pH 7.4；5 mMの酢酸アンモニウムで調整)中にてホモジナイズした。同量のアセトニトリルを加え、30分間ボルテックス攪拌により充分に混合した。サンプルを15,000 rpmで30分間、遠心分離した。上清を回収してLC-MS/MS分析を行った。

＜LC-MS/MS法＞
質量分析パラメーター：セレコキシブ、C-SA、C-SA-T、およびインドプロフェン（内部標準）の質量分析パラメーターは、陰イオン化モードで、シリンジ注入方式によって1.0 μg/mL溶液を液体クロマトグラフィー タンデム 質量分析機器(API 3000; PE SCIEX, Concord, Ontario, Canada)に注入することにより、最適化した。すべての分析物は、多重反応監視(MRM)方式（セレコキシブ 380/316、C-SA 480/380、C-SA-T 587/206、およびインドプロフェン 280/236）でモニターした。
LCパラメーター：Zorbax SB C18 (3.5 μm, 2.1 × 100 mm) のカラム；5 mM ギ酸アンモニウム(pH 6.8, 移動相 A)、およびアセトニトリル(移動相 B)を移動相として用い、勾配溶出方式で；流速0.4 ml/min、カラム温度25℃。総溶出時間は5.5 分間であった。

＜ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデルにおけるC-SAおよびC-SA-Tの点眼剤の有効性評価＞
糖尿病の誘導：体重175〜225 gのBNラットは、任意の実験手順の前に少なくとも２日間馴化させた。一晩の絶食（12〜16時間）の後、10 mM クエン酸緩衝液(pH 4.5)中30 mg/mlのストレプトゾトシンの溶液を腹腔内投与(60 mg/kg 体重)して、糖尿病を誘発した。ストレプトゾトシン注入の3〜4時間後、動物には通常の食餌を与え、ストレプトゾトシン注入の24時間後、血液サンプル(5〜10 μl)を尾の静脈から採取した。動物の血中グルコースレベルは、グルコースモニター(One Touch; Life Scan Inc., Milpitas, CA)を用いて測定した。血中グルコースレベルが250 mg/dL超の動物は、糖尿病であると見なされた。動物は4群に分けられた。群1: 正常 (N = 12)、群2: 糖尿病 + ベヒクル (N = 12)、群3: 糖尿病 + 0.2 % w/v C-SA 点眼剤 (N = 12)、および群4: 糖尿病 + 1.0 % w/v C-SA-T 点眼剤 (N = 12)。処置は、糖尿病誘導の直後に開始した。群2、群3、および群4においては、それぞれの処置を1日2回60日間、両目に投与した。群2〜4の動物は、2ヶ月経過後に屠殺した。群1の正常な動物は、動物収容施設における馴化の直後に屠殺した。3つのアッセイ、すなわちFITC-デキストラン漏出、硝子体と血漿とのタンパク質比、および白血球停滞のそれぞれについて、本発明者らは、上述の4つの群のそれぞれから4匹の動物を用いた。

＜血液網膜関門漏出＞
網膜FITC-デキストラン漏出：各群からのBNラットが、FITC-デキストラン漏出の評価に用いられた。61日目の最後の投与の1時間後、ラットはFITC-デキストラン漏出アッセイのために屠殺した。アッセイおよび組織サンプリング手順の簡単なプロトコルは、下記に説明される。まず、動物にケタミン (80 mg/kg)およびキシラジン(12 mg/kg)を腹腔内投与することにより麻酔をかけた。その後、FITC-デキストラン（分子量4.4 kDa）の50 mg/ml PBS (pH 7.4)溶液を、尾静脈から静脈内投与(50 mg/kg 体重)した。動物は、尾静脈からの投与の10分後（FITC-デキストランの循環時間）、150 mg/kgのペントバルビタール ナトリウム塩を用いて安楽死させた。血液サンプル(0.5〜1 ml)は、心臓から、50 μlのEDTAを含む2 ml エッペンドルフ チューブ(SureLock Microcentrifuge Tubes, LIGHTLABS, USA)中に採取した。胸腔を開いた。動物は、50 mlシリンジに連結された20G針が左心室に挿入された後6〜7分間、PBS (500 ml/kg 体重)を用いて灌流させた。眼を摘出し、イソペンタン-ドライアイス浴を用いて眼を直ちに急速凍結した後、-80℃で保管した。それぞれの眼の網膜を分離し、重量測定して、500 μlのPBS (pH 7.4)中でホモジナイズした。ホモジナイズした後、2% Triton X-100を含む500 μlのPBSをホモジネートに加えた。混合物を室温で1時間ボルテックス攪拌した。ホモジネートを15000 rpm (21,130 g) で20分間遠心分離し、上清を回収した。1 mlの上清中のFITC-デキストラン相対蛍光単位は、蛍光分光計（励起波長483 nm、発光波長538 nmに設定）を用いて測定した。各サンプルの読み取り値から差し引くために、ブランクPBSの蛍光もまた測定した。FITC-デキストランの終濃度は、μg/g組織として表される。標準曲線は、既知の量のFITC-デキストラン(5 ng/ml〜5 μg/ml)を用いて作製された。20 μl (〜20 mg)の血漿は、標準サンプルの線形範囲下での定量のために、PBS を用いて1 mlに希釈(50 倍希釈) した。希釈率は、血液サンプル1マイクロリットル当たりのFITC-デキストランを推定するために、考慮された。眼組織へのFITC-デキストラン漏出の量は、希釈率について補正した後、下記の式を用い、算出した。

