JP2015501291A - ハイブリッド定常領域 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ハイブリッド定常領域、および、これを組み込んだ抗体または融合タンパクを提供する。ハイブリッド定常領域は、少なくとも、ＩｇＧまたはＩｇＡ定常領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、Ｃμ定常領域のＣμ３領域およびＣμ４領域を含む。ハイブリッドは、両構成要素の定常領域特性を保持する。ハイブリッドは、多価複合体、たとえば、五量体構造または六量体構造を形成するＣμ定常領域の能力を保持する。ＩｇＧハイブリッドは、また、比較的長いインビボ半減期に関連するｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、および、精製を容易にするプロテインＧへの特異的結合を含むＩｇＧ特性を保持する。アイソタイプおよびサブタイプ、抗原の性質、ならびに、追加のＩｇＧ ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインの存在に応じて、ＩｇＧハイブリッドは、プロテインＡへの特異的結合の特性、ならびに、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化のエフェクター機能も保持するかも知れない。ＩｇＡハイブリッドは、Ｆｃアルファ受容体ＣＤ８９に結合するＩｇＡの特性を保持する。【選択図】図17

Description

関連出願の参照
本出願は２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第６１／５３９，４１６号の非仮出願である。
抗体は、免疫系において重要な役割を果たすＢ細胞によって産生される糖タンパクである（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：Ｓ４１−Ｓ５２，２０１０）。５つのクラスの抗体、すなわち、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＧ，ＩｇＡおよびＩｇＥが、動物において産生される。ヒトにおいては、ＩｇＧ抗体の４つのサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）ならびにＩｇＡ抗体の２つのサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）が産生される。各抗体は、単量体型の２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から成る。これら４つの鎖は、共有結合および非共有結合の組み合わせによって相互に接続されて、Ｙ字状の分子を形成する。哺乳類には、２種類の軽鎖、カッパおよびラムダ、がある。抗体のクラスを決定する数種類の重鎖が存在する。ヒトでは、μ重鎖がＩｇＭに、デルタ重鎖がＩｇＤに、ガンマ−１重鎖がＩｇＧ１に、ガンマ−２重鎖がＩｇＧ２に、ガンマ−３重鎖がＩｇＧ３に、ガンマ−４重鎖がＩｇＧ４に、アルファ−１重鎖がＩｇＡ１に、アルファ−２重鎖がＩｇＡ２に、イプシロン重鎖がＩｇＥに組み込まれている。これらの抗体の単量体型は、２つの抗原結合部位を有しており、したがって、抗原結合について２価である。ＩｇＧ，ＩｇＤおよびＩｇＥは、もっぱら単量体として産生されるが、ＩｇＭは六量体として産生され、したがって、Ｊ鎖が存在しない場合は、抗原結合について１２価であり、Ｊ鎖が存在するときは、１０価の五量体である（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．１８：１６７−１７４，２００８）。ＩｇＡはＪ鎖を有する４価の二量体を形成し、一方、Ｊ鎖が存在しないとき、ＩｇＡは単量体であるが、Ｊ鎖を有しない二量体ＩｇＡの同時形成も報告されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５２：２４０−２４８，２０００）。
米国食品医薬品局は、２０１０年末までに、ヒトの治療法として、２８のモノクローナル抗体を承認している。これらの治療抗体はすべて、ＩｇＧ抗体またはその誘導体である。ＩｇＧ抗体は、特異的な抗原結合に加えて、Ｆｃ領域によって媒介される様々な生物学的機能を引き起こす（前記Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１７：１２７８−１２８５，２０１１）。ヒトにおいて、細胞結合ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体は、ＮＫ細胞上に発現されるＦｃγ受容体タイプＩＩＩ（ＣＤ１６）のＦｃ領域に結合することによって、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する（Ｈｕｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１−１２７，１９９４）。同様に、細胞結合ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体は、Ｆｃ領域と補体成分との相互作用によって、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を効率よくトリガーし得る（Ｂｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１２７−１４２，１９８８）。
ヒトＩｇＧ抗体の４つのすべてのサブクラスのＦｃ領域は、膜貫通α鎖およびβ２−マイクログルブリンから成るヘテロダイマーである新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に、ｐＨ依存性の態様で結合して、ピノサイトーシスによって内在化したＩｇＧ抗体を、リソソーム中での異化分解から救済して、血液循環へのそれらの再循環を可能にする（Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６，２０００）。ＩｇＧ抗体は、したがって、血液循環からの遅いクリアランスを呈して、ヒトにおいて、通常２３日という、長い血清半減期という結果となる（Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，２００６）。さらに、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、プロテインＡ（ＩｇＧ３を除く）およびプロテインＧに結合するので、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによるＩｇＧ抗体の精製が可能である（Ａｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｔ ２．７，Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＩＩ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９７）。
細胞表面の特異性分子の２量化は、１つ以上の生物学的応答をしばしばトリガーし得る。細胞表面のＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）タンパクへのモノクローナルＩｇＧ抗体の結合は、ＰＳＭＡ内在化の比率を高める（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４０５５−４０６０，１９９８）。タイプＩ膜貫通タンパクΜＵＣ１の内在化および下方制御は、マウスＩｇＧ１抗体への結合によってトリガーされる（Ｈｉｓａｔｓｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３８８：６７７−３８２，２００９）。ｃ−Ｍｅｔタンパクに対するモノクローナル抗体は細胞表面のｃ−Ｍｅｔを二量化し、細胞内シグナル伝達を開始させて、細胞増殖をもたらす（Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１１：２３７−２４７，１９９８）。同様に、モノクローナル抗ＥＰＯ受容体抗体は、表面のＥＰＯ受容体のホモ二量化により、細胞成長のアゴニストとして機能し得る（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８９：４７３−４８２，１９９７）。しかし、細胞表面の、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである細胞死受容体５（ＤＲ５）の抗体媒介二量化は、必ずしもシグナル伝達をトリガーせず、一方、マウスモノクローナル抗ＤＲ５抗体とヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体との混合物によるＤＲ５タンパクの多量化は、たとえば、細胞質におけるシグナル伝達を誘導し、アポトーシスをトリガーする（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２５９７−２６０５，１９９９）。
ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖を有する五量体およびＪ鎖を有しない六量体として存在する（前記Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．）。抗原を二量化することのみが可能であるＩｇＧ抗体と対照的に、ＩｇＭは、その１０価または１２価の抗原結合能力によって、細胞表面タンパクを多量化することが可能である。ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（Ｃｏｓｍａｎ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４４０−４５５，１９９４）であるＦａｓに対する特異性を有するモノクローナルＩｇＭ抗体は、表面のＦａｓタンパクの多量化によって、Ｆａｓ発現細胞のアポトーシスを効率よく誘導することができ（Ｙｏｎｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７−１７５６，１９８９）、一方、抗Ｆａｓ ＩｇＧ抗体は、架橋していなければ、誘導しない（Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２９：１６０９−１６１４，２００２）。ＩｇＧと比較して、ＩｇＭは、ＦｃＲｎに結合する能力を欠いているため、ヒトにおいて通常５日という、はるかに短い血液循環半減期を呈する（前記Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．）。ＩｇＭ抗体は、また、ＣＤ１６への結合を欠くため、ＡＤＣＣを媒介し得ない。さらに、ＩｇＭがプロテインＡおよびプロテインＧへの結合を欠くことが、プロテインＡおよびプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーそれぞれによるＩｇＭの精製を不可能としている（Ｇａｕｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．Ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊｕｌｙ ２０１１）。
新規形態の多価抗体を生成する試みにおいて、種々の構造形式が利用されてきた。多価抗体の技術における近年の進歩が、Ｃｕｅｓｔａらの総説（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２８：３５５−３６２，２０１０）にまとめられている。好ましい多価ＩｇＧ抗体は、細胞表面の抗原を効率よく多量化し得る。ＡＤＣＣ，ＣＤＣ、オプソニン化、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、ならびに、プロテインＡおよびプロテインＧへの結合能などの、ガンマ重鎖のＦｃ領域によって媒介される特性が、そのような多価ＩｇＧ抗体において保持されていることも重要である。
多価ＩｇＧ抗体を生成するために、Ｃａｒｏｎら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５，１９９２）は、ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ１／カッパ抗体、ＨｕＧ１−Ｍ１９５において、ヒトガンマ−１重鎖のカルボキシル末端からの４位に、セリンからシステインへの置換を導入した。Ｈｄ−ＩｇＧと呼ばれるこのような変更ＨｕＧ１−Ｍ１９５は、精製されて、架橋するために、および、次いで過剰のスルフヒドリル位をブロックするために、エルマン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で処理された。単量体のＨｕＧ１−Ｍ１９５は、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによって、Ｈｄ−ＩｇＧから除去された。得られたＨｄ−ＩｇＧは、ＣＤ３３分子を内在化する能力の劇的な向上を示し、ＡＤＣＣおよびＣＤＣにおいて、ＨｕＧ１−Ｍ１９５よりも強力であった。
Ｍｉｌｌｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：４８５４−４８６１，２００３）は、ヒト化抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１モノクローナル抗体、ｈｕ４Ｄ５の重鎖のＶＨ−ＣＨ１領域を複製することで、４価のＩｇＧ抗体を構築した。この変更ガンマ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ，ＣＨ１，ＶＨ，ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２およびＣＨ３の領域で構成された。変更ＩｇＧ中の４つのＶＨ−ＣＨ１領域の各々には１つの軽鎖が結合して、４価のｈｕ４Ｄ５抗体（ＴＡ−ＨＥＲ２）を形成した。ＴＡ−ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２発現細胞上の親の２価ｈｕ４Ｄ５よりも、速やかに内在化された。Ｍｉｌｌｅｒら（前記）は、また、ＴＡ−ＨＥＲ２と同じ重鎖形式の、ＴＡ−ＤＲ５と呼ばれる４価の抗ＤＲ５ ＩｇＧ抗体を構築した。ＴＡ−ＤＲ５は、親の２価抗ＤＲ５ ＩｇＧモノクローナル抗体よりも約１００倍低い濃度で、アポトーシスをトリガーした。
Ｒｏｓｓｉら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８：８３８４−８３９２，２００８）は、Ｈｅｘ−ｈＡ２０と名付けられた６価の抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体の、ドック−ロック法(Dock-and-Lock method)を用いた構築を報告した。６つのＦａｂ領域および２つのＦｃ領域から成るＨｅｘ−ｈＡ２０を生成するために、２つの構成要素が、構築され、哺乳類細胞において別個に生産された。第１に、Ａキナーゼアンカータンパクのアンカードメイン（ＡＤ）が、ヒト化抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体、ｈＡ２０の重鎖のカルボキシル末端に、遺伝子的に融合された。この構造物は、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０と名付けられた。第２に、サイクリックＡＭＰ依存性のタンパクキナーゼのドッキングドメイン（ＤＤＤ）が、ｈ２０のＦａｂフラグメントのカルボキシル末端に、遺伝子的に融合された。この構造物は、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡ２０と名付けられた。ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０およびＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡ２０は、プロテインＡおよびプロテインＬアフィニティクロマトグラフィーによってそれぞれ精製された。Ｈｅｘ−ｈＡ２０は、精製したＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０およびＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡ２０を酸化還元条件下で混合し、次いで、プロテインＡで精製することによって得られた。Ｈｅｘ−ｈ２０は、架橋抗体を必要とすることなく、ＣＤ２０発現Ｂリンパ腫細胞株の増殖を阻害した。Ｈｅｘ−ｈ２０は、ｈＡ２０のＡＤＣＣ活性を保持したが、ＣＤＣ活性は失った。
Ｙｏｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７：３３７７１−３３７７７，１９９９）は、ガンマ−２重鎖の一部がヒトアルファ−１重鎖の対応する部分で置き換えられた、変異型ヒト抗ＤＮＳ ＩｇＧ２抗体を構築した。γγγ−αｔｐと呼ばれる構造物において、ヒトアルファ−１重鎖のＣ末端に存在し、αｔｐと呼ばれる１８個のアミノ酸ポリペプチド（アルファ尾部とも呼ばれる）が、ヒトガンマ−２重鎖のＣ末端にて付加された。γγγ−αは、次の３つの変異型ＩｇＧ２抗体を生成するために、さらに変更された。αγγ−αｔｐにおいては、ガンマ−２重鎖のＣＨ１領域が、ヒトアルファ−１重鎖の相手方で置き換えられた。ααγ−αｔｐにおいては、ＣＨ１領域、ヒンジ領域およびＣＨ２領域が、ヒトアルファ−１重鎖の相手方で置き換えられた。γαγ−αｔｐにおいては、ヒンジ領域およびＣＨ２領域が、ヒトアルファ−１重鎖の相手方で置き換えられた。これらの構造物は、Ｊ鎖を産生するマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０において安定して発現された。精製されたγγγ−αｔｐ抗体、αγγ−αｔｐ抗体、ααγ−αｔｐ抗体およびγαγ−αｔｐ抗体の各々は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体の混合物であった。混合物における六量体と五量体とを合わせた割合は、γγγ−αｔｐについては２０％、αγγ−αｔｐについては２５％、ααγ−αｔｐについては４５％、γαγ−αｔｐについては３２％であった。
Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２８５８−２８６５，１９９６）は、第１、第２および第３のヒンジ領域が削除された、ヒトモノクローナル抗ＮＩＰ（３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニル酢酸）ＩｇＧ３抗体変異型に基づき、多価抗体を生成した。この変異型ＩｇＧ３抗体のガンマ−３重鎖遺伝子は、２つの位置において変更された。第１に、ヒトμ重鎖のＣ末端に存在し、μｔｐと呼ばれる１８個のアミノ酸ポリペプチド（ミュー尾部とも呼ばれる）が、重鎖のＣ末端にて付加された。第２に、ＣＨ２領域の３０９位のロイシン残基が、システイン残基に変更された。ＩｇＧＬ３０９Ｃμｔｐと呼ばれる、このような変更モノクローナルＩｇＧ３抗体は、Ｊ鎖を産生するマウス骨髄腫細胞株Ｊ５５８Ｌにおいて発現され、ＮＩＰ−セファロースカラムを用いて精製された。ＩｇＧＬ３０９Ｃμｔｐの分泌レベルは、親のＩｇＧ３抗体よりも低いと報告され、ＩｇＧＬ３０９Ｃμｔｐの大部分が、細胞内に保持された。サイズ分析は、五量体および六量体が、精製ＩｇＧＬ３０９Ｃμｔｐの８１％を構成することを示した。
Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１９−２７，２０００）も、ガンマ−３重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を、ヒトμ重鎖の、μｔｐを含むＣＨ３領域およびＣＨ４領域で置換することによって、上記と同じヒト抗ＮＩＰ ＩｇＧ３抗体変異体を変更した。このような変更ＩｇＧ３／ＩｇＭハイブリッド分子の重鎖は、ＩｇＧ−Ｃμ３−Ｃμ４と呼ばれ、Ｎ末端から、ヒトガンマ−３重鎖の抗ＮＩＰ ＶＨ領域、ＣＨ１および第４ヒンジ領域、ならびに、ヒトμ重鎖の、μｔｐを含むＣＨ３領域およびＣＨ４領域から成る。ＩｇＧ−Ｃμ３−Ｃμ４は、Ｊ鎖を産生するＪ５５８細胞において発現され、ＮＩＰ−セファロースカラムを用いて精製された。精製ＩｇＧ−Ｃμ３−Ｃμ４において、六量体および五量体は、それぞれ、１４．０％および６６．７％を構成した。ＩｇＧ−Ｃμ３−Ｃμ４は、ヒトガンマ−３重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を有しないので、ＡＤＣＣ、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、ならびに、プロテインＡおよびプロテインＧへの結合能などの、Ｆｃγ媒介特性を欠くであろう。
発明の概要
本発明は、各々がＩｇＧアイソタイプもしくはＩｇＡアイソタイプであるＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、Ｃμ３領域およびＣμ４領域を、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む抗体または融合タンパクを提供する。随意的に、前記免疫グロブリン重鎖は、さらに、前記ＣＨ２領域のＮ末端にヒンジ領域を含む。随意的に、前記免疫グロブリン重鎖は、さらに、前記ヒンジ領域のＮ末端にＣＨ１領域を含む。
随意的に、前記抗体または融合タンパクは、前記重鎖定常領域が重鎖可変領域に融合した抗体であって、さらに、軽鎖可変領域および定常領域を含む軽鎖を含む抗体である。随意的に、前記抗体は、異なる重鎖可変領域、および、随意的に、異なる軽鎖可変領域を有する複数の抗体を含む多重特異性抗体であって、前記複数の抗体は、前記多重特異性抗体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多重特異性抗体の構成要素である。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、本発明の抗体または融合タンパクにおける、前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１領域である。随意的に、前記抗体または融合タンパクにおける、前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ２領域である。随意的に、前記抗体または融合タンパクにおける、前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ３領域である。随意的に、前記抗体または融合タンパクにおける、前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ４領域である。随意的に、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＡ領域である。随意的に、前記ＣＨ１領域および前記ヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトのＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域であり、前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域は、ヒトのＣμ３領域およびＣμ４領域である。
随意的に、前記抗体または融合タンパクは、前記重鎖定常領域に連結した単鎖Ｆｖを含む単鎖抗体である。随意的に、前記単鎖抗体は、複数の単鎖抗体を含む多重特異性抗体であって、前記複数の前記ｓｃＦｖは異なるＶＨ領域を有し、前記複数の単鎖抗体は、前記多重特異性抗体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多重特異性抗体の構成要素である。随意的に、前記ｓｃＦｖは同じＶＬ領域を有する。
随意的に、抗体または融合タンパクは、２つの前記重鎖および２つの前記軽鎖を含むユニットの少なくとも５つもしくは６つの複製を含む多量体であって、前記複製は、前記多量体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多量体の形態である。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧであり、前記抗体または融合タンパクは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合し、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよび／またはオプソニン化を呈する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ１領域であり、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合する。随意的に、このような抗体または融合タンパクは、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化を呈する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトのＩｇＧ２領域またはＩｇＧ４領域であり、前記抗体または融合タンパクは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ３であり、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合する。随意的に、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化を呈する請求項２０に記載の抗体または融合タンパク。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクにおいて、前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＡであり、前記抗体は、Ｆｃアルファ受容体に結合する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、異種ポリペプチドに連結した免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパクである。随意的に、前記異種タンパクは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａなどの可撓性リンカーを介して、前記定常領域の前記ヒンジに連結している。随意的に、前記異種ポリペプチドは、受容体細胞外ドメインまたは受容体細胞外ドメインに特異的に結合するポリペプチドである。随意的に、前記融合タンパクは、異なる異種ポリペプチドを含有する複数の融合タンパクを含む多重特異性複合体の構成要素である。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化した抗体および融合タンパクを含む多重特異性複合体である。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、ヒト化した、キメラの、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）の、または、ヒトの抗体である。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、ＣＤ７９ａ，ＣＤ３０またはＤＲ５に特異的に結合する。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、ＴＮＦアルファ受容体、ＬＦＡ−３受容体、もしくはＩＬ−１受容体の細胞外ドメインを含む融合タンパク、または、ＴＲＡＩＬタンパクを含む融合タンパクである。
随意的に、上記の抗体または融合タンパクは、有毒部分に、随意的に、細胞毒性を有する部分に抱合している。
本発明は、さらに、上記の抗体または融合タンパクを含む医薬組成物を提供する。
本発明は、さらに、癌を有するまたは癌の危険性のある患者に、上記の抗体または融合タンパクの有効な投与計画を実施することを含む癌を治療する方法を提供する。
本発明は、さらに、免疫学的疾患を治療する方法であって、前記疾患を有するまたは前記疾患の危険性のある患者に、上記の抗体または融合タンパクの有効な投与計画を実施することを含む方法を提供する。
本発明は、さらに、抗体および／または融合タンパクの多重特異性複合体を生成する方法を提供し、この方法は、ａ．異なる特異性を有する複数の請求項１に規定の抗体および／または融合タンパクをコードするベクターまたは複数のベクターを細胞に導入すること、ならびに、ｂ．前記多重特異性複合体を細胞培養物から単離することを含む。そして、前記抗体および／または融合タンパクは、発現すると、前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して前記多重特異性複合体に組み立てられる。随意的に、前記複数の抗体または融合タンパクの各々は、異なるベクターによってコードされる。
本発明は、さらに、Ｎ末端ＩｇＧ定常領域区分およびＣ末端ＩｇＭ定常領域区分を含むハイブリッド定常領域を含む抗体または融合タンパクであって、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を呈し、プロテインＧに特異的に結合し、前記ＩｇＭ定常領域を介して多量化して少なくとも五量化または六量化する抗体または融合タンパクを提供する。
図１：抗体発現ベクターの模式的構造を示す図である。
