JP2015228840A

JP2015228840A - 癌の検出液

Info

Publication number: JP2015228840A
Application number: JP2014117153A
Authority: JP
Inventors: 信至佐久間; Nobuyuki Sakuma; 裕志仲瀬; Hiroshi Nakase; 謙一郎日渡; Kenichiro Hiwatari; 光倫熊谷; Mitsunori Kumagai; 哲也池島; Tetsuya Ikejima
Original assignee: Adeka Corp; Kyoto University; Josho Gakuen Educational Foundation
Current assignee: Adeka Corp; Kyoto University; Josho Gakuen Educational Foundation
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2015-12-21
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: JP6440110B2

Abstract

【課題】生体から採取された組織に於ける癌の有無を、簡便且つ迅速に判定することが可能な検出液の提供、及び癌の検出方法の提供。
【解決手段】粒子状マーカーが水系媒体に分散されており、ポリマーと識別性物質を含有し、平均粒子径が１ｎｍ〜１００μｍであり、前記ポリマーがレクチン残基を含有する置換スチレンを共重合している主骨格がスチレン重合体であるポリマーであり、前記ポリマーにおけるレクチンの割合は０．１〜０．７質量％である検出液。識別性物質が蛍光物質である検出液。生体から採取した組織に、前記検出液を塗布することにより、粒子状マーカーが癌細胞に結合し、癌細胞が容易に判別可能となる癌の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、簡便で迅速な判定が可能な、癌の検出液に関する。

早期の大腸癌は、明らかな隆起が見られる隆起型と、目立った隆起のない表面型に大別される。大腸癌の疑いのある病変部位は、内視鏡を有する鉗子を用いて切除し、癌の有無や進行度の判定が行われる。特に、隆起型大腸癌の多くは大腸ポリープが成長し癌化したものと考えられており、大腸ポリープは切除されることが多い。大腸癌の判定方法としては、病理診断（例えば、特許文献１参照）や免疫染色による診断（例えば、特許文献２参照）が用いられている。しかしながら、従来の判定方法は、煩雑な処理が必要で長時間を要し、判定にも熟練を要するという問題があった。

一方、国際公開第２００７／０９７３１８号パンフレット（特許文献３）には、消化器癌粘膜に結合性のある基を有するポリマーを主成分とする粒子状診断マーカーが開示されており、消化器癌の内視鏡による早期発見／治療に有用であることが示唆されているが、切除された生体組織について適用可能であることやその方法については何らの開示又は示唆されていない。

特開２０１０−１６００１８号公報国際公開第２０１０／０９８４３５号パンフレット国際公開第２００７／０９７３１８号パンフレット

本発明の目的は、切除された消化器組織に発生する癌の、簡便で迅速であり、判定が容易な検出液を提供することにある。

本発明者らは上記課題に鑑み、特定の粒子状マーカーを分散させた検出液を使用することにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明に到達した。即ち本発明は、生体から採取した組織用の癌の検出液であって、粒子状マーカーが水系媒体に分散されており、粒子状マーカーが、下記一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーと識別性物質を含有し、平均粒子径が１ｎｍ〜１００μｍであることを特徴とする癌の検出液である。

（式中、ａ、ｂ及びｃは、ａ：ｂ：ｃ＝１：０．０１〜１０：１００〜２０００となる数を表わし、ｄは１０〜６００の数を表わし、ｅは１０〜６００の数を表わし、Ｘは、レクチン残基を表わす。但し、ａ、ｂ及びｃの各繰り返し数に対応する各ユニットの主鎖における順序は任意であり、前記ポリマーにおけるレクチン残基の割合は０．１〜０．７質量％である。）

