JP2015172010A

JP2015172010A - リン酸エステルの精製方法

Info

Publication number: JP2015172010A
Application number: JP2014047943A
Authority: JP
Inventors: 山田　雅士; Masashi Yamada; 雅士山田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2015-10-01

Abstract

【課題】、膨大な工数をかけなくても、リン酸エステルを精製することができる方法を提供し、特に無機リン酸塩をも除去することができる精製方法を提供する。【解決手段】水溶性リン酸エステル（例えば１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸エステルの塩、４−メチルウンベリフェリルリン酸塩、又はｐ−ニトロフェニルホスフェイトの塩）の水溶液に酸を添加し、生成した水不溶性リン酸エステルを水溶液から分離・回収し、得られた水不溶性リン酸エステルに塩基を添加し、生成した水溶性リン酸エステルを回収することを特徴とする、リン酸エステルの精製方法。【選択図】なし

Description

本発明は、リン酸エステルの精製方法に関し、特に混在している無機リン酸塩を除去することができる精製方法に関する。

従来、水溶性リン酸エステルの精製は、主に逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行われている（特許文献１参照。）。しかし逆相ＨＰＬＣ精製においては、精製されたものから水分の除去が必要であり、凍結乾燥などの操作が行われているが、非常に工数のかかるものであった。また、ＨＰＬＣによって１回に精製処理できる量は限られており、大量に精製する場合にはＨＰＬＣ装置の大型化もしくは複数回繰り返しの精製が必要であり、設備投資もしくは膨大な工数が必要であるという問題点があった。さらに、上記精製法によっても無機リン酸塩の除去は不完全であった。そのため水溶性リン酸エステルをそのような方法で精製し、それをアルカリ性ホスファターゼ等の基質として用いた場合には、残存する無機リン酸塩によりアルカリ性ホスファターゼの酵素活性が阻害されるという問題があった。特にアルカリ性ホスファターゼと水溶性リン酸エステルを用いた酵素免疫測定法においては、生体成分等の微量物質を検出する際に、残存する無機リン酸塩により正しい測定値が得られないという問題があった。

特開２００２−１４５８８２公報

本発明の目的は、膨大な工数をかけなくてもリン酸エステルを精製することができる方法を提供することにある。特に無機リン酸塩をも除去することができる精製方法を提供することにある。

本発明者は、鋭意検討の結果、上記問題点を解決しうることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］水溶性リン酸エステルの水溶液に酸を添加し、生成した水不溶性リン酸エステルを水溶液から分離・回収することを特徴とする、リン酸エステルの精製方法。
［２］水溶性リン酸エステルが１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸エステルの塩、４−メチルウンベリフェリルリン酸塩、又はｐ−ニトロフェニルホスフェイトの塩である、［１］に記載の精製方法。
［３］上述の［１］又は［２］の方法で得られた水不溶性リン酸エステルに塩基を添加し、生成した水溶性リン酸エステルを回収することを特徴とする、リン酸エステルの精製方法。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

（１）水溶性リン酸エステル水溶液の調製
水溶性リン酸エステル水溶液としては特に限定はなく、例えば水溶性リン酸エステルを水に溶解して水溶液としてもよく、また合成反応や精製等で得られた水溶液を用いてもよい。水溶性リン酸エステルとしては特に限定されるものでないが、例えばリン酸エステルの塩等があげられ、より具体的には１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸エステルの塩、４−メチルウンベリフェリルリン酸塩、又はｐ−ニトロフェニルホスフェイトの塩があげられる。特に１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸エステルの塩としては、具体的には５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩、リン酸３−［３’−メトキシスピロ［アダマンタン−２，４’−［１，２］ジオキセタン］−３’−イル］フェニルジナトリウム塩、２−クロロ−５−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝４−ｙｌ）フェニルリン酸ジナトリウム塩などがあげられる。

水溶液の温度は、水溶性リン酸エステルが、１，２−ジオキセタン誘導体の場合には摂氏８度以下であることが好ましく、特に本発明の精製工程全体を８℃以下で行うことが更に好ましい。なお温度の下限は水溶液が凍結しない温度であればよい。

水溶液は、ろ紙、グラスフィールターやセライトなどを用いてろ過を行い、不溶物などを除去することが好ましい。

（２）酸の添加／水不溶性リン酸エステルの生成
上の（１）で得られた水溶性リン酸エステル水溶液に酸を添加して、水不溶性リン酸エステルを生成させる。この水不溶性リン酸エステルは油状物質、粉末、結晶等の形で生成する。