図２：単量体型の組み換え抗体の模式的構造を示す図である。
図３Ａ-Ｅ：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ１抗体の溶出パターンを示す図である。
図４：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ１抗体によるラモス細胞(Ramos cell)のアポトーシスの誘導を示す図である。
図５：多価ＩｇＧ１抗体のＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合を示す図である。
図６Ａ-Ｉ：多価ＩｇＧ１抗体のＣＤ１６への結合を示す図である。
図７Ａ-Ｄ：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、抗ＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体の溶出パターンを示す図である。
図８：多価抗ＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体によるＫａｒｐａｓ ２９９細胞の細胞分裂停止を示す図である。
図９：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、ＨＥＫ２９３細胞に発現した多価抗ＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体の溶出パターンを示す図である。
図１０Ａ-Ｄ：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、抗ＤＲ５ ＩｇＧ１抗体の溶出パターンを示す図である。
図１１：多価抗ＤＲ５ ＩｇＧ１抗体により誘導されるＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを示す図である。
図１２Ａ-Ｃ：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４抗体の溶出パターンを示す図である。
図１３Ａ-Ｅ：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過カラムからの、抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ３抗体の溶出パターンを示す図である。
図１４：多価ＩｇＧ３抗体のＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合を示す図である。
図１５Ａ-Ｇ：多価ＩｇＧ３抗体のＣＤ１６への結合を示す図である。
ガンマ−１（配列番号１５〜１８）、ガンマ−２（配列番号１９〜２２）、および、ガンマ−３（配列番号２３〜２６）の重鎖定常領域の配列を示す図である。 ガンマ−４（配列番号２７〜３０）、アルファ−１（配列番号３１〜３３）、および、アルファ−２（配列番号３４〜３６）の重鎖定常領域の配列を示す図である。 ミュー重鎖定常領域（配列番号５１〜５４）、および、Ｊ鎖（配列番号５５）の配列を示す図である。Ｃミュー配列において、１８個のアミノ酸ミュー尾部に下線を付してある。Ｊ鎖に示した最初の２２個のアミノ酸は、開裂シグナルペプチドである。
六量体コンフォメーションの、ハイブリッド定常領域を有する例示的抗体を示す図である。鎖間ジスルフィド結合は直線で示してある。各単量体ユニットは、各々が重鎖可変領域および軽鎖可変領域から形成された２つの結合部位を有する。６つの単量体ユニットは、異なる単量体ユニットのＣμ３領域とＣμ４領域との間のジスルフィド結合を介して、互いに結合している。結合価およびジスルフィド結合パターンを含めて示した抗体は、例示のための本発明の１つの実施形態にすぎない。
ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１またはＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１で処理したラモス担持ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの生存データを示す図である。
定義
抗体または融合タンパクは、一般に、単離型で提供される。これは、抗体または融合タンパクが、一般に、その産生または精製で生じる干渉タンパクおよび他の汚染物質から、少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であるが、モノクローナル抗体が、その使用を容易にするための、医薬的に許容される過剰の担体または他の媒体と、組み合わされる可能性を排除するものではない。いくつかの抗体または融合タンパクは、産生または精製由来の干渉タンパクおよび他の汚染物質から、少なくとも６０，７０，８０，９０，９５または９９％ｗ／ｗ純粋である。抗体または融合タンパクは、その精製後に残存する主たる高分子種であることが多い。
抗体または融合タンパクのその標的抗原への特異的結合とは、少なくとも１０６，１０７，１０８，１０９，または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合は、少なくとも１つの関連のない標的に対して生じる非特異的結合よりも、結合程度が検出可能に高く、非特異的結合から区別される。非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果であるが、特異的結合は、特定の官能基間の結合または特定の空間的合致（たとえば、鍵と鍵穴型）の形成の結果であり得る。ただし、特異的結合は、抗体または融合タンパクが１つの標的のみに結合することを必ずしも意味しない。
基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットの四量体である。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）鎖および「重」（約５０〜７０ｋＤａ）鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主要な関与をする、約１００〜１１０個またはそれより多数のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、最初、開裂可能なシグナルペプチドに連結して発現される。シグナルペプチドを有しない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることもある。したがって、たとえば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを有しない軽鎖可変領域を意味する。ただし、可変領域と呼ぶことは、シグナル配列が必ず存在することを意味せず、実際のところ、本発明の抗体または融合タンパクは、発現され分泌されると、シグナル配列が開裂する。重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対は、抗体の結合領域を規定する。軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分は、それぞれ、軽鎖定常領域および重鎖定常領域を規定する。重鎖定常領域は、エフェクター機能に主要な関与をする。ＩｇＧ抗体において、重鎖定常領域は、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に区分される。ＩｇＡにおいて、重鎖定常領域は、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に区分される。ＣＨ１領域は、ジスルフィド結合および非共有結合によって、軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に可撓性をもたらし、また、四量体において、２つの重鎖定常領域の間に分子内ジスルフィド結合のための部位を提供する。ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、エフェクター機能およびＦｃＲｎ結合の主要な部位である。ＩｇＭ抗体において、μ重鎖定常領域（Ｃμ）は、４つの領域、Ｃμ１，Ｃμ２，Ｃμ３およびＣμ４にさらに区分される。Ｃμ３領域およびＣμ４領域は、１つ以上のＪ鎖と協働して、天然ＩｇＭ抗体および本発明の抗体または融合タンパクにおいて、多量化機能を提供することがある。ミュー尾部は、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣ末端に位置する１８アミノ酸長のポリペプチドである。ＩｇＭは多量化して、Ｊ鎖が存在するときは五量体構造を、Ｊ鎖が存在しないときは六量体構造を、形成する。
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、それぞれ、抗体アイソタイプをＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤまたはＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２個またはそれより多数のアミノ酸の「Ｊ」区分によって結合されており、重鎖は、約１０個またはそれより多数のアミノ酸の「Ｄ」区分も含む（概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照）（あらゆる目的のために、参照によってその全体が組み込まれる）。
軽鎖／重鎖の各対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、抗体全体は、２つの結合部位を有し、すなわち２価である。天然の抗体において、これらの結合部位は同じである。ただし、２つの結合部位が異なる二重特異性抗体を作製することが可能である（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照）。可変領域はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結され、比較的保存されている同じ一般構造のフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整合され、これにより特異的エピトープへの結合が可能になっている。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両者は、ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３およびＦＲ４のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバトの定義、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１），または、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）に従う。カバトはまた、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基が、同じ番号を割り当てられる、広く使用されている番号付け規則（カバト番号付け）を提供している。カバト番号付けは抗体定常領域に使用することが可能であるが、ＥＵインデックスがより一般に使用されており、本出願においてもそのようにしている。
多量化ユニットは、そのＩｇＭ部分によって多量化される本発明のハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクの、単量体ユニットである。多量化ユニットは、それ自体１価または２価であり得る。単一特異性２価抗体ユニットにおいて、２つの重鎖および２つの軽鎖は同じである。二重特異性２価抗体ユニットにおいては、異なる結合特異性を有する、重鎖および軽鎖の２つの異なる対が存在する。抗体ユニットは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が分子内で対を成す単鎖抗体の場合のように、重鎖および軽鎖の単一の組み合わせを含んで、１価でもあり得る。融合タンパクユニットは、単量体型、融合タンパクの２つの複製を含むホモ二量体型、または、２つの異なる融合タンパクを含むヘテロ二量体型であり得る。
多量化とは、ハイブリッド定常領域のＣμ部分を介する、少なくとも２つの多量化ユニット、より一般には、５つまたは６つのそのようなユニットの、会合を意味する。ハイブリッド定常領域を有する抗体または融合タンパクの多量化は、通常のＩｇＭの五量体または六量体の構造よりも、高次または低次の構造を形成することもあり得る。このようなことは、多量化によって形成された複合体を、少なくとも約５つまたは６つのユニットを有すると特徴付けることによって示されることがある。
結合価とは、結合領域の数を指し、換言すれば、抗体または融合タンパクが結合し得る標的抗原の最大分子数を指す。通常のホモ二量体型ＩｇＧ抗体は、２の結合価を有する。通常のＩｇＭ抗体は、五量体型または六量体型のどちらの構造（つまり、各々が２つの結合部位を有する四量体である５つまたは６つのＩｇＭユニット）が形成されるかに応じて、１０または１２の結合価を有する。単量体ユニットが２価である本発明の抗体または融合タンパクは、１０または１２の結合価を有することが可能であり、一方、単量体ユニットが１価である抗体または融合タンパクは、５または６の結合価を有し得る。ハイブリッド定常領域が、通常のＩｇＭの五量体型または六量体型の構造よりも高次または低次の構造を形成することがあり、上記の抗体または融合タンパクにおいて、結合価は上記の値から変化するかも知れない。これらの結合価は、理論的最大値である。実際には、結合する抗原の複製の数は、立体障害のため、理論的最大値よりも少なくなるかも知れない。
本発明の抗体または融合タンパクは、そのすべての抗原（またはリガンド）結合領域が同じ特異性を有する場合、単一特異性である。抗体または融合タンパクは、その抗原結合領域が少なくとも２つの異なる特異性を有する場合は、多重特異性である。多重特異性の抗体または融合タンパクにおける異なる特異性の数は、２から抗体または融合タンパクの最大結合価（たとえば、１０または１２）にわたる。同じ細胞培養で産生される抗体または融合タンパクの集団において、異なる特異性の数は、集団の異なる要素間で変動し得る。
「抗体」の用語は、少なくとも１つの結合領域を有するあらゆる形の抗体を包含し、１価フラグメント、２つの重鎖および軽鎖の２価四量体ユニット、ならびに、より高次の複合体、特に、１価または２価のユニットの五量体および六量体、を包含する。抗体は、すべての結合領域が同じ特異性を有する単一特異性、または、結合部位が少なくとも２つの特異性を有する多重特異性であり得る。抗体フラグメントは、一般に、重鎖可変領域およびハイブリッド重鎖定常領域を含み、軽鎖可変領域も含んでよい。たとえば、抗体フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖可変領域、ペプチドスペーサー、重鎖可変領域、および、本発明のハイブリッド重鎖定常領域を含み得る。他のフラグメントは、重鎖可変領域（結合領域）およびハイブリッド重鎖定常領域を含み、軽鎖を含まない（つまり、Ｄａｂまたはナノボディ）。同様に、融合タンパクは、単量体型または二量体型の融合タンパクユニット、または、より高次の複合体、特に、五量体または六量体を含む。
「エピトープ」の用語は、抗体または融合タンパクが結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸、または、１つ以上のタンパクの三次折り畳みによって並置された不連続アミノ酸で形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（直線状エピトープとしても知られる）は、一般に、変性溶媒に曝されても維持され、一方、三次折り畳みで形成されるエピトープ（コンフォメーションエピトープとしても知られる）は、一般に、変性溶媒での処理で失われる。いくつかの抗体は、末端特異的エピトープに結合し、このことは、抗体が、自由端を有するポリペプチドに対して、他のポリペプチドと融合して自由端を失った同じポリペプチドに対するよりも、優先的に結合することを意味する。エピトープは、一般に、少なくとも３個、より普通には、少なくとも５個または８〜１０個の、独特の立体コンフォメーションのアミノ酸を含む。エピトープの立体コンフォメーションを決定する方法には、たとえば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。
「抗原」または「標的抗原」の用語は、抗体または融合タンパクが結合する標的分子を指す。抗原は、あらゆる長さのタンパク（天然、合成、または組み換え発現）、核酸、炭水化物、その他の分子であってよい。抗原には、受容体、リガンド、カウンターレセプター、および外皮タンパクが含まれる。
融合タンパクにおける異種ポリペプチドは、天然には免疫グロブリン定常領域に連結していないポリペプチドである。このようなポリペプチドは、完全長タンパクであるか、または、完全長タンパクが結合する抗原への特異的結合を維持するに足る長さの、完全長タンパクのあらゆるフラグメントであり得る。たとえば、異種ポリペプチドは、受容体細胞外ドメインまたはそれに対するリガンドであり得る。
同じまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原への他の抗体の結合に競合する１つの抗体の能力を示す、単純な免疫アッセイで同定され得る。抗体のエピトープは、抗原に結合した抗体の接触残基を同定するための、Ｘ線結晶学によっても同定され得る。これに代えて、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または消去する、抗原におけるすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または消去する場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減または消去するいくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または消去する場合、重複するエピトープを有する。
抗体間の競合は、試験中の抗体が共通の抗原への対照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される（たとえば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。過剰の試験抗体（たとえば、少なくとも２ｘ，５ｘ，１０ｘ，２０ｘまたは１００ｘ）が、競合結合アッセイで測定して、対照抗体の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％，９０％または９９％阻害する場合、試験抗体は対照抗体と競合する。競合アッセイで規定される抗体（競合抗体）には、対照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および、立体障害が生じるに足るほど、対照抗体が結合するエピトープに近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
「患者」の用語は、予防処置または治療処置を受けるヒトおよび他の哺乳類対象を包含する。
アミノ酸置換を保存的または非保存的と分類する目的で、アミノ酸は次のようにグループ分けされる：グループＩ（疏水性側鎖）：ｍｅｔ，ａｌａ，ｖａｌ，ｌｅｕ，ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ，ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ，ｇｌｎ，ｈｉｓ，ｌｙｓ，ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ，ｐｒｏ；および、グループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ，ｔｙｒ，ｐｈｅ。保存的置換には、同じクラスのアミノ酸間での置換が含まれる。非保存的置換は、いずれか１つのクラスの要素を、他のクラスの要素と交換することから成る。
配列同一性割合は、可変領域についてのカバト番号付け規則、または定常領域についてのＥＵ番号付けによって、最大に整合される抗体配列で決定される。整合化の後、対象抗体領域（たとえば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が対照抗体の同じ領域と比較される場合、対象抗体領域と対照抗体領域との配列同一性割合は、対象抗体領域と対照抗体領域の双方において同じアミノ酸が占める位置の数を、両領域の整合させた位置のギャップを除外した総数で割り、百分率に変換するために、１００を乗じたものである。
１つ以上の明記した要素を「含む」組成物または方法は、明記していない他の要素を含んでよい。たとえば、抗体を含む組成物は、その抗体を、単独で、または他の含有物と組み合わせて、有してよい。
「抗体依存性細胞毒性」の用語、またはＡＤＣＣは、抗体被覆標的細胞（つまり、抗体が結合した細胞）と溶解作用を行う免疫細胞（エフェクター細胞とも呼ばれる）との相互作用に依存した、細胞死を誘導するメカニズムである。このような、エフェクター細胞には、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、および好中球が含まれる。ＡＤＣＣは、細胞に結合した抗体のＦｃ領域と、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上のＦｃγ受容体、特に、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ、との相互作用によってトリガーされる。標的細胞は、媒介するエフェクター細胞のタイプに依存して、食作用または溶解によって除去される。抗体被覆標的細胞の死が、エフェクター細胞活性の結果として生じる。
「抗体依存性細胞食作用」またはＡＤＣＰとしても知られるオプソニン化の用語は、抗体被覆細胞が、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食免疫細胞（たとえば、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）によって、全体的にまたは部分的に、内在化される処理を指す。
「補体依存性細胞毒性」の用語またはＣＤＣは、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化し、結果として標的細胞膜に穴を形成する細胞死を誘導するメカニズムを指す。一般に、抗体被覆細胞上のものなどの抗原−抗体複合体は、補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、これが補体カスケードを活性化して、標的細胞の死をもたらす。補体の活性化は、また、白血球上の補体受容体（たとえば、ＣＲ３）に結合することによってＡＤＣＣを促進する標的細胞表面への、補体成分の沈着という結果になるかも知れない。
ＦｃＲｎ受容体への抗体のｐＨ依存性結合とは、抗体がそのような受容体に、ｐＨ６．０において、ｐＨ７．５におけるよりも強く結合することを意味する。飲作用による内在化後のエンドソームにおける低いｐＨでのＦｃＲｎの結合は、ＩｇＧ抗体をリソソームにおける異化作用分解から救済する。救済されたＩｇＧ抗体は、次いで、中性ｐＨにてＦｃＲｎから解放され、血液循環に再利用される。このようなｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合が、ＩｇＧ抗体（および、本発明のハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク）の長い血清半減期の分子機構の基礎となる（Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６，２０００）。たとえば、ヒトＩｇＧ抗体は、ｐＨ６．０にて、ヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、一方、ｐＨ７．５においては、それらはＦｃＲｎに弱く結合するにすぎない。ＩｇＧ抗体におけるＦｃＲｎ結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの連結部に存在する。μ重鎖は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．５においてＦｃＲｎに結合しないので、天然ＩｇＭは、ＦｃＲｎ媒介経路を利用して、白血球における分解から抗体を救済することができず、したがって、一般に、天然ＩｇＧ抗体よりも短い半減期を有する。
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に移植されている、遺伝子操作された抗体である（たとえば、ＵＳ ５，５３０，１０１および５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ， ＵＳ ５，２２５，５３９，Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ ６，４０７，２１３，Ａｄａｉｒ，ＵＳ ５，８５９，２０５ ６，８８１，５５７，Ｆｏｏｔｅ，ＵＳ ６，８８１，５５７を参照）。アクセプター抗体配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または、生殖細胞系領域配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するＣＤＲのいくつかまたはすべて、ならびに、完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する、可変領域フレームワーク配列および定常領域（存在する場合）を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する、少なくとも１つ、２つ、通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する、重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域（存在する場合）を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来する、少なくとも１つ、２つ、通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列および定常領域配列に由来する、軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域（存在する場合）を有する。ナノボディおよびｄＡｂを除き、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるＣＤＲは、対応するＣＤＲ間で、対応残基（カバトの規定による）の少なくとも８５％，９０％，９５％または１００％が同一であるときは、非ヒト抗体における対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、カバトの規定による対応残基の少なくとも８５％，９０％，９５％または１００％が同一であるときは、それぞれ、ヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に、実質的に由来する。
ヒト化抗体は、しばしば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲ（好ましくは、カバトの規定による）を取り込んでいるが、ヒト化抗体は、すべてよりも少ないＣＤＲ（たとえば、マウス抗体由来の少なくとも３つ，４つまたは５つのＣＤＲ）で作製することもできる（たとえば、Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえば、マウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域が、ヒトの軽鎖定常領域および重鎖定常領域と組み合わされた抗体である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を実質的にまたは完全に保持し、ヒト配列の約２／３である。
張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体は、非ヒト抗体のいくつかの、通常はすべてのＣＤＲ、および、非ヒト可変領域フレームワーク残基を保持するが、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープに寄与するかも知れない他の可変領域フレームワーク残基、たとえば、露出残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）が、ヒト抗体配列の対応位置由来の残基で置き換えられた、１種のヒト化抗体である。その結果、ＣＤＲが、非ヒト抗体に完全にまたは実質的に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが、置換によって、ヒト様とされた抗体となる。