また本発明は、生体から採取した組織に、前記の癌の検出液を塗布することを特徴とする癌の検出方法を提供するものである。

本発明によれば、生体から採取された組織における癌の有無を、簡便且つ迅速に判定することが可能な癌の検出液及び検出方法を提供できる。

本発明の検出液は、粒子状マーカーが水系媒体に分散されており、粒子状マーカーが、前記一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーと識別性物質を含有し、平均粒子径が１ｎｍ〜１００μｍであることに特徴がある。本発明の検出液の粒子状マーカーは、癌細胞との結合性に優れており、生体から採取した組織に、本発明の検出液を塗布することにより、粒子状マーカーが癌細胞に結合し、癌細胞が容易に判別できる。

先ず、粒子状マーカーに含有される一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーについて説明する。
一般式（１）において、ａ、ｂ及びｃは、ａ：ｂ：ｃ＝１：０．０１〜１０：１００〜２０００となる数を表わす。ａ、ｂ及びｃは、癌の検出感度が上がることから、ａ：ｂ：ｃが１：０．０５〜８：１３０〜１０００の割合が好ましく、１：０．１〜６：１５０〜６００の割合が更に好ましい。なお、ａ、ｂ及びｃの各繰り返し数に対応する各ユニットの主鎖における順序は任意であり、ブロック状、ランダム状、ブロック状とランダム状との組み合わせ等のいずれでもよい。

ｄは１０〜６００の数を表わす。ｄは、癌の検出感度が上がることから、２０〜３００の数が好ましく、３０〜１５０の数が更に好ましい。ｅは１０〜６００の数を表わす。ｅは、癌の検出感度が上がることから、３０〜３００の数が好ましく、５０〜２００の数が更に好ましく、６０〜１５０の数が最も好ましい。

一般式（１）において、Ｘはレクチン残基を表わす。本発明においてレクチンとは、糖鎖に結合活性を示すタンパク質の総称である。またレクチン残基とは、後述する一般式（１a）で表される構造を有するポリマーにおけるCOOH基と、レクチンのアミノ基とが、脱水縮合してアミド結合を生じることにより、レクチンが水素原子を一つ失った残基をいう。レクチン残基は、１箇所のみで一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーと結合してもよく、複数個所で結合してもよい。本発明に使用できるレクチンとしては、癌細胞が産出する糖鎖に結合活性を示すレクチンであれば、どのようなレクチンでも使用できる。このようなレクチンとしては、ＣｏｎＡ（タチナタマメ種子由来レクチン）、ＤＢＡ（ドリコスマメ種子由来レクチン）、ＬＥＬ（トマト果実由来レクチン）、ＰＮＡ（ピーナッツ由来レクチン）、ＰＨＡ（インゲンマメ種子由来レクチン）、ＲＣＡ（ヒマ種子由来レクチン）、ＳＢＡ（ダイズ種子由来レクチン）、ＵＥＡＩ（ハリエニシダ種子由来レクチン）、ＷＧＡ（コムギ胚種子由来レクチン）等が挙げられる。これらのレクチンは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのレクチンのうち、癌細胞が産出する糖鎖への結合性が高く、癌の検出感度が上がることから、ＰＮＡが好ましい。一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーにおけるレクチン残基の割合は０．１〜０．７質量％である。レクチン残基の割合が０．１質量％よりも少ない場合には、粒子状マーカーの癌細胞への結合が不十分となり、０．７質量％よりも多い場合には正常細胞への結合が増え、いずれの場合も癌の検出感度が十分得られない。一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーにおけるレクチン残基の割合は０．２〜０．６７質量％が好ましく、０．２５〜０．６６質量％が更に好ましく、０．２７〜０．６５質量％が最も好ましい。レクチン残基の割合は、ニンヒドリン法により求めることができる。

一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーは、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、一般式（１）で表わされる構造以外の他の構造を有していてもよい。このような他の構造としては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸アミド、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセトアミド、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーが他の構造を有する場合、ポリマー全体における該他の構造の割合は、５０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがより好ましい。一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーは、一般式（１）で表わされることが好ましい。