硝子体と血漿とのタンパク質比：各群からのBNラットが、硝子体と血漿とのタンパク質比の評価に用いられた。61日目の最後の投与の1時間後、ラットはタンパク質比を測定するために屠殺した。ラットは、150 mg/kgのペントバルビタール ナトリウム塩を腹腔内投与して安楽死させた。眼を摘出し、イソペンタン-ドライアイス浴を用いて眼を直ちに急速凍結した後、-80℃で保管した。血液サンプル(0.5〜1 ml)は、心臓に穿刺した後、心臓から、50 μlのEDTAを含む2 ml エッペンドルフ チューブ(SureLock Microcentrifuge Tubes, LIGHTLABS, USA)中に採取した。上述のサンプルを15,000 g、4℃で15分間遠心分離し、上清中の血漿を回収した。血漿サンプルは-80℃で保管した。網膜および硝子体を含む眼組織をそれぞれの眼から分離し、重量測定した。硝子体は、液化させた。硝子体サンプルは、を15,000 g、4℃で20分間遠心分離した。硝子体の上清を新しいエッペンドルフ チューブ中に採取し(20 μl)、重量測定した（重量範囲= 19〜21 mg）。上清（20 μl）は、PBS (pH 7.4)を用いて1 mlに希釈(50 倍希釈) した。100マイクロリットルの上記希釈物質は、1 ml の Bradford試薬と混合した。上記1 ml体積の吸光度を595 nmで測定した。血漿サンプルもまた、PBS (pH 7.4)を用いて1 mlに希釈(50 倍希釈) した。100マイクロリットルの上記希釈物質は、1 ml の Bradford試薬と混合した。上記1 ml体積の吸光度を595 nmで測定した。標準曲線は、既知の濃度のウシ血清アルブミン(25〜500 μg/ml のPBS溶液, pH 7.4)を用いて作製した。100マイクロリットルのそれぞれの標準物質は、1 ml の Bradford試薬と混合した。血漿および硝子体中のタンパク質の量は、希釈率について補正した後、標準曲線から推定した。

＜網膜の白血球停滞＞
各群からのBNラットが、接着性の白血球の評価に用いられた。61日目の最後の投与の1時間後、ラットは、ex vivo網膜白血球停滞アッセイのために屠殺した。まず、動物にケタミン (80 mg/kg)およびキシラジン(12 mg/kg)を腹腔内投与することにより麻酔をかけた。その後、胸腔を注意深く開き、動物は、50 mlシリンジに連結された20G針が左心室に挿入された後6〜7分間、PBS (250 ml/kg 体重)を用いて灌流させた。動物はその後、FITC-コンジュゲート コンカナバリン A レクチン (5 mg/kg, 〜 33 ml)の40 μg/ml PBS (pH 7.4) 溶液を用いて灌流させ、接着性白血球と血管内皮細胞を標識した。動物は再度、上述したように同量のPBSを用いて灌流させ、非結合レクチンを除去した。眼を摘出し、2% パラホルムアルデヒドで2 時間固定した。網膜を注意深く除去して、フラットマウント標本を作製した。蛍光分光計(Digital Eclipse C1; Nikon Inc., Melville, NY) にて青色光の下(Ex 465-495, DM 505, BA 515-555)、20×対物レンズを用いて、血管壁に付着した白血球の数を計数した。この数を、処置ラットと未処置ラットとの間で比較した。

＜統計解析＞
この研究におけるすべてのデータは、平均値± S.D.として表される。2つの群の間の比較は、スチューデントt-検定によって行われ、多群間の比較は、一元配置ANOVAを用い、その後Tukey post hoc検定を用いて行った。統計的有意差はp ≦0.05に設定した。

＜結果＞
＜セレコキシブ-スクシンアミド酸（C-SA）およびセレコキシブ-スクシンアミド酸-タウリン（C-SA-T）のプロドラッグの合成および特徴解析＞
C-SA（セレコキシブの単一アミドプロドラッグ）の総収率は、75〜80 %であった。C-SAの構造は、¹HNMR および MS (TOF, ES)のスペクトルデータから確認された。
¹HNMR (CDCl₃) δ 2.3 (s, 3H), 2.5 (t, 2H), 2.7 (t, 2H), 6.8 (s, 1H), 7.0 (d, 2H), 7.2 (d, 2H), 7.4 (d, 2H), 7.8 (d, 2H), 9.9 (s, 1H). MS (TOF, ES) (m/z) 479.97, 379.99.
C-SA-T（セレコキシブの二重アミドプロドラッグ）の総収率は、55〜60 %であった。C-SA-Tの構造は、¹HNMR および MS (TOF, ES) のスペクトルデータから確認された。
¹HNMR (CDCl₃) δ 2.3 (s, 3H), 2.5 (t, 2H), 2.7 (t, 2H), 3.6 (t, 2H), 3.7 (t, 2H), 6.8 (s, 1H), 7.0 (d, 2H), 7.2 (d, 2H), 7.4 (d, 2H), 7.8 (d, 2H), 9.9 (s, 2H). MS (TOF, ES) (m/z) 587.04, 480.01, 380.04.

＜ウシの角膜、結膜、および強膜-脈絡膜RPEにおけるin vitro輸送＞
ウシの角膜における、6時間経過時のセレコキシブ(5 % HP-β-CD)、C-SAおよびC-SA-Tの累積％輸送（図９）は、それぞれ0.017、0.177、および0.441%であった。C-SAおよびC-SA-Tの輸送は、セレコキシブの輸送と比較して、それぞれ約10倍および約25倍の高さであることが分かった。ウシの結膜における、セレコキシブ(5 % HP-β-CD)、C-SAおよびC-SA-Tの輸送は、それぞれ3.9、8.4、および15.6 %であった。C-SAおよびC-SA-Tの輸送は、セレコキシブの輸送と比較して、それぞれ約2倍および約4倍の高さであることが分かった。ウシの強膜-脈絡膜RPEにおける、セレコキシブ(5 % HP-β-CD)、C-SAおよびC-SA-Tの輸送は、それぞれ約0.1、1.0、および2.0 %であった。C-SAおよびC-SA-Tの輸送は、セレコキシブの輸送と比較して、それぞれ約10倍および約20倍の高さであることが分かった。阻害剤としてのタウリンの効果は、角膜およびSCRPEにおけるC-SA-T輸送が> 50 %減少したことに見られる。