ヒト抗体は、ヒトから単離することができるが、他に、ヒト免疫グロブリン遺伝子の発現からも生じる（たとえば、インビトロでのまたはファージ提示による、遺伝子組み換えマウス）。ヒト抗体を産生する方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇらのトリオーマ法（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６３４，６６４；およびＥｎｇｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ４，６３４，６６６）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子組み換えマウスの使用（たとえば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９３／１２２２７（１９９３）；ＵＳ ５，８７７，３９７，ＵＳ ５，８７４，２９９，ＵＳ ５，８１４，３１８，ＵＳ ５，７８９，６５０，ＵＳ ５，７７０，４２９，ＵＳ ５，６６１，０１６，ＵＳ ５，６３３，４２５，ＵＳ ５，６２５，１２６，ＵＳ ５，５６９，８２５，ＵＳ ５，５４５，８０６，Ｎａｔｕｒｅ １４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ ９１／１０７４１（１９９１）を参照）、および、ファージ提示法（たとえば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９１／１７２７１、ならびに、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９２／０１０４７，ＵＳ ５，８７７，２１８，ＵＳ ５，８７１，９０７，ＵＳ ５，８５８，６５７，ＵＳ ５，８３７，２４２，ＵＳ ５，７３３，７４３およびＵＳ ５，５６５，３３２を参照）が含まれる。
プロテインＡは、もともと黄色ブドウ球菌の細胞壁において発見された、４０〜６０ｋＤａの表面タンパクである。プロテインＡは、マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのほか、ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に、高い親和性で特異的に結合する。プロテインＡは、ヒトＩｇＧ３，ＩｇＡまたはＩｇＭには結合しない。プロテインＡは、抗体のアフィニティ精製に使用される。
プロテインＧは、６５ｋＤａ（Ｇ１４８プロテインＧ）および５８ｋＤａ（Ｃ４０プロテインＧ）の連鎖球菌細胞表面タンパクである。プロテインＧは、血清アルブミン結合ドメインを含むが、ＩｇＧ結合には必要とされず、削除されていることが多い。プロテインＧは、ヒトＩｇＧのすべてのアイソタイプに特異的に結合するが、ＩｇＡおよびＩｇＭには結合しない。プロテインＧも、抗体精製に使用される。
詳細な説明
Ｉ．概説
本発明は、ハイブリッド定常領域、および、ハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクを提供する。ハイブリッド定常領域は、少なくとも、ＩｇＧまたはＩｇＡの定常領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、Ｃμ定常領域のＣμ３領域およびＣμ４領域を含む。ハイブリッドは、両構成要素の定常領域特性を保持している。ハイブリッドは、多価複合体、たとえば、五量体型構造または六量体型構造（図１７に示す）、を形成するＣμ定常領域の能力を保持している。ＩｇＧハイブリッドは、また、比較的長いインビボ半減期に関連するｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、および、精製を容易にするプロテインＧへの特異的な結合を含む、ＩｇＧ特性を保持している。アイソタイプおよびサブタイプ、抗原の性質、ならびに、追加のＩｇＧ ＣＨ１ドメインおよびヒンジドメインの存在に応じて、ＩｇＧハイブリッドは、また、プロテインＡへの特異的結合、エフェクター機能、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化の特性も、保持するかも知れない。ＩｇＡハイブリッドは、ヒトにおいてＦｃアルファ受容体ＣＤ８９に結合するＩｇＡの特性を保持している（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ２４０７１）。
ＩｇＧエフェクター機能、比較的長い半減期、および、精製の容易さと、多量化するＩｇＭの能力との組み合わせは、新規な組み合わせの特性を有する抗体または融合タンパクをもたらす。たとえば、いくつかのこのような抗体または融合タンパクは、ＡＤＣＣ，ＣＤＣ、オプソニン化、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、ならびに、ＩｇＧアイソタイプを有する抗体と比較した、プロテインＡおよびプロテインＧに結合する能力などの、Ｆｃγ媒介特性を維持しながら、または、さらには増強しながら、細胞表面の受容体または結合リガンドを効率よく多量化することができる。異なるアイソタイプ由来の特性の組み合わせは、癌および他の疾患の治療について、従来のＩｇＧ，ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体よりも強力である可能性をもたらす。
多量化するＩｇＭの能力は、また、異なる特異性を有するユニットがＩｇＭ定常領域によって共に保持されている、多重特異性の抗体または融合タンパクの複合体を作製する形式を提供する。
上述の長所は、ハイブリッド抗体または融合タンパクの発現のための核酸構造物の作製に関与する操作以外にインビトロでの操作なしで、達成することができる。
ＩＩ．ハイブリッド定常領域の構成要素
ハイブリッド定常領域は、ＩｇＧ部分またはＩｇＡ部分およびＣμ部分を含む。ＩｇＧ部分またはＩｇＡ部分は、少なくとも、ＩｇＧまたはＩｇＡのＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、ＦｃＲｎ結合、プロテインＡおよびプロテインＧへの結合、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化に、少なくとも部分的に関与する。ＩｇＧ部分は、また、好ましくは、ヒンジ領域および／またはＣＨ１領域を含む。ヒンジ領域は、抗体または融合タンパクの結合領域とエフェクター領域との間に可撓性をもたらし、ＡＤＣＣ、オプソニン化およびＣＤＣなどのエフェクター機能に寄与する。ヒンジ領域は、また、一対のＩｇＧ重鎖を互いに連結するジスルフィド結合の部位でもある。ＣＨ１領域は、軽鎖定常領域と結合し、一般に、軽鎖定常領域を有する軽鎖が存在する形式で含まれるが、融合タンパク、または軽鎖定常領域が存在しない単鎖抗体形式においては、省略可能である。ＩｇＡは、カバトの領域描写によれば、ヒンジ領域を有しない。ただし、ＩｇＡにおいてこれらの領域間の境界に隣接するＣＨ１およびＣＨ２における残基が、ヒンジ領域の役割を効果的に果たす可撓性を提供する。ＣＨ１領域は、好ましくは、抗体軽鎖定常領域を含むＩｇＡ融合に含まれ、好ましくは、他所では省略される。
Ｃμ部分は、Ｃμ定常領域のＣμ３およびＣμ４を含む。Ｃμ部分は、複数の１価または２価の結合ユニットを多量化して、多価複合体とする。本発明を実施するためにメカニズムの理解は必要ではないが、ハイブリッド抗体または融合タンパクの多量化は、異なる単量体のＣμ３領域間の、および異なる単量体のミュー尾部間の、鎖間ジスルフィド結合を通じて、天然のＩｇＭ抗体における態様と類似の態様で生じると考えられる。ＩｇＭのいくつかの多量体は、また、ミュー尾部に結合した１つ以上のＪ鎖も含む。ＩｇＭは、１つ以上のＪ鎖が存在すると、五量体型構造を形成することができ、Ｊ鎖が存在しなければ、六量体型構造を形成することができる。六量体型ＩｇＭは、五量体型よりも強いＣＤＣを有すると報告されている。本発明の抗体または融合タンパクは、ＩｇＭと同様に、五量体型または六量体型の複合体を形成すると考えられるが、より大きいまたはより小さい他の多量体も、同様に、または五量体型または六量体型に代えて、形成されるかも知れない。
上述の構成要素は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＩｇＧまたはＩｇＡのＣＨ１領域（存在する場合）、ＩｇＧヒンジ領域（存在する場合）、ＩｇＧまたはＩｇＡのＣＨ２領域、ＩｇＧまたはＩｇＡのＣＨ３領域、Ｃμ３領域、および、Ｃμ４領域の順序で、配置される。
通常ＩｇＧ領域またはＩｇＡ領域のすべては、同じアイソタイプおよびサブタイプである。すなわち、すべてのＩｇＧ領域は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれかに由来し、すべてのＩｇＡ領域は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のいずれかに由来する。
好ましくは、ＩｇＧ領域またはＩｇＡ領域は、ヒトのＩｇＧ領域またはＩｇＡ領域である。同様に、Ｃμ３領域およびＣμ４領域は、好ましくは、ヒトのものである。ヒトのＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＭの重鎖定常領域の例示的配列を、構成要素（ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，ＣＨ３，Ｃμ１，Ｃμ２，Ｃμ３およびＣμ４ならびにＪ鎖）に区分する説明と共に、図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃに示す。ただし、非ヒト霊長類、ラクダ科、軟骨魚類、マウスまたはラットを含む他の種に由来する領域も、また、使用することが可能である。
ヒトのＩｇＧ領域、ＩｇＡ領域もしくはＩｇＭ領域（つまり、ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，ＣＨ３，Ｃμ３およびＣμ４）またはＪ鎖に言及することは、例示的配列、またはそのアロタイプもしくは同型アロタイプ、または、例示的配列と少なくとも９０，９５，９８もしくは９９％の配列同一性を有し、かつ／あるいは、ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３，Ｃμ３およびＣμ４ならびにＪ鎖の場合には、１，２，３，４，５，１０もしくは１５個までのアミノ酸削除、置換もしくは内部挿入によって、および、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のヒンジ領域については、１，２もしくは３個の削除、置換もしくは内部挿入によって、ＩｇＧ３ヒンジについては、１，２，３，４，５もしくは６個までの削除によって、例示的配列とは異なる他の変異配列に、言及することである。置換（存在する場合）は、好ましくは保存的である。ヒト定常領域は、異なる個体間で、アロタイプ変異および同型アロタイプ変異を示し、つまり、定常領域は、異なる個体において、１つ以上の多型位置にて異なり得る。同型アロタイプは、同型アロタイプを認識する血清が、１つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプと相違する。ヒト定常領域への言及は、あらゆる天然アロタイプ（同型アロタイプを含む）を有する定常領域、または、天然アロタイプの多型位置を占める残基のあらゆる並べ替えを含む。非ヒト定常領域の配列は、たとえば、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースまたはＧｅｎｂａｎｋデータベースによって、提供される。非ヒト定常領域への言及は、同様に、アロタイプ変異もしくは同型アロタイプ変異、およびその並び替え、または、天然配列とは異なる他の変異配列を含む。変異の範囲は、配列同一性、および／または、非ヒト定常領域の天然配列に関する置換の数によって、上述のヒト定常領域に関する変異の説明と類似の態様で、規定される。アイソタイプまたは他の種内の対応する位置を規定すること、または、突然変異位置を定義することにおいては、Ｅｕ番号付け規則が使用される。
重鎖のＣ末端リジンなどの、軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１個または数個のアミノ酸は、分子の一部または全体において、欠落してまたは誘導体化されてもよい。補体媒介細胞毒性またはＡＤＣＣなどのエフェクター効果を、低下させもしくは上昇させるために（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６２４，８２１；Ｔｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８３４，５９７；およびＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５，２００６を参照）、または、ヒトにおける半減期を引き延ばすために（たとえば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照）、定常領域において置換を行うことができる。例示的な置換には、抗体の半減期を増すための、位置２５０のＧｌｎ、および／または位置４２８のＬｅｕが含まれる（ＥＵ番号付け）。位置２３４，２３５，２３６および／または２３７のいずれかにおける置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ、に対する親和性を低下させる（たとえば、ＵＳ ６，６２４，８２１を参照）。随意的に、ヒトＩｇＧ２の位置２３４，２３６および／または２３７はアラニンで置換され、位置２３５はグルタミンで置換される（たとえば、ＵＳ ５，６２４，８２１を参照）。
ヒンジ領域が使用される場合、ヒンジの一部分は、合成リンカー分子で置き換えることが可能である。このようなことは、融合タンパクの結合領域が、たとえば、１０個までのＮ末端残基が合成の可撓性リンカーで置き換えられたヒンジ領域を介して、ＣＨ２およびＣＨ３ ＩｇＧまたはＩｇＡ定常領域に結合された融合タンパクにおいて行われることが多い。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ，Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａおよびこれらの多量体が、そのようなリンカーの例である。このヒンジ領域は、全体を合成リンカーで置き換えること、または、置換なしで省略することが可能である。
ヒンジ領域の一部または全体を置き換える合成リンカー、ならびに、エフェクター機能もしくは以下にさらに説明するＦｃＲｎ結合、およびＮ末端での結合領域の付加を増強または抑制するための、１つまたはいくつかのアミノ酸置換を可能な例外として、ハイブリッド定常領域は、上述のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、Ｃμ３領域およびＣμ４領域以外の配列を含まないことが好ましい。それでも、たとえばヘキサヒスチジンタグなどの、他の配列を加えることが可能であるが、必要ではない。
ＩＩＩ．融合の特性
上述のハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクの特性は、アイソタイプ、ならびに、ＣＨ１領域、ヒンジ領域（存在する場合）、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のサブタイプ、ＣＨ１領域および／またはヒンジ領域が存在するか否か、ならびに、抗体または融合タンパクが結合する抗原の性質に部分的に依存する。
ハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、少なくとも、１価または２価のユニットを多量化してより多価にするＣμ３およびＣμ４の能力、ならびに、ＩｇＧ抗体またはＩｇＡ抗体の少なくとも１つの特性を保持する。ＣＨ１、ヒンジ（存在する場合）、ＣＨ２およびＣＨ３がＩｇＧ起源であるとき、抗体は、少なくとも、プロテインＧへの結合およびｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合というＩｇＧ様の特性とともに、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する。
アイソタイプまたはサブタイプの選択は、所望の特性に依存する。非ハイブリッド抗体に関して、強いエフェクター機能が望まれる場合（癌細胞、病原体に対する場合が多い）は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３が選択され、必要とされるＣＤＣ，ＡＤＣＣおよびオプソニン化がより弱い場合、またはこれらが必要とされない場合（メカニズムが受容体−リガンド相互作用の阻害の場合にあるかも知れない）は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４が選択される。
ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域がヒトＩｇＧ１であるときには、ハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、プロテインＡおよびプロテインＧへの特異的結合を有し、結合した抗原に応じて、ＡＤＣＣ，ＣＤＣ，オプソニン化などのエフェクター機能を有するかも知れない。このようなエフェクター機能は、通常、結合した抗原が表面受容体（たとえば、細胞またはウイルス上のもの）である場合に存在する。抗原が通常は可溶な形態である場合、エフェクター機能は、通常、可溶な抗原に対しては発現しないが、（たとえば、細胞表面上の）結合型の抗原を発現させることによって、証明することができる。
ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域がヒトＩｇＧ２，ＩｇＧ４であるときには、ハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、少なくとも、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合、ならびに、プロテインＡおよびプロテインＧへの特異的結合を示す。ヒトのＩｇＧ２アイソタイプおよびＩｇＧ４アイソタイプは、一般に、ＣＤＣを欠く。ＩｇＧ４は、結合抗原に対していくらかのＡＤＣＣおよびオプソニン化を有するが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３よりも弱い。
ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域がヒトＩｇＧ３であるときには、ハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、少なくとも、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合およびプロテインＧへの特異的結合を示す。このような抗体または融合タンパクは、ＩｇＧ１の場合と同様に、結合抗原が表面抗原であるか可溶であるかに応じて、ＡＤＣＣ，ＣＤＣ、オプソニン化などのエフェクター機能も示すかも知れない。
ＡＤＣＣ，ＣＤＣまたはオプソニン化が存在するハイブリッド定常領域を有する抗体または融合タンパクにおいて、ＡＤＣＣ，ＣＤＣまたはオプソニン化のレベルは、従来のＩｇＧ定常領域を有し他の点では同等の抗体または融合タンパクのレベルと、（実験誤差の範囲内で）同じであることもあり、それよりも高いこともある。
ＩＶ．抗体および融合タンパクの形式
ハイブリッド定常領域は、単一特異性抗体、融合タンパク、および多重特異性複合体に、組み込むことができる。単一特異性抗体の発現について、ハイブリッド重鎖定常領域は、重鎖可変領域に連結して、可変領域および定常領域を含む軽鎖で発現させることが可能である。重鎖および軽鎖は、重鎖および軽鎖の定常領域のＣＨ１領域を介して互いに結合して、ヘテロ二量体を形成する。２つのヘテロ二量体は、次いで、従来の抗体の場合と同様に、重鎖のＩｇＧ部分またはＩｇＡ部分のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の会合によって、対を成して、四量体ユニットを形成する。四量体ユニットは、それらの重鎖定常領域のＣμ部分の会合によって、さらに多量化することができる。重鎖定常領域は、異なる鎖のＣμ３領域間のジスルフィド結合によって、および／または、異なる鎖のミュー尾部間のジスルフィド結合によって、会合し得る。
単一特異性単鎖抗体について、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ペプチドスペーサーによって隔てられた同一鎖の一部として発現する（たとえば、ＵＳ ５，２６０，２０３，ＵＳ ５８６９２０３，ＵＳ ６，２９１，１５９を参照）。ペプチドスペーサーの長さは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が分子内で会合して、１つの重鎖可変領域と分子内で対を成した１つの軽鎖可変領域を含むユニットを形成するか、あるいは、分子間で会合して、各軽鎖可変領域が重鎖可変領域に分子間で結合した、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域の四量体型ユニットを形成するかを、決定する。どちらの場合も、ユニットは、重鎖可変領域に連結しているハイブリッド定常領域のＣμ部分を介して、多量化し得る。Ｃμ部分のジスルフィド結合を介する多量化は、少なくとも５つまたは６つのユニットを含む複合体を生じ得る。
ハイブリッド定常領域は、キメラ抗体、ヒト化抗体、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体またはヒト抗体を含む、あらゆるタイプの改変抗体と共に使用することが可能である。その抗体は、モノクローナル抗体または遺伝子操作されたポリクローナル抗体調製物であり得る（ＵＳ ６，９８６，９８６を参照）。
融合タンパクについて、ハイブリッド定常領域は、異種ポリペプチドに連結して発現される。異種ポリペプチドは、定常領域のＮ末端において結合領域を提供し、単に結合領域と呼ばれることもある。ＩｇＧまたはＩｇＡのＣＨ１領域は、一般に、融合タンパクについては、定常領域に含まれない。ＩｇＧヒンジ領域は、含まれても、含まれなくてもよい。いくつかの融合タンパクにおいて、ヒンジ領域の一部分および全部は、合成リンカーペプチドで置き換えられて、融合タンパクの結合部分とハイブリッド定常領域との間に可撓性をもたらす。
融合タンパクの結合領域は、（とりわけ）今日までに生成されている他の融合タンパクで使用される結合部分の、いずれかのタイプである。結合領域の例は、細胞受容体の細胞外ドメインもしくはそれらのリガンド、またはカウンターレセプター（たとえば、ＴＮＦアルファ受容体、ＬＦＡ３またはＩＬ−１受容体またはＴｒａｉｌ）である。
抗体および融合タンパクの双方は、多重特異性形式で、つまり、異なる標的特異性内で抗体ユニットまたは融合タンパクユニットを含む複合体として、発現することが可能である。個々の特異性は、定常領域のＣμ部分の多量化を介して会合する。複合体中での異なる特異性の数は、たとえば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１または１２であり得る。異なる特異性のユニットの組み合わせは、２つのレベルで生じ得る。第１のレベルにおいては、二重特異性抗体またはヘテロ二量化融合タンパクにおけるように、２価の多量化ユニットが２つの結合特性を含み得る。組み合わせの第２のレベルにおいては、異なる特異性の多量化ユニットが、Ｃμ媒介多量化を介して、互いに組み合わされ得る。このような多量化は、少なくと、約５つまたは６つのユニットの複合体を生成する。
特異性の組み合わせの２つのレベルが集合するとき、この方法は、同じ複合体内に、約１０（五量体）または１２（六量体）の特異性を組み合わせることを可能にする。多くの適用において、特異性のこの数は必要とされる数を超えるが、本発明は、より少ない数（たとえば、わずか２）の特異性が必要とされる適用において、利点をもたらす。特異性が組み合わされる第２のレベルのおかげで、形成される複合体が各所望の特異性のユニットを少なくとも１つ含むことが、統計的にはるかに確実になる。対照的に、二重特異性抗体を従来の方法で発現させるとき、多重特異性ユニットの形成は、単一特異性ユニットの形成と競合して、いくつかは二重特異性であるが、かなりの数が単一特異性である、不均一な抗体集団を生じることになる。
多重特異性形式の抗体において、ユニットは、一般に、異なる重鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域も、同様に異なり得る。しかし、異なる結合特異性を有し、同じ軽鎖可変領域を有する抗体を、（たとえば、ファージ提示を使用して）選択することも可能である。そのような抗体は、ユニットが、異なる重鎖可変領域を有しながら、同じ軽鎖可変領域を有する、多重特異性の形式で組み合わせることができる。
多重特異性の抗体または融合タンパクは、標的（たとえば、癌細胞または病原体）上の抗原に対する結合特異性と、エフェクター細胞上の抗原（たとえば、Ｔ細胞上のＣＤ３）に対する結合特異性とを含むことができる。そのような多重特異性複合体は、標的細胞とエフェクター細胞との間に架橋を形成して、エフェクター細胞の細胞毒性活性またはオプソニン化活性を、促進する。多重特異性の抗体または融合タンパクは、さらに、または代替的に、同一標的（たとえば、癌細胞または病原体）上の２つの異なる抗原に対する結合特異性を含むことができる。そのような抗体または融合タンパクは、標的細胞に対して、単一の抗原に対して特異性を有する抗体または融合タンパクよりも、大きな選択毒性を有し得る。他の多重特異性抗体または融合タンパクは、受容体およびそのリガンドまたはカウンターレセプターの双方に対する結合領域を含む。そのような抗体または融合タンパクは、受容体またはリガンド／カウンターレセプターのみに結合する抗体または融合タンパクよりも、大きい阻害を発揮し得る。これらのいずれ特異性も、同じ多重特異性複合体において他の特性と組み合わせることが可能である。
Ｖ．遺伝子操作および発現
ハイブリッド重鎖定常領域を含む抗体または融合タンパクは、組み換え発現によって産生される。ハイブリッド定常領域は、ＩｇＧ部分またはＩｇＡ部分をコードするＤＮＡ区分を、Ｃμ部分をコードするＤＮＡ区分と融合させることよってなされる。好ましくは、ＩｇＧ部分またはＩｇＡ部分のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸が、Ｃμ３エクソンの最初のアミノ酸に、インフレームで融合される。ハイブリッド定常領域をコードする区分のＮ末端は、抗体の場合は重鎖可変領域、または、融合タンパクの場合は他の結合領域（たとえば、細胞表面受容体の細胞外領域）、であり得る結合領域をコードするＤＮＡ区分に、融合することができる。単一鎖抗体において、少なくとも軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ構造物は、重鎖をコードする区分に、インフレームで融合することができる。これに代えて、軽鎖は、重鎖と同じベクター上の、または別のベクター上の、いずれかの異なる発現ユニットとして、別個に発現することができる。従来の抗体産生の場合と同様に、抗体鎖または融合タンパクをコードするＤＮＡ区分は、一般に、分泌を可能にするべく、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ区分に、Ｎ末端にて機能可能に連結される。
いくつかの構成要素をコードする構造物を構築する際の遺伝因子の融合を行う順序は、重要ではない。たとえば、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ区分を、ハイブリッド定常領域のＩｇＧ部分をコードするＤＮＡに連結することが可能であり、その後、このＩｇＧ部分をコードするＤＮＡを、ＩｇＭ部分をコードするＤＮＡに連結することが可能であり、または、ハイブリッド定常領域をコードする区分を、まず、互いに連結することが可能である。これらの区分は、それぞれの区分をコードする重複するオリゴヌクレオチドを重複ＰＣＲ型反応において結合することによって、同時に連結することもできる。実際には、ハイブリッド定常領域をコードする発現ベクターが一旦生成されると、そのハイブリッド定常領域をコードするＤＮＡ区分を再生成することなく、重鎖可変領域または融合タンパクの場合は他の結合領域（および軽鎖可変領域）を挿入するために、同じベクターを使用することができる。
哺乳類細胞が、本発明の抗体または融合タンパクをコードするヌクレオチド区分を発現するための、好ましいホストである（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照）。無損傷の異種タンパクを分泌するいくつかの好適なホスト細胞株が、当技術分野で開発されており、それには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ヒーラ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびに、Ｓｐ２／０およびＮＳ０を含む抗体非産生骨髄腫が、含まれる。好ましくは、細胞は非ヒト細胞である。抗体を産生するために使用される細胞は、内生的にＪ鎖を発現してもよいし、しなくてもよい。内生的Ｊ鎖が発現されない場合、または不十分なレベルで発現される場合、ホスト細胞は、遺伝子的に変更してＪ鎖を発現させることが可能である（つまり、それをコードする構造物を導入することによる）。しかし、Ｊ鎖を発現しないホスト細胞を使用することも可能である。Ｊ鎖を有するまたは有しない細胞の選択は、生成される抗体または融合タンパクが有する結合価に影響する（たとえば、Ｊ鎖を有する五量体および有しない六量体）。好ましくは、本発明の抗体または融合タンパクは、モノクローナル細胞株から発現される。
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの、発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位などの、必要な処理情報部位、および、転写終結因子配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照。