一般式（１）で表される構造を有するポリマーは、各種溶媒への溶解性が不十分であることから、分子量の測定が困難であるが、中間体の下記一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマー（好ましくは、一般式（１ａ）で表されるポリマー）であれば、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography）分析による分子量の測定が可能である。

（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、一般式（１）と同義である。）

一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマーを中間体として、一般式（１）で表される構造を有するポリマーを合成する場合、一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマーの質量平均分子量は１万〜２００万が好ましく、２０万〜１８０万が更に好ましく、５０万〜１６０万が最も好ましい。なお、本発明において質量平均分子量とは、ＤＭＦ（N,N-Dimethylmethanamide）を溶媒としてＧＰＣ分析を行った場合のポリスチレン換算の質量平均分子量をいい、質量平均分子量は、重量平均分子量と呼ぶ場合もある。

本発明で用いる粒子状マーカー中の、一般式（１）で表される構造を有するポリマーの含有量があまりに少ない場合には、癌細胞への結合性が不十分となることから、７０質量％以上であることが好ましく、９０質量％以上であることが更に好ましい。

次に、粒子状マーカーに含有される識別性物質について説明する。
本発明で用いる粒子状マーカーに含有される識別性物質は、本発明で用いる粒子状マーカーが癌細胞に結合したことを何らかの方法で識別するための物質であり、本発明の一般式（１）で表される構造を有するポリマーに化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。識別性物質としては、染料、顔料、磁性物質、放射性物質、蛍光物質等が挙げられるが、安全で、高感度での識別が可能であることから、蛍光物質が好ましい。蛍光物質としてはフルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類、ダンシル類、ＮＢＤ類等が挙げられ、一般式（１）で表される構造を有するポリマーとの相溶性に優れ、本発明の一般式（１）で表される構造を有するポリマーからの溶出が少ないことから、クマリン類が好ましく、中でもクマリン６（下式（２）参照）が好ましい。

本発明で用いる粒子状マーカー中の、識別性物質の含有量があまりに少ない場合には検出感度が不十分となり、あまりに多い場合には、含有量に見合う増量効果は得られないばかりか、却って物性等に悪影響を及ぼすことがある。このため、識別性物質が蛍光物質の場合の粒子状マーカー中の識別性物質の含有量は０．０１〜１質量％が好ましく、０．０２〜０．２質量％が更に好ましい。

本発明で用いる粒子状マーカーは、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、下記一般式（１）で表わされる構造を有するポリマー及び識別性物質以外に、他の化合物を含有してもよい。このような他の化合物としては、ポリスチレン、ポリアクリル酸メチル、ポリメタクリル酸メチル、シリカ、チタン等が挙げられる。

本発明で用いる粒子状マーカーの平均粒子径は１ｎｍ〜１００μｍである。平均粒子径があまりに小さい場合には、採取組織に塗布した後の洗浄が困難となる場合があり、あまり大きい場合には、水溶媒への分散性が低下する場合があることから、平均粒子径は２００〜１０００ｎｍが好ましく、２５０〜６００ｎｍが更に好ましい。

本発明の検出液中の、本発明で用いる粒子状マーカーの含量があまりに少ない場合には、癌の検出感度が十分出ない場合があり、またあまりに多い場合には、分散安定性が低下する場合があることから、検出液中の本発明で用いる粒子状マーカーの含量は０．１〜５質量％が好ましく、０．５〜３質量％が更に好ましい。

本発明で用いる粒子状マーカーを製造する場合には、例えば、下記一般式（３）で表されるマクロモノマー、下記一般式（４）で表されるマクロモノマー及びスチレンを共重合させて前記一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマーを合成し、このポリマーの微粒子にレクチンを結合させることにより得ることができる。共重合の方法は、特に限定されないが、粒径分布の狭い微細な粒子が得られることから、極性溶媒中で溶液重合を行うことが好ましい。識別性物質は、共重合前のモノマー又は共重合に使用する溶媒に溶解又は分散させておいてもよいし、共重合後の微粒子に含浸させてもよい。特に前者の場合、一般式（１）で表される構造を有するポリマー同士間、又はポリマーの部位同士間に効率よく識別性物質を保持させることができるため好ましい。