＜等温滴定熱量測定を用いるメラニン結合の推定＞
図10A〜Cは、セレコキシブ、C-SA、およびC-SA-Tと、天然メラニンとのメラニン結合を示す。セレコキシブとメラニンとの結合／会合定数の値は、1.01 × 10⁶ M^-1であることが分かった。一方、C-SAおよびC-SA-Tとメラニンとの結合について同様の値は、それぞれ8.89 × 10³ M^-1および7.39 × 10³ M^-1であり、これは、セレコキシブのメラニンとの結合親和性と比較して110〜130倍低いことが分かった。さらに、本発明者らは、本発明者らの結合実験のために、セレコキシブの濃度と比較して125倍高い濃度のC-SAを用いた。プロドラッグを作製する際には、わずかに塩基性で正に帯電した、セレコキシブのスルホンアミド基が、酸性／負に帯電したスクシンアミド酸へと変換された。一般的には、酸性／負に帯電した基は、塩基性／正に帯電した基と比較して、メラニンとはより結合しないと考えられる。

＜褐色Norway ラットにおける点眼剤としてのセレコキシブ/CSA のin vivo送達＞
角膜におけるセレコキシブのレベルは、CSAのレベルよりも高く、これは、セレコキシブが高親油性であるという性質に因るものであり得る。別の重要な因子は、セレコキシブ懸濁液の粘性であり得、これは、CSAの粘度よりもずっと高いことが観測された。同様に、虹彩およびCRPEにおけるセレコキシブのレベルは、CSAのレベルよりも高く、これはおそらく、これらの組織が高度に着色されているという性質に因る。しかしながら、眼周囲空間におけるセレコキシブのレベルは、CSAのレベルよりも低いことが観測された。角膜、虹彩、およびCRPE以外の他の組織すべてにおいて、CSAのレベルは、セレコキシブのレベルよりも高かった。網膜への送達は、CSAを用いた場合に、セレコキシブを用いた場合と比較して、ほぼ2倍であった。C-SA-Tプロドラッグを用いた場合のセレコキシブのレベルは、親薬物を用いた場合と比較して、すべての組織においてより高かった。局所投与後における0.2 % w/v および 1 % w/vの C-SA-Tを用いた網膜送達の増加は、セレコキシブの場合と比較して、それぞれ約10倍および20倍であることが分かった。

＜ストレプトゾトシン誘導糖尿病性網膜症ラットモデルにおけるC-SA およびC-SA-Tの点眼剤の有効性評価＞
血液網膜関門漏出は、網膜FITC-デキストラン漏出、および硝子体と血漿とのタンパク質比によって評価した。図１３Ａに示されるように、２ヶ月経過後、正常の動物(平均値 ± s.d. = 22.83 ± 7.21 μl/g/min)と比較して、ベヒクル(PBS, pH 7.4)で処置された糖尿病の動物は、ほぼ４倍の高さの網膜関門漏出(平均値 ± s.d. = 97.80 ± 34.59 μl/g/min)を呈した。0.2 % w/v C-SA溶液で処置された動物は、漏出の有意な低下は何も示さなかった(平均値 ± s.d. = 93.66 ± 37.08 μl/g/min)。一方、セレコキシブの二重プロドラッグ(C-SA-T, 1.0 % w/v 溶液)で処置された動物は、漏出の有意な低下を示した(平均値 ± s.d. = 23.64 ± 4.20 μl/g/min)。C-SA-Tは、正常な動物において評価されたレベル近くまで、漏出レベルを低下させることができた。

＜硝子体と血漿とのタンパク質比＞
図１３Ｂに示されるように、正常な動物では、硝子体と血漿とのタンパク質比が平均0.14 ± 0.03であることが示され、一方、糖尿病の動物では、硝子体と血漿とのタンパク質比が平均0.54 ± 0.10であり、正常な動物の場合の約4倍の高さであった。0.2 % w/v C-SA溶液で処置された動物では、硝子体と血漿とのタンパク質比が平均0.49 ± 0.11であり、これは、糖尿病の動物と比較して有意には異ならなかった。一方、1.0 % w/v C-SA-T溶液で処置された動物では、硝子体と血漿とのタンパク質比が平均0.28 ± 0.06であり、純粋なベヒクルで処置された糖尿病の動物と比較して、有意に低かった。様々な動物群のうちの硝子体と血漿とのタンパク質比の順番は、糖尿病 ≧糖尿病 + 0.2 % w/v C-SA 処置 ＞ 糖尿病 + 1.0 % w/v C-SA-T 処置 ≧正常 (スチューデント t-検定, p値 < 0.001)であった。

＜網膜の白血球停滞＞
網膜血管への白血球の付着は、病気の進行を示す別のマーカーである。白血球の数は、すべての動物群について、蛍光分光計でモニターした。正常、糖尿病+ ベヒクル、糖尿病 + 0.2 % w/v C-SA、および糖尿病+ 1.0 % w/v C-SA-T の各群における網膜白血球の平均数は、それぞれ32 ± 7、114 ± 19、95 ± 12、および47 ± 10であり、この結果は、セレコキシブの二重プロドラッグ(C-SA-T)が、糖尿病性網膜症における網膜白血球を減少させるのに有効であることを明確に示した。様々な動物群のうちの網膜白血球についての順番は、糖尿病 ≧糖尿病+ 0.2 % w/v C-SA 処置 ＞糖尿病+ 1.0 % w/v C-SA-T処置 ≧正常(スチューデント t-検定, p値 < 0.001)であった。図１３Ｃを参照されたい。