細胞には、発現すべき抗体または融合タンパクをコードする１つ以上のベクターが導入される。多重鎖抗体については、重鎖および軽鎖は、同じまたは別個のベクター上で発現され得る。多重特異性複合体の発現については、その複合体の構成要素（つまり、異なる抗体または融合タンパク）をコードするＤＮＡは、同じまたは別個のベクター上に存在し得る。
抗体または融合タンパク鎖は、発現され、処理されてシグナルペプチドを除かれ、組み立てられて、ホスト細胞から分泌される。多量化およびＪ鎖との会合は、少なくとも大部分、細胞内で生じ、したがって、抗体または融合タンパクは、そもそも、多量体として、特に、５つまたは６つのユニットがハイブリッド定常領域のＣμ部分を介して会合した多量体として、分泌されると考えられる。
抗体または融合タンパクは、細胞培養物上清から、従来の抗体精製法によって、精製することができる。ハイブリッド定常領域がＩｇＧ部分を含む場合、精製は、親和性試薬としてプロテインＡまたはプロテインＧを用いるクロマトグラフィー工程を含み得る。ハイブリッド定常領域がＩｇＡ部分を含む場合、ジャカリンレクチンアフィニティクロマトグラフィーを、代わりに使用することができる。イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、またはＨＰＬＣなどの従来の抗体精製処理もまた、使用することが可能である（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照）。
ＶＩ．標的
ハイブリッド定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、あらゆる標的に対して作製することが可能である。抗体または融合タンパクは、標的タンパクの凝集が所望の応答を誘導する表面結合標的タンパク（たとえば、細胞上またはウイルス上のもの）に、特に有用である。所望の応答は、たとえば、標的を担持する細胞またはウイルスの除去、受容体を通じてのシグナル伝達であり得、たとえば、アポトーシス、リガンドまたはカウンターレセプターへの受容体の結合の阻害、または、毒物に抱合した抗体または融合タンパクの内在化を含む。抗体または融合タンパクは、市販の抗体または融合タンパクと同じ標的に対して、作製することができ、または、市販の抗体または融合タンパクを誘導体化して、既存の定常領域が本発明のハイブリッド定常領域で置き換えられたものとすることができる。抗体または融合タンパクは、表面結合抗原に結合した標的リガンドに結合することによって、間接的に、表面結合抗原を凝集させることもできる。
１つの可能な作用メカニズムを説明するために、本発明のハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーに対して特異性を有するように生成される。このような受容体は、シグナル伝達のために三量化を必要とする。抗体は、多価（たとえば、五量体または六量体）であるので、腫瘍細胞の表面の抗原を多量化して、アポトーシスおよび／または腫瘍細胞の増殖停止を誘導することができる。癌を処理するこのような多価抗体の有効性は、マウス異種移植モデル、または、他の適当な癌の動物モデルにおいて検討することが可能である。
他のメカニズムを説明するために、ハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、免疫細胞、たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球または樹状細胞、の表面に発現された抗原に対して特異性を有するように生成される。このような抗体は、免疫細胞の表面の抗原を多量化して、正常または異常のシグナル伝達をトリガーすることができる。これに代えて、このような抗体は、細胞表面抗原の内在化をトリガーすることができる。このような免疫細胞の機能は、抗原、細胞のタイプ、および、結合したエピトープに応じて増強または抑制され、免疫系の調節をもたらす。免疫不全を処理するこのような抗体の有効性は、免疫不全の適当なインビトロ系または動物モデルにおいて、検討することが可能である。
他のメカニズムを説明するために、ハイブリッド重鎖定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパクは、感染性細菌、イースト、真菌またはウイルスなどの、病原体によって発現される抗原に対して特異性を有するように生成される。抗体は、感染性微生物またはウイルスを無力化する（たとえば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、オプソニン化により、または、病原体と細胞受容体との相互作用を阻害することにより、または、抗体に付加した有毒部分の作用による）。感染性疾患を処理するこのような抗体の有効性は、感染のインビトロ系または動物モデルにおいて、検討することが可能である。
興味深い標的には、癌細胞上の受容体、およびそのリガンドまたはカウンターレセプター（たとえば、ＣＤ３，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ３０，ＣＤ３４，ＣＤ４０，ＣＤ４４，ＣＤ５２，ＣＤ７０，ＣＤ７９ａ，ＤＲ４，ＤＲ５，ＥＧＦＲ，ＣＡ−１２５／Ｍｕｃ−１６，ΜＣ１受容体，ＰＥＭ抗原，ｇｐ７２，ＥｐＣＡＭ，Ｈｅｒ−２，ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ，ガングリオシド ＧＤ３，ＣＥＡ，ＡＦＰ，ＣＴＬＡ−４，アルファ ｖ ベータ ３，ＨＬＡ−ＤＲ １０ ベータ，ＳＫ−１）が含まれる。興味深い他の標的は、自己抗体または自己免疫疾患を媒介するＴ細胞サブセットである。興味深い他の標的は、成長因子受容体（たとえば、ＦＧＦＲ，ＨＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＥＦＧＲ，ＮＧＦＲ，およびＶＥＧＦＲ）ならびにそれらのリガンドである。他の標的は、Ｇタンパク受容体であり、これには、サブスタンスＫ受容体、アンジオテンシン受容体、αおよびβアドレナリン受容体、セロトニン受容体、およびＰＡＦ受容体が含まれる。たとえば、Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６２５ ６４９（１９８７）を参照。他の標的には、イオンチャンネル（たとえば、カルシウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、カリウムチャンネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、および、ドーパミン受容体が含まれる（Ｈａｒｐｏｌｄ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４０１，６２９およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４３６，１２８を参照）。他の標的は、インテグリン、セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパクである（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４２５ ４３３（１９９０）；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２））。他の標的は、インターロイキン ＩＬ−１ないし今日までの約ＩＬ−３７、腫瘍壊死因子、インターフェロン、ならびに、腫瘍成長因子ベータ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、および、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの、サイトカインである。Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ａｍｐ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９９１）を参照。他の標的は、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレインまたはプリオンペプチドなどのアミロイド生成性ペプチドである。他の標的は、ホルモン、酵素、ならびに、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣなどの細胞内および細胞間の伝達物質である。標的分子は、ヒトの、哺乳類の、または細菌のものであり得る。他の標的は、タンパク、糖タンパク、ウイルスおよび細菌の両方の微生物病原体由来の炭水化物、ならびに腫瘍などの、抗原である。
市販の抗体およびそれらの標的の例には、アレムツズマブ、ＣＤ５２、リツキシマブ、ＣＤ２０、トラスツズマブ Ｈｅｒ／ｎｅｕ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ＥＧＦＲ、ベバシズマブ、ＶＥＧＦ、パリビズマブ、ＲＳＶ、アブシキシマブ、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ ＴＮＦ−アルファ、バシリキシマブ(baciliximab)、ダクリズマブ、ＩＬ−２、オマリズマブ、ＩｇＥ、ゲムツズマブ、ＣＤ３３、ナタリズマブ、ＶＬＡ−４、ベドリズマブ、アルファ４ベータ７、ベリムマブ、ＢＡＦＦ、オテリキシズマブ(otelixizumab)、テプリズマブ ＣＤ３、オファツムマブ、オクレリズマブ ＣＤ２０、エプラツズマブ ＣＤ２２、アレムツズマブ(alemtuzumumab) ＣＤ５２、エクリズマブ Ｃ５、カナキヌマブ(canakimumab) ＩＬ−１ベータ、メポリズマブ ＩＬ−５、レスリズマブ、トシリズマブ ＩＬ−６Ｒ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ ＩＬ−１２、２３が含まれる。市販の融合タンパクの例には、ＴＮＦ−アルファに結合するエタネルセプト、アレファセプト（ＣＤ２に結合するＬＦＡ３−Ｆｃ融合物）、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬに結合するＴＡＣＩ−Ｆｃ融合物、アバタセプト（ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合するＣＴＬＡ−４−Ｆｃ）、および、ロミプロスチム（Ｆｃに融合したトロンボポイエチンのペプチドアナログ）が含まれる。市販の抗体または融合タンパクのいずれも、変更して、既存の重鎖定常領域を、本発明のハイブリッド定常領域で置き換えることが可能である。これに代えて、ハイブリッド定常領域を、上記の市販の抗体または融合タンパクのいずれかと同じ標的特異性（たとえば、競合アッセイによって決定される）を有する他の抗体に、連結することもできる。
ＶＩＩ．免疫抱合体
抗体または融合タンパクは毒物と抱合することができる。毒物は、細胞毒性または細胞増殖抑制性であり得る。毒物のいくつかの例には、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（たとえば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体、ならびに、カルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリフォーム化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。放射性コンジュゲート(radioconjugated)抗体の生成のための、種々の放射性核種が入手可能である。例には、２１２Ｂｉ，１３１Ｉ，１３１Ｉｎ，９０Ｙおよび１８６Ｒｅが含まれる。抗体と毒物との抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール) プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチル ＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（２，６−ジイソシアネートなど）、および、ビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、二官能性タンパクカップリング剤を用いて作製することができる。毒物は、リンカーを介して抗体に連結することも可能であり、そのリンカーは細胞内条件で開裂してもよい（ＵＳ ２００３−００８３２６３，２００５−０２３８６４９および２００５−０００９７５１）。上記の毒物の多くは、細胞内に内在化されたとき、単に有効であるか、または最も有効である。本発明の抗体または融合タンパクは、細胞性受容体に結合することによって内在化することが可能であり、たとえば、細胞性受容体の架橋は、内在化を促進し得る。
ＶＩＩＩ．治療方法および医薬組成物
本発明の抗体または融合タンパクは、上述の市販の抗体が使用されてきた癌を含む癌の治療に使用することが可能である。この方法は、固形腫瘍を治療するのに使用することができ、また、特に、白血病（たとえば、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（ホジキンスもしくは非ホジキンス）、または、多発性骨髄腫などの、血液悪性疾患に使用することができる。固形腫瘍には、皮膚（たとえば、黒色腫）、卵巣、子宮内膜、膀胱、乳房、直腸、結腸、胃、膵臓、肺、胸腺、腎臓および脳のものが含まれる。
本発明の抗体または融合タンパクは、上述の市販の抗体が使用されてきた免疫応答を含む、様々な好ましくない免疫応答を抑制するのにも使用することが可能である。
本発明の抗体または融合タンパクによって治療することが可能な免疫不全の１つの範疇は、移植拒絶反応である。同種異系細胞または器官（たとえば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓、および骨髄）がホストに移植されたとき（すなわち、寄贈者と受贈者が、同じ種の異なる個体である）、ホストの免疫系は、移植中の外来抗原に対して免疫反応（移植片対宿主病）を起こし、移植された組織の破壊に至る。本発明の抗体は、とりわけ、受贈者におけるアロ抗原誘導免疫応答を阻止するのに有用である。
本発明の抗体または融合タンパクについての関連する使用は、「移植片対宿主」病（ＧＶＨＤ）に含まれる免疫応答を調節することにある。ＧＶＨＤは、免疫適格細胞が、同種レシピエント(recipient)に移転されたときに生じる、致死の可能性のある疾患である。この状況において、ドナーの免疫担当細胞は、レシピエントの組織を攻撃するかも知れない。皮膚、腸上皮および肝臓の組織が、しばしば標的となり、ＧＶＨＤの過程において破壊されるかも知れない。この疾患は、骨髄移植の場合など、免疫組織が移植されるときに、特に深刻な問題を示すが、心臓および肝臓の移植を含む他の場合には、より軽度のＧＶＨＤも報告されている。
免疫抑制が望まれるさらなる状況は、タイプ１糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、スティフマン症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、およびエリテマトーデスなどの、自己免疫疾患の治療においてである。これらの疾患において、身体は、それ自体の抗原に対して細胞性および／またはホルモン性の免疫応答を示し、その抗原の破壊、および、可能性としては、深刻なおよび／または致死的な結果に至る。自己免疫疾患は、本発明の抗体または融合タンパクの１つを投与することで治療される。
本発明の抗体または融合タンパクで治療可能な他の免疫疾患には、喘息、アレルギー、セリアック病、乾癬、およびブドウ膜炎が含まれる。セリアック病、乾癬およびブドウ膜炎は、自己免疫疾患である。
抗体または融合タンパクは、また、ウイルス性、細菌性、原生動物性、または真菌性感染などの病原性感染症にも使用することができる。ウイルス性感染症のいくつかの例には、ＨＩＶ、肝炎（Ａ，ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（たとえば、ＶＺＶ，ＨＳＶ−１，ＨＡＶ−６，ＨＳＶ-ＩＩ，ＣＭＶ，およびエプスタイン・バール・ウイルス）、アデノウイルス、ＸＭＲＶ、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、ＭＬＶ関連ウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、および、アルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。細菌性感染症のいくつかの例には、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリウム、ブドウ球菌、連鎖球菌、ニウモノコッカス、髄膜炎菌、および、コノコッカス、クレブシエラ菌、プロテウス菌、セラチア菌、緑膿菌、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、桿菌、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、ライム病原因菌、連鎖球菌、または、ナイセリア菌が含まれる。病原性真菌のいくつかの例には、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、ニューモシスティス、およびスタキボトリスが含まれる。原生動物の例には、クリプトスポリジウム、ランブル鞭毛虫、およびマラリア原虫が含まれる。
抗体または融合タンパクは、発症を遅延し、重度を軽減し、さらなる悪化を阻止し、および／または、疾患の少なくとも１つの兆候または症状を改善する用量、投与経路、投与頻度を意味する有効な投与計画で実施される。患者が既に疾患を患っている場合、投与計画は、治療上有効な投与計画を指し得る。患者が、一般住民と比較して高い疾患の可能性を有するが、未だ症状を経験していない場合、投与計画は、予防上有効な投与計画を指し得る。いくつかの例において、治療上または予防上の有効性は、歴史的対照または同じ患者における過去の経験と比較して、個々の患者において観察され得る。他の例において、治療上または予防上の有効性は、非処理の対照集団と比較して、処理患者の集団での前臨床試験または臨床試験において実証することができる。
抗体または融合タンパクの例示的用量は、固定用量として、０．０１〜２０，０．５〜５，０．０１〜１，０．０１〜０．５もしくは０．０５〜０．５ｍｇ／体重ｋｇ（たとえば、０．１，０．５，１，２，３，４もしくは５ｍｇ／ｋｇ）、または、１０〜１５００ｍｇである。用量は、患者の状態、および、先の処理に対する応答（いくらかでもある場合）、処理が予防的であるか治療的であるか、疾患が急性であるか慢性であるか、その他の因子に依存する。
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内、または筋肉内の経路であり得る。静脈内または皮下投与による、体循環への投与が好ましい。静脈内投与は、たとえば、３０〜９０分の時間にわたる点滴で行うことができる。
投与頻度は、血液循環における抗体または融合タンパクの半減期、患者の状態、投与経路、その他の因子に依存する。頻度は、患者の状態の変化または治療中の疾患の進行に応じて、毎日、毎週、毎月、毎四半期、または、不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的な頻度は、治療理由が継続する期間にわたって毎週ないし毎四半期であるが、より高いまたは低い頻度も可能である。皮下投与については、例示的な頻度は、毎日から毎月であるが、より高いまたは低い頻度も可能である。
投与される用量の数は、疾患が急性であるか慢性であるか、および、治療に対する疾患の反応に依存する。急性疾患、または、慢性疾患の急性憎悪については、１〜１０の用量で十分なことが多い。急性疾患または慢性疾患の急性憎悪については、随意的に分割した態様での単回ボーラス投与で、十分なこともある。急性疾患または急性憎悪の反復に対しては、治療を繰り返すことができる。慢性疾患については、抗体は、少なくとも１年、５年もしくは１０年または患者の生涯にわたって、毎週、隔週、毎月、毎四半期、毎半年などの規則的な間隔で投与することができる。
非経口投与の医薬組成物は、このましくは、無菌で実質的に等張であり、ＧＭＰ条件で製造される。医薬組成物は、単位用量（つまり、単回投与のための用量）の形態で提供することができる。医薬組成物は、生理的に許容される媒体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて、製剤とすることが可能である。製剤は、選択される投与経路に依存する。たとえば、抗体は、水溶液で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、生理食塩水、または酢酸緩衝液などの生理的に許容される緩衝液中で（注射部位の不快感低減のため）、製剤することができる。溶液は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。これに代えて、抗体は、滅菌した発熱性物質非含有水などの好適な媒体で使用前に調製するために、凍結乾燥の形態とすることもできる。
本発明の抗体での治療は、治療中の疾患に対して有効な他の治療と組み合わせることが可能である。免疫異常の治療について、従来の治療には、肥満細胞脱顆粒阻害剤、副腎皮質ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、ならびに、アザチオプリン、シクロホスファミド、ロイケラン、ＦＫ５０６、および、シクロスポリンなどの、より強力な抗炎症剤が含まれる。Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）またはＨｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）などの生物学的抗炎症剤も、使用することができる。癌の治療に使用するとき、本発明の抗体は、化学療法、放射線、幹細胞治療、手術、もしくは、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、もしくは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などのＥＧＦ受容体への抗体などの、生物製剤での治療と組み合わせることができる。化学療法剤には、クロランブシル、シクロホスファミド、または、メルファラン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、および、ミトキサントロン、メソトレキセート、フルダラビン、および、シタラビン、エトポシド、または、トポテカン、ビンクリスチン、および、ビンブラスチンが含まれる。感染について、治療は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または、抗原虫剤など、と組み合わせることができる。
ＩＸ．他の適用
抗体または融合タンパクは、臨床診断もしくは治療において、または研究において、それらの標的分子を検出するために使用することができる。たとえば、抗体は、治療に適する免疫媒介疾患を患者が患っていることの目安として、癌関連抗原を検出するために使用することができる。抗体は、また、標的および種々の刺激に対するそれらの応答の検出における研究室用の研究試薬として、販売することも可能である。そのような用途では、抗体または融合タンパクは、蛍光分子、スピンラベル分子、酵素またはラジオアイソトープで標識することが可能であり、アッセイを行うために必要なすべての試薬を有するキットの形態で、提供することができる。抗体または融合タンパクは、それらの標的抗原を、たとえば、アフィニティクロマトグラフィーによって、精製するために使用することもできる。
上記または下記で引用するすべての特許出願、ウェブサイト、他の出版物、受託番号などは、個々の各項目が、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれると、具体的かつ個別に示されているのと同様に、あらゆる目的のために参照によって全体が取り込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点で受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日の受託番号に関連付けられたバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日、または、該当する場合、受託番号に言及する優先出願の出願日の、早い方を意味する。同様に、出版、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、そうでないと示されない限り、本出願の出願日における最新公開のバージョンを意味する。本発明の、あらゆる特徴、ステップ、要素、実施形態、または側面は、具体的にそうでないと示されない限り、他のいずれとも組み合わせて使用することが可能である。本発明を、明瞭化および理解のために、図面および例を用いてある程度詳しく説明したが、添付の特許請求の範囲内で、ある程度の変更および修正を実施してもよいことが、明らかであろう。
実施例１：発現ベクター
本研究における遺伝子クローニング、突然変異生成、およびプラスミド構築は、標準的な生物学的手法を用いて行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９３：５５６−５６５，２００１），およびＣｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３−３６２１，１９９７）を参照。これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
マウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１）からキメラＩｇＧ１を生成するための哺乳類発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１（図１）を、次の遺伝要素を含むように構築した。図１のｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１のＳａｌＩ部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始する、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターおよびエンハンサー（図におけるＣＭＶ−Ｐ）で始まる重鎖転写ユニットを含む。ＣＭＶプロモーターに続いて、ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接するマウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６の重鎖可変領域エクソン（９Ｇ６ ＶＨ）、介在するイントロン共に、ＣＨ１エクソン（ＣＨ１（γ１））、ヒンジエクソン（ｈ（γ１））、ＣＨ２エクソン（ＣＨ２（γ１））およびＣＨ３エクソン（ＣＨ３（γ１））を含むヒトγ−１重鎖定常領域を含むゲノム配列、ならびに、ヒトγ−１重鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。重鎖遺伝子配列の後には、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−Ｐ）で始まる軽鎖転写ユニットがあり、これに続いて、ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位が隣接するマウス抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナル抗体９Ｇ６の軽鎖可変領域エクソン（９Ｇ６ ＶＬ）、イントロンの一部が先行するヒトカッパー鎖定常領域エクソン（ＣＬ）を含むゲノム配列、ならびに、ＣＬエクソンに続くヒトカッパー鎖遺伝子のポリアデニル化部位が存在する。その後、軽鎖遺伝子には、ＳＶ４０早期プロモーター（ＳＶ４０−Ｐ）、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシル転移遺伝子（ｇｐｔ）、および、ＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０−Ａ）を含む区分が続く。最後に、プラスミドは、細菌起原の複製（ｐＵＣ ｏｒｉ）およびβラクタマーゼ遺伝子（β ｌａｃｔａｍａｓｅ）を含むプラスミドの一部ｐＵＣ１９を含む。図における矢印は、転写の方向を示す。
抗ヒトＣＤ７９ａモノクローナルＩｇＧ抗体９Ｇ６を産生するマウスハイブリドーマは、ＪＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にて、免疫原としての組み換えＣＤ７９ａタンパク、およびそれに続く標準的なハイブリドーマ技術を用いて生成された。ＶＨ配列およびＶＬ配列は、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３，２００５）に記載されているものなどの、標準的な実験手順で決定した。ＳｐｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにおける９Ｇ６ ＶＨ遺伝子は、コード化領域の３’端にスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして、設計した。このシグナルペプチドを含み、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１のＶＨエクソンによってコードされる９Ｇ６ ＶＨのアミノ酸配列を、以下に示す。成熟９Ｇ６ ＶＨ配列は、配列番号１の位置２０に始まる。