（式中、ｄは、一般式（１）と同義である。）

（式中、ｅは、一般式（１）と同義である。）

一般式（３）で表されるマクロモノマーは、例えば、２−メルカプトエタノールを出発物質としてＮ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）を、ラジカル重合開始剤の存在下に重合させて得られる下記一般式（３ａ）で表される化合物に、ビニルベンジルクロライドを反応させることにより得ることができる。

（式中、ｄは、一般式（１）と同義である。）

一般式（４）で表されるマクロモノマーは、例えば、２−メルカプトエタノールを出発物質としてメタクリル酸ｔ−ブチルを、ラジカル重合開始剤の存在下に重合させて得られる下記一般式（４ａ）で表される化合物に、ビニルベンジルクロライドを反応させた後、ｔ−ブチル基を酸触媒で分解除去することにより得ることができる。

（式中、ｅは、一般式（１）と同義であり、ｔ−Ｂｕはｔ−ブチル基を表わす。）

一般式（３）で表されるマクロモノマー、一般式（４）で表されるマクロモノマー及びスチレンを溶液重合する場合の極性溶媒は、特に限定されないが、微細な粒子が得られることから、水と有機極性溶媒との混合溶媒が好ましい。有機極性溶媒としては、沸点が低く、除去が容易であることから、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランが好ましく、エタノール、イソプロパノールが更に好ましい。これらの有機極性溶媒は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。溶液重合は、公知の条件で行えばよく、例えば、ラジカル重合開始剤として、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリルを使用する場合には、４０℃〜８０℃の温度で、３時間〜４８時間程度反応させることが好ましい。水と有機極性溶媒との混合溶媒を使用する場合、該混合溶媒中における水の割合は、有機極性溶媒の種類によっても異なるが、１０〜７０質量％、特に３０〜６５質量％であることが好ましい。

極性溶媒中での溶液重合では、極性溶媒に対する溶解性の高い構造部分が外側に、極性溶媒に対する溶解性の低い構造部分は内側となるように集積されて粒子化する。従って、溶液重合により得られた微粒子は、一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマーを主成分とするが、一般式（３a）で表される化合物及び一般式（４a）で表される化合物に由来する構造部分が外側を、スチレンに由来する構造部分を内側となるように集積された微粒子である。微粒子の平均粒径は、使用するマクロモノマーの分子量や反応比、極性溶媒の組成等により異なるが、一般式（１ａ）で表される構造を有するポリマーの質量平均分子量を１万〜１００万程度に制御すれば、平均粒径が５０ｎｍ〜１００μｍ程度の微粒子が得られる。

溶液重合で得られた微粒子の一般式（４）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分にレクチンを結合することにより、本発明で用いる粒子状マーカーが得られる。レクチンを結合させる方法は、特に限定されず、タンパク質やペプチドの固定化に、通常使用される縮合剤を用いて、縮合すればよい。このような縮合剤としては、カルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤、ウロニウム系縮合剤等が挙げられるが、反応性が良好であることから、カルボジイミド系縮合剤が好ましく、中でも、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが好ましい。

本発明で用いる粒子状マーカーを水系媒体に分散することにより、本発明の癌の検出液が得られる。水系媒体としては、本発明で用いる粒子状マーカーの分散が可能で、生体から採取した組織への塗布が容易であり、塗布後に過剰の検出液が容易に除去でき、組織へのダメージが少ないことが求められることから、水系媒体としては、水、緩衝液、生理食塩水、多価アルコール水溶液等が好ましい。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。生理食塩水は、緩衝作用を有する化合物を添加した緩衝生理食塩水でもよく、カルシウムやマグネシウムを含有してもよい。多価アルコール水溶液の多価アルコールとしては、プロピレングルコール、ジプロピレングルコール、グリセリン、エリトロース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン等が挙げられる。分散媒としては、採取した組織への悪影響が少なく、癌の検出感度も高いことから、生理食塩水が好ましく、緩衝生理食塩水が更に好ましい。リン酸緩衝生理食塩水が最も好ましい。