実施例３
純粋なポリマーPLGAマイクロスフェアおよびPLAナノスフェアは、従来のエマルション溶媒蒸発法を用いて作製した。純PLGAマイクロスフェアは、100 mg のポリマーを1 ml の DCM中に溶解させ、その後、10,000 rpmで1分間ホモジナイズしながら(Virtishear Cyclone（登録商標）,USA)、10 mlの2% ポリビニルアルコール水溶液中にポリマー溶液を分散させた。調製したO/Wエマルションは、Virtishear Cyclone（登録商標）ホモジナイザーを用いて15000 rpm で5分間ホモジナイズしながら、100 mlの2% ポリビニルアルコール水溶液中にさらに移した。その後、3時間室温で攪拌することにより、有機溶媒を2% ポリビニルアルコール水溶液から蒸発させた。次に、マイクロスフェアは、12000 rpmで15分間 4℃で遠心分離(Beckman, USA)することにより分離した。マイクロスフェアのペレットは、50 mlの蒸留水に懸濁させ、24時間凍結乾燥(Lanconco Triad, USA)させて、乾燥マイクロスフェアを得た。純PLAナノスフェアは、100 mg のポリマーを1 ml の DCM中に溶解させ、200 μlの水をポリマー溶液中に分散させ、氷上で出力レベル10 Wにて1分間超音波処理(Misonix Inc., USA)して、一次エマルションを調製した。これをその後、50 mlの2% ポリビニルアルコール水溶液中に分散させ、30 Wで5分間超音波処理した。次に、PLAナノスフェアを回収し、上述したのと同様の手順で凍結乾燥させた。

実施例４
超臨界流体圧力焼入技術（Supercritical fluid pressure quench technology）が、ブランクPLGAマイクロスフェアの膨張および多孔化に用いられ、その後ベバシズマブを多孔性マイクロスフェア中に装填した。簡潔に言うと、50 mg の純PLGAマイクロスフェアを高圧の容器に入れ、圧力1150〜1200 psi、温度33℃で30分間、SC CO₂に暴露した。SC CO₂への暴露が完了した後、圧力を1分間に亘って開放し、粒子を回収した。次に、ベバシズマブは、2.5 mg に相当する100 μlのベバシズマブ溶液を30分間インキュベーションし、一晩凍結乾燥させることにより、細孔内に装填した。ベバシズマブのin vitro放出をPBS pH 7.4中で実施し、ベバシズマブ含量は、マイクロBCAアッセイを用いて推定された（図１４）。

実施例５
別のアプローチでは、ベバシズマブは、凍結乾燥によって100 μl中2.5 mg のベバシズマブを50 mgの純PLGAマイクロスフェアにまずコーティングし、その後、実施例4において説明されるように超臨界CO₂に暴露することにより、PLGAマイクロスフェア中に封入した。ベバシズマブのin vitro放出をPBS pH 7.4中で実施し、ベバシズマブ含量は、マイクロBCAアッセイを用いて推定された（図１５）。

実施例６
ベバシズマブの放出を徐放性とするための、多孔性マイクロスフェア中ナノスフェア(NPinPMP)を調製するために、新規の超臨界注入および圧力焼入技術を開発した。この技術において、純PLAナノスフェアは、凍結乾燥によりベバシズマブでコーティングされ、純PLGAマイクロスフェアとさらに混合し、超臨界CO₂に暴露した。簡潔に言うと、100 μlのベバシズマブ溶液(2.5 mg)を50 mgのPLAナノスフェアに加え、4℃で30分間インキュベーションし、一晩凍結乾燥させた(B-PLA NP)。その後、ベバシズマブでコーティングされたPLAナノスフェアを純PLGAマイクロスフェアと混合し、高圧の容器中に置いた。粒子は、圧力1150〜1200 psi、温度33℃で30分間、SC CO₂に暴露した。SC CO₂に暴露した後、圧力を1分間に亘って開放し、粒子を回収した。ベバシズマブのin vitro放出をPBS pH 7.4中で実施し、ベバシズマブ含量は、マイクロBCAアッセイを用いて推定された（図１６）。ベバシズマブの活性は、ELISA法によって測定した。in vitro放出実験におけるベバシズマブの立体配座安定性および構造安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー、円偏光二色性分光、およびゲル電気泳動によって評価した。ベバシズマブのin vivo送達は、ラットモデルにおける硝子体内注入の後、非侵襲的にモニターした。

＜放出サンプルにおけるベバシズマブの活性＞
NPinPMPから放出されるベバシズマブの活性は、サンドイッチELISA法によって評価した。ELISAプレート(BD life sciences, USA)は、50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）中0.1 μg/ml VEGF-165 を100 μl用いてコーティングし、一晩4℃でインキュベーションした。一晩のインキュベーションの後、プレートは緩衝液で3回洗浄し、ブロッティングし、風乾させた。その後、300 μlのブロッキング溶液(PBS pH 7.4中0.5% BSA & 0.05% Tween 20)を各ウェルに加え、暗所で1時間インキュベーションした。その後、プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄し、ブロッティングし、乾燥させた。ベバシズマブ標準を希釈緩衝液中に調製し(0.5から50 ng/ml)、暗所で2時間インキュベーションした。次に、100 μlの各放出サンプルをそれぞれのウェルに加えた。2時間インキュベーションした後、プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄し、ブロッティングし、乾燥させた。ヤギ抗ヒトIgG (FC)二次抗体を1 % BSA 含有TBS (トリス緩衝生理食塩水) pH 7.6-7.8中で希釈(1:10000)し、この溶液100 μlをプレートに加え、暗所で2時間インキュベーションした。インキュベーションの後、プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄し、乾燥させた。各ウェルに100 μlの TMB 基質 (3,3’,5,5”-テトラメチルベンジジン)を加え、発色するまで放置した。30分間のインキュベーションの後、50 μlのストップ溶液を加え、450 nmにおける吸光度を記録した。同様の手順により得た標準曲線は、放出サンプル中のベバシズマブの定量に用いられた。図１９に示されるように、放出されたベバシズマブは、活性であり、VEGF-165についての親和性を保持しており、これにより、放出されたベバシズマブがVEGF-165に対する結合能力を4ヶ月間保持したことが確認された。