９Ｇ６ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１）：
ＭＧＷＳＲＩＦＬＦＬＬＳＩＴＡＧＶＨＣＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＴＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＶＤＳＡＶＹＦＣＥＲＦＹＹＧＮＴＦＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの９Ｇ６ ＶＬ遺伝子も、コード化領域の３’端にスプライスドナーシグナルを含むエクソンとして、設計した。このシグナルペプチドを含み、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１のＶＬエクソンによってコードされる９Ｇ６ ＶＬのアミノ酸配列を以下に示す。成熟９Ｇ６ ＶＬ配列は、配列番号２の位置２０に始まる。
９Ｇ６ ＶＬのアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳＤＶＬＭＴＱＩＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１にコードされる免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域（配列番号３）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１にコードされる免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１にコードされる軽鎖定常領域（配列番号４）：
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１を変更して、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域（それぞれＣμ３およびＣμ４）をコードするｃＤＮＡ由来のフラグメントが、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１のヒンジ領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合するように、新たな発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍを構築した。Ｃμ３およびＣμ４のアミノ酸配列を以下に示す。
ヒトμ重鎖のＣμ３およびＣμ４（配列番号５）：
ＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
ヒトγ−１重鎖のＣＨ２エクソンおよびＣＨ３エクソンは、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍにおいて削除した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１の軽鎖配列は、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍにおいて変更しなかった。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍの模式的な構造を図１に示す。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍにコードされる重鎖定常領域には、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトガンマ−１重鎖のＣＨ１領域およびヒンジ領域、ならびに，Ｃμ３領域およびＣμ４領域が含まれる。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍにコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を、以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍにコードされる重鎖定常領域（配列番号６）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１もまた、Ｃμ３およびＣμ４のコード化領域が、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸にインフレームで融合するように、変更した。軽鎖配列は変更しなかった。得られたプラスミドｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の模式的な構造を図１に示す。ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１にコードされる重鎖定常領域（配列番号７）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１から産生される単量体型の抗体（それぞれ、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１）の模式的な構造を、図２に示す。図中の記号「ＣＨ１」、「ヒンジ」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」は、ヒトガンマ重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域をそれぞれ示す。記号「Ｃμ３」および「Ｃμ４」は、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域をそれぞれ示す。記号「ＣＬ」は、ヒトカッパー定常領域を示す。
実施例２：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ１抗体の発現、精製および特徴付け
発現ベクターｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１を、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に導入して、それぞれＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１抗体，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１抗体を安定的に産生する細胞株を得た。ＮＳ０細胞を、７．５％ＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含有するＤＭＥ培地で培養した。ＮＳ０への安定導入を、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５，１９９２）に記載されているように、エレクトロポレーションによって行った。導入に先立ち、各発現ベクターを、ＦｓｐＩを用いて直線化した。一般的な実験において、約１０７個の細胞に、２０μｇの直線化プラスミドを形質移入し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ培地に懸濁し、９６ウェルプレートに播いた。４８時間後、選択培地（１０％ＦＢＳ、ＨＴ培地添加物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．２５ｍｇ／ｍｌキサンチンゲルおよび１μｇ／ｍｌミコフェノール酸を含有するＤＭＥ培地）を適用した。選択開始の約１０日後、形質転換体の培養上清を、抗体産生についてアッセイした。
抗体の発現を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。一般的な実験において、ＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）中１／２，０００希釈の、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異性ポリクローナル抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１について）、または、抗ヒトＩｇＭ Ｆｃμ鎖特異性ポリクローナル抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍについて）で、４℃にて一晩被覆し、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、ブロック緩衝液（２％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で、室温にて０．５時間ブロックした。洗浄緩衝液で洗浄後、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で適当に希釈した１００μｌ／ウェルの試験試料を、ＥＬＩＳＡプレートに施した。適当なヒトＩｇＧ／κ抗体またはＩｇＭ／κを標準として用いた。ＥＬＩＳＡプレートを室温にて１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した後、結合した抗体を、１００μ／ウェルのＥＬＩＳＡ緩衝液中１／２，０００希釈のＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトカッパー鎖ポリクローナル抗体を用いて、検出した。室温にて１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質を添加することにより、発色現像を行った。１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸を添加することにより、発色現像を停止した。４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１抗体の各々を産生するＮＳ０安定形質転換体を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる無血清培地中での培養に付し、ローラーボトル中で約１０６／ｍｌの濃度まで培養し、１／１０倍体積の６０ｍｇ／ｍｌの、ＳＦＭ４ＭＡｂ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）に溶解したＵｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｅｄ Ｓｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を与え、細胞生存率が５０％未満になるまで、さらに培養した。遠心分離およびろ過の後、培養液上清を、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１のために、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭＡＢＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に載せた。カラムをＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍは、ヒトガンマ−１重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を欠いており、プロテインＡに結合しないので、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍを産生するＮＳ０安定形質転換体の培養液上清は、ヤギ抗ヒトＩｇＭアガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）に載せた。抗ヒトＩｇＭアガロースカラムをＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で抗体を溶出した。溶出したすべての抗体の緩衝液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和し、次いで透析によってＰＢＳに変えた。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、抗体濃度を決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４ＯＤ）。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１がヒトＣＤ７９ａに特異的に結合することが確認された。
精製したＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１抗体の特徴を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標準的な手順に従って明らかにした。還元条件下での分析は、各抗体が２つの鎖を含むことを示唆した。各鎖の分子量を、ゲル上での移動度を分子量マーカーの移動度と比較することによって、見積もった。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１に共通である軽鎖は、約２６ｋＤａの分子量を有すると見積もられた。重鎖は、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１については５４ｋＤａ、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍについては５８ｋＤａ、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１については７６ｋＤａであると見積もられた。軽鎖および重鎖の各々の見積もった分子量は、対応するアミノ酸配列に基づく予想分子量と一致した。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の天然型での分子サイズを、球状タンパクの分離範囲が５ｋＤａ〜５，０００ｋＤａであるＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを有する、ＡＫＴＡ Ｂａｓｉｃ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いるゲルろ過により分析した。溶出緩衝液にはＰＢＳを使用した。図３Ｃ〜図３Ｅに、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１（図３Ｃ）、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ（図３Ｄ）およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１（図３Ｅ）の溶出パターンを示す。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１については、それぞれ、溶出量１６．７ｍｌおよび９．９ｍｌに、１つの主要なピークのみが観察され、一方、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍについては、２つの主要なピークと、いくつかの小さなピークが存在した。骨髄腫細胞株から精製したヒトモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）は、１０．４ｍｌに溶出した（図３Ｂ）。分子量標準物質（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の溶出パターン（図３Ａ）と比較することにより、溶出量１１．７ｍｌおよび１４．８ｍｌの２つの大きなピークにおけるＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍの分子量は、それぞれ、約８００ｋＤａおよび２２０ｋＤａと見積もられた。主要なピークにおけるＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１の分子量は、１５４ｋＤａと見積もられ、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのその重鎖および軽鎖のサイズに基づく、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１単量体の予測分子量（１６０ｋＤａ）に対応する。ヒトＩｇＭが１０．４ｍｌに溶出したのに対して、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は９．９ｍｌに溶出しており、これは、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１がヒトＩｇＭよりも僅かに大きいことを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の重鎖および軽鎖の分子量が、それぞれ、７６ｋＤａおよび２６ｋＤａであることを示唆しているので、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の単量体の分子量は約２００ｋＤａであると計算され、これは、ヒトＩｇＭの単量体（概略１８０ｋＤａ）よりも僅かに大きい。骨髄腫細胞から精製したヒトＩｇＭは、五量体として（または、おそらく六量体として）存在し易いので、したがって、ＮＳ０細胞から精製したＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１もまた、天然型では五量体または六量体として存在すると結論付けられた。
実施例３：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ１抗体によるアポトーシス
ヒトバーキットリンパ腫細胞株ラモスは、膜結合ＩｇＭ／ラムダ、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂタンパクから成るＢ細胞受容体細胞表面に発現する（Ｏｌｌｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３５３７−３５５１，２００７；Ｒｅｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：９７−１２１，１９９２）。架橋によるＢ細胞受容体の多量化は、ラモス細胞のアポトーシスを誘導する（前記Ｏｌｌｉａ ｅｔ ａｌ．）。
ラモス細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥ媒質中で培養される。ＣＤ７９ａタンパクへの結合を介して細胞表面上のＢ細胞受容体を多量化して、アポトーシスを誘導するＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１抗体の能力を評価するために、各抗体を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で、３倍のラモス細胞とインキュベートした。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１には、１μｇ／ｍｌの濃度で、架橋のために、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体も加えた。アポトーシスの陽性対照として、１μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ポリクローナル抗体を、ラモス細胞とインキュベートした。７．５％ＣＯ２インキュベータ中で３日間培養した後、細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造者のプロトコルに従って測定した。
試験抗体の存在下における吸光度値を試験抗体の非存在下における吸光度値に対して規格化することによって、パーセント細胞生存率を計算した。細胞なしでの吸光度値を背景として使用した。生存率は、ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ポリクローナル抗体について６９％（図中「抗ラムダ ｐＡＢ」）、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１について１０７％、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１とヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体の混合物（図中「Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１＋抗ヒトＩｇＧ」）について４２％、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１について５３％であった。２価Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１は、ラモス細胞のアポトーシスを誘導しなかったが、架橋Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１は、アポトーシスを誘導することができた。Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は、架橋Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１が誘導したのとほぼ同じ効率で、ラモス細胞のアポトーシスを誘導した。多価抗ＣＤ７９ａ抗体として機能するＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は、細胞表面のＢ細胞受容体を多量化し、ラモス細胞のアポトーシスを誘導することができる（図４）。
実施例４：新生児Ｆｃ受容体への多価ＩｇＧ１抗体の結合
ｐＨ依存性の態様でＦｃＲｎに結合するＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１抗体の能力を、細胞表面にヒトＦｃＲｎを発現するＮＳ０細胞（ＮＳ０／ＦｃＲｎ細胞）を用いるフローサイトメトリーによって分析した。ＦｃＲｎ α鎖およびβ２−マイクログルブリンから成るヘテロ二量体である、ヒトＦｃＲｎを細胞表面に安定的に発現するＮＳ０／ＦｃＲｎ形質転換体を、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３−６２１６ ２００４）に記載されている一般的手順に従って生成した。この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。１次染色工程において、１μｇ／ｍｌのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１を、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載の手順に従って、個別に、ｐＨ６．０および７．５で、ＮＳ０／ＦｃＲｎ細胞とインキュベートした。２次染色工程において、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトガンマ鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１について、抗体対照なし）、または、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトμ鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１について、抗体対照なし）を用いて、ＦｃＲｎに結合する抗体を検出した。図５に示すように、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は両方とも、ｐＨ６．０にて、ＦｃＲｎに強く結合した。それらのＦｃＲｎ結合は、ｐＨ７．５においてはｐＨ６．０よりも有意に弱く、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合を表し、これらの抗体が長い血清半減期を有することを示唆した。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍは、ｐＨ６．０および７．５の両方においてＦｃＲｎにほとんど結合せず、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍの血清半減期が短いことを示唆した。このことは、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭがＦｃＲｎへの結合部位を欠くことと、合致している。
実施例５：ＣＤ１６への多価ＩｇＧ１抗体の結合
細胞結合したＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ３抗体のＦｃ領域と、ＮＫ細胞の表面に発現したＣＤ１６分子（Ｆｃγ受容体タイプＩＩＩとも呼ばれる）との相互作用は、ヒトにおける抗体結合した細胞に対するＮＫ細胞による、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）をトリガーする（Ｈｕｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１−１２７，１９９４）。ＣＤ１６結合部位は、ヒトガンマ−１鎖およびヒトガンマ−３鎖のＣＨ２領域にコードされる下ヒンジに存在する（Ｓａｒｍａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−６３９，１９９２）。
ヒトＣＤ１６への多価ＩｇＧ１抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。１次抗体結合工程にて、表面にヒトＣＤ１６を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０２５％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ）中の、１μｇ／ｍｌのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１またはマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ１６ ＩｇＧ抗体３Ｇ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と、氷上で３０分インキュベートした。対照として、ヒトＣＤ１６を発現するＨＥＫ２９３細胞も、試験抗体なしでインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２次染色工程にて、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中の、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギポリクローナル抗ヒトガンマ重鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１について、抗体対照なし）、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトμ重鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１について、抗体対照なし）、または、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗マウスガンマ重鎖抗体と、氷上で１５分インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、染色した細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
マウス抗ＣＤ１６抗体は、ヒトＣＤ１６を一次的に発現するＨＥＫ２９３細胞に、強く結合した（図６Ｉ）。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１も、ヒトＣＤ１６への強い結合を示した（図６Ｄ）。Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１よりもさらに強いヒトＣＤ１６への結合を示し（図６Ｆ）、ＡＤＣＣを発揮する能力を示唆した。一方、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍは、ＰＥ標識ヤギ抗μ重鎖抗体で染色しただけの細胞と比べたとき（図６Ｃ）、ヒトＣＤ１６への僅かな結合を示すのみであった（図６Ｅ）。ＣＤ１６へのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍの見かけ上の弱い結合は、ＰＥ標識ヤギ抗μ重鎖抗体によるのではない。なぜならば、２次染色工程でＰＥ標識ヤギ抗μ重鎖抗体を使用したときに、ＣＤ１６へのＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の強い結合が観察された（図６Ｇ）からである。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭがＣＤ１６に結合し得ないということは、ＡＤＣＣ活性がないという結果になり、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍがヒトガンマ−１重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を欠いていることと、合致している。
実施例６：多価抗ＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体の生成、発現、精製および特徴付け