本発明の検出液は、生体から採取した種々の組織の癌細胞の検出に適用できる。本発明の検出液が適用できる生体は、癌が発生する可能性のある生体であり、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。生体から組織を採取する手段は、癌化した組織を破壊せずに採取できる手段であれば特に制限されず、鉗子、メス等の一般的な外科的手段により採取すればよい。本発明の検出液の適用対象となる組織としては、特に、癌細胞の検出感度が高いことから、消化器の組織が好ましく、胃、大腸、直腸の組織が更に好ましく、大腸の組織が最も好ましい。本発明の検出液中の粒子状マーカーが癌細胞に選択的に結合し、組織に付着した粒子状マーカーの有無により癌細胞であるか否かを判断できる。本発明の検出液は癌細胞の検出感度が高く、生体から採取した組織の粘膜面（組織表面）、切断面のいずれにも適用できる。

本発明の検出液を使用する場合は、生体から採取した組織に、本発明の検出液を塗布して粒子状マーカーを癌細胞に付着させ、組織に付着していない余剰の粒子状マーカーを除去した後に、粒子状マーカーに使用した識別性物質に応じた検出方法により、癌細胞に付着した粒子状マーカーを認識することにより癌細胞の存在がわかる。生体から採取した組織に本発明の検出液を塗布する場合は、公知の方法、例えば、検出液の滴下、検出液への浸漬、刷毛等による塗布、検出液の噴霧等の方法を用いて塗布すればよい。組織に付着していない余剰の粒子状マーカーを除去する場合は、除去が容易であることから水系媒体を用いて除去することが好ましく、組織に付着した粒子状マーカーへの影響が少ないことから、検出液に用いる水系媒体と同種の水系媒体を用いて除去することが更に好ましい。塗布から除去開始までの時間（塗布が浸漬による場合は浸漬開始から除去開始までの時間）は、この時間があまりに短い場合やあまりに長い場合には、癌の検出感度が低下する場合があることから、０．５〜６０分が好ましく、１〜１０分が更に好ましい。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。

〔製造例１：マクロモノマーＡ〕
撹拌装置、温度計を備えたガラス製反応容器に、Ｎ−ビニルアセトアミド８５．１ｇ（１ｍｏｌ）、２−メルカプトエタノール０．３１３ｇ（４ｍｍｏｌ）、ラジカル重合開始剤としてＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１．６４ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び溶媒としてトルエン４００ｇを仕込み、６０℃で６時間攪拌して重合させ、生成した沈殿物をろ過により回収した。沈殿物のエタノール溶液を、アセトンにより再沈殿させ、溶媒を除去することによりＮ−ビニルアセトアミドポリマー（一般式（３a）で表される化合物）４２ｇを得た。

撹拌装置、温度計を備えたガラス製反応容器に、Ｎ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇ、水素化ナトリウムの６０％オイルディスパージョン０．４３ｇ、触媒としてテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ、及び溶媒としてジメチルホルムアミド１００ｇを仕込み、２５℃で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加し、２５℃で２４時間攪拌して反応させた。この反応溶液を５０％メタノール水溶液に滴下して、生成する沈殿をろ過により回収し、溶媒を除去することによりマクロモノマーＡ１５．２ｇを得た。マクロモノマーＡは一般式（３）においてｄが５５の化合物である。なお、ｄの数は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークと、Ｎ−ビニルアセトアミド由来のピークとの面積比より求めた。