＜サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による放出サンプル中のベバシズマブの安定性評価＞
NPinPMPから放出されたベバシズマブの可溶性凝集性物質（aggregate sand）分解生成物は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて評価した。粒径5 μmのシリカ系サイズ排除カラム(TSK（登録商標）Gel G3000SWX；サイズ 7.8 mm × 30 cm；細孔サイズ250 Å)を用いた。移動相は、0.182 M KH₂PO₄、0.018 M K₂HPO₄、および0.25 M KClの水溶液（pH 6.2）であった。移動相の流速は0.50 ml／分であった。波長210〜400nmをスキャンするUV検出器を用いて、サイズ排除カラムからの溶出物を検出した。

図２１に示されるように、放出されたベバシズマブのSECクロマトグラムの分析により、8.1分に単一の顕著な単量体ピークの存在が示された。観測された単一ピークは、ベバシズマブの物理的安定性および化学的安定性が37℃で4ヶ月の放出時間に亘って維持されたことを示唆する。

＜円偏光二色性（CD）による放出サンプル中のベバシズマブの配座安定性評価＞
SC CO₂暴露後およびin vitro放出サンプル中における、ベバシズマブの二次構造の変化は、円偏光二色性（CD）分光計(Photophysics, USA)を用いて測定された。タンパク質濃度が等量であるサンプルを、光路長1 mmの非着色石英キュベット中に採り、スペクトルを25℃にて記録した。データは、200〜260 nmの波長領域においてステップサイズ1 nmで収集した。

図２０に示されるように、未処理ベバシズマブの円偏光二色性（CD）スペクトルは、218 nmにピークを示し、これは、ベータシート様構造が高い割合で存在することを示すものであり、既知の抗体においてベータシート配座が高率で存在することと一致する。例示的なPinPから放出されたベバシズマブは、1、2、3、および4ヶ月の時点で、未処理のベバシズマブと同様のCDスペクトルを示した。観測されるスペクトルは、ベバシズマブの二次構造が、放出実験の間にそれほど変化しなかったことを示す。

＜ゲル電気泳動による放出サンプル中のベバシズマブ分解の評価＞
in vitro放出サンプルからのベバシズマブの分解および凝集は、還元および非還元の両方のゲル電気泳動によって評価した。ゲル電気泳動は、4〜20% SDS-PAGE 成形済み勾配ゲルを用いて実施した。サンプルは、10 μgのベバシズマブに相当する30 μlの各サンプルと、15 μlの2×電気泳動用色素とを採取することにより調製し、その後、5分間沸騰させた後、15000 rpmで5分間 (Beckman Avanti 30, Beckman Coulter, Inc. USA)、遠心分離した。各サンプル(40 μl)を成形済みゲルに載せ、2時間、20 mAで電気泳動させた。次に、ゲルをクマシーブリリアントブルー（Coomassie Blue）R-250で染色し、脱色し、Gel-DOC システム (Bio-Rad Laboratories, USA)で可視化した。

図２３に示されるように、SDS-PAGEデータは、4ヶ月間に亘って、放出サンプル中のベバシズマブの分解および／または凝集がなかったことを示す。

＜ラットにおけるベバシズマブのin vivo送達＞
ベバシズマブのin vivo送達は、ラットモデルにおいてNPinPMP中のAlexa Fluor 488コンジュゲート ベバシズマブを硝子体内投与した後、評価した。ラットは、ケタミン (35 mg/kg)/キシラジン (5 mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけ、ラットが麻酔状態になったら、ベタジン溶液を眼の表面に投与し、30-G針を用いて硝子体内注入を行った。ラットの眼に、Alexa- ベバシズマブ封入NPinPMP製剤(5 μl中に Alexa-ベバシズマブ1.8 μg ＋ 未標識ベバシズマブ5.4 μg；300 mg の粒子/1 ml PBS pH 7.4)、および対照としてAlexa-ベバシズマブを等濃度 (7.2 μg/5 μl)で注入した。Alexa-ベバシズマブの放出による眼球蛍光発光は、Fluorotron Master（商標）(Ocumetrics, CA, USA)を用いて、蛍光が検出限界の下限またはベースラインに到達するまで、定期的にモニターした。眼についてのベースライン蛍光値をモニターし、その後、製剤を注入した。各時点において、蛍光スキャンは3回実施し、平均値を用いた。Alexa-ベバシズマブについての異なる濃度における標準曲線は、キュベットと、ラットのレンズのためのアダプターを備える眼の蛍光分光計とを用いて、作製した。標準曲線は、蛍光分光計によって与えられる蛍光に相当する濃度を、実際のAlexa-ベバシズマブの濃度へと変換するために用いた。

Alexa-ベバシズマブ封入NPinPMP、および可溶性Alexa-ベバシズマブを硝子体内注入した後、垂直平面（axial planes）（前眼部から後眼部への方向へのデータポイントとして示される）に沿ってalexa蛍光強度分布（フルオレセインナトリウム濃度に相当する）曲線を測定することによって間接的に、眼の光軸に沿ってベバシズマブの濃度分布が測定された。蛍光スキャンにより、溶液と比較したNPinPMPからのAlexa-ベバシズマブの徐放性送達が明らかになった。Fluorotron Masterによって報告されるフルオレセインに相当する濃度は、Alexa-ベバシズマブの濃度に変換された。異なる時点における、溶液から、およびNPinPMPから放出される硝子体領域のAlexa-ベバシズマブの濃度をプロットした。標識されたベバシズマブの濃度のみが報告されている。