抗ヒトＣＤ３０モノクローナル抗体Ｓａｎ１１を産生するマウスハイブリドーマは、ＪＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて、組み換えヒトＣＤ３０タンパクを免疫原として用い、標準的なハイブリドーマ手法に従って、単離された。Ｓａｎ１１ ＶＨ配列およびＶＬ配列を、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（前記）に記載された方法などの標準的な実験手順で決定した。Ｓａｎ１１ ＶＨ配列を、シグナルペプチドを含めて、以下に示す。成熟天然Ｓａｎ１１ ＶＨアミノ酸配列は、配列番号８の位置２０に始まる。
Ｓａｎ１１ ＶＨ（配列番号８）：
ＭＫＣＳＷＶＩＦＦＬＭＡＶＶＴＧＶＮＳＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＭＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＤＴＩＹＤＰＮＦＱＧＫＡＴＩＴＡＹＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＧＳＳＹＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ。
Ｓａｎ１１ ＶＬアミノ酸配列を、シグナルペプチドを含めて、以下に示す。成熟天然Ｓａｎ１１ ＶＬ配列は、配列番号９の位置２１に始まる。
Ｓａｎ１１ ＶＬ（配列番号９）：
ＭＥＳＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＧＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＩＡＭＹＦＣＱＱＳＲＫＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ。
哺乳類発現ベクターｐＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を、次の手順で構築した。まず、コード化領域の３’端のスプライスドナーシグナルを含み、ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接するエクソンとして、Ｓａｎ１１ ＶＨ遺伝子を構築した。同様に、スプライスドナーシグナルを含み、ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に隣接するエクソンとして、Ｓａｎ１１ ＶＬ遺伝子を構築した。Ｓａｎ１１ ＶＨエクソンを担持するＳｐｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、および、Ｓａｎ１１ ＶＬエクソンを担持するＮｈｅＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１の対応する部位に導入して、ｐＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１を生成した。同様に、Ｓａｎ１１ ＶＨエクソンを担持するＳｐｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、および、Ｓａｎ１１ ＶＬエクソンを担持するＮｈｅＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の対応する部位に導入して、ｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を生成した。ｐＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の全体構造は、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の全体構造（図１）と、それぞれ同一であった。ｐＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１から産生される抗体（それぞれ、ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１）の模式的構造を図２に示す。
ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に記載のように行った。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによるＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の精製を、実施例２に記載のように行った。還元条件下でのＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各抗体が２つの鎖を含むことを示した。分子量マーカーと比較することによって、軽鎖の分子量は、ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の双方について、２５ｋＤａであると見積もられた。重鎖の分子量は、ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１について５３ｋＤａ、ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１について７９ｋＤａであると見積もられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された軽鎖および重鎖それぞれのサイズは、対応するアミノ酸配列に基づく予想サイズに合致していた。
天然のＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１抗体およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１抗体の分子サイズを、実施例２に記載のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬを用いるゲルろ過によって分析した。ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１抗体およびＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１抗体の溶出パターンを図７に示す。ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１は、単一の主要なピークを、溶出量１５．７ｍｌに示した（図７Ｃ）。検量線を分子量標準物質（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＢｉｏＲａｄ）の溶出パターン（図７Ａ）と比較することにより、主要なピークにおけるＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１の分子量は、約１５０ｋＤａであると見積もられた。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの軽鎖および重鎖のサイズに基づくＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１単量体の予測分子量（１５６ｋＤａ）に対応する。ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、単一の主要なピークを、溶出量９．９ｍｌに示した（図７Ｄ）。ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、同じ条件下で、１０．４ｍｌに溶出した（図７Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づき概略２０８ｋＤａという分子量を有しているＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１が、ヒトＩｇＭの単量体（約１８０ｋＤａ）よりも僅かに大きいことを考慮すると、ＮＳ０細胞から精製したＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、天然型において、五量体または六量体として存在すると結論付けられた。
モノクローナル抗ＣＤ３０ＩｇＧ抗体とポリクローナル抗ＩｇＧ抗体との混合物での処理による、細胞表面のＣＤ３０タンパクの架橋は、ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｋａｒｐａｓ ２９９（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：３７３６−３７４２，２００２）の細胞分裂停止を引き起こした。ＣＤ３０タンパクを架橋させるＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の能力を調べるために、２ｘ１０５個のＫａｒｐａｓ ２９９細胞を、９６ウェルプレートにおいて、（ａ）２μｇ／ｍｌのＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１、（ｂ）２μｇ／ｍｌのＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１と１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体との混合物、または、（ｃ）２μｇ／ｍｌのＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１、の存在下で、１０％ＦＢＳ含有の０．２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０媒体中でインキュベートした（図８）。５日間のインキュベーションの後、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とインキュベートし、デヒドロゲナーゼ活性、したがって細胞生存率の指標となる４５０ｎｍでの吸光度を測定した。試験抗体の存在下における吸光度値を、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞に結合しない対照ＩｇＧ抗体の存在下における吸光度値に対して規格化することによって、パーセント細胞生存率を計算した。細胞なしでの吸光度値を背景として使用した。Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞の生存率は、ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１の存在下では９５％、ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１とヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体との混合物（図中、「ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１（架橋）」）の存在下では４４％、ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の存在下では４８％であった（図８）。ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体で架橋したＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１と同程度の効率で、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞の細胞分裂停止を誘導した。ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、したがって、多価抗体として機能し、細胞表面のＣＤ３０分子を架橋させて、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞の増殖停止を誘導する。
実施例７：ＨＥＫ２９３細胞におけるＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の発現
ＩｇＭは、たとえば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０におけるように、Ｊ鎖が存在するとき五量体を形成し、一方、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯにおけるように、Ｊ鎖が存在しないときには、ＩｇＭは六量体を形成する（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．１８：１６７−１７４ ２００８）。Ｊ鎖がないときの構造を調べるために、ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を、ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３において発現させた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、提供者のプロトコルに従って、ｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１ベクターをＨＥＫ２９３細胞に一時的に導入した。一時的に導入されたＨＥＫ２９３細胞の培養上清を、実施例２に記載の手順に従って、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲルろ過を用いて分画した。各０．５ｍｌ画分中のＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の存在を、実施例２に記載のように、ＥＬＩＳＡで監視した。図９に、各画分のＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１のレベルを示す。ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１の最も高いＥＬＩＳＡシグナルが、溶出量９．０ｍｌに観察された。単量体型ＣｈＳａｎ１１−ＩｇＧ１抗体が溶出する（図７Ｃ）、溶出量１６ｍｌ付近の画分では、顕著なＥＬＩＳＡシグナルは検出されなかった。ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体は、同じ条件下で１０．４ｍｌに溶出したので、天然ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、ＩｇＭよりも大きい。したがって、ＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１は、Ｊ鎖が存在しないとき、五量体または六量体で、あるいはおそらく六量体よりも大きく、産生されると結論付けられた。
実施例８：多価キメラ抗ＤＲ５ ＩｇＧ１抗体の生成、発現、精製および特徴付け
マウス抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体のＶＨ遺伝子のコード化領域を、シグナルペプチドコード化配列、スプライスドナーシグナル、ならびに、隣接ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むエクソンに変換した。同様に、マウス抗ＤＲ５モノクローナル抗体のＶＬ遺伝子を、シグナルペプチドコード化配列、スプライスドナーシグナル、ならびに、隣接ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を含むエクソンに変換した。マウス抗ＤＲ５モノクローナル抗体の、ＶＨエクソンを担持するＳｐｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびＶＬエクソンを担持するＮｈｅＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１の対応する部位に導入して、ｐＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１を生成した。同様に、ＳｐｅＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩ ＶＨフラグメントおよびＮｈｅＩ〜ＥｃｏＲＩ ＶＬフラグメントをｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１に導入して、ｐＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１を生成した。ｐＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびｐＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の全体構造は、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子が異なることを除いて、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１およびｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１の全体構造（図１）と、それぞれ同一である。ｐＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびｐＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１から生成された抗体（それぞれ、ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１）の模式的構造を、図２に示す。
ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の各々を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に記載のように行った。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによるＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の精製を、実施例２に記載の方法で行った。還元条件下でのＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各抗体が、２つの鎖：２つの抗体に共通のサイズの軽鎖、および、抗体ごとに異なるサイズを有する重鎖、を含むことを示した。ゲル上での分子量マーカーの位置を比べることによって、共通軽鎖の分子量は、２６ｋＤａであると見積もられた。重鎖の分子量は、ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１について５１ｋＤａ、ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１について７５ｋＤａであると見積もられた。
天然のＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１抗体およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１抗体のサイズを、実施例２に記載のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを用いるゲルろ過で分析した。それらの溶出パターンを図１０Ａ〜図１０Ｄに示す。ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１は、単一の主要なピークを、溶出量１５．９ｍｌに示した（図１０Ｃ）。分子量標準物質（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＢｉｏＲａｄ）の溶出パターン（図１０Ａ）と比較することにより、主要なピークにおけるＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１の分子量は、約１５０ｋＤａと見積もられた。これは、ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１の単量体の予測分子量に対応する。ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１は、単一の主要なピークを、溶出量９．２ｍｌに示した（図１０Ｄ）。ヒト骨髄腫細胞（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）から精製したヒトＩｇＭモノクローナル抗体は、１０．４ｍｌに溶出したので（図１０Ｂ）、ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の分子サイズは、ヒトＩｇＭの分子サイズはよりも僅かに大きい。ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の単量体が概略２００ｋＤａであり、ヒトＩｇＭの単量体が約１８０ｋＤａであることを考慮すると、ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１は、天然型において、五量体または六量体で存在すると結論付けられる。
表面のＤＲ５分子の架橋は、ヒトＴ細胞白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔのアポトーシスを誘導する（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１９４０−４１９５２，２００５）。アポトーシスを誘導するＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１およびＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１の能力を、Ｊｕｒｋａｔ細胞とのインキュベーションにより見積もった。３セットの試験抗体、（ｉ）ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１、（ｉｉ）架橋用の１０倍過剰のヤギ抗ヒトガンマ重鎖ポリクローナル抗体と混合したＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１、および、（ｉｉｉ）ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１、を３３３ｎｇ／ｍｌを最終濃度として始まる３倍段階希釈の様々な濃度で加えた。細胞を、７．５％ＣＯ２インキュベータ中で、３７℃にて１日、９６ウェルプレートで培養した。ＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて、細胞生存率を測定した。試験抗体なしのＪｕｒｋａｔ細胞の吸光度値を１００％生存率に用い、細胞なしの値を背景に用いた。結果を図１１に示す。ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１は、アポトーシスを誘導する能力を示さなかった。１０倍過剰のヤギ抗ヒトガンマ重鎖ポリクローナル抗体で架橋したＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１（図中、「ＣｈＡＤＲ５−ＩｇＧ１（架橋）」）は、１１１ｎｇ／ｍｌにて７０％の細胞死を、４ｎｇ／ｍｌにて２０％の細胞死を示した。ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１は、より強いアポトーシス誘導能、３３３ｎｇ／ｍｌ〜１．４ｎｇ／ｍｌでの９０％以上の細胞死を示した。ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１は、０．１５ｎｇ／ｍｌにて４０％近い細胞死を示した。このように、ＣｈＡＤＲ５−ＭＶＩｇＧ１は、多価抗体として機能し、細胞表面のＤＲ５分子を効率よく架橋させた。
実施例９：多価抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４抗体の生成
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１におけるヒトガンマ−１重鎖のゲノムＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の配列を、ヒトガンマ−４重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域（図中、それぞれＣＨ１（γ４），ｈ（γ４），ＣＨ２（γ４）およびＣＨ３（γ４））（図１）をコードするｃＤＮＡ由来フラグメントで置き換えることによって、キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４モノクローナル抗体を発現するためのｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ４ベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ４にコードされるガンマ−４重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域（配列番号１０）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
Ｃμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ４（図１）のＣＨ３領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合することによって、多価キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ４モノクローナル抗体を発現するためのｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４ベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４にコードされる重鎖定常領域（配列番号１１）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に記載のように行った。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによるＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４の精製を、実施例２に記載の方法で行った。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４が約２５ｋＤａの軽鎖および約７８ｋＤＡの重鎖を含むことを示した。
天然Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４の分子サイズを、実施例２に記載のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムを用いるゲルろ過によって分析した。１つの大きいピーク（溶出量１０．１ｍｌ）および１つの小さいピーク（溶出量１４．１ｍｌ）が、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４の溶出パターンに観察された（図１２）。ＢｉｏＲａｄの分子量標準物質（図１２Ａ）およびヒトＩｇＭ（１０．４ｍｌに溶出；図１２Ｂ）と比較し、単量体型のＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４（〜２０８ｋＤａ）およびＩｇＭ（〜１８０ｋＤａ）の予想サイズを考慮することによって、１０．１ｍｌに溶出するＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４は、五量体または六量体であると結論付けられた。このような多量体型Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ４が、全精製抗体の８３％を成した。
実施例１０：多価ＩｇＧ３抗体の発現、精製および特徴付け