〔製造例２：マクロモノマーＢ〕
撹拌装置、温度計を備えたガラス製反応容器に、メタクリル酸ｔ−ブチル１４２ｇ（１ｍｏｌ）、２−メルカプトエタノール０．７８１ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ラジカル重合開始剤としてＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１．６４ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び溶媒としてテトラヒドロフラン３００ｇを仕込み、６０℃で６時間攪拌して重合させた。反応液を、５０％メタノール水溶液に滴下して、生成する沈殿をろ過により回収し、溶媒を除去することによりメタクリル酸ｔ−ブチルポリマー（一般式（４a）で表される化合物）１２０ｇを得た。

撹拌装置、温度計を備えたガラス製反応容器に、メタクリル酸ｔ−ブチルポリマー２０ｇ、水素化ナトリウムの６０％オイルディスパージョン０．７２ｇ、触媒としてテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ、及び溶媒としてジメチルホルムアミド４００ｇを仕込み、２５℃で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド３ｇを添加し、２５℃で２４時間攪拌して反応させた。この反応溶液を５０％メタノール水溶液に滴下して、生成する沈殿をろ過により回収し、溶媒を除去することにより生成物１８．２ｇを得た。

撹拌装置、温度計を備えたガラス製反応容器に、得られた生成物１８．２ｇ、溶媒としてエタノール２００ｇ、酸触媒として濃塩酸２０ｇ及び重合禁止剤としてヒドロキノン０．８ｇを仕込み、７０℃で６時間攪拌してｔ−ブチル基を分解除去し、透析により塩酸を除去した後、凍結乾燥してマクロモノマーＢ１０ｇを得た。マクロモノマーＢは一般式（４）においてｅが７６の化合物である。なお、ｅの数は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークと、メタクリル酸由来のピークとの面積比より求めた。

〔製造例３：粒子状マーカーＡ１〕
ガラス製スクリュー管ビンに、マクロモノマーＡ０．５ｇ、マクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１ｇ、識別性物質としてクマリン６を２０ｍｇ、ラジカル重合開始剤としてＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇ、溶媒として６５％エタノール水溶液１５ｇを仕込み、溶解させ、窒素のバブリングを３０分間行った後、フタをして、６０℃の湯浴中で２４時間震蕩させて重合させた。生成した微粒子を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）により分離した後、凍結乾燥させて粒子状マーカーＡ１を得た。粒子状マーカーＡ１は、一般式（１ａ）においてａ：ｂ：ｃ＝１：１：３００、ｄ＝５５、ｅ＝７６となるポリマーを主成分とし、動的光散乱法による平均粒子径は２８０ｎｍであり、質量平均分子量は９０万であった。なお、ａ：ｂ：ｃの比は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により算出した。

〔製造例４：粒子状マーカーＡ２〕
マクロモノマーＡを０．５ｇから０．２５ｇに変更し、マクロモノマーＢを０．５ｇから０．７５ｇに変更した以外は、製造例３と同様の操作を行い、粒子状マーカーＡ２を得た。粒子状マーカーＡ２は、一般式（１ａ）においてａ：ｂ：ｃ＝１：３：６００、ｄ＝５５、ｅ＝７６となるポリマーを主成分とし、動的光散乱法による平均粒子径は３２０ｎｍであり、質量平均分子量は１００万であった。なお、ａ：ｂ：ｃの比は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により算出した。

〔製造例５：粒子状マーカーＡ３〕
マクロモノマーＡを０．５ｇから０．９５ｇに変更し、マクロモノマーＢを０．５ｇから０．０５ｇに変更した以外は、製造例３と同様の操作を行い、粒子状マーカーＡ３を得た。粒子状マーカーＡ３は、一般式（１ａ）においてａ：ｂ：ｃ＝１：０．００８：３５０、ｄ＝５５、ｅ＝７６となるポリマーを主成分とし、動的光散乱法による平均粒子径は２５０ｎｍであり、質量平均分子量は１１０万であった。なお、ａ：ｂ：ｃの比は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により算出した。