添加する酸としては特に限定されるものではないが、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸又は酢酸、ギ酸などの有機酸が好ましく、これらの内からいずれか１つ又は２種類以上の酸を使用することが出来る。酸は水溶液として添加することが好ましい。
酸を添加する際に攪拌もしくは震盪することが好ましく、これは生成した水不溶性リン酸エステルが不純物を抱き込まないようにするためである。また酸を添加した後は、静置することが好ましい。これは次の分離工程での分離を行いやすくするためである。

（３）不溶物の分離・回収
次に生成した水不溶性リン酸エステルを水溶液から分離・回収する。その方法には特に限定はなく、デカンテーション、濾過、吸引等、不溶物の形状に応じて適宜行うことができる。なお、不純物として混在していた無機リン酸塩は、水溶液中に存在するので、この工程で除去される。このようにして精製した水不溶性リン酸エステルを得ることができる。

またこれに続けて、以下の工程を行うことにより、水溶性リン酸エステルを得ることができる。

（４）塩基の添加
水不溶性リン酸エステルに塩基を添加する。これにより水不溶性リン酸エステルは溶解し、水溶性リン酸エステルが生成する。ここで使用される塩基としては、特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩基若しくはアンモニアなどの有機塩基が好ましく、これらの内からいずれか１つ若しくは２種類以上の塩基を使用することが出来る。なお塩基は水溶液として添加するのが好ましい。添加する塩基の量は限定されるものではないが、当量添加することにより、次の回収工程において減圧乾燥等により容易に目的物を得ることができる。

（５）水溶性リン酸エステルの回収
水溶性リン酸エステルは前述のように減圧乾燥で回収してもよく、また適宜他の方法で回収することもできる。

本発明により、リン酸エステル類を精製することができる。特に無機リン酸塩の除去が可能となる。そのためアルカリ性ホスファターゼ等の基質として用いる場合に、特に酵素免疫測定等において微量成分を検出する際に、残存する無機リン酸塩によりアルカリ性ホスファターゼの酵素活性を阻害されるという問題を解決することが可能である。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。しかし本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

（比較例１）
アルカリ性ホスファターゼ０．００５μｇ／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬに、蛍光性物質としてフルオレセインを０．３ｍＭ、カチオン性界面活性剤として臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを２．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５００ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を２５μＬ添加し、次いで５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩の粗生成物を２．０ｍＭ、及びアジ化ナトリウム０．１％を含む、５０ｍＭの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０）を２５μＬ順次添加し、混合して、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（検出器：シングルフォトンカウンター；測定波長領域：３８０〜６３０ｎｍ）を使用した。測光条件は上述のように混合した５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。発光量は１，６３７，３３８であった。

（実施例１）
比較例１と同じ５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩の粗生成物５．０ｇに１８０ｍＬの水を加えて溶解して、ろ過を行った。その後、濃塩酸２０ｍＬを加えて磁気攪拌子を用いて攪拌することにより、白〜微黄色油状沈殿が生成した。酸性水溶液をデカンテーションにより除去した後、５Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬを添加して前述の油状沈殿物を溶解した。これを減圧乾燥し、精製した５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩の白色粉末を４．１ｇ得た。回収率８２％。なお、これら一連の反応は、おおむね４〜７℃で行った。

この精製した５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩を用いた以外は比較例１と同様にして発光量を測定した。発光量は１，８８１，７８７であり、比較例１と比較して１１４．９％発光量の増加を確認した。これは粗生成物中に残存していた無機リン酸塩が除去されたためである。

Claims

水溶性リン酸エステルの水溶液に酸を添加し、生成した水不溶性リン酸エステルを水溶液から分離・回収することを特徴とする、リン酸エステルの精製方法。
水溶性リン酸エステルが１，２−ジオキセタン誘導体のリン酸エステルの塩、４−メチルウンベリフェリルリン酸塩、又はｐ−ニトロフェニルホスフェイトの塩である、請求項１に記載の精製方法。
請求項１又は２の方法で得られた水不溶性リン酸エステルに塩基を添加し、生成した水溶性リン酸エステルを回収することを特徴とする、リン酸エステルの精製方法。