キメラ抗ＣＤ７９ａ ＩｇＧ３モノクローナル抗体およびその２つの誘導体を発現するために、３つのベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１におけるヒトガンマ−１重鎖のゲノムＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を担持するｄＩＩＩ〜ＥａｇＩフラグメントを、ヒトガンマ−３重鎖のゲノムＣＨ１領域、第４ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域（図中、それぞれＣＨ１（γ３），ｈ（γ３），ＣＨ２（γ３）およびＣＨ３（γ３））（図１）を担持するＨｉｎｄＩＩＩ〜ＥａｇＩフラグメントで置き換えることによって、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄにおいて、第１、第２および第３のヒンジ領域のコード化配列は除外した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域（配列番号１２）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ（図１）のヒンジ領域の最後のアミノ酸にインフレームで融合することによって、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにおいて、ヒトガンマ−３重鎖のＣＨ２エクソンおよびＣＨ３エクソンは除いた。Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトガンマ−３重鎖のＣＨ１領域および第４ヒンジ領域、ならびに、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域から成る、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる得られた重鎖定常領域は、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１９−２７ ２０００）により報告されているＩｇＧ−Ｃμ３−Ｃμ４重鎖定常領域と同一であった。ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍにコードされる重鎖定常領域（配列番号１３）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域（配列番号５）を、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ（図１）のヒトガンマ−３重鎖のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸に、インフレームで融合することによって、ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄベクターを構築した。ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄにコードされる得られた重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄにコードされる重鎖定常領域（配列番号１４）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭおよびｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄから産生される抗体の単量体型の模式的構造（それぞれ、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ）を図２に示す。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体の各々を産生するＮＳ０安定形質転換体の生成を、実施例２に概説したように行った。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体を産生するＮＳ０安定形質転換体を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭを用いる無血清媒体での増殖に適用し、実施例２に記載のようにローラーボトルに展開した。遠心分離およびろ過の後、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３ＤおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄについて、培養上清をプロテインＧセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載せた。プロテインＧセファロースカラムをＰＢＳで洗浄し、その後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で抗体を溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、溶出した抗体の緩衝液を透析によってＰＢＳに変えた。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍは、ヒトガンマ−３重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を欠いており、プロテインＧに結合しないので、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍを産生するＮＳ０安定形質転換体の培養上清は、ヤギ抗ヒトＩｇＭアガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）に載せた。抗ヒトＩｇＭアガロースカラムをＰＢＳで洗浄し、その後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で抗体を溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、溶出した抗体の緩衝液を透析によってＰＢＳに変えた。
精製した抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、標準的な手順に従って特徴付けた。還元条件下での分析は、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体の各々が、２つの鎖を含むことを示唆した。ゲル上での移動度を分子量マーカーの移動度と比較することによって、各鎖の分子量を見積もった。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄに共通の軽鎖は、約２５ｋＤａの分子量を有していた。重鎖の分子量は、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄについて５３ｋＤ、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍについて６０ｋＤａ、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄについて８１ｋＤａであると見積もられた。軽鎖および重鎖の各々の見積もられたサイズは、対応するアミノ酸配列に基づいて予想されるサイズに合っていた。
天然型のＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体のサイズを、実施例２に記載のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬを有するＡＫＴＡ Ｂａｓｉｃ ＦＰＬＣシステムを用いるゲルろ過によって分析した。図１３に、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ（図１３Ｃ），Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ（図１３Ｄ）およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ（図１３Ｅ）の溶出パターンを示す。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄについて、単一の主要なピークが、溶出量１５．６ｍｌに観察された。Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）の溶出パターン（図１３Ａ）と比較することによって、主要なピークにおけるＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄの分子量は、１５０ｋＤａと見積もられ、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果からのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄの単量体の予測分子量に対応する。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍでは、４つの大きなピークが観察された（図１３Ｄ）。１２．３ｍｌ，１５．０ｍｌおよび１６．１ｍｌに溶出したＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍの分子量は、それぞれ、６５０ｋＤａ，１８０ｋＤａおよび９０ｋＤａであると見積もられた。２０．８ｍｌに溶出した第４の大きなピークのタンパクは、概略２ｋＤａの分子量を有しており、抗ＩｇＭアガロースカラムに結合しそれから溶出したＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍの分解物のようである。
Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄでは、単一の主要なピークが、溶出量１０．４ｍｌに観察された（図１３Ｅ）。ヒトＩｇＭも１０．４ｍｌに溶出した（図１３Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から見積もられたＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ（〜２００ｋＤａ）およびＩｇＭ（〜１８０ｋＤａ）の単量体のサイズを考慮して、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄは、天然型では五量体または六量体で産生されると結論付けられた。
実施例１１：ＦｃＲｎへの多価ＩｇＧ３抗体の結合
ｐＨ依存性の態様でＦｃＲｎに結合するＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ抗体、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ抗体およびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄ抗体の能力を、細胞表面にヒトＦｃＲｎを発現するＮＳ０細胞（ＮＳ０／ＦｃＲｎ細胞）を用いるフローサイトメトリーによって分析した。１次染色工程において、１μｇ／ｍｌでのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６−Ｉｇ３Ｄ／ＭおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄを、個別に、実施例４に記載のように、ｐＨ６．０および７．５にて、ＮＳ０／ＦｃＲｎ細胞とインキュベートした。２次染色工程において、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトガンマ鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄについて、抗体対照なし）、または、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトμ鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄについて、抗体対照なし）を用いて、ＦｃＲｎに結合する抗体を検出した。図１４に示すように、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄは、ｐＨ６．０においてはＦｃＲｎに強く結合し、ｐＨ７．５では弱く結合しただけであった。同様に、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄは、ｐＨ６．０にてＦｃＲｎに強く結合した。Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１のＦｃＲｎ結合は、ｐＨ６．０ではｐＨ７．５よりもはるかに強かった。したがって、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３ＤおよびＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄの両者は、ｐＨ依存性の態様でＦｃＲｎに結合し、これらの抗体が長い血清半減期を有することを示唆している。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍは、ｐＨ６．０または７．５において、ＦｃＲｎへの顕著な結合を示さず、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍの短い血清半減期を示唆している。このことは、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭがＦＣＲｎへの結合部位を欠いていることと合致している。
実施例１２：ＣＤ１６への多価ＩｇＧ３抗体の結合
ヒトＣＤ１６への多価ＩｇＧ３抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。表面にヒトＣＤ１６を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０２５％ナトリウムアジドを含有するＰＢＳ）中で、１μｇ／ｍｌのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭまたはＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄと、氷上で３０分インキュベートした。対照として、ヒトＣＤ１６を発現するＨＥＫ２９３細胞も、試験抗体なしでインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、２次染色工程において、細胞を、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトガンマ重鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄについて、抗体対照なし）、または、ＰＥ標識ヤギポリクローナル抗ヒトμ重鎖抗体（Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍ，Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄについて、抗体対照なし）と、氷上で１５分インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄは、ＣＤ１６に強い結合を示した（図１５Ｄ）。Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１は、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄよりもさらに強いＣＤ１６結合を示し（図１５Ｆ）、ＡＤＣＣを発揮する能力を示唆している。一方、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／Ｍは、ＰＥ標識ヤギ抗μ重鎖抗体のみで染色した細胞に比べて（図１５Ｃ）、ヒトＣＤ１６への非常に弱い結合を示し（図１５Ｅ）、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１／ＭがＡＤＣＣ活性を有しないことを示唆している。ＰＥ標識ヤギ抗μ重鎖抗体を２次染色工程で使用したときに、Ｃｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ３Ｄの強いＣＤ１６結合が観察されたので（図１５Ｇ）、ＣＤ１６へのＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍの顕著な結合は、ＰＥ標識２次抗体の違いによるものではない。Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／ＭがＣＤ１６に結合し得ないことは、Ｃｈ９Ｇ６−ＩｇＧ３Ｄ／Ｍが、ヒトガンマ−３重鎖のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を欠くことと合致している。
多価ＩｇＧ２抗体を生成するために、ヒトガンマ−２重鎖のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸を、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域に、インフレームで融合した。得られた重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）ヒトガンマ−２重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、その後の（ｉｉ）ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域、から成る。得られた多価ＩｇＧ２抗体を、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティカラムを使用して使用済培養上清から精製し、ゲルろ過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。
実施例１３：多価ＩｇＧ２抗体
多価ＩｇＧ２抗体を生成するために、ヒトガンマ−２重鎖のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸を、ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域に、インフレームで融合した。得られた重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）ヒトガンマ−２重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、その後の（ｉｉ）ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域、から成る。得られた多価ＩｇＧ２抗体を、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティカラムを使用して使用済培養上清から精製し、ゲルろ過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。
実施例１４：多価ＩｇＡ抗体
多価ＩｇＡ抗体を生成するために、ヒトアルファ−１またはアルファ−２重鎖のＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸を、ヒトμ重鎖のＣＨ３領域およびＣＨ４領域に、インフレームで融合した。得られた重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）ヒトアルファ−１またはアルファ−２重鎖のＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、その後の（ｉｉ）ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域、から成る。得られた多価ＩｇＡ抗体を、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞で発現させ、Ｊａｃａｌｉｎレクチンカラムまたは他の標準的な手順を使用して培養上清から精製し、ゲルろ過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。
実施例１５：多価Ｆｃ融合タンパク
本研究において多価ＩｇＧ抗体を生成するために発明された技術は、また、多価Ｆｃ融合タンパクを生成することにも適用可能である。たとえば、ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１ベクターを、（ｉ）ＶＨエクソンおよびＣＨ１エクソンを除去し、（ｉｉ）シグナルペプチドおよびヒトＴＲＡＩＬの細胞外領域（ＴＲＡＩＬ ＥＣ）をコードするｃＤＮＡ由来フラグメントを、ヒンジエクソンの最初のアミノ酸にインフレームで融合し、（ｉｉｉ）軽鎖転写ユニットを除去する、などの方法で変更した。Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙなどの可撓性のポリペプチドリンカーを、ＴＲＡＩＬとヒンジ領域との間に入れてもよい。得られたＦｃ融合タンパク（ＴＲＡＩＬ−ＭＶＦｃ）は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）ＴＲＡＩＬ ＥＣ、（ｉｉ）ヒトガンマ−１重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、その後の（ｉｉｉ）ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域、から成る。このようなＦｃ融合タンパクは、哺乳類細胞において五量体または六量体として産生される。ＤＲ４またはＤＲ５を発現する細胞のアポトーシスを誘導するこのような多量体型Ｆｃ融合タンパクの生物活性は、標準的な手順で分析される。
実施例１６：多重特異性Ｆｃ融合タンパク
多価Ｆｃ融合タンパクを生産するための技術は、さらに、多重特異性Ｆｃ融合タンパクの生成にも適用可能である。たとえば、３つの異なるＦｃ融合タンパクを発現させるために、３つのベクターを構築する。最初の発現ベクターは、ヒトガンマ−１重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に融合したヒトＴＮＦ受容体タイプＩＩの細胞外領域（ＴＮＦＲ−ＩＩ ＥＣ）をコードし、これを、さらに、ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域に融合する（ＴＮＦＲ−ＩＩ−ＭＶＦｃ）。第２のベクターは、ヒトガンマ−１重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に融合したヒトＬＦＡ−３の細胞外領域をコードし、これを、さらに、ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域に融合する（ＬＦＡ−３−ＭＶＦｃ）。第３のベクターは、ヒトガンマ−１重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に融合したヒトＩＬ−１受容体の細胞外領域をコードし、これを、さらに、ヒトμ重鎖のＣμ３領域およびＣμ４領域に融合する（ＩＬ−１Ｒ−ＭＶＦｃ）。ＴＮＦＲ−ＩＩ−ＭＶＦｃ，ＬＦＡ−３−ＭＶＦｃおよびＩＬ−１Ｒ−ＭＶＦｃを、同時に発現させて、ＴＮＦα、ＣＤ２（ＬＦＡ−３の受容体）およびＩＬ−３に結合することが可能な、多価Ｆｃ融合タンパクを生成する。炎症性疾患を治療するためのこのような多重特異性多価Ｆｃ融合タンパクの有効性は、標準的な方法を用いて研究される。
実施例１７：ＩｇＧ抗体およびＦｃ融合タンパクから成る多価タンパク
多価ＩｇＧ抗体およびＦｃ融合タンパクを生産するための技術は、また、ＩｇＧ抗体およびＦｃ融合タンパクの双方から成る多価タンパクの生成にも適用可能である。たとえば、２つの発現ベクター：（ｉ）多価抗ＤＲ５ ＩｇＧ抗体の産生のための発現ベクター、および、（ｉｉ）多価ＴＲＡＩＬ−Ｆｃ融合タンパクの産生のための発現ベクター、を哺乳類細胞に同時導入する。発現した多量化タンパクは、抗ＤＲ５ ＩｇＧ抗体およびＴＲＡＩＬ−Ｆｃ融合タンパクの双方から成る。ＤＲ４媒介およびＤＲ５媒介のアポトーシスを誘導するこのようなタンパクの生物活性は、標準的な手順によって分析される。
実施例１８：二重特異性多価抗体
それぞれヒトＣＤ７９ａおよびＣＤ３０に結合する多価ＩｇＧ１抗体を発現するベクター、ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を、個別にまたは共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、提供者のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞を、７．５％ＣＯ２インキュベータにおいて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥ培地で、３７℃にて４日間インキュベートした。培養上清に一時的に発現した抗体の抗原結合を、次の２つの形式のＥＬＩＳＡで試験した。
第１の形式のＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートのウェルを、Ｃ末端にてヒトγ１鎖のＦｃ領域（ＣＤ３０−Ｆｃ；配列番号３７）に融合した組み換えヒトＣＤ３０細胞外領域で被覆した。ウェルをブロック緩衝液でブロックした後、適当に希釈したＨＥＫ２９３細胞の培養上清をウェルに加え、４℃にて一夜インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中の、Ｃ末端にてヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトＣＤ７９ａ細胞外領域（ＣＤ７９ａ−Ｃλ；配列番号３８）を、ウェルに加えた。ＣＤ７９ａ−Ｃλにおいては、ヒトλ２定常領域におけるカルボキシル末端から２番目の位置のシステイン残基を、セリン残基に変更した。ＥＬＩＳＡプレートを室温にて１時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、結合したＣＤ７９ａ−Ｃλを、ＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体によって検出した。ＡＢＴＳ基質を加えることによって発色現像を開始し、２％シュウ酸で停止した。４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１またはｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１のいずれかを導入したＨＥＫ２９３細胞の培養上清は、非導入ＨＥＫ２９３細胞の培養上清と比べたとき、この第１の形式のＥＬＩＳＡにおいて、シグナルを示さなかった。ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１をＨＥＫ２９３細胞に導入したとき、培養上清は、この形式のＥＬＩＳＡにおいて強いシグナルを示し、溶液中のＣＤ７９ａ−ＣλおよびＥＬＩＳＡプレート上に被覆したＣＤ３０−Ｆｃの双方に結合し得る、二重特異性抗体の存在を示唆している。
第２の形式のＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートのウェルを、Ｃ末端にてヒトγ１鎖のＦｃ領域に融合した組み換えヒトＣＤ７９ａ細胞外領域（ＣＤ７９ａ−Ｆｃ；配列番号３９）で被覆した。ウェルをブロック緩衝液でブロックした後、適当に希釈したＨＥＫ２９３細胞の培養上清をウェルに加え、４℃にて一夜インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中の、Ｃ末端にてヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトＣＤ３０細胞外領域（ＣＤ３０−Ｃλ；配列番号４０）を、ウェルに加えた。ＣＤ３０−Ｃλにおいては、ヒトλ２定常領域におけるカルボキシル末端から２番目の位置のシステイン残基を、セリン残基に変更した。ＥＬＩＳＡプレートを室温にて１時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、結合したＣＤ３０−Ｃλを、ＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体によって検出した。ＡＢＴＳ基質を加えることによって発色現像を開始し、２％シュウ酸で停止した。４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１またはｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１のいずれかを導入したＨＥＫ２９３細胞の培養上清は、非導入ＨＥＫ２９３細胞の培養上清と比べたとき、この第２の形式のＥＬＩＳＡにおいて、シグナルを示さなかった。一方、ｐＣｈ９Ｇ６−ＭＶＩｇＧ１およびｐＣｈＳａｎ１１−ＭＶＩｇＧ１を導入したＨＥＫ２９３細胞の培養上清は、第２の形式のＥＬＩＳＡにおいて強いシグナルを示し、ＣＤ７９ａおよびＣＤ３０の双方に結合し得る、二重特異性抗体の存在を裏付けている。
Ｃ末端にてヒトガンマ−１鎖のＦｃ領域に融合した組み換えヒトＣＤ３０細胞外領域（ＣＤ３０−Ｆｃ）のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＦＰＱＤＲＰＦＥＤＴＣＨＧＮＰＳＨＹＹＤＫＡＶＲＲＣＣＹＲＣＰＭＧＬＦＰＴＱＱＣＰＱＲＰＴＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＤＲＣＴＡＣＶＴＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＶＣＥＣＲＰＧＭＦＣＳＴＳＡＶＮＳＣＡＲＣＦＦＨＳＶＣＰＡＧＭＩＶＫＦＰＧＴＡＱＫＮＴＶＣＥＰＡＳＰＧＶＳＰＡＣＡＳＰＥＮＣＫＥＰＳＳＧＴＩＰＱＡＫＰＴＰＶＳＰＡＴＳＳＡＳＴＭＰＶＲＧＧＴＲＬＡＱＥＡＡＳＫＬＴＲＡＰＤＳＰＳＳＶＧＲＰＳＳＤＰＧＬＳＰＴＱＰＣＰＥＧＳＧＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＧＲＣＴＡＣＶＳＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＴＣＥＣＲＰＧＭＩＣＡＴＳＡＴＮＳＣＡＲＣＶＰＹＰＩＣＡＡＥＴＶＴＫＰＱＤＭＡＥＫＤＴＴＦＥＡＰＰＬＧＴＱＰＤＣＮＰＴＰＥＮＧＥＡＰＡＳＴＳＰＴＱＳＬＬＶＤＳＱＡＳＫＴＬＰＩＰＴＳＡＰＶＡＬＳＳＴＧＫＰＶＬＤＴＧＧＧＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３７）。
Ｃ末端にてヒトλ２定常領域に融合した組み換えＣＤ７９ａ細胞外領域（ＣＤ７９ａ−Ｃλ）のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＧＴＬＩＩＱＮＶＮＫＳＨＧＧＩＹＶＣＲＶＱＥＧＮＥＳＹＱＱＳＣＧＴＹＬＲＶＲＱＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＴＧＧＧＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＳＳ（配列番号３８）。