〔製造例６：粒子状マーカーＡ４〕
マクロモノマーＡを０．５ｇから０．０８ｇに変更し、マクロモノマーＢを０．５ｇから５ｇに変更した以外は、製造例３と同様の操作を行い、粒子状マーカーＡ４を得た。粒子状マーカーＡ４は、一般式（１ａ）においてａ：ｂ：ｃ＝１：１２：１５００、ｄ＝５５、ｅ＝７６となるポリマーを主成分とし、動的光散乱法による平均粒子径は２５０ｎｍであり、質量平均分子量は８０万であった。なお、ａ：ｂ：ｃの比は、^１Ｈ−ＮＭＲによる分析により算出した。

〔実施例１：粒子状マーカーＢ１、検出液Ａ１〕
粒子状マーカーＡ１の１０ｍｇを、０．７８％リン酸二水素カリウム水溶液８００ｍｇに分散させ、縮合剤として１−エチル−３−（３' −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下ＣＤＩと略記）２ｍｇを０．７８％リン酸二水素カリウム水溶液２００ｍｇに溶解して添加し、４℃で３０分間震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ，１０分間）で上澄みを除去した後、ＰＮＡ（ピーナッツ由来レクチン）１ｍｇをダベルコリン酸緩衝生理食塩液（シグマアルドリッチジャパン社製、商品名：Ｄ８５３７。以下ＤＰＢＳ（−）と略記する）１ｇに溶解した溶液を加えて分散させ、４℃で２４時間震蕩させて、ピーナッツレクチンを結合させて粒子状マーカーＢ１を合成した。粒子状マーカーＢ１中の、未結合のピーナッツレクチンをＤＰＢＳ（−）で洗浄して除去した後、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含有するダベルコリン酸緩衝生理食塩液（シグマアルドリッチジャパン社製、商品名：Ｄ８６６２。以下ＤＰＢＳ（＋）と略記する）に、分散させて本発明の検出液Ａ１を得た。検出液Ａ１中の粒子状マーカーＢ１の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ１は、平均粒子径（動的光散乱法で測定、以下同様）２８０ｎｍで、一般式（１）で表わされる構造を有するポリマー中のレクチン残基の含量（以下、単に「レクチン含量」ともいう）は０．５％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔実施例２：粒子状マーカーＢ２、検出液Ａ２〕
ＣＤＩを２ｍｇから１ｍｇに、ＰＮＡを１ｍｇから０．５ｍｇに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、粒子状マーカーＢ２を合成し、粒子状マーカーＢ２を分散させた検出液Ａ２を得た。検出液Ａ２中の粒子状マーカーＢ２の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ２は、平均粒子径２８０ｎｍで、レクチン含量は０．３％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔比較例１：粒子状マーカーＢ３、検出液Ｂ１〕
ＣＤＩを２ｍｇから０．５ｍｇに、ＰＮＡを１ｍｇから０．２５ｍｇに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、粒子状マーカーＢ３を合成し、粒子状マーカーＢ３を分散させた比較の検出液Ｂ１を得た。検出液Ｂ１中の粒子状マーカーＢ３の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ３は、平均粒子径２８０ｎｍで、レクチン含量は０．０８％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔比較例２：粒子状マーカーＢ４、検出液Ｂ２〕
ＣＤＩを２ｍｇから４ｍｇに、ＰＮＡを１ｍｇから２ｍｇに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、粒子状マーカーＢ４を合成し、粒子状マーカーＢ４を分散させた比較の検出液Ｂ２を得た。検出液Ｂ２中の粒子状マーカーＢ４の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ２は、平均粒子径２８０ｎｍで、レクチン含量は０．８％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔比較例３：粒子状マーカーＢ５、検出液Ｂ３〕
粒子状マーカーＡ１の１０ｍｇの代わりに粒子状マーカーＡ３の１０ｍｇを使用した以外は実施例１と同様の操作を行い、粒子状マーカーＢ５を合成し、粒子状マーカーＢ５を分散させた比較の検出液Ｂ３を得た。検出液Ｂ３中の粒子状マーカーＢ５の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ３は、平均粒子径３２０ｎｍで、レクチン含量は０．１１％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔比較例４：粒子状マーカーＢ６、検出液Ｂ４〕
粒子状マーカーＡ１の１０ｍｇの代わりに粒子状マーカーＡ４の１０ｍｇを使用した以外は実施例１と同様の操作を行い、粒子状マーカーＢ６を合成し、粒子状マーカーＢ６を分散させた比較の検出液Ｂ４を得た。検出液Ｂ４中の粒子状マーカーＢ６の含量は１％であり、粒子状マーカーＢ６は、平均粒子径２５０ｎｍで、レクチン含量は０．３％であった。なお、レクチン含量はニンヒドリン法により求めた。