硝子体内注入の前に、正常な眼についてのフルオレセインのベースライン読み取り値を記録し、フルオレセインのベースライン濃度が1.78 μg/mlであることがわかった。図２４に示されるように、Alexa-ベバシズマブ溶液注入群では、Alexa-ベバシズマブの濃度が第1日において32 μg/mlであり、第15日までに2.2 μg/mlまで減少したことが示され、これは、硝子体領域からの急速な排出を示す。NPinPMP注入群では、硝子体内のAlexa-ベバシズマブの濃度が第1日において5 μg/mlであり、第45日において3.5 μg/mlであることがわかった。しかしながら、第60日経過するまでに、Alexa-ベバシズマブの濃度が2.2 μg/mlであってベースライン読み取り値に到達したことが観測された。観測されたデータは、例示的なPinP組成物からのベバシズマブの徐放性in vivo送達を達成することができることを示す。

実施例７
共焦点顕微鏡を用いて調べることにより、SC CO₂処理によって、多孔性PLGAマイクロスフェア内にベバシズマブ コーティングPLAナノスフェアが注入されたことを確認した。ナイルレッド（Nile red）試薬染色PLAナノスフェア、および6-クマリン（6-coumarin）試薬染色PLGAマイクロスフェアは、エマルション溶媒蒸発法を用いて調製した。ナイルレッド試薬および6-クマリン試薬(100 μg/100 mg ポリマー)は、それぞれPLAおよびPLGAのポリマー溶液に溶解させ、その後、粒子を調製した。6-クマリン試薬染色PLGAマイクロスフェア、およびナイルレッド試薬染色PLA NPと6-クマリン試薬染色PLGA MPとの混合物（重量比1:9）をSC CO₂処理した。SCF条件は、約1200psiで30分間、33 ℃であった。SC CO₂処理された粒子は、共焦点顕微鏡(Leica Microsystems, USA)を用いて異なる倍率(10、20、および100×)で観察した。さらに、Z-スタック共焦点画像を用いて、6-クマリン試薬染色PLGAマイクロスフェア中にナイルレッド試薬が局在していることを捕捉した。画像は、0.25 μmの間隔で取り込んだ。ナイルレッド試薬の励起は561 nmで実施され、蛍光画像は、赤色フィルターを用いて捕捉した。同様に、6-クマリン試薬の励起は488 nmで実施され、蛍光画像は、緑色フィルターを用いて捕捉した。

膨張した多孔性PLGA MPおよびNPinPMP製剤の共焦点画像は、図１７および図１８にに示されており、これらは、SC CO₂暴露の後、PLGAマイクロスフェアが細孔形成を伴って膨張したことを示す。SC CO₂処理の後、ナイルレッド試薬の赤色シグナルが6-クマリン試薬の緑色シグナルに囲まれて観測され、これは、膨張したPLGA MP内にPLA NPが注入されたことを示す。NPinPMP製剤のZ軸スライス像は、膨張した6-クマリン染色PLGAマイクロスフェア内にナイルレッド染色PLAナノスフェアが局在していることを示した。

金コーティングPinPの表面形態は、走査型電子顕微鏡(JSM-6510, Jeol USA, Inc., CA)を用いて、1000×〜5000×の範囲の異なる倍率で可視化された。図１９に示されるように、SCFによって、PLGA MPの細孔形成を伴う膨張がもたらされる。また、SEM画像から、PLA NPが、膨張した多孔性PLGA MP中に封入されたことは明らかであった。

実施例８
タンパク質の徐放性放出についてのPinPの有用性は、別のタンパク質His-LEDGF_1-326を用いて評価した。His-LEDGF_1-326を封入するNPinPMPは、実施例６に説明されるように調製した。NPinPMPからのHis-LEDGF_1-326のin vitro放出およびin vivo送達が実施された。

＜His-LEDGF_1-326のin vitro累積放出＞
His-LEDGF_1-326 封入NPinPMPは、PBS pH 7.4中のin vitro放出について評価した。粒子(2-3 mg)の重量を測定し、1 mlのPBS pH 7.4中に分散させて、200 rpmで振盪(Max Q shaker incubator)しながら37℃でインキュベーションした。予め決められた時点に、懸濁した粒子を13,000 gにて15分間遠心分離し、上清を回収した。粒子を含むペレットを1 mlの新しいPBS pH 7.4中に再懸濁し、インキュベーションした。サンプル中のHis-LEDGF_1-326含量は、製造者(Pierce Biotechnology, IL, USA)の指示書に従いマイクロBCAアッセイを用いて推定された。in vitro累積データは、NPinPMPからのHis-LEDGF_1-326の徐放性放出を示した。図２５に示されるように、His-LEDGF_1-326の60 %の累積放出が3ヶ月を経過するまでに観測された。

＜ラットにおけるHis-LEDGF_1-326のin vivo送達＞
His-LEDGF_1-326のin vivo送達は、ラットモデルにおけるNPinPMP中Alexa Fluor 488 コンジュゲート His-LEDGF_1-326の硝子体内投与の後、評価した。NPinPMPにおいて、非標識LEDGF_1-326は用いなかった。ラットの眼にAlexa- His-LEDGF_1-326 封入 NPinPMP (6.0 μg の His-LEDGF_1-326 /5 μl)を注入し、対照としてAlexa- His-LEDGF_1-326を当濃度 (1.5 μg の標識タンパク質および4.5 μg の非標識タンパク質/5 μl)で注入した。この比率を用いることにより、実験を始める両群について、同様の蛍光強度で開始することができた。Alexa-His-LEDGF_1-326の放出に因る眼球蛍光発光は、蛍光が検出限界の下限またはベースラインに到達するまで、Fluorotron Master^TM(Ocumetrics, CA, USA)を用いて定期的にモニターした。眼のベースライン蛍光値をモニターした後、製剤を注入した。各時点において、３回の蛍光測定スキャンを行い、平均値が用いられた。異なる濃度におけるAlexa- His-LEDGF_1-326についての標準曲線は、キュベットと、ラットのレンズのためのアダプターを備える眼の蛍光分光計とを用いて、作製した。標準曲線は、蛍光分光計によって与えられる蛍光に相当する濃度を、実際のAlexa- His-LEDGF_1-326の濃度へと変換するために用いた。