Ｃ末端にてヒトガンマ−１鎖のＦｃ領域に融合した組み換えヒトＣＤ７９ａ細胞外領域（ＣＤ７９ａ−Ｆｃ）のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＧＴＬＩＩＱＮＶＮＫＳＨＧＧＩＹＶＣＲＶＱＥＧＮＥＳＹＱＱＳＣＧＴＹＬＲＶＲＱＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＴＧＧＧＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）。
Ｃ末端にてヒトλ２定常領域に融合した組み換えヒトＣＤ３０細胞外領域（ＣＤ３０−Ｃλ）のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＦＰＱＤＲＰＦＥＤＴＣＨＧＮＰＳＨＹＹＤＫＡＶＲＲＣＣＹＲＣＰＭＧＬＦＰＴＱＱＣＰＱＲＰＴＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＤＲＣＴＡＣＶＴＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＶＣＥＣＲＰＧＭＦＣＳＴＳＡＶＮＳＣＡＲＣＦＦＨＳＶＣＰＡＧＭＩＶＫＦＰＧＴＡＱＫＮＴＶＣＥＰＡＳＰＧＶＳＰＡＣＡＳＰＥＮＣＫＥＰＳＳＧＴＩＰＱＡＫＰＴＰＶＳＰＡＴＳＳＡＳＴＭＰＶＲＧＧＴＲＬＡＱＥＡＡＳＫＬＴＲＡＰＤＳＰＳＳＶＧＲＰＳＳＤＰＧＬＳＰＴＱＰＣＰＥＧＳＧＤＣＲＫＱＣＥＰＤＹＹＬＤＥＡＧＲＣＴＡＣＶＳＣＳＲＤＤＬＶＥＫＴＰＣＡＷＮＳＳＲＴＣＥＣＲＰＧＭＩＣＡＴＳＡＴＮＳＣＡＲＣＶＰＹＰＩＣＡＡＥＴＶＴＫＰＱＤＭＡＥＫＤＴＴＦＥＡＰＰＬＧＴＱＰＤＣＮＰＴＰＥＮＧＥＡＰＡＳＴＳＰＴＱＳＬＬＶＤＳＱＡＳＫＴＬＰＩＰＴＳＡＰＶＡＬＳＳＴＧＫＰＶＬＤＴＧＧＧＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＳＳ（配列番号４０）。
実施例１９：ラモス細胞でのマウス全身性異種移植モデルにおける多量体型抗ＤＲ４ ＩｇＧ抗体の治療効果
抗ヒト細胞死受容体４（ＤＲ４；Ａｐｏ２、ＴＲＡＩＬ受容体１およびＴＮＦＲＳＦ１０Ａとも呼ばれる）モノクローナルＩｇＧ１／ラムダ抗体ＹＯＮ００７を産生するマウスハイブリドーマは、ＪＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にて、ヒトガンマ−１重鎖のＦｃ領域に融合したヒトＤＲ４の細胞外領域（ＤＲ４−Ｆｃ）（配列番号４１）を免疫原とし、続く標準的なハイブリドーマ技法を用いて生成された。
ＹＯＮ００７ ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（前記）に記載の方法などの標準的実験手順によって決定した。ＹＯＮ００７ ＶＨのアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列を含めて、次のとおりである：
ＭＮＲＬＴＳＳＬＬＬＬＩＶＰＡＹＶＬＳＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＫＩＳＫＤＴＳＳＮＱＶＦＬＫＩＴＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＴＲＲＧＥＹＧＮＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号４２）（ＵＳ ６１／６７９，０４５）。
成熟ＹＯＮ００７ ＶＨは、配列番号４２の位置２０に始まる。ＹＯＮ００７ ＶＬのアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列を含めて、次のとおりである：
ＭＡＷＩＳＬＩＬＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＳＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４３）（ＵＳ ６１／６７９，０４５）。
成熟ＹＯＮ００７ ＶＬは、配列番号４３の位置２０に始まる。
ＹＯＮ００７ ＶＨおよびＶＬのヒト化を、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（前記）に記載の手順により行った。ヒト化ＹＯＮ００７（ＨｕＹＯＮ００７）ＶＨのアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含めて、次のとおりである：
ＭＮＲＬＴＳＳＬＬＬＬＩＶＰＡＹＶＬＳＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＴＲＲＧＥＹＧＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４４）（ＵＳ ６１／６７９，０４５）。
成熟ＹＯＮ００７ ＶＨ配列は、配列番号４４の位置２０に始まる。
ヒト化ＹＯＮ００７（ＨｕＹＯＮ００７）ＶＬのアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＭＡＷＩＳＬＩＬＳＬＬＡＬＳＳＧＡＩＳＱＴＶＶＴＱＥＰＳＦＳＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＳＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＱＴＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＬＬＧＮＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＡＤＤＥＳＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号４５）（ＵＳ ６１／６７９，０４５）。
成熟ＹＯＮ００７ ＶＬ配列は、配列番号４５の位置２０に始まる。
ＨｕＹＯＮ００７ ＶＨ（配列番号４６）をコードする遺伝子を、コード化領域の３’端のスプライスドナーシグナル、フラグメントの５’端のＳｐｅＩ部位、およびフラグメントの３’端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むエクソンとして、合成した。ＨｕＹＯＮ００７ ＶＬ（配列番号４７）をコードする遺伝子を、コード化領域の３’端のスプライスドナーシグナル、フラグメントの５’端のＮｈｅＩ部位、およびフラグメントの３’端のＥｃｏＲＩ部位を含むエクソンとして、合成した。
ヒト化抗ヒトＤＲ４モノクローナルＩｇＧ１／ラムダ抗体ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１産生のための哺乳類発現ベクターｐＨｕＹＯＮ００７の構造は、（１）９Ｇ６ ＶＨ遺伝子が、ＳｐｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のＨｕＹＯＮ００７ ＶＨ遺伝子（配列番号４６）で置き換えられ、（２）９Ｇ６ ＶＬ遺伝子が、ＮｈｅＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のＨｕＹＯＮ００７ ＶＬ遺伝子（配列番号４６）で置き換えられ、（３）Ｃκコード化エクソンが、ヒトラムダ−２定常領域をコードするエクソンで置き換えられ、（４）ｇｐｔ遺伝子が、ピューロマイシンＮアセチル転移遺伝子で置き換えられていることを除いて、ｐＣｈ９Ｇ６−ＩｇＧ１（図１）の構造と本質的に同一である。
ｐＨｕＹＯＮ００７にコードされる成熟重鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＴＲＲＧＥＹＧＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４８）。
ｐＨｕＹＯＮ００７にコードされる成熟軽鎖のアミノ酸配列は、次のとおりである：
ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＦＳＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＳＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＱＴＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＬＧＮＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＡＤＤＥＳＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号４９）。
多量体型ＨｕＹＯＮ００７ ＩｇＧ抗体の発現のために、Ｃμ３およびＣμ４のコード化領域を、ｐＨｕＹＯＮ００７におけるＣＨ３エクソンの最後のアミノ酸に、インフレームで融合した。軽鎖配列は変更しなかった。プラスミドｐＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１にコードされる結果の成熟重鎖のアミノ酸配列は、つぎのとおりである：
ＱＶＴＬＲＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＴＲＲＧＥＹＧＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号５０）。
発現ベクターｐＨｕＹＯＮ００７およびｐＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の染色体に、個別に導入して、ヒト化ＩｇＧ１／ラムダ抗体ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１およびＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１を、それぞれ得た。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、７．５％ＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃にてＳＦＭ４ＣＨＯ媒体（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で増殖させた。エレクトロポレーションによって、ＣＨＯ−Ｓ細胞への安定導入を行った。導入に先立ち、ＦｓｐＩを用いて各発現ベクターを直線化した。一般的な実験において、約１０７個の細胞に、ＳＦＭ４ＣＨＯに懸濁した２０μｇの直線化プラスミドを導入し、細胞の適当な希釈の後、いくつかの９６ウェルプレートに塗布した。４８時間後、安定形質転換体の選択のために、ピューロマイシンを加えた。選択の開始後約２週間に、形質転換体の培養上清を抗体産生についてアッセイした。抗体の発現は、被覆に、ヤギ抗ヒトガンマ重鎖ポリクローナル抗体を用い、結合したＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１抗体またはＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１抗体の検出に、ＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトラムダ鎖抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１およびＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１の各々を産生するＣＨＯ−Ｓ安定形質転換体を、ＳＦＭ４ＣＨＯに展開した。
遠心分離およびろ過の後、培養上清をプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭＡＢＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に載せた。カラムをＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出したすべての抗体の緩衝液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和し、次いで、透析によってＰＢＳに変えた。前述のように、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬを用いるゲルろ過分析において、約１５０ｋＤａに対応する単一の主要なピークが、ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１について観察された。約１，０００ｋＤａに対応する単一の主要なピークが、ゲルろ過分析において、ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１について観察された。
ヒトバーキットリンパ腫細胞株ラモスは、細胞表面にＤＲ４を発現する（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１１０：４０３７−４０４６，２００７）。細胞表面での架橋によるＤＲ４の多量化が、細胞のアポトーシスを誘導することが知られている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２５９７−２６０５，１９９９）。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地において、２００ｎｇ／ｍｌのＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１またはＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１の存在下で、ラモス細胞をインキュベートした。２４時間インキュベーション後のラモス細胞の生存率は、ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１の存在下では５％未満であったが、ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１の存在下では生存率は７５％を超え、ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１が、ラモス細胞のアポトーシスを効率よく誘導することを示唆している。
ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１の治療上の有効性を、ラモス細胞での全身性マウス異種移植モデルを用いて見積もった。ＣＢ１７ ＳＣＩＤ雌マウスに、第０日に、腫瘍成長のために、尾静脈への静脈内投与で５ｘ１０６個のラモス細胞を接種した。第
７，１０，１４，１７，２１，２４，２８および３１日に、ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１（０．５ｍｇ／ｋｇ），ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１（０．５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを、担癌マウスに静脈内投与した。マウスを、病状および生死について、毎日監視した。後肢麻痺が発生した時、または２０％超の体重減少があった時に、マウスを安楽死させた。
マウスの生存を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いてプロットし（図１８）、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ試験を用いて、有意性について分析した。平均生存時間は、ＰＢＳ処理群については２７．５日、ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１で処理した群については３１．５日、ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１で処理した群については３７．５日であった。ＰＢＳ処理群とＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１処理群との間のＰ値は、０．００１９であった。ＨｕＹＯＮ００７−ＩｇＧ１処理群とＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１処理群との間のＰ値は０．０１２８であった。ＨｕＹＯＮ００７−ＭＶＩｇＧ１は、ラモス細胞でのマウス全身性異種移植モデルにおける治療薬として、ＨｕＹｏｎ００７−ＩｇＧ１よりも、有意に有効であった。
ヒトガンマ−１重鎖のＦｃ領域に融合したヒトＤＲ４（ＤＲ４−Ｆｃ）の細胞外領域のアミノ酸配列、配列番号４１は、次のとおりである：
ＡＳＧＴＥＡＡＡＡＴＰＳＫＶＷＧＳＳＡＧＲＩＥＰＲＧＧＧＲＧＡＬＰＴＳＭＧＱＨＧＰＳＡＲＡＲＡＧＲＡＰＧＰＲＰＡＲＥＡＳＰＲＬＲＶＨＫＴＦＫＦＶＶＶＧＶＬＬＱＶＶＰＳＳＡＡＴＩＫＬＨＤＱＳＩＧＴＱＱＷＥＨＳＰＬＧＥＬＣＰＰＧＳＨＲＳＥＨＰＧＡＣＮＲＣＴＥＧＶＧＹＴＮＡＳＮＮＬＦＡＣＬＰＣＴＡＣＫＳＤＥＥＥＲＳＰＣＴＴＴＲＮＴＡＣＱＣＫＰＧＴＦＲＮＤＮＳＡＥＭＣＲＫＣＳＴＧＣＰＲＧＭＶＫＶＫＤＣＴＰＷＳＤＩＥＣＶＨＫＥＳＧＮＧＨＮＴＧＧＧＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ＨｕＹＯＮ００７ ＶＨをコードするエクソンのヌクレオチド配列、配列番号４６は、次のとおりである：
ＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＡＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＴＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴ。
ＨｕＹＯＮ００７ ＶＬをコードするエクソンのヌクレオチド配列、配列番号４７は、次のとおりである：
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＣＴＣＡＴＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣ。

Claims (40)

  1. 各々がＩｇＧアイソタイプもしくはＩｇＡアイソタイプであるＣＨ２領域およびＣＨ３領域、ならびに、Ｃμ３領域およびＣμ４領域を、Ｎ末端からＣ末端に向かって順に含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含むことを特徴とする抗体または融合タンパク。
  2. 前記免疫グロブリン重鎖は、さらに、前記ＣＨ２領域のＮ末端にヒンジ領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  3. 前記免疫グロブリン重鎖は、さらに、前記ヒンジ領域のＮ末端にＣＨ１領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  4. 前記重鎖定常領域が重鎖可変領域に融合した抗体であって、さらに、軽鎖可変領域および定常領域を含む軽鎖を含む抗体であることを特徴とする請求項３に記載の抗体または融合タンパク。
  5. 異なる重鎖可変領域、および、随意的に、異なる軽鎖可変領域を有する請求項４に規定の複数の抗体を含む多重特異性抗体であって、前記複数の抗体は、前記多重特異性抗体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多重特異性抗体の構成要素であることを特徴とする請求項４に記載の抗体。
  6. 前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ１領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  7. 前記ＣＨ１領域およびヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ２領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  8. 前記ＣＨ１領域および前記ヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ３領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  9. 前記ＣＨ１領域および前記ヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧ４領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  10. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＡ領域であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  11. 前記ＣＨ１領域および前記ヒンジ領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトのＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域であり、前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域は、ヒトのＣμ３領域およびＣμ４領域であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または融合タンパク。
  12. 前記重鎖定常領域に連結した単鎖Ｆｖを含む単鎖抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  13. 請求項１２に規定の複数の単鎖抗体を含む多重特異性抗体であって、前記複数の前記ｓｃＦｖは異なるＶＨ領域を有し、前記複数の単鎖抗体は、前記多重特異性抗体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多重特異性抗体の構成要素であることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
  14. 前記ｓｃＦｖは同じＶＬ領域を有することを特徴とする請求項１３に記載の抗体。
  15. ２つの前記重鎖および２つの前記軽鎖を含むユニットの少なくとも５つまたは６つの複製を含む多量体であって、前記複製は、前記多量体において前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化している多量体の形態であることを特徴とする請求項４に記載の抗体または融合タンパク。
  16. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ＩｇＧであり、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示す前記抗体または融合タンパクは、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合し、ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよび／またはオプソニン化を呈することを特徴とする請求項２に記載の抗体または融合タンパク。
  17. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ１領域であり、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合することを特徴とする請求項２に記載の抗体または融合タンパク。
  18. ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化を呈することを特徴とする請求項１７に記載の抗体。
  19. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトのＩｇＧ２領域またはＩｇＧ４領域であり、前記抗体または融合タンパクは、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合し、プロテインＡに特異的に結合することを特徴とする請求項２に記載の抗体または融合タンパク。
  20. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ヒンジ領域、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＧ３であり、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を示し、プロテインＧに特異的に結合することを特徴とする請求項２に記載の抗体または融合タンパク。
  21. ＡＤＣＣ，ＣＤＣおよびオプソニン化を呈することを特徴とする請求項２０に記載の抗体または融合タンパク。
  22. 前記ＣＨ１領域（存在する場合）、ならびに、前記ＣＨ２領域および前記ＣＨ３領域は、ヒトＩｇＡであり、前記抗体は、Ｆｃアルファ受容体に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  23. 異種ポリペプチドに連結した免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパクであることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  24. 前記異種タンパクは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａなどの可撓性リンカーを介して、前記定常領域の前記ヒンジに連結していることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク。
  25. 前記異種ポリペプチドは、受容体細胞外ドメインまたは受容体細胞外ドメインに特異的に結合するタンパクであることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク。
  26. 異なる異種ポリペプチドを含有する複数の融合タンパクを含む多重特異性複合体の構成要素であることを特徴とする請求項２３に記載の融合タンパク。
  27. 前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して複合化した抗体および融合タンパクを含む多重特異性複合体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  28. 前記抗体は、ヒト化した、キメラの、張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）の、または、ヒトの抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  29. 受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  30. ＣＤ７９ａ，ＣＤ３０またはＤＲ５に特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  31. ＴＮＦアルファ受容体、ＬＦＡ−３受容体、またはＩＬ−１受容体の細胞外ドメインを含む融合タンパクであることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  32. ＴＲＡＩＬタンパクを含む融合タンパクであることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  33. 有毒部分に抱合していることを特徴とする請求項１に記載の抗体または融合タンパク。
  34. 前記有毒部分は細胞毒性を有することを特徴とする請求項３３に記載の抗体または融合タンパク。
  35. 請求項１に規定の抗体または融合タンパクを含むことを特徴とする医薬組成物。
  36. 癌を有するまたは癌の危険性のある患者に、請求項１に規定の抗体または融合タンパクの有効な投与計画を実施することを含むことを特徴とする癌を治療する方法。
  37. 免疫学的疾患を治療する方法であって、前記疾患を有するまたは前記疾患の危険性のある患者に、請求項１に規定の抗体または融合タンパクの有効な投与計画を実施することを含むことを特徴とする方法。
  38. 抗体および／または融合タンパクの多重特異性複合体を生成する方法であって、
    ａ．異なる特異性を有する複数の請求項１に規定の抗体および／または融合タンパクをコードするベクターまたは複数のベクターを細胞に導入すること、ならびに
    ｂ．前記多重特異性複合体を細胞培養物から単離すること
    を含み、
    前記抗体および／もしくは融合タンパクは、発現すると前記Ｃμ３領域および前記Ｃμ４領域を介して前記多重特異性複合体に組み立てられることを特徴とする方法。
  39. 前記複数の抗体または融合タンパクの各々は、異なるベクターによってコードされることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
  40. Ｎ末端ＩｇＧ定常領域区分およびＣ末端ＩｇＭ定常領域区分を含むハイブリッド定常領域を含む抗体または融合タンパクであって、前記抗体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合を呈し、プロテインＧに特異的に結合し、前記ＩｇＭ定常領域を介して多量化して少なくとも五量体または六量体を形成することを特徴とする抗体または融合タンパク。
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