〔比較例５：検出液Ｂ５〕
粒子状マーカーＡ１をＤＰＢＳ（＋）に含量が１％となるように分散させ、比較の検出液Ｂ５を得た。

〔比較例６：検出液Ｂ６〕
粒子状マーカーＡ２をＤＰＢＳ（＋）に含量が１％となるように分散させ、比較の検出液Ｂ６を得た。

〔評価に使用する生体組織〕
ヒト大腸癌細胞株（ＨＴ−２９）をヌードマウスの直腸の漿膜下に移植し、癌を定着させ成長させた大腸癌組織と、ヌードマウスの大腸の正常組織を試験に用いた。

〔評価方法〕
縦１．５ｍｍ、横３ｍｍの小片状に切断された組織片を、実施例又は比較例の検出液に２分間浸漬した後、ＤＰＢＳ（＋）を用いて、過剰の検出液を除去した。検出液で処理した組織片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製、型式：ＢＸ６３）を用いて観察（観察倍率４０倍、露光時間１／６０秒、ＦＩＴＣフィルター使用）し、蛍光の強さを以下の基準で評価した。結果を表１に示す。
＜評価基準＞
◎：強い蛍光が認められる。
○：蛍光が認められる。
△：わずかな蛍光が認められる。
×：蛍光が認められない、又は蛍光がほとんど認められない。

癌の検出では、癌細胞に特異的に結合することにより、癌細胞に強い蛍光が認められるだけでなく、正常細胞に蛍光が見られないことが重要である。本発明の検出液は、癌細胞に強い蛍光が認められたが、正常細胞に蛍光が見られない又はほとんどみられず、癌細胞を正常細胞と区別して容易に検出できる。比較例１〜６の検出液のうち、癌細胞に強い蛍光が認められたのは比較例２だけであるが、比較例２は正常細胞でも蛍光が見られているため、該比較例２の検出液によって、検出対象の組織の細胞が癌細胞であることを特定することは困難である。

Claims

生体から採取した組織用の癌の検出液であって、粒子状マーカーが水系媒体に分散されており、粒子状マーカーが、下記一般式（１）で表わされる構造を有するポリマーと識別性物質を含有し、平均粒子径が１ｎｍ〜１００μｍであることを特徴とする癌の検出液。

（式中、ａ、ｂ及びｃは、ａ：ｂ：ｃ＝１：０．０１〜１０：１００〜２０００となる数を表わし、ｄは１０〜６００の数を表わし、ｅは１０〜６００の数を表わし、Ｘは、レクチン残基を表わす。但し、ａ、ｂ及びｃの各繰り返し数に対応する各ユニットの主鎖における順序は任意であり、前記ポリマーにおけるレクチン残基の割合は０．１〜０．７質量％である。）
識別性物質が蛍光物質である請求項１記載の癌の検出液。
生体から採取した組織が、消化器組織である請求項１又は２記載の癌の検出液。
生体から採取した組織に、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌の検出液を塗布することを特徴とする癌の検出方法。