Alexa-His-LEDGF_1-326 封入NPinPMPおよび可溶性Alexa- His-LEDGF_1-326を一定間隔で硝子体内注入した後、眼の光軸に沿うHis-LEDGF_1-326 の濃度分布は、垂直平面（axial planes）（前眼部から後眼部への方向へのデータポイントとして示される）に沿ってalexa蛍光強度分布（フルオレセイン ナトリウムの濃度に相当する）曲線を測定することにより、間接的に測定した。蛍光スキャンにより、溶液と比較したNPinPMPからのAlexa-His-LEDGF_1-326の徐放性送達が明らかになった。Fluorotron Masterによって報告されるフルオレセインに相当する濃度は、Alexa-His-LEDGF_1-326の濃度に変換された。異なる時点における、溶液から、およびNPinPMPから放出される硝子体領域のAlexa-His-LEDGF_1-326の濃度をプロットした。標識されたベバシズマブの濃度のみが報告されている。
硝子体内注入の前に、正常な眼についてのフルオレセインのベースライン読み取り値を記録し、フルオレセインのベースライン濃度が2.03 μg/mlであることがわかった。図２６に示されるように、Alexa-His-LEDGF_1-326溶液注入群では、Alexa-His-LEDGF_1-326の濃度が第1日において2.02 μg/mlであり、これは、硝子体領域からの急速な排出を示す。NPinPMP注入群では、硝子体内のAlexa-His-LEDGF_1-326の初期濃度が18.23 μg/mlであり、ベースラインより高いAlexa-His-LEDGF_1-326の濃度は第35日まで維持され、第50日までには正常な眼のベースラインレベルに到達したことがわかった。観測されたデータは、例示的なPinP組成物からのAlexa-His-LEDGF_1-326の徐放性in vivo送達を達成することができることを示す。

＜参考文献＞
1. Rohdewald, P. and V. Keuth, Evaluation of algesimetric parameters on the basis of tooth pulp stimulation in humans.Anesth Prog, 1990. 37(1): p. 4-10.

2. Kompella, U.B., N. Bandi, and S.P. Ayalasomayajula, Subconjunctival nano- and microparticles sustain retinal delivery of budesonide, a corticosteroid capable of inhibiting VEGF expression. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003. 44(3): p. 1192-201.

3. Ayalasomayajula, S.P. and U.B. Kompella, Celecoxib, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, inhibits retinal vascular endothelial growth factor expression and vascular leakage in a streptozotocin-induced diabetic rat model. Eur J Pharmacol, 2003. 458(3): p. 283-9.

4. Ayalasomayajula, S.P., A.C. Amrite, and U.B. Kompella, Inhibition of cyclooxygenase-2, but not cyclooxygenase-1, reduces prostaglandin E2 secretion from diabetic rat retinas. Eur J Pharmacol, 2004. 498(1-3): p. 275-8.

5. Sennlaub, F., et al., Cyclooxygenase-2 in human and experimental ischemic proliferative retinopathy. Circulation, 2003. 108(2): p. 198-204.

6. Cheng, T., et al., Prostaglandin E2 induces vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor mRNA expression in cultured rat Muller cells.Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998. 39(3): p. 581-91.

7. Saishin, Y., et al., Inhibition of protein kinase C decreases prostaglandin-induced breakdown of the blood-retinal barrier. J Cell Physiol, 2003. 195(2): p. 210-9.

8. Penn, J.S., et al., Vascular endothelial growth factor in eye disease. Prog Retin Eye Res, 2008. 27(4): p. 331-71.

9. Derevjanik, N.L., et al., Quantitative assessment of the integrity of the blood-retinal barrier in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002. 43(7): p. 2462-7.

10. Pow, D.V., et al., Localization of taurine transporters, taurine, and (3)H taurine accumulation in the rat retina, pituitary, and brain. Glia, 2002. 37(2): p. 153-68.

11. Ehinger, B., Glial uptake of taurine in the rabbit retina. Brain Res, 1973. 60(2): p. 512-6.

12. Ball, A.K. and D.H. Dickson, Displaced amacrine and ganglion cells in the newt retina. Exp Eye Res, 1983. 36(2): p. 199-213.

13. Pourcho, R.G., Distribution of [35S]taurine in mouse retina after intravitreal and intravascular injection. Exp Eye Res, 1977. 25(2): p. 119-27.

14. Obrosova, I.G., et al., Antioxidants attenuate early up regulation of retinal vascular endothelial growth factor in streptozotocin-diabetic rats. Diabetologia, 2001. 44(9): p. 1102-10.

15. Cheruvu, N.P. and U.B. Kompella, Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006. 47(10): p. 4513-22.

16. Thakur, A., R.S. Kadam, and U.B. Kompella, Trabecular meshwork and lens partitioning of corticosteroids: Implications for elevated intraocular pressure and cataracts.Arch Ophthalmol. In press.

17. Kadam, R.S., et al., Sclera-choroid-RPE transport of eight beta-blockers in human, bovine, porcine, rabbit, and rat models. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011. PMID: 21282583.

Claims (48)

1. 少なくとも１つの末端親水性酸官能基を含むように修飾された、親油性コルチコステロイドである化合物。
2. 少なくとも１つの末端親水性酸官能基が、エステル結合によって親油性コルチコステロイドに結合する、請求項１に記載の化合物。
3. 少なくとも１つの末端親水性酸官能基が、硫酸基、リン酸基、およびコハク酸基からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
4. 親油性コルチコステロイドが、トリアムシノロン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、フルオシノロン アセトニド、トリアムシノロン アセトニド、またはブデソニドである、請求項１に記載の化合物。
5. 親油性コルチコステロイドがブデソニドである、請求項３に記載の化合物。
6. 少なくとも１つの末端親水性酸官能基が硫酸基である、請求項５に記載の化合物。
7. 硫酸基がトリエチルアンモニウム硫酸塩である、請求項６に記載の化合物。
8. 少なくとも１つの末端親水性酸官能基がコハク酸基である、請求項５に記載の化合物。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物またはその組み合わせを含む組成物。
10. 医薬担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
11. 必要とする患者に請求項９または１０に記載の組成物を投与することを含む、眼疾患を治療するための方法であって、前記投与により、網膜または隣接する後眼部に前記組成物が送達される、方法。
12. 前記組成物が経強膜投与される、請求項１１に記載の方法。
13. 眼疾患が、変性性眼疾患、血管性眼疾患、炎症性眼疾患、感染性眼疾患、緑内障、または視神経炎である、請求項１１に記載の方法。
14. 非ステロイド抗炎症剤(NSAID)を含む化合物であって、pKaが約7〜約10であるNSAIDの末端官能基が、それに対する多官能性カウンター酸官能基と結合することによって遮蔽される、化合物。
15. NSAIDが、サリチラート、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、オキシカム、フェナム酸、コキシブ、またはスルホンアニリドである、請求項１４に記載の化合物。
16. NSAIDがコキシブである、請求項１５に記載の化合物。
17. コキシブがセレコキシブである、請求項１６に記載の化合物。
18. 多官能性カウンター酸官能基が、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、およびコハク酸からなる群より選択される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
19. 多官能性カウンター酸官能基がコハク酸である、請求項１８に記載の化合物。
20. 多官能性カウンター酸官能基に結合するタウリンをさらに含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
21. 請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の化合物またはその組み合わせを含む組成物。
22. 医薬担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
23. 必要とする患者に請求項２１または２２に記載の組成物を投与することを含む、眼疾患を治療するための方法であって、前記投与により、網膜または隣接する後眼部に前記組成物が送達される、方法。
24. 組成物が眼に局所投与される、請求項２３に記載の方法。
25. 眼疾患が、変性性眼疾患、血管性眼疾患、炎症性眼疾患、感染性眼疾患、緑内障、または視神経炎である、請求項２４に記載の方法。
26. 疾患が糖尿病性網膜症である、請求項２５に記載の方法。
27. 下記の一般式を有し、式中、Ｒは、アセトアミド、グルタルアミド酸、マロンアミド酸、およびスクシンアミド酸からなる群より選択される、化合物。
    

    
28. 医薬担体、希釈剤、賦形剤、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２７に記載の化合物。
29. 一般式IVで表される化合物に結合するタウリンをさらに含む、請求項２７または２８に記載の化合物。
30. 必要とする患者に請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、眼疾患を治療するための方法であって、前記投与により、網膜または隣接する後眼部に前記組成物が送達される、方法。
31. 多孔性外部粒子中に装填される内部粒子を含む徐放性組成物であって、治療薬が、内部粒子の表面に結合するか、外部粒子の表面に結合するか、内部粒子内に封入されるか、外部粒子内に封入されるか、外部粒子の細孔中に存在するか、またはこれらの組み合わせである、組成物。
32. 内部粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張しない粒子材料から選択される、請求項３１に記載の組成物。
33. 内部粒子の直径が約1 nm 〜約 999 nmであり、外部粒子の直径が約1 μm〜約500 μmである、請求項３１に記載の組成物。
34. ナノ粒子材料がナノ粒子ポリマー材料である、請求項３２に記載の組成物。
35. 内部粒子ポリマー材料が、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸) (PGA)、乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)、セルロース誘導体、およびキトサンからなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
36. 内部粒子ポリマー材料がポリ乳酸(PLA)である、請求項３５に記載の組成物。
37. 外部粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張する粒子材料から選択される、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
38. 外部粒子材料がポリマー材料である、請求項３７に記載の組成物。
39. 外部粒子ポリマー材料が、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン グリコール、ポリアルキレン オキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、およびこれらの共重合体；アルキル セルロース、ヒドロキシアルキル セルロース、セルロース エーテル、セルロース エステル、ニトロ セルロース、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの重合体、メチル セルロース、エチル セルロース、ヒドロキシプロピル セルロース、ヒドロキシプロピル メチル セルロース、ヒドロキシブチル メチル セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチル セルロース、セルロース ポリ（メチル メタクリラート）、ポリ（エチル メタクリラート）、ポリ（ブチルメタクリラート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニル酢酸）、およびポリビニルピロリドンから選択される、請求項３８に記載の組成物。
40. 外部粒子ポリマー材料がラクチド-コ-グリコリドである、請求項３９に記載の組成物。
41. 治療薬が、小分子系治療薬、核酸分子系治療薬、ペプチド系治療薬、またはウイルスベクター系治療薬である、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
42. 治療薬がペプチド系治療薬である、請求項４１に記載の組成物。
43. 治療薬をナノ粒子材料と結合させるか、ナノ粒子材料を用いて封入することにより、治療薬が装填されたナノ粒子を作製するステップと；
    超臨界流体の存在下で、治療薬が装填されたナノ粒子を多孔性マイクロ粒子中に注入することにより、多孔性マイクロ粒子内ナノ粒子(NPinPMP)組成物を作製するステップ
    とを含む、徐放性組成物を製造する方法。
44. 超臨界流体が二酸化炭素である、請求項４３に記載の方法。
45. 必要とする患者に請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、徐放性放出のための治療薬を送達する方法。
46. 組成物を治療部位に埋め込むことにより、組成物が投与される、請求項４５に記載の方法。
47. 組成物が全身投与される、請求項４６に記載の方法。
48. 治療薬が、請求項１〜８、１４〜２０、および２７〜２９のいずれか１項に記載の化合物を含む、請求項４５または４６に記載の方法。

Images